CN111595736B - 单个纳米颗粒的等离激元相位成像系统和耦合效应测量方法 - Google Patents

单个纳米颗粒的等离激元相位成像系统和耦合效应测量方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开单个纳米颗粒的等离激元相位成像系统和耦合效应测量方法，所述系统包括：单色激光发射模块、颗粒激发模块与颗粒散射强度检测模块，用于采集单纳米颗粒的散射光图像，包括反射镜片和图像采集器；本发明将表面等离激元共振相位成像的方法引入到单纳米颗粒的耦合效应测量中，实现了在不同厚度的烷基硫醇单分子层介导下，直接检测金膜玻片表面的单个纳米颗粒散射强度值及相位变化与单分子层厚度的关系，进一步用于单纳米颗粒表面修饰的ssDNA:miRNA分子剪切过程中由于颗粒与金膜玻片之间距离变化引起的动态相位检测和耦合效应的转换分析。

Description

单个纳米颗粒的等离激元相位成像系统和耦合效应测量方法
技术领域
本发明涉及纳米颗粒相位测定领域，具体涉及一种单个纳米颗粒的等离激元相位成像系统和耦合效应测量方法。
背景技术
表面等离激元技术目前已经广泛地应用于生物及化学分子结合常数和特性的免标记定量分析中。该技术的不断发展使得单个金属纳米颗粒成像成为了可能，进一步为单纳米颗粒甚至单分子层面上的电化学、光化学、生物传感及纳米科学的研究提供了全新的视野。
最新研究表明，两个金纳米颗粒或金纳米颗粒与金属表面之间形成的纳米结具有有趣的量子效应。当纳米结的间隙在消逝场深度范围之内时，金纳米颗粒之间或者金纳米颗粒与金属表面之间存在经典电磁耦合效应(Classical electromagnetic coupling)。当运用分子来调控间隙逐渐减小至一定范围时，纳米结发生电子隧穿效应，使得经典电磁耦合效应转换为量子耦合效应(Quantum coupling)。这一转换现象已经运用金属纳米颗粒的吸收光谱及电子能量损失能谱的方法进行了证明，但这两种方法无法实现转换过程的单纳米颗粒实时动态分析。由于纳米颗粒的表面等离激元共振图像是由单个纳米颗粒与金属表面的耦合效应引起的，因此我们认为经典电磁耦合效应与量子耦合效应之间的转换将对单纳米颗粒的表面等离激元光学信号引起相应的变化(如光学强度及相位的改变)。
相位的动态成像分析可以提供单纳米颗粒及与金属表面纳米间隙变化的内在信息，如折射率、电子分布及能带变化。通过定位表面等离激元共振角度来调控单纳米颗粒的成像特性，可以获得等离激元近场相位的分布，从而研究纳米间隙变化导致的耦合效应动态转换。这一单颗粒相位成像技术，不仅对分子层介导的单颗粒相位成像基础研究具有重要意义，同时还对纳米化学、表界面化学及生命科学等学科的交叉共融都有重大的推动作用。
常见的生物分子检测技术包括了荧光显微镜、超微电极、吸收光谱显微镜及等离激元增强显微镜。然而由于低分辨率、低光学吸收及低电学活性等因素，这些方法都较难实现对生物分子的免标记检测。到目前为止，对于生物分子水平检测方法的报道仅有运用碳纳米管场效应晶体管、纳米孔、以及光学微孔。然而这些手段都需要基于单个转换器，损失了大部分的空间分辨率。
现有的成像技术灵敏度低，为了实现对生物分子调控的实时分析，需要引入高灵敏，高空间分辨率的光学体系以及良好的生物相容性。本发明基于表面等离激元共振成像技术实现免标记、快速成像，归功于物镜的高数值孔径、单色激光光源的高功率及高速相机对光学强度及相位信号的采集。这一方法极大的降低了背景噪声，实现了高时空分辨率下的生物分子分析。
发明内容
第一发明，本发明提供一种能够测量分子耦合效应测量的单个纳米颗粒的等离激元相位成像系统，该系统包括：
单色激光发射模块，其包括单色激光光源，用于将固定波长的单色激光引入表面等离激元成像中并调节所述激光的光强以满足成像需求；
颗粒激发模块，其设置在单色激光发射模块的下游，所述的颗粒激发模块包括用于调节光路路径及角度的光学调整组件、用于光学信号放大成像的光学显微放大物镜、用于高数值孔径油镜的折射率匹配镜油、用于吸收激发光从而产生表面等离激元共振现象的金膜玻片和用于盛放溶液的样品池；
光学调整组件、光学显微放大物镜与折射率匹配镜油配合用于将单色激光以p偏振光及表面等离激元共振的特定角度入射以激发金膜玻片表面的单个金纳米颗粒等离激元共振获得散射光；
