JP5002105B2 - 内因性のｍＲＮＡタンパク質（ｍＲＮＰ）複合体の単離および特徴付けの方法 - Google Patents

内因性のｍＲＮＡタンパク質（ｍＲＮＰ）複合体の単離および特徴付けの方法 Download PDF

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Description

【０００１】
（関連出願）
本願は、米国仮出願第６０／１７３，３３８号（１９９９年１２月２８日出願）（これは、その全体が本明細書によって援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府の支援の陳述）
本発明は、国立衛生研究所からの助成金番号ＲＯ１ ＣＡ７９９０７の下での連邦政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、概して、転写後調節および遺伝子発現のプロファイリング方法に関する。
【０００４】
（発明の背景）
多くの疾患が、遺伝学的に基づき、そして各個々の遺伝背景は、男性または女性の疾患に対する感受性に深い影響を有し得る。比較的新しい機能的ゲノムの分野によって、研究者らは、タンパク質をコードする遺伝子の知識に基づいてタンパク質の機能を決定する能力を得た。機能的ゲノムの主な目的は、薬物探索の適切な標的である遺伝子産物を同定することである。このような知識は、目的の標的が疾患において本質的な機能を有することが示される場合に、標的を確認するための基礎を導き得る。従って、成長および発達に関するゲノムの因果関係を理解するために細胞および組織の遺伝子発現状態のプロファリングを可能にする方法を開発する必要性ある。
【０００５】
総細胞レベルでの包括的な遺伝子発現の理解には、転写、プレｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡ代謝回転および翻訳の寄与を詳細に理解することが必要である。各細胞におけるこれら調節プロセスの総数はその特有の発現プロフィールの原因であるが、ほとんどの方法は、独立して、各プロセスをひとまとめにして評価することには利用可能ではない。
【０００６】
複雑な組織または腫瘍における遺伝子の発現状態は、一般的に、サンプル（例えば、全組織）からメッセンジャーＲＮＡを抽出し、そしてｃＤＮＡライブラリー、マイクロアレイ、もしくは遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）方法論を用いて発現された遺伝子を分析することによって決定される。例えば、Ｄｕｇｇａｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１，１０−１４．；Ｇｅｒｈｏｌｄら（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２４，１６８−１７３；Ｂｒｏｗｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１，３８−４１；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，４８４−４８７ Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８，２４３−２５１を参照のこと。組織もしくは腫瘍内の任意の単一細胞型の遺伝子発現プロフィールを決定するためか、またはこれらのメッセンジャーＲＮＡを回収するために、組織はまず、微小に解剖されなければならない。少量の細胞物質のみが回収され、そしてこの細胞物質の純度および品質は損なわれるので、これは非常に困難である。
【０００７】
転写後事象は、転写事象と同じように有意にタンパク質発現の結果に影響を及ぼす。転写および転写後の調節は、一般的に関連している。転写活性化因子または転写抑制因子の発現を変えることは、細胞の発生に重要な意義を有する。従って、特定のｍＲＮＡの転写活性化に続くフィードバックループは、増殖シグナルまたは分化シグナルに応答して転写のプログラムを変更し得る。ＤＮＡアレイは、ｍＲＮＡの安定状態レベル（すなわち、総ｍＲＮＡまたは「トランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）」）を包括的にプロファイリングするのに非常に適している。しかし、転写後事象はｍＲＮＡの安定性および翻訳に影響を与えるので、多くの細胞タンパク質の発現レベルは、ｍＲＮＡの安定状態レベルと直接相関しない（Ｇｙｇｉら（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９，１７２０−１７３０；Ｆｕｔｃｈｅｒら（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９，７３５７−７３６８）。
【０００８】
多くのｍＲＮＡは、その転写後発現および局在を調節する配列を含む（Ｒｉｃｈｔｅｒ（１９９６）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ，編，Ｊ．Ｗ．Ｂ Ｈｅｒｓｈｅｙら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，４８１−５０４頁）。これらの調節エレメントは、プレ−ｍＲＮＡのイントロンおよびエキソンの両方に存在し、同様に成熟転写物のコード領域および非コード領域の両方に存在する（ＪａｃｏｂｓｏｎおよびＰｅｌｔｚ（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５，６９３−７３９；Ｗｉｃｋｅｎｓら（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．７，２２０−２３２）。配列特異的調節モチーフの１つの例は、初期応答遺伝子（ＥＲＧ）ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在するＡＵリッチの不安定エレメント（ＡＲＥ）であり、これらの多くは、増殖および分化に必須なタンパク質をコードする（Ｃａｐｕｔら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，１６７０−１６７４；ＳｈａｗおよびＫａｍｅｎ（１９８６）Ｃｅｌｌ ４６，６５９−６６７；Ｓｃｈｉａｖｉら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
１１１４，９５−１０６；ＣｈｅｎおよびＳｈｙｕ（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０，４６５−４７０）。ＡＲＥを介した調節は、ほとんど理解されていないが、哺乳動物ＥＬＡＶ／Ｈｕタンパク質は、インビトロでＡＲＥ配列エレメントに結合し、インビボで転写後ｍＲＮＡ安定性および翻訳に影響を与えることが示されている（Ｊａｉｎら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７，９５４−９６２；Ｌｅｖｙら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，６４１７−６４２３；ＦａｎおよびＳｔｅｉｔｚ（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７，３４４８−３４６０；Ｐｅｎｇら（１９９８）ＥＭＢＯ
Ｊ．１７，３４６１−３４７０；Ｋｅｅｎｅ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，５−７）。
【０００９】
細胞性配列に基づくインビトロＲＮＡ選択方法が、Ｇａｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，１１２０７−１１２１１（１９９４）および米国特許第５，７７３，２４６号、同第５，５２５，４９５号、および同第５，４４４，１４９号（全てＫｅｅｎｅら）（これらの開示は、その全体が本明細書中に援用される）に報告される。一般的に、これらの方法は、メッセンジャーＲＮＰ（ｍＲＮＰ）複合体中に存在する多数のｍＲＮＡを同定することが意図され、そして天然に存在するｍＲＮＡの大きなプール由来のｍＲＮＡ配列のインビトロ結合および増幅を利用した。これらの研究は、細胞性ｍＲＮＡの非翻訳領域に存在するＡＵリッチ配列エレメントに結合することが既知のタンパク質（ＥＬＡＶまたはＨｕタンパク質と称される）を使用した。これらの実験によって、構造的もしくは機能的に関連するｍＲＮＡが複数標的化ＲＮＡ結合タンパク質（すなわち、１つより多くの標的に特異的に結合するＲＮＡ結合タンパク質）を使用して明らかにされ得ることが、発見された。Ｌｅｖｉｎｅら（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３，３４９４−３５０４；ならびにＫｉｎｇら（１９９３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １４，１９４３−１９５２を参照し；ＡｎｔｉｃおよびＫｅｅｎｅ（１９９７）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６１，２７３−２７８ならびにＫｅｅｎｅ（１９９９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）９６，５−７に概説される。しかし、これらの報告は、インビトロ適用に限定され、ＲＮＡ結合タンパク質を用いてＲＮＡを構造的サブセットまたは機能的サブセットに配分するためのインビボ方法は記載していない。インビトロ方法はタンパク質−ＲＮＡ相互作用を決定するために使用されているが、これらの使用は特定の制限を有する。生化学方法が、注意深く制御される場合、一般的に確実であるが、ＲＮＡ結合は、問題が多くあり得る。なぜなら、多くの相互作用は、低い親和性、低い特異性あるいは人為的産物の相互作用であり得るからである。ＲＮＡ−タンパク質相互作用または全体的な系のレベルに対してそれらの機能的な関連を理解するために、インビボにおいてメッセンジャーＲＮＰ複合体をモニターするための信頼性のある方法を見出す必要がある。
【００１０】
エピトープタグ化されたＥＬＡＶ／Ｈｕタンパク質（これは、前ニューロン細胞にトランスフェクトされている）の好首尾な免疫沈降が、報告されている。Ａｎｔｉｃら，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３，４４９−４６１（１９９９）を参照のこと。この免疫沈降には、神経フィラメントＭタンパク質（ＮＦ−Ｍ）をコードするメッセンジャーＲＮＡの同定を可能にする核酸増幅が続く。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、メッセンジャーＲＮＡのクラスターまたはサブセットを通した遺伝情報の流れを利用する、遺伝子発現を決定するための新規のインビボ手段に関する。近年、複数の高分子事象を、これらの情報をコンピューター化で組織化する目標とともに、同時かつ並行に調べることは、呼称「−ｏｍｅ」が採られている。従って、ゲノムは、細胞の遺伝子全てを同定し、一方、トランスクリプトームは、ゲノムのメッセンジャーＲＮＡ相補体として規定され、そしてプロテオーム（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）は、ゲノムのタンパク質相補体として規定される（図１を参照のこと）。本発明者らは、トランスクリプトームのいくつかの物理的に組織化されたサブセットを規定し、そしてこれらを「リボノーム（ｒｉｂｏｎｏｍｅ）」の動的単位として規定する。本明細書中に記載されるように、リボノームは、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、調節ＲＮＡ結合タンパク質）との会合に起因して、細胞中でクラスター化しているメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の多数の異なるサブセットからなる。細胞性リボノームのｍＲＮＡ成分を同定することによって、細胞性トランスクリプトームは、細胞または組織の遺伝子発現状態を規定するために一緒に使用され得る一連のサブプロフィールに破壊され得る（図２を参照のこと）。例えば、高スループット手段と組み合わせ、そしてＲＮＡプロセシングアレイと多重化することによって、本発明の方法は、複数の遺伝子転写物中で生じる変化を同時に決定する能力を提供する。
【００１２】
従って、本明細書中の１つの局面は、内因性の細胞性ｍＲＮＡ結合タンパク質（ｍＲＮＰ）複合体を区別するインビボ方法である。１つの実施形態において、この方法は、少なくとも１つ以上のｍＲＮＰ複合体を含む生物学的サンプルを、このｍＲＮＰ複合体の成分に特異的に結合するリガンドと接触させる工程を包含する。生物学的サンプルは、例えば、組織サンプル、全組織、全器官、細胞培養物、または細胞抽出物もしくは溶解物であり得る。ｍＲＮＰ複合体の成分は、ＲＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ会合タンパク質、ｍＲＮＡ自身を含むｍＲＮＰ複合体と会合する核酸、またはｍＲＮＰ複合体と会合する別の分子もしくは化合物（例えば、炭水化物、脂質、ビタミンなど）であり得る。リガンドは、例えば、この成分に特異的に結合する抗体、この成分に結合する核酸（例えば、アンチセンス分子、この成分に結合するＲＮＡ分子）、またはこの複合体の成分に結合する任意の他の化合物もしくは分子であり得る。次いで、ｍＲＮＰ複合体は、リガンドを（ここではｍＲＮＰ複合体に結合する）、このリガンドを結合する結合分子に結合させることによって分離される。結合分子は、リガンドに直接的に結合しても（すなわち、リガンドに対して特異的な抗体であり得る）、リガンドに間接的に結合してもよい（すなわち、リガンド上のタグに対する抗体または結合パートナーであり得る）。結合分子は、当該分野で公知のように、固体支持体（例えば、ビーズまたはプレートまたはカラム）に付着される。従って、ｍＲＮＰ複合体は、リガンドおよび結合分子を介して固体支持体に付着される。次いで、ｍＲＮＰ複合体は、この複合体を固体支持体から取り外すことによって収集される（すなわち、この複合体は、適切な条件および溶媒を用いて固体支持体から洗浄して取り外される）。
【００１３】
次いで、ｍＲＮＰ複合体内に結合したｍＲＮＡの同一性が、例えば、ｍＲＮＡをこの複合体から分離し、このｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、そしてこのｃＤＮＡを配列決定することによって、決定され得る。
【００１４】
従って、本発明の実施形態において、ｍＲＮＰ複合体は、エピトープタグの有りまたは無しで、ｍＲＮＰ複合体の直接的な免疫沈降によって単離され得るか、または他の生化学的な区別方法によって単離され得る。例えば、ｍＲＮＰ複合体に結合するかまたはｍＲＮＰ複合体と会合している他のタンパク質は、ｍＲＮＰ複合体それに続いてこの複合体内の結合したｍＲＮＡを収集するために、免疫沈降され得る。当業者は、本発明の方法の実施形態が、同時に（すなわち共に）、連続して、またはバッチ式の様式で、多数のｍＲＮＡ複合体の同定を可能にすることを理解する。あるいは、この方法は、１つの生物学的サンプル（またはその一部）に対して多数回実行され得、この方法の工程は、異なるリガンドを利用する方法を各々反復することによって、連続様式で実施される。任意の記載された実施形態において、例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムマイクロアレイのグリッドが、本発明の方法によって単離されたｍＲＮＡをひとまとめに同定するために使用され得る。
【００１５】
