CN109270267A

CN109270267A - 用于胰腺癌早期诊断的外泌体cd82蛋白及其检测试剂盒

Info

Publication number: CN109270267A
Application number: CN201811561204.7A
Authority: CN
Inventors: 甄林青; 吴唯维; 赵小玉; 何章勇; 许骋; 楼敬伟
Original assignee: SHANGHAI BIOTECAN MEDICAL DIAGNOSTICS Co Ltd; SHANGHAI ZHANGJIANG TRANSLATIONAL MEDICINE RESEARCH CENTER Co Ltd; Shanghai Biotecan Biology Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI BIOTECAN MEDICAL DIAGNOSTICS Co Ltd; SHANGHAI ZHANGJIANG TRANSLATIONAL MEDICINE RESEARCH CENTER Co Ltd; Shanghai Biotecan Biology Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN109270267B

Abstract

本发明涉及用于胰腺癌早期诊断的外泌体CD82蛋白及其检测试剂盒。具体地，本发明提供一种外泌体CD82蛋白或其检测试剂的用途，用于制备检测试剂或检测试剂盒，所述的检测试剂或检测试剂盒用于诊断胰腺癌和/或区分慢性胰腺炎与胰腺癌。本发明首次意外发现通过检测Exo‑CD82表达量用于胰腺癌的早期诊断检测，血液样品中Exo‑CD82含量在区分健康人与胰腺癌患者时具有较高的灵敏度和特异性，诊断结果更为精准有效，为胰腺癌的早期诊断及疗效监控检测提供了新方法。

Description

用于胰腺癌早期诊断的外泌体CD82蛋白及其检测试剂盒

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地涉及外泌体CD82蛋白用于胰腺癌的早期诊断。

背景技术

胰腺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，具有极高的致死率，其5年生存率仅为3%。近40年来，胰腺癌患者的存活率并没有提高。而我国胰腺癌发病率呈上升趋势，2015年发病人数约达9.01万人。由于胰腺癌缺乏特异性肿瘤标志物，仅依靠传统的影像学手段难以实现胰腺癌的早期诊断及大规模的人群筛查，直接导致 80%的胰腺癌患者在确诊时已发生转移，其中仅15%的患者能够进行手术治疗，且术后复发率极高。

因此，本领域需要开发一种适用于临床胰腺癌早期诊断及疗效监控检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于胰腺癌早期诊断的外泌体CD82蛋白及其检测试剂盒和检测方法。

本发明的第一方面，提供一种外泌体CD82蛋白或其检测试剂的用途，用于制备检测试剂或检测试剂盒，所述的检测试剂或检测试剂盒用于：

（1）诊断胰腺癌；和/或

（2）区分慢性胰腺炎与胰腺癌。

在另一优选例中，所述的诊断为体外诊断。

在另一优选例中，所述的区分为体外区分。

在另一优选例中，所述的区分包括辅助性区分、早期区分或预先区分。

在另一优选例中，所述的诊断包括辅助性诊断、早期诊断或预先诊断。

在另一优选例中，所述的检测为体外检测。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括检测外泌体CD82蛋白表达量的试剂。

在另一优选例中，所述的检测是为采用流式细胞术对外泌体CD82表达量进行的检测。

在另一优选例中，所述的检测试剂或检测试剂盒包括用于外周血外泌体CD82蛋白表达量检测的试剂。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括用于检测外周血外泌体CD82蛋白表达量的检测试剂。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒包括用于检测外周血外泌体CD82蛋白表达量的检测试剂盒。

在另一优选例中，所述的检测试剂或检测试剂盒的检测样本包括血液样品。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括用于检测外泌体CD82蛋白的试剂。

在另一优选例中，所述的血液样品包括全血、血浆和/或血清。

在另一优选例中，所述的检测试剂或检测试剂盒通过检测血液样品中的外泌体CD82蛋白表达量，用于诊断胰腺癌和/或区分慢性胰腺炎与胰腺癌。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒包括标签或使用说明书，所述的标签或使用说明书记载以下内容：当所测对象血液样品中外泌体CD82蛋白表达量高于39.5%时，则表明该对象患胰腺癌风险高于正常人群；或

