WO2006022277A1

WO2006022277A1 - 表面プラズモン共鳴分析における解離定数の算出方法

Info

Publication number: WO2006022277A1
Application number: PCT/JP2005/015318
Authority: WO
Inventors: Koji Kuruma; Hirohiko Tsuzuki
Original assignee: Fujifilm Corporation
Priority date: 2004-08-24
Filing date: 2005-08-24
Publication date: 2006-03-02
Also published as: US7602495B2; US20080037023A1; JPWO2006022277A1; EP1795886A1; EP1795886A4; JP4664298B2

Abstract

　本発明の目的は、表面プラズモン共鳴における金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数の算出を、ノイズレベル（参照チップのノイズ幅）が低く、かつベースライン変動（参照チップの信号変化）が小さく、信頼性の高い測定結果を得ることができる分析方法において実現することである。本発明によれば、金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、金属膜面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法において、信号変化の測定結果から、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出する方法が提供される。

Description

明細書

表面プラズモン共鳴分析における解離定数の算出方法

技術分野

[0001] 本発明は、表面プラズモン共鳴分析において、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出する方法に関する。

背景技術

[0002] 現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなぐ測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴 (SPR)測定技術、水晶発振子マイクロバランス (QCM)測定技術、金のコロイド粒子力ゝら超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。 SPR測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。 QCM測定技術は水晶発振子の金電極 (デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、 ngレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子 (nmレベル)表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列力生体関連物質の検出ができる。以下、当技術分野で最も使われている表面ブラズモン共鳴 (SPR)について説明する。

[0003] 一般に使用される測定チップは、透明基板 (例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定ィ匕できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。上記したような分析を行なうための表面プラズモン共鳴測定装置としては、例えば、特開 2001— 330560号公報に記載の装置などが挙げられる。

[0004] 該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定する際、一般的には、被験物質と相互作用する生理活性物質を結合して!/、な、参照セルと、被験物質と相互作用する生理活性物質を結合した検出セルとを直列に連結して流路系内に設置し、該参照セルと該検出セルに液体を流すことによって、結合反応の測定を行なう。また、測定の際には、前記流路系内の液体を、測定すべき被験物質を含有しない対照液体から、測定すべき被験物質を含有する試料液体へと交換することによって、生理活性物質と被験物質との結合反応を開始させ、時間の経過による信号変化を測定する方法が一般的である。

[0005] 一方、上記したような SPRを用いたバイオセンサーにおいては、測定物のセンサー

(金属膜 +リガンド)へのアナライト結合を屈折率変化 (およびそれに伴う暗線角度変動）として検出する。横軸を時間、縦軸に結合信号をプロットすると、いわゆる「センサ一グラム」と呼ばれる、信号 (結合量等）の経時変化を得ることができる。そして、センサーグラムに下記式 (i)のような速度方程式をフィッティングし、それから、吸着速度係数 (ka)、離脱速度係数 (kd)等の速度係数を求めることが重要である。

dR/dt = ka X C X [Rmax R (t) ]— kd X R (t) (i)

R(t) = (ka X C X Rmax) /(ka X C + kd) X (1— exp(— kd X C+kd) X t)) (ii) (上記式（i) を解いたもの）

kd :吸着速度係数、 kd :離脱速度係数、 C:アナライト濃度溉知)、 Rmax:理論的最大結合量、 t:時間

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 上記したような流路系内の液体を、測定すべき被験物質を含有しな!、対照液体から、測定すべき被験物質を含有する試料液体へと交換することによって、生理活性物質と被験物質との結合反応を開始させ、時間の経過による信号変化を測定する方法においては、測定時間内における参照セルの信号変化のノイズ幅、及びベースライン変動が問題となり、信頼性の高い結合検出データを取得することは困難であった。上記問題を解消するための手法として、特願 2003— 404040号明細書には、金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、金属膜面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換することで表面プラズモン共鳴の変化を測定する方法であって、前記流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することを特徴とする測定方法が記載されている。このように流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することにより、ノイズレベル (参照チップのノイズ幅）が低ぐかつベースライン変動 (参照チップの信号変化）が小さぐ信頼性の高い測定結果を得ることができる。し力しながら、表面プラズモン共鳴測定装置中の流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法において、得られた信号変化の測定結果力 ka (吸着速度係数）及び kd (離脱速度係数)などの速度定数を求めることについてはこれまでのところ報告がない。即ち、本発明は、表面プラズモン共鳴における金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数の算出を、ノイズレベル (参照チップのノイズ幅）が低ぐかつベースライン変動 (参照チップの信号変化）が小さぐ信頼性の高、測定結果を得ることができる分析方法にぉ、て実現することを解決すべき課題とした。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明者らは、表面プラズモン共鳴測定装置中の流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法においても、得られた信号変化の測定結果カゝら kd (吸着速度係数)及び kd (離脱速度係数)などの速度定数を正確に求めることができることを初めて実証し、本発明を完成するに至った。

[0008] 即ち、本発明によれば、金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、金属膜面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法において、信号変化の測定結果から、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出する方法が提供される。

