CN113552372A - 一种用于saa检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于SAA检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒的制备方法,包括步骤:S1,配制基础溶液;S2对清洗后的所述磁微粒进行活化,并将活化后的所述磁微粒与所述SAA抗体1进行偶联,得磁微粒与SAA抗体1的结合物;对所述磁微粒与SAA抗体1的结合物用所述磁微粒封闭液进行封闭处理,得所述磁微粒偶联SAA抗体1;S3将吖啶酯和所述SAA抗体2按预设时长进行混合;对所述吖啶酯和SAA抗体2的结合物用所述赖氨酸封闭液进行封闭处理后进行脱盐处理,得所述吖啶酯标记SAA抗体2。本发明能够提高检测的准确度和灵敏度低、避免发生钩状效应、降低检测结果受到的干扰、且操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂盒,尤其涉及一种用于血清淀粉样蛋白A检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒及其制备方法。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(human serum amyloid A,SAA)是 1976 年从血清中被分离鉴定出的一类高度保守的急性期蛋白家族成员,也是一种存在于血浆中的脂结合蛋白,相对分子质量约 12000。血清 SAA 是一种敏感的急性期反应蛋白。正常时人体内的SAA主要来源于肝细胞,血清中含量较少,参考范围≤10 mg/L。性别和个体内生理变化没有显著地影响,会随年龄增长有升高。当机体受到细菌、支原体等抗原刺激后,在 IL-1、IL-6 和 TNF等细胞因子的刺激下,肝脏中巨噬细胞、纤维母细胞合成大量 SAA 并释放入血液中,使血液中 SAA 的浓度在 4~6 h 内迅速增加 100 至 1000 倍,半衰期为50min,当机体抗原清除后则迅速降低至正常水平。由于感染性疾病的早期血清 SAA的水平与炎症程度密切相关,故血清中 SAA 可作为感染性疾病的早期诊断的敏感指标,有助于感染性疾病的诊断,疾病活动性和预后的监测。目前为止,共发现 4 种蛋白亚型,其中 SAA1 和 SAA2 蛋白结构 93% 一致,在炎症的急性期显著上调;SAA3 为假基因,不能转录和表达蛋白;SAA4 蛋白不参与急性炎症反应。研究表明,SAA 还与高密度脂蛋白有关,它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢;其降解产物能以淀粉样蛋白 A 原纤维的方式沉积在不同的器官中,在慢性炎症疾病中产生严重的并发症。
同时,有大量报道认为血清 SAA 水平可以作为评估和预测冠心病病情严重程度的敏感标志物。近年来的研究结果表明:SAA在细菌、病毒感染,慢性炎性(类风湿性关节炎、糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病),肿瘤等疾病中均有升高,与传统的感染标志物外周血白细胞计数(peripheral bloodwhite blood cell count,WBC)和 C 反应蛋白(C-re-active protein,CRP)相 比,SAA 的优势在于病毒感染期灵敏度高,升高时间较其他标志物早,而且升高幅度大,尤其对“正常”与微小急性相反应可提供更好的鉴别。通常约2/3感冒患者SAA升高,但少于1/2的患者相同表现CRP升高。在病毒感染病例中,SAA和CRP浓度升高见于腺病毒感染者。SAA和CRP的反应形式在急性感染的恢复阶段是平行的,这同时适用于细菌和病毒感染。因此在感染早期,SAA联合CRP检测,能提高鉴别细菌或病毒感染的可靠性。
为了对SAA进行检测,目前用于检测SAA的方法主要有免疫比浊法和酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。但是,免疫比浊法有灵敏度低、高浓度样本易发生钩状效应(HOOK效应)、检测结果易受血脂浓度的影响,若血脂含量过高,可致待测样品含量假性升高、同时少量小抗原抗体复合物极难形成浊度,可致假阴性等缺陷;酶联免疫吸附法则操作步骤繁琐、反应时间较长。
鉴于此,有必要提供一种用于血清淀粉样蛋白A检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒及其制备方法和应用,以解决或至少缓解上述准确度和灵敏度低、易发生钩状效应、检测结果易受干扰、操作繁琐等技术缺陷。
发明内容
本发明的主要目的是提供了,旨在解决上述准确度和灵敏度低、易发生钩状效应、检测结果易受干扰、操作繁琐的技术问题。
为实现上述目的,本发明提供了一种用于SAA检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒的制备方法,包括步骤:
S1,配制基础溶液,所述基础溶液包括磁微粒封闭液和赖氨酸封闭液;
其中,所述磁微粒封闭液包括:PBS 98%~99.8%(v/v)、BSA 1%~10%(g/ml)、海藻糖0.2%~1%(g/ml)、吐温20 0.1%~1%(v/v);
所述赖氨酸封闭液包括:赖氨酸10~15mg/ml、PBS 98%~99.8%(v/v)、吐温20 0.1%~1%(v/v)、BSA 0.1%~1%(v/v);
S2,配制磁微粒偶联SAA抗体1;所述磁微粒偶联SAA抗体1的配制过程包括:对所述磁微粒进行清洗,然后对清洗后的所述磁微粒进行活化,并将活化后的所述磁微粒与所述SAA抗体1进行偶联,得磁微粒与SAA抗体1的结合物;对所述磁微粒与SAA抗体1的结合物用所述磁微粒封闭液进行封闭处理,然后对所述磁微粒与SAA抗体1的结合物进行清洗,得所述磁微粒偶联SAA抗体1;