ｍＲＮＡの「サブセット」は、ｍＲＮＰ複合体を特異的に結合するかまたはｍＲＮＰ複合体と特異的に会合する、複数のｍＲＮＡ転写物またはメッセージとして規定される。言い換えると、サブセットは、特定のｍＲＮＰ複合体内に結合するかまたは特定のｍＲＮＰ複合体に結合するその能力によって規定される。サブセットは、好ましくは、細胞の総ｍＲＮＡ集団の定量的画分または定性的画分である。さらに、ｍＲＮＡサブセット内のサブセットは、本発明を用いて同定され得る。任意の特定の細胞または組織サンプルのｍＲＮＡサブセットの収集は、発現プロフィールであり、本明細書中において、この細胞または組織に関して「リボノームプロフィール（ｒｉｂｏｎｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅ）」とも称される。発現プロフィールが、サンプル中の細胞型（例えば、細胞が何の種または組織型であるか）、細胞の分化状態、細胞の病原性（すなわち、この細胞が感染されているか否か、または細胞が有害な遺伝子（例えば、癌遺伝子）を発現しているか否か、またはこの細胞が特定の遺伝子を欠くか否か）、ｍＲＮＰ複合体を単離するために使用される特定のリガンドなどに依存して、細胞サンプル間で異なることが理解される。従って、細胞の発現プロフィールは、細胞の同定因子として使用され得、当業者が異なる細胞のプロフィールを比較し、識別することを可能にする。
【００１６】
他に示されない限り、リボノームプロフィールは、細胞の全体的なｍＲＮＡプロフィールのパターン認識サブセットを提供する。細胞の増殖状態が変化する（すなわち、腫瘍化）場合か、または細胞が病原体によって混乱された（すなわち、ウイルス感染）場合、このプロフィールは変化し、そしてリボノームの混乱が、検出され得る。細胞が化合物（すなわち、薬物）で処理される場合、リボノームパターンは、所望の変化または所望されない変化を示す。従って、この新規方法は、多数の因子の細胞に対する影響（毒性、加齢、アポトーシス、病原および細胞分化を含む）を評価するための方法を提供する。
【００１７】
新規である本発明は、ＲＮＡを区別する以前の方法よりもいくつかの利点を有する。第１に、ｍＲＮＰ複合体の区別は、インビボで実行され得、一方、以前の方法は、インビトロ適用に制限されていた。この新規方法は、十分に確固としており、その結果、一旦目的のｃＤＮＡが単離されたｍＲＮＡサブセットから逆転写されると、この目的のｃＤＮＡを同定するために増幅（例えば、ＰＣＲによるか、または代替的に、Ａｎｔｉｃら（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，４４９−４６１の方法に従う）をする必要はない。本発明は、Ｇａｏら（前出）に示されるような反復工程の使用を必要としない。最後に、例えば、ハイブリダイゼーションが細胞の発現プロフィールを分析するために（例えば、マクロアレイアッセイまたはＲＮＡｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）において）使用される場合、定量的な決定が本発明において可能である。
【００１８】
従って、特定の実施形態において、本発明は、当業者が、成熟遺伝子転写物の局在、活性、安定性、および生細胞のタンパク質成分への翻訳を決定するためにひとまとめにこの成熟遺伝子転写物を同定、モニター、および定量することを、好都合に可能にする。本明細書中に記載される方法は、内因性メッセンジャーＲＮＡ結合タンパク質を単離する方法、およびｍＲＮＰ複合体中に含まれる細胞性ｍＲＮＡのサブセットを同定する方法を、マイクロアレイまたは他の公知の手順を用いて提供することによって、機能的ゲノムに新規の手段を好都合に提供する。好ましい実施形態において、本発明の方法は、ｍＲＮＡ結合タンパク質およびｍＲＮＡサブセットを規定するための他のｍＲＮＰ会合因子を用いることによって、増殖および分化のサイクルの間の機能的ｍＲＮＡネットワークを研究しそしてこれらを決定する基礎を提供する。
【００１９】
ｍＲＮＡサブセットのパターン（すなわち、発現プロフィール）は、特定の化合物（すなわち、薬物）の存在下、または種々の疾患状態下で変更され得ることが、理解される。従って、特定の実施形態において、本発明の方法は、治療的用途がある化合物であり得る化合物をスクリーニングするため、およびこの化合物に対する適切な遺伝子標的を見出すために有用である。他の実施形態において、本発明の方法は、細胞の疾患状態を決定するのに有用であり、従って、疾患（例えば、癌）の存在または疾患の素因を分類または診断するための手段が提供される。
【００２０】
遺伝子発現プロフィールはまた、複雑な組織（例えば、腫瘍）に存在する異なる細胞型間で異なる。いくつかのｍＲＮＡ結合タンパク質は、特定の腫瘍細胞においてのみ存在し、そして腫瘍は、１より多い細胞型を含み得る。腫瘍または組織内の各細胞型についての遺伝子発現プロファイリングは、その組織の抽出物を作製し、そしてｍＲＮＰ複合体の細胞特異的成分（例えば、ｍＲＮＡに付着しているＲＮＡ結合タンパク質）をその抽出物から直接的に（すなわち、インビボで）免疫沈降することによって行われ得る。これらの免疫沈降したペレットは、その結合または会合した成分を含む、その同じ細胞中にのみ存在するｍＲＮＡを含む。従って、特定の実施形態において、本発明の方法は、複数の細胞型の遺伝子発現プロフィール（どの細胞型が、その同じ複雑な組織中に共存し得るか）を特徴付けそして区別するために使用され得る。これは、例えば、腫瘍細胞周辺の非腫瘍間質細胞および血液細胞におけるｍＲＮＡを分析する必要なく、これらの腫瘍細胞を腫瘍抽出物全体においてプロフィールするのを可能にし得る。このような特徴付けの結果は、例えば、処置の選択が、腫瘍に存在する組織の種類（例えば、内皮血管組織）に依存する場合の、腫瘍に罹患している患者の適切な処置の過程の決定において有用であり得る。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、ｍＲＮＰ複合体と結合または会合するタンパク質を単離および必要に応じて同定するための方法を提供する。
【００２２】
あるいは、および別の実施形態において、本発明の方法は、細胞における遺伝子発現を調節する能力について、試験化合物をスクリーニングするために使用され得る。このような方法は、遺伝子発現における異常に関連する障害（癌を含むがこれらに限定されない）の処置および／または予防において使用され得る、推定の薬物をスクリーニングするのに有用である。
【００２３】
本発明の前述および他の局面は、以下に示す本明細書中において詳細に説明される。
【００２４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ここで、本発明を、添付の図面（ここでは、本発明の好ましい実施形態が示される）を参照してより十分に説明する。しかし、本発明は、異なる形態において具体化され得、そして本明細書中に示される実施形態に限定されるとみなされない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分伝えるように提供される。
【００２５】
本明細書中の本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、本発明を限定することを意図されない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」とは、他に明らかに示されない限り、複数形態もまた同様に含むことが意図される。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の文献は、それらの全体が参考として援用される。
【００２６】
他に示されなければ、標準的な方法が、本発明に従って、クローニングした遺伝子、発現カセット、ベクターならびに形質転換された細胞および植物の産生に使用され得る。このような方法は、当業者に公知である。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照のこと。
【００２７】
ヌクレオチドおよびアミノ酸は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２および確立された使用法に従って、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または（アミノ酸について）三文字コードで本明細書中に示される。例えば、ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ，９９−１０２（Ｎｏｖ．１９９０）（米国特許商標局）を参照のこと。
【００２８】
ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向に（左から右へ）一本鎖のみによって本明細書中に示される。本明細書中で使用される場合「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそれらのフラグメントをいい、そしてゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ（これらは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得る）をいう。用語「核酸」とは、一本鎖形態または二本鎖形態にある、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドならびにそれらのポリマーをいう。特に限定されない限り、この用語は、その参照核酸と同様の結合特性を有しそして天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。他に示されない限り、特定の核酸配列にはまた、それらの保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列が暗に包含され、そして同様に、その配列も明らかに示される。２つの核酸は、その２以上の核酸の各々由来の配列が、子孫核酸において合わせられている場合に、「組換え」られている。
【００２９】
用語「核酸」または「核酸配列」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子にコードされるｍＲＮＡに関して使用され得る。用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連する、ＤＮＡの任意のセグメントを言及するために広く使用される。従って、遺伝子は、コード配列および／またはそれらの発現に必要とされる調節配列を含む。遺伝子はまた、発現されないＤＮＡセグメント（例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する）を含む。遺伝子は、種々の供給源（目的の供給源からのクローニングあるいは既知または推定の配列情報からの合成を含む）から得られ得る。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、核酸分子は、ＲＮＡ（用語「ＲＮＡ」は、全てのリボ核酸（プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよびｔＲＮＡを含むがこれらに限定されない）を包含する）；ＤＮＡ；ペプチド核酸（ＰＮＡ）（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎらに対する米国特許第５，５３９，０８２号、およびＡｒｌｉｎｇｈａｕｓらに対する米国特許第５，８２１，０６０号に記載されるような）；ならびにそれらのアナログおよび改変形態であり得る。好ましくは、核酸は、ＲＮＡであり、そしてより好ましくは、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。本発明の核酸分子は、線状または環状、遺伝子全体またはそのフラグメント、全長またはフラグメント化／消化されたもの、「キメラ」（そのセンス鎖において１種より多い核酸を含む）であり得、そして一本鎖または二本鎖であり得る。任意の供給源由来の核酸が、本発明において使用され得る；つまり、本発明の核酸としては、ゲノム核酸、合成核酸、プラスミドから得られた核酸、ｃＤＮＡ、組換え核酸、ならびに公知の化学的方法によって改変された核酸（本明細書中にさらに記載されるような）が挙げられるが、これらに限定されない。核酸はまた、インビトロ選択実験の産物（アプタマーとも呼ばれる）および他のリガンドに結合するかまたは結合される能力について有用な他の核酸分子であり得る。Ｄ．Ｋｅｎａｎ，ＴＩＢＳ １９，５７−６４（１９９４）；Ｌ．Ｇｏｌｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４，７６３−７９８（１９９５）；Ｓ．Ｅ．ＯｓｂｏｒｎｅおよびＡ．Ｄ．Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７，３４９−３７０（１９９７）を参照のこと。
【００３１】
本発明の核酸は、細菌、ウイルス、真菌、植物および動物を含むが、これらに限定されない、任意の生物から得られ得、ここで、動物の核酸が好ましく、哺乳動物の核酸がより好ましく、そしてヒト核酸が最も好ましい。所望の場合、核酸は、当該分野で周知の、既知の核酸増幅方法のいずれか（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＱＣ−ＰＣＲ、ＳＤＡなど）に従って増幅され得る。本発明の核酸は、当該分野で公知の方法に従って精製され得、そして好ましくは、当該分野で公知の方法に従って精製される。
【００３２】
上記に要約されるように、本発明は、細胞からｍＲＮＰ複合体を区分化（ｐａｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）するためのインビボ方法に関する。本発明のｍＲＮＰ複合体は、好ましくは、生物学的サンプル（例えば、組織サンプル、組織全体、器官全体（例えば、脳、肝臓、腎臓全体など）、体液サンプル、細胞培養物、細胞溶解物、細胞抽出物など）由来であり得る。好ましい実施形態において、この生物学的サンプルは、細胞の集団を含むかまたは細胞の集団から得られる。本明細書中で「細胞の集団」によって、少なくとも２つの細胞を意味され、ここで、少なくとも約１０３が好ましく、少なくとも約１０６が特に好ましく、そして少なくとも約１０８〜１０９がとりわけ好ましい。この集団またはサンプルは、一次または二次培養物あるいは複合組織（例えば、腫瘍）のいずれか由来の異なる細胞型の混合物を含み得るか、あるいは単一の細胞型のみを含み得る。好ましい実施形態において、増殖している細胞が使用される。あるいは、増殖していない細胞が使用され得る。
【００３３】
本発明の使用に好ましい細胞型としては、哺乳動物細胞（動物（げっ歯類、ウマ、ウシ、イヌ、ネコおよび霊長類）細胞およびヒト細胞を含む）が挙げられるが、これらに限定されず、ここで、ヒト細胞が、好ましい。非哺乳動物（例えば、鳥類、魚類、爬虫類）由来および植物由来の細胞もまた、本発明の実施において使用され得る。細胞は、任意の型の腫瘍（乳房、皮膚、肺、頸部、結腸直腸および脳／ＣＮＳの腫瘍など）由来の腫瘍細胞であり得る。さらに、任意の器官の非癌性細胞（肝臓細胞、ニューロン、筋肉細胞などを含む）が、使用され得る。
【００３４】
ｍＲＮＡとは、「メッセージ」または「転写物」として、本明細書中で交換可能に称される。ｍＲＮＡの「サブセット」は、特定のｍＲＮＡ結合タンパク質複合体（ｍＲＮＰ複合体）内に特異的に結合する、複数のｍＲＮＡとして定義される。従って、サブセットは、特定のｍＲＮＰ内または特定のｍＲＮＰに結合する、それらの能力によって規定される。ｍＲＮＡサブセットは、好ましくは、この細胞の総ＲＮＡ集団のうちのわずかなものであり得る。
【００３５】
上記で要約されるように、本発明の１つの局面は、内因性細胞ｍＲＮＡ結合タンパク質（ｍＲＮＰ）複合体を区分かするインビボ方法である。「内因性」とは、このｍＲＮＰ複合体が細胞中（すなわち、インビボまたはインサイチュ）で形成することを意味するものとして、本明細書中で使用される。このｍＲＮＰ複合体は、その細胞において天然に形成し得、すなわち、このｍＲＮＰ複合体の成分が、その細胞中に存在し、そしてこのｍＲＮＰ複合体を形成する。あるいは、この複合体の１以上の成分が、例えば、感染または形質転換によって細胞内に導入されても、このｍＲＮＰ複合体は、その細胞中で形成する。例えば、このｍＲＮＰ複合体の成分であるＲＮＰ結合タンパク質が、（例えば）このタンパク質をコードする核酸を保持する発現ベクターを細胞に形質転換するかまたは感染させることによってこの細胞中に異所的に発現され、そしてそのタンパク質が結合するｍＲＮＰ複合体が形成される場合に、ｍＲＮＰ複合体は、細胞中で内因的に形成する。