[0009] 好ましくは、表面プラズモン共鳴の信号変化の測定結果から吸着速度係数 (kd)及び離脱速度係数 (kd)を求め、求めた吸着速度係数 (ka)及び離脱速度係数 (kd)から、 KD = kdZkaで表される式により解離定数 (KD)を算出する。

[0010] 好ましくは、表面プラズモン共鳴の信号変化の測定結果から、下記式（1)、（2)及び（3)を用いることによって吸着速度係数 (ka)及び離脱速度係数 (kd)を求める。 d 0 /dt=kd X c X (1 - 0 ) -kd X θ (1)

(式中、 Θは吸着率（=吸着量 Ζ飽和吸着量)、 kaは吸着速度係数、 kdは離脱速度係数、 cは金属表面近傍の被解析分子の濃度を表す。 )

3 c/ 3 t=D X 3 ²c/ 3 x² (2)

(式中、 Xは金属表面力ゝらの距離、 Dは被解析分子の拡散係数、 cは被解析分子の濃度を表し、 =0のとさじ=じとなる。 )

Θ =R/Rmax (3)

(式中、 Θは吸着率（=吸着量 Z飽和吸着量)を示し、 Rは表面プラズモン信号を示し、 Rmaxは被解析分子が飽和吸着したときの信号を表す。 )

[0011] 好ましくは、前記液体の交換に力かる時間を理想条件での吸着現象とみなして補正することにより解離定数を算出する。

好ましくは、非線形回帰解析を用いて解離定数を算出する。

[0012] 好ましくは、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用いる。

[0013] 好ましくは、前記流路系内の液体を、測定すべき被験物質を含有しな!、対照液体から、測定すべき被験物質を含有する試料液体へと交換し、その後、試料液体の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定する。

[0014] 好ましくは、被験物質と相互作用する物質を結合していない参照セルと、被験物質と相互作用する物質を結合した検出セルとを直列に連結して流路系内に設置し、該参照セルと該検出セルに液体を流す。 [0015] 好ましくは、前記セルの体積 (Vs ml)に対する 1回の測定あたりの液交換量 (Ve ml)の比率 (Ve/Vs)力 ^以上 100以下である。さらに好ましくは、 Ve/Vsが 1以上 50以下である好ましくは、前記流路系内の液体の交換にかかる時間が 0.01秒以上 100秒以下である。

発明を実施するための最良の形態

[0016] 以下、本発明の実施の形態について説明する。

本発明は、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出する方法に関するものである。より具体的には、本発明による解離定数の算出方法は、金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、金属膜面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法にお!、て、信号変化の測定結果から、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出することを特徴とする。

[0017] 本発明の別の観点によれば、金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、金属膜面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法であって、信号変化の測定結果から、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出することを含む、上記した表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法が提供される。

[0018] 被解析分子は金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子へ時間とともに吸着する。この現象は下記式（1)で記述できる。

d 0 /dt=ka X c X (1 - 0 ) -kd X θ (1)

式中、 0は吸着率（=吸着量 Z飽和吸着量)、 kaは吸着速度係数、 kdは離脱速度係数、 cは金属表面近傍の被解析分子の濃度を表す。

ここで、金属表面を定常的に新鮮な液に置換しつづけられる理想的な条件では c は一定となり、簡素な微分方程式を解くことで測定結果から ka、 kdを求めることが可能である。

[0019] し力しながら、金属表面の流れが極めて遅ぐ cを一定に保つには高速に被解析分子溶液を高速に流す必要がある。一方、表面プラズモンは金属表面の流れの乱れが信号に揺らぎを与えること、および高速に流すためには被解析分子を大量に使用することとなる。このため、 Cを一定にすることは実際には不可能である。

[0020] cが一定で無、場合、被解析分子の吸着、離脱による濃度変化は沖合!、からの被解析分子の拡散によって変化する関数となる。このときの拡散は下記式 (2)で表される。

d c/ d t=O X 3 ²c/ 3 x² (2)

[0021] 一方、表面プラズモン信号 R (被解析分子が吸着して、な、ときの表面プラズモン信号との差)は被解析分子表面吸着量に比例することが知られており、下記式 (3)で表される。

Θ =R/Rmax (3)

[0022] 上記式（1) (2)および（3)を用いることで実験により測定した信号から吸着速度係数 ka、離脱速度 kdおよびその比である平衡解離定数 KD ( = kdZka)を求めることが可能となる。

[0023] 以下、具体的な解析方法を示す。

被解析分子を含まない参照溶液力ゝら被解析分子を含む試料溶液への切り替えが、被解析分子の吸着速度より充分速ぐかつ沖合い濃度 C

0が均一な流れが定常的に生じている場合 (以下、理想条件と呼ぶ）は、式（1)で計算することが可能となる。具体的には表面プラズモンの信号変化は式 (4)で表される。

dR/dt = ka X C X (Rmax-R) kd X R (4)

o

[0024] 実験で得られた時間 tにおける信号 Rの変化を式 (4)を用いて非線形回帰分析することで、吸着速度係数 ka、離脱速度係数 kdを求めることができる。ここで、 Rmaxは被解析分子の金属表面への結合状態などを反映するため ka及び kdを同時に求めることが好ましぐ未知数が 3つの非線形回帰分析を行うこととなる。し力しながら、この条件を充足するには溶液の線速度を高める必要があり、表面プラズモン信号が不安定となりノイズが上昇する問題がある。

