CN114507735B - 人外周血免疫细胞蛋白在检测、诊断肿瘤中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域,尤其涉及人外周血免疫细胞蛋白在检测、诊断肿瘤中的应用。本发明提供了人外周血免疫细胞Bestrophin1蛋白作为标志物在制备检测和/或诊断肿瘤的试剂和/或试剂盒中的应用。本发明提供的肿瘤标志物人外周血免疫细胞蛋白,是一类单核细胞表面表达的蛋白分子,其在包括头颈鳞癌、肺癌、结直肠癌及乳腺癌等患者的外周血单核细胞中的表达水平比正常人显著增高,肿瘤微环境对单核细胞具有特异性,因此诊断具有较高的灵敏度和特异度和广泛意义。同时各种肿瘤的外周血免疫细胞丰度均较高且易于分离标记,检测BEST1表达只需简单的流式细胞分析即可,可广泛应用于各种肿瘤类型,操作简便,可满足大规模检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,尤其涉及人外周血免疫细胞蛋白在检测、诊断肿瘤中的应用。
背景技术
近年来,恶性肿瘤(癌症)已成为世界范围内重大的公共卫生问题和导致死亡的主要病因之一,因此对于癌症的早期筛查和诊断对于病人生存率的提高和生存质量的改善尤为重要。目前应用于临床的癌症免疫学检查与诊断以检测肿瘤相关抗原为主。常用的检测指标有癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、血糖链抗原(CA)系列(CA15-3、CA19-9等)及前列腺特异性抗原(PSA)等,被称为肿瘤标志物。
肿瘤相关抗原是指肿瘤细胞和正常组织细胞均可表达的抗原,其含量在癌变时期显著增高。检测肿瘤相关抗原是目前临床最常用的癌症免疫诊断方法,同时对于癌症患者的免疫功能状态具有评估作用。肿瘤抗原的种类较为繁杂,检测较多的有胚胎抗原类和糖基抗原类等。某些肿瘤抗原在特定类型的肿瘤中高表达,如甲胎蛋白在原发性肝癌、CA19-9在胰腺癌、CA12-5在卵巢癌中等。因此,肿瘤抗原含量的测定对于肿瘤诊断有重要意义,被称为肿瘤标志物。应用于癌症诊断的标志物是目前的研究热点,致力于发现更多更有效的肿瘤标志物。
以癌胚抗原为例的肿瘤标志物可在外周血清中被检测到,常用的检测方法为化学发光免疫分析等。具体方法为抽取受试者静脉血离心分离血清样本,使用吖啶酯等发光物质标记待测肿瘤抗原的抗体,基于抗原-抗体特异性结合形成复合物,标记的化学物质被激发,发光信号强度利用发光信号测量仪器进行检测,信号强度可用来判定待测肿瘤相关抗原的含量。此外还有放射免疫分析、酶联免疫吸附试验等检测方法。
然而,现有的诊断方法具有一定局限性。其一,肿瘤相关抗原是由肿瘤细胞生成并释放到外周血中,具有一定的组织特异性,某些肿瘤并不能导致其水平发生改变。其二,肿瘤相关抗原在外周血中的丰度较低,检测方法主要是对于血清或血浆免疫分析,实验成本较高。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了人外周血免疫细胞蛋白在检测、诊断肿瘤中的应用。本发明提供的肿瘤标志物人外周血免疫细胞Bestrophin1蛋白(BEST1),是一类表达在免疫细胞膜外的蛋白,各种肿瘤的外周血免疫细胞丰度均较高且易于分离标记,检测BEST1表达只需简单的流式细胞分析即可,可广泛应用于各种肿瘤类型,操作简便,可满足大规模检测。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了人外周血免疫细胞Bestrophin1蛋白作为标志物在制备检测和/或诊断肿瘤的试剂和/或试剂盒中的应用。
在本发明的一些实施方案中,上述应用的人外周血免疫细胞包括:T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中,上述应用的肿瘤包括:子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、结肠癌、肛门生殖器区域的鳞状细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌、胃癌、膀胱癌、胆囊癌、肝癌、甲状腺癌、喉癌、唾液腺癌、食道癌、头部和颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、间皮瘤、肉瘤、血液学癌症中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中,上述肿瘤的分期包括I期,II期,III期,IV期。
在本发明的一些实施方案中,上述肿瘤的诊断包括肿瘤发病诊断、分期诊断、治疗效果诊断及预后诊断。
本发明还提供了上述应用的标志物的筛选方法,包括在蛋白和/或mRNA水平检测外周血免疫细胞上BEST1的方法,作为优选,包括单个核细胞分离、流式细胞检测、WesternBlot或qPCR中的一种或多种。
本发明还提供了引物、探针或其组合,以上述应用中的标志物为扩增的目的片段。