颗粒散射强度检测模块，其设置在颗粒激发模块的下游，所述的颗粒散射强度检测模块包括用于转换光学显微放大物镜发射的散射光路入射角度的反射镜片(31)以及用于获取反射镜发射光成像的图像传感器(32)。
在一些实施例中，所述光学调整组件括用于调节光束方向的准直透镜、用于产生特定偏振光并激发表面等离激元共振的p偏振片、用于将散射光聚焦于光学显微放大物镜后焦面上的聚光透镜和用于实现一半光路反射一半光路透射的半透半反镜片。
在一些实施例中，所述的光学显微放大物镜和金膜玻片之间填充折射率匹配镜油，该光学显微放大物镜的数值孔径为1.49，折射率匹配镜油的折射率为1.51。
在一些实施例中，所述的金膜玻片通过如下方法制备获得：在玻璃片表面通过磁控溅射的方法先镀上Cr层以增加金膜与玻璃片的粘附力，后镀上一层金膜用以作为表面等离激元共振产生的基底。
在一些实施例中，多个金膜玻片分别用不同碳原子个数的的烷基硫醇进行修饰以此来调第二方面，本发明提供一种单个纳米颗粒的耦合效应测量方法，所述测量方法包括：
(1)搭建如前所述的单颗粒等离激元显微成像系统；
(2)通过引入多个具有不同长度的烷基硫醇单分子层来调节纳米颗粒与金膜玻片之间的距离，从而改变单颗粒与金膜玻片基底之间的耦合相互作用；
(3)采集所述金纳米颗粒在不同厚度烷基硫醇单分子层介导下的光学图像以获得其强度及相位信息，从而推出其耦合效应的变化；
(4)运用ssDNA:miRNA分子取代硫醇单分子层来介导单个金纳米颗粒与金膜玻片，通过双链剪切酶的剪切作用，获得介导层厚度动态变化导致的单纳米颗粒等离激元光学图像强度及相位的信息和耦合效应的变化。
在一些实施例中，步骤(2)中，将正己硫醇、正辛硫醇、正癸硫醇、正十二烷硫醇、正十四烷硫醇、正十六烷硫醇和正十八烷硫醇分别加入到乙醇中以获得浓度为不同硫醇修饰溶液；将前面处理好的金膜玻片放入相应的溶液中浸泡使得金膜表面可以形成稳定且均匀的不同厚度烷基硫醇自组装单分子层。在一些具体实施例中，用扫描电子显微镜和动态光散射对测定的金纳米颗粒分布、粒径和形貌进行了表征；从数据可知，金纳米颗粒形貌均匀且粒径为60nm；同时，在水溶液的环境下，对烷基硫醇单分子层修饰的金膜玻片表面运用原子力显微镜的非接触模式对其粗糙度进行测定来验证单分子层的形成，如图8所示；烷基硫醇修饰的金膜玻片表面粗糙度出现不同程度增大，这说明了金膜玻片表面确实形成了单分子层，从而导致表面粗糙度增加。
在一些实施例中，步骤(3)中，采集所述金纳米颗粒在不同厚度烷基硫醇单分子层介导下的光学图像包括：
(31)将含有所述金纳米颗粒的溶液加入所述样品池内，并通过非特异性作用吸附在金膜基底上修饰的烷基硫醇单分子层表面；
(32)通过电化学工作站给所述样品池施加一个固定扫速的扫描电压记录烷基硫醇单分子层修饰后的金膜玻片的充放电电流，通过对充放电过程的面积积分获得单分子层的电容，由电容可以计算得到相应的单分子层厚度；
(33)筛选基底表面的单个金纳米颗粒表面等离激元激发角度，以获得最优图像分辨率，运用图像采集器获得单纳米颗粒的等离激元图像强度和相位信息，以获得分子层厚度与相位的关系。
在一些具体实施例中，用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质的样品池粘在已经预先清洁过的金膜玻片表面，构建一个可以进行单个纳米颗粒成像测定盛放溶液的样品池；将红色LED激光引入成像系统中，作为单颗粒等离激元成像的激发光源；单个金纳米颗粒共振激发产生的散射光是通过光学显微放大物镜(60倍，NA＝1.49)收集；对散射光信号的检测是用高速低噪CMOS相机，可以同步记录单个纳米颗粒散射强度值和其对应的相位信息。最后，向样品池内加入含有直径为60nm金纳米颗粒的水溶液，通过非特异性吸附的作用将金纳米颗粒分散固定在不同修饰条件下的金膜玻片表面，从而获得相应的单个金纳米颗粒等离激元图像(如图4A所示)；当正十八烷基硫醇修饰在金膜玻片表面的厚度为2.6纳米，单个金纳米颗粒的等离激元图像中间为暗条纹，此时对应于经典电磁耦合效应；随着颗粒与金膜玻片之间距离减小，单个金纳米颗粒的等离激元图像中间条纹逐渐变亮，直至变为亮条纹，此时对应量子耦合效应(如图4B所示)；即从图中可以获知，当单个金纳米颗粒与金膜玻片之间距离控制在1nm以内时，此时两者之间存在量子耦合效应，其等离激元共振强度较强，表现为单个金纳米颗粒的等离激元图像尾部中间区域为明条纹；当两者距离增大时，量子效应减弱至传统电磁耦合效应，单个金纳米颗粒的等离激元图像尾部中间区域为暗条纹。
