KR101363575B1 - 신부전증에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신부전증에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 마커를 이용하면 신속·정확하게 신부전증의 진단 및 예후 분석을 할 수 있다.

Description

신부전증에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도{Novel Biomarker Indicative of Renal Failure and Their Use}
본 발명은 신부전증에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.
신장은 생체의 항상성(homeostasis)을 유지하는 중요한 장기로, 약 100만개의 네프론(nephron)이라는 기본구조로 이루어지며, 하나의 네프론은 사구체라고 불리는 미세한 모세혈관 덩어리와 세뇨관으로 구성된다. 사구체에서의 여과, 세뇨관에서의 재흡수와 분비 과정을 통해 노폐물과 불필요하게 많은 수분 및 무기염류를 오줌으로 만들어 내보냄으로써, 체내 체액량, 혈액 내의 이온 농도와 pH를 조절하고, 대사성 노폐물, 독소, 약물 등의 노폐물을 배설하며, 혈압 조절 및 기타 대사성, 내분비 기능을 수행한다.
이러한 신장이 배설, 조절, 대사 및 내분비적 기능을 정상적으로 수행하지 못하고 전체적으로 기능이 저하되거나, 이상이 초래된 상태를 신장질환이라고 한다. 넓은 의미의 신장질환은 만성적인 모든 신장병이 포함되고, 좁은 의미로는 원인이 뚜렷하지 않고 기질적 변화와 사구체 여과 기능이 저하되어 가는 질환들을 의미한다. 신장의 손상으로 인한 기능의 저하는 신장 및 관련 구조의 증대, 신장의 위축, 체액량의 변화, 전해질 불균형, 대사성 산증, 가스교환장애, 항감염 기능 손상, 요독성 독소의 축적 등을 초래한다.
신부전증은 신장이 정상적인 기능을 하지 못하는 질환으로 어느 나라에 국한된 것이 아니라 전세계에 걸쳐 발생되는 21세기의 조용한 질병으로 알려져 있다. 신부전증의 원인이 되는 당뇨병이나 고혈압 등의 질환이 증가하면서 신부전증의 발생률이 급격히 증가하고 있다. 신부전증 환자는 혈액투석, 복막투석 및 신장이식 등의 치료를 통하여 신장 기능을 회복시키지만, 이에 한계성이 있다.
급성 신부전증은 신장 기능이 수시간에서 수일에 거처 급격하게 저해되는 신장질환으로서, 신장 기능의 급격한 저하에 따라 소변의 생산량이 어른의 경우 400 ㎖/일, 어린이의 경우 0.5 ㎖/일 이하로 감소하는 징후를 보이며, 체내 수분함량, 체액의 변화, 및 체내 전해질의 교란 등이 일어난다. 급성 신부전증은 신장으로 보내지는 혈액 공급에 갑작스런 방해에 따라 일어나거나, 독성물질에 따른 신장의 과부하에 따라 발생된다. 또한, 심장우회 수술과 같은 시술을 할 경우 신장으로의 혈류량이 감소되어 급성 신부전증이 발생할 수 있고, 또한 항생제 같은 약물을 과량 복용하거나, 화학치료가 신장에 무리를 주어 급성 신부전증을 일으킬 수 있다.
만성 신부전증은 3개월 이상 신장이 손상되어 있거나, 신장 기능 감소가 지속적으로 나타나는 것을 말한다. 만성 신부전증은 신장의 손상 정도와 기능의 감소 정도에 따라 5단계로 나누어지며, 잘 관리하지 않으면 마지막 단계로까지 악화되어 결국은 투석이나 신장이식과 같은 신장대체 요법을 해야 한다.
종래에는 혈청 내 크레아티닌(creatinine) 단백질의 증가 및 혈액 내 요소 농도의 증가를 신장 기능 이상의 초기 증세로 간주하여, 신부전증의 진단을 위하여 이들의 양을 측정하였다. 다른 방법으로 소변검사(urinalysis)를 통하여 소변 내 단백질 양과 크레아티닌 단백질의 비율을 검사하여 측정하였다. 그러나, 이와 같은 방법은 시간이 오래 걸리며, 약물이 이용되는 문제점이 있다.
