WO2016148313A1 - Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 - Google Patents

Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 Download PDF

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del
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cells
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백문창
문평곤
이정은
박호용
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주식회사 엑쏘좀
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention is a biomarker composition for diagnosing or prognosticing a cancer comprising Del-1 protein positive exosomes, a composition for diagnosing or prognosticing a cancer comprising the agent for detecting the biomarker, and a cancer comprising the composition
  • the present invention relates to a kit for diagnosis or prognosis prediction, a method for providing information for diagnosis or prognosis of cancer using the composition, and a method for screening a cancer therapeutic substance.
  • Tumors are the product of uncontrolled and disordered cell proliferation caused by an excess of abnormal cells, and when the tumors have destructive proliferative, invasive and metastatic properties, they are classified as malignant tumors, or cancers. do.
  • types of cancer include cerebral spinal cord tumor, head and neck cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer and biliary tract cancer.
  • cancer may be classified by different classification systems depending on the mechanism or form of the disease, and may also be classified according to the degree of progression. For example, the condition in which cancer cells are localized in the mucosa is classified as early cancer.
  • cancers In various cancers, the prognosis in treating cancer of patients found in the early cancer state appears to be relatively good. Therefore, early diagnosis and treatment of cancer is expected to contribute to lower cancer mortality rate and lower treatment cost. However, most cancers have no symptoms in the early stages, and even if they have symptoms, they are mildly indigestion or upper abdominal discomfort, so most people are easy to overlook it, which causes cancer mortality.
  • exosomes mean a small form of vesicles (membrane vesicle) secreted by most cells.
  • the exosomes contain various kinds of proteins, genetic material (DNA, mRNA, miRNA), lipids, etc. derived from the cell, and tissue-derived exosomes reflect the state of the tissue secreting the exosomes. It has been previously reported that it can be used for diagnosis.
  • the present inventors have continued the research to develop novel cancer diagnosis or prognostic markers, and when using Del-1 protein-positive exosomes, it was confirmed that cancer can be diagnosed or predicted quickly and accurately. By this, the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a biomarker composition for diagnosis or prognosis of cancer comprising Del-1 protein positive exosomes.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing or predicting cancer, including an agent for detecting Del-1 protein positive exosomes.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing or predicting cancer, including the composition.
  • Another object of the present invention to provide a method for providing information for the diagnosis or prognosis of cancer using the composition.
  • the present invention provides a biomarker composition for the diagnosis or prognosis of cancer, including Del-1 protein positive exosomes.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing or predicting cancer, including an agent for detecting Del-1 protein positive exosomes.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing or prognosticing a cancer comprising the composition.
  • the present invention comprises the steps of (a) separating the exosomes from the biological sample; And (b) confirming the expression level of Del-1 protein in the exosomes.
  • the method provides an information providing method for diagnosing or prognostic cancer.
  • the present invention comprises the steps of (a) treating the candidate substance to cancer cells; And (b) measuring the expression level of Del-1 protein in the exosome of the candidate-treated cells.
  • Del-1 protein-positive exosomes according to the present invention is significantly increased in the blood of cancer patients and decreased in patients after surgery compared to normal people, can be used as a biomarker for diagnosing cancer and predicting its prognosis.
  • Del-1 protein-positive exosomes are capable of diagnosing stage 1 to 4 breast cancers as well as stage 0 epithelial cancer, which was not easy to measure with known markers and methods. Since the back can be diagnosed, it can be usefully used to diagnose the cancer accurately and quickly and to predict the prognosis thereof.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for analyzing infiltration activity of MCF-7 cells.
  • Figure 2 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 or MDA-MB-231 cells using breast cancer cell culture.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the rate difference centrifugation process of MDA-MB-231 cell culture.
  • Figure 5 shows the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 or MDA-MB-231 cells using fractionation pellets of MCF-7 or MDA-MB-231 cell cultures obtained by rate difference centrifugation.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results confirmed by Western blot whether the expression of the exosome markers in the fraction pellet of MDA-MB-231 or MCF-7 cells obtained through the rate difference centrifugation.
  • Figure 6 is a diagram showing the result of confirming the number and size distribution of fractional pellets of MDA-MB-231 or MCF-7 cells obtained through the rate difference centrifugation using a flow cytometer.
  • Figure 7 is a diagram showing the result of confirming the diameter structure of the fraction pellet of MDA-MB-231 or MCF-7 cells obtained through the rate difference centrifugation by transmission electron microscope.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells using each fraction after centrifugation of a discrete pellet containing pellets (pellet 3) exosome density.
  • FIG. 9 shows Rab27a protein in normal MDA-MB-231 cell culture (Control), MDA-MB-231 cell culture (Vehicle) treated with the empty vector, and MDA-MB-231 cell culture (shRab27a) treated with shRab27a. It is a figure which shows the result of having confirmed the expression amount.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells using shRab27a MDA-MB-231 cell culture.
  • Figure 11 is a diagram showing the results confirmed by Western blot whether the expression of exosome markers in exosomes isolated from the plasma of breast cancer patients (EQ; Exoquick method, UC; ultracentrifugation method).
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of analyzing the exosomes isolated from the plasma of breast cancer patients with a vesicle size analyzer (EQ; Exoquick method, UC; ultracentrifugation method).
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of observing the exosomes isolated from the plasma of breast cancer patients by electron transmission microscope (EQ; Exoquick method, UC; ultracentrifugation method).
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells using exosomes isolated from the plasma of normal patients, breast cancer patients and postoperative patients.
  • 15 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells using MDA-MB-231 cell-derived exosomes or heated MDA-MB-231 cell-derived exosomes.
  • FIG. 17 is a diagram showing the results of confirming the expression of Del-1 protein through Western blot in MDA-MB-231 cell culture treated with three siRNAs for Del-1.
  • FIG. 17 is a diagram showing the results of confirming the expression of Del-1 protein through Western blot in MDA-MB-231 cell culture treated with three siRNAs for Del-1.
  • 18 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells using MDA-MB-231 cell culture treated with three siRNAs for Del-1.
  • 19 is a diagram showing the expression of Del-1 protein in the exosomes or cell lysates of MCF-7 cells overexpressing Del-1 protein and the result of infiltration activity of MCF-7 cells using the same.
  • FIG. 20 is a diagram showing the results of exosomes isolated from MDA-MB-231 cell culture, followed by immunogold labeling and observation with a transmission electron microscope.
  • FIG. 20 is a diagram showing the results of exosomes isolated from MDA-MB-231 cell culture, followed by immunogold labeling and observation with a transmission electron microscope.
  • 21 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells using a sample treated with an antibody to exosomes isolated from each cell culture medium or MDA-MB-231 cell culture.
  • 22 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells according to the concentration of standard Del-1 protein.
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells using exosomes, standard Del-1 protein, exosomes treated with PGNase F, or standard Del-1 protein treated with PGNase F.
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells using exosomes, standard Del-1 protein, exosomes treated with PGNase F, or standard Del-1 protein treated with PGNase F.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells using antibodies to various integrin types, RGD peptide, RGE peptide or IgG (control).
  • FIG. 25 shows Western blots of phosphorylation of FAK, SRC, ERK and expression of MMP-9, MMP-2 after treatment of MDA-MB-231 cell-derived exosomes with MCF-7 cells with cell signal transduction inhibitors.
  • Figure shows the results confirmed through.
  • Figure 26 shows the results confirmed by Western blot Del-1 protein expression in various breast cancer cells.
  • FIG. 27 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells using various breast cancer cells.
  • FIG. 28 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells using samples treated with antibodies to various breast cancer cell-derived exosomes.
  • 29 is a schematic diagram showing an experimental procedure using a breast cancer animal model.
  • FIG. 30 is a diagram showing the results of measuring the size of metastatic lesions in lung tissue of the animal model of breast cancer.
  • Figure 31 shows the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells using blood exosomes isolated from a breast cancer animal model injected with MDA-MB-231, shRab27a MDA-MB-231 or MCF-7 cells.
  • FIG. 32 is a diagram showing the results of measuring the degree of metastasis of breast cancer cells in tissue after injecting MDA-MB-231 cell-derived exosomes treated with each antibody into a breast cancer animal model injected with shRab27a MDA-MB-231 cells to be.
  • 33 is a schematic of a modified ELISA method for measuring Del-1 protein positive exosomes.
  • Figure 34 shows the change in tumor size, blood exosomes and Del-1 protein-positive exosomes after administration of cisplatin, an anticancer agent, to the animal model of breast cancer injected with MDA-MB-231 cells, and weekly collected blood exosomes.
  • Figure shows the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells.
  • 35 is a diagram showing the results of analysis of infiltration activity of MCF-7 cells using a sample treated with Del-1 antibody or PNGaseF in blood exosomes of a breast cancer patient.
  • 36 is a diagram showing the results of measurement of the concentration of Del-1 protein positive exosomes in the blood of normal patients, breast cancer patients and postoperative patients (C: control, D: DCIS, S1: stage 1, S2: stage 2, S3: stage 3, S4: stage 4, AS: After surge).
  • FIG. 37 is a comparison of the concentrations of CA 15-3 and Del-1 protein positive exosomes in normal and breast cancer patients.
  • 39 is a diagram confirming the concentration of Del-1 protein positive exosomes in normal, breast cancer, thyroid cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer patients and rheumatoid arthritis patients.
  • the present invention provides a biomarker composition for diagnosis or prognosis of cancer, including Del-1 protein positive exosomes.
  • diagnosis in the present invention means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, it is to confirm whether cancer develops.
  • prognosis refers to determining whether such subjects relapse, metastasis, drug reactivity, resistance, etc. after treatment of cancer.
  • the cancer is breast cancer (breast cancer), liver cancer (liver cancer), bladder cancer (bradder cancer), brain cancer (brain cancer), cervical cancer (cervical cancer), colorectal cancer (esophageal cancer), esophageal cancer, Gallbladder cancer, head and neck cancer, kidney cancer, lung cancer (small or non-small cell), melanoma, ovary Cancer (ovarian cancer, germ cell cancer), prostate cancer, pancreatic cancer, penile cancer, skin cancer, soft-tissue sarcoma sarcoma), squamous cell carcinomas, stomach cancer, testicular cancer, thyroid cancer, ileroid cancer, uterine cancer or uterine cancer It doesn't work.
  • Cancer in the present invention preferably includes breast cancer, thyroid cancer, gastric cancer, pancreatic cancer or biliary tract cancer, more preferably breast cancer.
  • marker is a substance that can predict the diagnosis or prognosis of cancer, polypeptides, nucleic acids (eg, mRNA, etc.), lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars that show an increase in cancer-causing individuals compared to normal individuals Organic biomolecules such as monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, and the like.
  • the marker is a Del-1 protein positive exosome.