在一些实施例中，步骤(4)中，所述通过巯基连接在金膜玻片与单个金纳米颗粒之间的ssDNA:miRNA共轭分子双螺旋结构通过双链剪切酶对其结构中的ssDNA进行剪切，从而动态调控纳米颗粒与金膜玻片之间的距离以获得相位变化，同时图像采集器记录不同时间下的所述单个金纳米颗粒的散射强度值及相位信息，并传输到电脑进行图像分析；在一些具体实施例中，先将一端连有巯基的ssDNA修饰在金膜玻片基底的表面，加入修饰有与ssDNA匹配的miRNA分子的金纳米颗粒与金膜玻片上的ssDNA形成双链结构。双链分子的厚度约为10.4nm，此时金纳米颗粒与金膜玻片之间存在经典电磁耦合效应，颗粒中间为暗条纹；当溶液中加入双链剪切酶对双链中的ssDNA进行剪切时，金纳米颗粒与金膜玻片之间的距离逐渐减小至0，金纳米颗粒与金膜玻片之间存在量子耦合效应，颗粒中间为亮条纹；具体地，运用厚度为10.4纳米的ssDNA:miRNA分子取代硫醇单分子层来介导单个金纳米颗粒与金膜玻片，通过双链剪切酶DSN(Duplex specific nuclease)的剪切作用，获得介导层厚度动态变化导致的单纳米颗粒等离激元光学图像强度、相位的信息和耦合效应的变化，如图6所示，先将一端连有巯基的ssDNA(序列为5’-CTA GTG GTC CTA AAC ATT TCA CTT T-(CH2)3-SH-3’)修饰在金膜玻片基底的表面，加入修饰有与ssDNA匹配的miRNA分子(序列为GUG AAA UGU UUA GGA CCA CUA G)的金纳米颗粒与金膜玻片上的ssDNA形成双链结构；双链分子的厚度约为10.4nm，此时金纳米颗粒与金膜玻片之间存在经典电磁耦合效应，颗粒中间为暗条纹；当溶液中加入双链剪切酶对双链中的ssDNA进行剪切时，金纳米颗粒与金膜玻片之间的距离逐渐减小至0，金纳米颗粒与金膜玻片之间存在量子耦合效应，颗粒中间为亮条纹。
在一些具体实施例中，所述纳米颗粒为金纳米颗粒。
第三方面，本发明提供的系统在精准识别生物分子或者高精度计算单分子层距离中的应用。
本发明将传统吸收光谱和电子能量损失能谱对单个金属纳米颗粒耦合效应引起的谱学变化推进到对单颗粒耦合效应引起的相位动态变化进行实时成像分析，通过直接检测单个金纳米颗粒的散射强度值及相位的变化，获得单个纳米颗粒的耦合效应差异。
等离激元共振纳米颗粒，如银或金纳米颗粒，可以以异常高的效率散射入射光，这是由于其导带电子的集体振动导致的。这样的性质可以使得等离激元共振纳米颗粒在生物分析和单分子成像上获得广泛的应用。近年来，基于等离激元共振散射的成像技术得到了长足的发展，通过这种显微技术可以了解等离激元纳米颗粒的物理和光学性质。研究发现纳米颗粒的光学强度、相位和耦合效应与其周边环境以及颗粒间距离密切相关。因此运用单纳米颗粒对生物分子(如microRNA)进行成像研究，拥有空前的检测限和空间分辨率。这对于研究生物分子的结合与解离等动态过程具有非常重要的意义，也为纳米颗粒和金属基底之间电荷转移过程中涉及的动态机理研究提供了可能。
生物分子的高灵敏免标记动态成像检测引起的表面等离激元强度及相位变化这一研究填补了该领域的空白；将纳米材料的超快相位转换和耦合效应过程与生物分子的识别研究相结合，预期实现通过改变单纳米材料的表面性质从而检测表面连接的生物分子。同时，在动态成像过程的捕获中，实现化学及生物现象的研究及能量转换、生物传感器等方面具有非常重要的意义。
附图说明
图1是本发明涉及的系统的结构示意图；
图2是本发明涉及的方法的流程图；
图3A是本发明涉及的正十八烷基硫醇单分子层修饰的金膜玻片充放电过程中电极电位与电流关系图；
图3B是本发明涉及的由充放电过程汇总电极电位和电流关系曲线计算得到的烷基硫醇单分子层修饰厚度与烷基数目的关系图；
图4A是本发明涉及的金膜玻片表面不同厚度烷基硫醇单分子层介导的单个金纳米颗粒等离激元图像；
