WO2006132326A1 - 生細胞固定化法及び生細胞活性化機能測定センサー - Google Patents

生細胞固定化法及び生細胞活性化機能測定センサー Download PDF

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WO2006132326A1
WO2006132326A1 PCT/JP2006/311542 JP2006311542W WO2006132326A1 WO 2006132326 A1 WO2006132326 A1 WO 2006132326A1 JP 2006311542 W JP2006311542 W JP 2006311542W WO 2006132326 A1 WO2006132326 A1 WO 2006132326A1
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living cell
cells
living
optical fiber
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PCT/JP2006/311542
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Michihiro Hide
Hidenori Suzuki
Yuhki Yanase
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Hiroshima University
Wakunaga Pharmaceutial Co., Ltd.
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    • G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
    • G01N21/554—Attenuated total reflection and using surface plasmons detecting the surface plasmon resonance of nanostructured metals, e.g. localised surface plasmon resonance

Definitions

  • the present invention relates to a living cell immobilization method for immobilizing living cells on a surface of metal or the like, and particularly suitable for evaluating the activation function of living cells utilizing plasmon resonance. It relates to the fixed method.
  • the present invention also relates to a sensor for measuring a function of activating living cells using the method for fixing living cells.
  • Patent Document 1 when the principle of surface plasmon resonance is used in Patent Document 1, changes that occur in response to extracellular stimulation to cells attached to the surface of metal, particularly gold foil plates or fine particles, It has been disclosed that detection can be performed without applying labeling or the like to cells.
  • Patent Document 2 discloses that an appropriate space between cells and a measurement chip is used to fix lymphocytes to a measurement chip for fixing live cells.
  • a method for fixing cells using a spacer is shown.
  • An example of a spacer in this case is poly-L-lysine.
  • a method is disclosed in which poly-L-lysine is applied to a measuring chip and cells are fixed thereon by placing them on the measuring chip!
  • Patent Document 1 JP 2002-85089 A
  • Patent Document 2 JP 2004-305095 A
  • this poly-L-lysine is widely known as a biocoat! / It is known that it has a certain fixing ability, but a polymer having a polyamino acid power is also known. Therefore, it may give unintended stimulation to the cell itself.
  • a polymer having a polyamino acid power is also known. Therefore, it may give unintended stimulation to the cell itself.
  • the mechanism of the cell fixation mechanism has not been clarified and the polymer structure on the metal surface is unknown, there is a problem in performing high-density and uniform fixation. For this reason, when fixing living cells, it has the same or better living cell adhesion as poly-L-lysine and has less influence on the functions expressed by living cells, and has stable and excellent reproducibility. There is a need for cell fixation.
  • the present invention relates to a living cell fixing method for fixing a living cell to a surface of metal or the like, and in particular, has an activation function of a living cell using plasmon resonance.
  • An object of the present invention is to provide a living cell fixation method that is suitable for evaluation and that is stable and excellent in reproducibility. It is another object of the present invention to provide a living cell activation function measuring sensor using the living cell fixation method.
  • the method for fixing a living cell uses an organic compound having a thiol group and an amino group, or a living cell fixing material made of an organic compound having a disulfide group and an amino group. To fix the living cells on the solid surface.
  • the fixation of the living cells is preferably performed in a physiological environment.
  • the solid surface is preferably a metal surface having an affinity for a thiol group or a disulfide group, particularly preferably a gold film or a gold nanoparticle.
  • the organic compound is preferably an aminoalkanethiol or a disulfide-type compound in which two molecules are bonded.
  • the above living cell-fixing material can be applied to both adherent live cells and non-adherent live cells such as lymphocytes, and adherents detached from the incubator solid phase. It can also be applied to live cells.
  • a living cell activation function measuring sensor suitable for evaluating the activation function of living cells can be configured as follows. That is, the living cell activation function measuring sensor has a disulfide-type compound force in which an optical fiber having gold nanoparticles attached to the end surface and an aminoalkanethiol immobilized on the surface of the gold nanoparticle or two molecules thereof are bonded. And a living cell fixed material and a living cell fixed to the living cell fixed material.
  • the living cell activation function measuring sensor has a light reflecting material provided on an end surface of the exposed portion of the optical fiber having an optical fiber core exposed at the tip, and an outer periphery.
  • the live cell fixation method according to the present invention is particularly suitable for attaching live cells to the surface of a metal plate such as gold, silver, or copper, or metal nanoparticles, and evaluating the function of the cells. , Stable and reproducible.
  • the living cell activation function measuring sensor according to the present invention can effectively examine the function of living cells with a small number of living cell samples.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a living cell activation function measuring sensor according to the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a sensor for measuring a function of activating a living cell according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a sensor portion for measuring the activation function of living cells used in the tests of Examples 3 to 5.
  • FIG. 4 is a graph showing test results obtained by forming a cysteamine film on a metal plate and fixing human peripheral blood basophils and measuring the cell function of human peripheral blood basophils.
  • Fig. 5 is a graph showing test results in the case of testing using human peripheral blood basophils from different people in Fig. 4.
  • FIG. 6 is a graph showing the test results of measuring the cell function of a B cell line when a cysteamine film was formed on a metal plate and the B cell line was fixed and stimulated with PMA.
  • FIG. 7 is a micrograph of a B cell line remaining on a chip collected after perfusion on an SPR device after forming a cysteamine membrane on a metal plate and fixing the B cell line.
  • Fig. 8 shows a micrograph of the B cell line remaining on the chip recovered after perfusion on the SPR device after fixing the B cell line on the chip prepared in the same manner without using cysteamine. is there.
  • FIG. 9 is a graph showing test results obtained by forming a cystamine film on a metal plate and fixing human peripheral blood basophils and measuring the cell function of human peripheral blood basophils.
  • FIG. 10 In the test for evaluating the activation function of human basophils using the live cell activation function measurement sensor shown in FIG. 1, the change state when human basophils are stimulated with mite antigen is shown. It is a graph to show.
  • FIG. 11 is a graph showing changes in human basophils in the control test of FIG.
  • FIG. 12 Changes in the activity of RBL-2H3 cells stimulated with DNP-HSA in the case of RBL-2H3 cell activity assay using the live cell activation function measurement sensor shown in Fig. 2. It is a graph which shows a state.
  • FIG. 13 is a graph showing changes in RBL-2H3 cells in a control test using a control solution instead of the antigen stimulation of FIG.
  • FIG.14 Fix the RBL-2H3 cells in Fig. 12! / Using a sensor and antigen stimulation with DNP-HSA It is a graph which shows the change state of the RBL-2H3 cell in the case of the comparative test which was intense.
  • the living cell immobilization method according to the present invention is a method in which a living cell is immobilized on a solid surface via an organic compound having a thiol group and an amino group, or a living cell fixing material made of an organic compound having a disulfide group and an amino group.
  • the present invention provides a living cell fixing material comprising an organic compound having a thiol group and an amino group or an organic compound having a disulfide group and an amino group in order to fix the living cell to the solid phase surface.
  • the material of the solid phase surface for fixing the living cells is not particularly limited as long as it has an affinity for thiol groups and disulfide groups.
  • metals such as gold, silver, copper, etc., particularly gold, are preferable.
  • the form thereof is preferably in the form of a foil plate or nanoparticles.
  • the foil plate may be a film formed by vapor deposition or sputtering of such metal on glass or plastics.
  • the present invention uses a living cell-fixing material having an organic compound having a thiol group or a disulfide group.
  • the gold or silver surface is strongly bonded with organic compounds by Au-S or Ag-S bonds.
  • a so-called self-assembled monolayer film in which organic compound molecules are uniformly arranged on the gold or silver surface is easily formed on the basis of van der Waals forces that generate bonds and act between the molecules constituting the organic compound. Can be formed.
  • the living cell fixing material used in the present invention also has an ability of an organic compound having an amino group.