当所测对象的血液样品中外泌体CD82蛋白表达量Ea明显高于或显著高于正常健康者血液样品中外泌体CD82蛋白表达量Eb，则表明该对象发生胰腺癌的几率大于正常人群，其中，所述的“明显高于”是指Ea/ Eb≥1.3倍，“显著高于”是指Ea/ Eb≥1.5倍。

在另一优选例中，所述的检测试剂或检测试剂盒包括外泌体CD82蛋白标准品。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括偶联剂、CD82特异性捕获剂和抗体染色剂。

在另一优选例中，所述的偶联剂为微球。

在另一优选例中，所述的微球为invitrogen微球。

在另一优选例中，所述的微球为-CHO修饰微球。

在另一优选例中，所述的CD82特异性捕获剂包括CD82抗体。

在另一优选例中，所述的抗体染色剂包括荧光抗体染色剂。

在另一优选例中，所述的抗体染色剂包括带有检测标记的二抗。

在另一优选例中，所述的抗体染色剂包括兔抗荧光二抗。

本发明第二方面，提供一种非诊断性检测外泌体CD82蛋白表达量的方法，所述的方法包括步骤：

（1）提供血液样品；

（2）对血液样品进行分离纯化，得到外泌体样本，加入偶联剂与外泌体样本偶联后，加入CD82特异性捕获剂和抗体染色剂，得到待测样本；

（3）对待测样本进行分析，从而获得待测样本中的外泌体CD82蛋白含量。

在另一优选例中，在所述的方法中，外泌体CD82蛋白为血液样品中的外泌体CD82蛋白。

在另一优选例中，步骤（1）中的血液样品为经预处理的血液样品。

在另一优选例中，所述的预处理的方法包括离心。

在另一优选例中，所述的步骤（2）中，所述偶联剂与所述外泌体蛋白进行偶联。

在另一优选例中，所述的步骤（2）中，分离纯化的方法包括采用密度梯度离心和超速离心对样品进行分离纯化。

在另一优选例中，所述密度梯度离心包括步骤：将血液样品加入到密度梯度介质中进行离心，所述的密度梯度介质通过以下方法制备：

将密度梯度介质-1加入到容器中，将密度梯度介质-2从容器底部加入，托起介质1；将将密度梯度介质-3从容器底部加入，托起介质2和1；将密度梯度介质-4从容器底部加入，托起介质3、2和1；

其中：

a）密度梯度介质-1包括3-7%蔗糖溶液；

b）密度梯度介质-2包括8-12%蔗糖溶液；

c）密度梯度介质-3包括16-24%蔗糖溶液；

d）密度梯度介质-4包括35-55%蔗糖溶液；

在另一优选例中，所述的步骤（2）中，分离纯化后外泌体回收率为10-1000μg/mL血浆。

在另一优选例中，所述的步骤（2）中，采用BCA蛋白浓度检测法对分离纯化后外泌体总蛋白的浓度或含进行测定。

在另一优选例中，所述的步骤（2）中，所述的偶联剂为微球。

在另一优选例中，所述的微球为invitrogen微球。

在另一优选例中，所述的微球为-CHO修饰微球。

另一优选例中，所述的步骤（2）中，所述的偶联的效率≥40%。

在另一优选例中，所述步骤（2）中，所述的CD82特异性捕获剂包括CD82抗体。

在另一优选例中，所述步骤（2）中，所述的抗体染色剂包括荧光抗体染色剂。

在另一优选例中，所述步骤（2）中，所述的抗体染色剂包括带有检测标记的二抗。

在另一优选例中，所述步骤（2）中，所述的抗体染色剂包括兔抗荧光二抗。

在另一优选例中，所述步骤（3）中，采用流式细胞术对待测样本进行含量分析。

本发明的第三方面，提供一种用于诊断胰腺癌和/或区分慢性胰腺炎与胰腺癌的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：

