CN117434270A - 一种可携带放射性信号的蛋白质支架及其抗体检测中的应用 - Google Patents

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CN117434270A CN202311164317.4A CN202311164317A CN117434270A CN 117434270 A CN117434270 A CN 117434270A CN 202311164317 A CN202311164317 A CN 202311164317A CN 117434270 A CN117434270 A CN 117434270A
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Abstract

本发明公开了一种可携带放射性信号的蛋白质支架及其抗体检测中的应用。本发明成功找到了可以携带放射性信号的蛋白质支架R12，用于协助部分抗原进行对应抗体的捕获；同时由于其在筛选过程中，既要携带信号又要排除交叉反应的更为苛刻的筛选条件，使其在应用中也将不局限于该方法学，对于只要求排除交叉反应的技术平台也可以直接使用。

Description

一种可携带放射性信号的蛋白质支架及其抗体检测中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种可携带放射性信号的蛋白质支架Ruber12及其在抗体检测中的应用。
背景技术
放射配体法(RBA)检测平台是通过在质粒快速转录翻译过程中添加放射性氨基酸原料(如S35标记的蛋氨酸)从而获得具有放射性的蛋白质抗原，其原位替换氨基酸的原理不改变任何获得的蛋白质空间结构，能够使结果保持很高的特异性。同时其作为一个开放式的技术平台，检测范围宽，灵敏性强，90min即可获得足量的抗原原料，上述特点使得该技术在前沿抗体的捕获中应用广泛。该检测平台的应用前提是待翻译的蛋白质序列自身包含一定的蛋氨酸序列(为保证信号携带效率利于批量检测，一般不少于8个)，用以进行放射性蛋氨酸的替换，但在实际研究过程中发明人发现很多抗原自身不包含蛋氨酸，无法携带放射性信号，不能应用到该方法中进行对应的抗体的捕获，使得RBA的应用受到一定的局限。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种可携带放射性信号的蛋白质支架，其氨基酸序列如下：
IKNILQPGSVDSQTEMVLVNAVYFKGMWEKAFKDEDTQAMPFRMTEQESTPVQMMYQVGSFKVAEMASEKMKILELPYASGELSMLVLLPDDVSGLEEIENAITFEKLTEWTSSSIMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMALGMTDLF。
本发明的目的之二是提供上述蛋白质支架在制备抗体检测产品中的应用。
进一步地，所述抗体检测产品适用于放射配体法。
更进一步地，所述蛋白质支架基因序列与抗原基因序列连接后，经转录翻译可获得携带放射性信号的抗原蛋白，用于放射配体法检测抗体。
本发明的目的之三是提供一种抗嗜乳蛋白3A1抗体的检测试剂盒，包括放射性抗原蛋白AR12A，所述放射性抗原蛋白AR12A是采用S35-蛋氨酸对抗原蛋白AR12A进行标记后得到，所述抗原蛋白AR12A的基因序列包括上述蛋白质支架的基因序列及两段抗嗜乳蛋白3A1的基因序列。
在本发明的一个实施例中，将目的基因(两段BTN3A1基因通过铰链基因连接到12号蛋白质支架R12两端)导入载体pTnTTM Vector构建得到AR12A质粒，然后通过快速转录翻译质粒，获得放射性标记的抗原蛋白。具体地，质粒结构包括：XhoI(ctcgag)+kozak序列(gccacc)+ATG+目的序列+终止密码子+XbaI。转录翻译后获得的每个放射性抗原蛋白AR12A包含两个BTN3A1蛋白抗原结构域，中间通过铰链蛋白连接，其携带放射性信号的能力得到了有效的翻倍，且两个抗原结构域使捕获抗体的能力也大为提高。
进一步地，所述检测试剂盒还包括TBST缓冲液，蛋白A琼脂糖，蛋白G琼脂糖，阳性对照和阴性对照。
本发明成功找到了可以携带放射性信号的蛋白质支架R12，用于协助部分抗原进行对应抗体的捕获；同时由于其在筛选过程中，既要携带信号又要排除交叉反应的更为苛刻的筛选条件，使其在应用中也将不局限于该方法学，对于只要求排除交叉反应的技术平台也可以直接使用。