  • the surface of the living cell is negatively charged by the sialic acid or phospholipid of the glycoprotein sugar chain that is universally present on the surface. Therefore, the surface of the living cell is generated by the electric attraction with the positive charge of the amino group. Cells are easily fixed to the organic matter. This fixation is based on electrical attraction, so it does not denature live cells or cause injury. Therefore, by using the living cell immobilization method according to the present invention, a cell device using plasmon resonance in a state of being in a living state and in a state close to that in a living body in an appropriate physiological environment. Performance evaluation.
  • Such an organic compound may be any organic compound having a thiol group or a disulfide group that easily binds to the solid phase surface and an amino compound that easily binds to living cells.
  • the organic compound can be prepared from an aminoalkanethiol, a disulfide type compound in which the two molecules are bound, or a salt such as a chloride or bromide thereof.
  • organic compounds include cysteamine (2-aminoethane-1-thiol), 6-amino-1-hexanethiol, and 8-amino-1-octanethiol chloride belonging to aminoalkanethiol, and It can be prepared from the chloride of cystamine (2,2'-disulfanedibis (ethylamine)), which belongs to a disulfide-type compound to which two aminoalkanethiol molecules are bound.
  • the living cell fixation method according to the present invention has been described above.
  • This live cell fixation method can be used for the live cell activation function measurement sensor described below, and thus, the viable cell force that is less than the average functional state in which many live cell forces are expressed.
  • the expressed functional state can be directly measured.
  • the functional state of even a small number of living cell samples can be examined.
  • the living cell activation function measuring sensor 100 includes an optical fiber 10 with gold nanoparticles 13 attached to the end face, and an aminoalcanti fixed on the surface of the gold nanoparticles 13.
  • a living cell-fixing material composed of a disulfide-type compound to which all or two molecules thereof are bound 20
  • live cells 30 fixed to the live cell immobilization material 20.
  • the optical fiber 10 has an optical fiber core 11 and a clad 12 covering the outer periphery thereof, and a known optical fiber 1 can be used.
  • Known gold nanoparticles 13 can be used.
  • the shape of the gold nanoparticle 13 is preferably spherical, and the size should be 100 to 10 nm. Force Particles such as a rectangle, a rod, and a polygon can also be used as necessary.
  • the living cell fixing material 20 can be prepared by aminoalkanethiol, disulfide-type compound in which two molecules thereof are bound, or salt strength thereof. By virtue of this live cell fixing material 20, it is possible to fix live cells to gold nanoparticles in a state suitable for measuring the activation function of live cells.
  • the living cells 30 may be cells isolated from tissues, primary cultured cells, cell lines, recombinantly expressed cells, etc., as long as a specific stimulant (product) causes a cellular response.
  • a specific stimulant product
  • human basophils, Ramos cells (B cell line), Rat Basophilic Leukemia cells (RBL-2H3) can be used.
  • the living cell activation function measuring sensor may have a structure shown in FIG.
  • This living cell activation function measuring sensor 101 is provided with a light reflecting material 15 on the end face of the exposed portion of the optical fiber 10 with the optical fiber one core 11 exposed at the tip portion, and a gold film on the outer peripheral portion.
  • a living cell immobilization material 20 composed of an optical fiber 10 covered with 14, an aminoalkanethiol immobilized on the surface of the gold film 14 or a disulfide type compound in which two molecules thereof are bonded, and a living cell immobilization material. Viable cells 30 fixed to 20.
  • an optical fiber 10 having a light reflecting material 15 provided on an end surface of an exposed portion of the optical fiber core and an outer peripheral portion covered with a gold film 14 is a known one. Can be used.
  • viable cells are immobilized on a measurement chip comprising a glass substrate on which gold is vapor-deposited, and are then viable by a measurement device (SPR device) using surface plasmon resonance.
  • SPR device a measurement device
  • a test was conducted to measure the activation function.
  • the living cells 30 are immobilized on the upper surface of the gold film 14 on which the gold of the measurement chip 17 is deposited via the living cell fixing material 20. Yes.
  • the activation function of the living cell 30 is performed by irradiating the prism 18 with the laser beam indicated by the arrow in FIG. 3 and analyzing the reflected light.
  • the prism 18, and the SPR device those attached to SPR-CELLIA manufactured by Moritex Co., Ltd. were used.
  • Viable cells 30 were human peripheral blood basophils.
  • the live cell fixing material 20 was formed by forming a cysteamine film on the gold film 14 surface. That is, first, the measurement chip 17 was ultrasonically washed in acetone for 10 minutes, and then cysteamine manufactured by Sigma ALDRICH Co. was dissolved in pure water or ethanol to a final concentration of ImM. Next, the measuring chip 17 was immersed in a cysteamine solution, shaken for 30 minutes, and then washed three times with pure water. As a result, a cysteamine film having a thickness of cysteamine monomolecular and having a positive charge on the surface was formed on the gold film 14 surface of the measurement chip 17.
  • human peripheral blood basophils were prepared. Specifically, 14 ml of human cubital vein blood was mixed with EDTA / 2Na, then 14 ml Balanced salt solution (D-glucose 0.01%, CaCl 5 M, MgCl 98 uM, KC1 540 ⁇ Tris 14.5 mM,
  • a cell suspension with a high proportion of basophils was prepared from the obtained fraction using a Basophil Isolation kit manufactured by Miltenyi Biotec.
  • FcR bio eking Reagent 50 ⁇ 1 was added to the obtained fraction to block Fc receptor, and then 100 ⁇ 1 Hapten-Antibody Cocktail was added to it and allowed to stand at 10 ° C for 10 minutes. did.
  • a cell suspension was obtained with a high proportion of spheres.
  • the cell suspension thus obtained was added to a cell suspension buffer (NaCl 0.14M, KC1 2.7, u M, NaH PO 0.46 mM, HEPE
  • the basophil cell suspension 100 ⁇ 1 prepared in this way was cis-added as described above. Place it on the gold film 14 of the measuring chip 17 on which the theaamine film is formed in a spot shape and let stand for 15 minutes, and then wash the measuring chip 17 with the cell suspension buffer 100 1 to A measurement chip 17 on which human peripheral blood basophils were immobilized was prepared by removing excess cells.
  • the measurement chip 17 thus prepared is attached to the measurement part of the SPR device, and after perfusion with a cell suspension buffer at a flow rate of 10 ⁇ 1, the flow path of the cell suspension buffer And the measurement chip part was perfused with an anti-human-IgE antibody (300 ng / ml) manufactured by BETHYL for about 6 minutes. After that, switch to the cell suspension buffer again and continue the perfusion and measure with the SPR device.
  • FIGS. 4 and 5 show the results measured with the SPR device.
  • Figure 4 shows the results for blood donor A
  • Figure 5 shows the results for blood donor B.
  • the horizontal axis indicates the elapsed time after the start of measurement, and the vertical axis indicates the resonance angle.
  • the solid line shows the signal change curve (Anti-IgE) when cells were stimulated by perfusion with anti-human IgE antibody.
  • the broken line shows the signal change curve (Buffer) of the control sample in which only the cell suspension buffer was perfused without perfusion of the anti-human-IgE antibody.
  • the thick horizontal line indicates the time during which the anti-human-IgE antibody was perfused.
  • Example 1 As in Example 1, a cysteamine film was formed on the gold film 14 surface of the measurement chip 17, and Ramos cells (B cell line) were immobilized thereon, and PMA (phorbol-12 myristate-13 acetate) The response of the B cell line when stimulated with (phorbol 12 myristate 13-acetate) was measured using the above SPR device.
  • the fixation of the measurement chip 17 of the B cell line on the gold film 14 was performed as follows. That is, on the cysteamine membrane prepared in the same manner as in Example 1, the above cell suspension or HEPES buffer (HEPES 20 mM, NaCl 120 mM, CaCl 2 mM,
  • RamCl cells (B cell line) adjusted to a concentration of 1 X 10 6 / ml with MgCl lmM (glucose 5 mM) 10
  • the measurement chip 17 on which the B cell line was fixed in this manner was attached to the SPR device measurement unit, and first, perfusion with a cell suspension buffer was performed at a flow rate of 101. Next, the PMA from Calbiochem was perfused for about 6 minutes to stimulate the B cell line, and then perfusion with the cell suspension buffer was performed again, and the measurement was performed with the SPR device. As a control sample, cysteamine treatment was carried out, and the same test was carried out on the sample.