【００３６】
１つの実施形態において、この方法は、少なくとも１つのｍＲＮＰ複合体を含む生物学的サンプルに、そのｍＲＮＰ複合体の成分を特異的に結合するリガンドを接触させる工程を包含する。このｍＲＮＰ複合体の成分は、ＲＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ会合タンパク質、このｍＲＮＡ自体を含むｍＲＮＰ複合体と会合する核酸、あるいはこのｍＲＮＰ複合体と会合する別の分子または化合物（例えば、炭水化物、脂質、ビタミンなど）であり得る。成分は、約１０−６〜約１０−９のＫｄでこのｍＲＮＰ複合体に結合するかまたは付着する場合に、ｍＲＮＰ複合体と「会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）」。好ましい実施形態において、この成分は、約１０−７〜約１０−９のＫｄでこの複合体に会合する。より好ましい実施形態において、この成分は、約１０−８〜約１０−９のＫｄでこの複合体に会合する。
【００３７】
このリガンドは、このｍＲＮＰ複合体の成分を特異的に結合する任意の分子であり得る。例えば、リガンドは、この成分を特異的に結合する抗体、この成分を結合する核酸（例えば、アンチセンス分子、この成分を結合するＲＮＡ分子）、あるいはこの複合体のこの成分を特異的に結合する任意の他の化合物または分子であり得る。特定の実施形態において、リガンドは、ｍＲＮＰ複合体特異的抗体またはタンパク質の産生に関連することが公知の障害を有する被験体（すなわち、ヒトまたは動物被験体）の血清を使用して、得られ得る。これらの障害の例としては、自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス（「狼瘡」またはＳＬＥ））および多くの癌が挙げられる。特定の実施形態において、リガンドは、このリガンドの分離、観察または検出を容易にするための別の化合物または分子で、「タグ化」され得る。本発明の１つの実施形態において、リガンドは、当該分野で公知のように、「エピトープタグ化」される。適切なタグは、当該分野で公知であり、そしてこれらには、ビオチン、ＭＳ２タンパク質結合部位配列、Ｕ１ｓｎＲＮＡ ７０ｋ結合部位配列、Ｕ１ｓｎＲＮＡ Ａ結合部位配列、ｇ１０結合部位配列（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから市販される）、およびＦＬＡＧ−ＴＡＧ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
次いで、このｍＲＮＰ複合体を、そのリガンドを特異的に結合する結合分子に、そのリガンド（ここでは、ｍＲＮＰ複合体に結合されている）を結合させることによって分離する。この結合分子は、リガンドを直接結合し得るか（すなわち、リガンドに特異的な抗体またはタンパク質であり得る）、またはリガンドに間接的に結合し得る（すなわち、リガンド上のタグに対する抗体または結合パートナーであり得る）。適切な結合分子としては、プロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジンが挙げられるが、これらに限定されない。結合分子はまた、例えば、自己免疫障害または癌に罹患している被験体の血清を使用して得られ得る。特定の実施形態において、このリガンドは、そのＦａｂ領域を介してそのｍＲＮＰ複合体の成分を結合する抗体であり、そして次いで、この結合分子は、この抗体のＦｃ領域を結合する。結合分子は、当該分野で公知のような固体支持体（例えば、ビーズ、ウェル、ピン、プレートまたはカラム）に付着されている。従って、このｍＲＮＰ複合体は、リガンドおよび結合分子を介して個体支持体に付着される。
【００３９】
次いで、ｍＲＮＰ複合体を、固体支持体からｍＲＮＰ複合体を取り出すことによって回収する（すなわち、適切なストリンジェンシー条件下で、当業者によって決定され得る適切な溶媒を使用して、固体支持体から複合体を洗い流す）。
【００４０】
本発明の特定の実施形態では、ｍＲＮＰ複合体にリガンドを結合させる前に、ｍＲＮＰ複合体を、架橋によって安定化させ得る。本明細書中で使用される場合、架橋は、共有結合（例えば、ｍＲＮＰ複合体の成分を共に共有結合すること）を意味する。架橋は、一般的に非共有結合であるリガンド−標的結合または結合分子−リガンド結合とは対照的であり得る。架橋は、物理的手段（例えば、熱または紫外線照射による）、または化学的手段（例えば、複合体を、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドまたは他の公知の架橋剤と接触させることによる）によって実施され得る。この手段は、当業者に公知であるかまたは当業者によって決定可能である。他の実施形態では、リガンドは、ｍＲＮＰ複合体を結合した後に、ｍＲＮＰ複合体に架橋され得る。さらなる実施形態では、結合分子は、リガンドに結合した後に、このリガンドに架橋され得る。さらに他の実施形態では、結合分子は、固体支持体に架橋され得る。
【００４１】
当業者は、本発明の方法が、同時に（例えば、「ひとまとめに」）複数のｍＲＮＰ複合体を同定することを可能にすることを理解する。例えば、生物学的サンプルを、異なるｍＲＮＰ複合体成分に特異的な複数のリガンドと接触させ得る。サンプル由来の複数のｍＲＮＰ複合体は、種々のリガンドを結合する。次いで、この複数のｍＲＮＰ複合体を、適切な結合分子を使用して分離し得、このようにして、この複数のｍＲＮＰ複合体を単離する。次いで、この複合体中に含まれるｍＲＮＰ複合体とｍＲＮＡとを、本明細書中に記載される方法および当該分野において公知の方法によって特徴付け得、および／または同定し得る。あるいは、この方法は、多数の時間に１つのサンプルに対して実施され得、本発明の工程は、連続的な様式で実施され、各反復工程で異なるリガンドを利用する。
【００４２】
上記に示したように、ｍＲＮＡのサブセットは、このサンプル中のＲＮＡの構造的または機能的ネットワークに特徴的なパターン認識プロフィールを同定する。任意の特定の細胞または組織のサンプルに関するｍＲＮＡサブセットの収集物は、この細胞または組織についての遺伝子発現プロフィール、そしてより詳細には、リボノミック（ｒｉｂｏｎｏｍｉｃ）遺伝子発現プロフィールを構成する。リボノミック発現プロフィールは、サンプル中の細胞型（例えば、その細胞がどの種または組織型であるか）、細胞の分化状態、細胞の生存能力（すなわち、細胞が感染されているか否か、または細胞が有害な遺伝子（例えば、オンコジーン）を発現しているか否か、または細胞が特定の遺伝子を欠いているかもしくは特定の遺伝子を発現させていないか否か）、ｍＲＮＰ複合体を単離するために使用された特定のリガンドなどに依存して、細胞ごとに異なり得ることが理解される。従って、細胞のリボノミック発現プロフィールは、細胞についての識別子として使用され得、当業者が、異なる細胞のプロフィールまたはサブプロフィールを比較および識別することを可能にする。各リボノミックパターンにおいて存在するＲＮＡによって同定される遺伝子は、特定の細胞周期、分化段階、アポトーシスもしくはストレス誘導、ウイルス感染、または癌と関連付けられ得る、異なるサブセットとを形成する。
【００４３】
ｃＤＮＡを使用して、ｍＲＮＰ複合体の成分に特異的なリガンド（１つまたは複数）で区切られたｍＲＮＰ複合体を同定し得る。例えば、ｃＤＮＡマイクロアレイ格子を使用して、ひとまとめに、ｍＲＮＡサブセットを同定し得る。マクロアレイは、正確に整列された格子であり、ここにおいて、各標的核酸（例えば、遺伝子）は、注意深くスポットされたｃＤＮＡのマトリクスに位置を有する。Ｇｅｒｈｏｌｄら（前出）、Ｄｕｇｇａｎら（前出）、およびＢｒｏｗｎら（前出）を参照のこと。あるいは、ゲノムマイクロアレイ（例えば、標的核酸がイントロンおよびエキソンを含み得るマイクロアレイ）を使用し得る。従って、マイクロアレイにおいて試験される各遺伝子または標的核酸は、位置づけられ得る正確な所在（ａｄｄｒｅｓｓ）を有し、そしてその結合が定量され得る。ナイロンまたはニトロセルロース上におけるシリコンチップまたはｃＤＮＡブロットに基づくものの形態のマイクロアレイは市販されている。ガラススライドもまた、相補的ＲＮＡ配列の検出のために、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡでカスタマイズされ得る。これらのすべての場合において、ハイブリダイゼーションプラットフォームは、結合および洗浄のストリンジェンシーに基づいて、サンプル中のｍＲＮＡの同定を可能にする。これは、「ハイブリダイゼーションによる配列決定」と言及されている。マイクロアレイ技術は、分析の一方法であるが、これは、ｍＲＮＡサブセット中のｍＲＮＡを同定および／または配列決定するための１つの方法にすぎない。代替的なアプローチとしては、ディファレンシャルディスプレイ、ファージディスプレイ／分析、ＳＡＧＥ、または単純に、ｍＲＮＡ調製物からのｃＤＮＡライブラリーの調製およびこのライブラリーのすべてのメンバーの配列決定が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
当該分野において周知でありかつ一般的に利用可能なＤＮＡ配列決定方法を使用して、本発明の任意の実施形態を実施し得る。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標）（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ），熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ｌｌｌ），またはポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）によって販売されるＥＬＯＮＧＡＳＥ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにおいて見られるもの）との組み合わせのような酵素を使用し得る。好ましくは、このプロセスは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，Ｎｅｖ．），Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，Ｍａｓｓ．）およびＡＢＩ Ｃａｔａｌｙｓｔならびに３７３および３７７ ＤＮＡ配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のような機器を用いて自動化される。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明に従って単離されたｍＲＮＡおよび／またはこのｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡの増幅は、核酸の同定の間に実施されず、そして本発明によって必要も要求もされない。しかし、当業者は、好みにより、便宜のために同定についての被験体である核酸（例えば、マイクロアレイ分析および／または配列決定を介して同定された核酸）を増幅するため、および／または特定の市販のマイクロアレイまたはマイクロアレイ分析システムの仕様書／説明書に従うために選択し得る。従って、所望される場合、核酸は、当該分野において周知である多数の公知の任意の核酸増幅方法（例えば、ＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲ，ＱＣ−ＰＣＲ，ＳＤＡなど）に従って増幅され得る。
【００４６】
本発明の方法は、実施者および本発明を実施する目的の必要に応じて、いくつかの様式で実施され得る。例えば、１つの実施形態では、目的の細胞型に固有のｍＲＮＡ−結合タンパク質複合体を同定する。このような実施形態の例では、ｍＲＮＰ複合体に特異的な抗体を使用して、この複合体をその会合のｍＲＮＡで免疫沈降し得る。次いで、ＲＮＡを同定して、その細胞型のリボノミック発現プロフィールを形成し得るか、あるいは（例として）薬物スクリーニングのために単離し得る。転写後調節についてのｍＲＮＡ候補を、細胞周期または発達事象の間のｍＲＮＡ安定性における変化について、サブセットとしてひとまとめに分析し得る。特定の実施形態では、この方法は、発達または細胞周期の変化を受けている細胞から核を単離する工程、公知技術に従って核流出アッセイを実施して転写したｍＲＮＡを得る工程、次いで、ｃＤＮＡマイクロアレイを使用して、同一細胞中の全体的なｍＲＮＡレベルと転写したｍＲＮＡとを比較する工程によって実施され得る。従って、これらの方法は、ひとまとめに、定常状態のｍＲＮＡレベルに対する転写後効果から転写効果を識別する能力を提供する。
【００４７】
別の実施形態では、培養物中の細胞を、ＲＮＡ−結合タンパク質（ＲＢＰ）または目的の細胞型のみにおける特定のｍＲＮＡと会合するＲＮＡ会合タンパク質（ＲＡＰ）を発現させるように形質転換する。ＲＢＰまたはＲＡＰをコードするＤＮＡは、組換えベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクター）によって保持され得、そして公知の手段によって細胞に形質転換され得、その後、ＲＢＰまたはＲＡＰは、細胞において発現される。任意のＲＢＰまたはＲＡＰが、本明細書中にさらに記載されるように、使用され得る。タンパク質は、そのネイティブな形態であり得るか、またはタンパク質は、細胞からの容易な回収のためにタグ化（例えば、エピトープタグ化）され得る。ＲＢＰまたはＲＡＰと結合するかまたは会合する複数のＲＮＡ標的のインビボでの検出は、必要に応じて、アクセス可能なエピトープを使用することによって実施され得るが、好ましくは、タグを伴わずに実施される。ＲＢＰまたはＲＡＰにおけるエピトープが、アクセス不能または不明である場合、異所的に発現された組換えタンパク質におけるエピトープタグが使用され得る。形質転換された細胞は、他の細胞型と混合され得るか、または動物もしくはヒト被験体中に移植され得る。タンパク質に特異的なリガンド（例えば、抗体）を使用して、形質転換細胞を含む組織の抽出物から、そのタンパク質を、その会合したメッセンジャーＲＮＡにより免疫沈降し得る。次いで、ｍＲＮＡ複合体およびその会合ＲＮＡは、その細胞型の発現プロフィールを形成するために同定され得るか、さもなくば分析される（例えば、薬物開発のため）。
【００４８】
なお別の実施形態では、動物における特定の細胞型を、１以上の細胞型特異的遺伝子プロモーターで操作して、目的の細胞型においてＲＢＰまたはＲＡＰを発現させる。上述のように、遺伝子プロモーターおよびＲＢＰまたはＲＡＰは、１以上のベクター上に保持され得、そして細胞に形質転換され得、この細胞において、ＲＢＰまたはＲＡＰが発現される。１つの実施形態では、このタンパク質に特異的なリガンド（例えば、抗体）を使用して、目的の細胞型を含む組織の抽出物から、このタンパク質を、その付着または会合メッセンジャーＲＮＡで免疫沈降し得る。次いで、ＲＮＡを同定して、その細胞型の発現プロフィールを形成するか、または例えば、薬物開発のために単離する。
【００４９】
本発明の実施において有用なＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）およびＲＮＡ関連タンパク質（ＲＡＰ）は当該分野において公知であるか、あるいは、本明細書中に記載の方法によって同定および発見され得る。ＲＮＡ結合タンパク質は、現在では、細胞の種々の調節および発達プロセス（例えば、ＲＮＡプロセシングおよび区画化、ＲＮＡ安定化、ｍＲＮＡ翻訳ならびにウイルス遺伝子発現）の制御に関与していると考えられている。ＲＮＡ結合タンパク質としては、ポリＡ結合タンパク質（「ＲＡＢＰ」、これは、総ｍＲＮＡ集団とは量的に異なる総ｍＲＮＡ集団のサブセットを生じる）および他の一般的なＲＮＡ結合タンパク質、ならびに特定の細胞型においてわずか１つかまたは少数のメッセンジャーＲＮＡに付着したＲＮＡ結合タンパク質が挙げられる。他の有用なタンパク質は、ＲＮＡおよびＲＮＡ結合タンパク質と反応性の自己抗体である。
【００５０】
有用なＲＮＡ結合タンパク質の例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＥＬＡＶ
ＲＮＡ−結合タンパク質の４つのＥＬＡＶ／Ｈｕ哺乳動物ホモログ（Ｇｏｏｄ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，４５５７−４５６１；ＡｎｔｉｃおよびＫｅｅｎｅ，前出）が挙げられる。ＨｕＡ（ＨｕＲ）は、偏在的に発現されるが、ＨｕＢ，ＨｕＣおよびＨｕＤ（および、それらの個々の選択的にスプライシングされたアイソフォーム）は、ニューロン組織において優勢に見出されるが、これはまたいくつかの小細胞癌腫、神経芽腫および髄芽腫において腫瘍細胞特異的抗原として発現され得る（Ｋｅｅｎｅ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，５−７において概説される）。すべてのＨｕタンパク質が、３つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）を含み、これはＡＲＥに対するその結合特異性を付与する（ＡｎｔｉｃおよびＫｅｅｎｅ，前出；Ｋｅｎａｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１６，２１４−２２０；ＢｕｒｄおよびＤｒｅｙｆｕｓｓ（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５，６１５−６２１）。Ｈｕタンパク質によるＡＲＥ結合の証拠は、組換えＨｕＢによってスクリーニングされた無作為化コンビナトリアルＲＮＡライブラリーからのＡＵ富化結合コンセンサス配列の同定から始まった（Ｌｅｖｉｎｅら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３，３４９４−３５０４；Ｇａｏら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，１１２０７−１１２１１）。これらのおよび他の研究によって、Ｈｕタンパク質が、インビトロにおいて、いくつかのＡＲＥ含有ＥＲＧ ｍＲＮＡ（ｃ−ｍｙｃ，ｃ−ｆｏｓ，ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＡＰ−４３を含む）に結合することが実証された（Ｌｅｖｉｎｅら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３，３４９４−３５０４；Ｇａｏら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，１１２０７−１１２１１；Ｋｉｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，１９４３−１９５２；Ｌｉｕら（１９９５）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４５，５４４−５５０；Ｍａら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，８１４４−８１５１；Ａｂｅら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，２０１１−２０１６；Ｃｈｕｎｇら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，６５９３−６５９８；ＦａｎおよびＳｔｅｉｔｚ（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７，３４４８−３４６０；Ａｎｔｉｃら（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，４４９−４６１）。
【００５１】
ＡＲＥ含有ｍＲＮＡへのＨｕタンパク質の結合は、ｍＲＮＡ転写物の安定化および翻訳可能性の増加を生じ得る（Ｊａｉｎら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７，９５４−９６２；Ｌｅｖｙら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，６４１７−６４２３；ＦａｎおよびＳｔｅｉｔｚ（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７，３４４８−３４６０；Ｐｅｎｇら（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７，３４６１−３４７０）。ニューロン特異的Ｈｕタンパク質は、ニューロンの分化を誘導するためのレチノイン酸（ＲＡ）処理後に、奇形癌細胞において生成される最も初期のニューロンマーカーの１つである（Ａｎｔｉｃら，前出；ＧａｏおよびＫｅｅｎｅ（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０９，５７９−５８９）。
【００５２】
１つの実施形態では、本発明を実施するために使用されるリガンドは、プレメッセンジャーＲＮＡプロセシングに関与する細胞性タンパク質のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）ファミリーから選択されるＲＮＡ結合タンパク質である。このようなタンパク質の１つの例が、Ｕ１Ａ ｓｎＲＮＰタンパク質である。ＲＲＭスーパーファミリーの２００を超えるメンバーが、現在までに報告されており、この大半が、偏在的に発現され、そして系統発生的に保存されている（Ｑｕｅｒｙら，Ｃｅｌｌ（１９８９）５７：８９−１０１；Ｋｅｎａｎら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（１９９１）１６：２１４−２２０）。大半が、ポリアデニル化ｍＲＮＡまたは核内低分子リボ核酸（例えば、Ｕ１、Ｕ２など）転移ＲＮＡ、５Ｓ ＲＮＡまたは７Ｓ ＲＮＡに対して結合特異性を有することが公知である。これらとしては、ｈｎＲＮＰタンパク質（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ），ＲＲＭタンパク質ＣＡｒＧ，ＤＴ−７，ＰＴＢ，Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３，ＨｕＤ，ＨＵＣ，ｒｂｐ９，ｅＩＦ４Ｂ，ｓｘｌ，ｔｒａ−２，ＡＵＢＦ，ＡＵＦ，３２ＫＤタンパク質，ＡＳＦ／ＳＦ２，Ｕ２ＡＦ，ＳＣ３５，および他のｈｎＲＮＰタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＲＭファミリーの組織特異的なメンバーは、さほど共通しておらず、これには、ＩＭＰ，Ｂｒｕｎｏ，ＡＺＰ−ＲＲＭＩ，Ｘ１６（これは、プレＢ細胞（ｐｒｅ−Ｂ ｃｅｌｌ）において発現される），Ｂｊ６（これは、パフ特異的なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａタンパク質である）およびＥＬＡＶ／Ｈｕ（これは、ニューロン特異的である）が挙げられる。
【００５３】
本発明の実施において有用なＲＮＡ結合タンパク質およびＲＮＡ関連タンパク質としては、自己免疫患者および癌患者の血清を使用して単離されるタンパク質が挙げられる。本発明の実施において有用なＲＮＡ結合タンパク質およびＲＮＡ関連タンパク質の非包括的なリストを、表１において以下に示す。
【００５４】
【表１】
Figure 0005002105
新たな（すなわち、新規な、以前に知られていない）ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）およびＲＮＡ関連タンパク質の同定が、本発明の別の局面である。従って、本発明の１つの実施形態では、目的のＲＮＡ（「ＲＮＡ Ｙ」として図８に示される）は、新たなＲＢＰまたはＲＡＰを捕捉するための「餌（ｂａｉｔ）」として使用される。好ましい実施形態では、ＲＮＡ Ｙは、標準的な分子生物学的技術を使用して、最初にｃＤＮＡへと変換され、そして引き続き、本発明のリガンド（図８において、タンパク質「Ｘ」として図示されたリガンド）を結合する配列（例えば、ＲＮＡ）をコードするＤＮＡの別のフラグメント（本明細書中では、「タグ化ＤＮＡ」と言及される）に対して３’末端または５’末端で連結される。換言すると、タグ化ＤＮＡは、リガンドの結合パートナーをコードする。有用なリガンドは、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＰ複合体特異的抗体またはタンパク質の産生に関連していることが公知の障害（自己免疫障害および癌を含む）を有している被験体（すなわち、ヒトまたは動物被験体）の血清から（すなわち、血清を使用することによって）獲得され得る。有用な結合パートナーとしては、リガンドに対する抗体が挙げられる。
【００５５】
得られたＤＮＡキメラを、発現ベクター（例えば、プラスミド）中においてプロモーターに融合し、そして生細胞（例えば、細胞培養物中）において発現させて、ＲＮＡ融合分子を生成する。代替的な実施形態では、発現ベクターを、ウイルス（好ましくは、組換えウイルス）によって、細胞中に感染させる。この培養物からの無細胞抽出物を調製し、そして固体支持体に固定されたリガンド（例えば、タンパク質Ｘ）と接触させる。インキュベーション期間の後、このリガンドおよび付着／会合したＲＮＡ融合分子、ならびにその会合ＲＢＰまたはＲＡＰを洗浄して、残留した細胞性物質を除去する。洗浄工程後、ＲＢＰまたはＲＡＰを、ＲＮＡ−タンパク質複合体から取り出し、そして分析する（例えば、微小配列決定の標準的な方法を使用して配列決定する）。
【００５６】
一旦、部分的なタンパク質配列が得られれば、対応する遺伝子は、ｃＤＮＡおよびゲノム配列を含む公知のデータベースから同定され得る。好ましくは、遺伝子が単離され、タンパク質が発現され、そして抗体が、公知の技術を用いて組換えタンパク質に対して作製される。次いでこの抗体を用いて、内因性のＲＢＰまたはＲＡＰを回収し、そして同一性を確認する。続いて、この抗体をリボノミック（ｒｉｂｏｎｏｍｉｃ）分析（以下の実施例を参照のこと）のために使用し、ＲＮＡ Ｙとクラスター化している（すなわち結合している）細胞ＲＮＡのサブセットを決定し得る。さらに、ＲＢＰまたはＲＡＰは、ＲＮＡ Ｙによりコードされるタンパク質の翻訳を調節する能力について試験され得、そして薬物標的としてのバリデーションについて試験され得る。さらに、ＲＮＡ Ｙとクラスター化した細胞ＲＮＡによりコードされるタンパク質は、本明細書中にさらに記載されるように、薬物標的としてのバリデーションについて試験され得る。
【００５７】
したがって、ｍＲＮＰ複合体と特異的に結合する抗体は、本発明の１つの局面である。ｍＲＮＰ複合体に対する抗体は、当該分野で周知の方法を用いて作製され得る。このような抗体として、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーにより生成されるフラグメントが挙げられ得るが、これらに限定されない。抗体およびこれらのフラグメントはまた、抗体ファージ発現提示技術（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｈａｇｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を用いて生成され得る。これは、当該分野において公知である。
【００５８】
抗体の生成のために、ヒツジ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、およびその他を含む種々の宿主が、ｍＲＮＰ複合体もしくは免疫原性の特性を有するこれらの任意のフラグメントまたは構成成分の注射により免疫され得る。宿主の種に基づき、種々のアジュバンドが、免疫応答を増大させるために用いられ得る。このようなアジュバンドとして、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ、無機質ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、および表面活性物質（例えば、リゾレシチン、ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油、エマルジョン、キーホールリンペットヘモシニアン、およびジニトロフェノール）が挙げられるがこれらに限定されない。ヒトにおいて使用されるアジュバンドの中では、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に好ましい。
【００５９】
ｍＲＮＰ複合体の構成成分に対するモノクローナル抗体は、培養物中の継続的な細胞系により抗体分子の生成を提供する任意の技術を用いて調整され得る。これらとしては、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術が挙げられるがこれらに限定されない（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｄ．ら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２；Ｃｏｔｅ，Ｒ．Ｊ．ら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０３０；Ｃｏｌｅ，Ｓ．Ｐ．ら（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６２：１０９−１２０）。詳細には、この手順は次のようなものである：動物を、ｍＲＮＰ複合体もしくはこれらの免疫原性フラグメントまたは接合体を用いて免疫する。次いで、リンパ細胞（例えば、脾臓リンパ球）を、免疫された動物から獲得し、そして不死化細胞（例えば、ミエローマまたはヘテロミエローマ）と融合してハイブリッド細胞を生成する。このハイブリッド細胞をスクリーニングして、所望の抗体を産生する細胞を同定する。
【００６０】
抗体はまた、文献に開示されるように、リンパ球集団におけるインビボでの産生を誘導することによるか、もしくは免疫グロブリンライブラリーまたは高い特異性の結合剤のパネルをスクリーニングすることにより生成され得る（Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，３８３３−３８３７（１９８９）；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９，２９３−２９９（１９９１））。
【００６１】
ｍＲＮＰ複合体に対する特異的な結合部位を含む抗体フラグメントもまた作製され得る。例えば、このようなフラグメントとして、抗体分子のペプシン消化により生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により生成され得るＦａｂフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築されて、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な同定が可能にされ得る（Ｈｕｓｅ，Ｗ．Ｄ．ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２７５−１２８１）。
【００６２】
種々の免疫アッセイが、ｍＲＮＰに対する所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリーニングに用いられ得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体かまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いる競合結合アッセイまたは免疫放射線アッセイのための多くのプロトコルは、当該分野で周知である。代表的にこのような免疫アッセイは、ｍＲＮＰ複合体の構成成分とそれに特異的な抗体との間の複合体形成の測定に関する。２つの非干渉性のエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２つの部位の、モノクローナルベースの免疫アッセイは好ましいが、競合結合アッセイもまた用いられ得る。
【００６３】