图4B是本发明涉及的金膜玻片表面不同厚度烷基硫醇单分子层介导的单个金纳米颗粒等离激元图像沿横切线的光学强度差异；
图5是本发明涉及的通过理论计算模拟单个金纳米颗粒不同相位下的等离激元图像以及对应的沿横切线光学强度分布图；
图6是本发明涉及的运用相位成像方法分析ssDNA:miRNA分子动态剪切过程导致单个纳米颗粒与金膜玻片之间距离变化的示意图；
图7是本发明涉及的单个金纳米颗粒的扫描电子显微镜图及粒径分布；
图8是本发明涉及的不同厚度烷基硫醇单分子修饰后金膜玻片的原子力显微镜图像及表面粗糙度的分布。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1单颗粒表面等离激元共振相位成像系统
如图1所示，本实施例搭建单颗粒表面等离激元共振相位成像系统，该系统包括单色激光发射模块，颗粒激发模块，颗粒散射强度检测模块；
如图1所示，本系统将单色激光光源引入等离激元共振相位成像中，作为具有等离激元共振效应的金膜玻片激发光源11，在本实施例中选择680nm红色激光作为激发光源，该光源配备一个光源强度控制器；通过光源强度的选择获得单个纳米颗粒的最优散射信号。
在单色激光进入60倍高数值孔径光学放大物镜22之前，为了将入射激光转换为p偏振光，系统引入了光学调整组件21。其中包含了用于调节光束方向的准直透镜(211)、用于产生特定偏振光并激发表面等离激元共振的p偏振片212、用于将散射光聚焦于高数值孔径光学显微放大物镜光学显微放大物镜后焦面上的聚光透镜213和用于实现一半光路反射一半光路透射的半透半反镜片214；实现以一定共振角度进入高数值孔径光学放大物镜22，后通过折射率匹配镜油照射至金膜玻片表面；运用样品池25，将含有金纳米颗粒的水溶液加入并固定在与样品池贴合的金膜玻片24表面。
首先，所述金膜玻片24是运用磁控溅射技术依次将厚度为2nm的铬和47nm的金覆盖在22mm×22mm载玻片上获得。金膜玻片在使用前需运用乙醇和超纯水依次冲洗后，用氮气吹干，最后用氢火焰处理金膜玻片以除去表面有机杂质，备用；分别配制不同烷基硫醇的修饰溶液：将正己硫醇、正辛硫醇、正癸硫醇、正十二烷硫醇、正十四烷硫醇、正十六烷硫醇和正十八烷硫醇分别加入到10mL乙醇中以获得浓度为5mM的不同硫醇修饰溶液；将前面处理好的金膜玻片放入相应的溶液中浸泡12个小时，使得金膜表面可以形成稳定且均匀的不同厚度烷基硫醇自组装单分子层；实验时用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质的样品池粘在金膜玻片表面，构建一个可以进行单个纳米颗粒成像测定盛放溶液的样品池25。
在检测器方面，通过互补金属氧化物半导体高速低噪相机(CMOS)作为图像采集器32直接检测单个金纳米颗粒的散射强度值和相位变化，可以极大提高光学成像的时间和空间分辨率。
确定最佳入射光强度和共振角度后，运用图像采集器记录下单个金纳米颗粒在修饰不同烷基硫醇分子的金膜玻片表面等离激元共振图像，并传输到电脑运用Matlab和Image J等图像处理软件进行信号提取和分析。
实施例2单个纳米颗粒耦合效应的测量方法
如图2，本发明还提供一种运用所述的系统实现单个纳米颗粒耦合效应测量的方法，测定具体方法包括：
(1)搭建单颗粒等离激元显微成像系统：
如实施例1所述，单颗粒等离激元显微成像系统搭建时将可进行强度调节的单色激光作为激发光源，通过光学调整元件得到入射角度可调节的p偏振光，颗粒的散射光可以运用图像采集器直接检测其强度值和相位信息。
(2)通过引入烷基硫醇单分子层来调节纳米颗粒与金膜玻片之间的距离，从而改变单颗粒与金膜玻片基底之间的耦合相互作用。
分别配制不同烷基硫醇的修饰溶液：将正己硫醇、正辛硫醇、正癸硫醇、正十二烷硫醇、正十四烷硫醇、正十六烷硫醇和正十八烷硫醇分别加入到10mL乙醇中以获得浓度为5mM的不同硫醇修饰溶液；将前面处理好的金膜玻片放入相应的溶液中浸泡12个小时，使得金膜表面可以形成稳定且均匀的不同厚度烷基硫醇自组装单分子层；实验时用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质的样品池粘在金膜玻片表面，构建一个可以进行单个纳米颗粒成像测定盛放溶液的样品池25；
