CN106841615A - 用于前列腺癌进展及预后诊断检测socs6的检测试剂及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于前列腺癌进展及预后诊断检测SOCS6的检测试剂及其试剂盒，其试剂组成如下：内源性过氧化物酶阻断剂50ul、动物非免疫血清（羊）50ul、一抗为鼠源抗SOCS6多克隆抗体1ul、磷酸缓冲盐溶液（PBS缓冲液）50ul，二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG 50ul、链霉菌抗生物素蛋白‑过氧化物酶50ul、DAB显色试剂100ul。本发明能检测SOCS6在前列腺癌的表达状态。

Description

用于前列腺癌进展及预后诊断检测SOCS6的检测试剂及其试 剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体来说涉及的是一种用于前列腺癌进展及预后诊断检测SOCS6的检测试剂，同时还涉及该用于前列腺癌进展及预后诊断SOCS6的检测试剂盒。

背景技术

前列腺癌是老年男性最常见的泌尿系恶性肿瘤，近年来中国的前列腺癌发病率呈显著上升的趋势。前列腺癌的发生是一个复杂的过程，受人体内在因素、行为因素、分子与环境等诸多因素的影响，最终形成前列腺癌。根治性前列腺切除术是目前治疗局限性前列腺癌最有效的方法之一，但根治术后10年内生化复发率可达17—53%，而生化复发是肿瘤继续进展并发生临床复发或转移的前兆，是提示前列腺癌复发的早期重要依据之一。

前列腺癌根治术后生化复发确诊时包括PSA水平、术前Gleason评分、术后病理分期、盆腔淋巴结转移是影响其复发的独立危险因素。当前的临床工作中主要以前列腺特异抗原（PSA）作为前列腺癌根治术后生化复发的主要检测指标。然而，作为前列腺癌的诊断指标，尽管PSA的敏感性较强，但其特异性不足，研究显示前列腺增生、前列腺炎、急性尿潴留等多种疾病均可引起血浆中PSA增多。因此，开发敏感性高、特异性强、结果稳定的肿瘤标记物是前列腺癌的诊断工作的重点研究方向。

干细胞因子受体（KIT）是将胞外信号传递到胞内的重要枢纽，它通过信号转导促进细胞的增殖、分化，许多细胞的癌变正是因为KIT的过度表达从而激活了原癌基因的表达，导致了细胞的无限增殖。

SOCS6是细胞因子信号转导抑制因子（SOCS）家族蛋白成员之一，与其他SOCS家族成员不同，SOCS6主要涉及受体酪氨酸激酶信号的负调节并涉及细胞增殖、转化和凋亡的调节，在生物体内还能抑制KIT介导的信号通路。SOCS-6通过与干细胞因子受体(KIT)相互作用，SOCS6-蛋白上的SH2结构域直接结合人干细胞因子受体的第567个酪氨酸上，负反馈调节KIT受体介导的信号通路，从而抑制KlT的活化，进而抑制原癌基因的表达。关于SOCS6的研究显示，其蛋白表达水平是细胞正常生长的重要因素，这些研究表明，SOCS6在许多案例中是一个生存信号的负性调节器。

研究显示SOCS6 的含量在多种肿瘤组织中出现明显下降，尤其是 SOCS6表达水平跟前列腺癌患者的预后存在密切的联系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能检测SOCS6在前列腺癌的表达状态的用于前列腺癌进展及预后诊断检测SOCS6的检测试剂。

本发明的另一目的在于提供该用于前列腺癌进展及预后诊断检测SOCS6的检测试剂盒。

本发明的一种用于前列腺癌进展及预后诊断检测SOCS6的检测试剂，其试剂组成如下：

内源性过氧化物酶阻断剂50ul、动物非免疫血清（羊）50ul 、一抗为鼠源抗SOCS6多克隆抗体1ul、磷酸缓冲盐溶液（PBS缓冲液）50ul，二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG 50ul、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶50ul、 DAB显色试剂 100ul 。

本发明的一种用于前列腺癌进展及预后诊断检测SOCS6的检测试剂盒，包含检测SOCS6表达状态的检测试剂组成如下：

内源性过氧化物酶阻断剂50ul 、动物非免疫血清（羊）50ul（、一抗为鼠源抗SOCS6多克隆抗体 1ul、二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG50ul 、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶50ul、 DAB显色试剂 100ul 。