（i）用于对血液样品进行分离纯化获得外泌体样本的试剂；

（ii）用于对外泌体样本中外泌体CD82蛋白表达量进行检测的检测试剂；

（iii）标签或使用说明书，所述标签或使用说明书注明所述试剂盒用于诊断胰腺癌和/或区分慢性胰腺炎与胰腺癌。

在另一优选例中，在所述的（ii）中，所述的检测试剂是采用流式细胞术检测的试剂。

在另一优选例中，在所述的（ii）中，所述的检测试剂包括

（a）偶联剂；

（b）CD82特异性捕获剂；和/或

（c）抗体染色剂。

在另一优选例中，所述的标签或使用说明书还记载以下内容：当所测对象血液样品中外泌体CD82蛋白表达量高于39.5%时，则表明该对象患胰腺癌风险高于正常人群；或

在另一优选例中，血液样品中外泌体CD8蛋白表达量是在ROC分析测定中，根据“尤登指数”即敏感性-（1-特异性），该指数的值取最大值处就是最佳的界值。

在另一优选例中，用于对血液样品中进行分离纯化获得外泌体样本的试剂包括选自下组的一种或多种：

a）密度梯度介质-1包括3-7%蔗糖溶液；

b）密度梯度介质-2包括8-12%蔗糖溶液；

c）密度梯度介质-3包括16-24%蔗糖溶液；

d）密度梯度介质-4包括35-55%蔗糖溶液。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括BCA试剂盒。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括BCA标准浓度蛋白溶液、BCA工作液A液和BCA工作液B液。

在另一优选例中，所述BCA标准浓度蛋白溶液包括3-6个选自下组的蛋白浓度：0、0.05、 0.1、 0.25、 0.5、 1.0 mg/ml

在另一优选例中，所述的偶联剂为微球。

在另一优选例中，所述的微球为invitrogen微球。

在另一优选例中，所述的微球为-CHO修饰微球。

在另一优选例中，所述的CD82特异性捕获剂包括CD82抗体。

在另一优选例中，所述的抗体染色剂包括荧光抗体染色剂。

在另一优选例中，所述的抗体染色剂包括兔抗荧光二抗。

本发明的第四方面，提供一种诊断胰腺癌或区分慢性胰腺炎与胰腺癌的方法，所述方法包括步骤：

(i)提供血液样本；

(ii)检测外泌体CD82蛋白表达量，从而进行诊断和/或预后。

在另一优选例中，所述的步骤(ii)包括：外泌体CD82蛋白表达量与标准值或标准曲线比较，从而进行诊断和/或预后。

在另一优选例中，所述的样本为血液、血清或血浆样品。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，当所测对象血液样品中外泌体CD82蛋白表达量高于39.5%时，则表明该对象患胰腺癌风险高于正常人群。

在另一优选例中，当所测对象的血液样品中外泌体CD82蛋白表达量Ea明显高于或显著高于正常健康者血液样品中外泌体CD82蛋白表达量Eb，则表明该对象发生胰腺癌的几率大于正常人群，其中，所述的“明显高于”是指Ea/ Eb≥1.3倍，“显著高于”是指Ea/ Eb≥1.5倍。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为其中健康人、慢性胰腺炎患者和胰腺癌患者各1例的流式检测结果直方图。

图2为26例健康人、6例慢性胰腺炎和24例胰腺癌患的Exo-CD82表达量结果的散点图。

图3为健康人与胰腺癌患者血液样品中Exo-CD82 表达量测定的ROC曲线。

图4为慢性胰腺炎与胰腺癌患者血液样品中Exo-CD82表达量测定的ROC曲线。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过对胰腺癌患者、正常人、慢性胰腺炎患者血液样品中的Exo-CD82表达量进行测定，首次意外发现胰腺癌患者血液样品中的Exo-CD82表达量显著高于正常人和慢性胰腺癌患者。利用血液样品中Exo-CD82表达量与胰腺癌发生和发展程度的相关性，血液样品中Exo-CD82表达量可以作为诊断胰腺癌和/或区分慢性胰腺炎与胰腺癌的标志物，通过检测血液样品中Exo-CD82表达量，用于胰腺癌的早期诊断检测和/或区分慢性胰腺炎与胰腺癌。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