  • FIG. 6 shows the results measured by the SPR device.
  • the horizontal axis shows the elapsed time after the start of measurement, and the vertical axis shows the resonance angle.
  • the thick horizontal line indicates the time during which PMA was perfused.
  • the measurement chip 17 was placed on the SPR device, perfused with the cell suspension buffer, collected, and observed under an optical microscope (magnification 100 times), as shown in FIG.
  • FIG. 9 shows the same as in Example 1, except that a cystamine film was formed on the gold film 14 of the measurement chip 17 and human peripheral blood basophils were immobilized, and an anti-human-IgE antibody ( The test results are shown when stimulation was performed by perfusing 300 ng / ml) for about 6 minutes.
  • This test was performed under the same conditions as in Example 1 except for the following cystamine film formation. Formation of the cystamine film on the gold film 14 was performed as follows. First, the measurement chip 17 was ultrasonically cleaned in acetone for 10 minutes, and then cystamine manufactured by Sigma ALDRICH Co. was dissolved in pure water or ethanol to a final concentration of ImM.
  • the measuring chip 17 was immersed in a cystamine solution, shaken for 30 minutes, and then washed three times with pure water. As a result, a cystamine film having a positive charge on the surface thereof bonded to the gold film 14 at the cystamine disulfide base was formed on the metal plate surface of the measurement chip 17.
  • the horizontal axis indicates the elapsed time after the start of measurement, and the vertical axis indicates the resonance angle.
  • the thick horizontal line indicates the time during which the anti-human-IgE antibody was perfused.
  • the solid line shows the signal change curve when anti-human-IgE antibody is perfused (Anti-IgE), and the broken line shows the signal for the control sample without perfusion of anti-human-IgE antibody. Shows the change curve (Buffer).
  • the signal indicating the activity of the cells is observed within a few minutes when the anti-human-IgE antibody is perfused.
  • a control sample without perfusion of the anti-human-IgE antibody It can be seen that there is almost no change in signal. This shows that the basophil stimulation response state specific to the anti-human-IgE antibody can be examined.
  • the optical fiber 10 is an optical fiber with an SC connector with a core ⁇ 50Z clad ⁇ 125 ⁇ m manufactured by Sumitomo Electric Industries, Ltd., and the average roughness is 0.05 to 0.1.
  • Gold nanoparticles 13 were attached to the end face of ⁇ m as follows. That is, the tip of the optical fiber 10 is immersed in a caseon and allowed to stand for 5 minutes, and then the tip of the optical fiber 10 is immersed in a solution of sulfuric acid and hydrogen peroxide (3: 1) for 15 minutes. Left to stand.
  • the tip of the optical fiber 10 was washed with distilled water and ethanol, then immersed in a 10% 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) Z ethanol solution, washed twice with ethanol and once with distilled water, and then BBI.
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • the living cell fixing material 20 having the 8-amino-1-octanethiol force is fixed on the surface of the gold nanoparticle 13 as shown below.
  • Basophil power also becomes Live cells 30 were immobilized. That is, the tip of the optical fiber with gold nanoparticles immobilized as described above was immersed in an ethanolic solution of ImM 8-aminooctane-1-thiol (lmL). 10 6 C ell / ml concentration cell suspension buffer force was suspended also put cell suspension of approximately 30 1 on a plastic plate, and suspend the Nigoeki suspended inverted every plastic plate, the liquid The fiber tip was inserted into the lower end of the drop and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. It was confirmed with an inverted microscope equipped with a digital camera that human basophils were immobilized on the living cell-fixing material 20.
  • human basophils were antigen-stimulated with mite antigen, and a control solution without mite antigen was used.
  • the response state of human basophils in the case of (control test) was examined.
  • the live cell activation function measurement sensor 100 is immersed in 20 ml of a cell suspension buffer in a petri dish ( ⁇ 10 cm), and Bayer Corporation mite antigen extract (40 AU / ml) 500 ⁇ m I went with 1 added.
  • the response state of human basophils was measured using a light source (Ocean Optics, Inc.
  • LED-518 LED-518
  • power puff ⁇ Newport and orporation Newport—125 ⁇ m
  • fa z ⁇ light 3 ⁇ 4 ucean Optics, Inc. (HR2000, Inc.) was used to measure the scattered light intensity at a wavelength of 530 nm obtained via a coupler with a fiber spectrometer and monitor it with analysis software (Ocean Opticsjn 0 OIBase32). .
  • Figs. 10 and 11 show the test results.
  • Figure 10 shows the test results when human basophils were stimulated with mite antigens
  • Figure 11 shows the test results for the control test.
  • the horizontal axis indicates the elapsed time after measurement
  • the vertical axis indicates the intensity of scattered light having a wavelength of 530 nm.
  • the arrow in the figure indicates the start of supplementation with the mite antigen extract ( Figure 10) and the control solution ( Figure 11).
  • Figure 10 shows the intensity of scattered light having a wavelength of 530 nm.
  • the arrow in the figure indicates the start of supplementation with the mite antigen extract ( Figure 10) and the control solution ( Figure 11).
  • FIG. 10 when human basophils were stimulated with antigen, the intensity increased linearly after the measurement.
  • the control test as shown in Fig. 11, it can be seen that there is no change in intensity.
  • An activation function evaluation test of RBL-2H3 cells was performed using the activation function measurement sensor 101 in which the living cells 30 also have RBL-2H3 cell power.
  • the live cell activation function measurement sensor 101 was prepared as follows.
  • Optical fiber 10 is a connector made by Sorabo Japan Co., Ltd.
  • aluminum is sputtered onto the end face of an optical fiber core with a length of 1 cm exposed at the tip, 300 nm thick
  • the light reflecting material 15 described above was formed, and gold was sputtered on the outer peripheral portion to form a gold film 14 having a thickness of 50 ⁇ 5 nm.
  • Aluminum sputtering is performed by evacuating the inside of the chamber to 8 X 10 Pa with a turbo molecular pump, and then 1 "gas flow rate is 0.051 / 1 ⁇ 2 (5 ( ⁇ ( ⁇ ), 301112 degree of vacuum) 3? sputtering of 1 hour was performed. gold under the conditions of a after evacuated chamber one to 8 X 10- 5 Pa at a turbo molecular pump, Ar gas flow rate 0.051 / min at standard conditions, Schlz degree of vacuum The test was performed at 3 Pa for 2 minutes and 40 seconds.
  • the tip of the optical fiber manufactured in this way was immersed in ImM's 8-aminooctane-1-thiol ethanol solution (lmL), and 8-aminooctane-1-thiol was deposited on the surface of the gold film 14.
  • the living cell fixing material 20 was formed by fixing.
  • approximately 3801 of the cell suspension of RBL-2H3 cells prepared in advance was placed in the plastic tube lid and inverted to suspend the liquid level.
  • a cell suspension of RBL-2H3 cells was prepared as follows. First, on the day before the experiment, R BL-2H3 cells were suspended in RPMI1640 tissue culture solution (Invitrogen Corporation) at a concentration of 4 X 10 5 cells / ml, and the cell suspension was further diluted to 50 ng / ml. -DNP IgE (manufactured by Sigma A LDRICH Co.) was sensitized, and 3 ml was placed in HydroCelKCelSeed Co., Ltd., and sputum culture was performed.
  • RBL-2H3 cells were added to this cell suspension at a concentration of 2 ⁇ 10 6 cell / ml Siraganian buffer (25 mM PIPES (pH 7.2), 159 mM NaCl, 5 mM KC1, 0.4 mM MgCl
  • the living cell activation function measuring sensor 101 thus prepared was immersed in 4.5 ml of buffer in a petri dish ( ⁇ 10 cm) and dinitrophenol conjugated human made by Sigma ALDRICH Co. Serum Alubumin (DNP-HS A) (500 ng / ml) 500 ⁇ 1 (final concentration 50 ng / ml) was added to the antigen stimulation of RBL-2 H3 cells, and DNP-HSA was not added.