本发明还提供了检测产品,包括上述的引物、探针或其组合以及可接受的助剂。
在本发明的一些实施方案中,上述检测产品包括芯片、试剂盒中的一种或多种。
本发明还提供了检测和/或诊断肿瘤的方法,取待测样本检测上述应用中的上述分子标志物。
本发明提供了人外周血免疫细胞Bestrophin1蛋白作为标志物在制备检测和/或诊断肿瘤的试剂和/或试剂盒中的应用。
本发明提供的肿瘤标志物人外周血免疫细胞Bestrophin1蛋白(BEST1),是一类单核细胞表面表达的蛋白分子,其在包括头颈鳞癌、肺癌、结直肠癌及乳腺癌等患者的外周血单核细胞中的表达水平比正常人显著增高,肿瘤微环境对于单核细胞的作用具有特异性,因此诊断具有较高的灵敏度和特异度和广泛意义。同时各种肿瘤的外周血免疫细胞丰度均较高且易于分离标记,检测BEST1表达只需简单的流式细胞分析即可,可广泛应用于各种肿瘤类型,操作简便,可满足大规模检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示头颈鳞癌患者外周血单核细胞中BEST1阳性率;
其中:A(左)示将患者与健康人外周血单个核细胞(PBMC)经CD14和CD16抗体标记,通过流式细胞术检测,将细胞分群,其中黑色圆圈中显示的是CD14++CD16-型单核细胞;
A(右)示流式细胞术检测患者与健康人CD14++CD16-型单核细胞中BEST1的表达百分率(阳性率);
B示患者和健康人CD14++CD16-型单核细胞中BEST1的表达阳性率的统计分析;
图2示单核细胞BEST1阳性率可作为头颈鳞癌诊断指标;
其中:A示期望BEST1作为头颈鳞癌的诊断指标的ROC曲线;
B示BEST1诊断头颈鳞癌的灵敏度特异度曲线;
C示患者与健康人单核细胞BEST1阳性率的分布点状图;
D示患者与健康人单核细胞BEST1阳性率的分布曲线图;
E a)示BEST1诊断头颈鳞癌模型的性能度量(performance measure)表;
E b)示BEST1诊断头颈鳞癌的临界点(cut-off)结果;
图3示肺癌、结直肠癌、乳腺癌患者和健康人CD14++CD16-型单核细胞中BEST1的表达阳性率的统计分析。
具体实施方式
本发明公开了人外周血免疫细胞蛋白在检测、诊断肿瘤中的应用。
应该理解,表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合,除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义,除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”,包括其语法同义语的使用,通常应该被理解为开放性和非限制性的,例如不排除其他未叙述的要素或步骤,除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解,只要本发明仍可操作,步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外,两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用,仅仅打算更好地说明本发明,并且除非提出权利要求,否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外,用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值,此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而,任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此,除非另有明确的说明,应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处,“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。
本发明提供的流式细胞检测单核细胞中Bestrophin1+(BEST1+)细胞百分比、检测不同癌症阳性率中,所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1流式细胞检测单核细胞中Bestrophin1+(BEST1+)细胞百分比血液样本:测试者外周全血(EDTA抗凝管采血,检测实验用量1-2mL);
试剂:人全血单个核细胞分离液(Ficoll配置)、抗人CD14、APC抗体(克隆号61D3)、抗人CD16、PE抗体(克隆号B73.1)、抗人Bestrophin1(细胞外部分)抗体、山羊抗兔IgG二抗、FITC;
仪器:台式离心机、流式细胞分析仪;
1)EDTA抗凝管(紫盖)取人外周血1~2mL;
2)在15mL离心管中加入3mL人全血单个核细胞分离液,然后缓慢加入混匀的全血,分层;
3)25℃,水平转子900g,离心30min;
