WO2015137738A1 - 혈액질환 진단 - Google Patents

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WO2015137738A1
WO2015137738A1 PCT/KR2015/002378 KR2015002378W WO2015137738A1 WO 2015137738 A1 WO2015137738 A1 WO 2015137738A1 KR 2015002378 W KR2015002378 W KR 2015002378W WO 2015137738 A1 WO2015137738 A1 WO 2015137738A1
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gelsolin
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백은정
이은미
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한양대학교 산학협력단
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention was made by the task number HI10C17400200 under the support of the Ministry of Health and Welfare, the research and management institution of the task is Korea Health Industry Development Institute, the research project name is "health and medical technology research and development project”, the research title is "red blood cells from stem cells Efficient Differentiation and Mechanism Research into Progenitor Cells ", The lead organization is Yonsei University Industry-Academic Cooperation Group, and the research period is 2013.04.01-2014.03.31.
  • the present invention was made by the task number HI12C0202 under the support of the Ministry of Health and Welfare, the research and management institution of the task is Korea Health Industry Development Institute, the research project name is “health and medical technology research and development project”, the research title is “stem cell differentiation And development of treatment for myelodysplastic syndrome through induction of maturity ", the host institution is Hanyang University Industry-Academic Cooperation Group, and the research period is 2013.08.01-2014.07.31.
  • the present invention relates to a method for screening a probable group of blood diseases by measuring the level of gelsolin mRNA in buffy coat and a method for prognostic analysis of blood diseases.
  • Hematologic disorders in the blood and bone marrow are largely classified into acute / chronic leukemia, myeloproliferative neoplasm (MPN), and myelodysplastic syndrome (MDS) (Vardiman JW 2008). .
  • MPN myeloproliferative neoplasm
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • Acute / chronic leukemia is subdivided into myeloid and lymphocytic leukemia, respectively.
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • P. vera polycythemia vera
  • ET essential thrombocythemia
  • PMF primary myelofibrosis
  • Myelodysplastic syndromes include refractory cytopenia with unilineage dysplasia (RCUD), multilineage dysplasia (MDMD), and blast myoblasts (intramedullary myeloblast 5-10%).
  • RCUD unilineage dysplasia
  • MDMD multilineage dysplasia
  • blast myoblasts intramedullary myeloblast 5-10%.
  • RAEB myeloblast 11-19% RAEB 2
  • Myelodysplastic syndrome is an acquired rare and refractory blood disease characterized by inefficient hematopoiesis due to worsening of pancreatic cells, abnormal cell differentiation / maturation, and abnormal blood cells within the bone marrow.
  • the disease can be chronic for many years and progress to acute leukemia, also called preleukemia.
  • myelodysplastic syndrome is a primary tumor of bone marrow, the incidence rate is higher than that of general leukemia, but the incidence of myelodysplastic syndrome is underestimated and is not diagnosed.
  • National Health Insurance Corporation's statistics in 2005, 1,845 domestic patients were diagnosed, with 500-600 patients annually.
  • 1 in 500 people in the 60-year-old and older age group (Newman, Maness-Harris et al. 2012) are expected to have 15,000 new cases annually and increase rapidly (Barzi and Sekeres 2010). .
  • Diagnosis of myeloid dysplasia is diagnosed by peripheral blood or bone marrow tests.
  • Three types of hematopoietic stem cells in the bone marrow myeloid, erythroid, and megakaryocytes that produce platelets
  • the extent and severity of dysplasia is assessed by lineage.
  • the average survival time is only 22 months, and the survival time for each risk group of patients with lung cancer is comparable to that of the median survival.
  • the prognosis is only 0.4 to 5.7 years.
  • Refractory cytopenia with uinilineage dysplasia (RCUD) or refractory anemia with ring sideroblasts (RARS) is a low risk group with a relatively good prognosis.
  • RCMD multiline dysplastic anemia
  • RAEB 1, RAEB 2 blastocytosis
  • Myelodysplastic syndromes do not have an effective treatment, and patients often go untreated even if they come early. At worse times, traditionally conservative treatment and chemotherapy and allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HCC) have been performed in high-risk groups. In recent five years, a new concept of epigenetics has resulted in improved survival and has emerged as a new treatment to replace the best supportive care, which is the principle of treatment. Efforts for combination therapy continue. However, even with the best treatments, only 10% of patients respond to treatment.
  • the present inventors have effectively improved dysplasia of erythroid cells produced by bone marrow cells of patients with myelodysplastic syndrome or external culture of hematopoietic stem cells when treating human recombinant gelsolin protein in culture. I have confirmed that it can be done.
  • the present inventors attempted to investigate whether the plasma concentration or cell concentration of gelsolin protein or RNA can be used as a diagnostic or prognostic marker of blood tumor diseases including myelodysplastic syndrome.
  • Gelsolin is a protein that binds to actin filaments and is known to play a role in regulating the degradation or binding of actin by cutting or capping actin filaments (Gremm and Wegner 2000).
  • Gelsolin is present in the form of cytoplasmic gelsolin or plasma gelsolin.
  • Plasma gelsolin is separated from cytoplasmic gelsolin (Chauhan, Ji et al. 2008) by attaching 25 more amino acids at the N-terminus and secreted out of cells. It is present at high concentrations of 200-250 mg / L in normal plasma (Kwiatkowski 1988).
  • Plasma gelsolin is an actin-scavenging protein that protects microcirculation by isolating and removing G-actin and F-actin, which are released into plasma in case of injury to cell tissues. and Galbraith 1992).
  • Plasma gelsolin was mainly produced and secreted in muscle (Kwiatkowski 1988) and studied in various diseases such as burns, trauma, brain ischemia / stroke, respiratory failure, and the like.
  • Some acute lung injury, septic shock, trauma, and myonecrosis associated with acute cellular injury or necrosis resulted in a 50% decrease in the level of gelsolin than normal (Suhler, Lin et al. 1997).
  • the defensive system of the actin-scavenger system does not work and can have a fatal effect on the patient's prognosis.
  • the present inventors attempted to find out whether the disease can be used as a diagnosis, progression judgment, and prognostic factor through the expression of gelsolin genes in bone marrow and peripheral blood of patients with hematologic disorders.
  • the present inventors have made diligent research efforts to develop methods for diagnosing and prognostic blood diseases using novel diagnostic markers that are not affected by platelet concentration or erythrocyte hemolysis state of a subject. As a result, the present invention has been completed by clarifying that the disease can be diagnosed and the prognosis can be analyzed by measuring the level of gelsoline mRNA contained in peripheral blood or bone marrow isolated from the subject.
  • Another object of the present invention to provide a method for analyzing the prognosis of blood diseases.
  • the present invention provides a method for screening a blood disease probable group comprising the following steps. :
  • the present inventors have made diligent research efforts to develop methods for diagnosing and prognostic blood diseases using novel diagnostic markers that are not affected by platelet concentration or erythrocyte hemolysis state of a subject. As a result, by measuring the level of gelsoline mRNA contained in peripheral blood or bone marrow isolated from the subject, a group of probable blood diseases including aplastic anemia, hematologic disorders, etc. can be selected and the prognosis can be analyzed. By clarifying that the present invention, the present invention was completed.
  • peripheral blood refers to blood circulating through the whole body and means blood that can be collected through the skin.
  • bone marrow aspirate refers to a biological sample extracted from bone marrow, which is a hematopoietic organ that produces blood, through a conventionally known suction method, and may be expressed as “bone marrow” for convenience. have.
  • Peripheral blood or bone marrow aspirate in the present invention can be used in a state separated from the object.
  • Bone marrow aspirate may be preferably used at the time of initial diagnosis, but in follow up, separation from the subject may be limited.
  • peripheral blood isolated from an object can be preferably used as a diagnostic sample, it should not be construed as limiting the use of bone marrow aspirate.
  • the “buffy coat” obtained from the peripheral blood and bone marrow aspirate is a white band-shaped layer located between the erythrocyte layer and the plasma layer which are separated when concentration gradient centrifugation is performed, and mainly includes leukocytes and platelets. It means a layer containing a nuclear cell (polymorphonucleae cell) and the like.
  • gelsoline of the present invention is an actin-binding protein and is known as a key regulator of the aggregation of actin filaments.
  • the screening method of the present invention utilizes the mRNA level of gelsolin contained in the buffy coat of the subject.
  • the present inventors have found a correlation between the level of the geloline mRNA contained in the buffy coat and the state of the blood disease and the deterioration of the blood disease according to the change of the geloline mRNA level. Any method known or developed in the future to measure specific mRNA levels contained in the blood may be used, and there is no particular limitation.
  • a feature of the present invention is that the gelsolline mRNA level contained in the buffy coat is used as a diagnostic marker for blood diseases, and the method of measuring mRNA is not limited.
  • the measurement of the expression level in the method of the present invention is quantitative real-time PCR (qPCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), Rapid Amplification of cDNA Ends ), Multiplex RT-PCR, Northern blotting, Nuclease Protection Assays, In Situ hybridization, serial analysis of gene expression, RNA microarrays and gene chips RNA microarray and gene chips), and RNA-seq (RNAsequencing) is measured by a method selected from the group consisting of.
  • qPCR may be used to measure gelsolin mRNA level on buffy coat, according to a conventionally known method.
  • the blood disease of the present invention is aplastic anemia or blood tumor disease, more specifically the blood tumor disease of the present invention is composed of acute leukemia, chronic leukemia, myeloid growth tumor and myelodysplastic syndrome At least one selected from the group.
  • biological samples peripheral blood and / or bone marrow obtained from patients belonging to all of the disease groups showed an average reduction relative to normal gelsolin mRNA levels.
  • Acute leukemia of the present invention includes acute myelogenous leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia and chronic lymphocytic leukemia, and the like.
  • Myeloproliferative tumors of chronic myelogenous leukemia, polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis of the present invention Refractory cytopenia with unilineage dysplasia, refractory cytopenia with multilineage dysplasia, blastocytosis 1 (RAEB 1) and blastocytosis anemia 2 (RAEB 2) Including but not limited to.
  • the expression level of gelsolin mRNA in buffy coat when measured at a low level of 80% or less than that of the normal group, it is diagnosed as a blood disease, and when measured at a high level of 120% or more, It is diagnosed as a hematological tumor immediately before or immediately after the development.