  • DNP-HS A serum Alubumin
  • the response status of RBL-2H3 cells in one control study was examined.
  • the response state of RBL-2H3 cells is examined using a sensor to which live cells 30 are not fixed (a sensor having the same structure as live cell activation function measurement sensor 101 except that live cells 30 are not fixed). A comparative test was also conducted.
  • the measuring device is a light source (LS-1 manufactured by Ocean Optics, Inc.), a coupler (manufactured by Opt-Link, ⁇ 200/230 ⁇ m), a fiber spectrometer (HR2000 manufactured by Ocean Optics, Inc.).
  • the optical fiber comprising the living cell activation function measuring sensor 101 was coupled to the fiber tip of the coupler via an SC connector.
  • Cell response analysis is performed by measuring the change in the absorption spectrum of the return light reflected from the live cell activation function measurement sensor 101 via the coupler and measuring the absorption maximum of the light intensity. This was done by monitoring the change in light wavelength over time. For the monitor, analysis software OOIBase 32 manufactured by Ocean Optics, Inc. was used.
  • FIG. 12 shows RBL-2H3 cells stimulated with DNP-HSA
  • Figure 13 shows a control test using a control solution instead of antigen stimulation
  • Figure 14 shows RBL-2H3 cells fixed.
  • the case of a comparative test in which antigen was stimulated with DNP-HSA using a sensor is shown. 12 to 14, the horizontal axis represents the elapsed time of the test, and the vertical axis represents the wavelength indicating the maximum absorption of the measured light intensity.
  • the arrows in the figure indicate the start of addition of DNP-HSA ( Figures 12 and 14) and the control solution ( Figure 13).

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Abstract

　生細胞を固相表面に固定するための生細胞固定化法に係り、特にプラズモン共鳴を利用した生細胞の活性化機能を評価するのに好適で、固着性に優れた生細胞固定化する方法を提供する。 　チオール基及びアミノ基をもつ有機化合物、または、ジスルフィド基及びアミノ基をもつ有機化合物からなる生細胞固定化材を介して生細胞を固相表面に固定化する。生細胞の固定は、生理環境下において行うのがよく、固相表面は、チオール基又はジスルフィド基と親和性のある金属表面であるのがよい。有機化合物は、アミノアルカンチオール、その二分子が結合したジスルフィド型化合物であるのがよい。このような生細胞固定化法を利用して生細胞の活性化機能を評価するのに好適な光ファイバーの先端部に生細胞を固定化させた生細胞活性化機能測定センサーを構成することができる。

Description

明 細 書
生細胞固定化法及び生細胞活性化機能測定センサー
技術分野
[0001] 本発明は、生細胞を金属等の表面に固定化するための生細胞固定化法に係り、特 にプラズモン共鳴を利用した生細胞の活性化機能を評価するのに好適な生細胞固 定ィ匕法に関する。また、その生細胞固定ィ匕法を利用した生細胞活性化機能測定セ ンサ一に関する。
背景技術
[0002] 近年、薬学や医療分野において、個々の蛋白質の機能解析では予測し得ない高 度な生命現象を調べる目的で、細胞自体の活動を包括的に解析するための方法が 望まれている。細胞の機能を生きたまま同時進行的に観察する方法としては、細胞 に光を当てて得られる透過光または反射光を顕微鏡的に観察する方法が一般的で ある。しかしながらこの方法では観察できる情報に限界があるため、特定の蛋白質や 染色体の局在や動きを観察するために、予め標的分子を蛍光物質などで標識して おくことが必要であった。これに対して、特許文献 1に、表面プラズモン共鳴の原理を 用いると、金属特に金の箔'板又は微粒子の表面に付着させた細胞への細胞外から の刺激に反応して起こる変化を、細胞に標識などの操作を加えることなく検出するこ とができることが開示されている。
[0003] このようなプラズモン共鳴法を利用した方法で生細胞の応答を検出するためには、 細胞の少なくとも一部が金板表面上の数百ナノメートル以内に位置していることが必 要であり、細胞がセンサーに使われる金板表面に接着していることが望ましい。しか し付着性の細胞であれば通常の金板表面にも自ら付着して固定されるが、浮遊性の 細胞の場合には何らかの固定ィ匕の方法が必要である。浮遊性の細胞を固相に固定 化する方法としては、遠心力を利用して細胞を固相に押しつけながら乾燥する方法、 有機溶媒により細胞膜脂質を溶解して蛋白成分を変成、吸着させる方法などがある 力 これらの技術では、いずれも細胞の生理的な膜構造を破壊するため、細胞固定 化後は起きた細胞の反応を観察することができない。一方、細胞表面上に露出して いる特定の蛋白質、糖鎖などよりなる分子 (抗原)を、抗体などの特異的結合物質を 介して金板表面に固定ィ匕すると、細胞を生きたまま固定ィ匕することはできるが、細胞 表面分子は固相に固定ィ匕するとしばしばそれだけで細胞内に信号を伝達してしまう ため、目的とする刺激に対する細胞応答の解析ができなくなるおそれがある。また、 細胞によっては適当な細胞表面分子が見つ力 ないものもあり、細胞を確実に固定 化できない場合がある。
[0004] この生細胞の固定ィ匕の問題に対し、例えば、特許文献 2に、生細胞を固定する測 定チップにリンパ球を固定ィ匕するに当たって、細胞と測定チップの間に適当なスぺー サを用いて細胞を固定する方法が示されている。この場合のスぺーサとしては、例え ば、ポリ- L-リジンがある。測定チップにポリ- L-リジンを塗布しておき、そこに、細胞を 乗せることにより固定する方法が開示されて!、る。
[0005] 特許文献 1：特開 2002-85089号公報