[0025] 被解析分子を含まな!/ヽ参照溶液から濃度 Cの被解析分子を含む試料溶液への切

0

り替えが被解析分子の吸着速度より充分速ぐかつ液交換後速やかに液が停止する場合 (以下、 Stopped Flow (SF)条件と呼ぶ)は、式（1) (2) (3)で計算することが可能となる。具体的には式（1) (2) (3)は近似的に差分方程式を下記差分方程式に置き換えることが可能である。

[0026] R[t] = (kaXC[0, (t At) ] X (Rmax— R[t— At])— kdXR[t— At]) X At+

R[t- At] (5)

[0027] C[0, t]=DX (C[Ax, (t At)]— C[0, (t At) ]) +C[0, (t—At)]— (kaX

C[0, (t一 At)] X (Rmax— R[t— At])一（kdXR[t— Δ t] ) /Rmax X Sm X At)

[0028] C[nX Δχ, t]=DX (C[(n+1) X Δχ, (t— At) ] +C[ (n— 1) X Δχ, (t— At)]

-2XC[Ax, (t-At)])+C[Ax, (t-At)] (7)

[0029] ここで、 R[t]は時間 tでの表面プラズモン信号を表し、 Atは微小時間を示す。 C[x

, t]は時間 tでの金属表面力距離 X離れた地点の被解析分子の濃度を表し、 Δχは微小距離を示す。また、 Smは被解析分子の飽和吸着量を表す。

[0030] Δχ、 Atが充分小さいとき、式 (5) (6) (7)は式（1) (2) (3)を近似することとなる。このとき、 At時間での被解析分子の拡散が距離 Δχより充分短い必要がある。具体的には下記式 (8)で表される仮拡散係数 Dが 0.01以上 0.5以下である必要があり、

0.05以上 0.45以下であることが好ましい。

[0032] さらに金属表面に接する地点の被解析分子濃度の間 Atで変化する量が充分小さい必要があり、下記式（9)で表される。

(C[0, t+ At]-C[0, t]) くく C[0, t] (9) [0033] 式 (6) (8) (9)から、 Δχは下記式（10)を充足する必要がある。

Δχ << D/(D XSmXka) (10)

M

[0034] ここで、影響度定数 Axを用いて式（10)を下記式（11)のように記述したとき、 Axは 0. 1以下 0.0001以上である必要があり、好ましくは 0.03以下 0.001以上である。 Ax=AxXD/(D XSmXka) (11)

M

[0035] また、通常の測定結果を解析する際には、 kaが未知の状態で計算をすることとなるため、 ka値として予想される最大値より大き、値を代入して Δ Xを決定する必要がある

[0036] 上記式 (4)〜（11)に対して下記式（12)の境界条件を用いることで表面プラズモン信号 R[t]を記述できる。

[0037] SF条件では被解析分子を含まなヽ参照溶液から濃度 Cの被解析分子を含む試

0

料溶液への切り替えが被解析分子の吸着速度より充分速いことを仮定しているが、実際の測定系（Real SF条件)では実現が困難である。このため、図 3に示すように液切替時に SF条件より高速の変化が発生する。これは液切替時には高速で液が流れて、るため、ノイズで計測は充分にはできな、が理想条件での吸着現象が見られて、ることとなる。

[0038] 実際の測定系では、液切り替え時間内（0≤t≤t)を式 (4)をもとにした差分方程式を下記式（13)として計算し、液交換後 (t_;≤t)は式（14) (15) (16)を用いることで解祈が可能となる。ここで、 Δχ, Δ tについては式 (8)〜（11)を充足する値を選択する

[0039] 0≤t≤tのとき

R[t] = (kaXC X (Rmax— R[t— At]) kdXR[t— At]) X At+R[t— At] o

(13)

[0040] t≤tのとき

R[t] = (kaXC[0, (t At)]X (Rmax— R[t— At])— kdXR[t— At]) X At+ R[t- At] (14)

[0041] C[0, t]=DX (C[Ax, (t At)]— C[0, (t At) ]) +C[0, (t— At)]— (kaX C[0, (t一 At)] X (Rmax— R[t— At])一（kdXR[t— Δ t] ) /Rmax X Sm X At)

C[nX Δχ, t]=DX (C[(n+1) X Δχ, (t— At) ] +C[ (n— 1) X Δχ, (t- At)] -2XC[Ax, (t-At)])+C[Ax, (t- At)] (16)