如本文所用，术语“外泌体CD82”和 “Exo-CD82”可互换使用，是指外泌体表达的CD82蛋白。

如本文所用，术语“外泌体CD82的表达量”和 “Exo-CD82+” 可互换使用。

如本文所用，术语“ROC曲线”为受试者工作特征曲线，是以假阳性概率（1-特异性）为横轴，真阳性概率（敏感度）为纵轴所组成的坐标图，和受试者在特定刺激条件下由于采用不同的判断标准得出的不同结果画出的曲线。选择最佳的诊断界限值。ROC曲线越靠近左上角,试验的准确性就越高。最靠近左上角的ROC曲线的点是错误最少的最好阈值，其假阳性和假阴性的总数最少。两种或两种以上不同诊断试验对疾病识别能力的比较。在对同一种疾病的两种或两种以上诊断方法进行比较时，可将各试验的ROC曲线绘制到同一坐标中，以直观地鉴别优劣，靠近左上角的ROC曲线所代表的受试者工作最准确。亦可通过分别计算各个试验的ROC曲线下的面积(AUC)进行比较，哪一种试验的 AUC最大，则哪一种试验的诊断价值最佳。

如本文所用，术语“Ea”指的是所测对象的血液样品中外泌体Exo-CD82表达量。

如本文所用，术语“Eb”指的是正常健康者血液样品中外泌体Exo-CD82表达量.

外泌体CD82蛋白或其检测试剂的用途

本发明提供一种外泌体CD82蛋白或其检测试剂的用途，用于制备检测试剂或检测试剂盒，所述的检测试剂或检测试剂盒用于：

（1）诊断胰腺癌；和/或

（2）区分慢性胰腺炎与胰腺癌。

在本发明应当理解的是，术语“外泌体CD82蛋白”、“表达CD82蛋白外泌体”与“含有CD82蛋白外泌体”可相互替换。

在本发明所述的外泌体CD82蛋白或其检测试剂的用途中，外泌体CD82蛋白检测试剂是指用来检测外泌体CD82蛋白表达量的检测试剂。外泌体CD82蛋白检测试剂并没有特别的限制，只要满足检测目的即可。

在另一优选例中，所述的检测试剂为采用流式细胞法对外泌体CD82表达量进行的检测采用的检测试剂，典型地所述的检测试剂包括偶联剂、CD82特异性捕获剂和抗体染色剂。在另一优选例中，所述的偶联剂为微球。在另一优选例中，所述的微球为invitrogen微球。在另一优选例中，所述的微球为-CHO修饰微球。在另一优选例中，所述的CD82特异性捕获剂包括CD82抗体。在另一优选例中，所述的抗体染色剂包括荧光抗体染色剂。在另一优选例中，所述的抗体染色剂包括带有检测标记的二抗。在另一优选例中，所述的抗体染色剂包括兔抗荧光二抗。

在一个优选例中，所述的检测包括外周血外泌体CD82蛋白表达量检测。优选地，所述的检测试剂包括外周血外泌体CD82蛋白表达量检测试剂。

在另一优选例中，所述的检测试剂或检测试剂盒的检测样本包括血液样品。代表性的，所述的血液样品包括全血、血浆和/或血清。典型地，所述的全血为外周血。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒包括外泌体CD82蛋白检测试剂和/或外泌体CD82蛋白标准品。所述的外泌体CD82蛋白标准品可以制备外泌体CD82蛋白的浓度标准曲线，参考标准浓度曲线测定测定样本（如血液样本）中的外泌体CD82蛋白表达量。