附图说明
图1为GTEx数据库和Tiger数据库中对56个人体组织及人胰岛的表达谱分析结果。
图2为GEO数据库及nPOD数据库对BTN3A1基因表达量的分析结果。
图3为1～18号待选蛋白质支架的质粒转录效率结果。
图4为抗原蛋白AR12A的模式图。
图5为不同模拟样本添加量下BTN3A1A检测的放射读数结果。
图6为健康人群RBA BTN3A1A界值判定结果。
图7为BTN3A1A在T1DM患者、DM(非T1DM)患者及健康人群中的分布。
图8为RBA BTN3A1A检测竞争性抑制实验结果。
具体实施方式
为了解决在RBA检测中抗原存在无法携带放射性信号的问题，发明人设计找寻一些与人类种属关系较远的来源于珍稀动物的富含蛋氨酸的基因序列，转录翻译后可作为支架蛋白，同时满足1)携带放射性信号和2)连接抗原的特性，利用该支架携带的放射性信号，使抗原可以应用到RBA中，对相应的抗体进行捕获。
发明人通过基因库上千个基因的筛查，找到了43个不同动物来源的富含蛋氨酸的基因序列，随后对蛋氨酸序列含量进行了计算，排除了25个含量较低的序列；然后对剩下的18个进行质粒合成，通过实验验证：(1)验证这18个支架的转录翻译效率；(2)验证健康人血清的交叉反应(因支架蛋白与人类部分食物中的蛋白质可能存在同源性，为避免因食物过敏引起的人类血清中的抗体与检测中应用的支架蛋白可能存在的非特异性结合，将通过与正常人血清的反应来排除可能存在这一问题的支架蛋白)；(3)验证代谢病人血清的交叉反应(因代谢病人体内的微环境与正常人不同，可能会存在一些影响检测特异性的代谢分子，这里也将进一步排除可能受这种微环境干扰的支架蛋白)。
在实验中剔除了转录翻译失败以及有交叉反应的序列，剩下的一个基因序列来自加勒比海红鹳(Phoenicopterus ruber)，基因名N337_12018，富含蛋氨酸，将其作为支架蛋白，命名为R12，并将其应用到新抗体的捕获中。
为了验证筛选出的蛋白质支架R12的有效性，进一步将其运用到抗嗜乳蛋白BTN3A1(Butyrophilin3A1，BTN3A1)抗体的检测中。发明人在前期的GWAS研究中发现BTN3A1与糖尿病相关，提示糖尿病患者可能存在针对该蛋白质的抗体，目前尚未有针对BTN3A1自身抗体的RBA检测方法。通过对BTN3A1蛋白的结构评估，发现其蛋氨酸含量极低，目的抗原的序列中仅包含4个蛋氨酸，用其自身携带放射性信号的话将不足以满足检测的需要。因此引入了用于携带放射性信号的蛋白质支架，协助进行该抗体的检测。具体地，将目的基因序列通过铰链基因连接到蛋白质支架R12的两侧，构建出相应的质粒，转录翻译后获得的放射性抗原蛋白可有效的携带放射性信号，且每个蛋白均包含两个一样抗原结构域，捕获抗体的能力也将直接翻倍。
具体实验方法包括：
1.基因筛选：在基因库中通过对上千个潜在的基因序列不断筛选比较，最终确定18个与人类种属关系较远的来源于珍稀动物的富含蛋氨酸的基因序列，作为待选的蛋白质支架序列。
2.构建质粒：将筛选的18个基因序列插入载体pTnTTM Vector，构建获得18个质粒。
3.转录翻译质粒：运用发明人实验室已有的放射配体法(RBA)检测平台，体外快速转录翻译质粒，获得18个放射性蛋白，剔除转录翻译效率极低的7个质粒，剩余11个待选蛋白质支架序列及对应的放射性蛋白。
4.支架蛋白与正常人血清的交叉反应：因支架蛋白与人类部分食物中的蛋白质可能存在同源性，为避免因食物过敏引起的人类血清中的抗体与检测中应用的支架蛋白可能存在的非特异性结合，发明人设计通过与正常人血清的反应来排除可能存在这一问题的支架蛋白。将剩余的11个待选放射性蛋白与正常人的血清共孵育，反复洗涤去除未结合的放射性蛋白，读取余下复合物的放射性强度，排除掉7个与正常人血清存在一定交叉反应的支架蛋白。
5.支架蛋白与代谢病人血清的交叉反应：因代谢病人体内的微环境与正常人不同，可能会存在一些影响检测特异性的代谢分子，这里发明人将进一步排除可能受这种微环境干扰的支架蛋白。将上述4中剩余的4个支架蛋白，按上述实验流程分别与代谢病人的血清样本孵育，排除掉3个与代谢病人血清存在一定交叉反应的支架蛋白。12号因转录翻译效率较高，背景低，因此初步选用12号(Ruber12，R12)作为拟采用的携带放射性信号的蛋白质支架，协助后续抗原进行对应抗体的捕获。
6.蛋白质支架R12在抗嗜乳脂蛋白3A1(BTN3A1)抗体(BTN3A1A)检测中的应用