한편, 프리온 질환은 정상적인 프리온 단백질(cellular prion protein, PrPc)이 어떠한 이유에 의해 프리온 단백질 구조의 알파-나선(alpha-helix) 구조가 베타-시트(beta-pleated sheet) 구조로 변성되면서 전염성을 지닌 프리온 단백질 (scrapie prion protein, PrPsc)로 전환되어 야기된다. 전염성을 지닌 단백질은 혈액을 통해 전염 가능하며 PrPsc가 PrPc를 PrPsc로 전환되면서 전파된다. 이런 단백질들은 뇌에서 축적되며 전염성해면상뇌병증(transmissible spongiform encephalopathy, TSE)을 야기한다. TSE는 다양한 척추동물에서 일어나는데, 대표적으로 인간이 이 병에 걸릴 경우 인간광우병(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD), 소의 경우 소해면상뇌병증(bovine spongiform encephalopathy, BSE), 양의 경우 스크래피(scrapie)라 한다. PrPsc는 CJD의 바이오마커로서 올리고머(oligomer)를 형성하는 특성을 이용한 CJD 진단법이 개발되어 있다.
그러나, 현재까지 프리온 단백질과 알부민간의 복합체(prion-albumin complex) 형성과 신부전증과의 관련성에 대해서는 전혀 알려진 바 없다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 신부전증을 신속하고 정확하게 분자진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 바이오마커로서 혈장 내 프리온-알부민 복합체를 검출하는 것으로, 신부전증의 조기 진단 및 예후 판정이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 신부전증의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 신부전증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 신부전증 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 프리온 단백질과 알부민이 결합하여 형성한 단백질 복합체(프리온-알부민 복합체)의 존재여부 또는 양을 측정하기 위한 다음의 제제를 포함하는 신부전증의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다:
(ⅰ) 프리온에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 및 알부민에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머; 또는
(ⅱ) 프리온-알부민 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머.
본 발명자들은 신부전증을 신속하고 정확하게 분자진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 바이오마커로서 혈장 내 프리온-알부민 복합체를 검출하는 것으로, 신부전증의 조기 진단 및 예후 판정이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서 표현 "신부전증의 진단 또는 예후 분석용 키트"는 신부전증의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 "신부전증의 진단 또는 예후 분석용 키트"는 "신부전증의 진단 또는 예후 분석용 조성물"과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.
본 명세서에서 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 신부전증의 단계 결정 또는 치료에 대한 신장 기능의 회복 가능성 예측, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.
본 명세서에서 용어, "신부전증"은 일반적으로 신장에 이상이 생겨 독소가 배출되지 못하고 손발이 붓거나 피부색이 어두워지는 등의 증세가 나타나는 신장질환을 의미한다. 신장질환은 진행 상태에 따라 급성 신부전증과 만성 신부전증으로 분류된다. 본 발명에서 신부전증은 급성 및 만성 신부전증을 모두 포함한다.
상기 급성 신부전증은 신장 기능이 수시간에서 수일에 걸쳐 급격하게 저하되는 것을 특징으로 하는 임상 증후군이다. 신장 기능 저하의 결과로 신체 내에 질소 노폐물이 축적되어 혈액 내에 고질소혈증이 일어나고, 체액 및 전해질 균형에 이상이 생긴다. 급성 신부전증은 병원에 입원하는 환자의 약 5% 정도에서 나타나며, 중환자실에 입원하는 환자의 약 30% 에서 나타난다.
상기 만성 신부전증은 3개월 이상 신장이 손상되어 있거나, 신장 기능 감소가 지속적으로 나타나는 임상 증후군이다. 주된 발병 원인은 당뇨병성 신장질환, 고혈압 또는 사구체신염 등이다. 그 밖의 원인으로는 다낭성 신질환과 기타 요로 질환이 있다.
본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로부터 채취한 시료로부터 신부전증의 발병 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 신부전증, 바람직하게는 급성 신부전증을 진단할 수 있는 물질로, 정상인에 비하여 신부전증이 발병한 개체에서 감소 양상을 보이는 단백질 복합체(protein complex)와 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 신부전증 진단 마커는 프리온 단백질과 알부민 단백질이 결합하여 형성한 단백질 복합체(프리온-알부민 복합체)이다.
본 명세서에서 용어, "프리온 단백질과 알부민이 결합하여 형성한 단백질 복합체" 또는 "프리온-알부민 복합체"는 프리온 단백질과 알부민 단백질이 결합하여 혈액 내에 존재하는 단백질 복합체를 의미한다. 상기 두 단백질은 강한 결합력(소수성 상호작용, 수소결합, 반 데르 발스 결합 등)으로 결합하고 있어 서로 분리해내기 어려움이 있는 단백질 복합체이다. 알부민 단백질은 프리온 단백질의 N-말단에 결합하고 있는 것으로 추측되고 있다. 프리온 단백질은 다양한 단백질과 결합을 할 수 있는 것으로 보고되었는데, 그 예로 β-amyloid1-42, synapsin Ib, GASP, 14-3-3, Bcl-2, GFAP, DNA, RNA, Hsp60, Laminin, NCAM, β-dystroglycan 등이 보고되었다(Linden R, Martins VR, Prado MA, Cammarota M, Izquierdo I, Brentani RR.;88(2):673-728. Review). 본 발명에서는 프리온 단백질이 알부민 단백질과 결합한 단백질 복합체를 신부전증 마커로서 이용하는 것이다.