优选地，所述的检测试剂或检测试剂盒通过检测血液样品中的外泌体CD82蛋白表达量，用于诊断胰腺癌和/或区分慢性胰腺炎与胰腺癌。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒包括标签或使用说明书，所述的标签或使用说明书记载以下内容：当所测对象血液样品中外泌体CD82蛋白表达量高于39.5%时，则表明该对象患胰腺癌风险高于正常人群和/或慢性胰腺炎。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒包括外泌体CD82蛋白检测试剂和/或外泌体CD82蛋白标准品。

非诊断性检测外泌体CD82蛋白表达量的方法

本发明还提供一种非诊断性检测外泌体CD82表达量的方法，所述的方法包括步骤：

（1）提供血液样品；

在另一优选例中，所述的预处理的方法包括离心。

其中：

a）密度梯度介质-1包括3-7%蔗糖溶液；

b）密度梯度介质-2包括8-12%蔗糖溶液；

c）密度梯度介质-3包括16-24%蔗糖溶液；

d）密度梯度介质-4包括35-55%蔗糖溶液；

在另一优选例中，所述的步骤（2）中，分离纯化后外泌体回收率为10-1000μg/mL血浆。。

在另一优选例中，所述的微球为invitrogen微球。

在另一优选例中，所述的微球为-CHO修饰微球。

用于诊断胰腺癌和/或区分慢性胰腺炎与胰腺癌的检测试剂盒

本发明还提供一种用于诊断胰腺癌和/或区分慢性胰腺炎与胰腺癌的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：

（i）用于对血液样品进行分离纯化获得外泌体样本的试剂；

在另一优选例中，在所述的检测试剂盒中，所述的检测试剂是采用流式细胞术检测的试剂。典型地，所述的检测试剂包括：

（a）偶联剂；

（b）CD82特异性捕获剂；和/或

（c）抗体染色剂。

在另一优选例中，所述的标签或使用说明书还记载以下内容：当所测对象血液样品中外泌体CD82蛋白表达量高于39.5%时，则表明该对象患胰腺癌风险高于正常人群。

a）密度梯度介质-1包括3-7%蔗糖溶液；

b）密度梯度介质-2包括8-12%蔗糖溶液；

c）密度梯度介质-3包括16-24%蔗糖溶液；

d）密度梯度介质-4包括35-55%蔗糖溶液。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括BCA试剂盒。

另一优选例中，所述的偶联剂为微球。

在另一优选例中，所述的微球为invitrogen微球。

在另一优选例中，所述的微球为-CHO修饰微球。

在另一优选例中，所述的CD82特异性捕获剂包括CD82抗体。

在另一优选例中，所述的抗体染色剂包括荧光抗体染色剂。

在另一优选例中，所述的抗体染色剂包括兔抗荧光二抗。

诊断胰腺癌或区分慢性胰腺炎与胰腺癌的方法

本发明还提供一种诊断胰腺癌或区分慢性胰腺炎与胰腺癌的方法，所述方法包括步骤：

(i)提供血液样本；

(ii)检测外泌体CD82蛋白表达量，从而进行诊断和/或预后。

在另一优选例中，所述的步骤（ii）包括：外泌体CD82蛋白表达量与标准值或标准曲线比较，从而进行诊断和/或预后。

在另一优选例中，所述的样本为血液、血清或血浆样品。

在另一优选例中，当所测血液样品中外泌体CD82蛋白表达量高于39.5%时，则表明该对象患胰腺癌风险高于正常人群。

本发明的主要优点在于：

1、本发明首次意外发现通过检测血液样品中Exo-CD82含量用于胰腺癌的早期诊断检测，血液样品中Exo-CD82表达量在区分健康人与胰腺癌、胰腺炎患者时具有较高的灵敏度和特异性，诊断结果更为精准有效，为胰腺癌的早期诊断及疗效监控检测提供了新方法，为实现胰腺癌的早期诊断、早期治疗，提高诊疗效率，延长患者生存期及改善预后奠定基础。

2、外周血具有取材方便、无创伤性、可连续检测等优点，利用外周血检测胰腺癌诊断生物标志物可以及早发现胰腺癌的发生，将临床胰腺癌早期诊断提高到了一个新的水平。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