  • the patients with hematologic disorders are less than 80%, more specifically less than 70%, more specifically less than 60%, more specifically less than 50%, and more specifically, compared to normal buffy coat gelsolin mRNA levels. 40% or less, and more specifically 30% or less.
  • the lower the expression level the greater the chance of being diagnosed with a blood disease.
  • leukemia shows the lowest expression.
  • the subject of the present invention when the subject of the present invention is a patient with myelodysplastic dysplasia, when the mRNA expression level of the gelsolin is measured at a high level of 120% or more compared to the expression level of the normal group, the condition worsened to the pre-leukemia stage It is expected to be.
  • the condition exacerbated by the pre-leukemia stage of the present invention is hyperblast-resistant refractory anemia 2 (RAEB-2).
  • the refractory anemia 2 is interpreted to include acute myeloid leukemia (AML) immediately after development from RAEB-2.
  • Gelsolin levels in most likely blood disease groups are measured at 80% or less Among the exceptionally high levels of gelsolin mRNA levels in normal patients in patients on the diagnostic boundary between diseases, for example, in the developmental boundary of disease from myelodysplastic syndrome (MDS) to acute myeloid leukemia (AML). Gelsolin mRNA levels were observed.
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • AML acute myeloid leukemia
  • patients with hematologic disorders immediately before or after the development of other diseases are 120% or more, more specifically 130%, even more specifically 140% or more, compared to normal buffy coat gelsolin mRNA levels. As the expression level of more than 150%. This is a feature that appears in the diagnosis of patients at the borderline of development of the disease from myelodysplastic syndromes (MDS) to acute myeloid leukemia (AML) as mentioned above.
  • MDS myelodysplastic syndromes
  • AML acute myeloid leukemia
  • the method of the invention is not affected by platelet concentration or erythrocyte hemolysis state of the sample. While attempts have been made to use the concentration of gelsolin protein in plasma to diagnose disease, the level of gelsolin protein in plasma is influenced by other factors in the sample, such as platelet concentration in samples, red blood cell hemolysis, etc. Because of this, it was not possible to obtain consistent results and did not reflect the condition of the disease. The present inventors have found that when buffy coats isolated from peripheral blood or bone marrow are used, a consistent result can be obtained regardless of the platelet concentration of the sample or the erythrocyte hemolysis state, and a method for diagnosing a blood tumor disease using the same.
  • the invention provides a method for prognostic analysis of hematologic disorders comprising the following steps:
  • the second expression level of gelsolin mRNA contained in the buffy coat is measured by using a buffy coat of peripheral blood or bone marrow aspirate separated from the subject. Comparing the relative difference with the first expression amount; When the amount of the second expression increases more than three times compared to the amount of the first expression, the disease is analyzed to be worsened.
  • the inventors of the present invention not only diagnosed the current disease state according to the amount of gelsolin mRNA expression measured at the first screening of the object, but also observed the relative changes in the amount of gelsolin mRNA expression in the follow-up of the subjects. The prognosis of the disease was identified.
  • the prognostic analysis method of the blood tumor disease of the present invention is common in that it uses the method of diagnosing the blood tumor disease, which is another aspect of the present invention, and the gelsolin mRNA level measurement result included in the buffy coat, and the description of common parts is described. The description is omitted, and the description thereof is omitted to avoid excessive complexity of the description.
  • the method of the present invention utilizes two buffy coat samples with different timings when separated from the object as analytical sample to analyze the prognosis of the disease state of the subject.
  • first expression amount refers to the amount of gelsolin mRNA expression in a sample that precedes the time of separation from the object of the two buffy coat samples.
  • the gelsolin mRNA expression level may be expressed as a relative value based on the gelsolin mRNA expression level of a normal person.
  • the measurement of the 1st expression amount can be measured by the method as already demonstrated in the detailed description about the diagnostic method of the blood tumor disease which is another aspect of this invention.
  • the prognostic analysis method of the blood disease of the present invention is to predict and predict a change in the disease, and after the measurement of the first expression amount, after performing appropriate treatment to improve the disease state in some cases, the therapeutic effect, disease state This includes the following process of follow up.
  • "After the time when symptoms are expected to improve” means after a period of time when symptoms are generally expected to improve, depending on the appropriate treatment method performed to improve the disease state, which means that the subject's health status, The type of treatment regimen, the sensitivity to treatment, etc. may vary depending on complex factors.
  • the expression "after the lapse of the time when symptoms are expected to improve” is generally difficult to expect a change when the first and second expression levels are measured at excessively short time intervals in which symptoms are not generally expected to improve. As a reflection of the point, the condition does not necessarily improve. Depending on the type of disease, treatment method, etc., it may be several hours or days or more.
  • the prognostic analysis method for blood diseases of the present invention is performed by comparing the relative difference between the first expression amount and the second expression amount described above. Specifically, the second expression amount is increased by about 3 times or more, more specifically 3.5 times or more, more specifically 4 times or more, even more specifically 5 times or more, and more specifically 6 times or more relative to the first expression amount. In cases, the disease is analyzed to have worsened.
  • the patient responds to treatment, and the disease progression is judged to be slow, and when the second expression amount increases but increases within about three times, the disease is increased. It is not deteriorated. However, when the second expression level is increased by about five times or more, the disease is considered to be worsened.
  • RCMD refractory hemocytopenia
  • RAEB-1 excessive blast anemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • the buffy coat in step (a) and step (b) is a buffy coat isolated from peripheral blood.
  • buffy coats isolated from peripheral blood or bone marrow can be used in the methods of the present invention, buffy coats isolated from peripheral blood can be preferably used rather than buffy coats isolated from bone marrow for convenience of follow up.
  • the measurement of the expression level of the present invention is quantitative real-time PCR (qPCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE-PCR), Multiplex RT PCR, Northern blotting, Nuclease Protection Assays, In Situ hybridization, serial analysis of gene expression, RNA microarrays and gene chips chips) and RNA-seq (RNAsequencing).
  • qPCR quantitative real-time PCR
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • RACE-PCR Rapid Amplification of cDNA Ends
  • Multiplex RT PCR Northern blotting
  • Nuclease Protection Assays In Situ hybridization
  • serial analysis of gene expression serial analysis of gene expression
  • RNA microarrays and gene chips chips serial analysis of gene expression
  • RNA-seq RNAsequencing
  • the blood disease of the present invention is aplastic anemia or blood tumor disease. More specifically, the oncological hematological tumor disease is at least one selected from the group consisting of acute leukemia, chronic leukemia, myeloid growth tumor and myelodysplastic syndrome.
  • the present inventors have identified the correlation between disease exacerbation and gelsolin mRNA changes for all the blood tumor diseases.
  • the diagnostic method and prognostic analysis method of the present invention reduce the physical and economic burden of the patient and enable to obtain a consistent diagnosis and prognostic analysis results that are not affected by other peripheral factors.
  • the present invention provides a method for screening a group of blood diseases.
  • the present invention provides a method for analyzing the prognosis of blood diseases.
  • Figure 1 shows the effect on plasma gelsolin concentrations due to hemolysis or platelet incorporation of peripheral blood.
  • Figure 2 shows the difference in the expression levels of plasma gelsolin by ELISA and qPCR method in peripheral blood and bone marrow.
  • Figure 3 shows the change of gelsolin mRNA expression level of peripheral blood of blood disease patients.
  • Figure 4 shows the change in gelsolin mRNA expression level of bone marrow aspirate of blood disease patients.
  • Figure 5 shows the comparison of gelsolin mRNA expression levels in peripheral blood and bone marrow at the initial diagnosis of MDS disease.
  • Figure 6 shows the comparison of gelsolin mRNA expression levels in peripheral blood buffy coat at the first diagnosis of blood disease patients.
  • Normal platelets were centrifuged (227 g, 5 min, 4 ° C.) and then platelets and plasma were separated. After removing the plasma, the concentrated platelets were diluted according to the concentration in the platelet plasma, and the experiment was performed by adjusting the same volume (100 ⁇ l).
  • RNA preservation After centrifuging the sample at 227 g, the buffy coat was collected, and then Trizol (Ambion) was added at a 5-fold volume ratio for RNA preservation, and total RNA was extracted (Choi, Lee et al. 2013); (Hofmann, de Vos et al. 2002).
  • Trizol Ambion
  • the gene was amplified by qPCR method using SYBR Green (TOPreal qPCR 2X PreMIX, EnzynoMics). All qPCRs were examined by duplication and corrected by GAPDH. Primer sequences used in the experiment are as follows.
  • Plasma gelsolin concentrations in plasma of patient bone marrow or peripheral blood were measured according to the manufacturer's manual with ELISA Kit for human Gelsolin (Life Science Inc., hubei, China).
  • erythrocyte hemolysis and plasma and platelet geloline concentrations were measured in immuno-coated 96-well plates (Nunc Immunoplates, Thermo Scientific, Germany) with samples of different concentrations of erythrocytes or platelets. Plasma was included and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing three times using the washing buffer (PBS containing 0.05% Tween20), the PBS containing 10% FBS is left to stand. After 1 hour, wash again three times using the wash buffer, and then put the first antibody (Gelsolin antibody, Abnova, Taipei, Taiwan) and leave for 1 hour at room temperature, then wash five times using the wash buffer.
  • the washing buffer PBS containing 0.05% Tween20
  • HRP-conjugated secondary antibody anti-rabbit, Jackson ImmunoResearch Antibody, USA
  • detection reagents ECL solutions
  • the Mann-Whitney test was used to test statistical significance between disease groups.
  • Plasma gelsolin protein (pGSN) levels were measured by ELISA in the patient's bone marrow or peripheral blood plasma according to conventional methods. If sample hemolysis was suspected, it was determined that plasma gelsolin levels were too different to reflect actual patient blood concentrations. In addition, the measurement of plasma gelsolin by Western blot also showed a big difference according to the degree of incorporation of RBC, and thus the actual amount of pGSN in plasma could not be measured. Therefore, the inventors first confirmed that the level of plasma gelsolin in the hemolyzed specimens can be severely varied.
  • Table 1 shows the parts indicated by the abbreviations in the drawings and tables showing the experimental results.
  • protein concentration and mRNA expression rate do not have the same meaning.