将含有金纳米颗粒的水溶液加入到样品池内，使得颗粒固定在金膜基底的表面。筛选单个纳米颗粒等离激元成像信噪比最优的激发光共振角度和强度；
请参阅图7(金纳米颗粒及烷基硫醇单分子层修饰的金膜玻片的表征)，本实施例用扫描电子显微镜和动态光散射对测定的金纳米颗粒分布、粒径和形貌进行了表征；从数据可知，金纳米颗粒形貌均匀且粒径为60nm；同时，在水溶液的环境下，对烷基硫醇单分子层修饰的金膜玻片表面运用原子力显微镜的非接触模式对其粗糙度进行测定来验证单分子层的形成，如图8所示；烷基硫醇修饰的金膜玻片表面粗糙度出现不同程度增大，这说明了金膜玻片表面确实形成了单分子层，从而导致表面粗糙度增加。
(3)采集所述金纳米颗粒在不同厚度烷基硫醇单分子层介导下的光学图像以获得其强度及相位信息，从而推出其耦合效应的变化。
当单个金纳米颗粒与金膜玻片之间距离控制在1nm以内时，此时两者之间存在量子耦合效应，其等离激元共振强度较强，表现为单个金纳米颗粒的等离激元图像尾部中间区域为明条纹；当两者距离增大时，量子效应减弱至传统电磁耦合效应，单个金纳米颗粒的等离激元图像尾部中间区域为暗条纹。
具体地，用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质的样品池粘在已经预先清洁过的金膜玻片表面，构建一个可以进行单个纳米颗粒成像测定盛放溶液的样品池。
其次，单纳米颗粒等离激元相位成像系统的搭建：
将红色LED激光引入成像系统中，作为单颗粒等离激元成像的激发光源；单个金纳米颗粒共振激发产生的散射光是通过光学显微放大物镜(60倍，NA＝1.49)收集；对散射光信号的检测是用高速低噪CMOS相机，可以同步记录单个纳米颗粒散射强度值和其对应的相位信息。
最后，向样品池内加入含有直径为60nm金纳米颗粒的水溶液，通过非特异性吸附的作用将金纳米颗粒分散固定在不同修饰条件下的金膜玻片表面，从而获得相应的单个金纳米颗粒等离激元图像(如图4A所示)；当正十八烷基硫醇修饰在金膜玻片表面的厚度为2.6纳米，单个金纳米颗粒的等离激元图像中间为暗条纹，此时对应于经典电磁耦合效应；随着颗粒与金膜玻片之间距离减小，单个金纳米颗粒的等离激元图像中间条纹逐渐变亮，直至变为亮条纹，此时对应量子耦合效应(如图4B所示)。
(4)运用ssDNA:miRNA分子取代硫醇单分子层来介导单个金纳米颗粒与金膜玻片，通过双链剪切酶的剪切作用，获得介导层厚度动态变化导致的单纳米颗粒等离激元光学图像强度及相位的信息和耦合效应的变化。
先将一端连有巯基的ssDNA修饰在金膜玻片基底的表面，加入修饰有与ssDNA匹配的miRNA分子的金纳米颗粒与金膜玻片上的ssDNA形成双链结构。双链分子的厚度约为10.4nm，此时金纳米颗粒与金膜玻片之间存在经典电磁耦合效应，颗粒中间为暗条纹；当溶液中加入双链剪切酶对双链中的ssDNA进行剪切时，金纳米颗粒与金膜玻片之间的距离逐渐减小至0，金纳米颗粒与金膜玻片之间存在量子耦合效应，颗粒中间为亮条纹；
具体地，运用厚度为10.4纳米的ssDNA:miRNA分子取代硫醇单分子层来介导单个金纳米颗粒与金膜玻片，通过双链剪切酶DSN(Duplex specific nuclease)的剪切作用，获得介导层厚度动态变化导致的单纳米颗粒等离激元光学图像强度、相位的信息和耦合效应的变化，如图6所示，先将一端连有巯基的ssDNA(序列为5’-CTA GTG GTC CTA AAC ATT TCACTT T-(CH2)3-SH-3’)修饰在金膜玻片基底的表面，加入修饰有与ssDNA匹配的miRNA分子(序列为GUG AAA UGU UUA GGA CCA CUA G)的金纳米颗粒与金膜玻片上的ssDNA形成双链结构；双链分子的厚度约为10.4nm，此时金纳米颗粒与金膜玻片之间存在经典电磁耦合效应，颗粒中间为暗条纹；当溶液中加入双链剪切酶对双链中的ssDNA进行剪切时，金纳米颗粒与金膜玻片之间的距离逐渐减小至0，金纳米颗粒与金膜玻片之间存在量子耦合效应，颗粒中间为亮条纹。
上述结果表明，该系统可以精准测定由于单纳米颗粒与金膜玻片基底之间的距离改变引起的单颗粒等离激元共振图像散射强度和相位的动态变化，并对应于不同的耦合效应转变。同时，该系统提供了一种生物分子检测的新方法。
