CN110780074A - 用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒及其应用 - Google Patents

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何慧婵
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Abstract

本发明公开了一种用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒及其使用方法和应用，试剂盒包括枸橼酸盐、非免疫动物血清封闭液、兔源性抗TRIB1单克隆抗体、第二抗体和二氨基联苯胺显色剂，其中，第二抗体靶向结合兔源性抗TRIB1单克隆抗体采用本发明提供的试剂盒，能够准确地检测出人体前列腺组织TRIB1的表达位置及水平，根据TRIB1的表达位置能判断前列腺癌的侵犯情况，根据TRIB1的表达量能有效的判断肿瘤免疫抑制状态，进而预测前列腺癌是否会生化复发以及发展进程。

Description

用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及前列腺癌病理辅助诊断技术领域，尤其是一种用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒及其应用。
背景技术
中国前列腺癌的发病率近十年来增速明显，这与人口老龄化密切相关。根据美国癌症协会的报告，前列腺癌目前是欧美老年男性的“头号杀手”。不同国家的前列腺癌的发病率存在较大差异。美国的前列腺癌发病率已经超越肺癌，成为发病率最高的男性恶性肿瘤。但近年来呈明显的上升趋势。
人类TRIB1蛋白，也被称为C8FW、GIG2、TRB1和SKIP1，编码基因位于染色体8q24.13。TRIB1在多种组织中都有表达，包括骨骼肌、胰腺、甲状腺、骨髓、外周血单核细胞和脂肪组织。TRIB1能够调控细胞内的NFKB信号通路，从而影响细胞外分泌的细胞因子，如IL8，CXCL1，CXCL2等，这些细胞因子能调节肿瘤微环境中的巨噬细胞，促进单核/巨噬细胞向II型巨噬细胞转化。从而出现肿瘤免疫抑制，诱导肿瘤细胞免疫逃逸。
在人的前列腺组织中，TRIB1能稳定的表达在基底细胞的细胞核膜上，对于病理判断前列腺腺体基底细胞膜是否完整提供可靠的依据，同时，TRIB1能稳定的显示基底细胞来源的肿瘤干细胞，良好的显示肿瘤侵袭范围。不仅如此，在临床数据分析发现，TRIB1蛋白高密度表达能有效预测前列腺癌的生化复发。
当前对前列腺癌的治疗以抗雄激素及手术切除治疗为主，以及术前前列腺穿刺得到前列腺组织样本，依据格利森(Gleason)评分来进行前列腺癌病理分级。病理诊断前列腺癌中，前列腺癌的基底细胞状态非常重要。在基底细胞向肿瘤干细胞转化过程中，目前临床诊断用的基底细胞分子如P53等都会消失，不利于观察基底细胞来源的肿瘤干细胞生长情况，因此难以准确地预测前列腺癌是否会生化复发以及发展进程。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒，以其检测结果为基础，能够准确地预测前列腺癌是否会生化复发以及发展进程。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
在第一个方面，用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒，包括枸橼酸盐、非免疫动物血清封闭液、兔源性抗TRIB1单克隆抗体、第二抗体和二氨基联苯胺显色剂，其中，第二抗体靶向结合兔源性抗TRIB1单克隆抗体。
优选地，所述试剂盒中各组分的用量分别为：
Figure RE-GDA0002340643920000021
所述枸橼酸盐为粉剂，所述兔源性抗TRIB1单克隆抗体的稀释倍数为1:100。需要说明的是，上述用量为100人次的检测用量，根据需要还可以调整为10次、30次、50次、80次、120次、200次等或者更多次用量。
在第二个方面，本发明提供了上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
1)准备超纯水，将枸橼酸盐充分溶解，配置成10mmol/L的枸橼酸盐溶液；
2)另外准备超纯水，加入30％(W/W)H2O2；准备1×TBST溶液1L；
3)将待测病理切片用二甲苯清洗；
4)将切片用100％酒精清洗；
5)将切片用95％酒精清洗；
6)将切片用超纯水清洗；