  • the term 'exosome' refers to a small form of endoplasmic reticulum secreted from cells.
  • 'Del-1 protein positive exosome' in the present invention means having a Del-1 protein on the surface of the exosomes.
  • the Del-1 protein may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, variants of the protein are included within the scope of the present invention.
  • a variant of the protein means a protein in which the amino acid sequence of the Del-1 protein or fragment thereof and one or more amino acid residues have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • Amino acid exchange in proteins and fragments that do not alter the activity of the molecule as a whole is known in the art (H. Neurode, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the Del-1 protein may be encoded by a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and includes a variant capable of functioning the same as the nucleotide, but is not limited thereto.
  • the Del-1 protein may be glycosylated, and preferably the N-terminus is glycosylated.
  • 'glycosylation' in the present invention is one of the representative post translational modifications occurring in the endoplasmic reticulum of eukaryotic cells. This changes the structure and function of the protein, thereby greatly affecting the activity of the protein.
  • Del-1 protein positive exosomes according to the present invention is significantly increased in the blood of cancer patients and decreased in patients after surgery compared to normal people, it is possible to diagnose the cancer and predict the prognosis Can be utilized as a biomarker.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing or predicting cancer, including an agent for detecting Del-1 protein positive exosomes.
  • the detection agent includes those capable of measuring the expression level of Del-1 protein or mRNA encoding the surface of the exosome.
  • "measurement of expression level of protein” is a process of confirming the presence and the level of expression of a marker protein in a biological sample for diagnosis or prognosis of cancer, specifically binding to Del-1 protein on the surface of the exosome
  • the amount of protein can be confirmed using an antibody.
  • an analytical method for this for example, Western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rockets (Rocket) immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complete fixation assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), protein chip, etc. It is not limited.
  • an antibody refers to a protein molecule specific to an antigenic site as it is known in the art.
  • an antibody means an antibody that specifically binds to a Del-1 protein on the surface of an exosome, and such an antibody can be prepared by conventional methods, and any commercially available one can be used without limitation.
  • the antibody also includes a partial peptide that can be made from a protein, the partial peptide comprising at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, more preferably 12 or more amino acids.
  • the form of the antibody in the present invention is not particularly limited and, if it is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or antigen-binding, a part thereof is included in the antibody of the present invention and all immunoglobulin antibodies are included. Furthermore, the antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies.
  • Antibodies used in the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • the functional fragment of an antibody molecule means the fragment which has at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2, and Fv.
  • mRNA expression level measurement is a process of confirming the presence and expression level of mRNA of a marker gene in a biological sample for the diagnosis or prognosis of cancer. This can be confirmed by measuring the amount of antisense oligonucleotide, primer pair or probe that can detect mRNA.
  • RT-PCR competitive RT-PCR
  • RNase protection assay RPA
  • Northern Blots orther blotting
  • DNA microarray chips but are not limited thereto.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing or prognosticing a cancer comprising the composition.
  • kits of the present invention can be used for diagnosis and prognosis of cancer by confirming and detecting the level of the biomarker Del-1 protein positive exosome.
  • Kits of the present invention may further comprise one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for analytical methods as well as antibodies that selectively recognize markers for the diagnosis and prognosis of cancer.
  • the kit for measuring protein expression level in the present invention may include a substrate, a suitable buffer, a secondary antibody labeled with a chromophore or a fluorescent substance, and a chromogenic substrate for immunological detection of the antibody.
  • the substrate may be a nitrocellulose membrane, a plate synthesized with a polyvinyl resin, a plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like.
  • the color-enzyme may be a peroxidase or an alkaline phosphatase.
  • the fluorescent material may be FITC, RITC, etc.
  • the chromogenic substrate may be ABTS (2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) or OPD ( O-phenylenediamine), TMB (tetramethyl benzidine) can be used.
  • the present invention also comprises the steps of (a) separating the exosomes from the biological sample; And (b) confirming the expression level of Del-1 protein in the exosomes.
  • the method provides an information providing method for diagnosing or prognostic cancer.
  • the biological sample of step (a) includes whole blood, serum, plasma, saliva, urine, sputum, lymph, or cells, preferably plasma, but is not limited thereto.
  • the method of confirming the expression level of the protein in step (b) is Western blot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, oukteroni ( Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, flow cytometry or protein chip, It includes, but is not limited to, all protein detection methods known in the art.
  • Western blot may be performed through the following experiment.
  • the whole protein is isolated from the sample, electrophoresed to separate the protein according to size, and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody.
  • the amount of the generated antigen-antibody complex can be confirmed by using a labeled antibody to confirm the amount of protein to predict the diagnosis and prognosis of the cancer.
  • the detection method comprises a method of examining the expression level of Del-1 protein in the normal control group and the expression level of Del-1 protein in cancer suspects. Protein levels can be expressed as absolute (eg ⁇ g / ml) or relative (eg relative intensity of signals) differences of the Del-1 protein described above.
  • ELISA is a direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support
  • an indirect ELISA using a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of antibodies that recognize an antigen attached to a solid support
  • Direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the complex of the antibody and the antigen attached to the support reaction with another antibody that recognizes the antigen in the complex of the antibody and the antigen attached to the solid support
  • Various ELISA methods include indirect sandwich ELISA using recognized labeled secondary antibodies.
  • a labeled antibody that recognizes an antigen of the antigen-antibody complex is enzymatically developed or labeled for an antibody that recognizes an antigen of the antigen-antibody complex. It can be detected by the sandwich ELISA method which attaches the secondary antibody thus enzymatically and colors it.
  • a method of analyzing a sample using a protein chip may include separating the protein from the sample and hybridizing the separated protein with the protein chip to form an antigen-antibody complex, and reading the same to detect the presence of Del-1 protein.
  • the degree of expression can be checked to confirm the diagnosis and prognosis of the cancer.
  • the present invention (a) treating the cancer cells with a candidate material; And (b) measuring the expression level of Del-1 protein in the exosome of the candidate-treated cells.
  • the method may further include (c) comparing the expression level of the Del-1 protein of the exosome with the control.
  • control means a normal individual who does not have cancer.
  • the Del-1 protein expression level of the exosome of the present invention in the cancer cells disclosed herein in the absence of a candidate for treatment of cancer is specified, and the Del- of the exosome of the present invention in the presence of the candidate for cancer treatment 1
  • the expression level of the protein of the present invention after specifying the expression level of the protein and comparing the two, the substance which reduces the expression level of the marker of the present invention in the presence of the cancer treatment candidate is lower than the expression level of the marker in the absence of the cancer treatment candidate. It can be predicted as a treatment for cancer.
  • each cell was added to DMEM high concentration glucose (Eagle's minimal essential medium-high glucose) medium containing Fetal Bovine Serum (FBS) of 10% and incubated at 37 °C.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • MCF-7 cells were laid in the top well of the coated chamber, 500 ⁇ l of MDA-MB-231 cell culture was added thereto, and the bottom well was incubated with a medium containing 1% fetal bovine serum. After 48 hours, MCF-7 cells that passed through the coated chamber were stained with crystal violet and observed under a microscope. MCF-7 cells that passed through the coated chamber were counted and analyzed for the degree of infiltration.
  • MDA-MB-231 cell culture CM
  • MDA-MB-231 cell culture significantly increased infiltration of MCF-7 cells.
  • the infiltration ability of MDA-MB-231 cells was enhanced by the MDA-MB-231 culture, but it was confirmed that the MCF-7 culture was not significantly affected.
  • Example 1-2 Isolation and Identification of Factors Associated with Invasion of Breast Cancer Cells
  • Example 1-1 In order to separate the factors related to invasion of breast cancer cells in the MDA-MB-231 cell culture in accordance with the results of Example 1-1, a rate difference centrifugation or a discontinuous density gradient centrifugation of the breast cancer cell culture was performed.
  • MDA-MB-231 cells are 80-90% full in Petri dishes, they are incubated for another 48 hours after exchange with medium containing 1% fetal bovine serum. And a culture was obtained.
  • the MDA-MB-231 cell culture was sequentially centrifuged at 300 ⁇ g for 3 minutes, 1500 ⁇ g for 15 minutes, and 2500 ⁇ g for 15 minutes to remove cells, cell debris, and organelles.
  • the supernatant of the centrifuged sample was filtered using a 0.2 ⁇ m filter and centrifuged again at 100,000 ⁇ g for one hour to obtain exosome pellets and dissolved in PBS.
  • the above fractionation process is shown in FIG. 3.
  • MDA-MB-231 or MCF-7 breast cancer cells are placed in the upper well of the coated chamber, and the control, MDA-MB-231 breast cancer cell culture solution, Fractional pellets containing exosomes isolated from MDA-MB-231 breast cancer cell culture medium obtained through the process (pellet 3); And four kinds of MDA-MB-231 breast cancer cell culture medium (Sup 3 + pellet 2, see FIG. 3) from which exosomes were removed, respectively, and analyzed the invasive activity of breast cancer cells. The results are shown in FIG.
  • the exosomes in the fraction pellet obtained from the culture medium of MDA-MB-231 or MCF-7 cells have a typical exosome size and have a diameter structure of about 100 nm. It was confirmed that there is.
  • the fraction pellet (pellet 3) containing the exosomes obtained through the above process was subjected to discontinuous density gradient centrifugation. More specifically, pellets obtained after loading 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, and 5% OptiPrep solutions into (1.25-0. 0.941 g / cm -3 ) tubes, respectively was loaded on the top layer and ultracentrifuge for 16 hours at 210,000 ⁇ g , and then each fraction was ultracentrifuged at 200,000 ⁇ g for 1 hour to obtain a fraction.
  • MCF-7 breast cancer cells are placed in the upper well of the coated chamber, and each fraction obtained through the discontinuous density gradient centrifugation was added thereto. Then, the invasive activity of breast cancer cells was analyzed. The results are shown in FIG.
  • the main fraction showing the invasive activity of breast cancer cells is a density fraction of 1.14-1.19 mg / ml expected to contain exosomes.
  • exosomes play a major role in the infiltration of breast cancer cells.
  • Example 1-3 Relationship between infiltration of breast cancer cells and exosomes
  • the expression level of Rab27a protein was confirmed in the three kinds of cells.
  • Cell cultures obtained from 10 7 cells were collected and centrifuged to obtain exosome pellets, and their proteins were quantified.
  • MCF-7 cells were placed in the upper well of the coated chamber, and the control, normal MDA-MB-231 cell culture medium, and vehicle MDA- After adding MB-231 cell culture or shRab27a MDA-MB-231 cell culture, respectively, the invasive activity of breast cancer cells was analyzed. The results are shown in FIGS. 9 and 10.
  • exosome secretion in shRab27a MDA-MB-231 cell culture was reduced by 40-50% compared to the control group as previously reported, and it was confirmed that expression of Rab27a was normally inhibited by shRNA.