特許文献 2：特開 2004-305095号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] しかしながら、このポリ- L-リジンはバイオコートとして広く知られて!/、るように、一定 の固定ィ匕能を有することが知られて 、るが、ポリアミノ酸力も成る高分子を用いて 、る ため細胞自体に意図しない刺激を与える場合がある。また、その細胞固定ィ匕の機序 は明らかにされておらず、金属表面上の高分子構造も不明であるため、高密度かつ 均一な固定ィ匕を行うには問題がある。このため、生細胞を固定ィ匕するにおいて、ポリ- L-リジンと同等以上の生細胞接着性を有するとともに、生細胞が発現する機能に与 える影響の少ない、安定かつ再現性に優れた生細胞の固定ィ匕法が求められている。
[0007] 本発明は、上記のような問題点に鑑み、生細胞を金属等の表面に固定するための 生細胞固定ィ匕法に係り、特にプラズモン共鳴を利用した生細胞の活性化機能を評価 するのに好適で、安定かつ再現性に優れた生細胞固定ィ匕法を提供することを目的と する。また、その生細胞固定ィ匕法を利用した生細胞活性化機能測定センサーを提供 することを目的とする。
課題を解決するための手段 [0008] 本発明に係る生細胞固定ィ匕法は、チオール基及びアミノ基をもつ有機化合物、ま たは、ジスルフイド基及びアミノ基をもつ有機化合物カゝらなる生細胞固定ィ匕材を介し て生細胞を固相表面に固定ィ匕する。
[0009] 上記発明において、生細胞の固定は、生理環境下において行うのがよい。固相表 面は、チオール基又はジスルフイド基と親和性のある金属表面であるのがよぐ特に、 金膜又は金ナノ粒子であるのが好まし 、。
[0010] 有機化合物は、アミノアルカンチオール、その二分子が結合したジスルフイド型化 合物であるのがよい。
[0011] また、上記生細胞固定ィ匕材は、付着性の生細胞にもリンパ球などの非付着性の生 細胞にも適用することができ、培養器固相から脱離させた付着性の生細胞にも適用 できる。
[0012] このような生細胞固定ィ匕法を利用することにより、生細胞の活性化機能の評価を行 うのに好適な以下のような生細胞活性化機能測定センサーを構成することができる。 すなわち、その生細胞活性化機能測定センサーは、端面に金ナノ粒子を付着させた 光ファイバ一と、該金ナノ粒子表面に固定されたアミノアルカンチオール又はその二 分子が結合したジスルフイド型化合物力 なる生細胞固定ィ匕材と、該生細胞固定ィ匕 材に固定された生細胞と、を有してなる。
[0013] また、生細胞活性化機能測定センサーは、先端部分に光ファイバ一コアを露出さ せた光ファイバ一の該光ファイバ一コア露出部の端面に光反射材が設けられるととも に外周部分が金膜で覆われた光ファイバ一と、該金膜表面に固定されたアミノアルカ ンチオール又はその二分子が結合したジスルフイド型化合物力 なる生細胞固定ィ匕 材と、該生細胞固定ィ匕材に固定された生細胞と、を有してなるものとすることができる 発明の効果
[0014] 本発明に係る生細胞固定ィ匕法は、特に金、銀、銅等の金属板や金属ナノ粒子等の 表面に生細胞を付着させ、その細胞の機能を評価するのに好適で、安定かつ再現 性に優れている。また、本発明に係る生細胞活性化機能測定センサーは、少ない生 細胞試料で生細胞の機能を効果的に調べることができる。 図面の簡単な説明
[図 1]本発明に係る生細胞活性化機能測定センサーの構成を示す模式図である。
[図 2]本発明に係る他の実施例の生細胞活性化機能測定センサーの模式図である。
[図 3]実施例 3〜5の試験に用いた生細胞の活性化機能を測定するセンサー部分の 模式図である。
[図 4]金板にシステアミン膜を形成してヒト末梢血好塩基球を固定ィ匕し、ヒト末梢血好 塩基球の細胞機能を測定した試験結果を示すグラフである。
[図 5]図 4において、異なる人のヒト末梢血好塩基球を用いて試験した場合の試験結 果を示すグラフである。
[図 6]金板にシステアミン膜を形成して B細胞株を固定ィ匕し、 PMAによる刺激を行った 場合の B細胞株の細胞機能を測定した試験結果を示すグラフである。
[図 7]金板にシステアミン膜を形成して B細胞株を固定ィ匕し、 SPR装置上で灌流後回 収したチップ上に残存する B細胞株の顕微鏡写真である。
[図 8]図 7においてシステアミンを使用せず同様の処理で作製したチップ上に B細胞 株を固定ィ匕し、 SPR装置上で灌流後回収したチップ上に残存する B細胞株の顕微鏡 写真である。
[図 9]金板にシスタミン膜を形成してヒト末梢血好塩基球を固定ィ匕し、ヒト末梢血好塩 基球の細胞機能を測定した試験結果を示すグラフである。
[図 10]図 1に示す生細胞活性化機能測定センサーを用いてヒト好塩基球の活性化機 能評価試験を行った場合で、ヒト好塩基球をダニ抗原で刺激したときの変化状態を 示すグラフである。
[図 11]図 10の対照試験の場合のヒト好塩基球の変化状態を示すグラフである。
[図 12]図 2に示す生細胞活性化機能測定センサーを用いて RBL-2H3細胞の活性ィ匕 機能評価試験を行った場合で、 RBL-2H3細胞を DNP-HSAで刺激したときの変化状 態を示すグラフである。
[図 13]図 12の抗原刺激の代わりに対照液を用 、た対照試験の場合の RBL-2H3細 胞の変化状態を示すグラフである。
[図 14]図 12の RBL-2H3細胞を固定して!/ヽな 、センサーを用 、て DNP-HSAで抗原刺 激をした比較試験の場合の RBL-2H3細胞の変化状態を示すグラフである。
符号の説明
[0016] 10 光ファイバ一
11 光ファイバ一コア
12 クラッド、
13 金ナノ粒子
14 金膜
15 光反射材
17 測定チップ
18 プリズム
20 生細胞固定化材
100、 101 生細胞活性化機能測定センサー
発明を実施するための最良の形態
[0017] 以下、本発明に係る生細胞固定ィ匕法について説明する。本発明に係る生細胞固 定化法は、チオール基及びアミノ基をもつ有機化合物、または、ジスルフイド基及び アミノ基をもつ有機化合物力 なる生細胞固定ィ匕材を介して生細胞を固相表面に固 定化する。すなわち、本発明は、生細胞を固相表面に固定ィ匕するのに、チオール基 及びアミノ基を有する有機化合物、または、ジスルフイド基及びアミノ基を有する有機 化合物からなる生細胞固定ィ匕材を用いる。
[0018] 生細胞を固定ィ匕する固相表面の材質は、チオール基及びジスルフイド基と親和性 があるものであれば特に問わない。しかしながら、以下に説明するように、本発明に おいては、金、銀、銅等の金属、特に金がよい。また、プラズモン共鳴を利用するた めに、それらの形態は、箔'板又はナノ粒子状のものであるのがよい。なお、箔'板と は、ガラスやプラスチックスにそれらの金属を蒸着又はスパッタリングした膜状のもの であってもよい。
[0019] 上述のように本発明は、チオール基、または、ジスルフイド基を有する有機化合物 力もなる生細胞固定ィ匕材を用いる。これにより、チオール基又はジスルフイド基に基 づき、例えば、金又は銀表面には Au-S又は Ag-S結合による有機化合物との強固な 結合を生ずるとともに、有機化合物を構成する分子同士間に作用するファン 'デル- ワールス力に基づき有機化合物の分子が均一に配列されたいわゆる自己組織化単 分子膜を金又は銀表面上に容易に形成することができる。
[0020] また、本発明に用いる生細胞固定ィ匕材はアミノ基を有する有機化合物力もなる。こ れにより、生細胞表面はその表面に普遍的に存在する糖タンパク質糖鎖のシアル酸 あるいはリン脂質により負に荷電して 、るから、ァミノ基の有する正の荷電との電気的 引力により生細胞は当該有機物に容易に固着される。この固着は電気的な引力に基 づくから、生細胞を変性させることもなく傷害を起こすこともない。従って、本発明に係 る生細胞固定化法を用いることにより、適当な生理環境下にお 、た生細胞について 、生きた状態でかつ生体内の状態に近い状態でプラズモン共鳴を利用した細胞機 能評価を行うことができる。