7)将切片放置枸橼酸盐溶液内微波炉煮沸5～10分钟，始终保持切片在枸橼酸盐溶液内；
8)将切片用超纯水清洗；
9)将切片浸泡在3％(W/W)的H2O2内；
10)将切片用超纯水清洗；
11)将切片用TBST清洗；
12)每张切片加100ul的非免疫动物血清，室温下孵育；
13)移去非免疫动物血清，每张切片加100ul的稀释后的第一抗体，4℃孵育过夜；
14)将切片移到室温，复温10分钟；用TBST清洗；
15)每张切片加50ul免疫组化加强检测试剂，室温孵育；
16)用TBST清洗切片；
17)加30ul的DAB浓缩液至1ml DAB稀释液，混匀；
18)每张切片加200ul的DAB混合液，染色，染色时间由肉眼或显微镜下观察，染色明显即可终止；
19)用超纯水清洗切片；
20)将切片在95％的酒精中浸泡；
21)将切片在100％的酒精中浸泡；
22)用中性树胶将组织用盖玻片封片，待中性树胶干燥后科在纤维镜下观察；
23)免疫组织化学检测结果判断结果判定标准：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，基底细胞细胞核膜出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，观察基底细胞是否连续用于判断前列腺腺体是否完整，肿瘤是否侵犯到间质；
根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果；按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3 分；
然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分，两者积分的乘积作为染色结果的评判标准：0定为-，阴性；1～4分为+，弱阳性；5～8分为++，阳性；9～12分为+++，强阳性。
在第三个方面，本发明提供了上述试剂盒在制备前列腺癌病理辅助诊断剂中的应用。
在第四个方面，本发明提供了上述的试剂盒在制备预测前列腺癌生化复发的试剂中的应用。
综上所述，本发明的有益效果为：
采用本发明提供的试剂盒，能够准确地检测出人体前列腺组织TRIB1的表达位置及水平，根据TRIB1的表达位置能判断前列腺癌的侵犯情况，根据TRIB1 的表达量能有效的判断肿瘤免疫抑制状态，进而预测前列腺癌是否会生化复发以及发展进程。
附图说明
图1为498例患者的随访结果中，TRIB1与生化复发的曲线图；
图2为在TCGA数据库中，TRIB1与细胞因子(CXCL1\CXCL2\ CXCL3\CXCL6\IL8)的相关性统计结果图；
图3为TRIB1在前列腺癌和正常前列腺组织中的染色图；
图4为TRIB1与免疫抑制细胞CD136+巨噬细胞表达关系统计图；
图5为过表达TRIB1对PC3增殖力的影响的检测结果图；
图6为过表达TRIB1对PC3侵袭性影响的检测结果图；
图7为过表达TRIB1对PC3细胞凋亡影响的检测结果图；
图8为过表达TRIB1对PC3细胞周期影响的检测结果图；
图9为过表达TRIB1对PC3迁移能力影响的检测结果图；
图10为过表达TRIB1诱导PC3肿瘤组织生长的动物成瘤及肿瘤重量统计图；
图11为PR807c芯片染色整体照片。
具体实施方式
本发明提供了一种能检测前列腺基底膜完整性的试剂盒，可用于前列腺癌病理辅助诊断，该试剂盒的检测结果可用于预测前列腺癌生化复发。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的试剂均可从市场或其它公开渠道获得。如无特别说明，本发明中的试剂浓度均为质量浓度。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。
实施例1
本发明中用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒的一种实施例，其试剂组成如下(100人份)：
枸橼酸盐(粉剂)、10mmol；非免疫动物血清封闭液、2ml；第一抗体：兔源性抗TRIB1单克隆抗体(浓度：1mg/ml，稀释浓度1：100)，100ul；抗体稀释液，10ml*2管；第二抗体(浓度：1mg/ml，稀释浓度：1：3000)，20ul；二氨基联苯胺显色剂，10ml。
上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
1)准备超纯水1L*2，将枸橼酸盐充分溶解，配置成10mmol/L的枸橼酸盐溶液。
2)另外准备10ml超纯水，加入10ml的30％H2O2；准备1×TBST溶液1L。