S3,配制吖啶酯标记SAA抗体2;所述吖啶酯标记SAA抗体2的配制过程包括:将吖啶酯和所述SAA抗体2按预设时长进行混合,得吖啶酯和SAA抗体2的结合物;对所述吖啶酯和SAA抗体2的结合物用所述赖氨酸封闭液进行封闭处理,然后对所述吖啶酯和SAA抗体2的结合物进行脱盐处理,得所述吖啶酯标记SAA抗体2。
进一步地,所述基础溶液还包括磁微粒清洗液,所述磁微粒清洗液包括:0.02M 十二烷基磺酸钠、0.02M MES缓冲液。
进一步地,在所述步骤S2中,所述对清洗后的所述磁微粒进行活化包括步骤:
S21,将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入至一份MES缓冲液中,得1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液;将N-羟基琥珀酰亚胺加入至另一份MES缓冲液中,得N-羟基琥珀酰亚胺溶液;
S22,将清洗后的所述磁微粒和所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、以及所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液进行预设时长的混合,并在混合后对所述磁微粒进行洗涤,得活化后的所述磁微粒。
进一步地,所述基础溶液还包括磁微粒保存液;
所述磁微粒保存液包括:PBS 60%~80%(v/v);新生牛血清10%~30%(v/v);甘油 10%~20%(v/v);Proclin300 0.01%~0.1%(v/v);吐温20 0.01%~0.1%(v/v);
所述步骤S2还包括:将所述磁微粒偶联SAA抗体1用所述磁微粒保存液进行清洗和保存,得待用的所述磁微粒偶联SAA抗体1。
进一步地,所述基础溶液还包括吖啶酯保存液;
所述吖啶酯保存液包括:PBS 70%~90%(v/v);甘油 10%~30%(v/v);BSA 1%~2%(v/v);Proclin300 0.01%~0.1%(v/v);
所述步骤S3还包括:将所述吖啶酯标记SAA抗体2用所述吖啶酯保存液进行保存,得待用的所述吖啶酯保存液。
进一步地,在所述步骤S3中,所述脱盐处理包括:采用G-25凝胶柱去除未标记在所述SAA抗体2上的物质。
本发明还提供了一种磁微粒化学发光免疫试剂盒,采用如上述任意一项所述磁微粒化学发光免疫试剂盒的制备方法进行制备。
进一步地,所述磁微粒化学发光免疫试剂盒包括待用的磁微粒偶联SAA抗体1和待用的吖啶酯标记SAA抗体2;
其中,所述待用的磁微粒偶联SAA抗体1包括:PBS 60%~80%(v/v);新生牛血清10%~30%(v/v);甘油 10%~20%(v/v);Proclin300 0.01%~0.1%(v/v);吐温20 0.01%~0.1%(v/v)、SAA抗体1 2-4μg/ml、磁微粒100~300μg/ml;
所述待用的吖啶酯标记SAA抗体2包括:PBS 70%~90%(v/v);甘油 10%~30%(v/v);BSA 1%~2%(v/v);Proclin300 0.01%~0.1%(v/v);SAA抗体2 6~10μg/ml;吖啶酯0.1~0.5μg/ml。
进一步地,所述磁微粒化学发光免疫试剂盒还包括SAA校准品、样品处理液、洗涤液、底物液。
进一步地,所述SAA校准品包括:SAA抗原、PBS 90%~92%(v/v)、新生牛血清8%~10%(v/v)、BSA 0.1%~1%(g/ml)、明胶 0.1%~0.3%(g/ml)、Proclin300 0.1%~0.2% (v/v)、海藻糖 2%~4%(g/ml)。
进一步地,所述样品处理液包括:含有0.01%~0.1% Proclin300(v/v)的PBS。
进一步地,所述洗涤液包括:0.02M 2-(N-吗啉代)乙磺酸、Proclin300 0.01%~0.1%(v/v)、吐温20 0.2~0.4%(v/v)、NaCl 0.5~0.9%(g/ml)。
进一步地,所述底物液由激发液A和激发液B组成;所述激发液A包括:0.1M HNO3、0.08M H2O2;所述激发液B包括:2% Triton X-100、0.2M NaOH。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明提供了一种用于血清淀粉样蛋白A检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒及其制备方法,通过对各类试剂的进行成分和比例上的改进,并结合吖啶酯发光免疫分析技术,制备了一种灵敏度和准确度高、精密度好、操作简单的血清淀粉样蛋白A(SAA)试剂盒,所述磁微粒化学发光免疫试剂盒还具有优秀的抗血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰能力,且在300ng/ml高浓度样本下,未出现明显的HOOK效应。
另外,采用本发明中的磁微粒化学发光免疫试剂盒,在准确度方面,相对偏差不超过±10%;在重复性方面,测试高低两个浓度样本,所得结果的变异系数(CV)不大于5%;在批间差方面,测试高低两个浓度样本,所得结果的批间变异系数(CV)不大于10%;而且,采用所述磁微粒化学发光免疫试剂盒,空白限不大于3μg/mL;线性范围在3μg/mL~200μg/mL的测量范围内,试剂的相关系数应≥0.9900。
具体实施方式
下面将对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式,而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式,都属于本发明保护的范围。