  • the present inventors have found that buffy including blood leukocytes and erythroblasts as well as platelets in the blood and bone marrow of patients with hematopoietic dysplasia and hematologic disorders such as acute or chronic leukemia.
  • the coat was used to test whether the expression level of gelsolin mRNA was meaningful for the diagnosis and prognosis of these diseases.
  • this method is more likely to be used due to the simpler test method and less error between examiners than the mononuclear cell separation method, which is difficult to use in a hospital laboratory using a density gradient centrifuge method.
  • the amount of gelsolin mRNA expression in peripheral blood collected during initial diagnosis of myelodysplastic syndrome and hematologic malignancies was measured by qPCR and compared with the normal value of 1.
  • Peripheral blood from patients with hematologic disorders, including myelodysplastic syndrome was divided into 5 groups (MDS, Leukemia, Lymphoma, Myeloproliferative Disease (MPN), etc.) for each disease. I checked. Detailed diseases and the number of cases included are shown in Table 2 below.
  • the expression rate (median value) of gelsolin mRNA was lower than that of normal persons.
  • the median value was particularly low, showing a statistically significant difference from the other groups (P values for MDS, MPN, and others were 0.016, 0.040, and 0.005, respectively) (see FIG. 6).
  • the expression level of gelsolin was very low in AML, ALL, and CLL disease groups regardless of acute or chronic or bone marrow or lymphatic system.
  • MPN group including leukocytes, erythrocytes, or CML with high platelet counts, as well as essential thrombocythemia (ET) with high platelet counts and polycythemia vera (PV) with increased red blood cells and bone marrow cells
  • E essential thrombocythemia
  • PV polycythemia vera
  • peripheral blood buffy coat gel expression was low in aplastic anemia or hypocellular marrow, which showed little or no cells in the bone marrow.
  • gelsolin mRNA expression was increased compared to normal adults.
  • the expression of gelsolin in acute leukemia is significantly reduced compared to the MDS group. Therefore, the expression level of gelsolin may be helpful for differential diagnosis of MDS on the diagnosis boundary, especially RAEB-2. I think you can.
  • the expression and pattern of gelsolin mRNA were similar to those of peripheral blood.
  • the expression of gelsolin mRNA was lower than that of the normal group, and the median value was particularly low in the leukemia group, which was significantly different from other groups (P for MDS, MPN, and EtcP, respectively). 0.024, 0.030, 0.019) (see FIG. 7).
  • the expression level of gelsolin was very low in all groups of AML, ALL, and CLL leukemia (median 0.05). Patients with bone marrow involvement of lymphoma also showed low levels of gelsolin mRNA expression at diagnosis (median 0.12).
  • the present invention uses a buffy coat of bone marrow or peripheral blood to reveal that gelsolin mRNA expression correlates with disease, making it available for marker or therapeutic response.
  • Vardiman JW M. J., Baccarani M, et al., Ed. (2008). Introduction and overview of the classification of the myeloid neoplasms. In: Vardiman JW, Brunning RD, Arber DA, Le Beau MM. eds. . WHO Classification of Tumours of Hematopoietic and Lymphoid Tissues. . Lyon, France, IARC Press.

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Abstract

본 발명은 말초혈액이나 골수흡인액의 버피 코트 내의 겔솔린 mRNA 레벨 측정에 의한 혈액질환 가능성 군 선별방법 및 혈액질환 예후 분석방법에 관한 것이다. 본 발명의 선별 또는 예후 분석 방법을 이용하여 혈액질환 가능성 군을 선별하고, 혈액질환 환자들의 예후를 용이하고 정확하게 분석할 수 있다.

Description

혈액질환 진단
본 발명은 대한민국 보건복지부의 지원 하에서 과제번호 HI10C17400200에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국보건산업진흥원, 연구사업명은 "보건의료기술연구개발사업", 연구과제명은 "줄기세포로부터 적혈구전구세포로의 효율적 분화 및 기전 연구", 주관기관은 연세대학교 산학협력단, 연구기간은 2013.04.01-2014.03.31이다.
또한 본 발명은 대한민국 보건복지부의 지원 하에서 과제번호 HI12C0202에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국보건산업진흥원, 연구 사업명은 "보건의료기술연구개발사업", 연구과제명은 "줄기세포 분화 및 성숙 유도를 통한 골수형성이상증후군 치료제의 개발", 주관기관은 한양대학교 산학협력단, 연구기간은 2013.08.01-2014.07.31이다.
본 특허출원은 2014년 3월 11일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2014-0028399호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 버피 코트 내의 겔솔린 mRNA 레벨 측정에 의한 혈액질환 가능성 군 선별 방법 및 혈액질환의 예후 분석 방법에 관한 것이다.
혈액종양 질환
혈액 및 골수에서 발생하는 혈액종양 질환은 크게 급성/만성 백혈병(acute/chronic leukemia), 골수증식종양(myeloproliferative neoplasm, MPN), 골수형성이상증후군(Myelodysplastic Syndrome, MDS)으로 분류된다(Vardiman JW 2008).
급성/만성 백혈병은 각각 골수성 백혈병과 림프구성 백혈병으로 세분화된다.
골수증식종양은 만성골수성백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 진성적혈구증가증(polycythemia vera, P. vera), 진성혈소판증가증(essential thrombocythemia, ET), 일차골수섬유증가증(primary myelofibrosis, PMF) 등으로 세분화된다.
골수형성이상증후군은 단계열형성이상불응혈구감소증(refractory cytopenia with unilineage dysplasia, RCUD), 다계열형성이상불응혈구감소증(refractory cytopenia with multilineage dysplasia RCMD), 모세포증가불응빈혈(골수내 myeloblast 5-10%는 RAEB 1, myeloblast 11-19%는 RAEB 2) 등으로 세분화된다(Brunning RD 2008).
골수형성이상증후군 설명, 유병율
골수형성이상증후군은 악화되는 범혈구 감소, 세포분화/성숙의 이상으로 비효율적 조혈을 특징으로 하는 후천적인 희귀 난치성 혈액질환으로, 골수내 세포의 이상으로 정상적으로 혈액세포를 만들지 못하는 질병이다. 이 질환은 수년에 이르는 만성 경과를 보이기도 하고 급성백혈병으로 진행하기도 해 전골수백혈병(preleukemia)이라고 불리기도 한다.
골수형성이상증후군은 골수에서 발생하는 원발성 종양으로 일반 백혈병보다 발병율이 높지만, 현재 골수형성이상증후군의 발병률은 과소평가되어 진단받지 못한 경우가 상당수 있다고 추정된다. 건강보험공단 통계에 의하면, 2005년 국내환자는 1,845명이고, 매년 500-600명의 환자가 발생한다. 미국에서는 60세 이상 연령 그룹에서 500명당 1명 꼴로 발병하며(Newman, Maness-Harris et al. 2012), 연간 15,000명의 환자가 새로 발생하고 그 수가 급격히 증가할 것이라고 예상되고 있다(Barzi and Sekeres 2010).
진단법, 예후
골수형상이상증후군의 진단은 말초혈액이나 골수 검사를 통해 진단하는데, 골수내 조혈세포의 세가지 분류 즉 골수계(myeloid), 적혈구계(erythroid), 혈소판을 생성하는 거핵구계(megakaryocyte)의 세 세포계열(lineage) 별로 이형성증(dysplasia)의 정도를 평가하여 그 범위와 중증을 정한다. 평균 생존기간은 22개월에 불과하여, 폐암 환자의 위험군별 생존기간을 비교해 봤을 때 중간생존기간이 비슷한 정도로 매우 심각하여, 예후가 0.4~5.7년에 불과하다. 이중 단계열형성이상불응혈구감소증(refractory cytopenia with uinilineage dysplasia, RCUD)이나 환상철적모구불응빈혈(Refractory anemia with ring sideroblasts, RARS)은 비교적 좋은 예후를 갖는 낮은 위험 군에 속한다. 반면 다계열형성이상불응혈구감소증(RCMD), 모세포증가불응빈혈(RAEB 1, RAEB 2)은 9-30개월 이내에 급성백혈병으로 진행하거나 죽게 되는 나쁜 예후를 갖는 그룹에 속한다. RAEB-1의 25%, RAEB-2의 33%가 AML로 발전한다. 이 질병군에서 환자 상태가 악화되는지 지속적으로 예측할 수 있는 지표는 아직까지 없다.
골수형성이상증후군의 최근 치료
골수이형성 증후군은 효과적인 치료약이 없어, 환자들은 대개 초기에 오더라도 치료하지 않고 지내는 경우가 많다. 좀더 악화된 시기에 방문하면 전통적으로 보존적 치료 및 고위험군에서 항암화학요법 및 동종조혈모세포이식술이 시행되어 왔다. 최근 5년 사이 새로운 개념의 표적치료제(epigenetics 요법)에 의해 생존률의 향상을 가져와 이때까지의 치료 원칙인 최적의 보존적치료(best supportive care)를 대체하는 새로운 치료법으로 대두되었고, 다양한 약제와의 조합 치료(combination therapy)를 위한 노력이 계속되고 있다. 그러나, 가장 좋은 치료제라 하더라도 치료에 반응하는 환자비율은 평균 10%에 불과하다. 이에, 향후 근본적으로 골수이형성 증후군의 원인에 대응해 치료제를 개발해야 하며, 고령의 환자에게 대부분 시행 가능하지 못한 조혈모세포 이식이 아닌, 단백질 자극에 의한 부작용이 적고 안전한 치료제/치료보조제가 개발되어야 한다.
이에 본 발명자들은 골수형성이상증후군 환자의 골수세포의 배양시나 조혈모세포의 외부 배양으로 생성한 적혈구계 세포의 이형성(dysplasia)을 배양액에 인간 재조합 겔솔린 단백질(human recombinant gelsolin protein)을 처리시 효과적으로 개선시킬 수 있음을 확인한 바 있다. 이어 본 발명자들은 겔솔린 단백질이나 RNA의 혈장 농도 혹은 세포 농도가 골수형성이상증후군을 비롯한 혈액종양질병의 진단이나 예후 마커로 쓰일 수 있는지 연구하고자 하였다.