实施例1提供了一种检测胰腺癌患者、慢性胰腺炎和正常人外周血中外泌体CD82（ Exo-CD82）含量的方法，具体测定方法如下所述：

1、提供试剂或材料

1）密度梯度介质-1：5%蔗糖溶液。

2）密度梯度介质-2：10%蔗糖溶液。

3）密度梯度介质-3：20%蔗糖溶液。

4）密度梯度介质-4：40%蔗糖溶液。

5）PBS缓冲液。

6）BSA标准浓度蛋白溶液（0, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 mg/ml）。

7）BCA工作液A液（市场购买，成品试剂盒，组分标注为A液）。

8）BCA工作液B液（市场购买，成品试剂盒，组分标注为B液）。

9）偶联剂：invitrogen微球（invitrogen 4um –CHO修饰的微球）。

10）BSA（牛血清白蛋白）。

11）甘氨酸。

12）CD82抗体（CD82 Polyclonal Antibody ，Invitrogen，Cat#:PA5-13228。13）兔抗荧光二抗（Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed SecondaryAntibody, Alexa Fluor 488， Invitrogen，Cat#: A-21206）。

14）洗涤液。

、提供血液样品

血液样本（26例健康志愿者、6例慢性胰腺炎、24例胰腺癌患者）的收集：收集约3-6 ml病人的外周血放入真空促凝管中，颠倒数次以便充分结合，静置约半小时，1600g离心10min，上清转移到新管。上清二次进行12000g离心10min，取上清，加入新离心管中得到血清。收集2-8ml外周血放于专用的EDTA抗凝管（管盖为紫色）内，轻轻颠倒8次，防止凝块，得到无凝块、无溶血的全血，2h内3000g离心5分钟，上清血浆转移到新管。

、对血液样品进行分离纯化

采用密度梯度离心和超速离心对样品进行分离纯化，得到外泌体样本。

血浆差速离心：血浆样本于4°C条件下，10000g离心30min；用移液器将上层血浆转移到新离心管A中，另准备一个新的离心管B，将A管中血浆经0.22μm过滤器滤入B管。

密度梯度介质制备：超速离心管C标记样本编号，用长细钢针头替换1ml注射器自带针头，将1ml密度梯度介质1缓慢注入离心管底；将1ml密度梯度介质2从离心管低缓慢注入，托起介质1；将1ml密度梯度介质3从离心管低缓慢注入，托起介质2和1；将1ml密度梯度介质4从离心管底缓慢注入，托起介质3、2和1。

血浆样本加样：用5ml注射器将B管中的血浆缓慢加入超速离心管中C中，若样本量不足，用PBS补充剩余体积，将超速离心管体积充满。采用热塑封仪进行离心管封口。注：加样时避免流速过快使样本冲散密度梯度介质分层。

分离纯化：根据采用的超速离心机转子设定转子参数，采用150,000g在4°C条件下离心6-20h。离心结束后弃上清，用2ml PBS悬浮沉淀，将外泌体悬液用5mL注射器转移至新的超速离心管D中，2ml PBS洗涤超速离心管C，洗涤液一并转移入D管中，剩余体积用PBS充满，热塑封仪进行封口。150,000g在4°C条件下离心1-4h，离心结束后弃上清，得到沉淀的外泌体样本，根据外泌体样本沉淀量加入适量PBS悬浮（100-700μL），并转移到新的1.5ml离心管E中，得到外泌体样本溶液。

通过以下方法测定外泌体样本溶液中的外泌体总蛋白：

根据BCA kit 说明书配制蛋白浓度梯度标准液（0, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0mg/ml）。根据A液：B液=1ml：20μL的比例配置适量的染色液（现用现配，避光存放）。将20μL蛋白标准液加入到酶标板中（A1-A6），添加平行样（B1-B6），20μL外泌体样本溶液加入到酶标板中（A7），添加平行样（B7）。每孔加入200μL染色液。37°C恒温箱内避光孵育30min，使用酶标仪读取562nm下的吸光度。根据蛋白标准液计算标准曲线方程，将样本管OD值代入标准曲线方程计算出含30μg外泌体样本蛋白的外泌体溶液的体积。