需要说明,本发明实施方式中所有方向性指示(诸如上、下……)仅用于解释在某一特定姿态下各部件之间的相对位置关系、运动情况等,如果该特定姿态发生改变时,则该方向性指示也相应地随之改变。
另外,在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。
并且,本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合,但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础,当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在,也不在本发明要求的保护范围之内。
本领域技术人员应当知道的是,在液态试剂的配制过程中,加入的固态物质有时会对总体积会造成一定的影响,因此,本领域中的各液态成分的体积百分数的总和可以出现略小于100%的情况;另外,在微量液态组分的添加过程中,通常可以将其加入其他各液态成分的混合液中,且微量液态组分对总体积的影响微乎其微,因此,本领域中还可以出现各液态成分的体积百分数的总和略大于100%的情况,以上情况均属于本领域试剂配制过程中的正常情况,本发明中各物质的实际添加量只需按照相应比例计算得出后进行相应的添加即可。另外,本发明中的(v/v)可以理解为体积比,(g/ml)等可以理解为固液比。
为获得一种重复性好、准确度高、操作简单的SAA检测试剂盒,本发明提供了一种用于SAA检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒的制备方法,包括步骤:
S1,配制基础溶液,所述基础溶液包括磁微粒封闭液和赖氨酸封闭液;
其中,所述磁微粒封闭液可以包括:0.01M PBS 98%~99.8%(v/v)、BSA 1%~10%(g/ml)、海藻糖 0.2%~1%(g/ml)、吐温20 0.1%~1%(v/v);应当注意的是,所述磁微粒封闭液中需加入海藻糖,研究表明海藻糖封闭液可以在不影响反应体系敏感性的前提下,抑制体系中的非特异性吸附;更重要的是,海藻糖封闭液有效保护抗体的活性,提高抗体的稳定性的作用。
所述赖氨酸封闭液可以包括:赖氨酸10~15mg/ml、0.01M PBS 98%~99.8%(v/v)、吐温20 0.1%~1%(v/v)、BSA 0.1%~1%(g/ml);应当注意的是,在所述赖氨酸封闭液中,吐温20为去污剂,有抗原修复作用,对非特异性吸附有很强的洗脱作用,同时可以降低蛋白质间的疏水作用,可提高特异性抗体的识别能力。BSA为蛋白稳定剂,由于抗体与吖啶酯连接的健不稳定而发生断裂,加入BSA能保持健的稳定性。
需知道的是,通常情况下,由于需要对磁微粒进行清洗、以及后续需要对成品试剂进行保存,所述基础溶液还可以包括磁微粒清洗液、磁微粒保存液、以及吖啶酯保存液。
所述磁微粒清洗液主要用于对磁微粒进行清洗,所述磁微粒清洗液可以包括:0.02M 十二烷基磺酸钠、0.02M MES缓冲液。
所述磁微粒保存液可以包括:0.01M PBS 60%~80%(v/v);新生牛血清10%~30%(v/v);甘油 10%~20%(v/v);Proclin300 0.01%~0.1%(v/v);吐温20 0.01%~0.1%(v/v)。
所述吖啶酯保存液可以包括:0.01M PBS 70%~90%(v/v);甘油 10%~30%(v/v);BSA1%~2%(v/v);Proclin300 0.01%~0.1%(v/v)。应当注意的是,由于吖啶酯在一般缓冲液中不稳定、易水解,造成试剂不稳定,甘油与BSA能起到保护蛋白稳定、减少非特异性吸附的作用,Proclin300为防腐剂。
另外,所述基础溶液的配制还可以包括所述SAA检测试剂盒中的常用试剂的配制,如SAA校准品、样本处理液、洗涤液、以及底物液,此类试剂的配制可以参照后续的SAA试剂盒中的各试剂组分进行配制。
S2,配制磁微粒偶联SAA抗体1;所述磁微粒偶联SAA抗体1的配制过程包括:对所述磁微粒进行清洗,然后对清洗后的所述磁微粒进行活化,并将活化后的所述磁微粒与所述SAA抗体1进行偶联,得磁微粒与SAA抗体1的结合物;对所述磁微粒与SAA抗体1的结合物用所述磁微粒封闭液进行封闭处理,然后对所述磁微粒与SAA抗体1的结合物进行清洗,得所述磁微粒偶联SAA抗体1;最后将所述磁微粒偶联SAA抗体1用所述磁微粒保存液进行清洗和保存,得待用的所述磁微粒偶联SAA抗体1。
为了提高抗体偶联效率,所述对清洗后的所述磁微粒进行活化包括:
S21,将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入至一份MES缓冲液(pH 5.5)中,得1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液;将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入至另一份MES缓冲液(pH 5.5)中,得N-羟基琥珀酰亚胺溶液;
S22,将清洗后的所述磁微粒和所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、以及所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液进行预设时长的混合,并在混合后对所述磁微粒用MES缓冲液(pH 5.5)进行洗涤,得活化后的所述磁微粒。
在上述活化的过程中,本发明采用MES缓冲液(pH 5.5)+EDC+NHS活化。本发明所用磁微粒为赛默飞M-270羧基磁微粒。EDC在酸性条件下活化效果更好,在低pH时交联剂EDC与羧酸形成的中间体不稳定,容易分解,但pH值过高时,部分不稳定中间物水解可能会释放出EDC或者使半稳定的氨基反应活性中间物的产量减少从而造成蛋白质与中间物的取代反应速度下降,使蛋白质偶联量下降。EDC先与羧基反应,生成活性中间体,中间体再与NHS反应生成NHS酯中间体,在有氨基存在的条件下,氨基与活性酯生成酰胺键结构。NHS酯中间体比EDC中间体稳定性更高,因此NHS可延长羧基中间体的活性时间,提高抗体偶联效率,节约成本,间接提高检测的灵敏度。