キット、もしくは種々のｍＲＮＰ複合体に対する抗体またはこれらの構成成分（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質に対する抗体）がその中に固定されているカラムを含むデバイス（例えば、流体デバイス）は、本発明の別の局面である。この抗体は、公知の技術（例えば、沈降）に基づき、診断アッセイに適切な個体支持体（例えば、ラテックスまたはポリスチレンのような物質から作られたビーズ、プレート、スライド、またはウェル）に結合され得る。同様に抗体は、公知の技術に基づき、検出可能な基（例えば、放射性標識（例えば、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）および蛍光標識（例えば、フルオレセイン）に結合され得る。好ましくは本発明のデバイスは、ｍＲＮＡ結合タンパク質に対する抗体とそのタンパク質自体との間の結合を検出する特異性を有する少なくとも１つの試薬を含む。この試薬はまた、補助的な試薬（例えば、緩衝試薬およびタンパク質安定化試薬（例えば、多糖類）など）を含み得る。このデバイスはさらに、必要な場合は、試験におけるバックグラウンドの干渉を減少させる試薬、制御する試薬、試験を実施するための装置などを含み得る。このデバイスは、試験を実施するための印刷された説明書をともに、単一の容器中に、代表的には多くのエレメントを含み、任意の適切な様式でパッケージされ得る。
【００６４】
本発明の特定の実施形態は、細胞または組織サンプルのリボノミックプロフィールに対する化合物の効果に基づき、治療、診断、または薬学的使用のための試験化合物をスクリーニングする方法に関する。このような実施形態の例として、細胞が試験化合物と接触しない（すなわち、この細胞は処理されない）条件下で細胞を増殖させる。次いでこの細胞型のリボノミックプロフィールが生成され、そしてｍＲＮＡサブセットが同定される。次いで未処理細胞のリボノミックプロフィールを、試験化合物で処理された同じ細胞型のリボノミックプロフィールと比較する。２つのプロフィールの間の任意の相違は、試験化合物が、細胞の特定の遺伝子の発現に対して（直接的にかまたは間接的に）効果を有することの指標であり、そして試験化合物が治療または診断使用のための候補であることの指標であり得る。あるいは、遺伝子発現をもたらす化合物の能力は、その遺伝子をさらなる試験の標的として同定し得る。プロフィールにおける「相違」とは、２つのプロフィールの間の発現における任意の改変または変化をいう。「改変」とは、発現における増加、発現における減少、存在する発現のタイプまたは種類における変化、完全な発現の停止（すなわち、発現の欠失）、または発現の誘因について言及し得る。用いられ得る適切な化合物として、タンパク質、核酸、低分子、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、（化学療法に関する）薬理学的薬剤、発癌性物質、または他の細胞（すなわち、細胞−細胞の接触）、が挙げられるがこれらに限定されない。細胞はまた、正常な遺伝子発現に対する環境的または生理的な因子（例えば、放射線、活動電位、など）の効果についてスクリーニングされ得る。
【００６５】
本発明の別の実施形態において、ｍＲＮＰ構成成分自体、その触媒性もしくは免疫原性フラグメントまたはそれらのオリゴペプチドは、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかによって、化合物のライブラリーをスクリーニングするために用いられ得る。このようなスクリーニングに用いられるフラグメントは、溶液中で遊離しているか、個体支持体に添加されているか、細胞表面に保有されているか、または細胞内に位置し得る。ｍＲＮＰ複合体と試験される化合物との間の結合が測定され得る。
【００６６】
使用され得る薬物スクリーニングのための別の技術は、目的のタンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物の高スループットのスクリーニングを提供する。これについては、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８４／０３５６４に記載される。１つの実施形態において、ｍＲＮＰ複合体に適用されるように、複数の異なる試験化合物が個体基質（例えば、プラスチックピンまたは他のいくつかの表面）上で合成されるか、または個体基質に添付される。この試験化合物は、ｍＲＮＰ複合体もしくはこれらのフラグメントおよび／または構成成分と反応し、そして洗浄される。次いで、結合したｍＲＮＰ複合体またはこれらの構成成分は、当該分野で周知の方法で検出される。
【００６７】
要約すると、本発明は、細胞のリボノミックプロフィールを決定し、そして同一のものにおける変化を検出するための強力なインビボでの方法を提供する。本発明は多くの用途を有する。腫瘍の発達、成長の状態または発達の状態、生物システムの摂動（例えば、疾患）、薬物または毒素処置、および細胞加齢または死の状態のモニタリングが挙げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、生物（例えば、植物、真菌、細菌、ウイルス、原生動物、または動物種）間のリボノミックプロフィールの識別における使用を見出す。
【００６８】
本発明は、転写および遺伝子発現に対する翻訳後の寄与とを識別し、ＲＮＰ複合体を通じたＲＮＡの動き（ＲＮＰ複合体におけるＲＮＡとタンパク質の組み合わせの相互作用を含む）を追跡するために用いられ得る。したがって、本発明は、ＲＮＡの安定性の調節を研究するために用いられ得る。本発明は、活性ポリゾームへの漸増ｍＲＮＡを追跡することにより、ｍＲＮＡの一連の、秩序だてられた発現を測定することにより、および複数のｍＲＮＡの同時の、協調的な発現を測定することにより、単一または複数の種でのｍＲＮＡの翻訳の活性を研究するために用いられ得る。本発明はまた、他の細胞成分と接触したときのＲＮＡ自体のトランス作用性機能を決定するために用いられ得る。これらおよび多くの他の用途は、本発明の明細書および請求の範囲の研究により、当業者に明らかにされる。
【００６９】
次の実施例は、本発明を説明するために示されるのであって、これらの限定と解釈されるべきではない。
【００７０】
（実施例１）
（マルチプローブシステムにおけるＲＮａｓｅ保護：物質および方法）
ｇ１０エピトープタグを用いるＨｕＢ（Ｈｅｌ−Ｎ１）の免疫沈降は、ｍＲＮＡの同時免疫沈降を引き起こし、そしてこのｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増殖し、そして配列決定してＮＦ−Ｍタンパク質をコードすることを見出したことが以前に報告されている（Ａｎｔｉｃ，１９９９，前出）。この実施例において、同じアプローチを拡張し、マルチプローブＲＮａｓｅ保護アッセイに用いて、異なるｍＲＮＡ結合タンパク質を含む種々の内因性ｍＲＮＡタンパク質（ｍＲＮＰ）複合体の免疫沈降を迅速に最適化する。このマルチプローブシステムにおいて、ｍＲＮＰペレット由来の多くのｍＲＮＡは、ポリアクリルアミドゲルの単一のレーンでアッセイされ得る。
【００７１】
（細胞培養および形質転換）
マウスＰ１９胚癌細胞をＡＴＣＣから獲得し、そしてフェノールレッド（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ ４１０６１−０２９）を含まない、７．５％子ウシ血清、２．５％胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１００Ｕペニシリン／ストレプトマイシンを補充したα−ＭＥＭを用いる単層培養で維持した。細胞を組織培養フラスコまたはプレート（０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）でプレコートし、使用前に除去した）で培養した。単層細胞培養物を３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
【００７２】
Ｐ１９細胞を、ＳＶ４０プロモーター駆動のｐＡｌｐｈａ２−ｇｅｎｅ１０−ＨｕＢプラスミドを用いて安定にトランスフェクトした。このプラスミドは、Ｈｅｌ−Ｎ２と命名された、ｇｅｎｅ１０タグ付加された神経特異的ＨｕＢタンパク質を異所的に発現する（Ｇａｏら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，１１２０７−１１２１１）。トランスフェクトしたプラスミドを、０．２ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を加えた培地を補充することにより維持した。これは、Ｈｅｌ−Ｎ１のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）２および３と連結するヒンジ領域から１３のアミノ酸を欠損しているが、ＲＲＭは同一であり、そしてインビトロでの結合実験は、Ｈｅｌ−Ｎ１およびＨｅｌ−Ｎ２のＡＵリッチのＲＮＡ結合特性における差異を示さなかった（Ｇａｏら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，１１２０７−１１２１１；Ａｂｅら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，２０１１−２０１６；公開していない結果）。
【００７３】
（抗体）
モノクローナル抗体−ｇｅｎｅ１０（ｇ１０）抗体を、以前に記載されたように生成した（Ｇａｏら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，１１２０７−１１２１１；Ａｎｔｉｃら（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，４４９−４６１）。ＨｕＡと反応性のポリクローナル血清を、以前に記載されたように生成した（Ｌｅｖｉｎｅら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３，３４９４−３５０４；Ａｔａｓｏｙら（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１１，３１４５−３１５６）。ポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）に反応性の抗体を、親切にもＭｃＧｉｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（カナダ）のＤｒ．Ｎ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇに提供していだだいた。
【００７４】
（無細胞抽出物の調製）
細胞を、ラバースクレイパーを用いて組織培養プレートから回収し、そして冷ＰＢＳで洗浄した。この細胞を、およそ２ペレット容量のポリゾーム溶解緩衝液（ＰＬＢ；１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、および０．５％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＤＴＴ、１００Ｕ／ｍＬ
ＰＮａｓｅ ＯＵＴ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、０．２％バナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍｇ／ｍＬ ペプスタチンＡ、５ｍｇ／ｍＬ ベスタチン、および２０ｍｇ／ｍＬ ロイペプチン（使用時に新鮮なものを添加した）を含む）に懸濁した。次いで、溶解した細胞を凍結して、−１００℃で保存した。使用時に、細胞溶解物を解凍し、そして卓上微量遠心管で１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を回収し、そして卓上微量遠心管で１６，０００ｒｐｍ、４℃で５分間、二度遠心分離してから氷上で保存するかまたは−１００℃で凍結させた。このｍＲＮＰ細胞溶解物は、およそ３０〜５０ｍｇ／ｍｌの総タンパク質を含んでいた。
【００７５】
（免疫沈降）
免疫沈降のために、プロテインＡセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を、５％ウシ血清アルブミンを補充したＮＴ２緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．０５％ ＮＰ−４０）中で１．５ｖ／ｖに膨張させた。１．５ｖ／ｖの予め膨張させたプロテインＡビーズのスラリーのアリコート３００μＬを、免疫沈降反応ごとに用い、そして過剰な免疫沈降抗体（代表的には５〜２０μＬ、試薬に基く）と４℃で一晩インキュベートした。抗体でコーティングされたプロテインＡビーズを、氷冷ＮＴ２緩衝液で５回洗浄し、そして１００Ｕ／ｍＬ ＲＮａｓｅ ＯＵＴ、０．２％ ＶＲＣ、１ｍＭ ＤＴＴ、および２０ｍＭ ＥＤＴＡを補充したＮＴ２緩衝液９００μＬに再懸濁した。このビーズを穏やかにボルテックスし、そして１００μＬのｍＲＮＰ細胞溶解物を加えた。このビーズを直ちに遠心分離し、そして１００μＬの上清を回収し、総ｍＲＮＰ細胞溶解物とした（本質的には、ｍＲＮＰ免疫沈降に用いられた溶解物の量の１／１０である）。免疫沈降反応および総ｍＲＮＰ溶解物を表わすために回収されたアリコートを、０から２時間までの間、室温でタンブルした。インキュベーション後、プロテインＡビーズを、氷冷ＮＴ２緩衝液で４回洗浄した後に、１Ｍ 尿素を補充したＮＴ２緩衝液で２回洗浄した。洗浄されたビーズを、０．１％ＳＤＳおよび３０μｇ プロテイナーゼＫを補充した１００μＬのＮＴ２緩衝液に再懸濁し、そして５５℃の水槽で３０分間インキュベートした。プロテイナーゼＫ消化後、免疫沈降したＲＮＡを、２回のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈殿で単離した。
【００７６】
（ＲＮａｓｅ保護アッセイ）
ｍＲＮＰ複合体を細胞溶解物およびＲＮＡ結合抽出物から免疫沈降した後、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ Ｒｉｂｏｑｕａｎｔアッセイ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、製造者の説明書に従って、ＲＮａｓｅ保護によりアッセイした（４５０１４Ｋ）。詳細には、抽出されたＲＮＡを、Ｌ３２、ＧＡＰＤＨ、種々のマウスＭｙｃ関連タンパク質（テンプレートセット４５３５６Ｐ）およびサイクリン（テンプレートセット４５６２０Ｐ）をコードするｍＲＮＡに特異的なテンプレートから生成された過剰な３２Ｐ−標識リボプローブとハイブリダイズさせた。非二重鎖ＲＮＡを、ＲＮａｓｅＡ＋Ｔ１で処理することにより消化した。生じたフラグメントを、変性ポリアクリルアミド／尿素ゲル電気泳動により分離した。各ｍＲＮＡ種に対するリボプローブの長さは固有の大きさなので、サンプル中のすべての検出可能なｍＲＮＡ種を単一のゲルレーンで分離し得た。保護されたリボプローブフラグメントを、２４時間の露光後にホスホイメージングスクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で可視化した。ホスホイメージを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＳＴＯＲＭ８６０ Ｓｙｓｔｅｍを用いて１００ミクロンの解像度でスキャンし、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖ１．１）を用いて分析した。
【００７７】
（実施例２）
（多重プローブ系におけるＲＮａｓｅ保護：実験結果）