a、构建质粒：构建同时包含一段蛋白质支架R12基因序列及两段BTN3A1基因序列的质粒BTN3A1R12BTN3A1(AR12A)。
b、运用发明人实验室已有的放射配体法(RBA)检测平台，体外快速转录翻译质粒，获得对应的放射性抗原蛋白AR12A。将直接购买的商业抗体BTN3A1A作为模拟样本与转录翻译获得的放射性抗原蛋白AR12A反应结合，鉴定AR12A蛋白及实验流程的有效性及携带放射性信号的效率。
c、将待测样品与放射性抗原蛋白AR12A反应结合，经过充分的洗涤，除去未结合的放射性抗原，读取余下抗原抗体复合物的放射性强度，计算出样品中抗体的含量指数。统计比较不同样本类型BTN3A1A检测结果的差异。
d、选择部分阳性样本，与购买的商业无放射性信号的抗原蛋白进行竞争性抑制实验，验证结果的真实性。
基于以上实验的寻找及验证，本发明成功找到了可以携带放射性信号的蛋白质支架R12，用于协助部分抗原进行对应抗体的捕获；同时由于其在筛选过程中，既要携带信号又要排除交叉反应的更为苛刻的筛选条件，使其在应用中也将不局限于该方法学，对于只要求排除交叉反应的技术平台也可以直接使用。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所采用的实验材料如下：
1.样本来源：BTN3A1A检测阳性质控来自于购买的的商品化抗体。阴性质控血清标本取自于无糖尿病家族史的健康志愿者。糖尿病人(DM)血清中，1型糖尿病人(T1DM)血清643例，非1型的DM(非T1DM)404例。健康人382例来自招募人群[年龄(33.5±5.3)岁；男190例，女192例]；糖耐量检测(OGTT)空腹及2h血糖正常,排除心、脑、肝、肾等慢性及内分泌疾病，无糖尿病家族病史及自身免疫疾病史。
2.主要试剂及仪器：TNT SP6快速转录翻译试剂盒(L2080，Promega)；S35-蛋氨酸(NEG709A 5mCi,PerkinElmer)；蛋白A琼脂糖PA(17-5280-02，GE)；蛋白G琼脂糖PG(17061805，GE)；96孔PVDF平板(3504，Corning)；Microscint-20闪烁液(6013621，PerkinElmer)；TBST缓冲液(Tris-Base 2.424g，NaCl 8.70g，Tween-20 1.5mL，BSA 1.0g加蒸馏水定容至至1000mL，pH7.4)；βCounter液体闪烁计数仪(2450Microplate Counter，Perkin-Elmer)；蛋白纯化柱NAP Column(17-0853-02，GE)；BTN3A1(Ag18414，proteintech)；BTN3A1A(25221-1-AP，proteintech)；质粒载体pTnTTM Vector(L5610，Promega)。
实施例1
在GTEx(Genotype-Tissue Expression)数据库和Tiger(Tumor ImmunotherapyGene Expression Resource)数据库中对56个人体组织及人胰岛的表达谱分析发现，BTN3A1基因作为广谱表达的基因，在胰岛及胰腺组织中表达丰度较高，如图1所示。
在GEO(Gene Expression Omnibus)数据库分析发现非新发T1D患者外周血中BTN3A1基因表达下降，如图2中左图所示(NTID为新发1型糖尿病、nonNTID为非新发1型糖尿病)；在糖尿病胰脏捐献者数据库(the Network for Pancreatic Donors with Diabetes，nPOD)中分析发现，T1DM患者胰岛β细胞单细胞测序中该基因的表达量显著上调，如图2中右图所示(AAB为自身抗体阳性未发病人群样本)。
进一步生信表位预测分析表明该基因所编码蛋白包含多个潜在的胰岛抗原特异性表位多肽，提示该基因编码蛋白是潜在的胰岛特异性自身抗原，如表1。
表1 HLA-A0201限制性的表位多肽列表
allele seq_num start end length peptide score percentile_rank
HLA-A*02:01 5 11 19 9 ALAGTLPVL 0.872816 0.05
HLA-A*02:01 1 2 10 9 KMASFLAFL 0.744097 0.11
HLA-A*02:01 4 20 28 9 GLYAVAASV 0.702861 0.13
HLA-A*02:01 9 5 13 9 FLDVSFSEA 0.664453 0.15
HLA-A*02:01 8 32 40 9 KLPKPPKKV 0.544369 0.24