[0042] ここで、境界条件は下記式（17)を用いる。

[0043] Real SF条件を用いて実際の測定結果を非線形回帰解析するには ka, kdおよび Rmaxにカ卩えて拡散係数 Dも未知数として取り扱うことが好まし、。拡散係数 Dは Ein steinの式を用いることで分子量より算出できるとされているが、実際には分子形状や溶媒の影響が大きく実測することが好ましい。また、 0≤t≤tの領域では測定系のノィズが大きく計算に使うことで誤差が大きくなる。そこで、 t≤tの領域に関して ka, kd, Rmaxおよび Dを未知数として非線形回帰を行い、求めた ka, kd, Rmaxおよび Dから得られる 0≤t全領域の曲線と実測値を比較すると図 4のように良好な一致を示すこととなる。

[0044] 実際の計算は差分方程式（13)〜（17)を用いていれば、いかようなアルゴリズムであってもよい。また、非線形回帰法についても既知のいかなる手法を使ってもよい。

[0045] 本発明にお、ては、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することにより、測定時間内における参照セルの信号変化のノイズ幅、及びベースライン変動を抑制することができ、これにより信頼性の高い結合検出データを取得することが可能になる。液の流れを停止させる時間は特に限定されないが、例えば、 1 秒以上 30分以下であり、好ましくは 10秒以上 20分以下であり、さらに好ましくは 1分以上 20分以下程度である。

[0046] 本発明にお、ては好ましくは、流路系内の液体を、測定すべき被験物質を含有しない対照液体から、測定すべき被験物質を含有する試料液体へと交換し、その後、試料液体の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。

[0047] 本発明にお、ては好ましくは、被験物質と相互作用する物質を結合して、な！/、参照セルと、被験物質と相互作用する物質を結合した検出セルとを直列に連結して流路系内に設置し、該参照セルと該検出セルに液体を流すことにより、表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。

[0048] また、本発明におヽては、測定に用いるセルの体積 (Vs ml) (上記した参照セルと検出セルを用いる場合はそれらのセルの合計体積）に対し、 1回の測定あたりの液交換量 (Ve ml)の比率 (Ve/Vs)は、好ましくは 1以上 100以下である。 Ve/Vsは、より好ましくは 1以上 50以下であり、特に好ましくは 1以上 20以下である。測定に用いるセルの体積 (Vs ml)は特に限定されないが、好ましくは 1 X 10— ⁶〜1. Oml、特に好ましくは 1 X 1 0一⁵〜 1 X 10— 程度である。また、液体の交換にかける時間としては、 0.01秒以上 10 0秒以下が好ましぐ 0.1秒以上 10秒以下がより好ましい。

[0049] 表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界力反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存すること〖こよるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。以下、本発明で用いる表面プラズモン共鳴測定装置について説明する。

[0050] 表面プラズモン共鳴測定装置とは、表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析するための装置である。本発明で用いられる表面プラズモン共鳴測定装置は、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備える。

[0051] また、前記の通り、前記誘電体ブロックは、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む 1つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体ィ匕されて、る。

[0052] 本発明では、具体的には、特開 2001— 330560号公報記載の図 1〜図 32で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置、特開 2002— 296177号公報記載の図 1 〜図 15で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置を好ましく用いることができる。特開 2001— 330560号公報および特開 2002— 296177号公報に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。

[0053] 例えば、特開 2001— 330560号公報記載の表面プラズモン共鳴測定装置としては、例えば、誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる薄膜層、およびこの薄膜層の表面上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる複数の測定ユニットと、これら複数の測定ユニットを支持した支持体と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段と、前記複数の測定ユニットの各誘電体プロックに関して順次前記全反射条件および種々の入射角が得られるように、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、各測定ユニットを順次前記光学系および光検出手段に対して所定位置に配置する駆動手段とを備えてなることを特徴とする表面プラズモン共鳴測定装置が挙げられる。

[0054] なお、上記の測定装置においては、例えば前記光学系および光検出手段が静止状態に保たれるものとされ、前記駆動手段が、前記支持体を移動させるものとされる

[0055] その場合、前記支持体は、回動軸を中心とする円周上に前記複数の測定ユニットを支持するターンテーブルであり、また前記駆動手段は、このターンテーブルを間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に 1列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、この支持体を前記複数の測定ユニットの並び方向に間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。

[0056] 一方、上記とは反対に、前記支持体が静止状態に保たれるものであり、前記駆動手段が、前記光学系および光検出手段を移動させるものであっても構わない。

[0057] その場合、前記支持体は、円周上に前記複数の測定ユニットを支持するものであり、前記駆動手段は、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に 1列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に直線移動させるものを適用してもよい

[0058] 他方、前記駆動手段が、その回動軸を支承するころがり軸受けを有するものである場合、この駆動手段は、該回動軸を一方向に回動させて前記複数の測定ユニットに対する一連の測定が終了したならば、この回動量と同量だけ該回動軸を他方向に戻してから、次回の一連の測定のためにこの回動軸を前記一方向に回動させるように構成されることが望ましい。

[0059] また上記の測定装置においては、前記複数の測定ユニットが連結部材により 1列に連結されてユニット連結体を構成し、前記支持体が、このユニット連結体を支持するように構成されて、ることが望まし、。