[0021] このような有機化合物は、固相表面と結合しやすいチオール基またはジスルフイド 基をもち、また生細胞と結合しやすいアミノ基を有する有機化合物力もなるものであ ればよい。有機化合物は、アミノアルカンチオール、その二分子が結合したジスルフ イド型化合物又はこれらの塩化物、臭化物等の塩から調製することができる。具体的 には、有機化合物は、アミノアルカンチオールに属するシステアミン (2-アミノエタン- 1 -チオール）、 6-ァミノ- 1-へキサンチオール、 8-ァミノ- 1-オクタンチオールの塩化物 から、また、アミノアルカンチオールの二分子が結合したジスルフイド型化合物に属す るシスタミン (2、 2'-ジスルファンジィルビス (ェチルァミン)）の塩化物から調製すること ができる。
[0022] 以上本発明に係る生細胞固定ィ匕法について説明した。本生細胞固定ィ匕法は、以 下に説明する生細胞活性化機能測定センサーに利用することができ、これにより、多 くの生細胞力 発現される平均的な機能状態ではなぐ生細胞力 発現される機能 状態が直接的に測定できるようになる。また、少ない生細胞試料であってもその機能 状態を調べることができる。
[0023] 本生細胞活性化機能測定センサー 100は、図 1に示すように、端面に金ナノ粒子 13 を付着させた光ファイバ一 10と、金ナノ粒子 13の表面に固定されたアミノアルカンチ オール又はその二分子が結合したジスルフイド型化合物からなる生細胞固定ィヒ材 20 と、生細胞固定化材 20に固定された生細胞 30と、を有してなる。
[0024] 光ファイバ一 10は、光ファイバ一コア 11とその外周を覆うクラッド 12を有しており、公 知の光ファイバ一を用いることができる。金ナノ粒子 13は公知のものを用いることがで きる。金ナノ粒子 13の形状は球形のものが好適で、サイズは 100〜10nmのものがよい 力 矩形、ロッド状、多角形などの粒子も必要に応じて利用することができる。
[0025] 生細胞固定ィ匕材 20は、アミノアルカンチオール、その二分子が結合したジスルフィ ド型化合物又はこれらの塩力 調製することができる。この生細胞固定ィ匕材 20により 、生細胞の活性化機能を測定するのに好適な状態で金ナノ粒子に生細胞を固定ィ匕 させることがでさる。
[0026] 生細胞 30は、特定の刺激剤（物）によって細胞の応答が引き起こされるものであれ ば、組織から分離した細胞、初代培養細胞、細胞株、遺伝子組み替え体発現細胞等 々でよぐ特に限定されない。例えば、ヒト好塩基球、 Ramos細胞（B細胞株）、 Rat Bas ophilic Leukemia細胞（RBL-2H3)を用いることができる。
[0027] 本発明に係る生細胞活性化機能測定センサーは、図 2に示す構造のものであって もよい。この生細胞活性化機能測定センサー 101は、先端部分に光ファイバ一コア 11 を露出させた光ファイバ一 10の光ファイバ一コア露出部の端面に光反射材 15が設け られるとともに外周部分が金膜 14で覆われた光ファイバ一 10と、金膜 14の表面に固 定されたアミノアルカンチオール又はその二分子が結合したジスルフイド型化合物か らなる生細胞固定化材 20と、生細胞固定化材 20に固定された生細胞 30と、を有して なる。
[0028] この生細胞活性化機能測定センサー 101において、光ファイバ一コア露出部の端 面に光反射材 15が設けられるとともに外周部分が金膜 14で覆われた光ファイバ一 10 は公知のものを用いることができる。
実施例 1
[0029] 本発明に係る細胞固定ィ匕法を用いて生細胞を、金を蒸着したガラス基板からなる 測定チップに固定ィ匕し、表面プラズモン共鳴を利用した測定装置 (SPR装置）により 生細胞の活性化機能を測定する試験を行った。図 3に示すように、生細胞 30は、生 細胞固定ィ匕材 20を介して測定チップ 17の金を蒸着した金膜 14上面に固定化されて いる。生細胞 30の活性化機能は、プリズム 18に図 3の矢印で示すレーザ光を照射し、 その反射光を解析することによって行われる。測定チップ 17、プリズム 18及び SPR装 置は、株式会社モリテックス社製 SPR— CELLIAに付属するものを用いた。生細胞 30 はヒト末梢血好塩基球を用いた。
[0030] 生細胞固定ィ匕材 20は、金膜 14面上にシステアミン膜を形成することによって構成し た。すなわち、まず、測定チップ 17をアセトン中で 10分間超音波洗浄を行った上、 Sig ma ALDRICH Co.製システアミンを最終濃度 ImMになるように純水またはエタノール で溶解した。つぎに、測定チップ 17をシステアミン溶液に浸し、 30分間振とうした後、 純水により 3回洗浄した。これにより、システアミン単分子長の厚さで表面に陽性荷電 をもつシステアミン膜が測定チップ 17の金膜 14面上に形成された。
[0031] そして、以下のように、上記生細胞固定化材 20を介してヒト末梢血好塩基球の測定 チップ 17への固定ィ匕を行った。まず、ヒト末梢血好塩基球の調製を行った。すなわち 、ヒト肘静脈血 14mlを EDTA/2Naと混和した後、 14ml平衡塩類溶液（Balanced salt sol ution) (D— glucose 0.01%、 CaCl 5 M、 MgCl 98uM、 KC1 540 μ Tris 14.5mM、
2 2
NaCl 126mM、 PH7.6) 14mlをカ卩えて混合した。この混合液を 14mlずつ 10ml FicolK Amersham Bioscience社製）に重層し 400g、 20°C、 40minで比重遠沈を行い、好塩基 球を含む画分を得た。
[0032] つぎに、この得られた画分から Miltenyi Biotec社製の Basophil Isolation kitを用いて 、好塩基球の割合の高い細胞浮遊液を調製した。すなわち、得られた画分に FcR bio eking Reagent 50 μ 1をカ卩えて Fcレセプターのブロッキングを行った上、これに 100 μ 1 Hapten-Antibody Cocktailをカ卩え、 10°Cで 10分静置した。つぎに、 650プランニング バッファー（2mM EDTA含有 PBS)、 100 1 MACS Anti— Hapten Micro Beadsを加え 1 0°Cで 15分静置した後、 Miltenyi Biotec社製の Auto-MACSによりネガティブセレクシ ヨンにかけて好塩基球の割合の高 、細胞浮遊液を得た。これにより得られた細胞浮 遊液に、細胞懸濁用緩衝液（NaCl 0.14M、 KC1 2.7 ,u M, NaH PO 0.46mM、 HEPE
2 4
S 10mM、 ブドウ糖 (glucose) 5.6mM、 ヒト血清アルブミン (HSA) 0.03%、 PH7.4)をカロえ 、好塩基球の割合が 1 X 106/mlの濃度になるように調整した。
[0033] そして、このように調製された好塩基球の細胞懸濁液 100 μ 1を、上記のように、シス テアミン膜を形成した測定チップ 17の金膜 14上にスポット状に乗せ 15分静置し、その 後測定チップ 17を細胞懸濁用緩衝液 100 1で洗浄して金膜 14に固化されな力つた 余剰の細胞を除き、ヒト末梢血好塩基球が固定化された測定チップ 17を作製した。
[0034] このように作製された測定チップ 17を SPR装置の測定部に装着し、流速 10 μ 1で細 胞懸濁用緩衝液による灌流を行った後、細胞懸濁用緩衝液の流路を切り換え、測定 チップ部に BETHYL社製抗ヒト -IgE抗体 (300ng/ml)を約 6分間灌流した。その後、再 度細胞懸濁用緩衝液に切り替えて灌流を継続させた状態で SPR装置による測定を行 つた o
[0035] 図 4及び 5に、上記 SPR装置により測定した結果を示す。図 4は血液提供者 Aの結 果であり、図 5は血液提供者 Bの結果である。図 4及び 5において、横軸は測定開始 後の経過時間を示し、縦軸は、共鳴角を示す。実線は抗ヒト IgE抗体を灌流して細 胞を刺激した場合のシグナルの変化曲線 (Anti-IgE)を示す。破線は抗ヒト -IgE抗体 を灌流させず細胞懸濁用緩衝液のみを灌流した対照試料の場合のシグナルの変化 曲線 (Buffer)を示す。太い横線は、抗ヒト -IgE抗体を灌流させた時間を示す。