겔솔린
겔솔린은 액틴 필라멘트(actin filament)들과 결합하는 단백질로 액틴 필라멘트들을 절단하거나 capping 하여 액틴의 분해 혹은 결합을 조절하는 역할을 한다고 알려져 있다(Gremm and Wegner 2000). 겔솔린은 사이토플라스믹(cytoplasmic) 겔솔린 혹은 플라스마(plasma) 겔솔린의 형태로 존재한다. 플라스마 겔솔린은 N말단에 25의 아미노산이 더 붙어 사이토플라스믹 겔솔린(Chauhan, Ji et al. 2008)과 구분되며, 세포 밖으로 분비(secreted) 된다. 정상인 혈장에서 200-250 mg/L의 고농도로 존재한다(Kwiatkowski 1988). 또한 플라스마 겔솔린은 액틴-청소 단백질(actin-scavenging protein)로 세포 조직에 상처가 발생한 경우 플라스마로 대량 방출된 G-액틴, F-액틴을 격리, 제거시켜 미소순환을 보호하는 역할을 한다(Lee and Galbraith 1992).
다른 질환에서 겔솔린의 진단적 가치
현재 플라스마 겔솔린과 질병 관계에 대해 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 플라스마 겔솔린은 주로 근육에서 생산되고 분비되어(Kwiatkowski 1988), 화상, 외상(trauma), 뇌 허혈(brain ischemia)/뇌졸중, 호흡 부전(respiratory failure)과 같은 다양한 질병 등에서 연구되었다. 급성 세포 손상(acute cellular injury)이나 괴사와 연관된 몇가지 질병군(acute lung injury, septic shock, trauma, myonecrosis)에서는 정상 수치보다 50%정도 겔솔린의 수치가 감소되어(Suhler, Lin et al. 1997) 액틴-청소 시스템(actin-scavenger system)에 의한 방어 시스템이 작동하지 않아 환자의 예후에 치명적인 영향을 끼치기도 한다. 뿐만아니라, 대장암, 위암, 폐암, 난소암, 유방암, 방광암, 전립선암, 신장암 등 여러 종양에서 겔솔린 발현의 감소가 암 발생과 밀접한 관련이 있다고 보고되고 있다(Noske, Denkert et al. 2005).
골수형성이상증후군에서 겔솔린 mRNA 레벨의 진단적 가치
그러나 골수형성이상증후군(MDS, Myelodysplastic Syndrome) 환자에서 겔솔린과의 관련성 여부에 대해 알려진 바가 거의 없다. 또한 대부분 기존 연구에서는 플라스마 겔솔린을 ELISA나 웨스턴 블랏 등으로 측정하여 감소 여부를 보고하였으나, 이 방법이 적절한지에 대해서는 검증된 바 없다. 급성 또는 만성 백혈병(acute or chronic leukemia) 질환에서 혈장 단백질 농도를 본 경우는 있으나, 분자 수준에서 겔솔린의 증가 및 감소여부에 대해 조사된 바가 전혀 없다.
또한 2008년 Genetics and Molecular Research(Qi, Chen et al. 2008)에 발표된 논문에서 골수형성이상증후군(MDS, Myelodysplastic Syndrome) 환자와 골수 질환 환자의 골수 단핵 세포(mononuclear cells)에서의 유전자 어레이결과 겔솔린 발현이 감소하는 패턴을 확인 하였다. 그러나, 어레이 결과를 PCR로 각 유전자의 발현을 확인하거나 검증하지 않았고, 단핵 세포는 혈소판이나 버피 코트(buffy coat) 에만 포함되는 다형핵 세포(polymorphonuclear cell) 등을 포함하고 있지 않아 전체적인 세포 상황을 반영하고 있지 못했다. 게다가, 피콜(Ficoll)을 사용하여 장시간 수작업으로 실험해야 얻어지는 단핵 세포는 사실상 환자 진단환경에서 대량으로 사용하기 불가능하기 때문에 바이오마커로 이용하기 어렵다. 또한 골수검사는 처음 진단시에만 시행하기 때문에 예후나 추적 검사(follow up)을 위해서는 시행할 수 없다는 큰 문제가 있다. 게다가 혈액종양 환자의 추적검사나 진단시 예후마커로서 역할은 밝혀진 바 없다.
2011년 아미노산에는 급성골수아구성백혈병(acute myeloblastic leukemia) 환자의 골수 및 말초혈 혈청으로 2DE(2-dimensinonal gel electrophoresis) 단백질 정량 실험을 통해 겔솔린이 감소하는 것을 밝혀 냈다(Braoudaki, Lambrou et al. 2013). 그러나 세포가 어떤 체내 요구에 의해 겔솔린을 생산하기 위해 mRNA 시그널이 증가하는 것과, 이것이 인트라사이토플라스믹 혹은 플라스마 형의 겔솔린으로 만들어지는 비율과, 혈장내로 분비된 겔솔린이 분해(degradation)되는 상황 등은 아직 밝혀진 바가 거의 없어 mRNA와 플라스마 겔솔린 레벨 간의 상관 관계를 예측하기 어렵다.
현재 대부분의 논문에서 사용한 ELISA와 웨스턴 블랏 방법으로 환자 질병군에서 플라스마 겔솔린을 연구한 논문들은 검체 혈액의 용혈(hemolysis)을 배제하지 못해, 검체의 용혈시 세포내(intracellular) 겔솔린이 플라스마로 방출되는 경우를 간과하여 그 측정값이 정확한지 알 수 없다. 또한 전혈(whole blood) 검체에서 단핵 세포를 분리해 실험하는 경우도 상당한 양의 RBC를 제거하기 어려울 뿐 아니라 혈소판도 같이 분리되기 때문에, 혈소판에 높은 농도로 있는 겔솔린 효과를 배제할 수 없다. 그러나, 검체에서 적혈구나 혈소판의 혼입 유무를 확인하고 연구한 예도 없고, 플라스마에서 측정시 용혈 유무를 체크한 후 겔솔린을 측정한 보고도 없다.
따라서 본 발명자는 혈액종양 질환 환자의 골수 및 말초 혈액에서 겔솔린 유전자 발현을 통해 질병 진단이나 경과(progression) 판단 및 예후인자(prognostic factor)로 사용가능한지 알아보고자 하였다. 이를 위해 이형성(dysplasia)이 있는 골수형성이상증후군 환자 및 다양한 혈액종양 질환에서 겔솔린 발현에 문제가 있는지 분비된 혹은 인트라사이토플라스믹 단백질 레벨과 mRNA 레벨을 골수 검체는 물론 말초혈액에서 다양한 방법으로 실험하여 혈액종양 질환별 마커로서의 가능성을 연구하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 피검체의 혈소판 농도나 적혈구 용혈 상태 등에 따라 영향을 받지 않는 신규 진단 마커를 이용한 혈액질환 진단 및 예후 분석 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 대상(subject)으로부터 분리된 말초 혈액 또는 골수에 포함된 겔솔린(gelsoline) mRNA 레벨을 측정함으로써 혈액 질환을 진단하고 그 예후를 분석할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 혈액질환 가능성군의 선별 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 혈액질환의 예후 분석 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 혈액질환 가능성군의 선별 방법을 제공한다. :
(a) 객체(subject)로부터 분리된 상태의 말초 혈액 또는 골수 흡인액의 버피 코트를 제공하는 단계; 및
(b) 상기 버피 코트에 포함된 혈액질환 마커로서의 겔솔린(gelsolin) mRNA의 발현량을 측정하는 단계; 상기 겔솔린의 mRNA의 발현량이 정상 그룹의 발현량에 비하여 80% 이하의 저레벨 또는 120% 이상의 고레벨로 측정되는 경우 혈액질환 가능성군으로 선별된다.
본 발명자들은 피검체의 혈소판 농도나 적혈구 용혈 상태 등에 따라 영향을 받지 않는 신규 진단 마커를 이용한 혈액질환 진단 및 예후 분석 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 대상(subject)으로부터 분리된 말초 혈액 또는 골수에 포함된 겔솔린(gelsoline) mRNA 레벨을 측정함으로써 재생불량성 빈혈, 혈액종양 질환 등을 포함하는 혈액질환 가능성 군을 선별하고 그 예후를 분석할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
이하 본 발명을 단계별로 자세히 설명한다.
(a) 객체(subject)로부터 분리된 상태의 말초 혈액 또는 골수 흡인액의 버피 코트를 제공하는 단계
본 발명에 있어서의 진단은 객체로부터 분리된 상태의 말초 혈액 또는 골수의 버피 코트를 이용한다. 본 명세서 상의 용어 “말초 혈액”은 전신을 순환하고 있는 혈액으로서 피부를 통하여 채취 가능한 혈액을 의미한다. 본 명세서 상의 용어 “골수 흡인액”은 뼈 안쪽 공간에 위치한 유연한 조직으로서, 혈액을 생성하는 조혈 기관인 골수로부터 종래 알려진 흡인 방법을 통해 추출한 생체시료를 의미하고, 편의상 본 명세서 상에서 “골수”라고 표현할 수 있다. 본 발명에 있어서의 말초 혈액 또는 골수 흡인액은 객체로부터 분리된 상태의 것을 이용할 수 있다. 골수흡인액의 경우는 최초 진단 시 바람직하게 이용할 수 있으나 추적 검사(follow up)에 있어서, 객체로부터의 분리에 제한이 따를 수 있다. 따라서 바람직하게 객체로부터 분리된 말초 혈액을 진단 시료로서 이용할 수 있지만, 골수흡인액의 이용을 제한하는 의미로 해석되어서는 안 된다. 상기 말초 혈액 및 골수흡인액으로부터 채취한 “버피 코트”는 농도 구배 원심분리를 시행하는 경우 분리되는 적혈구 층과 혈장 층의 사이에 위치하는 하얀 띠 모양의 층으로서, 주로 백혈구 및 혈소판을 포함하고 다형핵 세포(polymorphonucleae cell) 등을 포함하는 층을 의미한다. 본 발명의 용어 “겔솔린”은 액틴-결합 단백질로서 액틴 필라멘트의 집합의 핵심 조절자로 알려져 있다. 본 발명의 선별 방법은 객체의 버피 코트 내에 포함된 겔솔린의 mRNA 레벨을 이용한다.