[0060] また上記の測定装置にお、ては、前記支持体に支持されて!、る複数の測定ュ-ットの各試料保持機構に、自動的に所定の試料を供給する手段が設けられることが望ましい。

[0061] さらに上記の測定装置においては、前記測定ユニットの誘電体ブロックが前記支持体に固定され、測定ユニットの薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが上記誘電体ブロックに対して交換可能に形成されてヽることが望ましい。

[0062] そして、このような測定チップを適用する場合は、この測定チップを複数収納した力セットと、このカセットから測定チップを 1つずつ取り出して、前記誘電体ブロックと組み合う状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。

[0063] あるいは、測定ユニットの誘電体ブロック、薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが前記支持体に対して交換可能に形成されてもよい。

[0064] 測定チップをそのような構成とする場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを 1つずつ取り出して、支持体に支持される状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望まし、。 [0065] 他方、前記光学系は、光ビームを誘電体ブロックに対して収束光あるいは発散光の状態で入射させるように構成され、そして前記光検出手段は、全反射した光ビームに存在する、全反射減衰による暗線の位置を検出するように構成されることが望ましい

[0066] また上記光学系は、光ビームを前記界面にデフォーカス状態で入射させるものとして構成されることが望ましい。そのようにする場合、光ビームの上記界面における、前記支持体の移動方向のビーム径は、この支持体の機械的位置決め精度の 10倍以上とされることが望ましい。

[0067] さらに上記の測定装置において、測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光源は前記支持体より上の位置から下方に向けて前記光ビームを射出するように配設され、前記光学系は、前記下方に向けて射出された前記光ビームを上方に反射して、前記界面に向けて進行させる反射部材を備えていることが望ましい。

[0068] また、上記の測定装置にお!/、て、前記測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光学系は、前記光ビームを前記界面の下側から該界面に入射させるように構成され、前記光検出手段は前記支持体よりも上の位置で光検出面を下方に向けて配設されるとともに、前記界面で全反射した光ビームを上方に反射して、前記光検出手段に向けて進行させる反射部材が設けられることが望ましい。

[0069] 他方、上記の測定装置においては、前記支持体に支持される前および Zまたは支持された後の前記測定ユニットを、予め定められた設定温度に維持する温度調節手段が設けられることが望まし、。

[0070] また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された測定ユニットの試料保持機構に貯えられた試料を、前記全反射減衰の状態を検出する前に撹拌する手段が設けられることが望ま、。

[0071] また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された複数の測定ユニットの少なくとも 1つに、前記試料の光学特性と関連した光学特性を有する基準液を供給する基準液供給手段が設けられるとともに、前記光検出手段によって得られた、試料に関する前記全反射減衰の状態を示すデータを、前記基準液に関する前記全反射減衰の状態を示すデータに基づいて補正する補正手段が設けられることが望ましい。

[0072] そのようにする場合、試料が被検体を溶媒に溶解させてなるものであるならば、前記基準液供給手段は、基準液として前記溶媒を供給するものであることが望まし、。

[0073] さらに、上記の測定装置は、測定ユニットの各々に付与された、個体識別情報を示すマークと、測定に使用される測定ユニットから前記マークを読み取る読取手段と、測定ユニットに供給される試料に関する試料情報を入力する入力手段と、測定結果を表示する表示手段と、この表示手段、前記入力手段および前記読取手段に接続されて、各測定ユニット毎の前記個体識別情報と前記試料情報とを対応付けて記憶するとともに、ある測定ユニットに保持された試料について求められた測定結果を、その測定ユニットに関して記憶されている前記個体識別情報および前記試料情報と対応付けて前記表示手段に表示させる制御手段とを備えることが望ましい。

[0074] 上記した測定装置を用いて生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する場合、前記測定ユニットの 1つにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出した後、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、別の測定ユニットにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出し、その後前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、前記 1つの測定ユニットにおける試料に関して、再度全反射減衰の状態を検出することにより測定を行うことができる。

[0075] 本発明で用いる測定チップは、本明細書中に記載した構成を有する表面ブラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、誘電体ブロックとこの誘電体ブロックの一面に形成された金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む 1つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されて！/、る。

[0076] 金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記金属膜への付着性を考慮して、基板と金属力もなる層との間にクロム等力もなる介在層を設けてもょ、。

[0077] 金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、 0. lnm以上 500nm以下であるのが好ましぐ特に lnm以上 200nm以下であるのが好ましい。 500nmを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等力もなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、 0. lnm以上、 10nm以下であるのが好ましい。

[0078] 金属膜の形成は常法によって行えばよぐ例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレ一ティング法、電気めつき法、無電解めつき法等によって行うことができる。

[0079] 金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなぐ他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、一般的には BK7等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチノレメタタリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロォレフインポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料力もなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。

[0080] 金属膜は、最表面に生理活性物質を固定ィ匕することができる官能基を有することが好ま、。ここで言う「最表面」とは、「金属膜から最も遠、側」と、う意味である。