  • MCF-7 cell infiltration ability by shRab27a MDA-MB-231 cell culture medium was 50% compared to MCF-7 cell induction ability induced by MDA-MB-231 cell culture medium. It was confirmed that the decrease.
  • Example 1-4 Infiltration Characteristics of Exosomes Isolated from Plasma of Breast Cancer Patients
  • the average size of the exosomes separated by ultracentrifugation (UC) in the plasma of breast cancer patients is 91.1nm
  • exosomes separated using Exoquick separation (EQ) The average size of is 101.8nm, there is no significant difference in size between exosomes separated by two methods Confirmed.
  • Exoquick separation method was used in subsequent experiments.
  • blood samples obtained from normal or breast cancer patients (phases 0 to 4) and patients after breast cancer removal surgery were centrifuged at 17000 x g for 5 minutes to obtain plasma.
  • Exoquick-Exosome Precipitation Solution System biosciences
  • MCF-7 cells were placed in the upper well of the coated chamber, and separated from the plasma of patients with Ductal Carcinoma in situ (DCIS), which means stage 0.
  • DCIS Ductal Carcinoma in situ
  • S0 exosome
  • S1 ⁇ S4 exosomes isolated from the plasma of stage 1 to 4 breast cancer patients
  • AS exosomes isolated from the plasma of the patient
  • C normal people
  • Example 2-1 Identification of Factors Inducing Infiltration Among Components of Exosomes
  • RNA and lipid of the exosomes induce the invasion of breast cancer cells, the exosomes were denatured to a high temperature, and the following experiment was performed.
  • MCF-7 cells are laid in the upper well of the coated chamber, and the control, MDA-MB-231 exosomes, 90 minutes at 90 °C Heated MDA-MB-231 exosomes or heat-treated MDA-MB-231 exosomes were added for 5 minutes at 65 ° C., respectively, and the invasive activity of breast cancer cells was analyzed. The results are shown in FIG.
  • the group treated with exosomes heated at 90 ° C. or 65 ° C. was found to have lower invasive activity of breast cancer cells than the group treated with exosomes without heat.
  • the protein of exosomes which appears to be destroyed by heat is a factor related to invasion of breast cancer cells.
  • each sample was treated with 10 mM dithiothreitol and reduced for 20 minutes at 60 ° C. for effective peptideization. Then, 50 mM of iodoacetamide was treated to induce degeneration of the exosome protein through alkylation. After the reaction, acrylamide, ammonium persulfate, and tetramethylethylenediamine (TEMED) were added to the exosome protein sample and gelled. The hard gel was cut into small pieces, washed with 100 mM triethylammonium bicarbonate (TEAB) solution and acetonitrile solution and dried under reduced pressure.
  • TEAB triethylammonium bicarbonate
  • MDA-MB-231 cell culture medium obtained by placing MCF-7 cells in the upper well of the coated chamber and treating each siRNA in the same manner as the invasion assay method of Example 1-1.
  • MB-231 cell culture or exosomes were treated and the invasive activity of breast cancer cells was analyzed. The results are shown in FIGS. 17 and 18.
  • MDA-MB-231 cell culture medium in which Del-1 protein expression was reduced by siRNA decreased induction ability of breast cancer cells by about 2-3 times compared to normal state.
  • Del-1 protein was re-validated by overexpressing Del-1 protein in MCF-7 exosomes with low expression of Del-1 protein.
  • the plasmid encoding the human Del-1 protein in MCF-7 cells was treated with the transfection material to induce the MCF-7 cells to express Del-1 protein.
  • Vehicle plasmids that do not encode proteins were treated as controls.
  • the expression of Del-1 protein was confirmed by Western blot.
  • MCF-7 cells were laid in the upper well of the coated chamber, and treated with the MCF-7 cell culture solution, respectively, followed by infiltration analysis of breast cancer cells. Was performed. The results are shown in FIG. 19.
  • Del-1 protein was present on the surface of exosomes isolated from MDA-MB-231 cell culture.
  • the group treated with MDA-MB-231 exosomes with neutralized Del-1 protein function compared to the group treated with exosomes without neutralizing Del-1 protein function, invading breast cancer cells. The ability was reduced .
  • MCF-7 cells were placed in an upper well of a coated chamber, and standard Del-1 protein was added thereto at a concentration of 0.05 to 2 ⁇ g, followed by breast cancer cells Infiltration analysis of was performed.
  • MDA-MB-231 exosomes treated with PGNase F or standard Del-1 protein which can remove the N-glycosylation group of Del-1 protein. It was.
  • MDA-MB-231 exosomes and standard Del-1 protein were used as a control. The results are shown in FIGS. 22 and 23.
  • the infiltration of the standard Del-1 protein and integrin was confirmed by infiltration analysis of MCF-7 cells using various integrin-type antibodies. More specifically, in the same manner as the invasion assay method of Example 1-1, MCF-7 cells are placed in the upper well of the coated chamber, and ⁇ 1, ⁇ 5, ⁇ v, ⁇ v ⁇ 5 or ⁇ v ⁇ 6 type integrin antibodies are standard. Treated with Del-1 protein.
  • the integrin antagonist RGD peptide, a counterpart control RGE peptide or IgG (control) of the RGD peptides were incubated for 10 minutes, and then the cells were coated in a coated chamber. The wells were plated and treated with standard Del-1 protein and analyzed for invasive activity of breast cancer cells . The same experiment was performed using breast cancer cell derived exosomes instead of the standard Del-1 protein. The results are shown in FIG.
  • invagrin antibody of ⁇ v ⁇ 5 type inhibited the invasive activity of breast cancer cells by Del-1 protein.
  • This interaction of integrin and Del-1 protein was inhibited by the RGD peptide, it was confirmed that the RGE peptide is not affected.
  • Del-1 protein of breast cancer cell-derived exosomes also inhibited invasive activity by ⁇ v ⁇ 5 type integrin antibody.
  • MCF-7 cells were treated with MDA-MB-231 cell-derived exosomes for 30 minutes with a cell signal transduction inhibitor (PF573228), and then cell lysates were separated. , Western blot was performed.
  • Antibodies were used for the normal and phosphorylated types of focal adhesion kinase (FAK), family of protooncogenic tyrosine kinase (SRC), and signal-regulated kinase (ERK), which are subtypes of integrin signal transduction.
  • FAK focal adhesion kinase
  • SRC protooncogenic tyrosine kinase
  • ERK signal-regulated kinase
  • MDA-MB-231 cell-derived exosomes were treated with an inhibitor of cell signaling material (PF573228) for 24 hours to obtain a cell culture solution, which was concentrated and subjected to electrophoresis using gel containing gelatin. . After electrophoresis, gelatin degradation of MMPs was induced, and gels were stained to measure MMP activity through digested gelatin band analysis. The results are shown in FIG.
  • Del-1 protein was expressed in various breast cancer cells except BT-549 cells.
  • MCF-7 cells are placed in the upper well of the coated chamber, and the other breast cancer cells (BT-549, MDA-MB-453, UACC-812, UACC-893, UACC-3199, UACC-3133, UACC-1179 or UACC-732) were treated, respectively, and the invasive activity of breast cancer cells was confirmed.
  • exosomes isolated from other breast cancer cells (BT-549, MDA-MB-453, UACC-893) were treated in the same manner to confirm the invasive activity of breast cancer cells. The results are shown in FIGS. 27 and 28.
  • exosomes isolated from MDA-MB-453 or UACC-893 cells but not exosomes isolated from BT-549 cells without Del-1 protein expression, infiltrated MCF-7 cells. Increasing capacity, it was confirmed that the activity is inhibited by Del-1 protein antibody.
  • Example 3-4 Identification of the mechanism of Del-1 protein involved in breast cancer cell invasion in animal models
  • MCF-7, MDA-MB-231 or shRab27a (Rab27a (-)) MDA-MB-231 cells were injected into breast fat pads of BALB / c Nude mice, respectively. Every day, MDA-MB-231 cell-derived exosomes were injected and the other group was injected with PBS. Three weeks after each breast cancer cell injection, mice were sacrificed and lungs were isolated, and metastatic lesions of the lungs were identified by immunohistochemistry (IHC) using antibodies against human vimentin. The experimental procedure is shown in FIG. 29 and the results in FIG. 30.
  • IHC immunohistochemistry
  • the size of the metastatic lesions in the lungs was shown in the order of the group injected with MDA-MB-231, Rab27a (-) MDA-MB-231, and MCF-7 cells, and the group injected with breast cancer cells only. Compared to the group injected with MDA-MB-231 cell-derived exosomes, the size of lung metastatic lesions was significantly increased. In particular, when co-injected with weakly invasive MCF-7 cells with MDA-MB-231 cell-derived exosomes, the size of metastatic lesions was 2 to 3 times larger than that of MCF-7 cells.
  • MCF-7 cells are placed in the upper well of the coated chamber, where MDA-MB-231, shRab27a MDA-MB-231 or MCF-7 After each addition of blood exosomes isolated from the animal model of breast cancer injected with cells, the invasive activity assay of the breast cancer cells was performed. The results are shown in FIG.
  • Del-1 protein of exosomes promoted metastasis of breast cancer cells in an animal model of breast cancer.
  • the tumor size gradually increased from 1 week after breast cancer cell injection, and was confirmed to be maximized at 10 weeks. No significant change was observed in blood exosomes for 10 weeks, but blood Del-1 protein-positive exosomes increased from 2 weeks, the initial state of which tumor size could not be confirmed, and maintained high levels until 10 weeks.
  • the group treated with the exosomes neutralized with the Del-1 protein of the exosomes using the Del-1 antibody and the Del- using the PNGaseF. It was confirmed that the invasive activity of breast cancer cells in the group treated with exosomes deglycosylated 1 protein. Through this, it was confirmed that the glycated Del-1 protein in the blood exosome has a major effect on the invasive ability of breast cancer cells.
  • Del-1 protein positive exosomes were used as markers for diagnosing or prognostic breast cancer. ELISA analysis was performed.
  • CD63 polyclonal antibody (O / N) was coated on a 96 well plate by O / N and then blocked using a blocking solution.
  • stage 0 stage DCIS
  • stages 1-4 patients 1-4 patients
  • postoperative patients 1 ul of normal human blood
  • 1 ul of normal human blood was injected into the wells for 2 hours, washed thoroughly, and then a monoclonal (detection antibody) Monoclonal) Del-1 antibody was used to check the expression of Del-1 protein of exosomes.
  • CA 15-3 which is used as a diagnostic biomarker for detecting metastatic (stage 4) breast cancer in the same patient. The results are shown in FIGS. 36 to 38.
  • the existing biomarker CA 15-3 showed low sensitivity in stages 0, 1, 2, and 3 of low stage breast cancer, and high sensitivity only in stage 4 of metastatic cancer. Confirmed.