所述步骤S2具体可以为:取磁微粒100~300μl(30mg/ml),用磁微粒清洗液清洗磁微粒后,加入磁微粒活化液A、B各50~150μl对磁微粒进行活化,搅拌活化20~40min,活化后的磁微粒再次使用磁微粒清洗液进行清洗;清洗完成后加入SAA抗体1 60~120μg,20℃~30℃充分震荡反应2~3h;反应完成后,用磁微粒封闭液清洗两次后,再次加入磁微粒封闭液进行封闭,震荡封闭20~30min,磁吸去上清;用磁微粒保存液清洗两次后,加入一定体积磁微粒保存液中保存。其中,所述磁微粒活化液A可以为所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液,所述磁微粒活化液A主要组成可以为:50 mg/ml EDC·HCl ;0.02M MES。所述磁微粒活化液B可以为所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液,所述磁微粒活化液B主要组成可以为:50 mg/ml NHS;0.02M MES。
S3,配制吖啶酯标记SAA抗体2;所述吖啶酯标记抗体的配制过程包括:将吖啶酯和所述SAA抗体2按预设时长进行混合,得吖啶酯和SAA抗体2的结合物;对所述吖啶酯和SAA抗体2的结合物用所述赖氨酸封闭液进行封闭处理,然后对所述吖啶酯和SAA抗体2的结合物进行脱盐处理,得所述吖啶酯标记SAA抗体2;最后将所述吖啶酯标记SAA抗体2用所述吖啶酯保存液进行保存,得待用的所述吖啶酯保存液。
优选地,所述脱盐处理包括:采用G-25凝胶柱去除未标记在所述SAA抗体2上的小分子物质。相比之下,常规透析工艺用时长、需要大体积的透析液、透析袋有易破、抗体失活风险增大等缺陷,本发明采用脱盐柱脱盐的方式去除未标定抗体的残余吖啶酯等小分子物质,脱盐柱具有用时短、脱盐柱可重复使用、操作简单、回收率高的优势。
所述步骤S3具体可以为,其中吖啶酯标记抗体的方法优选为:取SAA抗体2 200~400μg,按摩尔比1:5~1:20加入吖啶酯,补加CB缓冲液至2mg/ml,20℃~30℃恒温震荡反应2~3h;反应结束后,加入赖氨酸封闭液,其中,吖啶酯:赖氨酸的物质的量之比可以为1:100~1:200,然后震荡反应封闭20~40min;封闭结束后,用G-25凝胶柱进行脱盐,并收集纯化后样品,补加同体积甘油待用;使用时用吖啶酯保存液稀释至抗体浓度为6~10μg/ml。其中,所述CB缓冲液可以为0.01M 碳酸盐缓冲液。其中,脱盐洗脱时所用的洗脱缓冲液可以为0.01M磷酸缓冲液。
本发明还提供了一种磁微粒化学发光免疫试剂盒,采用如上述任意实施方式所述的磁微粒化学发光免疫试剂盒的制备方法进行制备。
具体地,所述磁微粒化学发光免疫试剂盒包括待用的磁微粒偶联SAA抗体1和待用的吖啶酯标记SAA抗体2。需知道的是,所述待用的磁微粒偶联SAA抗体1中主要含有所述磁微粒保存液中的物质和所述磁微粒偶联SAA抗体1,所述待用的吖啶酯标记SAA抗体2中主要含有吖啶酯保存液中的物质和所述吖啶酯标记SAA抗体2,由于吖啶酯标记SAA抗体2中的SAA抗体2和吖啶酯的浓度更加直观,因此,下述待用的吖啶酯标记SAA抗体2中将SAA抗体2和吖啶酯的浓度分别体现。
所述待用的磁微粒偶联SAA抗体1包括:PBS 60%~80%(v/v);新生牛血清10%~30%(v/v);甘油 10%~20%(v/v);Proclin300 0.01%~0.1%(v/v);吐温20 0.01%~0.1%(v/v)、SAA抗体1 2~4μg/ml、磁微粒 100~300μg/ml;
所述待用的吖啶酯标记SAA抗体2包括:PBS 70%~90%(v/v);甘油 10%~30%(v/v);BSA 1%~2%(v/v);Proclin300 0.01%~0.1%(v/v);SAA抗体2 6~10μg/ml;吖啶酯0.1~0.5μg/ml。
可选地,所述磁微粒化学发光免疫试剂盒还可以包括样品处理液、SAA校准品、洗涤液、底物液。
其中,所述样品处理液包括:含有0.01%~0.1% Proclin300(v/v)的PBS;,其中,配制时,PBS采用0.01M的PBS。
所述SAA校准品包括:SAA抗原、PBS 90%~92%(v/v)、新生牛血清8%~10%(v/v)、BSA0.1%~1%(g/ml)、明胶 0.1%~0.3%(g/ml)、Proclin300 0.1~0.2%(v/v)、海藻糖 2%~4%(g/ml);所述SAA校准品可以进行冷冻干燥后待用。
为了使所述SAA校准品具有多种SAA抗原浓度,可以在配置时对多份SAA校准品进行不同SAA抗原比例的添加;也可以在对所述SAA校准品复溶时,将所述SAA校准品复溶并稀释成多种SAA抗原浓度。需知道的是,所述SAA校准品为产品校准品,用于校准终端用户常规测量程序。
所述洗涤液主要是用于样本检测过程中的清洗,所述洗涤液可以包括:0.02M 2-(N-吗啉代)乙磺酸、Proclin300 0.01%~0.1%(v/v)、吐温20 0.2~0.4%(v/v)、NaCl 0.5~0.9%(g/ml)。
所述底物液可以由激发液A和激发液B组成;激发液A:0.1M HNO3、0.08M H2O2;激发液B:2% Triton X-100、0.2M NaOH。
所述磁微粒化学发光免疫试剂盒具体性能指标如下:
1、准确度:测试企业参考品控制品,相对偏差不超过±10%。
2、空白限:不大于3μg/mL。
3、线性范围:在3μg/mL ~200μg/mL的测量范围内,试剂的相关系数应≥0.9900。