(b) 상기 버피 코트에 포함된 혈액질환 마커로서의 겔솔린( gelsolin ) mRNA 의 발현량을 측정하는 단계
본 발명자들은 상기 버피 코트 상에 포함된 겔솔린의 mRNA 레벨과 혈액질환 상태와의 상관관계 및 겔솔린 mRNA 레벨의 변화 양상에 따른 혈액질환의 악화와의 연관성을 규명하였다. 혈액 속에 포함된 특정 mRNA 레벨을 측정하는 종래 공지된, 또는 향후 개발될 어떠한 방법이라도 이용할 수 있고, 특별한 제한은 없다. 본 발명의 특징은 버피 코트 내에 포함된 겔솔린 mRNA 레벨을 혈액질환의 진단 표지로서 이용하는 것에 특징이 있고, mRNA 측정 방법에 제한을 두는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 본 발명의 방법에 있어서의 발현량의 측정은 qPCR(quantitative real-time PCR), RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends), Multiplex RT-PCR, 노던 블랏(Northern blotting), 뉴클레아제 보호 분석(Nuclease Protection Assays), 인시츄 혼성화(In Situ hybridization), SAGE(serial analysis of gene expression), RNA 마이크로어레이 및 유전자 칩(RNA microarray and gene chips), 및 RNA-seq(RNAsequencing)로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의한 측정이다. 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 일 실시예에서 이용한 바와 같이 qPCR을 이용하여 종래 공지된 방법에 따라, 버피 코트 상의 겔솔린 mRNA 레벨을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 혈액질환은 재생 불량성 빈혈 또는 혈액 종양 질환이고, 보다 구체적으로 본 발명의 혈액 종양 질환은 급성 백혈병, 만성 백혈병, 골수증식종양 및 골수형성이상증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다. 본 발명자들은 상기 모든 질병군에 속하는 환자들로부터 얻은 생물학적 시료(말초 혈액 및/또는 골수)를 통해 정상인의 겔솔린 mRNA 레벨에 비하여 평균적인 감소를 보임을 확인하였다.
본 발명의 급성 백혈병은 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia) 및 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia) 등을 포함하고, 본 발명의 골수증식종양은 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 진성적혈구증가증(polycythemia vera), 진성혈소판증가증(essential thrombocythemia) 및 일차골수섬유증가증(primary myelofibrosis)을 포함하며, 본 발명의 골수형성이상증후군은 단계열형성이상불응혈구감소증(refractory cytopenia with unilineage dysplasia), 다계열형성이상불응혈구감소증(refractory cytopenia with multilineage dysplasia), 모세포증가불응빈혈1(RAEB 1) 및 모세포증가불응빈혈2(RAEB 2)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명인 방법 상에서, 버피 코트에서의 겔솔린의 mRNA의 발현량이 정상 그룹의 발현량에 비하여 80% 이하의 저레벨로 측정되는 경우 혈액 질환으로 진단되며, 120% 이상의 고레벨로 측정되는 경우에는 타 질환으로의 발전 직전 또는 직후의 혈액종양 질환으로 진단된다.
보다 구체적으로 상기 혈액종양 질환 환자들은 정상인의 버피 코트 겔솔린 mRNA 레벨에 비하여 80%이하, 더 구체적으로 70%이하, 더욱 더 구체적으로 60%이하, 보다 더 구체적으로 50%이하, 보다 더 구체적으로 40%이하, 보다 더 구체적으로 30%이하의 발현량을 보인다. 발현량이 낮아질 수록 혈액 질환으로 진단될 가능성은 증가한다. 특히 골수형성이상증후군, 백혈병, 골수증식종양 간의 겔솔린 mRNA 발현량 관계에 있어서 백혈병(leukemia)의 경우, 평균적으로 가장 낮은 발현량을 보인다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 객체가 골수이형성증 환자인 경우, 상기 겔솔린의 mRNA 발현량이 정상 그룹의 발현량에 비하여 120% 이상의 고레벨로 측정되는 경우, 전백혈병 단계로 악화된 상태인 것으로 예측된다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 전백혈병 단계로 악화된 상태는 모세포과다 불응성빈혈 2(RAEB-2)이다. 상기 불응성빈혈 2는 RAEB-2로부터 발전된 직후의 급성 골수성 백혈병(AML)을 포함하는 것으로 해석된다.
대부분의 혈액질환 가능성 군의 겔솔린 레벨이 정상군의 80% 이하로 측정되는 가운데 예외적으로 질병간 진단 경계상에 있는, 예를 들면, 골수형성이상증후군(MDS)로부터 급성골수성백혈병(AML)로의 질병의 발전 경계상의 상태에 있는 환자들에게서 정상인의 겔솔린 mRNA 수치에 비하여 증가된 겔솔린 mRNA 수치가 관찰된다.
보다 구체적으로 상기 타 질환으로의 발전 직전 또는 직후의 혈액 종양질환 환자들은 정상인의 버피 코트 겔솔린 mRNA 레벨에 비하여 120%이상, 더 구체적으로 130%이상, 더욱 더 구체적으로 140%이상, 보다 더 구체적으로 150%이상의 발현량을 보인다. 이는 앞서 언급한 바와 같은 골수형성이상증후군(MDS)로부터 급성골수성백혈병(AML)로의 질병의 발전 경계상의 상태에 있는 환자들 진단 상에 나타나는 특징이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 시료의 혈소판 농도 또는 적혈구 용혈 상태에 영향을 받지 않는다. 종래 혈장에 포함된 겔솔린 단백질의 농도를 질병의 진단에 이용하고자 하는 시도가 있었지만, 혈장에 포함된 겔솔린 단백질의 레벨은 시료의 혈소판 농도, 적혈구 용혈 상태 등과 같은 검체의 다른 요소들에 의해 영향을 많이 받아 일관된 결과를 얻을 수 없고, 질병상태를 잘 반영하지 못하여 제대로 된 질병의 진단에 이용할 수 없었다. 본 발명자들은 말초 혈액 또는 골수로부터 분리한 버피 코트를 이용하는 경우, 시료의 혈소판 농도 또는 적혈구 용혈 상태 등에 상관없이 일관된 결과를 얻을 수 있음을 규명하였고, 이를 이용한 혈액종양 질환 진단 방법을 발굴하였다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 혈액종양 질환의 예후 분석 방법을 제공한다:
(a) 객체(subject)로부터 분리된 상태의 말초 혈액 또는 골수흡인액의 버피 코트를 이용하여, 상기 버피 코트에 포함된 겔솔린 mRNA의 제1 발현량을 측정하는 단계;
(b) 증상의 호전이 기대되는 시간의 경과 후, 개체로부터 분리된 상태의 말초 혈액 또는 골수흡인액의 버피 코트를 이용하여, 상기 버피 코트에 포함된 겔솔린 mRNA의 제2 발현량을 측정하여 상기 제1 발현량과 상대적인 차이를 비교하는 단계; 상기 제1 발현량에 비하여 상기 제2 발현량이 3배 이상 증가하는 경우, 질환이 악화된 것으로 분석된다.
본 발명자들은 객체에 대한 최초 검진시 측정한 겔솔린 mRNA 발현량에 따른 현 질병 상태의 진단 뿐만 아니라, 객체에 대한 추적 검사(follow up)에 있어서, 겔솔린 mRNA 발현량의 상대적인 변화 양상 관찰을 통해 질병의 예후를 분석할 수 있음을 규명하였다.
이하 단계별로 본 발명을 자세히 설명한다.
(a) 객체(subject)로부터 분리된 상태의 말초 혈액 또는 골수흡인액의 버피 코트를 이용하여, 상기 버피 코트에 포함된 겔솔린 mRNA 의 제1 발현량을 측정하는 단계
본 발명인 혈액종양 질환의 예후 분석 방법은 본 발명의 다른 일 양태인 혈액종양 질환의 진단 방법과 버피 코트에 포함된 겔솔린 mRNA 레벨 측정 결과를 이용한다는 점에서 공통되며, 공통되는 부분에 대한 기재를 원용하고, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략하도록 한다.
본 발명인 방법은 객체의 질병 상태의 예후를 분석하기 위하여, 분석 시료로서 객체로부터 분리된 시기를 달리하는 두 버피 코트 시료를 이용한다. 본 명세서 상의 용어 “제1 발현량”이란 상기 두 버피 코트 시료 중 객체로부터 분리된 시기가 앞서는 시료 내의 겔솔린 mRNA 발현량을 의미한다. 겔솔린 mRNA 발현량은 정상인의 겔솔린 mRNA 발현량을 기준으로 상대적인 값으로 나타낼 수 있다.
제1 발현량의 측정은, 본 발명의 다른 일 양태인 혈액종양 질환의 진단 방법에 대한 상세한 설명에서 이미 설명한 바와 같은 방법으로 측정할 수 있다.
(b) 증상의 호전이 기대되는 시간의 경과 후, 개체로부터 분리된 상태의 말초 혈액 또는 골수의 버피 코트를 이용하여, 상기 버피 코트에 포함된 겔솔린 mRNA 의 제2 발현량을 측정하여 상기 제1 발현량과 상대적인 차이를 비교하는 단계
본 발명인 혈액질환의 예후 분석 방법은 질병의 변화를 예측하고 전망하는 것으로서, 상기 제1 발현량의 측정 후, 경우에 따라 질병 상태를 호전시키기 위해 적절한 치료를 수행한 뒤, 그 치료 효과, 질병 상태의 변화 등을 추적검사(follow up)하는 과정을 포함한다. 상기 “증상의 호전이 기대되는 시간의 경과 후”는 질병 상태를 호전시키기 위하여 행해진 적절한 치료 방법에 따라, 증상이 호전되는 것이 일반적으로 기대되는 시일의 경과 후를 의미하고, 이는 객체의 건강 상태, 치료 요법의 종류, 치료에 대한 감응성 등 복합적인 요소에 의해 달라질 수 있다. 상기 “증상의 호전이 기대되는 시간의 경과 후”라는 표현은 증상이 호전이 일반적으로 기대되지 않는 지나치게 짧은 시간 간격으로 제1 발현량과 제2 발현량을 측정하는 경우, 통상 그 변화를 기대하기 어렵다는 점을 반영하는 것으로서, 반드시 해당 증상이 호전될 것을 조건으로 하지 않는다. 질환의 종류, 치료 방법 등에 따라, 수 시간이 될 수도 있으며, 수 일 또는 그 이상이 될 수 있다.