  • Del-1 protein positive exosomes were increased in all stages of breast cancer compared to normal, and decreased after surgery.
  • Del-1 protein positive exosomes can be used as markers for the diagnosis or prognosis of cancers other than breast cancer, breast cancer patients, thyroid cancer patients, gastric cancer patients, pancreatic cancer patients, biliary cancer patients And expression of Del-1 protein of exosomes in the same manner as in Example 4-3 using the plasma of rheumatoid arthritis patients. The results are shown in FIG. 39.
  • Del-1 protein-positive exosomes were increased in breast cancer patients as well as other cancer patients as compared to normal patients.

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Abstract

본 발명은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물, 상기 바이오마커를 검출하는 제제를 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 키트, 상기 조성물을 이용한 암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법 및 암 치료물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Del-1 단백질 양성 엑소좀은 정상인에 비해 암 환자의 혈액에서 현저하게 증가하고 수술 후 환자에서는 감소하는 바, 암을 진단하고 그 예후를 예측할 수 있는 바이오마커로서 활용될 수 있다. 특히, Del-1 단백질 양성 엑소좀은 기존에 알려진 마커 및 방법으로는 측정하기 쉽지 않았던 유방암 0기인 상피내암 상태뿐 아니라 1 내지 4기의 유방암 진단이 가능하며, 유방암 외에도 갑상선암, 위암, 췌장암 담도암 등을 진단할 수 있으므로, 정확하고 신속하게 암을 진단하고, 그 예후를 예측하는데 유용하게 활용될 수 있다.

Description

DEL-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물
본 발명은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물, 상기 바이오마커를 검출하는 제제를 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 키트, 상기 조성물을 이용한 암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법 및 암 치료물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
종양(Tumor)은 비정상적인 세포의 과잉으로 인하여 발생하는 비제어적이고, 무질서한 세포 증식의 산물로서, 상기 종양이 파괴적인 증식성, 침윤 및 전이성을 가지게 되면 악성종양(malignant tumor), 즉 암으로 분류하게 된다. 암의 종류는 현재까지 밝혀진 것만 해도 수십 종에 이르며, 주로 발병 조직의 위치에 따라 구분된다. 예를 들어, 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암 등이 있다. 또한, 암은 발병 기전 또는 형태에 따라 다른 분류 체계에 의해 구분되기도 하며, 그 진행 정도에 따라 구분되기도 한다. 일례로 암세포가 점막 내에 국한되어 있는 상태를 조기암으로 분류하는데, 다양한 암에 있어, 조기암 상태에서 발견된 환자의 암 치료시의 예후는 비교적 좋은 것으로 나타난다. 따라서 암의 조기 진단 및 치료는 암의 사망률을 낮추고, 치료 비용을 낮추는데 기여할 것으로 판단된다. 그러나 대부분의 암은 초기에는 증상이 없으며, 증상이 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람이 이를 간과하기 쉽고, 이는 암의 사망률을 높이는 원인이 되고 있다.
현재까지 이용되는 암의 진단 수단은 물리적인 방법으로 이중조영법, 압박촬영법 또는 점막촬영법 등이 있다. 또한, 조직 검사(생검)하여 암이 의심스러운 부분을 직접 진단할 수 있다. 그러나 상기 방법들은 위생상의 문제가 있고, 검사가 진행되는 동안 환자가 고통을 감수해야 하는 단점이 있어, 이를 대체할 만한 진단 방법이 필요하다.
한편, 엑소좀은 대부분의 세포에서 분비되는 작은 형태의 소포체(membrane vesicle)를 의미한다. 엑소좀 안에는 그 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA), 지질 등이 포함되어 있으며, 조직 유래 엑소좀은 엑소좀을 분비한 조직의 상태를 반영하기 때문에, 질병의 진단에 이용될 수 있다는 가능성이 종래 보고된 바 있다.
이에 본 발명자는 신규한 암의 진단 또는 예후 예측용 마커를 개발하기 위한 연구를 지속한 결과, Del-1 단백질 양성 엑소좀을 이용할 경우, 정확하고 신속하게 암을 진단하거나 예후를 예측할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 검출하는 제제를 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 치료 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 검출하는 제제를 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 엑소좀에서 Del-1 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;를 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 암 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보물질이 처리된 세포의 엑소좀에서 Del-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 암 치료 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 Del-1 단백질 양성 엑소좀은 정상인에 비해 암 환자의 혈액에서 현저하게 증가하고 수술 후 환자에서는 감소하는 바, 암을 진단하고 그 예후를 예측할 수 있는 바이오마커로서 활용될 수 있다. 특히, Del-1 단백질 양성 엑소좀은 기존에 알려진 마커 및 방법으로는 측정하기 쉽지 않았던 유방암 0기인 상피내암 상태뿐 아니라 1 내지 4기의 유방암 진단이 가능하며, 유방암 외에도 갑상선암, 위암, 췌장암 담도암 등을 진단할 수 있으므로, 정확하고 신속하게 암을 진단하고, 그 예후를 예측하는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 유방암 세포 배양액을 이용한 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 MDA-MB-231 세포 배양액의 속도차 원심분리 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 속도차 원심분리를 통해 수득한 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포 배양액의 분획 펠렛을 이용한 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 속도차 원심분리를 통해 수득한 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 분획 펠렛에서 엑소좀 마커의 발현 여부를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 속도차 원심분리를 통해 수득한 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 분획 펠렛을 유세포 분석기를 이용하여 그 개수 및 크기 분포를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 속도차 원심분리를 통해 수득한 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 분획 펠렛을 투과전자현미경으로 관찰하여 직경 구조를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 엑소좀이 포함된 분획펠렛(펠렛 3)을 불연속 밀도 구배 원심분리한 한 후, 각각의 분획물을 이용한 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 정상 MDA-MB-231 세포 배양액(Control), 공벡터를 처리한 MDA-MB-231 세포 배양액(Vehicle), 및 shRab27a를 처리한 MDA-MB-231 세포 배양액(shRab27a)에서 Rab27a 단백질의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 shRab27a MDA-MB-231 세포 배양액을 이용한 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀에서 엑소좀 마커의 발현 여부를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(EQ; Exoquick 방법, UC; 초원심분리방법).
도 12는 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀을 베지클 사이즈 분석기로 분석한 결과를 나타낸 도이다(EQ; Exoquick 방법, UC; 초원심분리방법).
도 13은 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀을 전자투과현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다(EQ; Exoquick 방법, UC; 초원심분리방법).
도 14는 정상인, 유방암 환자 및 수술 후 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀을 이용한 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 MDA-MB-231 세포 유래 엑소좀, 또는 열을 가한 MDA-MB-231 세포 유래 엑소좀을 이용한 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포 배양액에서 분리한 엑소좀; 정상 유방 세포주인 MCF10A 및 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포를 각각 용해하여 수득한 세포 용해물(Cell lysate)에서 Del-1 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 Del-1에 대한 3가지 siRNA를 처리한 MDA-MB-231 세포 배양액에서 Del-1 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 Del-1에 대한 3가지 siRNA를 처리한 MDA-MB-231 세포 배양액을 이용한 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 Del-1 단백질을 과발현시킨 MCF-7 세포의 엑소좀 또는 세포 용해물에서 Del-1 단백질의 발현 및 이를 이용한 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 MDA-MB-231 세포 배양액에서 분리한 엑소좀에 항체를 처리한 후, 면역금표지(immunogold)하여 투과전자현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 각 세포 배양액 또는 MDA-MB-231 세포 배양액에서 분리한 엑소좀에 항체를 처리한 샘플을 이용한, MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 표준 Del-1 단백질의 농도에 따른 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 엑소좀, 표준 Del-1 단백질, PGNase F를 처리한 엑소좀 또는 PGNase F를 처리한 표준 Del-1 단백질을 이용한 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 다양한 인테그린 타입에 대한 항체, RGD 펩타이드, RGE 펩타이드 또는 IgG (대조군)를 이용한 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 MCF-7 세포에 MDA-MB-231 세포 유래 엑소좀을 세포 신호 전달물질 저해제와 함께 처리한 후, FAK, SRC, ERK의 인산화 및 MMP-9, MMP-2의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 다양한 유방암 세포에서의 Del-1 단백질 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 27은 다양한 유방암 세포를 이용한 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 28은 다양한 유방암 세포 유래 엑소좀에 항체를 처리한 샘플을 이용한, MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 29는 유방암 동물모델을 이용한 실험 과정을 나타낸 모식도이다.
도 30은 유방암 동물모델의 폐 조직에서 전이성 변병의 크기를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 31은 MDA-MB-231, shRab27a MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포를 주입한 유방암 동물모델로부터 분리한 혈중 엑소좀을 이용한, MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 32는 shRab27a MDA-MB-231 세포를 주입한 유방암 동물모델에 각 항체를 처리한 MDA-MB-231 세포 유래 엑소좀을 주입한 후, 조직 내 유방암 세포의 전이 정도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 33은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 측정하기 위한 변형된 ELISA 방법을 나타낸 모식도이다.
도 34는 MDA-MB-231 세포를 주입한 유방암 동물모델에 항암제인 시스플라틴을 투여한 뒤 종양의 크기, 혈중 엑소좀 및 Del-1 단백질 양성 엑소좀의 변화와, 매주 수집된 혈중 엑소좀을 이용한 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 35는 유방암 환자의 혈중 엑소좀에 Del-1 항체 또는 PNGaseF를 처리한 샘플을 이용한 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 36은 정상인, 유방암 환자 및 수술 후 환자의 혈중 Del-1 단백질 양성 엑소좀의 농도 측정 결과를 나타낸 도이다(C: control, D: DCIS, S1: stage 1, S2: stage 2, S3: stage 3, S4: stage 4, AS: After surge).
도 37은 정상인 및 유방암 환자에서 CA 15-3 및 혈중 Del-1 단백질 양성 엑소좀의 농도를 비교한 도이다.
도 38은 정상인 및 유방암 환자에서 CA 15-3 및 혈중 Del-1 단백질 양성 엑소좀의 민감도를 비교한 도이다.
도 39는 정상인, 유방암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 담도암 환자 및 류마티스 관절염 환자에서 Del-1 단백질 양성 엑소좀의 농도를 확인한 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 암의 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 용어 "예후"란 암의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 암은 유방암(breast cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 뇌암(brain cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 대장암(colorectal cancer), 식도암(esophageal cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 두경부암(head and neck cancer), 신장암(kidney cancer), 폐암(소세포 또는 비-소세포)(lung cancer (small or non-small cell)), 흑색종(melanoma), 난소암(ovarian cancer), 생식세포암(ovary (germ cell) cancer), 전립선암(prostate cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 음경암(penile cancer), 피부암(skin cancer), 연조직 육종(soft-tissue sarcoma), 편평상피세포암(squamous cell carcinomas), 위암(stomach cancer), 고환암(testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 담도암(bile duct cancer) 또는 자궁암(uterine cancer)을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 암은 바람직하게는, 유방암, 갑상선암, 위암, 췌장암 또는 담도암을 포함하며, 더욱 바람직하게는 유방암이다.