4、重复性:测试高低两个浓度样本,所得结果的变异系数(CV)应不大于5%。
5、批间差:测试高低两个浓度样本,所得结果的批间变异系数(CV)应不大于10%。
需注意的是,所述磁微粒化学发光免疫试剂盒所检测的样本类型优选为血清、血浆,其他样本类型不适用与本发明中的所述磁微粒化学发光免疫试剂盒,所取血浆采用的抗凝方式优选为EDTA或肝素抗凝管。另外,所述磁微粒化学发光免疫试剂盒可以用于体外定量检测人血浆或血清中的血清淀粉样蛋白A(SAA)的含量,临床上主要作为一种非特异性炎症指标。
应当知道的是,所述磁微粒化学发光免疫试剂盒基于磁微粒化学发光技术,并利用SAA抗体检测人血清、血浆样本中抗原的浓度。具体检测过程可以包括:将待测样本由样本针加样,样本中的待测物与磁微粒偶联的抗体(磁微粒偶联SAA抗体1)形成复合物,使用清洗液洗掉未与SAA抗体1结合的游离物质,加入吖啶酯标记的抗体(吖啶酯标记SAA抗体2),37℃下孵育一段时间,加入全自动免疫检测系统用底物液,在全自动免疫检测系统用底物液的作用下,吖啶酯被氧化,氧化过程发出光子,发出的光子量与结合吖啶酯的量,即与待测物的量成正正相关关系。
本发明的产品在应用时,采用双抗体夹心化学发光免疫分析法与磁微粒分离技术相结合的检测方法。试剂中两种SAA单克隆抗体分别被磁珠、吖啶酯标记,可与样本中的分析物反应形成吖啶酯标记SAA抗体2-SAA抗原-磁珠结合的SAA抗体1的双抗体夹心复合物,然后加载磁场使复合物吸附在反应容器内,使用清洗液洗去游离物质,最后再加入全自动免疫检测系统用底物液,复合物中的吖啶酯在全自动免疫检测系统用底物液作用下产生化学发光,其相对发光值(RLU)在一定范围内与复合物浓度成正比,通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的SAA含量。
作为对上述实施方式的延伸说明,本领域普通技术人员应当理解的是,化学发光免疫分析法是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合,用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。应用于临床检验的化学发光体系有多种,最主要的有鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、螺旋金刚烷-1,2-二氧乙烷及其衍生物和电化学发光体系等。
吖啶酯的发光原理:在碱性H2O2溶液中,吖啶酯的分子受到过氧化氢离子进攻时,吖啶环上的取代基能与吖啶环上的C-9和H2O2(过氧化氢)形成不稳定的二氧乙烷,此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物在有H2O2的稀碱性溶液中即能发光,不需要催化剂,发光系统简单。同时这类化合物的发光为闪光型,加入发光启动试剂后0.4s左右发射光强度即达到最大,半衰期为0.9s左右,非常省时。基于上述特点,为增强吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物的化学发光强度,有些在发光启动试剂中加入Triton X-100、CTAC、Tween-20(吐温-20)等表面活性剂。
相比鲁米诺发光体系,吖啶酯类具有如下的优点:
1.吖啶酯发光系统简单,不需要催化剂。
在碱性条件下,吖啶酯分子受到过氧化氢攻击可生成二氧乙烷,二氧乙烷不稳定而分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮,当其回到基态时发出波长为430nm的光,不需要催化剂,发光系统简单。
2.吖啶酯发光效率高且强度大。
吖啶酯化学发光为闪光型,在化学发光免疫分析领域与其它技术相比具有优势,吖啶酯化学发光在加入启动剂0.4s后发射光强度达到最大,半衰期为0.9s,2s内发光基本结束,可以实现快速检测,吖啶酯具有较高的量子产率,其化学发光效率较高,通常是鲁米诺的五倍或五倍以上。
3.吖啶酯发光体系的干扰因素少,本底极低,信噪比很高。
吖啶酯类化合物从发光的机理来说的特点是发光反应中在形成电子激发态中间体之前,联结于吖啶环上的不发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来,即未发光部分与发光部分分离,因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。此外,吖啶酯分子量小,易与蛋白质通过化学键牢固联结(即为标记),对联结后的抗体构象影响小(进而保证了其在后续免疫检测中保持良好的反应性),且联结物的稳定性好。
在各个领域应用方面,吖啶酯发光免疫分析技术有着极大的帮助。由于吖啶酯化学发光免疫技术是一种非常精确的定量检测,使检测确率更高更快速方便,而一般免疫学检测的准确率明显低于吖啶酯发光免疫技术的结果,且时间长,不方便。因此,本发明基于吖啶酯发光免疫分析技术和对成分以及比例的创新,对用于SAA检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒进行了改进,并改进了相应的制备和检测方法。
为了对本发明做进一步的理解,现举例说明:
实施例1
血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒(磁微粒化学发光法)基础溶液配制:
1、磁微粒清洗液配制:0.02M 十二烷基磺酸钠、0.02M MES缓冲液;
2、磁微粒封闭液配制:0.01M PBS缓冲液 998ml;BSA 100g;海藻糖:10g;吐温201ml。
3、磁微粒保存液配制:0.01M PBS缓冲液(pH=7.4)70%(v/v)、新生牛血清 20%(v/v)、甘油10%(v/v)、Proclin300 0.05%(v/v)、吐温20 0.05%(v/v)。