본 발명인 혈액질환의 예후 분석 방법은, 상술한 제1 발현량과 제2 발현량의 상대적인 차이를 비교함으로써 실시된다. 구체적으로 상기 제1 발현량에 비하여 상기 제2 발현량이 약 3배 이상, 더 구체적으로 3.5배 이상, 더욱 구체적으로 4배 이상, 더욱 더 구체적으로 5배 이상, 더욱 더 구체적으로 6배 이상 증가하는 경우, 질환이 악화된 것으로 분석된다.
제1 발현량에 비하여 제2 발현량에 거의 변화가 없거나, 감소하는 경우에는 치료에 반응을 하고, 질병진행이 느린 것으로 판단되고, 제2 발현량이 증가하지만 약 3배 이내로 증가하는 경우에는 질병이 악화되지 않은 것으로 판단된다. 그러나 제2 발현량이 약 5배 이상 증가하는 경우에는 질병이 악화된 것으로 판단되고, 구체적으로 예를 들면, 복합계통 이형성을 갖는 내화성 혈구감소증(RCMD)에서 모세포과다 불응성 빈혈(RAEB-1)로의 악화 또는 RAEB-1에서의 급성 골수성 백혈병(AML)로의 악화 등으로 판단된다(참조: 도 3).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a) 및 단계 (b)에서의 버피 코트는 말초 혈액으로부터 분리한 버피 코트이다. 본 발명의 방법 상 말초 혈액 또는 골수로부터 분리된 버피 코트를 이용할 수 있지만, 추적 검사(follow up)의 편의상 골수로부터 분리된 버피 코트보다는 말초 혈액으로부터 분리된 버피 코트를 바람직하게 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 발현량의 측정은 qPCR(quantitative real-time PCR), RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends), Multiplex RT-PCR, 노던 블랏(Northern blotting), 뉴클레아제 보호 분석(Nuclease Protection Assays), 인시츄 혼성화(In Situ hybridization), SAGE(serial analysis of gene expression), RNA 마이크로어레이 및 유전자 칩(RNA microarray and gene chips), 및 RNA-seq(RNAsequencing)로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의한 측정이다. 종래 공지된 절차에 따라 상기 방법을 이용하여 겔솔린 mRNA의 발현량을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 혈액질환은 재생 불량성 빈혈 또는 혈액 종양 질환이다. 보다 더 구체적으로 본 발병의 혈액 종양 질환은 급성 백혈병, 만성 백혈병, 골수증식종양 및 골수형성이상증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다. 본 발명자들은 상기 모든 혈액종양 질환들에 대하여 질병 악화 양상과 겔솔린 mRNA 변화 양상과의 상관관계를 규명하였다.
본 발명의 진단 방법 및 예후 분석 방법은 환자의 신체적, 경제적 부담을 덜어주고, 다른 주변 요소들에 영향을 받지 않는 일관성 있는 진단 및 예후 분석 결과를 얻을 수 있도록 한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 혈액질환 가능성군의 선별 방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 혈액질환 예후 분석 방법을 제공한다.
(c) 본 발명을 이용하면, 혈액질환 가능성 군을 주변 요소들의 영향을 최소화하여 일관성있게 선별하는 것이 가능하다.
(d) 본 발명을 이용하면, 혈액질환의 예후를 보다 높은 정확도로 분석하는 것이 가능하다.
도 1은 말초혈액의 용혈이나 혈소판 혼입에 의한 플라스마 겔솔린 농도에의 영향을 나타낸다.
도 2는 말초혈액 및 골수에서 ELISA 및 qPCR 방법에 의한 플라스마 겔솔린의 발현량의 차이를 나타낸다.
도 3은 혈액질환 환자들의 말초혈액의 겔솔린 mRNA 발현 레벨의 변화를 나타낸다.
도 4는 혈액질환 환자의 골수 흡인액의 겔솔린 mRNA 발현 레벨의 변화를 나타낸다.
도 5는 MDS 질환의 최초 진단시 말초혈액과 골수에서 겔솔린 mRNA 발현 레벨의 비교 결과를 나타낸다.
도 6은 혈액질환 환자의 최초 진단시 말초 혈액 버피 코트에서 겔솔린 mRNA 발현 레벨의 비교 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 방법
실시예 1: 혈액채취
진단을 내리기 위해 혈액종양환자의 골수혈액 및 말초혈액을 약 3 ml 정도 EDTA 튜브에 채취하였다. 검체 채취 후 6시간 이내에 진단 후 폐기 결정된 샘플을 사용하였다. 골수 및 말초혈액을 227 g에서 10분간 원심분리한 후 버피 코트를 분리하였다. 말초혈액의 버피 코트에는 백혈구(leukocyte)가 있고, 골수의 버피 코트(buffy coat)에는 백혈구 및 적혈구 세포(erythroid cell)가 모두 포함되어 있다. 환자 검체로 qPCR 법으로 mRNA 발현량을 측정한 경우, 최근 혈소판이나 혈장 수혈 경력이 없는 경우만 포함시켜, 수혈에 의한 영향을 배제시켰다.
실시예 2: 용혈( hemolysed ) RBC 를 혼합하여 겔솔린 농도 변화 측정
먼저 혈액을 원심분리(227 g, 5분, 4℃) 한 후 혈장을 분리하였다. 혈장을 분리 한 혈액에 RBC 용해 용액(BioLegend, San Diego, USA)을 넣고 상온에 10분간 방치하였다. 다시 원심분리 후 상층액을 분리하여 4℃에 보관하였다. ELISA 수행 시 용혈된 혈액은 혈장에 희석하였으며, 총 양은 100 ㎕로 동일한 부피를 맞추어 실험을 진행하였다.
실시예 3: 혈소판을 혼합하여 겔솔린 농도 변화 측정
정상적인 혈소판을 원심분리 (227 g, 5분, 4℃) 한 후 혈소판과 혈장을 분리하였다. 혈장을 제거한 후의 농축된 상태의 혈소판을 혈소판 혈장에 농도에 따라 희석하였으며 이때 동일한 부피(100 ㎕)를 맞추어 실험을 진행하였다.
실시예 4: mRNA - PCR
검체를 227 g로 원심침전 후 버피 코트를 수집 후 RNA보존을 위해 Trizol (Ambion)을 5배 부피 비율로 넣은 후 총 RNA를 추출하였다(Choi, Lee et al. 2013); (Hofmann, de Vos et al. 2002). SuperScript III Reverse Transcriptase cDNA synthesis kit(Invitrogen)를 이용해 cDNA합성 후 SYBR Green(TOPreal qPCR 2X PreMIX, EnzynoMics)를 사용하여 qPCR 법으로 유전자를 증폭하였다. 모든 qPCR은 듀플리케이트(duplicate)로 검사하였으며, GAPDH로 보정하였다. 실험에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.
GSN, 5’-CTTTGCCTGCTCCAACAAGA-3’ / 5’-CCGTCTCGATGTACCGCTTA-3’.
GAPDH, 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’ / 5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’.
실시예 5: ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSpecific Assay)
환자 골수나 말초혈액의 혈장에서 plasma 겔솔린 농도는 ELISA Kit for human Gelsolin (Life Science Inc., hubei, China)로 제조사의 매뉴얼에 따라 측정하였다.
그 외 적혈구 용혈과 혈장 및 혈소판에 의한 겔솔린 농도는 면역-코팅된(Immune-coated) 96 웰 플레이트(Nunc Immunoplates, Thermo Scientific, Germany)에 여러 농도로 적혈구를 용해시킨 샘플 혹은 여러 농도의 혈소판을 포함한 혈장을 넣고 상온에서 2시간 방치하였다. 이후 워싱 버퍼(0.05% Tween20이 포함된 PBS)를 이용하여 세 번 씻어 낸 후 10% FBS가 포함된 PBS를 넣어 방치한다. 1시간 후 다시 워싱 버퍼를 이용하여 세 번 씻어 낸 후 첫 번째 항체(Gelsolin antibody, Abnova, Taipei, Taiwan)를 넣고 상온에서 1시간 방치 후 워싱 버퍼를 이용하여 다섯 번 씻어 낸다. 그리고 나서 두 번째 항체(HRP-conjugated secondary Ab, Jackson ImmunoResearch Antibody, USA)를 넣어 주고 상온에서 방치한다. 1시간 후 워싱 버퍼를 이용하여 7번 씻어 준 후 검출 용액(Biolegend, San Diego, CA)을 넣어 준 다음 30분 후에　ELISA 리더(reader)(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 측정한다.
실시예 6: 웨스턴 블랏 (Western blot)
환자 골수나 말초혈액을 수거한 후 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 전체 단백질을 용해(lysis) 용액으로 녹인 후 20 ㎍으로 정량하여 사용하였다. 그 후 SDS-PAGE에 전기영동 한 후 Hybond-ELC 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 멤브레인은 1시간동안 상온에서 5% skim milk(in TBST: Tris buffer saline with Tween; 25mM Tris, 140 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH8.0)에 넣어 방치하였다. 1시간이 지난 후 일차(primary) 항체 (gelsolin, Abcam, USA)를 4℃에 넣어 12시간 이상 반응시킨다. TBST로 10분씩 3번 세척 후 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체(anti-rabbit, Jackson ImmunoResearch Antibody, USA)를 넣어서 1시간 동안 상온에서 방치한 후 다시 TBST로 10분간 3회 반복하여 세척하였다. 이 후 검출 시약(ECL solution)을 가한 후 X-ray 필름에 노출시켜 각각의 단백질 발현을 확인하였다.
실시예 7: 통계
질환 그룹간에 통계적 유의미함 검증에 Mann-Whitney 테스트를 사용하였다.
실험 결과
1. 겔솔린 단백질 레벨 측정시 문제점
혈액종양환자의 경우 특히 혈관이 약하거나 적혈구의 이상형성으로 인해 혈액채취시나 환자상태상 용혈(hemolysis) 되는 경우가 있었고, 특히 골수흡인 검체의 경우는 대부분 용혈이 동반되었다. 종래 방법대로 환자의 골수나 말초혈액 플라스마에서 ELISA로 플라스마 겔솔린 단백질(pGSN) 레벨을 측정하였다. 검체 용혈이 의심되는 경우 플라스마 겔솔린 레벨이 지나치게 차이가 나서 실제 환자 혈액 내 농도를 반영할 수 없다고 판단되었다. 또한 혈장의 겔솔린을 웨스턴 블랏으로 측정한 것도 RBC의 혼입 정도에 따라 그 결과가 매우 큰 차이를 보여 실제 혈장 내 pGSN 양을 측정할 수 없었다. 따라서, 본 발명자들은 용혈된 검체에서 플라스마 겔솔린의 레벨이 심하게 변동될 수 있음을 실험으로 처음 확인하였다.