상기 프리온 단백질은 1982년 Stanley B. Prusiner 박사에 의해서 명명된 것으로 단백질 같은 전염성 물질(proteinaceous infectious particle)을 간추려 prion이란 단어를 합성하였다. 프리온 단백질은 전염성 단백질과 비 전염성 단백질로 구분되는데 PrPc는 비 전염성, PrPsc는 전염성 단백질을 나타낸다. PrPc는 모든 인간에 존재하고 아직 그 기능이 완전히 밝혀지진 않았지만, 각 개체에서 특정한 역할을 하고 있는 것으로 여겨진다. PrPc 단백질이 PrPsc에 노출되면 PrPsc로 전환된다. PrPsc의 단백질은 잘못 접힌 구조(mis-folded protein)로서, 바이러스와 비슷하게 전파되지만, 그 전파 물질이 핵산이 아닌 단백질에 있다. 전염성의 PrPsc는 뇌에서 축적되며 전염성해면상뇌병증(transmissible spongiform encephalopathy, TSE)을 야기하는데, 그 예로 인간의 경우에는 인간광우병 (Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)을 유발한다. 본 발명의 목적상 상기 프리온 단백질은 PrPc를 의미한다. 프리온 단백질의 아미노산 서열은 GenBank에 BAA00011 등으로 개시되어 있다.
상기 알부민은 인간의 혈청에서 가장 많은 비율을 차지하는 혈청 알부민 (serum albumin)을 의미한다. 알부민은 분자량이 약 65,000으로 구형 단백질이며 당이 붙어있지 않다. 포유동물의 혈액에서 알부민은 혈액 내 콜로이드성 분자의 삼투압(colloid osmotic pressure)을 조절하고, 혈액 내 스테로이드, 지방산, 부신호르몬 등을 운반하는 역할과 세포 외액의 부피를 안정화 하는 역할을 한다. 알부민의 아미노산 서열은 GenBank에 AAA98797 등으로 개시되어 있다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 급성 신부전증 환자로부터 채취한 생물학적 시료(혈장)를 이용하여 상기 프리온-알부민 복합체의 양을 측정한 결과, 정상 대조군과 비교할 때 매우 적은 양이 검출되었다(도 2 참조).
본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 프리온-알부민 복합체의 존재여부 또는 양의 측정은, (ⅰ) 프리온에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 및 알부민에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머; 또는 (ⅱ) 프리온-알부민 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.
본 발명에서 용어, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커 또는 상기 마커 의 구성 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 본 발명에서는 프리온에 특이적으로 결합하는 두 종 이상의 항체를 조합하여 사용할 수도 있다.
상기한 바와 같이 새로운 신부전증 마커가 규명되었으므로, 프리온 단백질, 알부민 단백질 또는 이들의 단백질 복합체(이들을 "마커 단백질 항원"이라 함)를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명에 따르면, 프리온-알부민 복합체는 인체 내에서 생성되며, 본 발명은 이러한 단백질 복합체를 검출하여 신부전증을 진단한다. 상기 단백질 복합체의 검출은 이에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대 프리온 단백질의 일부 서열 및 알부민 단백질의 일부 서열 모두를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 실시할 수 있다.
상기 다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology 6:511-519, 1976 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al. Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al. J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 신부전증을 진단하는데 이용될 수 있다.
이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 방법에 따라 실시하여 신부전증을 진단하는데 이용될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 캡처-엘라이자, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.
본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 시료(예컨대, 혈액, 혈장 또는 혈청)를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 프리온 단백질(또는 알부민)에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응 시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 알부민(또는 프리온 단백질)에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질, 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 프리온 단백질, 알부민 또는 이들의 단백질 복합체에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자, 바람직하게는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al. Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 신부전증을 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 약하게 나오는 경우에는 신부전증으로 진단된다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 바람직하게는 상기 면역분석용 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이고, 보다 바람직하게는 ELISA 키트이다.