図３は、ｇ１０−ＨｕＢ ｃＤＮＡで安定してトランスフェクトしたマウスＰ１９細胞の抽出物由来のＨｕＢとポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）−ｍＲＮＰ複合体との免疫沈降を示す。ポリクローナルの予め出血させたウサギ血清を用いて（図３Ａおよび３Ｂ、レーン３）か、またはこのアッセイで試験された多数の他のウサギ、マウス、および正常なヒト血清を用いて（データは示されていない）、免疫沈降したペレットにおいて、ｍＲＮＡは検出されなかった。ＨｕＢ ｍＲＮＰ複合体と会合したｍＲＮＡのプロフィールは、ｎ−ｍｙｃ、１−ｍｙｃ、ｂ−ｍｙｃ、ｍａｘおよびｃｙｌｉｎｓ Ａ２、Ｂ１、Ｃ、Ｄ１、およびＤ２を含むが、ｓｉｎ３、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ３、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ２、Ｌ３２またはＧＡＰＤＨ ｍＰＮＡを含まない（図３Ａおよび３Ｂ、レーン４）。対照的に、ＰＡＢＰ−ｍＲＮＰ複合体から抽出されたｍＲＮＡのプロフィールは、総ＲＮＡのプロフィールに類似するが、濃縮したレベルのＬ３２およびＧＡＰＤＨを示し、減少したレベルのｓｉｎ３ ｍＲＮＡを示した（図３Ａおよび３Ｂ、レーン５）。これらの細胞性ＲＮＡ結合タンパク質と反応性の抗体は、ｍＲＮＰ複合体を免疫沈降し、そしてそれらが特異的に会合しているｍＲＮＡを回収するために使用され得ると結論付けられた。これらの結果は、細胞増殖および分化の間に転写後の遺伝子発現を調節する際のＨｕタンパク質の仮定の役割と一貫している（Ｊａｉｎら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７，９５４−９６２；Ｌｅｖｙら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，６４１７−６４２３；ＦｎａおよびＳｔｅｉｔｚ（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７，３４４８−３４６０；Ｐｅｎｇら、（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７，３４６１−３４７０；ＡｎｔｉｃおよびＫｅｅｎｅ（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６１，２７３−２７８；Ｌｅｖｉｎｅら、（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３，３４９４−３５０４；Ｇａｏら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，１１２０７−１１２１１；Ｋｉｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，１９４３−１９５２；Ｌｉｕら、（１９９５）Ｎｕｒｏｌｏｇｙ ４５，５４４−５５０；Ｍａら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、８１４４−８１５１；Ａｂｅら、（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，２０１１−２０１６；Ａｎｔｉｃら、（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，４４９−４６１；Ｃｈｕｎｇら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，６５９３−６５９８；Ａｋａｍａｔｓｕら、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，９８８４−９８９０；Ｓａｃｈｓら、（１９９７）Ｃｅｌｌ ８９，８３１−８３８；Ａｒａｎｄａ−Ａｂｒｅｕら、（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９，６９０７−６９１７）。
【００７８】
（実施例３）
（ｃＤＮＡアレイを使用するＲＮＡ結合タンパク質と一緒に会合したｍＲＮＡサブセットの同定：材料および方法）
内因性ｍＲＮＰ複合体で会合したｍＲＮＡを同定するための能力をさらに拡大するために、この実施例は、増幅または反復性選択なしでｍＲＮＡサブセットを検出するための高度に特異的および感受性の方法としてのｃＤＮＡアレイフィルターの使用を記載する（図４）。
【００７９】
抗体。モノクローナル抗遺伝子１０（ｇ１０）抗体を以前に記載されるように産生した（例えば、Ｄ．Ｔｓａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，８８６４−８８６８（１９９２）；Ｇａｏら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，１１２０７−１１２１１；Ａｎｔｉｃら、（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，４４９−４６１）。Ｈｕタンパク質と反応性のポリクローナル血清を以前に記載されるように産生した（Ｌｅｖｉｎｅら、（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３，３４９４−３５０４；Ａｔａｓｏｙら、（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１１，３１４５−３１５６）。５’キャップ結合タンパク質（ｅｌＦ−４Ｅ）に対する抗体をＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｉｒｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から獲得した。ポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）と反応性の抗体は、ＭｃＧｉｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（カナダ）のＮ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ博士から親切に提供して下さった。
【００８０】
細胞培養物および分化。トランスジェニック細胞の調製を実施例１に記載のようであった。レチノイン酸（ＲＡ）での化学処理を使用して、ＧａｏおよびＫｅｅｎｅ（１９９６）において記載されるように、０．５μＭ ＲＡ（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ，Ｎｕｍｂｅｒ Ｒ２６２５）とともに、６０ｍｍのペトリ皿に静置して（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ、Ｎｕｍｂｅｒ ８−７５７−１３Ａ）、５×１０５Ｐ１９細胞を処理することによって、ニューロンの分化を誘導した。２日後、凝集塊を形成した細胞の２５％を除去し、新しいペトリ皿に配置し、そして、新鮮な培地およびＲＡで補充した。さらに２日後、細胞凝集をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１度洗浄し、そしてトリプシン処理した。次いで、細胞を２つの１００ｍｍのゼラチンコート組織培養プレートに配置した。さらに４日後、細胞を回収した。ＲＡ処理したＨｕＢ（Ｈｅｌ−Ｎ２）で安定してトランスフェクトしたＰ１９細胞は、神経突起を成長し、そして、特徴的なニューロンマーカーおよび形態を示したが、終末分化せず、そして、有糸分裂インヒビターを有する死滅に感受性のままであった。無細胞抽出物および免疫沈降を実施例１に記載のようであった。
【００８１】
ｃＤＮＡアレイ分析。 ｃＤＮＡアレイ分析を、ナイロン膜上に並んで２連にスポットした全５９７ｃＤＮＡセグメントを含むＡｔｌａｓＴＭ Ｍｏｕｓｅ Ａｒｒａｙｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して行なった。ｃＤＮＡアレイのプロービングをＣｌｏｎｔｅｃｈ ＡｔｌａｓＴＭ ｃＤＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙｓ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ（ＰＴ３１４０−１）に記載されるように行なった。手短に言うと、ＨｕＢで安定してトランスフェクトしたＰ１９胚性癌細胞からＲＮＡを抽出し、そして、逆転写プローブを生成するために使用した。アレイ上に示された遺伝子に相補的な、プールしたセットのプライマーを、逆転写プローブ合成のために使用し、これを、３２Ｐα−ｄＡＴＰで放射線標識した。放射線標識プローブをＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮＴＭ−２００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を通過させることによって精製し、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭハイブリダイゼーション溶液（Ｃｈｏｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用してアレイ膜と一晩インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、アレイ膜を洗浄し、そして、ホスホイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）スクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）上で可視化した。
【００８２】
ホスホイメージをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＳＴＯＲＭ ８６０ Ｓｙｓｔｅｍを使用して１００ミクロンの解像度で走査し、そして、ファイルとして保管した。イメージをＡｔｌａｓＩｍａｇｅＴＭ １．０および１．０１ソフトウェア（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して分析した。任意の所定の遺伝子についてのシグナルは、２つの２連のｃＤＮＡスポットからシグナルの平均として計算した。ＡｔｌａｓＩｍａｇｅＴＭ １．０ ソフトウェアマニュアル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）において記載されるように、デフォールト外部バックグラウンド設定を、バックグラウンドベースのシグナル閾値と組み合わせて使用して、遺伝子シグナルの有意性を決定した。遺伝子についてのシグナルは、その調節された強度（全シグナル−バックグラウンド）がそのときのバックグラウンドシグナルの２倍を超える場合、バックグラウンドを有意に超えると考えられた。多重ｃＤＮＡアレイイメージの比較を、アレイ（全体的な正規化（ｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ））上のすべての遺伝子シグナルの平均を使用して行ない、アレイ間のシグナル強度を正規化した。レチノイン酸に応答するＨｕＢ ｍＲＮＰ複合体のｍＲＮＡプロフィールにおける変化は、それらが４倍を超える場合（遺伝子発現変化の有意性を確立するために代表的に使用されるストリンジェンシーの２倍）、有意であると考えられる。ｃＤＮＡアレイ画像およびオーバーレイをＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）５．０．２（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して調製した。
【００８３】
（実施例４）
（ｃＤＮＡアレイを使用するＲＮＡ結合タンパク質と一緒に会合したｍＲＮＡサブセットの同定：実験結果）
結果。 ＨｕｂでトランスフェクトしたＰ１９細胞（トランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ））の全体の遺伝子発現プロフィールを評価した後、ＨｕＢおよびＰＡＢＰｍＲＮＡ複合体、ならびにｅｌｆ−４Ｅ ｍＲＮＰ複合体を別々に免疫沈降し、そして、捕獲されたｍＲＮＡをｃＤＮＡアレイ上で同定した。これらのアレイの最初のアライメントをアレイ膜の底の６つのＤＮＡスポットにハイブリダイズする放射線標識したλファージマーカーとのハイブリダイゼーション反応を加えることによって容易にした。一旦アライメントレジスタが確立されると、引き続くブロットは、配向についての与えられたλマーカーの使用を必要としない。
【００８４】
ウサギの予め出血させた血清での免疫沈降から作製されたアレイを、アレイの底部で観察された与えられたλマーカーを除き、基本的に盲検であった（図５Ａ）。免疫沈降したＨｕＢ ｍＲＮＰおよびｅｌｆ−４Ｅ ｍＲＮＰ複合体は各々、総細胞ＲＮＡにおいて検出される１０％をわずかに超えるｍＲＮＡを含んだが、お互いにかなり異なっていた（図５Ｂ、５Ｃ、および５Ｅ）。
【００８５】
ＨｕＢおよびｅｌＦ−４Ｅのように、ＰＡＢＰは、ｍＲＮＡ安定化および翻訳を容易にすることに関与する（Ｒｏｓｓ（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９，４２３−４５０；Ｒｏｓｓ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２，１７１−１７５；Ｗｉｃｋｅｎｓら、（１９９６）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｈｅｒｓｈｅｙ編、Ｊ．Ｗ．Ｂ，Ｍｔｈｅｗｓ，Ｍ．Ｂ．＆Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，４１１−４５０頁；Ｓａｃｈｓら、（１９９７）Ｃｅｌｌ ８９，８３１−８３８）。驚くことではないが、ＰＡＢＰ ｍＲＮＰは、ＨｕＢまたはｅｌＦ−４Ｅ ｍＲＮＰについて観察されるよりも多数のｍＲＮＡを含んでいた（図５Ｄ）。予想されるように、これらの細胞由来のＰＡＢＰ ｍＲＮＰ中のｍＲＮＡのプロフィールは、トランスクリプトームのプロフィールと密接に類似していた。しかし、ＨｕＢおよびｅｌＦ−４Ｅ ｍＲＮＰにおいて観察されるように、いくつかのｍＲＮＡは、総ＲＮＡと比較してＰＡＢＰ−ｍＲＮＰにおいて濃縮または枯渇されている（図５Ｄおよび５Ｅ）。これらのｍＲＮＰ複合体において検出されるｍＲＮＡのプロフィールおよび相対量は、高度に再現可能であるが、ホスホイメージ上で検出可能なｍＲＮＡ種の絶対数は、プローブの特定の活性における差異の結果として時折変化する。
【００８６】
総ＲＮＡを使用することに由来するｃＤＮＡアレイは、ｍＲＮＰ免疫沈降について使用される溶解物の量の１０分の１を使用して作製されるので、総ＲＮＡにおいて観察されるｍＲＮＰ複合体において検出された各ｍＲＮＡの絶対量の比較は行なわれない。より正確な結果が、各マイクロアレイ内のお互いに対して各ｍＲＮＡ種の相対量を比較することによって獲得された。例えば、β−アクチンおよびリボソーマルタンパク質Ｓ２９（図５、それぞれ、矢印ａおよびｂ）をコードするｍＲＮＡの相対量は総細胞性ＲＮＡにおよそ等しいが、ｍＲＮＰ複合体の各々の間で劇的に変化する。この特徴の多数の他の例は、図４において容易に明らかである。これらの発見は、ＨｕＢ、ｅｌＦ−４Ｅ、およびＰＡＢＰ ｍＲＮＰ複合体において検出されるｍＲＮＡプロフィールが、お互いに別個でありトランスクリプトームのそれとは、離れていることを示す。
【００８７】
（実施例５）
（レチノイン酸（ＲＡ）に応答するｍＲＮＰ複合体における変更）
Ｈｕｂは主に、ニューロンの分化を調節する際に役割を果たすと考えられているニューロンタンパク質であり、ＨｕＢ ｍＲＮＰ複合体において検出されるｍＲＮＡ集団がＲＡ（ニューロンの分化のインデューサー）に応答して変化するか否かを調査するために研究が行なわれた。ＨｕＢでトランスフェクトしたＰ１９細胞をＲＡで処理し、ニューロン分化の開始を誘導し、ＨｕＢ ｍＲＮＰ複合体を免疫沈降し、次いで、会合したｍＲＮＡをｃＤＮＡアレイ上に同定した。ＲＡ処理の前および後にＨｕＢ ｍＲＮＰから抽出されたｍＲＮＡプロフィールの比較は、１８のｍＲＮＡが、ＲＡ処理されたＨｕＢ ｍＲＮＰにおいて排他的に存在するか、または非常に濃縮されている（４倍以上）かのいずれかであるであることを明らかにする（図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃ、赤い棒）。さらに、３つのｍＲＮＡ（Ｔ−リンパ球活性化タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質ＳＡＴＢ１、およびＨＳＰ８４）は、ＲＡ処理に応答して、４倍量以上減少する（図６Ｃ、青い棒）。ＨｕＢ ｍＲＮＡ複合体のｍＲＮＡプロフィールにおいて観察される変化が独特であるか否かを決定するために、遍在的に発現されたＥＬＡＶファミリーメンバーＨｕＡ（ＨｕＲ）を、これらの処理細胞から免疫沈降させた。ＲＡでの処理後にＨｕＡ ｍＲＮＰプロフィールに対する少数の変化が存在するが、それらは、ＨｕＢと比較して大して重要でない。