因此推测1型糖尿病患者中可能存在针对BTN3A1的胰岛特异性自身抗体。
实施例1支架的筛选
1.质粒构建方案
按照哺乳蛋白表达体系进行密码子优化后(避开两个酶切位点)构建在质粒载体pTnTTM Vector(L5610，Promega)上，包含kozak序列，XhoI、XbaI酶切位点，目的序列。
质粒结构包括：XhoI(ctcgag)+kozak序列(gccacc)+ATG+目的序列+终止密码子+XbaI。
将18个待选的来源于珍稀动物的蛋白质支架序列作为目的序列插入上述载体中，构建出相应的18个质粒。
1-18号待选蛋白质支架氨基酸序列如下：
1号：N306_04127
AIYFKGMWQKAFKDEDTQEVPFRMTEQQSKPVQMMYQTGSFKVAVVASEKMKILAL PYASGQLSLLVMLPDDVSGLKQLESAITSEKLIEWTSPSMMEERKIKVYLPRMKIEEKYNLT SVLMALGITDLFSPSANLSGISSAESLKMSQA(SEQ ID NO.1)
2号：N334_07249
IKNILQPGSVDPQTEMVLVNAVYFKGMWEKAFKDEDTQAVPFRMTEQESKPVQMMY QIGSFKVAVMASEKIKILELPYASGELSMLVLLPDDVSGLEQLETAITLDKLTEWTSSNAMEERKMKVYLPRMKIEKKYNLTSVLIALGMTDLF(SEQ ID NO.2)
3号：N326_09826
IKNILQPGSVDPQTEMILVNAIYFKGVWEKAFKDEDTQAVPFRMTEQESKPVQMMYQ FGSFKVAAMAAEKMKILELPYASGALSMLVLLPDDVSGLEQLESAITFEKLMEWTSSNMM EEKKIKVYLPRMKMEEKYNFTSVLMALGMTDLF(SEQ ID NO.3)
4号：N309_12713
IRNMFLPGTVNSQSEMVLANAVSFKGMWENAFKDEDTQELPFRVSEQESKPVQMMY QVGSFRVATLAAEKVKILELPYSSRLLSMLVLVPDSIADMEQLEAIISHEKLNEWTSPNVME RKTVKVYFPRMKLGEKYNLTSAFISMGMTDVL(SEQ ID NO.4)
5号：SERPINB14(EMU)
ITEQESKPVQMMYQAGSFKVATVAAEKMKILELPYASGELSMFVLLPDDISGLEQLETT ISIEKLSEWTSSNMMEDRKMKVYLPHMKIEEKYNLTSVLVALGMTDLFSPSANLSGISTAQTLKMSEAIHGAYVEIYEAGSEMATSTGVLV(SEQ ID NO.5)
6号：N301_12937
IKNILQPGSVDSQTEMVLVNAIYFKGMWEKAFKDEDTQTVPFRMTEQETKPVQMMY QIGTFKVAVMPSEKMKILELPYASGELCMLVMLPDDVSGLEELESSITVEKLMEWTSSNMM EERKMKVFLPRMKIEEKYNLTSVLMALGMTDLF(SEQ ID NO.6)
7号：AS28_15041
PVQMMYQIGSYKVAVIASEKMKILELPYASGELSMLVLLPDDVSGLEQLETAITFEKLM EWTSSNMMEERKVKVYLPRMKIEEKYNLTSVLMALGMTDLFSPSANLSGISSAESLKMSEAIHEAFVEIYEAGSEVVGSTEAGMEVTSVSE(SEQ ID NO.7)
8号：N334_07249
IKNILQPGSVDPQTEMVLVNAVYFKGMWEKAFKDEDTQAVPFRMTEQESKPVQMMY QIGSFKVAVMASEKIKILELPYASGELSMLVLLPDDVSGLEQLETAITLDKLTEWTSSNAMEERKMKVYLPRMKIEKKYNLTSVLIALGMTDLF(SEQ ID NO.8)
9号：N332_13903
IKNILQPSSVNPQTEMVLVNAIYLKGMWEKAFKDEDTQTMPFRVTQQESKPVQMMYQ IGSFKVAVIASEKMKILELPYTSGQLSMLVLLPDDVSGLEQVESAITAEKLMEWTSPSIMEERTMKVYLPRMKMVEKYNLTSVLMALGMTDLF(SEQ ID NO.9)