본 발명에서 "마커"란 암의 진단 또는 예후를 예측할 수 있는 물질로, 정상 개체에 비해 암이 발생한 개체에서 증가를 보이는 폴리펩타이드, 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 마커는 Del-1 단백질 양성 엑소좀이다.
본 발명에서 용어 '엑소좀'은 세포에서 분비되는 작은 형태의 소포체를 의미하는 것이다.
본 발명에서 용어 'Del-1 단백질 양성 엑소좀'은 엑소좀의 표면에 Del-1 단백질을 가진 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 Del-1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있으며, 상기 단백질의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 단백질의 변이체란 Del-1 단백질 또는 이의 단편의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 단편에서의 아미노산 교환은 당업계에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
상기 Del-1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있고, 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체를 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
상기 Del-1 단백질은 당화(glycosylation)된 것일 수 있으며, 바람직하게는 N-말단이 당화된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 '당화'는 진핵세포의 소포체에서 일어나는 대표적인 번역후 과정(post translational modification) 중의 하나이다. 이는 단백질의 구조와 기능에 변화를 가져옴으로써 단백질의 활성에 큰 영향을 미친다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 Del-1 단백질 양성 엑소좀은 정상인에 비해 암 환자의 혈액에서 현저하게 증가하고 수술 후 환자에서는 감소하는 바, 암을 진단하고 그 예후를 예측할 수 있는 바이오마커로서 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 검출하는 제제를 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상기 검출 제제는 엑소좀 표면의 Del-1 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 것을 포함한다.
본 발명에서 "단백질의 발현 수준 측정"은 암의 진단 또는 예후 예측을 위하여 생물학적 시료에서 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 엑소좀 표면의 Del-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용해 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 예를 들어, 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), 유세포분석법(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "항체"란 당업계에 공지된 용어로서 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 엑소좀 표면의 Del-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있고, 시판되는 것을 제한없이 이용할 수 있다. 상기 항체에는 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 상기 부분 펩티드는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명에서 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다. 본 발명에서 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 "mRNA 발현 수준 측정"은 암의 진단 또는 예후 예측을 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 엑소좀 표면의 Del-1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA를 검출할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브의 양을 측정해 확인할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 예를 들어, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏(northern blotting), 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은, 상기 조성물을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 바이오 마커인 Del-1 단백질 양성 엑소좀의 수준을 확인하여 이를 검출함으로써 암의 진단 및 예후 예측에 이용될 수 있다. 본 발명의 키트에는 암의 진단 및 예후 예측을 위해 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있으며, 발색 기질은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(O-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 엑소좀에서 Del-1 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;를 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 또는 세포를 포함하며, 바람직하게는 혈장이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (b) 단계의 단백질의 발현 수준을 확인하는 방법은 웨스턴 블랏, 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Ouchterlony) 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS(Flow Cytometry) 또는 단백질 칩(protein chip)을 포함하며, 당업계에 알려진 단백질 검출 방법을 모두 포함하고, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 웨스턴 블랏은 하기와 같은 실험을 통해 수행될 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 단백질의 양을 확인하여, 암의 진단 및 예후를 예측할 수 있다. 상기 검출 방법은 정상 대조군에서의 Del-1 단백질의 발현량과 암 의심개체에서의 Del-1 단백질의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. 단백질 수준은 상기한 Del-1 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대강도) 차이로 나타낼 수 있다.
예를 들어, ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 예를 들어, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다.
예를 들어, 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, Del-1 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 암의 진단 및 예후 예측을 확인할 수 있다.
또한 본 발명은, (a) 암 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보물질이 처리된 세포의 엑소좀에서 Del-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 암 치료 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법은 (c) 상기 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현 수준을 대조구와 비교하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "대조구"란 암에 걸리지 않은 정상개체를 의미한다.
구체적으로, 암 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 Del-1 단백질 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 엑소좀의 Del-1 단백질 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 본 발명에서 개시하고 있는 암의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 암의 치료 후보 물질의 부재하에 본 발명에서 개시된 암 세포에서의 본 발명의 엑소좀의 Del-1 단백질 발현 수준을 특정하고, 또한 암 치료 후보 물질의 존재하에서 본 발명의 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현 수준을 특정하여 양자를 비교한 후, 암 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 암 치료 후보 물질의 부재 하에서의 마커의 발현 수준보다 감소시키는 물질을 본 발명에서 개시된 암의 치료제로 예측할 수 있는 것이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 유방암 세포의 침윤 활성과 관련된 인자의 분리 및 검증
실시예 1-1. 유방암 세포의 침윤 분석
유방암 세포의 배양액에서 유방암 세포의 침윤과 관련된 인자가 존재하는지를 확인하고, 이를 분리하기 위하여, 침윤성을 가지는 인간 유방 선암 세포 MDA-MB-231 및 약한 침윤성을 가지는 인간 유방암 세포 MCF-7을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 포함하는 DMEM 고농도 글루코오스(Eagle's minimal essential medium-high glucose) 배지에 각 세포를 넣고 37℃에서 배양하였다. 세포가 90% 이상 배양되면, 1% 우태아혈청을 포함하는 DMEM 배지로 교환한 후 다시 48시간 동안 배양하고, 배양액을 수득하였다.
유방암 세포의 침윤 활성 분석을 수행하기 위하여, 공극 지름(pore diameter)이 8㎛인 웰(well)을 24 웰에 삽입하고 25%의 마트리겔(Matrigel)로 2시간 동안 코팅하였다. 상기 코팅된 챔버 상부 웰에 10,000개의 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 MDA-MB-231 세포 배양액 500 ㎕를 희석하여 첨가하였으며, 하부 웰에는 1% 우태아혈청을 포함하는 배지를 넣어 배양하였다. 48시간 뒤 코팅된 챔버를 통과한 MCF-7 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하고 현미경으로 관찰하였으며, 상기 코팅된 챔버를 통과한 MCF-7 세포를 계수하여 침윤 정도를 분석하였다. 이상과 동일한 방법으로 코팅된 챔버 상부 웰에 10,000개의 MDA-MB-231 세포를 깔고, MCF-7 세포 배양액 500 ㎕을 첨가하여 침윤 정도를 분석하였다. 대조군으로는 혈청-프리 배지(SF)를 이용하였다. 이상의 세포 침윤 분석 방법에 대한 모식도를 도 1에 나타냈으며, 침윤 분석 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 세포 배양액(CM)이 MCF-7 세포의 침윤을 현저하게 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, MDA-MB-231 세포의 침윤 능력은 MDA-MB-231 배양액에 의해서 향상되었지만 MCF-7 배양액에는 유의한 영향을 받지 않음을 확인하였다.
실시예 1-2. 유방암 세포의 침윤과 관련된 인자 분리 및 확인
상기 실시예 1-1의 결과에 따라 MDA-MB-231 세포 배양액 내에서 유방암 세포의 침윤과 관련된 인자를 분리하기 위하여, 유방암 세포 배양액의 속도차 원심분리 또는 불연속 밀도 구배 원심분리를 수행하였다.
보다 구체적으로, 속도차 원심분리를 수행하기 위하여, MDA-MB-231 세포가 페트리 디쉬에 80-90% 정도 가득 찼을 때, 1% 우태아혈청을 포함하는 배지로 교환한 후 다시 48시간 동안 배양하고 배양액을 수득하였다. 상기 MDA-MB-231 세포 배양액을 300×g에서 3 분, 1500×g에서 15 분 및 2500×g에서 15 분의 조건으로 순차적으로 원심분리하여 세포, 세포 파괴물 및 세포 소기관 등을 제거하였다. 상기 원심분리된 시료의 상층액을 0.2 ㎛의 필터를 이용하여 걸러내고, 100,000×g 에서 한시간 동안 다시 원심분리하여 엑소좀 펠렛을 수득하고 이를 PBS에 녹였다. 이상의 분획 과정을 도 3에 나타내었다.
상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에는 MDA-MB-231 또는 MCF-7 유방암 세포를 깔고, 여기에 대조군, MDA-MB-231 유방암 세포 배양액, 상기 과정을 통해 수득한 MDA-MB-231 유방암 세포 배양액에서 분리한 엑소좀이 포함된 분획 펠렛(펠렛 3); 및 엑소좀이 제거된 MDA-MB-231 유방암 세포 배양액(상층액(Sup) 3 + 펠렛 2, 도 3 참고) 등 4 종류를 각각 첨가하여 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 엑소좀이 포함된 분획 펠렛(펠렛 3, 도 4의 Exosome)을 처리한 군에서 유방암 세포의 침윤 활성 증가를 확인하였으며, 엑소좀이 제거된 MDA-MB-231 세포 배양액(상층액 3 + 펠렛 2, 도 4의 w/o Exosome)을 처리한 군에서는 이러한 세포 침윤 활성의 변화가 나타나지 않음을 확인하였다.
또한, 상기 과정을 통해 수득한 엑소좀이 포함된 분획 펠렛(펠렛 3)이 엑소좀의 고유한 특성을 지니고 있는지 확인하기 위하여, CD63 및 CD9 엑소좀 마커를 이용한 웨스턴 블랏을 수행하였고, 유세포분석기(Flow Cytometry, FACS)를 이용하여 개수 및 크기 분포를 확인하였다. 또한, 상기 펠렛을 그리드(grid)에 부착하고 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색한 후 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)(Hitachi H-7000)을 이용하여 직경 구조를 관찰하였다. 그 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 배양액에서 수득한 분획 펠렛 모두 CD63 및 CD9의 엑소좀 마커를 발현함을 확인하였다.
또한, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 배양액에서 수득한 분획 펠렛 내의 엑소좀이 전형적인 엑소좀의 크기를 가지고 있으며, 약 100 nm의 직경 구조를 가지고 있음을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통해 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 배양액에서 수득한 분획 펠렛은 엑소좀의 고유한 특성을 가지고 있음을 확인하였다.
상기 실험 결과를 재 검증하기 위하여, 상기 과정을 통해 수득한 엑소좀이 포함된 분획 펠렛(펠렛 3)을 불연속 밀도 구배 원심분리 하였다. 보다 구체적으로, 각 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 및 5% 농도의 OptiPrep 용액을(1.25―0.941 g/cm-3) 튜브에 로딩한 후 상기 수득한 펠렛을 최상층에 로딩하여 210,000×g 에서 16시간 동안 초원심분리(ultracentrifuge)한 후, 각각의 분획을 다시 200,000×g에서 1시간 동안 초원심분리하여 분획물을 수득하였다. 이후, 상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에는 MCF-7 유방암 세포를 깔고, 여기에 상기 불연속 밀도 구배 원심분리를 통해 수득한 각각의 분획물을 첨가한 후, 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 유방암 세포의 침윤 활성을 나타내는 주요 분획은 엑소좀이 포함되어 있을 것으로 예상되는 1.14-1.19 mg/ml의 밀도 분획임을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통해, 유방암 세포의 침윤에 엑소좀이 주요 역할을 함을 확인하였다.