4)离心后出现明显分层,小心吸取中间白膜层单个核细胞(约1mL)至新的15mL离心管,加入10mL PBS洗涤细胞;
5)25℃,水平转子400g,离心10min;
6)弃上清,加入1mL PBS洗涤细胞,室温,水平转子400g,离心5min;
7)配制一抗:50μL PBS中同时加入0.2μL抗CD14、0.2μL抗CD116和0.2μL抗Bestrophin1(BEST1)抗体;
8)弃上清,加入50μL一抗重悬细胞,4℃孵育30min;
9)加入1mL PBS洗涤细胞,25℃,水平转子400g,离心5min,弃上清,重复2次;
10)配制二抗:50μL PBS中加入0.2μL山羊抗兔IgG二抗;
11)加入50μL二抗重悬细胞,4℃孵育30min;
12)加入1mL PBS洗涤细胞,25℃,水平转子400g,离心5min,弃上清,重复2次;
13)加入300μL PBS吹打重悬细胞至流式管;
14)应用流式细胞分析仪检测单核细胞中Bestrophin1+(BEST1+)细胞百分比。
实施例2流式细胞检测单核细胞中Bestrophin1+(BEST1+)细胞百分比
1)人外周抗凝血1~2mL,25℃,水平转子400g,离心5min,弃上清;
2)在细胞沉淀中加入8倍体积的红细胞裂解液,轻柔吹打混匀,裂解3~5min,裂解过程中轻柔摇动;
3)25℃,水平转子400g,离心5min,弃红色上清;
4)加入1mL PBS洗涤细胞,25℃,水平转子400g,离心5min,重复1~2次;
5)配制一抗:50μL PBS中同时加入0.2μL抗CD14、0.2μL抗CD116和0.2μL抗Bestrophin1(BEST1)抗体;
6)弃上清,加入50μL一抗重悬细胞,4℃孵育30min;
7)加入1mL PBS洗涤细胞,25℃,水平转子400g,离心5min,弃上清,重复2次;
8)配制二抗:50μL PBS中加入0.2μL山羊抗兔IgG二抗;
9)加入50μL二抗重悬细胞,4℃孵育30min;
10)加入1mL PBS洗涤细胞,25℃,水平转子400g,离心5min,弃上清,重复2次;
11)加入300μL PBS吹打重悬细胞至流式管;
12)应用流式细胞分析仪检测单核细胞中Bestrophin1+(BEST1+)细胞百分比。
实施例3检测外周血单核细胞中BEST1在头颈鳞癌中的阳性率
研究选取41例健康人(Normal)和36例头颈鳞癌患者(HNSC)外周血为样本,按照实施例1实验流程分离PBMC,检测BEST1+细胞百分比。
结果表明,通过对单核细胞表面标志物CD14和CD16的染色,可将外周血单核细胞细分为若干亚群,其中CD14++CD16-亚群细胞所占比例最高,被称为经典型单核细胞,如图1-A(CD16)所示。CD14++CD16-单核细胞中表达BEST1蛋白,且头颈鳞癌患者的BEST1+细胞百分比高于健康人对照,如图1-A(BEST1)所示。统计学分析如图1B和表1所示,头颈鳞癌患者和健康人中BEST1+阳性率具有显著性差异。
表1健康人与头颈鳞癌患者外周血经典型单核细胞中BEST1表达阳性细胞百分比(%)
*注:此数据为图1、图2原始数据
将41例健康人和36例头颈鳞癌患者的实验数据进一步分析,得到单核细胞BEST1阳性率作为诊断指标的ROC曲线,曲线下面积(AUC)为0.888,表示其具有良好的头颈鳞癌诊断价值,灵敏度(Sensitivity)为0.750,特异度(Specificity)为0.886,如图2-A、B、E(a)所示。通过分析健康人与患者单核细胞BEST1阳性率的分布,得到诊断区间(Cut-off point)在13.8%~15.7%,表示若受试者按照实施例1中实验流程检测到单核细胞BEST1阳性率高于此区间,即可提示头颈鳞癌诊断的可能性,如图2-C、D、E(b)所示。
实施例4检测外周血单核细胞中BEST1在肺癌、结直肠癌、乳腺癌中的阳性率
研究继续选取30例肺癌患者(LUSC肺鳞癌、LUAD肺腺癌)、34例结直肠癌患者(COAD结肠癌、READ直肠癌)和36例乳腺患者(BRCA)外周血为样本,按照实施例1实验流程检测BEST1+细胞百分比。
结果显示,这几类癌症患者的单核细胞BEST1+细胞百分比显著高于健康人对照,提示BEST1作为诊断标志物可以广泛应用于包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌等在内的各癌种中如图3和表2所示。
表2健康人与各高发癌种患者外周血经典型单核细胞中BEST1表达阳性细胞百分比(%)
*注:此数据为图3原始数据
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.单核细胞中Bestrophin1蛋白作为标志物在制备检测和/或诊断头部和颈部鳞状细胞癌的试剂和/或试剂盒中的应用。
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