3)将病理切片(以下简称“切片”)用二甲苯洗三次，每次5分钟；
4)将切片用100％酒精洗2次，每次10分钟；
5)将切片用95％酒精洗2次，每次10分钟；
6)将切片用超纯水洗2次，每次5分钟。
7)将切片放置枸橼酸盐溶液内微波炉煮沸8分钟，始终保持切片在枸橼酸盐溶液内。
8)将切片用超纯水洗3次，每次5分钟。
9)将切片浸泡在3％的H2O2内10min。
10)将切片用超纯水洗2次，每次5分钟。
11)将切片用TBST洗1次，5分钟。
12)每张切片加100ul的非免疫动物血清，室温下孵育1小时。
13)移去非免疫动物血清，每张切片加100ul的稀释后的第一抗体。4℃孵育过夜。
14)将切片移到室温，复温10分钟；用TBST洗3次，每次5分钟。
15)每张切片加50ul免疫组化加强检测试剂，室温孵育30分钟。
16)用TBST洗切片3次，每次5分钟。
17)加30ul的DAB浓缩液至1mlDAB稀释液，混匀。
18)每张切片加200ul的DAB混合液，染色1-10分钟，染色时间由肉眼或显微镜下观察，染色明显即可终止。
19)用超纯水洗切片2次，每次5分钟。
20)将切片在95％的酒精中泡2次，每次10秒；
21)将切片在100％的酒精中泡2次，每次10秒；
22)将切片在100％的酒精中泡2次，每次10秒。
23)用中性树胶将组织用盖玻片封片，待中性树胶干燥后科在纤维镜下观察。
24)免疫组织化学检测结果判断结果判定标准：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，基底细胞细胞核膜出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，观察基底细胞是否连续用于判断前列腺腺体是否完整，肿瘤是否侵犯到间质。根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果。按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分.两者积分的乘积作为染色结果的评判标准：0定为-，阴性；1～4分为+，弱阳性；5～8分为++，阳性；9～12分为+++，强阳性。
实施例2数据收集及统计分析
通过对TCGA数据库前列腺癌病例数据的整理及分析，用Graphpad prism 7 对TRIB1与前列腺癌生化复发的关系进行统计，利用生化复发为阳性事件，对 TRIB1的表达量作ROC曲线。计算：敏感度+特异性-100的值，当计算值最高时，选取该点的TRIB1表达量为分割点，高于该表达量者归入高表达组，低于该表达量者归入低表达组。以此作生化复发曲线。如图1所示，可见，TRIB1高表达组的无生化复发率明显低于TRIB1低表达组。TRIB1具有预测前列腺癌生化复发的潜力。同时，统计了该数据库中TRIB1和CXCL1/CXCL2/CXCL3/CXCL6/IL8在转录组表达的相关性，图2-A为统计P值，p<0.05表示存在表达相关，图2-B为皮尔森相关系数，当皮尔森相关系数>0.3，表示相关性较大，由图2可知，TRIB1 的表达和CXCL1\CXCL2\IL8的表达相关性较大。
实施例3临床前列腺癌组织切片和非前列腺癌组织切片TRIB1染色对比
利用实施例1的试剂盒及使用方法对临床前列腺癌组织切片和非前列腺癌组织切片进行检测，其中实验样本来源于广州市第一人民医院泌尿外科，遵循伦理委员会要求，告知患者样本用途，签署知情同意书，并通过伦理委员会审查。
结果如图3所示，可见在肿瘤组织中，TRIB1的表达量明显高于非前列腺癌组织，在非癌的前列腺组织中，可见，TRIB1表达在基底膜上，并能完整的观察到表达TRIB1的基底膜。
利用临床组织芯片，对同一来源的切片通过染色TRIB1及CD163+巨噬细胞，其中包括50例前列腺癌组织，30例非肿瘤的前列腺组织。通过配对检验分析二者的相关性，结果如图4所示，p<0.001，皮尔斯相关系数为0.52，具有很高的相关性，可见，TRIB1能反应前列腺癌组织内免疫抑制状态，可有效的指导临床前列腺癌的治疗。
实施例4体外细胞功能实验
利用已经构建好的过表达TRIB1 PC3细胞株，对照组选用转入空载体的PC3 细胞株。先通过Western-blot验证TRIB1蛋白过表达效果。完成CCK8实验(图 5)、transwell实验(图6)、凋亡比例检测(图7)、周期检测(图8)以及划痕实验(图9)。*代表p<0.05，**代表<0.01，表明实验组和对照组实验结果具有统计学差异。由图5～9的实验结果表明，过表达TRIB1能促进细胞生长、转移、迁徙并抑制细胞凋亡。