[0036] 図 4及び 5によると、抗ヒト -IgE抗体を灌流した場合は、ともに、数分以内に細胞の 活性ィ匕を示すシグナル (Anti-IgE曲線の急上昇以降部分)が観測された。しかし、抗 ヒト -IgE抗体を灌流しなかった対照試料の場合は、ほとんどシグナルの変化は認めら れなかった。
実施例 2
[0037] 実施例 1と同様に、測定チップ 17の金膜 14面上にシステアミン膜を形成し、これに R amos細胞（B細胞株）を固定化し、 PMA (フオルボール- 12ミリステート- 13アセテート（ phorbol 12 myristate 13-acetate) )による刺激を行った場合の B細胞株の応答を上記 の SPR装置を用いて測定した。 B細胞株の測定チップ 17の金膜 14上への固定ィ匕は以 下のように行った。すなわち、実施例 1と同様な方法で作製したシステアミン膜上に上 記細胞懸濁液または HEPES緩衝液（HEPES 20mM、 NaCl 120mM、 CaCl 2mM、
2
MgCl lmM、 ブドウ糖 5mM)で 1 X 106/mlの濃度に調整した Ramos細胞（B細胞株） 10
2
0 1をスポット状に乗せ 15分静置したのち、細胞懸濁用緩衝液 100 1で洗浄し、固 定されなかった余剰の細胞を除いて、 B細胞株を測定チップ 17の金膜 14上に固定ィ匕 した。
[0038] このように B細胞株を固定ィ匕した測定チップ 17を SPR装置測定部に装着し、まず、流 速 10 1で細胞懸濁用緩衝液による灌流を行った。つぎに、 Calbiochem社製の PMA を約 6分間灌流して B細胞株の刺激を行った後、再度細胞懸濁用緩衝液による灌流 を行うことにより、 SPR装置による測定を行った。なお、対照試料として、システアミン 処理をして 、な 、試料にっ 、ても同様に試験をした。
[0039] 図 6に、 SPR装置により測定した結果を示す。図 6において、横軸は測定開始後の 経過時間を示し、縦軸は、共鳴角を示す。太い横線は、 PMAを灌流させた時間を示 す。図 6によると、測定チップ 17上に PMAを灌流して B細胞株を刺激するとシグナル は大きく変化することが分かる。一方、対照試料の方は測定不可能であった。 B細胞 株の固定処理後に測定チップ 17を上記 SPR装置に設置して細胞懸濁用緩衝液を灌 流した後回収し、光学顕微鏡下 (倍率 100倍)で観察したところ、図 7に示すように、シ ステアミン処理をした金板表面上には固定ィ匕された B細胞株 (粒状に観察されるもの )が数多く確認された。しかし、システアミンを用いなカゝつた対照試料では、図 8に示 すように、ほとんど B細胞株を認めることはできな力つた。
実施例 3
[0040] 図 9は、実施例 1と同様に、測定チップ 17の金膜 14上にシスタミン膜を形成し、ヒト末 梢血好塩基球を固定ィ匕したものに、抗ヒト -IgE抗体 (300ng/ml)を約 6分間灌流して刺 激を行った場合の試験結果を示す。この試験は、以下のシスタミン膜の形成を除い て実施例 1の場合の条件と同等の条件で試験を行った。金膜 14上へのシスタミン膜 の形成は以下のように行った。まず、測定チップ 17をアセトン中で 10分間超音波洗浄 を行った上、 Sigma ALDRICH Co.製シスタミンを最終濃度 ImMになるように純水また はエタノールで溶解した。つぎに、測定チップ 17をシスタミン溶液に浸し、 30分間振と うした後、純水により 3回洗浄した。これにより、シスタミンのジスルフイド基部で金膜 14 上に結合し表面に陽性荷電をもつシスタミン膜が測定チップ 17の金板面上に形成さ れた。
[0041] つぎに、実施例 1と同様にして調製された血液提供者 Cの好塩基球懸濁液 100 μ 1を 、既にシスタミン膜を形成した測定チップ 17の金板上にスポット状に乗せ 15分静置し た。その後、細胞懸濁用緩衝液 100 1で洗浄し、金板に固定ィ匕されな力つた余剰の 細胞を除いた後、その測定チップ 17を上記 SPR装置の測定部に装着した。 SPR装置 による測定は、まず、流速 10 1で細胞懸濁用緩衝液による灌流を行った後、細胞懸 濁用緩衝液の流路を切り換え、測定チップ部に BETHYL社製抗ヒト -IgE抗体 (300ng/ ml)を約 6分間灌流したうえで、再度細胞懸濁用緩衝液に切り替えて灌流を継続する ことにより行った。
[0042] 図 9において、横軸は測定開始後の経過時間を示し、縦軸は、共鳴角を示す。太 い横線は、抗ヒト -IgE抗体を灌流させた時間を示す。実線は抗ヒト -IgE抗体の灌流を 行った場合のシグナルの変化曲線 (Anti-IgE)を示し、破線は、抗ヒト -IgE抗体の灌 流を行わなカゝつた対照試料の場合のシグナルの変化曲線 (Buffer)を示す。
図 9によると、抗ヒト -IgE抗体を灌流した場合は数分以内に細胞の活性ィ匕を示すシグ ナルが観測される力 抗ヒト -IgE抗体を灌流しなカゝつた対照試料の場合は、ほとんど シグナルの変化が認められないことが分かる。これにより、抗ヒト -IgE抗体に特異的な 好塩基球の刺激応答状態を調べることができることが分かる。
実施例 4
[0043] 生細胞 30がヒト好塩基球力 構成される生細胞活性化機能測定センサー 100を用 V、てヒト好塩基球の活性化機能評価試験を行った。生細胞活性化機能測定センサ 一 100において、光ファイバ一 10は、住友電気工業株式会社製のコア φ 50Zクラッド φ 125 μ mの SCコネクタ付光ファイバ一を用い、その平均粗さが 0.05〜0.1 μ mの端面 に以下のように金ナノ粒子 13を付着させた。すなわち、光ファイバ一 10の先端部をァ セトンに浸漬し 5分間静置させた後、光ファイバ一 10の先端部を硫酸と過酸ィ匕水素 (3 :1)溶液に浸漬し、 15分間静置した。つぎに、光ファイバ一 10の先端部を蒸留水、エタ ノールで洗浄した後、 10%3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)Zエタノール溶液に 浸し、エタノールで 2回、蒸留水で 1回洗浄した後、 BBI社製 60nmの金ナノ粒子液（50 0 ^ 1)に浸し、ー晚静置することにより、先端部に金ナノ粒子 13を付着させた光フアイ バー 10を作製した。
[0044] つぎに、以下のように 8-ァミノ- 1-オクタンチオール力 なる生細胞固定ィ匕材 20を金 ナノ粒子 13の表面に固定し、さらに、その生細胞固定ィ匕材 20にヒト好塩基球力もなる 生細胞 30を固定化させた。すなわち、上記のように金ナノ粒子を固定化させた光ファ ィバーの先端部を ImMの 8-ァミノオクタン- 1-チオールのエタノール溶液（lmL)に浸 漬し、その後、ヒト好塩基球を 2 X 106 Cell/mlの濃度で懸濁させた細胞懸濁用緩衝液 力も約 30 1の細胞懸濁液をプラスチック板上に乗せ、プラスチック板ごと反転して懸 濁液を懸垂し、この液滴の下端にファイバー先端を差し込んで室温で 20分間静置し た。ヒト好塩基球が生細胞固定ィ匕材 20に固定化されていることはデジタルカメラを装 備した倒立顕微鏡下で確認した。
[0045] このようにヒト好塩基球が固定された生細胞活性化機能測定センサー 100を用いて 、ヒト好塩基球がダニ抗原で抗原刺激された場合と、ダニ抗原のない対照液を用い た (対照試験)の場合のヒト好塩基球の応答状態を調べた。ヒト好塩基球の抗原刺激 は、生細胞活性化機能測定センサー 100をシャーレ（ φ 10cm)の中の細胞懸濁用緩 衝液 20mlに浸し、 Bayer Corporation製ダニ抗原エキス（40 AU/ml) 500 μ 1を添カ卩して 行った。ヒト好塩基球の応答状態の測定は、光源 (Ocean Optics,Inc.製 LED-518)、力 プフ ~~ (Newport し orporation製 Newport— 125 μ m)、ファ z ~~ 、光 ¾ ucean Optics, Inc.製 HR2000)からなる測定装置において、カプラーを経由して得られる波長 530nm の散乱光強度をファイバー分光器で測定し、これを解析ソフト (Ocean Opticsjn 製 0 OIBase32)でモニターすることにより行った。