10号：N324_12318
IKNILQPSSVDPQTEMVLVNAIYFKGMWQKAFKDEDTQAVPFRISEQESKPVQMMYQI GSFKVAVMAAEKMKILELPYASGELSMLVLLPDEVSGLEQLENAITVEKLMEWTSSSPMEERIMKVYLPRMKIEEKYNLTSVLMALGITDLF(SEQ ID NO.10)
11号：N321_14342
AIYFKGMWQRAFKEEDTQAVPFRISEKESKPVQMMYQIGSFKVAVIPSEKIKILELPYAS GLLSMLVILPDDVSGLEQLENAITLEKLMQWTSSNMMEERKIKVYLPRMRMEEKYNLTSVFMALGITDLFSSSANLSGISSAESLKMSDA(SEQ ID NO.11)
12号：N337_12018
IKNILQPGSVDSQTEMVLVNAVYFKGMWEKAFKDEDTQAMPFRMTEQESTPVQMMY QVGSFKVAEMASEKMKILELPYASGELSMLVLLPDDVSGLEEIENAITFEKLTEWTSSSIMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMALGMTDLF(SEQ ID NO.12)
13号：N338_08254
IKNILKPSSVDSQTEMVLVNAIYFKGLWEKAFKDEDTQAMPFRITEQESKPVQMMYQI GSFKVAEMAAEKMKILELPYASGELSMLVLLPDDVSSLEQIETAITFEKLTEWTSSSVMEERKMKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMALGVTDLF(SEQ ID NO.13)
14号：AS27_14686
PVQMMYQIGSYKVAVIASEKMKILELPYASRELSMLVLLPDDVSGLEQLETAITFEKLM EWTSSNMMEERKVKVYLPRMKIEEKYNLTSVLMALGMTDLFSPSANLSGISSAESLKMSEAVHEAFVEIYEAGSEVVGSTGAGMEVTSVSE(SEQ ID NO.14)
15号：N327_05653
IKNILQPGSVDPQTEMVLVNAIYFKGMWEKAFKDEDTQAVPFRMTEQESKTVQMMY QIGSFKVAVMASEKMKILELPYASGELSMLVMLPDDVSGLEQLETAITFEKLMEWTSSNMM EERKMKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMALGVTDLF(SEQ ID NO.15)
16号：Anapl_17064
VDSQTTMVLVNAIYFKGMWEKAFKDEDTQAMPFRMTEQESKPVQMMYQVGSFKVAMVTSEKMKILELPFASGMMSMFVLLPDEVSGLEQLESTISFEKLTEWTSSTMMEERRMKVYLPRMKMEEKYNLTSVFMALGMTDLFSSSANMSGI(SEQ ID NO.16)
17号：N312_13708
IKNILQPGSVDPQTQMVLVNAIYFKGVWEKAFKDEDTQAVPFRMTKQESKPVQMMYQIGSFKVAVMASEKMKILELPYASGQLSMLVMLPDDVSGLEQIENAITFEKLMEWTNPNMMEERKMKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMALGMTDLF(SEQ ID NO.17)
18号：N306_04127
AIYFKGMWQKAFKDEDTQEVPFRMTEQQSKPVQMMYQTGSFKVAVVASEKMKILALPYASGQLSLLVMLPDDVSGLKQLESAITSEKLIEWTSPSMMEERKIKVYLPRMKIEEKYNLTSVLMALGITDLFSPSANLSGISSAESLKMSQA(SEQ ID NO.18)。
2.转录翻译蛋白
S35-蛋氨酸和TNT SP6混合液解冻后置于冰上，依次加入40μL TNT混合液、1μL(1μg/μL)构建的质粒和5μL S35-蛋氨酸，用4μL无核酸酶水补充至总反应体系为50μL，充分混匀后置于30℃水浴箱孵育90min，随后取出置于冰上准备过NAP-5柱。