4、赖氨酸封闭液配制:赖氨酸 13.72mg/ml、0.01M PBS缓冲液(pH=7.4)98.8%(v/v)、吐温20 0.1%(v/v)、BSA 1%(g/ml)。
5、吖啶酯保存液配制:0.01M PBS缓冲液(pH=7.4) 80%(v/v);甘油 20%(v/v);BSA1%(v/v);Proclin300 0.05%(v/v)。其中,由于吖啶酯在一般缓冲液中不稳定、易水解,造成试剂不稳定,甘油与BSA能起到保护蛋白稳定、减少非特异性吸附的作用,Proclin300为防腐剂。
6、样品处理液的配制:在0.01M的PBS缓冲液中按体积比加入0.1% Proclin300。
7、SAA校准品的配制:SAA抗原、0.01M PBS缓冲液90%(v/v)、新生牛血清9%(v/v)、BSA 1%(g/ml)、明胶0.1%(g/ml)、Proclin300 0.2%(v/v)、海藻糖3%(g/ml),冷冻干燥后备用。
8、洗涤液的配制:0.02M 2-(N-吗啉代)乙磺酸、Proclin300 0.1%(v/v)、吐温200.4%(v/v)、NaCl 0.9%(g/ml)
9、底物液的配制:底物液由激发液A和激发液B组成;激发液A:0.1M HNO3、0.08MH2O2;激发液B:2% Triton X-100、0.2M NaOH。
实施例2
配制磁微粒偶联SAA抗体1:
1、取200 uL的磁微粒(30mg/ml)加入2mL的离心管中,磁分离3min,然后去上清。
2、向离心管中加入200 uL的磁微粒清洗液,震荡混匀,磁分离去上清,清洗2次。
3、称取一定量的EDC,加入一定体积MES缓冲液,配制成50mg/ml;称取一定量的NHS,加入一定体积MES缓冲液,配制成50mg/ml。
4、向离心管中加入100uL的50mg/mL EDC,加入100uL的50mg/mL NHS震荡混匀。
5、将离心管置于混匀器上活化30min。适当调整转速,使液体在倒置的时候能稳定下流。
6、活化完成后,使用2倍体积的0.02M MES清洗两次,去上清。
7、分别在离心管中加入60ug SAA抗体1定容至300ul,做好标记。在恒温摇床上,25℃偶联2-3h。磁分离后保存上清用作后续偶联效率的初步确认。
8、用400ul体积的磁微粒封闭液清洗2次,去上清,封闭液中需加入海藻糖,研究表明海藻糖封闭液可以在不影响反应体系敏感性的前提下,抑制体系中的非特异性吸附;更重要的是,海藻糖封闭液有效保护抗体的活性,提高抗体的稳定性的作用。
9、再向离心管中加入400ul体积的磁微粒封闭液,震荡混匀30min。去上清。
10、用400ul体积的磁微粒保存液清洗两次,去上清,然后移至30mL的磁微粒保存液中。
在上述过程中,本发明采用MES缓冲液(pH 5.5)+EDC+NHS活化。本发明所用磁微粒为赛默飞M-270羧基磁微粒。EDC在酸性条件下活化效果更好,在低pH时交联剂EDC与羧酸形成的中间体不稳定,容易分解,但pH值过高时,部分不稳定中间物水解可能会释放出EDC或者使半稳定的氨基反应活性中间物的产量减少从而造成蛋白质与中间物的取代反应速度下降,使蛋白质偶联量下降。EDC先与羧基反应,生成活性中间体,中间体再与NHS反应生成NHS酯中间体,在有氨基存在的条件下,氨基与活性酯生成酰胺键结构。NHS酯中间体比EDC中间体稳定性更高,因此NHS可延长羧基中间体的活性时间,提高抗体偶联效率,节约成本,间接提高检测的灵敏度。
实施例3
配制吖啶酯标记SAA抗体2:
1、取200ug的SAA抗体2,以抗体与吖啶酯的比例1:10加入一定量的吖啶酯,补加抗体的终浓度为2mg/mL。
2、在恒温摇床或者混匀器上,25℃反应3h。
3、加入赖氨酸封闭液(摩尔浓度比,吖啶酯:赖氨酸封闭液=1:140)进行封闭,反应20min。
其中,赖氨酸封闭液为:13.72mg/ml赖氨酸、0.01M 磷酸盐缓冲液(pH=7.4)98.8%、吐温20 0.1%、BSA 1%。吐温20为去污剂,有抗原修复作用,对非特异性吸附有很强的洗脱作用,同时可以降低蛋白质间的疏水作用,可提高特异性抗体的识别能力。BSA为蛋白稳定剂,由于抗体与吖啶酯连接的健不稳定而发生断裂,加入BSA能保持健的稳定性。
4、反应结束后,使用G-25凝胶柱进行脱盐。相比之下,常规透析工艺用时长、需要大体积的透析液、透析袋有易破、抗体失活风险增大等缺陷,本发明采用脱盐柱脱盐的方式去除未标定抗体的残余吖啶酯等小分子物质,脱盐柱具有用时短、脱盐柱可重复使用、操作简单、回收率高的优势。
5、脱盐完成后,补加甘油至抗体终浓度为0.5mg/mL,待用。
6、吖啶酯使用吖啶酯保存液稀释液至抗体终浓度8ug/mL。
实施例4
磁微粒化学发光免疫试剂盒的的使用方法:
1、将所需试剂从试剂盒中取出,去掉试剂瓶盖后盖上乳胶盖,放置于设置的对应位置。
2、将取出的SAA校准品复溶后,进行校准操作。
3、校准完成后,将样本放置样本架上,仪器自动按以下顺序进行测试,仪器启动固定稀释程序即首先用样本处理液将样本稀释300倍,再取稀释后样本75ul、磁微粒偶联SAA抗体1 50ul,吖啶酯标记SAA抗体2 50ul,孵育10min后,样本中的分析物反应形成吖啶酯标记抗体2-SAA抗原-磁珠结合的SAA抗体1的双抗体夹心复合物,然后加载磁场使复合物吸附在反应容器内,使用洗涤液洗去游离物质,最后再加入全自动免疫检测系统用底物液,复合物中的吖啶酯在全自动免疫检测系统用底物液作用下产生化学发光,其相对发光值(RLU)在一定范围内与复合物浓度成正比,通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的SAA含量。
实施例5
对关键原材料进行确认:
对上海莫迪斯(Medix)、北京春达两个厂家提供的SAA抗体分别进行磁微粒包被,吖啶酯标记,制备成不同的组分试剂,以最低检出限评估其性能,选择最佳配对的抗体。
将Medix、春达两个厂家提供的SAA抗体1包被至磁微粒上面,抗体浓度为60 ug/mL,包被完成后,将磁微粒稀释至0.2 mg/mL的浓度。
将Medix、春达两个厂家提供的SAA抗体2与吖啶酯按照摩尔比为1:5的比例,在碳酸缓冲液中标记完成后,将标记好的抗体,稀释至8ug/mL。
组装成试剂后,测试结果如下:
上述检测结果说明,其中标记抗体为Medix、包被抗体也为Medix的组合,其灵敏度最好,因此选择Medix提供的SAA的抗体作为标记和包被抗体。
另外,本发明中的SAA抗体1和SAA抗体2为一对配对抗体,均能和抗原进行特异性结合,两者的结合位点不同,不存在对结合位点的竞争作用,通过抗原抗体特异性结合特性,使这两个针对不同抗原决定簇的抗体能够同时结合SAA抗原。一是可以避免空间位阻等其他不利于夹心复合物形成的影响因素,获得较好的工作曲线,二是增加抗原抗体结合位点,抗体与抗体之间不会形成结合位点的竞争,从而提高检测灵敏度。
实施例6
参考品的制备:
以SAA抗原为纯品做原料,以含10%的新生牛血清的PBS作为基质液,梯度配制SAA抗原,得到一系列企业参考品。
实施例7
性能测试:
1、准确度:
对两个浓度水平的企业参考品进行检测,检测结果与标定浓度的相对偏差在±10%范围内,测试结果如下:
2、空白限:
用零浓度校准品或样本稀释液作为样本进行检测,重复测定20次,得出20次测量
结果的RLU值(相对发光值),计算其平均值()和标准差(SD),得出+2SD,根据零浓度校
准品和相邻校准品的浓度-化学发光(RLU)值结果进行两点回归拟合得出一次方程,将+
2SD所对应的RLU值带入方程式中,求出对应的浓度值,即为空白限,空白限不大于3μg/mL,
结果如下:
3、重复性:
对两个不同浓度的企业参考品分别重复测定10次,其变异系数应不大于5%,结果如下:
4、线性范围:
将接近线性范围上限的高值企业参考品按一定比例稀释为至少5种浓度,其中低值浓度的企业参考品须接近线性范围的下限,对每一浓度的样本均重复检测3次,计算其平均值,并计算线性相关系数r,r值应大于0.99,结果如下:
实施例8
对试剂盒抗干扰能力进行研究:
高血脂样本以及黄疸样本对检测结果产生影响,对样本中的干扰物质进行分析,确定干扰物的浓度。血脂是指体内脂肪在血液中脂质的总称,包括总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白(极低密度脂蛋白)、高密度脂蛋白等。为了检验高血脂样本对本试剂的影响,本公司采用两个不同浓度的血清样本,然后加入不同浓度的甘油三酯,以评估高血脂样品对检测结果的影响;引起黄疸的物质叫胆红素,呈橙黄色,当待检样本中的胆红素浓度超出一定的值时,它会影响样本测定效果,从而影响检测的性能。为了检验黄疸样本对本试剂的影响,本公司采用两个不同浓度的血清样本,然后加入不同浓度的胆红素,以评估黄疸样品对检测结果的影响。
1、实验要求
(1) 实验人员应熟悉测定方法与仪器操作。
(2) 采用合适的质控品并保持仪器处于正常状态。
2、接受标准
将每个浓度梯度的干扰物样本连续测试3次,取均值,以低浓度干扰物样品的测试均值为标准,计算其它样本与它的相对偏差;当相对偏差超过±10%时,此时对应的干扰物浓度被认为是该干扰物对该试剂产生干扰的极限浓度。
3、实验材料和方法
甘油三酯:称取一定量的甘油三酯纯品,加入适量的纯水将之配制成浓度为600g/L的甘油三酯原液,按1:19加入到临床血清中,混匀即得3000 mg/dL的甘油三酯高浓度干扰物样品;另取临床血清按19:1加入纯水,混匀得到低浓度干扰物样品。
胆红素:称取一定量的胆红素纯品,加入适量体积0.1 mol/L的NaOH将之配制为400 mg/dL的胆红素原液,然后按1:19加入到临床血清中,混匀即得20 mg/dL的胆红素高浓度干扰物样品;另取临床血清按19:1加入0.1 mol/L的NaOH,混匀得到低浓度干扰物样品。
血红蛋白:称取一定量的血红蛋白纯品,加入适量的纯水将之配制成浓度为100g/L的血红蛋白原液,然后按1:19加入到临床血清中,混匀即得浓度为500 mg/dL的血红蛋白高浓度干扰物样品;另取临床血清按19:1加入纯水,混匀得到低浓度干扰物样品。
按下表进行干扰物样本的梯度混合:
4、实验结果
5、实验结论
甘油三酯:浓度≤3000 mg/dL,干扰相对偏差小于10%,未发现有干扰;胆红素:浓度≤20 mg/dL,干扰相对偏差小于10%,未发现有干扰。血红蛋白:浓度≤500mg/dL,干扰相对偏差小于10%,未发现有干扰。
实施例9
对钩状效应效应研究
钩状效应即HOOK效应,是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象,其中抗体过量叫做前带效应;抗原过量叫做后带效应。抗原抗体特异性反应时,生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体,均可发现只有在两者分子比例合适时才出现最强的抗原-抗体反应。
1、试验要求及方法
检测超出线性范围外的样本(如果样本浓度不够高,即加入相应抗原),梯度测试,从高到低进行测试,每个浓度测试3次,测试结果小于上一个梯度的测试结果时,则出现严重的钩状效应。
2、试验结果
3、实验结论
当SAA浓度上升至300μg/ml 时,未出现明显钩状效应;当样本浓度在SAA浓度上升至600μg/ml 时,出现明显的钩状效应。
本发明的上述技术方案中,以上仅为本发明的优选实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是在本发明的技术构思下,利用本发明说明书所作的等效结构变换,或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。