实施例3金膜玻片表面修饰烷基硫醇单分子层的厚度测定
为了计算金膜玻片表面修饰的单分子层厚度，本发明运用三电极体系对不同烷基硫醇修饰的金膜玻片在一定电极电位范围内(0～+0.05V)进行循环伏安充放电过程的扫描，如图3A所示。通过对充放电曲线积分可以得到金膜玻片修饰单分子层后的电容C，假设厚度d＝b*n(b是常数且n是碳原子数)，则C和n之间的关系可表示为：1/C＝b(εε0)-1n+(εε0)- 1ddl，可以计算得到相应的单分子层厚度(如图3B)，其中n为烷基链的碳原子数，ε为金电极上正链烷硫醇的介电常数(ε＝2.6)，ε0是真空介电常数，ddl是双电层的厚度。
实施例4真实性验证试验
单个金纳米颗粒等离激元图像中间条纹强度与相位的理论模型：
如图5所示，单个金纳米颗粒等离激元成像原理是单色激发光激发的平面等离激元波，和伴随着单颗粒散射的圆形等离激元波之间的干涉效应。金纳米颗粒的等离激元图像可以简化为以下公式：
I～Re{Esp(r)αEsp(r’)e-iκ|r-r’|},
其中Esp(r)代表r位置处的平面等离激元波，αEsp(r’)e-iκ|r-r’|为r’位置处金纳米颗粒的散射波，α和κ为单个金纳米颗粒的极化性和等离激元波的波数目。
上述公式表明金纳米颗粒得等离激元图像与α有关，可将α写作|α|eiδ，其中|α|为光学强度的大小，δ为相位；单个金纳米颗粒等离激元光学强度的大小及相位在经典电磁耦合效应向量子效应转变的过程中都会发生变化，请再次参阅图5，随着单分子层距离的逐渐增加，散射光的光强逐渐降低且其相位呈现180度的转换；
通过实施例4获得的试验图像与实施例5获得图像相比，理论计算数据和实验数据的变化趋势基本一致，即本发明提供的测试方法真实准确呈现了金纳米颗粒的耦合效应。
应用例1生物分子的精准识别
一端连有巯基的ssDNA(序列为5’-CTA GTG GTC CTA AAC ATT TCA CTT T-(CH2)3-SH-3’)与匹配的miRNA分子(序列为GUG AAA UGU UUA GGACCACUAG)形成双链结构，接着双链剪切酶对双链中的ssDNA进行剪切，金纳米颗粒与金膜玻片之间的距离逐渐减小至0，金纳米颗粒与金膜玻片之间发生耦合效应的转变，颗粒中间为暗条纹变为亮条纹。而如果采用单碱基非匹配miRNA分子(序列为GUG AAAUGU UUU GGACCACUA G)与ssDNA形成的非完全共轭结构无法被双链剪切酶剪切，因此不会产生等离激元图像的强度及相位变化。由此该方法可以实现对生物分子的精准识别；将该方法运用于生物分子的成像研究可以便于向生物体内的探索提供最直接，最强有力的定性及定量信息。
生物分子的高灵敏免标记动态成像检测引起的表面等离激元强度变化这一研究填补了该领域的空白。将纳米材料的相位转换过程与生物分子的识别研究相结合，预期实现通过改变单纳米材料的表面性质从而识别表面连接的生物分子。同时，在动态成像过程的捕获中，对产生的相位及耦合效应变化的研究，实现了化学及生物现象的研究及能量转换、生物传感器等方面具有非常重要的意义。
应用例2单分子层距离的高精度计算
该发明将不同距离的烷基硫醇单分子层插入单个金纳米颗粒及金膜玻片基底之间，观察等离激元光强及相位信号随着分子层距离的增加而减弱至消失的过程。伴随着该过程，颗粒与金膜玻片基底间的量子耦合效应也可能会发生从有到无的变化，从而表面等离激元共振图像的相位发生约180度左右的变化。因此，可以从等离激元图像强度及相位的差异来推出单分子层的距离，其计算精度较高，可以达到纳米级别的推算。该方法预期对低维度纳米材料具有普遍适用性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围。
Figure BDA0002490027940000111
Figure BDA0002490027940000121
序列表
<110> 南京大学
<120> 单个纳米颗粒的等离激元相位成像系统和耦合效应测量方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctagtggtcc taaacatttc actt 24