실시예 1-3. 유방암 세포의 침윤과 엑소좀의 관련성 확인
유방암 세포의 침윤이 엑소좀과 관련성이 있는지 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
실험에는 정상 MDA-MB-231 세포, shRNA 플라스미드를 이용한 Rab27a의 발현 저해를 통해 엑소좀의 분비를 감소시킨 MDA-MB-231 세포(shRab27a), 및 대조군으로 공벡터를 삽입한 MDA-MB-231 세포(vehicle)를 이용하였다. 상기 Rab27a는 엑소좀 방출 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
상기 3 종류의 세포에서 Rab27a 단백질의 발현량을 확인하였으며, 107 개의 각 세포로부터 수득한 세포 배양액을 모아 원심분리하여 엑소좀 펠렛을 수득하고, 이의 단백질을 정량하였다. 또한, 상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에는 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 대조군, 정상 MDA-MB-231 세포 배양액, 비히클(vehicle) MDA-MB-231 세포 배양액 또는 shRab27a MDA-MB-231 세포 배양액을 각각 첨가한 후, 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, shRab27a MDA-MB-231 세포 배양액에서 엑소좀 분비는 종래에 보고된 바와 같이 대조군에 비해 40-50% 줄어들었으며, shRNA에 의해 정상적으로 Rab27a의 발현이 저해된 것을 확인하였다.
또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, shRab27a MDA-MB-231 세포 배양액에 의한 MCF-7 세포의 침윤 능력은, MDA-MB-231 세포 배양액에 의해 유도된 MCF-7 세포의 침윤 능력에 비해 50% 가량 감소됨을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통해, 유방암 세포의 침윤 능력은 엑소좀의 분비 수준과 관련이 있음을 확인하였다.
실시예 1-4. 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀의 침윤 특성 분석
유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀의 특성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
혈액 샘플은 경북대학교 병원에서 제공받았으며, 1 내지 4기의 유방암 환자의 혈액 채취는 경북대학교병원의 임상시험감사위원회의 규정에 따라 진행하였다. 서로 다른 임상단계의 유방암 환자 100명의 혈장에서 Exoquick (Systembio) 또는 플라즈마 순환 엑소좀을 분리하는 초원심분리법(UC)을 이용하여 엑소좀을 분리하였다. 상기 두 가지 방법으로 분리된 엑소좀의 특성을 웨스턴 블랏, 베지클 사이즈 분석기(Model　ELS-Z　(Otsuka　Electronics Co.) 및 전자투과현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 11 내지 도 13에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 유방암 환자의 혈장에서 Exoquick 분리법(EQ) 또는 초원심분리법(UC)을 이용하여 분리한 엑소좀은 모두 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9를 발현함을 확인하였다.
또한, 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 유방암 환자의 혈장에서 초원심분리법(UC)을 이용하여 분리한 엑소좀의 평균 크기는 91.1nm이고, Exoquick 분리법(EQ)을 이용하여 분리한 엑소좀의 평균 크기는 101.8nm로, 두 가지 방법으로 분리된 엑소좀 간에 유의한 크기 차이가 없음을 확인하였다.
상기 실험을 통하여, 엑소좀 분리 방법에 따른 순도 차이가 없음을 확인하였으므로, 이후 실험에서는 Exoquick 분리법을 이용하였다. 먼저, 정상인 또는 유방암 환자(0기 내지 4기), 및 유방암 제거 수술 후 환자에서 채취한 혈액을 17000×g에서 5분 동안 원심분리하여 혈장을 얻었다. 상기 원심분리한 혈장 시료에 Exoquick-Exosome Precipitation Solution (System biosciences)을 혈장 부피의 1/4만큼 넣어준 후, 2시간 동안 4℃에서 휴지시키고, 1500×g에서 30분간 다시 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 엑소좀 펠렛을 PBS에 녹여 이후 실험에 이용하였다.
상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 0 기를 의미하는 상피내암(Ductal Carcinoma in Situ, DCIS) 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀(S0), 1 내지 4기 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀(S1~S4), 유방암 제거 수술 후 환자(AS)의 혈장에서 분리한 엑소좀; 또는 정상인(C)의 혈장에서 분리한 엑소좀을 각각 첨가하여 유방암 세포의 침윤 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 1 내지 4 기의 유방암 환자의 혈장 엑소좀을 처리한 군에서 정상인의 엑소좀을 처리한 군에 비해 MCF-7 세포의 침윤이 3 ~ 4 배 증가함을 확인하였다. 또한, 다른 장기나 림프 노드(lymph node)로의 전이가 일어나지 않은 0 기인 상피내암(DCIS) 상태의 환자의 혈중 엑소좀을 처리한 군 역시 높은 유방암 진행 단계 환자의 혈중 엑소좀을 처리한 군과 비슷한 수준으로 MCF-7 세포의 침윤을 유도함을 확인하였으며, 이를 통해 기관 수준에서 미세 전이가 관찰되지 않은 초기 단계의 유방암 세포에서도 이미 침윤 능력을 지닌 엑소좀이 분비될 수 있음을 확인하였다. 또한, 수술로 암 조직을 제거한 경우, 정상인과 비슷한 수준으로 혈중 엑소좀의 유방암 세포 침윤 유도 능력이 줄어듦을 확인하였다.
실시예 2. 유방암 세포의 침윤 활성과 관련된 엑소좀의 특성 확인
실시예 2-1. 엑소좀의 구성 요소 중 침윤을 유도하는 인자 확인
엑소좀의 단백질, RNA 및 지질 중 어느 인자가 유방암 세포의 침윤을 유도하는지 확인하기 위하여, 엑소좀을 고온으로 변성시킨 후, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 대조군, MDA-MB-231 엑소좀, 90℃에서 5분간 열을 가한 MDA-MB-231 엑소좀 또는 65℃에서 5분간 열을 가한 MDA-MB-231 엑소좀을 각각 넣은 후, 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 90℃ 또는 65℃로 열을 가한 엑소좀을 처리한 군은 열을 가하지 않은 엑소좀을 처리한 군에 비해 유방암 세포의 침윤 활성이 떨어짐을 확인하였다. 상기 실험 결과를 통하여, 열에 의해 파괴되는 것으로 보이는 엑소좀의 단백질이 유방암 세포의 침윤과 관련된 인자임을 확인하였다.
실시예 2-2. 엑소좀에서 Del-1 단백질의 확인
엑소좀 단백질 중 어떤 단백질이 유방암 세포의 침윤을 유도하는지 확인하기 위하여, 질량 분석기를 이용한 비 표지 정량법을 이용해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포로부터 엑소좀을 수득한 후, 각 시료에 효과적인 펩타이드화를 위하여 10 mM의 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 처리하고 60℃에서 20분간 환원시킨 후, 이어서 50 mM의 요오드아세트아미드(iodoacetamide)를 처리하여 알킬화(alkylation)를 통해 엑소좀 단백질의 변성을 유도하였다. 반응이 끝난 후 엑소좀 단백질 시료에 아크릴아미드(acrylamide), 과산화황산암모늄(ammonium persulfate) 및 테트라메틸에틸렌디아민(Tetramethylethylenediamine, TEMED)을 넣고 겔 상태로 만들어 굳혔다. 상기 굳은 겔을 작은 조각으로 자른 후 100 mM TEAB(triethylammonium bicarbonate) 용액 및 아세토니트릴(acetonitrile) 용액으로 세척하고 완전히 감압 건조하였다. 상기 건조된 겔 조각에 트립신(trypsin)을 처리하고 37℃에서 15시간 동안 반응시켜 펩타이드화하였다. 펩타이드를 겔에서 추출하여 염을 제거하고 nano-UPLC와 Q-Tof Premier (waters) 기기의 질량 분석법(Mass spectrometry)을 이용하여 프로테옴을 분석하였다. MASCOT 프로그램을 통해 단백질을 동정하고, IDEAL-Q 프로그램으로 정량 정보를 분석하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
표 1
AccNo Description Protein score No. of peptides MB231/MCF7 ratio SD
IPI00306046 EDIL3 Isoform 1 of EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 507 16 6.422 0.476
표 1에 나타낸 바와 같이, MCF-7 엑소좀과 비교하여 MDA-MB-231 엑소좀에서 높은 발현을 보이는 단백질을 확인하였으며, 특히, MDA-MB-231 엑소좀에서 높은 발현을 보이는 단백질 중에서, 인테그린 신호 전달 경로를 통해 암의 혈관 신생에 중요한 역할을 하고, 세포의 외부 막에 위치한 것으로 알려진 Del-1(EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3, EDIL3와 동의어) 단백질을 확인하였다.
상기 실험을 통해 확인한 Del-1 단백질 양성 엑소좀이 인테그린 신호 전달 경로를 통해 유방암의 전이를 매개하는지 확인하기 위하여, 유방암 세포주인 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포 배양액에서 분리한 엑소좀; 정상 유방 세포주인 MCF10A 및 유방암 세포주인 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포를 각각 용해하여 수득한 세포 용해물(Cell lysate)을 이용하였다. 상기 각 시료에서 단백질을 분리한 후, Del-1 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 대조군으로 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 항체를 이용하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, MCF-7 엑소좀 및 이의 세포 용해물에서 비해 MDA-MB-231 엑소좀 및 이의 세포 용해물에서 Del-1 단백질 발현이 증가되어 있음을 확인하였고, 정상 유방 세포주인 MCF10A의 세포 용해물에서 Del-1 단백질의 발현이 거의 없는 것을 확인하였다. 한편, MCF10A 세포 배양액에서 분리된 엑소좀은 웨스턴 블랏이 불가능할 정도로 적었다.
엑소좀에서 Del-1 단백질 발현에 따른 기능을 확인하기 위해, MDA-MB-231 세포에 siRNA를 형질주입(transfection)시켜 넉다운(knockdown) 실험을 진행하였다. Del-1에 대한 3가지 siRNA 서열 또는 대조군 (siScrambled) 서열을 METAFECTENE SI (Biontex) 형질주입 시약(transfection reagent)과 섞어 리포플렉스(lipoplex)로 결합시킨 후, 이를 MDA-MB-231 세포에 처리하였다. 그 후, 세포 용해물과 엑소좀에서 Del-1 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.
또한, 상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에 MCF-7 세포를 깔고, 각 siRNA를 처리한 후 수득한 MDA-MB-231 세포 배양액, 정상 MDA-MB-231 세포 배양액 또는 엑소좀을 처리하고, 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 17 및 도 18에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, siRNA에 의해 MDA-MB-231 세포 용해물과 엑소좀에서 Del-1 단백질의 발현이 약 25-50 % 감소함을 확인하였다.