[0081] 好ましい官能基としては— OH、— SH、— COOH、— NR ² (式中、 R¹及び R²は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、 CHO、一 NR³NRiR² (式中、 R²及び R³は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、—NCO、 — NCS、エポキシ基、またはビュル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的には C1〜C10程度であり、好ましくは C1〜C6である。

[0082] 最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、例えば、それらの官能基の前駆体を含有する高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体力それらの官能基を生成させる方法が挙げられる。

[0083] 上記のようにして得られた測定チップにおいて、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属膜に生理活性物質を固定ィ匕することができる

[0084] 本発明の測定チップの表面上に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。

[0085] 免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体ゃハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ち IgG、 IgM、 IgA、 IgE、 IgDを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中で O抗原 26、 86、 55、 111、 157などに対する抗体等を使用することができる。

[0086] 酵素としては、測定対象物又は測定対象物力代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなぐ種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースォキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールォキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。

[0087] 微生物としては、特に限定されることなぐ大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。

核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダィズするものを使用することができる。核酸は、 DNA (cDNAを含む）、 RNAのいずれも使用できる。 DNAの種類は特に限定されず、天然由来の DNA、遺伝子組換え技術により調製した組換え DNA、又は化学合成 DNAの何れでもよい。

低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。

[0088] 非免疫蛋白質としては、特に限定されることなぐ例えばアビジン (ストレブトァビジン）、ピオチン又はレセプターなどを使用できる。

免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテイン Aあるいはプロテイン G、リゥマチ因子 (RF)等を使用することができる。

糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。

脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、ァラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸ェチル、ァラキジン酸ェチル、ベヘン酸ェチル等が挙げられる。

[0089] 生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。

[0090] 上記のようにして生理活性物質を固定ィ匕した測定チップは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び Z又は測定のために使用することができる。

[0091] 即ち、本発明によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している測定チップ (セル)を少なくとも使用し、測定すべき被験物質を含有する試料液体と該セルとを接触させ、流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定する工程を含む、生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。

被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。

[0092] 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力本発明は実施例によつて限定されるものではない。

実施例

[0093] 以下の実験は、特開 2001— 330560号公報の図 22に記載の装置（以下、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置と呼ぶ）（本明細書において図 1として示す)、及び同公報の図 23に記載の誘電体ブロック（以下、本発明の誘電体ブロックと呼ぶ）（本明細書において図 2として示す)を用いて行った。

[0094] 図 1に示す表面プラズモン共鳴測定装置は、測定ユニットを支持する支持体として、互いに平行に配された 2本のガイドロッド 400,400に摺動自在に係合し、それらに沿つて図中の矢印 Y方向に直線移動自在とされたスライドブロック 401が用いられてヽる。そしてこのスライドブロック 401には、上記ガイドロッド 400,400と平行に配された精密ねじ 402が螺合され、この精密ねじ 402はそれとともに支持体駆動手段を構成するパルスモータ 403によって正逆回転されるようになって!/、る。

[0095] なおこのパルスモータ 403の駆動は、モータコントローラ 404によって制御される。すなわちモータコントローラ 404には、スライドブロック 401内に組み込まれてガイドロッド 4 00,400の長手方向における該スライドブロック 401の位置を検出するリニアエンコーダ (図示せず）の出力信号 S40が入力され、モータコントローラ 404はこの信号 S40に基づ!、てパルスモータ 403の駆動を制御する。

[0096] またガイドロッド 400,400の側下方には、それに沿って移動するスライドブロック 401をそれぞれ左右カゝら挟む形で、レーザ光源 31および集光レンズ 32と、光検出器 40とが配設されている。集光レンズ 32は光ビーム 30を集光する。また、光検出器 40が設置されている。

[0097] ここで本実施形態においては、一例として 8個の測定ユニット 10を連結固定してなるスティック状のユニット連結体 410が用いられ、測定ユニット 10は 8個一列に並べた状態でスライドブロック 401にセットされるようになって、る。

[0098] 図 2は、このユニット連結体 410の構造を詳しく示すものである。ここに示される通りユニット連結体 410は、測定ユニット 10が 8個、連結部材 411により連結されてなるものである。

[0099] この測定ユニット 10は、誘電体ブロック 11と試料保持枠 13とを例えば透明榭脂等から一体成形してなるものであり、ターンテーブルに対して交換可能な測定チップを構成している。交換可能とするためには、例えばターンテーブルに形成された貫通孔に、測定ユニット 10を嵌合保持させる等すればよい。なお本例では、金属膜 12の上にセンシング物質 14が固定されている。 [0100] 実施例：液を停止した状態での測定

(1)デキストラン測定チップの作製

金属膜として 50nmの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックを Mode卜 208UV—ォゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.)で 30分間処理した後、エタノール Z水（80/20)中 11 ヒドロキシー 1 ゥンデカンチオールの 5.0mM溶液を金属膜に接触するように添カ卩し、 25°Cで 18時間表面処理を行った。その後、エタノールで 5回、ェタノール/水混合溶媒で 1回、水で 5回洗浄を行った。