그 결과(도 1) 명확히 검체의 용혈이 없다는 것을 매번 확인하기 전에는 정확한 pGSN 농도를 측정할 할 수 없다는 것을 알게 되었다. 또한 혈소판 혼입량이 증가할 때에도 플라스마 겔솔린 레벨이 영향 받음을 확인하였다. 따라서 기존의 혈장에서 ELISA로 pGSN 농도를 측정하거나 버피 코트 및 단핵 세포를 분리해 백혈구의 겔솔린 단백질 농도를 웨스턴 블랏 법으로 측정하는 것은 일반적인 환자 샘플 검사로는 적절치 않음을 확인하였다.
도 1의 좌측 패널에 있어서, 말초혈액이나 골수혈액 채취시 흔히 일어나는 용혈에 의해 플라스마 내 겔솔린 농도가 영향을 받는지 확인하기 위해, 용혈이 없는 플라스마에 적혈구를 용혈시켜 일정 비율대로 섞은 후 겔솔린 농도를 ELISA로 측정하였다. 그 결과 적혈구 용혈량이 증가할수록, 겔솔린의 농도도 높아져서, 플라스마 겔솔린 농도가 크게 영향을 받음을 알 수 있었다. 또한 도 1의 우측 패널에 있어서, 혈장에 혈소판을 희석 배율을 달리하여 섞은 후 겔솔린 농도를 ELISA로 측정하였다. 그 결과 혈소판의 희석 농도가 커질수록 플라스마 겔솔린의 농도가 감소하여 혈장내 혈소판의 증가와 겔솔린 농도가 연관이 있음을 확인하였다.
실험 결과를 나타내는 도면 및 표에 약어로 제시된 부분이 나타내는 바를 표 1에 나타내었다.
표 1
PB 말초혈액(Peripheral blood)
BM 골수(Bone marrow)
MDS 골수형성이상증후군(Myelodysplastic syndrome)
PLT 혈소판 (platelet)
RA 불응성 빈혈(Refractory anemia)
RCMD 복합계통 이형성을 갖는 내화성 혈구감소증(Refractory cytopenia with multilineage dysplasia)
RCMD-RS 고리철적혈모세포를 갖는 RCMD(RCMD with ringed sideroblasts)
RAEB 1 모세포과다 불응성빈혈 1(Refractory anemia with excess blasts 1)
RAEB 2 모세포과다 불응성빈혈 2(Refractory anemia with excess blasts 2)
CMML 만성 골수단구 백혈병(Chronic myelomonocytic leukemia)
AML 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia)
AMML 급성 골수단구 백혈병(Acute myelomonocytic leukemia)
ALL 급성 림프모세포성 백혈병(Acute lymphoblastic leukemia)
CLL 만성 림프모세포성 백혈병(Chronic lymphocytic leukemia)
APL 급성 전골수세포 백혈병(Acute promyelocytic leukemia)
MPN 척수 증식성 종양(Myeloproliferative neoplasms)
CML 만성 골수성 백혈병(Chronic myelogenous leukemia)
P-VERA 진성 다혈구증(Polycythemia vera)
ET 본태성 혈소판증가증(Essential Thrombocythemia)
AA 재생 불량성 빈혈(Aplastic anemia)
CR 완전완화(Complete remission)
2. 버피 코트( buffy coat)의 mRNA 측정의 의미
일반적으로 단백질 농도와 mRNA 발현 비율은 같은 의미를 지니지는 않는다. 본 발명자들은 처음으로, 검체의 혈소판 농도나 적혈구 용혈 상태에 따라 영향을 받는 단백질 농도를 측정하는 것 대신 버피 코트를 이용해 분자 수준에서 겔솔린을 측정하였고, 이는 검체의 다른 요소에 영향을 받는 플라스마 단백질 레벨보다 더 일관되고 질병상태를 신속하게 더 잘 반영하는 지표가 될 수 있다고 생각하였다.
따라서, 본 발명자들은 골수형성이상증후군 및 급성 또는 만성 백혈병(acute or chronic leukemia) 등의 혈액종양질환 환자의 혈액 및 골수에서 혈액 백혈구(blood leukocyte) 및 적아구(erythroblast)는 물론 혈소판까지 포함하는 버피 코트를 이용해 겔솔린 mRNA의 발현 정도가 이들 질환의 진단 및 예후 측정에 의미가 있는지 실험하였다. 특히 이 방법은, 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifuge)법을 이용해 병원 검사실에서 이용하기 어려운 단핵 세포 분리법에 비해, 검사법이 간단하며 시험자간 오차가 적어 활용 가능성이 매우 높다.
정상군과 비교하였을 때 여러 혈액종양 질환에서 골수 흡인액(aspirates)은 흔히 용혈(helolysis) 되기 때문에, ELISA법으로 검사시 정상인보다 높은 값을 보였다. 반면, 버피 고트에서 RNA를 추출하여 겔솔린 mRNA를 qPCR로 검사한 경우는 대부분 정상인보다 발현률이 낮았다.
3. 질환 경과에 따른 말초혈액의 겔솔린 mRNA 발현 레벨의 변화
골수형성이상증후군 및 혈액종양질환 환자 11명의 말초 혈액에서 질환 상태와 겔솔린의 발현과의 상관 관계를 조사하였다. 도 3에서 같은 색의 막대는 같은 환자의 결과이며 우측으로 갈수록 시간경과 후 상태를 나타낸다.
처음 진단시보다 후속 진단(follow up) 검체에서 낮은 겔솔린 mRNA 발현량을 보이는 경우 평균 1/86.6배(1/425.7 - 1/4.3)로 감소하였고, 이 경우 치료에 반응을 하고 질병진행이 느렸다(case 2, 3, 4, 5, 9). 초기에 비해 그 발현비율이 증가했지만 3.4배(case 1), 2.1배(case 5) 증가한 경우는 악화되지 않았다. 반대로 치료에 반응을 보이지 않고 악화된 경우 초기 진단시보다 mRNA 값이 5 이상 모두 증가하였다. 즉, RCMD에서 RAEB-1로 악화되거나(6.2배, case 6), RAEB-1에서 AML로 악화된 경우(6.7배, case 7), 골수형성이상증후군에서 진행되어 AML이 되어 화학요법(chemotherapy)을 받은 후 겔솔린 값이 감소하였다가 다시 치료에 반응하지 않고 사망한 경우(11.4배, case 8), ALL로 진단 받고 치료에 효과가 있어 완치가 되었다 재발한 경우(5.1배, case 10) 겔솔린 mRNA 발현량이 5배 이상 증가하였다. 요약하면, MDS나 급성백혈병에서 질병이 악화 될 시기에 겔솔린 mRNA의 변화비율이 평균 7.36배(5.1-11.4배)로 큰 증가비를 보였다. 혈액종양질환과는 달리, 알려지지않은 오리진(unknown origin)의 고형암(solid caner)이 골수로 전이된 경우에는 사망 직전 겔솔린 레벨이 급감하였다(case 11).
요약하면, 골수형성이상증후군과 백혈병과 같은 혈액종양질환에서 말초혈액의 버피 코트를 이용한 겔솔린 mRNA 변화양상이 치료에 반응하거나 질환 악화에 대한 진단 및 예후인자의 가치가 있음을 보여주어, 혈액종양질환에서 특히 골수형성이상증후군과 관련해 질병진행의 예측인자(prognostic factor)로서 사용될 수 있음을 보여주었다.
4. 골수의 겔솔린 mRNA 발현 레벨의 변화
말초혈액과 동일하게 골수형성이상증후군 및 혈액종양질환 환자 5명의 골수를 채취 하여 임상적 후속 진단(clinical follow up)을 통해 겔솔린의 발현과 질환의 상관 관계를 조사하였다. 도 4의 같은 색의 막대는 같은 환자의 검체이며 우측으로 갈수록 시간경과 후 상태를 나타낸다.
골수의 겔솔린 발현양 증감은 말초혈액에서와 비슷한 양상임을 확인했다. Case 8 환자의 경우 화학요법(chemotherapy) 이후 골수의 세포질(cellularity)이 감소하여 겔솔린의 발현량이 급격히 감소 하였으며, case 5, case 13의 경우는 겔솔린의 발현이 3.2, 3.3배 정도만 증가하였다. 또한 질병의 진단 이후 완치 판정을 받은 CML 환자도 겔솔린 발현량이 감소하였다(case 12).
골수형성이상증후군과 백혈병 군과 비교하기 위해 검사한 재생불량성 빈혈(AA) 환자는 진단 초기 및 이후에도 낮은 값을 보이며 큰 변화를 보이지 않았다(case 14). 이는 겔솔린의 mRNA 발현의 증감이 혈액종양질환 환자 중 특히 골수형성이상증후군과 백혈병의 치료효과 여부와 질병의 진행의 악화 여부를 판단하는 데 말초혈액 검사와 더불어 도움이 될 수 있음을 보여 준다.
도 5의 좌측 패널에 있어서, 골수형성이상증후군에서 PB의 경우 저/중간 상태(low/intermediate state)에 해당하는 RA, RCMD 및 RAEB-1 환자에서 겔솔린의 발현량이 낮았다(RA, RCMD 및 RAEB-1 각각에 대하여 중앙값(median) 0.07, 0.49, 0.49). 이와 반대로 18개월 내에 33%에서 백혈병(leukemia)으로 악화되는 RAEB-2의 경우는 정상인의 수치보다 높은 값을 보였다(중앙값 2.38). 이는 도 3에서 환자의 말초혈액을 이용한 후속 진단 시 질병이 악화될 때 겔솔린 값이 증가하는 것과 일치한다.