取出1只NAP-5柱置于试管架上，将其上下盖子均打开，弃去平衡液后加入1mL的TBST缓冲液平衡NAP-5柱，洗脱3次。将反应混合物小心加在NAP-5柱填充物表面，再用100μL的缓冲液清洗反应管后仍将其加入NAP-5柱中，待红色液体缓慢下移至柱2/3后，加入500μL缓冲液,仔细观察柱下液滴的颜色变化，收集红色过柱液约500μL，从中取出2μL过柱抗原于闪烁管中与1mL闪烁液混匀，置96孔βCounter闪烁计数仪上计数其每分钟脉冲数(countsperminute,CPM)值，低于8000CMP则认为转录翻译效率较低。
3.待测样本与抗原的结合与检测
每孔各加5μL样本血清或模拟样本，每个标本和质控血清均为双复孔，取适量标记蛋白，用6mL TBST缓冲液稀释标记蛋白至20000CPM/60μL，向其中每孔加60μL稀释后标记蛋白，每孔CPM值要求≥20000，标记蛋白与血清室温混匀振荡1小时，4℃冰箱中过夜。孵育PVDF板，150μL TBST/孔，4℃冰箱中过夜。次日，倒去PVDF板中的液体，每孔中加25μL的蛋白A/G混合琼脂糖(62.5％的PA与20％的PG按4:1配制)，依次从96孔平板各孔中取出50μL混合液转移至96孔PVDF过滤板上，4℃冰箱中混匀1h沉淀抗原-抗体复合物后取出，真空泵抽吸去液体，先向PVDF过滤板各孔中加200μL TBST缓冲液洗涤沉淀物，真空泵抽吸去液体留取沉淀物，再加150μL缓冲液重复洗涤7次，置于烘箱烘干后每孔加入60μL闪烁液，置96孔βCounter计数仪上计数，每孔计数1min。
按下式计算放射指数：
放射指数(Index)＝(标本血清CPM－阴性质控CPM)/(阳性质控CPM－阴性质控CPM)。
所有数据均采用SPASS26软件进行统计，对所有计量资料符合正态分布的以用均数±标准差表示，采用单因素方差分析、方差分析趋势性检验等。P<0.05为差异显著，具有统计学意义。
4.实验结果
4.1 1～18号待选蛋白质支架的质粒转录效率
S35-蛋氨酸和TNT SP6混合液解冻后置于冰上，依次加入40μL TNT混合液、1μL(1μg/μL)构建的1-18号蛋白质支架质粒和5μL S35-蛋氨酸，用4μL无核酸酶水补充至总反应体系为50μL，充分混匀后置于30℃水浴箱孵育90min，随后取出置于冰上准备过NAP-5柱，按上述方法学检测2μL转录效率。
如图3所示，1、4、11、14、15、16、18号蛋白质支架，因转录效率较低(<8000CPM)，不利于后续批量检测被排除。余下的支架蛋白将用于下一步实验。
4.2支架蛋白与正常人的交叉反应
因支架蛋白可能与人类部分食物中的蛋白质有同源性，为避免因食物过敏引起的人类血清中的抗体与检测中应用的支架蛋白可能存在的非特异性结合，设计通过与正常人血清的反应来排除可能存在这一问题的支架蛋白。将转录翻译后获得的2、3、5、6、7、8、9、10、12、13、17号支架蛋白，按上述实验流程分别与正常人的血清110例样本孵育，洗涤，除去未结合的抗原蛋白，检测CPM值。在没有交叉反应的正常样本中数据分布较为集中，离散度不高，这里将统计各组样本的变异系数，CV<30％，则认为样本离散度较为适中，数据较为集中，可进入下一步与代谢异常病人血清的交叉反应的检测。
表2支架蛋白与正常人血清反应的变异系数
以上结果显示2、5、6、7、8、9、13号蛋白质支架，因CV大于30％，数据变异较大，将被排除进入下一步的实验。
4.3支架蛋白与代谢病病人的交叉反应
因代谢病人体内的微环境与正常人不同，可能会存在一些影响检测特异性的代谢分子，这里将进一步排除可能受这种微环境干扰的支架蛋白。将转录翻译后获得的3、10、12、17号支架蛋白，按上述实验流程分别与代谢病人非TDM130例的血清样本孵育，洗涤，除去未结合的抗原蛋白，检测CPM值。在没有交叉反应的样本中数据分布较为集中，离散度不高，这里我们将统计各组样本的变异系数，CV<30％，则认为样本离散度较为适中，数据较为集中，可进入下一步的实验。
表3支架蛋白与代谢病人血清反应的变异系数
以上结果显示3、10、17号蛋白质支架，CV大于30％，数据变异较大，且整体均值也偏大表明背景过高，将被排除下一步的应用。因此选用12号支架(R12)应用到后续的实验中。
实施例2
支架R12在抗体BTN3A1A捕获中的应用
1.质粒构建方案
按照哺乳蛋白表达体系进行密码子优化后(避开两个酶切位点)构建在质粒载体pTnTTM Vector(L5610，Promega)上，包含kozak序列，XhoI、XbaI酶切位点，目的序列。