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gugaaauguu uaggaccacu ag 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gugaaauguu uuggaccacu ag 22

Claims (9)

1.一种单个纳米颗粒的耦合效应测量方法，其特征在于，所述测量方法包括：
（1）搭建单颗粒等离激元显微成像系统；该系统包括：
单色激光发射模块，其包括单色激光光源（11），用于将固定波长的单色激光引入表面等离激元成像中并调节所述激光的光强以满足成像需求；
颗粒激发模块，其设置在单色激光发射模块的下游，所述的颗粒激发模块包括用于调节光路路径及角度的光学调整组件（21）、用于光学信号放大成像的光学显微放大物镜（22）、用于高数值孔径油镜的折射率匹配镜油（23）、用于吸收激发光从而产生表面等离激元共振现象的金膜玻片（24）和用于盛放溶液的样品池（25）；
光学调整组件（21）、光学显微放大物镜（22）与折射率匹配镜油（23）配合用于将单色激光以p偏振光及表面等离激元共振的特定角度入射以激发金膜玻片表面的单个纳米颗粒等离激元共振获得散射光；
颗粒散射强度检测模块，其设置在颗粒激发模块的下游，所述的颗粒散射强度检测模块包括用于转换光学显微放大物镜发射的散射光路入射角度的反射镜片（31）以及用于获取反射镜发射光成像的图像传感器（32）;
（2）通过引入多个具有不同长度的烷基硫醇单分子层来调节纳米颗粒与金膜玻片之间的距离，从而改变单颗粒与金膜玻片基底之间的耦合相互作用；
（3）采集所述纳米颗粒在不同厚度烷基硫醇单分子层介导下的光学图像以获得其强度及相位信息，从而推出其耦合效应的变化；
（4）运用ssDNA:miRNA分子取代硫醇单分子层来介导单个纳米颗粒与金膜玻片，通过双链剪切酶的剪切作用，获得介导层厚度动态变化导致的单纳米颗粒等离激元光学图像强度及相位的信息和耦合效应的变化。
2.根据权利要求1所述的单个纳米颗粒的耦合效应测量方法，其特征在于，所述光学调整组件（21）包括用于调节光束方向的准直透镜（211）、用于产生特定偏振光并激发表面等离激元共振的p偏振片（212）、用于将散射光聚焦于光学显微放大物镜后焦面上的聚光透镜（213）和用于实现一半光路反射一半光路透射的半透半反镜片（214）。
3.根据权利要求1所述的单个纳米颗粒的耦合效应测量方法，其特征在于，所述的光学显微放大物镜（22）和金膜玻片（24）之间填充折射率匹配镜油（23），该光学显微放大物镜的数值孔径为1.49，折射率匹配镜油的折射率为1.51。
4.根据权利要求1所述的单个纳米颗粒的耦合效应测量方法，其特征在于，所述的金膜玻片（24）通过如下方法制备获得：在玻璃片表面通过磁控溅射的方法先镀上Cr层以增加金膜与玻璃片的粘附力，后镀上一层金膜用以作为表面等离激元共振产生的基底。
5.根据权利要求1所述的单个纳米颗粒的耦合效应测量方法，其特征在于，多个金膜玻片（24）分别用不同碳原子个数的烷基硫醇进行修饰以此来调节纳米颗粒与金膜玻片之间的距离。
6.根据权利要求1所述的单个纳米颗粒的耦合效应测量方法，其特征在于，步骤（2）中，将正己硫醇、正辛硫醇、正癸硫醇、正十二烷硫醇、正十四烷硫醇、正十六烷硫醇和正十八烷硫醇分别加入到乙醇中以获得浓度为不同硫醇修饰溶液；将前面处理好的金膜玻片放入相应的溶液中浸泡使得金膜表面可以形成稳定且均匀的不同厚度烷基硫醇自组装单分子层。
7.根据权利要求1所述的单个纳米颗粒的耦合效应测量方法，其特征在于，步骤（3）中，采集所述纳米颗粒在不同厚度烷基硫醇单分子层介导下的光学图像包括：
（31）将含有所述纳米颗粒的溶液加入所述样品池内，并通过非特异性作用吸附在金膜基底上修饰的烷基硫醇单分子层表面；
（32）通过电化学工作站给所述样品池施加一个固定扫速的扫描电压记录烷基硫醇单分子层修饰后的金膜玻片的充放电电流，通过对充放电过程的面积积分获得单分子层的电容，由电容可以计算得到相应的单分子层厚度；
（33）筛选基底表面的单个纳米颗粒表面等离激元激发角度，以获得最优图像分辨率，运用图像采集器获得单纳米颗粒的等离激元图像强度和相位信息，以获得分子层厚度与相位的关系。