도 5의 우측 패널에 있어서, BM에서 모두 동일하게 MDS-RA, RCMD, RAEB-1에서는 정상보다 낮은 값을 보였으나(RA, RCMD, RAEB-1에 대하여 중앙값 0.09, 0.83, 0.80) RAEB-2에서는 중앙값이 1.63으로 증가되었다. 따라서, MDS군의 세부 질환에서 질병이 악화 된 상태인 급성 백혈병(acute leukemia) 전 단계라고 할 수 있는 RAEB-2에서 겔솔린의 발현량이 증가되는 것을 볼 때, 겔솔린 mRNA의 발현 여부가 질병이 악화되는 정도를 판단하는 데 보조적인 기준이 될 수 있을 것이다.
5. 말초혈액의 버피 코트에서 겔솔린 mRNA 발현 레벨
골수형성이상증후군 및 혈액종양 질환의 초기 진단시 채취한 말초혈액에서 겔솔린 mRNA 발현량을 qPCR로 측정해 정상인의 수치를 1로 기준하여 비교하였다. 골수형성이상증후군을 비롯한 혈액종양질환 환자의 말초혈액을 통해 질환별로 5군 (MDS, 백혈병(Leukemia), 림프종(Lymphoma), 골수증식성 질환(MPN), 기타)으로 나누어 겔솔린 mRNA 발현량을 조사해 보았다. 세부질환 및 포함된 증례수는 아래 표 2에 나타냈다.
표 2
그룹 진단명 Case 수
건강한 공여자 - 3
MDS RARCMDRAEB-1RAEB-2 1632
백혈병(leukemia) AML AMMLALLCLLAPL말초 T-세포 백혈병 522222
림프종의 BM 전이(BM involvement of Lymphoma) NK/T 세포 림프종여포성 림프종 11
골수 증식성 종양(MPN) CMLETP-vera 421
기타 재생불량성 빈혈혈전성 혈소판감소성 자반병(TTP)전이성 암의 BM 관련미숙아 3111
MDS, 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), MPN군에서 정상인의 수치보다 낮은 겔솔린 mRNA의 발현율(median 값)을 보였다. 특히 백혈병 군에서 중앙값이 특히 낮아 다른 군과 통계적으로 유의한 차이를 보였다(MDS, MPN 및 기타에 대하여 P값은 각각 0.016, 0.040, 0.005)(참조: 도 6). 또한, 급성이나 만성 혹은 골수나 림프 계열에 상관없이 AML, ALL, CLL 질환군 모두에서 겔솔린의 발현량이 매우 낮았다.
백혈구, 적혈구, 혹은 혈소판이 매우 증가하는 CML은 물론, 혈소판이 매우 증가하는 진성혈소판증가증(essential thrombocythemia, ET) 및 적혈구 및 골수세포가 증가하는 진성적혈구증가증(polycythemia vera, PV)를 포함하는 MPN 군에서도 겔솔린의 발현량이 크게 낮았다. 이는 단순히 혈소판을 비롯한 혈액세포의 숫자가 증가한다고 겔솔린 mRNA의 발현율이 높은 것이 아님을 알 수 있었다. 하지만 MPN의 CML의 경우 중 질환이 악화되는 경우 겔솔린의 발현량이 더욱더 현저히 증가 되는 것을 확인 했다.
기타 질환군에서는, 골수 내에 세포가 거의 없거나 감소한 질환인 재생 불량성 빈혈이나 저세포성 골수(hypocellular marrow)의 경우 말초혈액 버피 코트의 겔솔린 mRNA 발현량이 낮았다. 미숙아는 겔솔린 mRNA 발현이 정상 성인에 비해 증가되어 있었다.
따라서, MDS군에 비하여 급성 백혈병에서 겔솔린 발현량이 매우 유의하게 감소되는 것을 볼 때, 겔솔린의 발현 정도가 급성 백혈병과 진단 경계상에 있는 MDS, 특히 RAEB-2의 경우 감별진단에 도움이 될 수 있을 것으로 판단된다.
6. 골수의 버피 코트에서 겔솔린 mRNA 의 발현량 비교
골수형성이상증후군 및 혈액종양 질환의 초기 진단을 위해 채취한 골수 흡인액에서 겔솔린 mRNA 발현량을 qPCR로 측정해 정상인의 수치를 1로 기준하여 비교하였다. 골수형성이상증후군 및 혈액종양질환 환자의 골수 검사를 통해 질환별로 5군(MDS, 백혈병, 림프종, 골수증식성 질환(MPN) 및 기타)으로 나누어 겔솔린 mRNA 발현량을 조사해 보았다. 세부질환은 표 3에 표기하였다.
표 3
그룹 진단명 Case 수
건강한 공여자 - 2
MDS RARCMDRAEB-1RAEB-2 2452
백혈병 AMLAMMLALLCLLAPL말초 T-세포 백혈병 512111
림프종의 BM 전이(BM involvement of Lymphoma) NK/T 세포 림프종 3
골수 증식성 종양(MPN) CMLETP-vera 533
기타 재생불량성 빈혈혈전성 혈소판감소성 자반병(TTP)전이성 암의 BM 관련미숙아 1114
겔솔린 mRNA의 발현 정도와 양상은 말초혈액과 비슷한 결과를 보였다. MDS, 백혈병, 림프종, MPN군에서 정상인의 수치보다 낮은 겔솔린 mRNA의 발현을 보였으며, 특히 백혈병 군에서 중앙값이 특히 낮아 다른 군과 유의한 차이를 보였다(MDS, MPN 및 EtcP 각각에 대하여 P는 0.024, 0.030, 0.019였다)(참조: 도 7). 또한, 말초혈액 결과와 마찬가지로 AML, ALL, CLL의 백혈병 모든 군에서 겔솔린의 발현량이 매우 낮았다(중앙값 0.05). 림프종이 골수에 퍼진 환자(bone marrow involvement of lymphoma)에서도 진단시 낮은 겔솔린 mRNA 발현량을 보였다(중앙값 0.12). 특히, MPN 중 각각 범혈구세포, 적혈구세포, 혈소판이 매우 증가하는 질환인 CML, p-vera, ET 질환에서도 말초혈액에서의 결과와 마찬가지로 겔솔린 레벨이 감소함을 확인할 수 있었다. 기타군에 해당하는 재생 불량성 빈혈(Aplastic anemia), 저세포성 골수(Hypocellular marrow)의 경우는 말초 혈액의 결과와는 반대로 감소하는 경향을 보였다. 혈액질환에 속하는 AA(재생불량성 빈혈)는 겔솔린의 발현양이 감소한다(0.36 +/- 0.18 로 대조군 대비 감소함). 따라서, 기타에 해당되지 않는 골수를 침범하는 혈액종양질환 군에서는 말초혈액과 골수에서의 각 질병별 겔솔린 mRNA 발현 패턴이 같아서, 진단시에만 행하게 되는 침습적인 골수채취법보다, 정기적으로 검사하게 되는 말초혈액을 이용하여 혈액종양 질환의 질병진행 정도를 면밀히 추적 가능할 것이다.
본 발명은 골수 또는 말초 혈의 버피 코트를 이용해 겔솔린 mRNA 발현이 질병과 상관성이 있음을 밝혀, 마커 또는 치료 반응에 이용할 수 있도록 하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (12)

  1. 다음 단계를 포함하는 혈액질환 가능성군의 선별 방법:
    (a) 객체(subject)로부터 분리된 상태의 말초 혈액 또는 골수 흡인액의 버피 코트를 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 버피 코트에 포함된 혈액질환 마커로서의 겔솔린(gelsolin) mRNA의 발현량을 측정하는 단계; 상기 겔솔린의 mRNA의 발현량이 정상 그룹의 발현량에 비하여 80% 이하의 저레벨 또는 120% 이상의 고레벨로 측정되는 경우 혈액질환 가능성군으로 선별된다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 발현량의 측정은 qPCR(quantitative real-time PCR), RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends), Multiplex RT-PCR, 노던 블랏(Northern blotting), 뉴클레아제 보호 분석(Nuclease Protection Assays), 인시츄 혼성화(In Situ hybridization), SAGE(serial analysis of gene expression), RNA 마이크로어레이 및 유전자 칩(RNA microarray and gene chips), 및 RNA-seq(RNAsequencing)로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의한 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 혈액질환은 재생 불량성 빈혈 또는 혈액 종양 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 혈액 종양 질환은 급성 백혈병, 만성 백혈병, 골수증식종양 및 골수형성이상증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 객체가 골수이형성증 환자인 경우, 상기 겔솔린의 mRNA 발현량이 정상 그룹의 발현량에 비하여 120% 이상의 고레벨로 측정되는 경우, 전백혈병 단계로 악화된 상태인 것으로 예측되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 전백혈병 단계로 악화된 상태는 모세포과다 불응성빈혈 2(RAEB-2)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 시료의 혈소판 농도 또는 적혈구 용혈 상태에 영향을 받지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 다음 단계를 포함하는 혈액질환의 예후 분석 방법:
    (a) 객체(aubject)로부터 분리된 상태의 말초 혈액 또는 골수의 버피 코트를 이용하여, 상기 버피 코트에 포함된 겔솔린 mRNA의 제1 발현량 을 측정하는 단계;
    (b) 증상의 호전이 기대되는 시간의 경과 후, 개체로부터 분리된 상태의 말초 혈액 또는 골수의 버피 코트를 이용하여, 상기 버피 코트에 포함된 겔솔린 mRNA의 제2 발현량을 측정하여 상기 제1 발현량과 상대적인 차이를 비교하는 단계; 상기 제1 발현량에 비하여 상기 제2 발현량이 3배 이상 증가하는 경우, 질환이 악화된 것으로 분석된다.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 단계 (b)에서의 버피 코트는 말초 혈액으로부터 분리한 버피 코트인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 발현량의 측정은 qPCR(quantitative real-time PCR), RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends), Multiplex RT-PCR, 노던 블랏(Northern blotting), 뉴클레아제 보호 분석(Nuclease Protection Assays), 인시츄 혼성화(In Situ hybridization), SAGE(serial analysis of gene expression), RNA 마이크로어레이 및 유전자 칩(RNA microarray and gene chips), 및 RNA-seq(RNAsequencing)로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의해 측정한 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 혈액질환은 재생 불량성 빈혈 또는 혈액 종양 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 혈액 종양 질환은 급성 백혈병, 만성 백혈병, 골수증식종양 및 골수형성이상증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
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