본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질 항원에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 항체는 마커 단백질 항원에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트 됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 복합 마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질 항원에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화 시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 양을 확인하여, 신부전증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스 키트는 마커 단백질 항원에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다. 루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100 종류의 어낼라이트(analyte)를 동시에 측정할 수 있는 고용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg 단위), 빠른 시간 내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 엘라이자(ELISA)나 엘리스팟(ELISPOT)을 대체할 수 있는 분석방법이다.
본 발명의 키트는 상기한 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨를 포함하고, 바람직하게는 혈액 또는 혈장을 의미하며, 가장 바람직하게는 혈장을 의미한다.
본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명은 신부전증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 프리온 단백질과 알부민이 결합하여 형성한 단백질 복합체(프리온-알부민 복합체)의 존재여부 또는 양을 측정하는 단계를 통하여 신부전증 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 신부전증 마커를 검출하는 방법과 상기 신부전증 분석용 키트는 동일한 마커를 사용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 신부전증을 의사의 소견에 의한 판단이 아니라, 분자 진단 방법으로 판단한다. 본 발명의 마커는 급성 신부전증에서 저농도로 존재하는 생체 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "저농도"는 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 마커의 양이 정상 시료와 비교하여 적은 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커가 정상인과 비교하여 2-4배 정도 적은 양이 검출되는 경우, 본 발명에서의 "저농도"로 판정하고 급성 신부전증으로 판정한다. 이를 통하여, 신부전증의 발병 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 (a) 프리온 단백질에 대해 결합능이 있고 고상의 매트릭스에 고정화된 포획항체(capturing antibody)에 생물학적 시료를 접촉 시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 알부민에 대해 결합능이 있는 검출항체(detecting antibody)를 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
상기 항원-항체 복합체 형성의 검출은 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명에 따르면, 간편하면서도 신속하게 신부전증의 발병 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 나온 데이터를 근거로 하여 신부전증 관련 약물을 환자에게 처리할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 신부전증에 대한 신규한 분자 마커를 제공한다.
(ⅱ) 본 발명은 프리온-알부민 복합체가 신부전증 환자에서 적은 양으로 존재한다는 것에 기초한다.
(ⅲ) 본 발명의 마커를 이용하면 신속·정확하게 신부전증의 진단 및 예후 분석을 할 수 있다.
도 1은 급성 신부전증 환자 및 정상인의 혈액 내에 존재하는 총 프리온 단백질의 양을 보여주는 ELISA 실험 결과이다.
도 2는 급성 신부전증 환자 및 정상인의 혈액 내에 존재하는 프리온-알부민 단백질의 양을 보여주는 ELISA 실험 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
신부전증 환자로부터 혈액 채취
급성신부전증 환자(acute renal failure) 9명과 정상인 2명(normal)으로부터 혈액 10 ㎖를 항응고제(citrate)를 이용하여 채취하였다. 항응고제가 충분히 섞이도록 천천히 혼합하였다. 채취된 혈액은 850xg에서 30분간 원심분리 후 혈구와 섞이지 않게 혈장을 분리하였다.
혈액 내 총 프리온 단백질의 양 측정
신부전증 환자로부터 채취한 혈액 내에 존재하는 프리온 단백질의 양을 측정하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 고속 대량 스크리닝(High-Throughput Screening)을 실시하였다. 항-프리온 항체 SAF-32(Cayman Chemical, A03202) 항체의 농도가 2 μg/㎖가 되도록 맞춘 후, 플레이트(Nunc Modules for Fluorescence, 475515)에 100 ㎕씩 넣은 다음 모이스쳐 챔버(moisture chamber)에 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 후, PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.4, Sigma, P3813)로 3번 세척하였다. Blockace(설인유업주식회사, Japan, UK-B80)를 10 mg/㎖로 물과 희석한 후, 300 ㎕씩 각 웰에 넣어 모이스쳐 챔버 내 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 4시간 후, PBS로 3번 세척하였다. 혈장을 TBST(Tris buffered saline, with tween 20, pH 8.0, Sigma, P9039)와 섞어 30%로 만들어 주었다. 30% 혈장을 상기의 프리온 항체로 코팅된 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST로 각 웰을 3번 세척하였다. TBST에 HRP가 부착된 프리온 단백질 항체(HRP conjugated mouse monoclonal anti-prion protein, T2, from Dr. T. Yokoyama) 및 Blockace를 각각 0.01 μg/㎖ 및 0.8 mg/㎖로 마지막 농도가 되도록 희석한 다음 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST로 각 웰을 3번 세척하였다. ECL 용액(Thermo Scientific, 37070)을 100 ㎕씩 각 웰에 넣어주고, Victor 플레이트 리더(VICTOR3, PerkinElmer)로 신호 강도를 측정하였다.