8.根据权利要求1所述的单个纳米颗粒的耦合效应测量方法，其特征在于，步骤（4）中，所述通过巯基连接在金膜玻片与单个纳米颗粒之间的ssDNA:miRNA共轭分子双螺旋结构通过双链剪切酶对其结构中的ssDNA进行剪切，从而动态调控纳米颗粒与金膜玻片之间的距离以获得相位变化，同时图像采集器记录不同时间下的所述单个纳米颗粒的散射强度值及相位信息，并传输到电脑进行图像分析。
9.如权利要求1-8任意一项所述的方法在精准识别生物分子或者高精度计算单分子层距离中的应用。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113376225B (zh) * 2021-01-20 2023-03-14 中国科学技术大学 纳米材料的高分辨成像装置及其成像分析方法
CN113433067B (zh) * 2021-06-29 2022-09-23 北京大学 基于金属纳米间隙表面等离激元本征辐射的折射率传感器
CN113777008B (zh) * 2021-08-03 2022-09-30 中国科学技术大学 一种光学无损探测单纳米颗粒表界面转化的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104142315A (zh) * 2013-05-07 2014-11-12 中国科学院理化技术研究所 一种用于肿瘤细胞检测的表面等离子体共振传感芯片及其制备方法、应用
CN104293898A (zh) * 2013-07-17 2015-01-21 深圳国际旅行卫生保健中心 miRNA检测芯片、其制作方法和应用
CN105628655A (zh) * 2015-12-24 2016-06-01 温州生物材料与工程研究所 一种基于表面等离子体共振的光学显微镜

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100962290B1 (ko) * 2008-02-13 2010-06-11 성균관대학교산학협력단 금 나노입자의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서를 이용한 생체물질 검출 방법
US9915654B2 (en) * 2012-09-28 2018-03-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Light microscopy chips and data analysis methodology for quantitative localized surface plasmon resonance (LSPR) biosensing and imaging

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104142315A (zh) * 2013-05-07 2014-11-12 中国科学院理化技术研究所 一种用于肿瘤细胞检测的表面等离子体共振传感芯片及其制备方法、应用
CN104293898A (zh) * 2013-07-17 2015-01-21 深圳国际旅行卫生保健中心 miRNA检测芯片、其制作方法和应用
CN105628655A (zh) * 2015-12-24 2016-06-01 温州生物材料与工程研究所 一种基于表面等离子体共振的光学显微镜

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Digitizing Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay by Imaging and Counting Single Nanoparticles;Liang Yuan等;《Anal.Chem.》;20160113;第88卷;正文第1-4页 *

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