[0101] 次に、 11ーヒドロキシー 1ーゥンデカンチオールで被覆した表面を 10重量⁰ /₀のェピクロロヒドリン溶液 (溶媒： 0.4M水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの 1： 1混合溶液）に接触させ、 25°Cの振盪インキュベータ一中で 4時間反応を進行させた。表面をエタノールで 2回、水で 5回洗浄した。

[0102] 次に、 25重量⁰ /₀のデキストラン（T500,Pharmacia)水溶液 40.5mlに 4.5mlの 1M水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をェピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベータ一中で 25°Cで 20時間インキュベートした。表面を 50°Cの水で 10 回洗浄した。続いて、ブロモ酢酸 3.5gを 27gの 2M水酸ィ匕ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、 28°Cの振盪インキュベーターで 16 時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を 1回繰り返した。

[0103] (2) ProteinA固定チップの作成

上記（1)で作成したデキストラン測定チップ内の溶液を除去した後、 200mM EDC(N -ェチル- Ν'- (3-ジメチルァミノプロピル)カルボジイミドハイド口クロライド)と 50mM NHS (N-ヒドロキシスクシンイミド)の混合溶液 70 1を添加し、 10分間放置した。混合溶液を除去した後、 100 の水で 3回、 100 /z lの Acetate5.0バッファー (BIAcore社製)で 3回洗浄した。 Acetate5.0バッファーを 100 μ 1入れた状態でこのチップを本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、チップ内を ProteinA溶液 (ProteinA (ナカライテスタ社製)を 50 μ g/mlになるよう Acetate5.0(BIAcore社製)に溶解したもの)に入れ替え 30 分間放置し、 ProteinAを固定した。チップ内を 1Mエタノールァミン溶液に置き換え、 10分間放置した。チップ内を 100 μ 1の Acetate5.0バッファーで 10回洗浄した。 Protein Aの固定による共鳴シグナル変化量は、 500RUであった。 [0104] (3)参照チップの作成：

上記（1)で作成したデキストラン測定チップ内の溶液を除去した後、 200mM EDCと 50mM NHSの混合溶液 70 1を添カ卩し、 10分間放置した。混合溶液を除去した後、 10 Ο ΐの水で 3回、 ΙΟΟ Ιの Acetate5.0バッファーで 3回洗浄した。チップ内を 1Mェタノールァミン溶液に置き換え、 10分間放置した。チップ内を 100 μ 1の Acetate5.0バッファ一で 10回洗浄した。

[0105] (4)流路系の作成

本発明の ProteinA固定チップに対し、誘電体ブロックをシリコンゴムでふたをすることで、内容積 15 1のセルを作成した。また、ふたのシリコンゴムに 2箇所、 1mm径の穴をあけ、内径 0.5mm、外径 lmmのテフロンチューブを通し、流路を作成した。同様に参照チップにもふた、流路を作成し、 2つのチップを直列につなぎ、流路系を作成した。この流路系の 2つのチップをそれぞれ、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設! ^し 7こ。

[0106] (5) mouse IgG結合性能評価

流路系内を HBS- EPバッファー (BIAcore社製)で満たした。 HBS-EPバッファーの組成は、 HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid) 0.01mol/l ( pH7.4)、 NaC10.15mol/l、 EDTA 0.003mol/l、 Surfactant P20 0.005重量⁰ /₀である。液交換前を基準とした信号変化を 0.5秒間隔で測定した。流路系内を 20 /z l/sec の速度で mouse IgG溶液 (mouse IgG (コスモバイオより購入)を 10 μ g/mlになるよう HBS -EPバッファーに溶解したもの)に置き換えた。置き換えに要した時間は 5秒であった

[0107] 液交換開始 5秒後以降は、液の流れを停止させた。

液交換開始 5秒後から 2分後までのデータを使用し、初期値として ka = 1 X 10⁵(M^_1s kd = 1 X 10"³(s^_1), Rmax = 500(RU), D = 1 X 10— ⁷(cm² s"¹), C = 6.7 X 10— ⁸(M)を代入し、 Excel2000(Microsoft社製)のソルバー機能を使用して ka, kd, Rmax, Dの値を変ィ匕させた時、最も実測グラフとの最小自乗法による誤差が小さくなる曲線を非線形回帰法により求めた。その結果を図 4に示す。実測グラフと計算で求めた曲線がほぼ重なっていることが分かる。 [0108] 比較例：液を流して、る状態での測定

以下の実験は、 BIAcore3000(BIAcore社製)を使用して行った。センサーチップ CM- 5を通常の方法でセットした後、 HBS-EPバッファーでプライムを行った。以下フローセル 2にフロー速度 10 1/minでバッファー、各種溶液を流して実験を行った。 200mM EDCと 50mM NHSの混合溶液を 7分間流した後、 HBS-EPバッファーを流して洗浄した。次に ProteinA溶液 (ProteinA (ナカライテスタ社製)を 10 μ g/mlになるよう Acetate5.0 (BIAcore社製)に溶解したもの)を 1分間流し、 ProteinAを固定した。 ProteinA溶液を H BS-EPバッファーで洗浄した後、 1Mエタノールァミン溶液を 7分間流した。エタノールァミン溶液を HBS-EPバッファーで洗浄した。 ProteinAの固定による共鳴シグナル変化量は、 300RUであった。