【００８８】
ＲＡ処理に応答するＨｕＢ−会合ｍＲＮＡプロフィールにおける変化は、単に総細胞性ｍＲＮＡにおける変化を反映するのではない（図６Ｇ、６Ｈ、および６Ｉ）。ＨｕＢ ｍＲＮＰ複合体において検出された差次的に濃縮されたかまたは枯渇したｍＲＮＡの多数のサンプルが、図６Ｃおよび６Ｉを比較して明らかである。比較の目的のために、これは、代表的なスポットの再アライメントおよび拡大によって、図７において記載される。例えば、ＩＧＦ−２ ｍＲＮＡは、ＲＡ処理細胞由来の総ＲＮＡおよびＨｕＢ ｍＲＮＰ複合体のみで検出可能である（図７）。しかし、他のＨｕＢ ｍＲＮＰ結合ｍＲＮＡ（例えば、インテグリンβ、サイクリンＤ２、およびＨｓｐ８４）は、ＲＡ処理後、総ＲＮＡプロフィールにおけるそれらの変化に不釣合いな量で、増加するかまたは減少する（図７）。総ＲＮＡおよびＨｕＢ ｍＲＮＰのｍＲＮＡプロフィールにおける変化間の不同性は、ＲＡ処理に応答するｍＲＮＰ複合体を通って動的に流動するｍＲＮＡの区画化における変化からおそらく生じる。これらのｍＲＮＰ複合体に由来するｍＲＮＡプロフィールが、動的であり、そして成長の状態、ならびに、レチノイン酸のような生物学的インデューサーに応答する細胞性環境における変化を反映し得る。
【００８９】
（実施例６）
（ＲＮＡ−結合タンパク質についての優先度インビボ標的配列優先度）
ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＳＴデータベースを使用して、ＲＡ処理したＨｕＢ−ｍＲＮＰ複合体において濃縮されたｍＲＮＡから、３’ＵＴＲ配列を同定した（表２）。
【００９０】
（表２）
【００９１】
【表２】
Figure 0005002105
その３’ＵＴＲ配列が利用可能なｍＲＮＡの多数は、インビトロでＨｕタンパク質に結合することが以前に見出されているような同様のウリジレートリッチ（ｕｒｉｄｙｌａｔｅ−ｒｉｃｈ）モチーフを含む（Ｌｅｖｉｎｅら、（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３，３４９４−３５０４；Ｇａｏら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，１１２０７−１１２１１：Ｋｉｎｇら、（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，１９４３−１９５２；Ｌｉｕら、（１９９５）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４５，５４４−５５０；Ｍａら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３５６４−３５６９；Ｆａｎら、（１９９７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１１，２５５７−２５６８）。さらに、これらのｍＲＮＡの大部分は、ニューロン組織において発現されるか、またはＲＡで誘導したニューロン分化後に上方制御されることが公知である（Ｂｅｃｋら、（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ １４，７１７−７３０；Ｃｏｌｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓａｎｔ（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１６，３５７−３６８；Ｇｒａｈａｍら、（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１２、２５５−２６４；Ｈｉｒｓｃｈら、（１９９４）Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０１、１０８−１２０；Ｈｕｎｔら、（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１２，４３−５０；Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｔｉｍｍｅｎら、（１９８９）Ｇｅｎｅ ８０、３２５−３３６；Ｋｏｎｄｏら、（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，５７２９−５７３５；Ｋｏｎｉｓｈｉら、（１９９４）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６４９，５３−６１；Ｎｅｕｍａｎら、（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５，３１１−３１８；Ｏｋｕｄａら、（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９，６２３−６３０；Ｓｏｏｓａａｒら、（１９９４）Ｂｒａｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２５，１７６−１８０；Ｔａｋｅｃｈｉら、（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０６，３２３−３２９；Ｔｅｌｆｏｒｄら、（１９９０）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．２７，８１−９２；Ｚｗａｒｔｋｒｉｕｓら、（１９９３）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０５、４２２−４２５；Ｔｏｍａｓｅｌｌｉら、（１９８８）Ｎｅｕｒｏｎ １、３３−４３；Ｒｅｄｉｅｓ（１９９５）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２２０，２４３−２５６；Ｒｏｓｓら（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６．２１０−２１９）。表３に示される配列アライメントは、ＨｕＢについてのコンセンサスＲＮＡ結合配列を誘導するためにインビトロ選択を使用するＬｅｖｉｎｅら、（（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３，２４９４−３５０４）およびＧａｏら、（（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１、１１２０７−１１２１１）の以前の結果と一致している。本明細書中に記載の方法を使用して、他のＲＮＡ結合配列についてのインビボ標的配列優先度を区別することが可能である。
【００９２】
（実施例７）
（ｃＤＮＡアレイ分析を使用する、内因性ｍＲＮＰ複合体を精製するためのそして一緒に会合したｍＲＮＡを同定するためのｍＲＮＡ結合タンパク質の使用）
ハイスループット方法を使用してＨｕｂタンパク質のｍＲＮＡ標的を同定するための初期の試みは、ＲＴ−ＰＣＲ増幅およびインビトロ反復性選択およびニューロン組織由来の同定されたいくつかの構造的に関連したＥＲＧ ｍＲＮＡを必要とする（Ｇａｏら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，１１２０７−１１２１１；ＡｎｄｒｅｗｓおよびＫｅｅｎｅ（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１８，２３３−２４４）。これらのｍＲＮＡの大部分は、それらの３’ＵＴＲにＡＲＥ様配列を含み、これは、ＥＲＧ ｍＲＮＡに特徴的である（Ｋｅｅｎｅ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，５−７；Ｌｅｖｉｎｅら、（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３，３４９４−３５０４；Ｇａｏら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１、１１２０７−１１２１１；Ｋｉｎｇら、（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，１９４３−１９５２）。Ｈｕタンパク質は、ＥＲＧ ｍＲＮＡを結合し得、そして、それらの安定性および／または翻訳活性化に影響し得ることが実証されている（Ｊａｉｎら、（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７、８５４−９６２；Ｌｅｖｙら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，６４１７−６４２３；ＦａｎおよびＳｔｅｉｔｚ（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７、３４４８−３４６０；Ｐｅｎｇら、（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７，３４６１−３４７０；Ｋｅｅｎｅ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，５−７；Ｌｅｖｉｎｅら、（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ Ｂｉｏｌ．１３，３４９４−３５０４；Ｇａｏら、（１９９４）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９１，１１２０７−１１２１１；Ｋｉｎｇら、（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４、１９４３−１９５２；Ｌｉｕら、（１９９５）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ
４５，５４４−５５０；Ｃｈｕｎｇら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、６５９３−６５９８；Ａｎｔｉｃら、（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，４４９−４６１；Ｍａら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５，３５６４−３５６９；Ａｒａｎｄａ−Ａｂｒｅｕら、（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９，６９０７−６９１７）。Ｇａｏら（（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，１１２０７−１１２１１）のインビトロアプローチは、ＥＲＧ配列特徴を有するヒト脳および髄芽腫から別個のｍＲＮＡサブセットを生じた。このより直接的なインビボアプローチは、インビトロ結合およびＰＣＲ増幅についての必要性を取り除く。さらに、この新しいアプローチは、連鎖した構造的および機能的性質を有するｍＲＮＡ転写の同定を可能とするが、それらの多数は、インビトロ技術を使用して検出されない（そして検出され得ない）。さらに、認識可能なＨｕＢタンパク質−ＲＮＡ結合配列は、インビボで捕獲されたｍＲＮＡサブセット内に同定される（表２）。
【００９３】
前述の実施例は、本発明を例示するものであって、それを制限するものとして解釈されるべきではない。本発明は、上記の特許請求の範囲によって記載され、特許請求の範囲の等価物は、そこに含まれるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ゲノムからプロテオームへの遺伝情報の流れ、ならびにリボノームおよびトランスクリプトームによって表される中間体レベルの略図である。トランスクリプトームは、ゲノムの総ｍＲＮＡ相補体を表すが、必ずしもタンパク質産生に直接的に相関しない。ｍＲＮＡのプロセシング、輸送および翻訳は、リボノームで起こり、ここでは、動的な調節工程が、そのプロテオームの結果を決定する。
【図２】 図２は、ｍＲＮＰ複合体内にて結合されリボノームの一部を形成するｍＲＮＡとの、総細胞ｍＲＮＡ（トランスクリプトーム）の比較を図示する。トランスクリプトームに対して比較する場合、ｍＲＮＰ複合体を表すマイクロアレイは、別個でかつより限定されたｍＲＮＡのサブセットを含む。
【図３】 図３Ａおよび３Ｂは、ｍＲＮＰ複合体に会合するｍＲＮＡの、マルチプローブＲＮａｓｅ保護分析を示す。細胞溶解物由来のメッセンジャーＲＮＰ複合体を免疫沈降し、そしてそのペレット化されたＲＮＡを抽出し、そしてＲＮａｓｅ保護によって定量する。図３Ａおよび３Ｂは、それぞれ、ｍＭｙｃおよびｍＣｙｃ−１のマルチプローブテンプレートセットの例を示す。レーン：（１）未消化リボプローブ（リボプローブプラスミドテンプレートに起因するＲＮａｓｅ消化された産物よりもわずかに大きい）；（２）総細胞ＲＮＡ；（３）ウサギ採血前血清コントロール；（４）ＨｕＢ ｍＲＮＰから抽出したｍＲＮＡ；（５）ＰＡＢＰ
ｍＲＮＰから抽出したｍＲＮＡ。アスタリスク（＊）は、総ＲＮＡ中に検出されなかった種のｍＲＮＡを示す。
【図４】 図４は、ＤＮＡアレイを使用するＲＮＡサブセットのリボノームプロファイリングを示す。ＲＮＡ−タンパク質複合体は、２つの個体、種、細胞型、処置、発生段階などの細胞由来であり得る。ｍＲＮＡ−タンパク質複合体を分離し、複合体の免疫沈降を行い、プローブを、ＲＮＡテンプレートから逆転写し、そして遺伝子のＤＮＡアレイを、ＲＮＰ由来のプローブの各プールでプローブして、遺伝子発現のサブプロフィール（１０）を作成する。次いで、サブプロフィールを、差し引きまたは相加によって比較して、遺伝子発現の全体画像（２０）を作成する。この図は、マイクロアレイを使用して、異なるｍＲＮＰを単離し、そしてそれらに会合するｍＲＮＡを同定する、リボノームの概念を示す。総細胞プロフィールのサブプロフィール（ｍＲＮＰ１、ｍＲＮＰ２、．．．．ｍＲＮＰｎ）は、相加物として示される。スタックされたｍＲＮＰサブプロフィールは、各々、単一の細胞型内の個々のｍＲＮＰを表し得るか、または各々、複雑な組織内または腫瘍内の個々の細胞のトランスクリプトームを表し得る。
【図５】 図５は、例示的な実施例４（前出）の結果を示し、そしてｃＤＮＡアレイを使用して、ｍＲＮＰ複合体に会合するｍＲＮＡを示す。パネル：（Ａ）採血前；（Ｂ）ＨｕＢ ｍＲＮＰ複合体；（Ｃ）ｅｌＦ−４Ｅ ｍＲＮＰ複合体；（Ｄ）ＰＡＢＰ ｍＲＮＰ複合体；（Ｅ）総細胞ＲＮＡ。この手順の特異性の例は、これらのｍＲＮＰプロフィール間のβ−アクチンおよびリボソームタンパク質Ｓ２９をコードするｍＲＮＡ（それぞれ、矢印ａおよびｂ）の差次的な量によって示される。このような特異性の他の例は、他のｍＲＮＡで容易に観察可能である（データは示さず）。
【図６】 図６は、例示的な実施例５（前出）の結果を示し、そしてレチノイン酸（ＲＡ）での処置前後のＨｕＢ ｍＲＮＰ由来のｍＲＮＡプロフィールの比較を示す。パネル：（Ａ）未処理細胞から免疫沈降したＨｕＢ ｍＲＮＰから抽出したｍＲＮＡ；（Ｂ）ＲＡ処理した細胞からから免疫沈降したＨｕＢ ｍＲＮＰから抽出したｍＲＮＡ；（Ｃ）パネルＡおよびＢのコンピューターによる比較；（Ｄ）未処理細胞から免疫沈降したＨｕＡ（ＨｕＲ） ｍＲＮＰから抽出したｍＲＮＡ；（Ｅ）ＲＡ処理した細胞から免疫沈降したＨｕＡ ｍＲＮＰから抽出したｍＲＮＡ；（Ｆ）パネルＤおよびＥのコンピューターによる比較；（Ｇ）未処理の細胞溶解物から抽出したｍＲＮＡの総相補体；（Ｈ）ＲＡ処理した細胞溶解物から抽出したｍＲＮＡの総相補体；および（Ｉ）パネルＧおよびＨのコンピューターによる比較。パネルＣ、ＦおよびＩについて：緑色のバーは、ほぼ等しい量のｍＲＮＡを示す；赤色のバーは、ＲＡ処理後に４倍以上で検出可能であったＨｕＢ ｍＲＮＰからのｍＲＮＡを表す；青色のバーは、ＲＡ処理前に４倍以上で検出可能であったＨｕＢ ｍＲＮＰからのｍＲＮＡを表す。
【図７】 図７は、リボノームプロファイリングの図である。
【図８】 図８は、新規のＲＮＡ結合タンパク質の同定のためのストラテジーを概略する図である。
【００９４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING



<110> Ribonomics, Inc.



<120> Methods for isolating and characterizing endogenous mRNA-protein (mRNP) complexes



<130> F102A59F67



<140> JP 2001-549077

<141> 2000-12-28



<150> US 60/173,338

<151> 1999-12-28



<160> 37



<170> PatentIn version 3.1



<210> 1

<211> 37

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of CD44

<400> 1
auuuucuauu ccuuuuuuau uuuaugucau uuuuuua 37


<210> 2

<211> 30

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of IGF-2

<400> 2
uaaaaaacca aauuugauug gcucuaaaca 30


<210> 3

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of IGF-2

<400> 3
uaaagaaauu aauuggcuaa aaacaua 27


<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of IGF-2

<400> 4
cuaaaaauua auuggcuuaa aaa 23


<210> 5

<211> 17

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of HOX 2.5

<400> 5
ucacucuuau uauuuau 17


<210> 6

<211> 16

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of HOX 2.5

<400> 6
aaauuuuauu aaguua 16


<210> 7

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of HOX 2.5

<400> 7
aucagguuca uuuugguugu 20


<210> 8

<211> 13

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of Inhibitor J6

<400> 8
auuuuaucug uua 13


<210> 9

<211> 33

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of Inhibitor J6

<400> 9
uuuuguuuuu cucccuuuuu uaguuuuuuc aaa 33


<210> 10

<211> 32

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of GADD45

<400> 10
uauuuuuuuu cuuuuuuuuu uuuggucuuu au 32


<210> 11

<211> 31

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of GADD45

<400> 11
uuaaauucuc agaaguuuua uuauaaaucu u 31


<210> 12

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of Nexin 1

<400> 12
uucuguuaaa uauuuuuaua uacugcuuuc uuuuuu 36


<210> 13

<211> 33

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of Nexin 1

<400> 13
auuuuauagu aguuuuuaug uuuuuaugga aaa 33


<210> 14

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of Nexin 1

<400> 14
auuugccuuu uuaauucuuu uu 22


<210> 15

<211> 30

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of Egr-1

<400> 15
uauuuugugg uuuuauuuua cuuuguacuu 30


<210> 16

<211> 13

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of Zif 268

<400> 16
uuuuguuuuc cuu 13


<210> 17

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of Neuronal-Cadherin

<400> 17
uuuuuuauuu ucuguauuuu uu 22


<210> 18

<211> 29

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of Neuronal-Cadherin

<400> 18
uuuuuuuuaa auuuuuuuau uuucuuuuu 29


<210> 19

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of Neuronal-Cadherin

<400> 19
uuuuuuauuu ucuguauuuu uu 22


<210> 20

<211> 23

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of Neuronal-Cadherin

<400> 20
uuuuuaauuu uuuaauuuuu uuu 23


<210> 21

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of integrin alpha 5

<400> 21
aaugguuuau auuuaugau 19


<210> 22

<211> 17

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of integrin alpha 5

<400> 22
uuguuuauau cuucaau 17


<210> 23

<211> 16

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of SEF2

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> wherein n at position 14 is a U, G, C orA



<400> 23
uucaagcgcu uganuu 16


<210> 24

<211> 25

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of Cf2r

<400> 24
ugcaucgauc cguugauuua cuacu 25


<210> 25

<211> 26

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of integrin beta

<400> 25
uauaauuuuu aauuuuuuau uauuuu 26


<210> 26

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of integrin beta

<400> 26
uuauuuuacc uuuuuuuuuu uucuuuaauu ccuggu 36


<210> 27

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of CTCF

<400> 27
uuaugaaugu uauauuugu 19


<210> 28

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of CTCF

<400> 28
ucuuaauuuu uucucuuuuu uuucuuu 27


<210> 29

<211> 33

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of TGF beta 2

<400> 29
uuuuuuuuuc cuuuuaauug uaaaugguuc uuu 33


<210> 30

<211> 37

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of TGF beta 2

<400> 30
uuaaugauca uucagauugu auauauuugu uuccuuu 37


<210> 31

<211> 25

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of TGF beta 2

<400> 31
uucaauuuuu uuuauauacu aucuu 25


<210> 32

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of TGF beta 2

<400> 32
uuuuucuuua auugguuuuu uu 22


<210> 33

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of MTP

<400> 33
ugucuugucu gagcauuuau uuucaaa 27


<210> 34

<211> 23

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of MTP

<400> 34
uucucgucuu guuuauuuua caa 23


<210> 35

<211> 32

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of MTP

<400> 35
uauaauaaua guuuauguuu uggauguuug gu 32


<210> 36

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> 3'-UTR sequence of cyclin D2

<400> 36
augucuuguu cuuuguguuu uuaggau 27


<210> 37

<211> 11

<212> RNA

<213> Artificial Sequence



<220>

<223> in vitro consensus sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> nn is UA or GA



<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> nn is UA or AG



<400> 37
nnuuuauuun n 11

Claims (44)

  1. ｍＲＮＡタンパク質（ｍＲＮＰ）複合体を含む細胞において内因性ｍＲＮＡサブセットを同定する方法であって、該方法が、以下：
    （ａ）ｍＲＮＡタンパク質（ｍＲＮＰ）複合体を含む生物学的サンプルを、該ｍＲＮＰ複合体の少なくとも１つの成分を特異的に結合する少なくとも１つのリガンドと接触させる工程；
    （ｂ）該リガンドに対して特異的な結合分子を用いて該リガンドを結合することによって該ｍＲＮＰ複合体を分離する工程であって、ここで該結合分子が固体支持体に付着される、工程；
    （ｃ）該固体支持体から該ｍＲＮＰ複合体を取り外すことによって該ｍＲＮＰ複合体を収集する工程；および
    （ｄ）該ｍＲＮＰ複合体から複数のｍＲＮＡを同定する工程であって、該同定は、該ｍＲＮＡをＰＣＲにより増幅することなく、（ａ）マイクロアレイを用いた検出と組み合わせた逆転写、および（ｂ）ＲＮＡｓｅ保護からなる群より選択されるアッセイを用いて行われ、ここで、該ｍＲＮＡタンパク質（ｍＲＮＰ）複合体は、その単離前に、インビボまたはインサイチュで形成されている、工程
    を包含する、方法。
  2. 前記生物学的サンプルが細胞培養物または細胞抽出物を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記生物学的サンプルが組織全体を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記生物学的サンプルが器官体全体を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記生物学的サンプルが腫瘍を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記生物学的サンプルが腫瘍細胞または腫瘍細胞抽出物を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記生物学的サンプルがニューロンの集団を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記リガンドが抗体である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記リガンドが癌を有する被験体の血清を使用して単離された抗体である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記リガンドが自己免疫障害を有する被験体の血清を使用して単離された抗体である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記結合分子が抗体である、請求項１に記載の方法。
  12. 前記結合分子がプロテインＡ、プロテインＧ、およびストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  13. 前記ｍＲＮＰ複合体の成分が核酸である、請求項１に記載の方法。
  14. 前記ｍＲＮＰ複合体の成分がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  15. 前記ｍＲＮＰ複合体の成分がｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  16. 前記ｍＲＮＰ複合体の成分が成熟ｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  17. 前記ｍＲＮＰ複合体の成分がＲＮＡ結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  18. 前記ｍＲＮＰ複合体の成分がＲＮＡ会合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  19. 前記ＲＮＡ会合タンパク質が前記ｍＲＮＰ複合体と１０−６〜１０−９のＫｄで会合する、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＲＮＡ会合タンパク質が前記ｍＲＮＰ複合体と１０−７〜１０−９のＫｄで会合する、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記ＲＮＡ会合タンパク質が前記ｍＲＮＰ複合体と１０−８〜１０−９のＫｄで会合する、請求項１８に記載の方法。
  22. 前記ｍＲＮＰ複合体の成分が炭水化物、脂質、およびビタミンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  23. 前記ｍＲＮＰ複合体を分離することによって該ｍＲＮＰ内に結合される前記ｍＲＮＡを同定する工程、該ｍＲＮＡのｃＤＮＡを得る工程、次いで該ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  24. 前記複数のｍＲＮＡがマイクロアレイを用いて同定される、請求項１に記載の方法。
  25. 前記マイクロアレイがｃＤＮＡマイクロアレイである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記リガンドが、ＨｕＡ、ＨｕＢ、ＨｕＣおよびＨｕＤからなる群より選択されるＥＬＡＶ／Ｈｕタンパク質である、請求項１に記載の方法。
  27. 前記リガンドが、前記ｍＲＮＰ複合体の少なくとも１つの成分に対して特異的な抗体であり、該ｍＲＮＰ複合体が免疫沈降によって分離される、請求項１に記載の方法。
  28. 前記ｍＲＮＰ複合体を前記リガンドと接触させる前に、該ｍＲＮＰ複合体を架橋させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  29. 前記ｍＲＮＰ複合体を前記リガンドと接触させた後に、該リガンドを該ｍＲＮＰ複合体と架橋させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  30. 前記ｍＲＮＰ複合体を単離するために複数のリガンドが前記生物学的サンプルと接触される、請求項１に記載の方法。
  31. 前記細胞における前記内因性ｍＲＮＡサブセットの前記同定が、複数のｍＲＮＰ複合体のひとまとめの同定を包含する、請求項１に記載の方法。
  32. 前記複数のｍＲＮＡがその同定の前に逆転写される、請求項１に記載の方法。
  33. 前記複数のｍＲＮＡが、既知の核酸配列に対するハイブリダイゼーションによって同定される、請求項１に記載の方法。
  34. 前記複数のｍＲＮＡが各ｍＲＮＡを配列決定することによって同定される、請求項１に記載の方法。
  35. 前記方法が、前記ｍＲＮＡの同定前に、反復性選択を含まない、請求項１に記載の方法。
  36. 前記結合されたｍＲＮＰ複合体の少なくとも１つの成分が、内因性ＲＮＡ結合タンパク質であり、該ｍＲＮＰ複合体に前記抗体が結合する、請求項１に記載の方法。
  37. 前記内因性ＲＮＡ結合タンパク質がポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記ＲＮＡ結合タンパク質が組織特異的である、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記細胞を薬物で処理した後に、内因性ｍＲＮＡサブセットを同定して、前記ｍＲＮＡサブセットにおける変化を同定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  40. 細胞周期、発生事象または加齢の状態の間に、内因性ｍＲＮＡサブセットを同定して前記ｍＲＮＡサブセットにおける変化を同定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  41. 前記細胞が動物細胞または植物細胞である、請求項１に記載の方法。
  42. 前記細胞が病原体に感染している、請求項１に記載の方法。
  43. 前記複数のｍＲＮＡがひとまとめに同定される、請求項１に記載の方法。
  44. 前記複数のｍＲＮＡが総ｍＲＮＡの約１０％を構成する、請求項１に記載の方法。
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