[0046] 図 10及び 11に試験結果を示す。図 10はヒト好塩基球をダニ抗原で抗原刺激を行 つた場合、図 11は対照試験の場合の試験結果である。図 10及び 11において、横軸 は測定後の経過時間を示し、縦軸は波長 530nmの散乱光の強度を示す。図中の矢 印は、ダニ抗原エキス（図 10)および対照液（図 11)の添カ卩開始時を示す。図 10によ ると、ヒト好塩基球を抗原刺激した場合は、強度は測定経過後直線的に増加している ことが分かる。これに対し、対照試験の場合は、図 11に示すように、強度は何ら変化 していないことが分かる。
実施例 5
[0047] 生細胞 30が RBL-2H3細胞力も構成される活性化機能測定センサー 101を用いて、 RBL-2H3細胞の活性化機能評価試験を行った。生細胞活性化機能測定センサー 1 01は以下のように作製した。光ファイバ一 10は、ソーラボジャパン株式会社製コネクタ 付光ファイバ一（光ファイバ一コア径 200 μ m、榭脂クラッド 230 μ m)を用い、その先端 部に露出させた長さ lcmの光ファイバ一コアの端面に、アルミニウムをスパッタリングし 厚さ 300nm以上の光反射材 15を形成し、外周部に金をスパッタリングし厚さ 50 ±5nm の金膜 14を形成した。
[0048] なお、アルミニウムのスパッタリングは、チャンバ一内をターボ分子ポンプで 8 X 10 Paまで真空引き後、 1"ガス流量が標準状態で0.051/½ （5(^(^)、301112真空度が3？ aの条件で 1時間行った。金のスパッタリングは、チャンバ一内をターボ分子ポンプで 8 X 10— 5Paまで真空引き後、 Arガス流量が標準状態で 0.051/min、 schlz真空度が 3Pa の条件で 2分 40秒間行った。
[0049] このように作製した光ファイバ一の先端部を、 ImMの 8-ァミノオクタン- 1-チオール のエタノール溶液（lmL)中に浸漬して 8-ァミノオクタン- 1-チオールを金膜 14の表面 に固定させて生細胞固定ィ匕材 20を形成した。つぎに、光ファイバ一の先端部を蒸留 水で 1回洗浄した後、予め作製した RBL-2H3細胞の細胞懸濁液約 380 1をプラスチ ックチューブ蓋部に入れて反転し、液面を懸垂した液部下部に光ファイバ一先端部 を差し込んで室温で 20分間静置して RBL-2H3細胞を 8-ァミノオクタン- 1-チオールに 固定させ、生細胞 30を生細胞固定化材 20に固定した生細胞活性化機能測定センサ 一 101を作製した。 RBL-2H3細胞が生細胞固定ィ匕材 20に固定ィ匕されていることはデ ジタルカメラを装備した倒立顕微鏡下で確認した。
[0050] なお、 RBL- 2H3細胞の細胞懸濁液は以下のように作製した。まず、実験前日に、 R BL- 2H3細胞を RPMI1640組織培養液 (Invitrogen Corporation製)に 4 X 105cells/mlの 濃度で懸濁させ、さらにその細胞懸濁液に 50ng/mlなる様に Anti-DNP IgE (Sigma A LDRICH Co.製）を感作させ、 HydroCelKCelSeed社製）に 3ml入れ、ー晚培養を行つ た。つぎに、この細胞懸濁液に RBL- 2H3細胞を 2 X 106cell/mlの濃度で Siraganianバ ッファー（25mM PIPES (pH7.2)、 159mM NaCl、 5mM KC1、 0.4mM MgCl
2、 ImM CaCl
2
、 lmg/ml glucose, and 0.1%BSA)に懸濁させて RBL-2H3細胞の細胞懸濁液を作製し た。
[0051] このように作製した生細胞活性化機能測定センサー 101をシャーレ（ φ 10cm)の中 のバッファー 4.5mlに浸して Sigma ALDRICH Co.製 dinitrophenol conjugated Human Serum Alubumin (DNP-HS A) (500 ng/ml)500 μ 1を添加し (最終濃度 50ng/ml)、 RBL-2 H3細胞の抗原刺激を行った場合と、 DNP-HSAを添加しな力つた対照試験の場合の RBL-2H3細胞の応答状態を調べた。また、生細胞 30が固定させていないセンサー（ 生細胞 30が固定されていない点を除けば生細胞活性化機能測定センサー 101と同じ 構成のセンサー）を用いて RBL-2H3細胞の応答状態を調べる比較試験も行った。
[0052] 測定装置は、光源（Ocean Optics,Inc.社製 LS- 1)、カプラー (Opt- Link社製、 φ 200 /230 μ m),ファイバー分光器（Ocean Optics,Inc.社製 HR2000)からなり、カプラーの ファイバー先端には SCコネクタを介して生細胞活性化機能測定センサー 101を構成 した光ファイバ一を結合させたものを用いた。細胞応答の解析は、生細胞活性化機 能測定センサー 101から反射してカプラーを経由して得られる戻り光の吸収スぺタト ルの変化を分光器で測定し、光強度の最大吸収を示す光波長の変化を経時的にモ -ターすることにより行った。モニターには Ocean Optics,Inc.社製解析ソフト OOIBase 32を用いた。
[0053] 図 12〜 14に試験結果を示す。図 12は、 RBL-2H3細胞を DNP-HSAで抗原刺激を 行った場合、図 13は抗原刺激の代わりに対照液を用いた対照試験の場合、図 14は RBL-2H3細胞を固定して ヽな 、センサーを用いて DNP-HSAで抗原刺激をした比較 試験の場合を示す。図 12〜14において、横軸は試験の経過時間、縦軸は測定され る光強度の最大吸収を示す波長を表す。図中の矢印は、 DNP-HSA (図 12、図 14) および対照液（図 13)の添加開始時を示す。
[0054] 図 12によると、 DNP-HSAの添カ卩開始後、最大吸収を示す波長は次第に長波長側 にシフトし、 DNP-HSAの添カ卩開始後 600sec (経過時間 800sec)以降では最大吸収を 示す波長のシフトは顕著になることが分かる。一方、図 13によると、抗原刺激を行わ ない対照試験の場合は、何ら有意な変化が見られないことが分かる。同様に図 14に よると、細胞を固定していない比較試験の場合でも、 DNP-HSAの添カ卩開始後も何ら 有意な変化が見られな 、ことが分力る。

Claims

請求の範囲
[1] チオール基及びアミノ基をもつ有機化合物、または、ジスルフイド基及びアミノ基を もつ有機化合物からなる生細胞固定ィ匕材を介して生細胞を固相表面に固定ィ匕する 生細胞固定化法。
[2] 生細胞を生理環境下において固定ィ匕する請求項 1に記載の生細胞固定ィ匕法。
[3] 固相表面は、チオール基又はジスルフイド基と親和性のある金属表面であることを 特徴とする請求項 1又は 2に記載の生細胞固定化法。
[4] 固相表面は、金膜又は金ナノ粒子であることを特徴とする請求項 1〜3のいずれか に記載の生細胞固定ィ匕法。
[5] 有機化合物は、アミノアルカンチオール、その二分子が結合したジスルフイド型化 合物であることを特徴とする請求項 1〜4のいずれかに記載の生細胞固定ィ匕法。
[6] 生細胞は、付着性細胞又は非付着性細胞であることを特徴とする請求項 1〜5のい ずれかに記載の生細胞固定化法。
[7] 生細胞は、付着性細胞を培養器固相から脱離させた生細胞であることを特徴とする 請求項 1〜6のいずれかに記載の生細胞固定ィ匕法。
[8] 端面に金ナノ粒子を付着させた光ファイバ一と、該金ナノ粒子表面に固定されたァ ミノアルカンチオール又はその二分子が結合したジスルフイド型化合物力 なる生細 胞固定化材と、該生細胞固定化材に固定された生細胞と、を有してなる生細胞活性 ィ匕機能測定センサー。
[9] 先端部分に光ファイバ一コアを露出させた光ファイバ一の該光ファイバ一コア露出 部の端面に光反射材が設けられるとともに外周部分が金膜で覆われた光ファイバ一 と、該金膜表面に固定されたアミノアルカンチオール又はその二分子が結合したジス ルフイド型化合物からなる生細胞固定化材と、該生細胞固定化材に固定された生細 胞と、を有してなる生細胞活性化機能測定センサー。
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