또한, 도 18에 나타낸 바와 같이, siRNA에 의해 Del-1 단백질의 발현이 줄어든 MDA-MB-231 세포 배양액은 정상 상태에 비해 약 2-3배 가량 유방암 세포의 침윤 유도능이 감소함을 확인하였다.
추가적으로, Del-1 단백질의 발현이 적은 MCF-7 엑소좀에 Del-1 단백질을 과발현시켜 Del-1 단백질의 역할을 재 검증하였다. 먼저 MCF-7 세포에 인간 Del-1 단백질을 코딩하는 플라스미드를 형질전환 물질과 함께 처리하여 MCF-7 세포가 Del-1 단백질을 발현하도록 유도하였다. 단백질을 코딩(coding)하지 않는 비히클 플라스미드(vehicle plasmid)를 대조군으로 처리하였다. 각 세포 용해물과 엑소좀으로부터 단백질을 분리한 후, 웨스턴 블랏을 통해 Del-1 단백질의 발현을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 상기 MCF-7 세포 배양액을 각각 처리한 후, 유방암 세포의 침윤 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, MCF-7 세포에서 Del-1 단백질의 과발현이 정상적으로 이루어졌으며, 상기 Del-1 단백질이 과발현된 MCF-7 세포의 침윤 능력이 대조군에 비해 증가함을 확인하였다.
마지막으로 엑소좀의 Del-1 단백질을 관찰하기 위해, 면역금표지(immunogold)를 수행하였다. 보다 구체적으로, MDA-MB-231 세포 배양액에서 분리한 엑소좀을 포름알데히드로 고정시킨 뒤, 순수한 탄소가 코팅된 그리드(pure carbon coated grid)에 흡착시킨 후 1% BSA로 블로킹(blocking)하고 Del-1 단백질의 항체와 9 내지 11 ㎛ 크기의 금 표지된 2차 항체를 순차적으로 결합시켰다. 결합된 시료를 0.5% 우라닐 아세테이트 용액으로 염색한 뒤 투과전자현미경으로 확인하였다. 또한, 상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 MDA-MB-231 세포에서 분리한 엑소좀에 Del-1 단백질 항체를 처리하여, Del-1 단백질 기능이 중성화된 엑소좀을 첨가하여 침윤 활성을 분석하였다. 대조군으로는 CD63 항체 및 정상 IgG 항체를 처리한 MDA-MB-231 엑소좀을 이용하였다. 그 결과를 도 20 및 도 21에 나타내었다.
도 20에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 세포 배양액에서 분리한 엑소좀의 표면에 Del-1 단백질이 존재함을 확인하였다.
또한, 도 21에 나타낸 바와 같이, Del-1 단백질 기능이 중성화된 MDA-MB-231 엑소좀을 처리한 군은 Del-1 단백질 기능을 중성화시키지 않은 엑소좀을 처리한 군에 비해 유방암 세포의 침윤 능력이 감소함을 확인하였다.
실시예 3. 엑소좀 Del-1 단백질의 특징 분석
실시예 3-1. Del-1 단백질의 유방암 세포 침윤 유도 확인
Del-1 단백질이 유방암 세포의 침윤을 유도함을 확인하기 위해, 시판되는 표준 Del-1 단백질(R&D systems)을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로. 상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 표준 Del-1 단백질을 0.05 내지 2 ㎍의 농도로 첨가한 후, 유방암 세포의 침윤 분석을 수행하였다.
동일한 방법으로 Del-1 단백질의 N-당화(N-glycosylation) 그룹을 제거할 수 있는 PGNase F를 처리한 MDA-MB-231 엑소좀 또는 표준 Del-1 단백질을 이용하여 유방암 세포의 침윤 분석을 수행하였다. 대조군으로는 MDA-MB-231 엑소좀 및 표준 Del-1 단백질을 이용하였다. 그 결과를 도 22 및 도 23에 나타내었다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 표준 Del-1 단백질의 처리 농도에 따라 유방암 세포의 침윤 능력이 증가함을 확인하였다.
또한, 도 23에 나타낸 바와 같이, 표준 Del-1 단백질과 MDA-MB-231 엑소좀에 PGNase F를 처리할 경우 비슷하게 분자량이 변화하고, PNGase F의 처리에 의해 Del-1 단백질의 N-당화 그룹을 제거한 경우 유방암 세포의 침윤 능력이 떨어짐을 확인하였다.
실시예 3-2. Del-1 단백질의 수용체 확인
유방암 세포의 침윤과 관련된 Del-1 단백질의 수용체(receptor)를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 여러 인테그린 타입의 항체를 이용한 MCF-7 세포의 침윤 분석을 통해 표준 Del-1 단백질과 인테그린의 상호작용을 확인하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 β1, β5, αv, αvβ5 또는 αvβ6 타입의 인테그린 항체를 표준 Del-1 단백질과 함께 처리하였다. 또한, 인테그린의 길항제(antagonist)인 RGD 펩타이드, RGD 펩타이드의 대응대조군인(counterpart control) RGE 펩타이드 또는 IgG (대조군)와 함께 MCF-7 세포를 10분 동안 배양한 뒤, 상기 세포를 코팅된 챔버의 상부 웰에 깔고, 표준 Del-1 단백질을 처리한 후, 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 표준 Del-1 단백질 대신 유방암 세포 유래 엑소좀을 이용하여 동일한 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 24에 나타내었다.
도 24에 나타낸 바와 같이, αvβ5 타입의 인테그린 항체에 의해 Del-1 단백질에 의한 유방암 세포의 침윤 활성이 저해됨을 확인하였다. 이러한 인테그린과 Del-1 단백질의 상호작용은 RGD 펩타이드에 의해 저해되고, RGE 펩타이드에는 영향을 받지 않음을 확인하였다. 유사하게, 유방암 세포 유래 엑소좀의 Del-1 단백질도 αvβ5 타입의 인테그린 항체에 의해 침윤 활성이 저해됨을 확인하였다.
다음으로, 인테그린 신호 전달 과정의 변화를 확인하기 위하여, MCF-7 세포에 MDA-MB-231 세포 유래 엑소좀을 세포 신호 전달물질 저해제(PF573228)와 함께 30분간 처리한 후 세포 용해물을 분리하고, 웨스턴 블랏을 수행하였다. 항체는 인테그린 신호 전달의 하위에 있는 FAK(focal adhesion kinase), SRC(family of protooncogenic tyrosine kinase), ERK(signal-regulated kinase)의 정상 타입 및 인산화 타입에 관한 것을 이용하였다. 또한, MDA-MB-231 세포 유래 엑소좀을 세포 신호 전달물질의 저해제(PF573228)와 함께 24시간 동안 처리한 후 세포 배양액을 수득하였으며, 이를 농축하여 젤라틴이 포함된 젤을 이용한 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 MMP의 젤라틴 분해를 유도한 뒤 젤을 염색하여 분해된 젤라틴 밴드 분석을 통해 MMP의 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 세포 유래 엑소좀을 처리하였을 때 MCF-7 세포에서 FAK, SRC, ERK의 인산화가 증가하고, MMP-2 및 MMP-9의 활성이 증가함을 확인하였다. 상기 현상은 인테그린의 길항제(antagonist)인 RGD 펩타이드, FAK의 인산화 저해제인 PF573228, Del-1 단백질을 중성화시킬 수 있는 Del-1 항체(EDIL3 Ab)를 함께 처리하였을 때 감소되었다.
실시예 3-3. 다른 유방암 세포에서 Del-1 단백질의 발현 확인
다른 유방암 세포에서도 Del-1 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여, BT-549, MDA-MB-453, UACC-812, UACC-893, UACC-3199, UACC-3133, UACC-1179 및 UACC-732을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과를 도 26에 나타내었다.
도 26에 나타낸 바와 같이, BT-549 세포를 제외한 다양한 유방암 세포에서 Del-1 단백질이 발현됨을 확인하였다.
다음으로, 상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 상기 다른 유방암 세포들(BT-549, MDA-MB-453, UACC-812, UACC-893, UACC-3199, UACC-3133, UACC-1179 또는 UACC-732)을 각각 처리한 후, 유방암 세포의 침윤 활성을 확인하였다. 또한, 동일한 방법으로 다른 유방암 세포(BT-549, MDA-MB-453, UACC-893)로부터 분리한 엑소좀을 처리하여 유방암 세포의 침윤 활성을 확인하였다. 그 결과를 도 27 및 도 28에 나타내었다.
도 27에 나타낸 바와 같이, Del-1 단백질이 발현되는 다양한 유방암 세포에 의해 MCF-7 세포의 침윤이 증가함을 확인하였다.
또한, 도 28 에 나타낸 바와 같이, Del-1 단백질이 발현되지 않는 BT- 549 세포에서 분리한 엑소좀이 아닌 MDA-MB-453 또는 UACC-893 세포에서 분리한 엑소좀도 MCF-7 세포의 침윤 능력을 증가시키며, Del-1 단백질 항체에 의해 상기 활성이 저해됨을 확인하였다.
실시예 3-4. 동물모델에서 유방암 세포 침윤에 관여하는 Del-1 단백질의 메커니즘 확인
상기 실시예 3-1 내지 3-3에서 확인한 유방암 세포 침윤에 관여하는 Del-1 단백질의 메커니즘을 동물모델에서 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, BALB/c Nude 마우스의 유방 지방 패드에 MCF-7, MDA-MB-231 또는 shRab27a(Rab27a(-)) MDA-MB-231 세포를 각각 주입하고, 두 군으로 나누어 한 군은 3일마다 MDA-MB-231 세포 유래 엑소좀을 주입하고 다른 한군은 PBS를 주입하였다. 각 유방암 세포 주입 3 주 후에 마우스를 희생시키고 폐를 분리하였으며, 인간의 비멘틴(vimentin)에 대한 항체를 이용한 면역조직화학검사(immunohistochemistry, IHC)를 통해 폐의 전이성 병변을 확인하였다. 실험 과정을 도 29에, 그 결과를 도 30에 나타내었다.
도 30에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231, Rab27a(-) MDA-MB-231 및 MCF-7 세포를 주입한 군의 순서로 폐의 전이성 병변의 크기가 나타났고, 유방암 세포만 주입한 군에 비하여 MDA-MB-231 세포 유래 엑소좀을 같이 주입한 군에서 폐의 전이성병변의 크기가 유의하게 커짐을 확인하였다. 특히, 약한 침윤성을 가지는 MCF-7 세포를 MDA-MB-231 세포 유래 엑소좀과 공동 주입하였을 때 MCF-7 세포만을 주입한 군에 비해 전이성 병변의 크기가 2 ~ 3 배 커짐을 확인하였다.