质粒结构包括：XhoI(ctcgag)+kozak序列(gccacc)+ATG+目的序列+终止密码子+XbaI。
将两段BTN3A1基因通过铰链基因连接到12号蛋白质支架R12两端，将序列插入上述载体中构建出相应的质粒。转录翻译后获得的每个放射性抗原蛋白AR12A包含两个BTN3A1蛋白抗原结构域，中间通过铰链蛋白连接(如图4所示)；其携带放射性信号的能力得到了有效的翻倍，且两个抗原结构域使捕获抗体的能力也大为提高。
抗原蛋白AR12A目的序列如下(其中PKPSTPPGSSGGGS为铰链序列)：
LLGGAGYFLWQQQEEKKTQFRKKKREQELREMAWSTMKQEQSTRVKLLEELRWRSIQYASRGERHSAYNEWKKALFKPADVILDPKTANPILLVSEDQRSVQRAKEPQDLPDNPERFNWHYCVLGCESFISGRHYWEVEVGDRKEWHIGVCSKNVQRKGWVKMTPENGFWTMGLTDGNKYRTLTEPRTNLKLPKPPKKVGVFLDYETGDISFYNAVDGSHIHTFLDVSFSEALYPVFRILTLEPTALTICPAPKPSTPPGSSGGGSIKNILQPGSVDSQTEMVLVNAVYFKGMWEKAFKDEDTQAMPFRMTEQESTPVQMMYQVGSFKVAEMASEKMKILELPYASGELSMLVLLPDDVSGLEEIENAITFEKLTEWTSSSIMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMALGMTDLFPKPSTPPGSSGGGSLLGGAGYFLWQQQEEKKTQFRKKKREQELREMAWSTMKQEQSTRVKLLEELRWRSIQYASRGERHSAYNEWKKALFKPADVILDPKTANPILLVSEDQRSVQRAKEPQDLPDNPERFNWHYCVLGCESFISGRHYWEVEVGDRKEWHIGVCSKNVQRKGWVKMTPENGFWTMGLTDGNKYRTLTEPRTNLKLPKPPKKVGVFLDYETGDISFYNAVDGSHIHTFLDVSFSEALYPVFRILTLEPTALTICPA(SEQ ID NO.19)。
2.转录翻译蛋白
S35-蛋氨酸和TNT SP6混合液解冻后置于冰上，依次加入40μL TNT混合液、1μL(1μg/μL)构建的质粒和5μL S35-蛋氨酸，用4μL无核酸酶水补充至总反应体系为50μL，充分混匀后置于30℃水浴箱孵育90min，随后取出置于冰上准备过NAP-5柱。
取出1只NAP-5柱置于试管架上，将其上下盖子均打开，弃去平衡液后加入1mL的TBST缓冲液平衡NAP-5柱，洗脱3次。将反应混合物小心加在NAP-5柱填充物表面，再用100μL的缓冲液清洗反应管后仍将其加入NAP-5柱中，待红色液体缓慢下移至柱2/3后，加入500μL缓冲液,仔细观察柱下液滴的颜色变化，收集红色过柱液约500μL，从中取出2μL过柱抗原于闪烁管中与1mL闪烁液混匀，置96孔βCounter闪烁计数仪上计数其每分钟脉冲数(countsperminute，CPM)值，低于8000CMP则认为转录翻译效率较低。
3.待测样本与抗原的结合与检测
每孔各加5μL样本血清或模拟样本，每个标本和质控血清均为双复孔，取适量标记抗原，用6mL TBST缓冲液稀释标记抗原至20000CPM/60μL，向其中每孔加60μL稀释后标记抗原，每孔CPM值要求≥20000，标记抗原与血清室温混匀振荡1小时，4℃冰箱中过夜。孵育PVDF板，150μL TBST/孔，4℃冰箱中过夜。次日，倒去PVDF板中的液体，每孔中加25μL的蛋白A/G混合琼脂糖(62.5％的PA与20％的PG按4:1配制)，依次从96孔平板各孔中取出50μL混合液转移至96孔PVDF过滤板上，4℃冰箱中混匀1h沉淀抗原-抗体复合物后取出，真空泵抽吸去液体，先向PVDF过滤板各孔中加200μL TBST缓冲液洗涤沉淀物，真空泵抽吸去液体留取沉淀物，再加150μL缓冲液重复洗涤7次，置于烘箱烘干后每孔加入60μL闪烁液，置96孔βCounter计数仪上计数，每孔计数1min。
按下式计算放射指数：
放射指数(Index)＝(标本血清CPM－阴性质控CPM)/(阳性质控CPM－阴性质控CPM)。
所有数据均采用SPASS26软件进行统计，对所有计量资料符合正态分布的以用均数±标准差表示，采用单因素方差分析、方差分析趋势性检验等。P<0.05为差异显著，具有统计学意义。