实施例5过表达TRIB对裸鼠成瘤的影响(体内实验)
7只BLAB/c鼠龄4-6周大的实验小鼠，制备细胞悬液，PC3-NC， PC3-OE-TRIB1 c＝4.5×106个/ml，裸鼠左侧背部种植对照组，右侧背部种植实验组，每次种植100ul。每3天测量肿瘤大小，体积计算公式为V＝x×y2×0.5。其中， x是最长径，y是最短径。待肿瘤体积解近200mm3时，取出肿瘤，并称重。所有相关的动物实验都按照动物伦理委员会规定完成，并经广州市第一人民医院动物伦理委员会审查。图10-a为实体肿瘤照片，提示过表达TRIB1能促进肿瘤生长，如图10-b。图10-c所示为肿瘤体积增长曲线。
实施例6
采用实施例1的试剂盒检测了来自西安艾莉娜生物技术有限公司前列腺芯片，编号：PR807c，50例前列腺癌组织切片，30例非肿瘤前列腺组织切片。临床信息：PR807c临床信息。芯片整体观见图11，具体染色情况见图3。
上述临床验证的结果(参见图3和图11，结合上述免疫组织化学检测结果判断结果判定标准)进一步表明：TRIB1可以作为基底膜的标志，能临床病理诊断前列腺癌。
综上所述，运用本发明提供的试剂盒，能够准确地检测人体前列腺组织 TRIB1的表达位置及水平，根据TRIB1的表达位置能判断前列腺癌的侵犯情况，根据TRIB1的表达量能准确有效的判断肿瘤免疫抑制状态。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒，其特征在于，包括枸橼酸盐、非免疫动物血清封闭液、兔源性抗TRIB1单克隆抗体、第二抗体和二氨基联苯胺显色剂，其中，第二抗体靶向结合兔源性抗TRIB1单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分的用量分别为：
所述枸橼酸盐为粉剂，所述兔源性抗TRIB1单克隆抗体的稀释倍数为1:100。
3.权利要求1或2所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)准备超纯水，将枸橼酸盐充分溶解，配置成10mmol/L的枸橼酸盐溶液；
2)另外准备超纯水，加入30％(W/W)H2O2；准备1×TBST溶液1L；
3)将待测病理切片用二甲苯清洗；
4)将切片用100％酒精清洗；
5)将切片用95％酒精清洗；
6)将切片用超纯水清洗；
7)将切片放置枸橼酸盐溶液内微波炉煮沸5～10分钟，始终保持切片在枸橼酸盐溶液内；
8)将切片用超纯水清洗；
9)将切片浸泡在3％(W/W)的H2O2内；
10)将切片用超纯水清洗；
11)将切片用TBST清洗；
12)每张切片加100ul的非免疫动物血清，室温下孵育；
13)移去非免疫动物血清，每张切片加100ul的稀释后的第一抗体，4℃孵育过夜；
14)将切片移到室温，复温10分钟；用TBST清洗；
15)每张切片加50ul免疫组化加强检测试剂，室温孵育；
16)用TBST清洗切片；
17)加30ul的DAB浓缩液至1ml DAB稀释液，混匀；
18)每张切片加200ul的DAB混合液，染色，染色时间由肉眼或显微镜下观察，染色明显即可终止；
19)用超纯水清洗切片；
20)将切片在95％的酒精中浸泡；
21)将切片在100％的酒精中浸泡；
22)用中性树胶将组织用盖玻片封片，待中性树胶干燥后科在纤维镜下观察；
23)免疫组织化学检测结果判断结果判定标准：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，基底细胞细胞核膜出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，观察基底细胞是否连续用于判断前列腺腺体是否完整，肿瘤是否侵犯到间质；
根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果；按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；
然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分，两者积分的乘积作为染色结果的评判标准：0定为-，阴性；1～4分为+，弱阳性；5～8分为++，阳性；9～12分为+++，强阳性。
4.权利要求1或2所述的试剂盒在制备前列腺癌病理辅助诊断剂中的应用。
5.权利要求1或2所述的试剂盒在制备预测前列腺癌生化复发的试剂中的应用。
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