本试剂盒使用方法如下：

（1）组织切片后，放在62度左右的烘箱中烤大约2h

（2）组织脱蜡：TO型生物制片透明剂Ⅰ（二甲苯）15min

TO型生物制片透明剂Ⅱ（二甲苯）15min

梯度酒精各2min：100%乙醇，100%乙醇，95%酒精，

95%酒精，90%酒精，80%酒精，70%酒精

（3）用蒸馏水冲洗一下，枸橼酸盐抗原修复液修复，高火3min，高火3min，中火3min，中火3min，冷却至室温；

（4）用阻水笔把组织圈住，PBS泡15min

（5）每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育15分钟。

（6）用磷酸缓冲盐溶液（PBS）（PH7.4）冲洗3次，每次3min ；

（7）甩去PBS液，每张切片加50ul动物非免疫血清（羊），温室下孵育20-30min；

（8）甩去血清，每张切片加50ul稀释好（第一抗体：PBS缓冲液=1:50）的第一抗体，室温下孵育1h或4℃、16h,；

（9）PBS冲洗3次，每次,10min，先冲后摇；

（10）甩去PBS液，每张切片滴加50ul第二抗体，室温下孵育30min；

（11）PBS冲洗3次，每次3min ；

（12）甩去PBS液，每张切片滴加50ul链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温下孵育15min,；

（13）PBS冲洗3次，每次3min；

（14）甩去PBS液，每张切片滴,2滴或100ul新鲜配制的二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）显色液，显微镜下观察3-10min；

（15）自来水冲洗，苏木素复染4min，0.1%HCL分化蘸一下约5秒，自来水冲洗10min反蓝；

（16）组织脱水：70%酒精，80%酒精，90%酒精，100%乙醇，100%乙醇各2min，干燥

（17）放在二甲苯（TO）中泡5min，中性树胶封片；

（18）免疫组织化学检测结果判断结果判定标准：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞的基底膜出现棕黄或棕褐色为阳性；根据细胞的阳性基底膜在总细胞中所占数量比例判定实验结果，按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分. 两者积分的乘积作为染色结果的评判标准：0定为-，阴性；1～4分为+，弱阳性；5～8分为++，阳性；9～12分为+++，强阳性。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明采用SOCS6作为检测前列腺癌进展的生物标记物，能检测SOCS6在前列腺癌的表达状态，为前列腺癌的进展及恶性程度和前列腺癌患者术后复发转移及预后的预测提供了一种切实可行的方法。免疫组织化学检测结果判断结果判定标准：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞的基底膜出现棕黄或棕褐色为阳性；根据细胞的阳性基底膜在总细胞中所占数量比例判定实验结果，按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分. 两者积分的乘积作为染色结果的评判标准：0定为-，阴性；1～4分为+，弱阳性；5～8分为++，阳性；9～12分为+++，强阳性。

具体实施方式

以下通过前列腺癌Lncap和PC3细胞株所致老鼠肿瘤组织下相关抗体的检测来进一步证实本发明的有益效果。

用于前列腺癌进展及预后诊断检测SOCS6的检测试剂盒，检测步骤如下：

1，组织切片后，放在62度左右的烘箱中烤大约2h

2，组织脱蜡：TO型生物制片透明剂Ⅰ（二甲苯）15min

TO型生物制片透明剂Ⅱ（二甲苯）15min

梯度酒精各2min：100%乙醇，100%乙醇，95%酒精，

95%酒精，90%酒精，80%酒精，70%酒精

3，用蒸馏水冲洗一下，枸橼酸盐抗原修复液修复，高火3min，高火3min，中火3min，中火3min，冷却至室温

4，用阻水笔把组织圈住，PBS泡15min

5，每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育15分钟。

6，PBS冲洗3×3min

7，甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul的非免疫性动物血清，室温下孵育20-30分钟。

8，甩去血清，每张切片加1滴或50ul的第一抗体,4℃放置16h

9，PBS冲洗3×10min。先冲后摇

10，甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul生物素标记的第二抗体，室温下孵育30分钟。

11，PBS冲洗3×3min

12，甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育15分钟。

13，PBS冲洗3×3min。

14，甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB，显微镜下观察3-10分钟，阳性显色为棕色。15，自来水冲洗，苏木素复染4min，0.1%HCL分化蘸一下约5秒，自来水冲洗10min返蓝