다음으로, 상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 MDA-MB-231, shRab27a MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포를 주입한 유방암 동물모델로부터 분리한 혈중 엑소좀을 각각 첨가한 후, 유방암 세포의 침윤 활성 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 31에 나타내었다.
도 31에 나타낸 바와 같이, MCF-7 유방암 세포의 침윤 능력은 MDA-MB-231 세포를 주입한 마우스의 혈중 엑소좀에 의해 증가함을 확인하였다. 따라서 MDA-MB-231 세포 주입에 의한 유방암 동물모델 유래 혈중 엑소좀은 유방암 세포의 전이에 기여할 수 있음을 확인하였다.
다음으로, 유방암 동물모델에서 혈중 엑소좀의 Del-1 단백질의 역할을 확인하기 위해, MDA-MB-231 세포 유래 엑소좀을 Del-1 항체와 반응시킨 후, 2×106개의 shRab27a MDA-MB-231 세포와 함께 BALB/c Nude 마우스의 유방 지방 패드에 주입하였다. 대조군의 경우 Del-1 항체 대신 IgG 항체를 이용하였다. 각 세포는 주입 후 3일째부터 3주 동안 일주일에 3회씩 주입하였으며, 실험 종료 후 각 마우스를 희생시키고 장기를 분리하였다. 각 조직에서 비멘틴(vimentin)에 대한 항체를 이용한 면역조직화학검사를 통해 유방암 세포의 전이를 확인하였다. 그 결과를 도 32에 나타내었다.
도 32에 나타낸 바와 같이, 유방암 동물모델에서 엑소좀의 Del-1 단백질은 유방암 세포의 전이를 촉진함을 확인하였다.
실시예 4. Del-1 단백질 양성 엑소좀의 유방암 진단 또는 예후 예측용 마커로서의 이용 가능성 확인
실시예 4-1. 항암제 투여에 따른 혈중 Del-1 단백질 양성 엑소좀의 변화
BALB/c Nude 마우스에 MDA-MB-231 세포를 주입하여 유방암 동물모델을 제작한 후, 세포 주입 7주 및 8주 후에 항암제인 시스플라틴을 투여하고, 시간에 따른 유방암 종양의 크기, 혈중 엑소좀, 혈중 Del-1 단백질 양성 엑소좀의 변화를 확인하였다.이때 종양의 크기는 캘리퍼를 이용하여 장축과 단축의 길이를 측정하여 확인하였으며, 혈중 엑소좀은 엑소좀 마커인 CD63을 이용한 ELISA 방법을 통해 확인하였다. 또한, Del-1 단백질 양성 엑소좀은 도 33에 개시된 변형된 ELISA 방법을 통해 측정하였다. 보다 구체적으로, ELISA 플레이트에 엑소좀 마커인 CD63 항체를 도포한 후 혈장 1 ul를 넣고 반응시켜 엑소좀을 부착시켰으며, 그 후 Del-1 항체를 이용하여 Del-1 단백질 양성 엑소좀의 발현을 확인하였다. 추가적으로, 상기 동물모델에서 매주 수집된 혈중 엑소좀을 이용하여 상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로 MCF-7 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 이상의 실험 결과를 도 34에 나타내었다.
도 34에 나타낸 바와 같이, 종양의 크기는 유방암 세포 주입 후 1주차부터 점차적으로 증가하여 10주차 때 최대가 됨을 확인하였다. 혈중 엑소좀은 10주간 유의한 변화가 관찰되지 않았으나, 혈중 Del-1 단백질 양성 엑소좀은 종양의 크기를 확인할 수 없는 초기 상태인 2주차부터 증가하여 10주차까지 높은 수준을 유지함을 확인하였다.
또한, 유방암 세포 주입 7주 및 8주 후에 항암제인 시스플라틴을 주사한 결과, 종양의 크기는 8주차부터 더 이상 증가하지 않고 점차 감소함을 확인하였으며, 혈중 Del-1 단백질 양성 엑소좀은 시스플라틴 처리 1주 후(8주차)에 현저하게 감소한 후, 10주차까지 비슷한 수준을 유지하였다. 덧붙여, 상기 동물모델에서 매주 수집된 혈중 엑소좀을 이용한 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 결과 역시 유사하게 나타났다.
이상의 실험 결과를 통해, 항암제인 시스플라틴에 의한 MDA-MB-231 세포의 증식 억제는 혈중 Del-1 단백질 양성 엑소좀의 생산을 감소시킴을 확인하였으며, MDA-MB-231 세포로부터 분비된 Del-1 단백질 양성 엑소좀은 유방암의 현재 진행 상태와 치료 상태를 나타내는 바이오 마커로 이용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 4-2. 유방암 환자의 혈액에서 엑소좀 내의 Del-1 단백질의 확인
유방암 환자의 혈액에서 침윤 활성과 관련된 엑소좀 내의 Del-1 단백질을 확인하기 위하여, 4명의 유방암 환자의 혈액에서 혈중 엑소좀을 분리하였다. 상기 실시예 1-1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로 코팅된 챔버의 상부 웰에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 상기에서 수득한 유방암 환자의 혈중 엑소좀 또는, 상기 혈중 엑소좀에 Del-1 항체 또는 PNGaseF를 처리한 것을 각각 첨가한 후, 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 35에 나타내었다.
도 35에 나타낸 바와 같이, 각 환자의 혈중 엑소좀 만을 처리한 군에 비해, Del-1 항체를 이용하여 엑소좀의 Del-1 단백질을 중성화시킨 엑소좀을 처리한 군 및 PNGaseF를 이용하여 Del-1 단백질을 탈 당화시킨 엑소좀을 처리한 군에서 유방암 세포의 침윤 활성이 감소함을 확인하였다. 이를 통해, 혈중 엑소좀에 있는 당화된 Del-1 단백질이 유방암 세포의 침윤 능력에 주요한 영향을 미침을 확인하였다.
실시예 4-3. Del-1 단백질 양성 엑소좀을 이용한 유방암의 진단 또는 예후 예측 가능성 확인
Del-1 단백질 양성 엑소좀이 유방암의 진단 또는 예후 예측용 마커로서 이용될 가능성이 있는지 확인하기 위하여, ELISA 분석을 수행하였다.
먼저, 96 웰 플레이트에 CD63 다클론성항체(polyclonal antibody)를 O/N으로 방치하여 코팅한 후 차단(blocking) 용액을 이용하여 차단하였다. 각 웰에 유방암 단계 0 기 (DCIS), 1 내지 4기의 환자, 수술 후 환자, 및 정상인의 혈액을 1 ul 넣어준 후 2시간 동안 반응시키고 충분히 세척한 후 검출 항체(detection antibody)로 단클론(monoclonal) Del-1 항체를 이용하여 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현을 확인하였다. 또한, 재조합 Del-1 단백질(recombinant Del-1)을 이용하여 표준 곡선을 그리고, 그 곡선의 추세선(y=0.0197x + 0.1104, x, 혈중 엑소좀 del-1 농도, y, O.D)을 이용하여 혈중 엑소좀 내의 Del-1 단백질의 발현을 계산하였다. 한편, 동일한 환자에서 전이성(4 단계) 유방암을 검출하는 진단 바이오 마커로 이용되고 있는 CA 15-3을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 36 내지 도 38에 나타내었다.
도 36에 나타낸 바와 같이, 정상인, 수술 후 환자 및 유방암 환자의 혈중 Del-1 단백질 양성 엑소좀의 농도에 현저한 차이가 있음을 확인하였다.
또한, 도 37 및 도 38에 나타낸 바와 같이, 기존 바이오 마커인 CA 15-3은 낮은 단계의 유방암인 0, 1, 2, 3기에서 낮은 민감도를 보였고, 전이성 암인 4기에서만 높은 민감도를 보임을 확인하였다. 반면, Del-1 단백질 양성 엑소좀은 정상인에 비해 모든 단계의 유방암에서 증가하였고, 수술 후에는 감소하였다.
실시예 5. Del-1 단백질 양성 엑소좀의 다른 암에 대한 진단 또는 예후 예측용 마커로서의 이용 가능성 확인
Del-1 단백질 양성 엑소좀이 유방암 외에 다른 암의 진단 또는 예후 예측용 마커로서 이용될 수 있는지 확인하기 위하여, 암에 걸리지 않은 정상인, 유방암 환자, 갑상선 암 환자, 위암 환자, 췌장암 환자, 담도암 환자 및 류마티스 관절염 환자의 혈장을 이용하여 상기 실시예 4-3과 동일한 방법으로 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 39에 나타내었다.
도 39에 나타낸 바와 같이, 정상인과 비교하여 유방암 환자 뿐만 아니라 다른 암 환자에서도 Del-1 단백질 양성 엑소좀이 증가함을 확인하였다.

Claims (10)

  1. Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Del-1 단백질은 당화(glycosylation)된 것을 특징으로 하는 암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Del-1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 Del-1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 암호화 되는 것을 특징으로 하는 암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  5. Del-1 단백질 양성 엑소좀 검출하는 제제를 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  6. 제5항의 조성물을 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측용 키트.
  7. (a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 엑소좀에서 Del-1 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;를 포함하는 암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 단백질의 발현 수준을 확인하는 방법은 웨스턴 블랏, 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Ouchterlony) 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS(Flow Cytometry) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  10. (a) 암 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 후보물질이 처리된 세포의 엑소좀에서 Del-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 암 치료 후보물질의 스크리닝 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113311162A (zh) * 2021-04-29 2021-08-27 安徽省肿瘤医院 用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合及应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BECKHAM, C. J. ET AL.: "Bladder Cancer Exosomes Contain EDIL-3/Dell and Facilitate Cancer Progression", THE JOURNAL OF UROLOGY, vol. 192, no. 2, 2014, pages 583 - 592, XP028877303 *
BLACKWELL, R. H. ET AL.: "The Untapped Potential of Urine Shed Bladder Cancer Exosomes: Biomarkers, Signaling, and Therapeutics", BLADDER, vol. 1, no. 1, 2014, pages e7-1 - e7-7, XP055311563 *
DATABASE Genbank [O] 23 September 2014 (2014-09-23), XP055311566, Database accession no. XP_009239148.1 *
FENG, M. -X. ET AL.: "Elevated Autocrine EDIL3 protects Hepatocellular Carcinoma from Anoikis through RGD-mediated Integrin Activation", MOLECULAR CANCER, vol. 13, no. 226, 2014, pages 1 - 17, XP021201136 *
HEGMANS, J. P . J. J ET AL.: "Proteomic Analysis of Exosomes secreted by Human Mesothelioma Cells", THE AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY, vol. 164, no. 5, 2004, pages 1807 - 1815, XP055311561 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113311162A (zh) * 2021-04-29 2021-08-27 安徽省肿瘤医院 用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合及应用

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