、偶联剂与外泌体样本进行偶联

4.1 试剂配制：

反应终止液：含100mM Gly（甘氨酸）、2% BSA的PBS溶液：2ml

洗涤液：含2% BSA的PBS溶液：2ml

封闭液：含10%BSA的PBS溶液：0.8ml

4.2 操作步骤：

取2个1.5ml离心管标记为0、1（分别计为0号管和1号管）；invitrogen微球超声5s，涡旋混匀。0，1管各添加10μl微球，0号管加入90μlPBS，使得终体积为100μl；1号管加入含30μg外泌体样本蛋白的外泌体溶液，添加PBS至总体积为100μl。室温旋转混匀15min；用PBS将上述溶液稀释至400μl，涡旋混匀，室温旋转孵育30min；14,800g离心5min，取出上清保留做BCA检测(参考BCA检测试剂盒)；沉淀用1mL反应终止液悬浮，涡旋混匀，室温旋转孵育30min；用400μL洗涤液洗涤微球1次（14800g ，5min）；用400μL封闭液悬浮微球沉淀，混匀，室温旋转孵育30min； 14800g 离心5min,弃上清；用400μL洗涤液洗微球1次（14800g ，5min）；沉淀用100μL洗涤液悬浮后4℃保存或直接进行后续实验。

外泌体偶联量分析：

根据标准品的蛋白浓度及OD绘制标准曲线，列出标准曲线方程及R²值（y = 1.1637x+0.0936，R²=0.9985）；根据标准曲线方程计算微球上外泌体偶联量（见表1和表2）。

表1：微球上外泌体偶联量检测结果示例（来源于一个胰腺癌患者的样本）

表2：微球上外泌体偶联量检测结果示例（分别随机选自3个来源于健康人、胰腺癌和慢性胰腺炎的样本）

偶联后上清浓度=（样本OD -背景管OD）/1.1637（即偶联后上清浓度=（1号管OD -0号管OD）/1.1637）

偶联上量=原液添加量-偶联后上清浓度*400 （偶联时反应体系为400uL）

偶联效率=偶联上量/原液添加量。偶联效率≥40%，即偶联成功可进行后续实验；若偶联效率过低，建议重新进行偶联。

实验研究表明，所有的健康人、慢性胰腺炎患者和胰腺癌患者的偶联效率≥40%，可进行下一步实验操作。

、加入CD82特异性捕获剂和抗体染色剂

5.1 试剂配制：

洗涤液：（含2%BSA的PBS溶液）100mgBSA+5mLPBS

CD82一抗溶液：（1.0μl：20μl） 1μl CD82抗体原液+20μl 洗涤液；

按每管2μl损耗计算；

二抗溶液：（2.0μl：20μl）取anti-Rabbit antibody FITC 488nm（原液稀释至100μg/mL）30μl+300μl洗涤液，充分混匀，避光保存；

5.2 操作步骤：

取2个1.5ml离心管，标记为0， CD82；将偶联后的样本（每管约100μl），用洗涤液稀释至500μl，混匀；各管相应添加50μl偶联后微球，14800g离心 5min；0号管添加20μl 洗涤液；CD82管添加20uLCD82一抗溶液；瞬离15s，转速达14800g；然后充分涡旋混匀，37℃恒温箱中静置孵育30min，每10min混匀一次；14800g 离心5min弃上清；洗涤液洗1次；各管加入20μl二抗溶液，瞬离15s，转速达14800g；充分混匀，37℃恒温箱中静置避光孵育30min，每10min混匀1次；14800g 离心5min弃上清，洗涤液洗1次，PBS洗1次。用100μl PBS悬浮沉淀，涡旋混匀，流式细胞仪进行检测（参考BD流式细胞仪使用方法）。