16，组织脱水：70%酒精，80%酒精，90%酒精，100%乙醇，100%乙醇各2min，干燥

17，放在TO中泡5min，中性树脂封片

结果显示，在LNCaP肿瘤细胞中Ki67抗体下，SOCS6的表达为实验组+++，对照组++；PECAM-1抗体下，实验组+、对照组+++；Caspase-3抗体下，实验组++，对照组—；MMP-9抗体下，实验组+，对照组++；在PC3肿瘤细胞中，P-akt1/2/3抗体下，实验组SOCS6表达为++，对照组++；PCNA抗体下，实验组—，对照组+；E-cadherin抗体下，实验组++，对照组+；Caspase-3抗体下，实验组++，对照组+；这一结果表明该检测试剂可以检测SOCS6在LNCaP肿瘤细胞和PC3肿瘤细胞不同抗体下的表达，可以检测出前列腺癌的不同进展与恶性程度下SOCS6的表达。

上述临床验证的结果进一步表明：该试剂盒可以显示作为判断前列腺癌进展及预后的分子标记物SOCS6的表达水平。运用本发明提供的试剂盒，检测人体前列腺组织SOCS6的表达水平，根据SOCS6表达水平可以方便快捷地为前列腺癌诊断提供帮助，并对肿瘤的恶性程度判断提供帮助。

Claims (3)

1.一种用于前列腺癌进展及预后诊断检测SOCS6的检测试剂，其试剂组成如下：内源性过氧化物酶阻断剂50ul、动物非免疫血清（羊）50ul 、一抗为鼠源抗SOCS6多克隆抗体1ul、磷酸缓冲盐溶液（PBS缓冲液）50ul，二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG 50ul、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶50ul、 DAB显色试剂 100ul 。

2.一种用于前列腺癌进展及预后诊断检测SOCS6的检测试剂盒，包含检测SOCS6表达状态的检测试剂组成如下：内源性过氧化物酶阻断剂50ul 、动物非免疫血清（羊）50ul（、一抗为鼠源抗SOCS6多克隆抗体 1ul、二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG50ul 、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶50ul、 DAB显色试剂 100ul 。

3.如权利要求2所述的用于前列腺癌进展及预后诊断检测SOCS6的检测试剂盒，使用方法如下：

（1）组织切片后，放在62度左右的烘箱中烤大约2h

（2）组织脱蜡：TO型生物制片透明剂Ⅰ（二甲苯）15min

TO型生物制片透明剂Ⅱ（二甲苯）15min

梯度酒精各2min：100%乙醇，100%乙醇，95%酒精，

95%酒精，90%酒精，80%酒精，70%酒精

（3）用蒸馏水冲洗一下，枸橼酸盐抗原修复液修复，高火3min，高火3min，中火3min，中火3min，冷却至室温；

（4）用阻水笔把组织圈住，PBS泡15min

（5）每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育15分钟；

（6）用磷酸缓冲盐溶液（PBS）（PH7.4）冲洗3次，每次3min ；

（7）甩去PBS液，每张切片加50ul动物非免疫血清（羊），温室下孵育20-30min；

（8）甩去血清，每张切片加50ul稀释好（第一抗体：PBS缓冲液=1:50）的第一抗体，室温下孵育1h或4℃、16h,；

（9）PBS冲洗3次，每次,10min，先冲后摇；

（10）甩去PBS液，每张切片滴加50ul第二抗体，室温下孵育30min；

（11）PBS冲洗3次，每次3min ；

（12）甩去PBS液，每张切片滴加50ul链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温下孵育15min,；

（13）PBS冲洗3次，每次3min；

（14）甩去PBS液，每张切片滴,2滴或100ul新鲜配制的二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）显色液，显微镜下观察3-10min；

（15）自来水冲洗，苏木素复染4min，0.1%HCL分化蘸一下约5秒，自来水冲洗10min反蓝；

（16）组织脱水：70%酒精，80%酒精，90%酒精，100%乙醇，100%乙醇各2min，干燥

（17）放在二甲苯（TO）中泡5min，中性树胶封片；

（18）免疫组织化学检测结果判断结果判定标准：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞的基底膜出现棕黄或棕褐色为阳性；根据细胞的阳性基底膜在总细胞中所占数量比例判定实验结果，按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分. 两者积分的乘积作为染色结果的评判标准：0定为-，阴性；1～4分为+，弱阳性；5～8分为++，阳性；9～12分为+++，强阳性。