혈액 내 프리온-알부민 복합체의 양 측정
신부전증 환자로부터 채취한 혈액 내에 존재하는 프리온-알부민 복합체의 양을 측정하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 고속 대량 스크리닝(High-Throughput Screening)을 실시하였다. 항-프리온 항체 MA1(Thermo Scientific, MA1-750) 항체의 농도가 2 μg/㎖가 되도록 맞춘 후, 플레이트(Nunc Modules for Fluorescence, 475515)에 100 ㎕씩 넣은 다음 모이스쳐 챔버에 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 후, PBS(pH 7.4, Sigma, P3813)로 3번 세척하였다. Blockace(설인유업주식회사, Japan, UK-B80)를 10 mg/㎖로 물과 희석한 후, 300 ㎕씩 각 웰에 넣어 모이스쳐 챔버 내 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 4시간 후, PBS로 3번 세척하였다. 혈장을 TBST(pH 8.0, Sigma, P9039)와 섞어 30%로 만들어 주었다. 30% 혈장을 상기의 프리온 항체로 코팅된 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST로 각 웰을 3번 세척하였다. TBST에 HRP가 부착된 알부민 단백질 항체(HRP conjugated goat polyclonal anti-human serum albumin, Abcam, Ab19183) 및 Blockace를 각각 0.1 μg/㎖ 및 0.8 mg/㎖로 마지막 농도가 되도록 희석한 다음 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST로 각 웰을 3번 세척하였다. ECL 용액(Thermo Scientific, 37070)을 100 ㎕씩 각 웰에 넣어주고, Victor 플레이트 리더로 신호 강도를 측정하였다.
통계 분석
실험에서 얻어진 수치는 Minitab 프로그램을 사용하여 통계치를 얻어내었다. 정량치 항목(data type: quantitative value)은 Student's t-test를 사용하여 유의성(p < 0.05, p < 0.01)을 확인하였다.
실험결과
신부전증 환자와 정상인의 총 프리온 단백질의 혈액 내 양 비교
급성 신부전증 환자의 혈액을 이용하여 혈장 내에 존재하는 총 프리온 단백질(total prion protein)의 양을 ELISA법으로 측정하였다. 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 급성 신부전증 환자의 혈액은 정상인에 비하여 많은 양의 프리온 단백질을 함유하고 있었다.
신부전증 환자와 정상인의 프리온-알부민 복합체의 혈액 내 양 비교
급성 신부전증 환자의 혈액을 이용하여 혈장 내에 존재하는 프리온-알부민 복합체의 양을 ELISA법으로 측정하였다. 프리온 단백질에 대한 항체로 코팅된 96 멀티-웰 플레이트에 정상인 및 급성 신부전증 환자의 혈장을 투입한 후, HRP가 부착된 알부민 단백질에 대한 2차 항체를 처리하여 농도를 측정하였다. 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 급성 신부전증 환자의 혈액은 정상인에 비해 많은 양의 프리온 단백질을 함유하고 있으나, 프리온-알부민 복합체는 정상인에 비해 훨씬 적은 양을 함유하고 있었다. 이러한 결과는, 혈액 내에 존재하는 프리온-알부민 복합체의 양을 측정하여 신부전증을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 의미한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 생물학적 시료 내에 존재하는 프리온 단백질과 알부민이 결합하여 형성한 단백질 복합체(프리온-알부민 복합체)의 존재여부 또는 양을 측정하기 위한 다음의 제제를 포함하는 신부전증의 진단 또는 예후 분석용 면역분석(immunoassay) 키트:
    (ⅰ) 프리온에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 및 알부민에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머; 또는
    (ⅱ) 프리온-알부민 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 면역분석(immunoassay)용 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트인 것을 특징으로 하는 신부전증의 진단 또는 예후 분석용 키트.
  4. 신부전증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 프리온 단백질과 알부민이 결합하여 형성한 단백질 복합체(프리온-알부민 복합체)의 존재여부 또는 양을 항원-항체 반응 방식으로 측정하는 단계를 통하여 신부전증 마커를 검출하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 방법은 (a) 프리온 단백질에 대해 결합능이 있고 고상의 매트릭스에 고정화된 포획항체(capturing antibody)에 생물학적 시료를 접촉 시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 알부민에 대해 결합능이 있는 검출항체(detecting antibody)를 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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