4.实验结果
4.1放射性抗原蛋白AR12A捕获抗体BTN3A1A的有效性判断
转录翻译AR12A质粒，获得对应的带有放射性信号的抗原AR12A。将购买的对应的商业抗体BTN3A1A作为模拟样本，使用转录翻译的放射性AR12A抗原进行捕获，根据上述实验方法，检测不同模拟样本量下的放射读数。
如图5所示，BTN3A1A放射性读数CPM随着模拟样本加样量的递减而递减，经过方差分析趋势性检验P<0.0001，趋势性极显著。因此转录翻译的抗原AR12A具有生物活性可有效捕获抗体，其携带的放射信号随着抗体含量的变化而变化。
后续实验中使用购买的抗体作为阳参，根据信噪比(S/N)>15(S/N：不同抗体添加量的CPM值/阴参的CPM值)以及成本综合考虑，选用0.6ug RPS26A抗体，CPM约5178作为阳参的加样量，如表3；0.078ug抗体BTN3A1A，CPM约7744作为阳参的加样量，如表4。
表4不同RPS26A添加量下信噪比(S/N)
4.2RBA检测BTN3A1A的健康人界值判定
取192例健康人血清进行放射性配体法检测BTN3A1A，计算放射指数，取99％百分位点为界值，经计算RBA BTN3A1A阳性界值为0.073，阳性判断标准为≥0.073，如图6所示。
4.3RBA检测BTN3A1A的批内批间差异
根据BTN3A1A指数低、中、高选择3份血清在批内和批间各重复检测5次(n＝5)，批内和批间变异系数(coefficient of variance，CV)。结果显示RBA BTN3A1A检测指数的批内CV为4.60％～8.58％，批间CV为7.63％～10.08％，阴阳性结果判断重复性100％。结果见表5。
表5RBA检测BTN3A1A的批内批间差异
4.4BTN3A1A在不同人群中的分布
检测BTN3A1A分别在T1DM、DM(非T1DM)及健康人群中的百分比，分别为2.17％(7/323)、9.16％(37/404)及1.05％(2/190)，经单因素方差分析P<0.01，差异显著。如图7所示。
4.4BTN3A1A阳性样本的竞争性抑制
取BTN3A1A阳性的样本12例，在检测中每孔加入对应的2μg购买的无放射性信号的商业BTN3A1蛋白，进行竞争性抑制实验。如图8所示，加入BTN3A1蛋白后，抗体的放射指数下降至阴性范围。因此RBA BTN3A1A检测可有效识别真实BTN3A1A抗体。
由以上结果可知，本发明设计的蛋白质支架Ruber12可以有效携带放射性信号。通过Ruber12的协助成功的建立了RBA法对BTN3A1A的检测。

Claims (4)

1.蛋白质支架在制备抗体检测产品中的应用，所述蛋白质支架的氨基酸序列如下所示：
IKNILQPGSVDSQTEMVLVNAVYFKGMWEKAFKDEDTQAMPFRMTEQESTPVQMMYQVGSFKVAEMASEKMKILELPYASGELSMLVLLPDDVSGLEEIENAITFEKLTEWTSSSIMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMALGMTDLF。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗体检测产品用于放射配体法。
3.蛋白质支架在制备抗嗜乳蛋白3A1抗体检测试剂盒中的应用，其特征在于：所述检测试剂盒包括放射性抗原蛋白AR12A，放射性抗原蛋白AR12A是采用S35-蛋氨酸对抗原蛋白AR12A进行标记后得到，所述抗原蛋白AR12A的基因序列包含所述蛋白质支架的基因序列和BTN3A1的基因序列；
所述蛋白质支架的氨基酸序列如下：
IKNILQPGSVDSQTEMVLVNAVYFKGMWEKAFKDEDTQAMPFRMTEQESTPVQMMYQVGSFKVAEMASEKMKILELPYASGELSMLVLLPDDVSGLEEIENAITFEKLTEWTSSSIMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMALGMTDLF。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述检测试剂盒还包括TBST缓冲液，蛋白A琼脂糖，蛋白G琼脂糖，阳性对照和阴性对照。
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