流式检测结果分析：

流式检测选择R1门区内20000个颗粒数，观察FL1通道荧光强度；用流式分析软件分析得到样本管阳性率数值，在Excel中对处理后的流式结果进行整理分析。收集26例健康人、6例慢性胰腺炎和24例胰腺癌患者外周血，用上述方法检测血浆外泌体Exo-CD82表达量，Exo-CD82表达量的结果如下表3所示，其中一个健康人、慢性胰腺炎患者和胰腺癌患者的流式检测结果直方图如图1所示，其中第1条线表示不加CD82抗体的（对照组）外泌体蛋白荧光强度，作为背景荧光值，第2条线表示添加CD82抗体的（实验组）外泌体蛋白荧光强度， M1门区内表示扣除对照组外泌体后的CD82蛋白阳性外泌体，以实验组M1区间内外泌体微球个数占实验组总微球个数的百分比表示外泌体CD82蛋白的表达量。26例健康人、6例慢性胰腺炎和24例胰腺癌患的Exo-CD82表达量结果的散点图如图2所示。

表3 26例健康人、6例慢性胰腺炎和24例胰腺癌患者血浆外泌体Exo-CD82表达量（%）数据

对健康人、慢性胰腺炎、胰腺癌患者外泌体Exo-CD82表达量进行ROC曲线分析

本发明检测了26例健康人、6例慢性胰腺炎和24例胰腺癌患者血浆外泌体中Exo-CD82+表达量，ROC分析结果如表4所示：

表4：健康人与胰腺癌患者外泌体Exo-CD82诊断的ROC分析

通过表4、图3和图4的ROC曲线结果分析发现，Exo-CD82用于诊断胰腺癌效果显著AUC_CD82=0.852（图3），P<0.01，其灵敏度和特异性明显高于常规指标CA19-9（70%）。Exo-CD82用于区分慢性胰腺炎与胰腺癌效果显著AUC_CD82= 0.896，P<0.01（图4）。本发明首次发现Exo-CD82可作为胰腺癌早期诊断的生物标志物，Exo-CD82检测对胰腺癌早期诊断的预测作用。

ROC分析测定表明：根据“尤登指数”即敏感性-（1-特异性），该指数值取最大值处就是最佳的界值，可得到健康人与胰腺癌患者的最佳界值为39.5%，即所述样本中外泌体CD82蛋白表达量高于39.5%时，则表明该对象患胰腺癌风险高于正常人群。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种外泌体CD82蛋白或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备检测试剂或检测试剂盒，所述的检测试剂或检测试剂盒用于：

（1）诊断胰腺癌；和/或

（2）区分慢性胰腺炎与胰腺癌。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂或检测试剂盒包括用于外周血外泌体CD82蛋白表达量检测的试剂。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂或检测试剂盒的检测样本包括血液样品。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂或检测试剂盒通过检测血液样品中的外泌体CD82蛋白表达量，用于诊断胰腺癌和/或区分慢性胰腺炎与胰腺癌。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂或检测试剂盒包括外泌体CD82蛋白标准品。

6.一种非诊断性检测外泌体CD82蛋白表达量的方法，其特征在于，包括步骤：

（1）提供血液样品；

7.一种用于诊断胰腺癌和/或区分慢性胰腺炎与胰腺癌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：

（i）用于对血液样品进行分离纯化获得外泌体样本的试剂；

8.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，在所述的（ii）中，所述的检测试剂是采用流式细胞术检测的试剂。

9.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，当所测对象血液样品中外泌体CD82蛋白表达量高于39.5%时，则表明该对象患胰腺癌风险高于正常人群；或

当所测对象的血液样品中外泌体CD82蛋白表达量Ea明显高于正常健康者血液样品中外泌体CD82蛋白表达量Eb，则表明该对象发生胰腺癌的几率大于正常人群，其中，所述的明显高于是指Ea/ Eb≥1.3倍。

10.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，当所测对象的血液样品中外泌体CD82蛋白表达量Ea显著高于正常健康者血液样品中外泌体CD82蛋白表达量Eb，则表明该对象发生胰腺癌的几率大于正常人群，其中，所述的显著高于是指Ea/ Eb≥1.5倍。