Claims (10)
1.一种用于SAA检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒的制备方法,其特征在于,包括步骤:
S1,配制基础溶液,所述基础溶液包括磁微粒封闭液和赖氨酸封闭液;
其中,所述磁微粒封闭液包括:PBS 98%~99.8%(v/v)、BSA 1%~10%(g/ml)、海藻糖 0.2%~1%(g/ml)、吐温20 0.1%~1%(v/v);
所述赖氨酸封闭液包括:赖氨酸10~15mg/ml、PBS 98%~99.8%(v/v)、吐温20 0.1%~1%(v/v)、BSA 0.1%~1%(v/v);
S2,配制磁微粒偶联SAA抗体1;所述磁微粒偶联SAA抗体1的配制过程包括:对所述磁微粒进行清洗,然后对清洗后的所述磁微粒进行活化,并将活化后的所述磁微粒与所述SAA抗体1进行偶联,得磁微粒与SAA抗体1的结合物;对所述磁微粒与SAA抗体1的结合物用所述磁微粒封闭液进行封闭处理,然后对所述磁微粒与SAA抗体1的结合物进行清洗,得所述磁微粒偶联SAA抗体1;
S3,配制吖啶酯标记SAA抗体2;所述吖啶酯标记SAA抗体2的配制过程包括:将吖啶酯和所述SAA抗体2按预设时长进行混合,得吖啶酯和SAA抗体2的结合物;对所述吖啶酯和SAA抗体2的结合物用所述赖氨酸封闭液进行封闭处理,然后对所述吖啶酯和SAA抗体2的结合物进行脱盐处理,得所述吖啶酯标记SAA抗体2。
2.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫试剂盒的制备方法,其特征在于,在所述步骤S2中,所述对清洗后的所述磁微粒进行活化包括步骤:
S21,将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入至一份MES缓冲液中,得1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液;将N-羟基琥珀酰亚胺加入至另一份MES缓冲液中,得N-羟基琥珀酰亚胺溶液;
S22,将清洗后的所述磁微粒和所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、以及所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液进行预设时长的混合,并在混合后对所述磁微粒进行洗涤,得活化后的所述磁微粒。
3.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫试剂盒的制备方法,其特征在于,所述基础溶液还包括磁微粒保存液;
所述磁微粒保存液包括:PBS 60%~80%(v/v);新生牛血清10%~30%(v/v);甘油 10%~20%(v/v);Proclin300 0.01%~0.1%(v/v);吐温20 0.01%~0.1%(v/v);
所述步骤S2还包括:将所述磁微粒偶联SAA抗体1用所述磁微粒保存液进行清洗和保存,得待用的所述磁微粒偶联SAA抗体1。
4.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫试剂盒的制备方法,其特征在于,所述基础溶液还包括吖啶酯保存液;
所述吖啶酯保存液包括:PBS 70%~90%(v/v);甘油 10%~30%(v/v);BSA 1%~2%(v/v);Proclin300 0.01%~0.1%(v/v);
所述步骤S3还包括:将所述吖啶酯标记SAA抗体2用所述吖啶酯保存液进行保存,得待用的所述吖啶酯保存液。
5.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫试剂盒的制备方法,其特征在于,在所述步骤S3中,所述脱盐处理包括:采用G-25凝胶柱去除未标记在所述SAA抗体2上的物质。
6.一种磁微粒化学发光免疫试剂盒,其特征在于,采用如权利要求1-5任意一项所述磁微粒化学发光免疫试剂盒的制备方法进行制备。
7.根据权利要求6所述的磁微粒化学发光免疫试剂盒,其特征在于,所述磁微粒化学发光免疫试剂盒包括待用的磁微粒偶联SAA抗体1和待用的吖啶酯标记SAA抗体2;
其中,所述待用的磁微粒偶联SAA抗体1包括:PBS 60%~80%(v/v);新生牛血清10%~30%(v/v);甘油 10%~20%(v/v);Proclin300 0.01%~0.1%(v/v);吐温20 0.01%~0.1%(v/v)、SAA抗体1 2~4μg/ml、磁微粒100~300μg/ml;
所述待用的吖啶酯标记SAA抗体2包括:PBS 70%~90%(v/v);甘油 10%~30%(v/v);BSA1%~2%(v/v);Proclin300 0.01%~0.1%(v/v);SAA抗体2 6~10μg/ml;吖啶酯0.1~0.5μg/ml。
8.根据权利要求7所述的磁微粒化学发光免疫试剂盒,其特征在于,所述磁微粒化学发光试剂盒还包括SAA校准品、样品处理液、洗涤液、底物液。
9.根据权利要求8所述的磁微粒化学发光免疫试剂盒,其特征在于,
所述SAA校准品包括:SAA抗原、PBS 90%~92%(v/v)、新生牛血清8%~10%(v/v)、BSA0.1%~1%(g/ml)、明胶 0.1%~0.3%(g/ml)、Proclin300 0.1%~0.2% (v/v)、海藻糖 2%~4%(g/ml)。
10.根据权利要求8所述的磁微粒化学发光免疫试剂盒,其特征在于,所述样品处理液包括:含有0.01%~0.1% Proclin300(v/v)的PBS。
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