[0109] 以下フローセル 1にフロー速度 10 μ 1/minでバッファー、各種溶液を流して実験を行つた。 200mM EDCと 50mM NHSの混合溶液を 7分間流した後、 HBS-EPバッファーを流して洗浄した。 1Mエタノールァミン溶液を 7分間流した。エタノールァミン溶液を H BS-EPバッファーで洗浄した。

[0110] 以下フローセル 1,2にフロー速度 20 1/minでバッファー、各種溶液を流して実験を行った。 mouse IgG溶液 (mouse IgG (コスモバイオより購入)を 10 g/mlになるよう HBS- EPバッファーに溶解したもの)を kinjectコマンドで注入し、結合、解離それぞれ 5分間の信号を測定した。

測定した信号について、解析ソフト BIAevaluation3.1(BIAcore社製)を使用し、 1 : 1(L angmuir) bindingモードでフィッティングを行い、 ka, kd, Rmaxを求めた。

[0111] 実施例及び比較例で求めた各パラメータの値を表 1に示す。実施例で得られた ka, kdの値は、比較例で得られた値と近いことが分かる。また、ベースライン変動等が良好な状態での解離定数を理想状態と同様に求めることができた。

[0112] [表 1]

産業上の利用可能性 [0113] 本発明によれば、ノイズレベル（参照チップのノイズ幅）が低ぐかつベースライン変動 (参照チップの信号変化)が小さぐ信頼性の高い測定結果を得ることが可能な、表面プラズモン共鳴測定装置中の流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法にぉ、ても、表面ブラズモン共鳴における金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数の算出を行うことが可能になった。

図面の簡単な説明

[0114] [図 1]図 1は、実施例で用いた表面プラズモン共鳴測定装置を示す。図中、 10は測定ユニット、 30は光ビーム、 31はレーザ光源、 32ば集光レンズ、 40は光検出器、 S4 0は出力信号、 400はガイドロッド、 401はスライドブロック、 402は精密ねじ、 403はパルスモータ、 404はモータコントローラ、 410はユニット連結体を示す。

[図 2]図 2は、実施例で用いた誘電体ブロックを示す。図中、 10は測定ユニット、 11は誘電体ブロック、 12は金属膜、 13は試料保持枠、 14はセンシング物質、 410はュ- ット連結体、 411は連結部材を示す。

[図 3]図 3は、 SPR測定について理想条件、ストップ 'フロー条件及び実測値の比較を示す。

[図 4]図 4は、本発明の方法により求めた ka, kd, Rmaxおよび D力得られる全領域の曲線と、 SPRの実測値とを比較した結果を示す。

Claims

請求の範囲

[1] 金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、金属膜面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法にお!、て、信号変化の測定結果から、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出する方法。

[2] 表面プラズモン共鳴の信号変化の測定結果力吸着速度係数 (ka)及び離脱速度係数 (kd)を求め、求めた吸着速度係数 (ka)及び離脱速度係数 (kd)から、 KD = kd Zkaで表される式により解離定数 (KD)を算出する、請求項 1に記載の方法。

[3] 表面プラズモン共鳴の信号変化の測定結果から、下記式（1)、（2)及び（3)を用いることによって吸着速度係数 (ka)及び離脱速度係数 (kd)を求める、請求項 1又は 2に記載の方法。

d 0 /dt=ka X c X (1 - 0 ) -kd X θ (1)

3 c/ 3 t=D X 3 ²c/ 3 x² (2)

Θ =R/Rmax (3)

[4] 前記液体の交換に力かる時間を理想条件での吸着現象とみなして補正することにより解離定数を算出する、請求項 1から 3の何れかに記載の方法。

[5] 非線形回帰解析を用いて解離定数を算出する、請求項 1から 4の何れかに記載の方法。

[6] 誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用いる、請求項 1から 5の何れかに記載の方法。

[7] 前記流路系内の液体を、測定すべき被験物質を含有しな!、対照液体から、測定すべき被験物質を含有する試料液体へと交換し、その後、試料液体の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定する、請求項 1から 6の何れかに記載の方法。

[8] 被験物質と相互作用する物質を結合して!/、な!、参照セルと、被験物質と相互作用する物質を結合した検出セルとを直列に連結して流路系内に設置し、該参照セルと該検出セルに液体を流す、請求項 1から 7の何れかに記載の方法。

[9] 前記セルの体積 (Vs ml)に対する 1回の測定あたりの液交換量 (Ve ml)の比率 (Ve/Vs) 力 Si以上 100以下である、請求項 8に記載の方法。

[10] Ve/Vsが 1以上 50以下である、請求項 9に記載の方法。

[11] 前記流路系内の液体の交換に力かる時間が 0.01秒以上 100秒以下である、請求項 1 力も 10の何れかに記載の方法。