CN108226528A - 一种基于双分子荧光互补技术的crp检测试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于双分子荧光互补技术的CRP诊断试剂盒。所述试剂盒包括：抗CRP抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗CRP抗体偶联的荧光蛋白C端片段；本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的CRP诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗CRP抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗CRP抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明试剂盒具有操作简单、线性范围宽、特异性好、免清洗、准确度高等优点，便于临床检测使用，其应用于炎症和心脑血管疾病风险预测，能够更加准确地预测炎症和糖尿病合并心脑血管事件的危险发生率，具有极大的市场价值。

Description

一种基于双分子荧光互补技术的CRP检测试剂盒、制备及使用 方法

技术领域

本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测人体内CRP的含量，属于疾病诊断检测领域。

背景技术

C-反应蛋白(CRP)是一种敏感的急性时相反应蛋白，是由Tillet和Francis在急性大叶性肺炎患者血清中发现一种物质，能在钙离子存在时与肺炎球菌C-多糖起沉淀反应，在人体遭受细菌感染或者组织损伤时，血清中C-反应蛋白浓度可快速升高。CRP值的升高滞后于炎症活动变化12小时左右。但重要的是比临床症状的变化发现要早，如类风湿关节炎中早4～ 6周。因此CRP值可为临床快速决定提供一种方法。CRP的临床参考值：≤10mg/L。在炎症开始数小时就升高，48小时即可达峰值，随着病变消退、组织、结构和功能的恢复降至正常水平，同时CRP水平的高低反映了患者应激反应的强弱。此反应不受放疗、化疗、皮质激素治疗的影响。

因此，CRP的检测在临床应用相当广泛，包括急性感染性疾病的诊断和鉴别诊断，手术后感染的监测；抗生素疗效的观察；病程检测及预后判断等。CRP升高的程度反应炎症组织的大小或活动性，在急性炎症和感染时，CRP与疾病活动性有良好的相关性，足以用来作为治疗监测。CRP值为10～50mg/L表示轻度炎症，例如局部细菌性感染(如膀胱炎、支气管炎、脓肿)、手术和意外创伤、心肌梗死、深静脉血栓、非活动性结缔组织病、许多恶性肿瘤和多数病毒感染。CRP值升为100mg/L左右表示较严重的疾病，它的炎症程度必要时需静脉注射。CRP值大于100mg/L，表示严重的疾病过程并常表示细菌感染的存在。

用乳胶免疫比浊法等敏感方法测出的较低浓度的血清CRP称为超敏CRP(hs-CRP)，超敏CRP与心血管事件相关。hs-CRP已是公认的预测未来心血管事件(急性冠状动脉综合征、心肌梗死、卒中等)发生危险性的有效指标。国际上通用的Reynold Score将hs-CRP纳入其中。hs-CRP对冠心病患者的临床危险分层有重要参考价值。急性冠状动脉综合征：hs-CRP及肌钙蛋白T/肌钙蛋白I、脑钠素是急性冠状动脉综合征的生物学标志物。动态监测hs-CRP有利于观察冠心病的严重程度和演变情况，及早预测可能发生的急性冠状动脉事件。研究显示，稳定性冠心病者置入冠状动脉支架6h后CRP即增加，48h达高峰，而后平稳下降。稳定性心绞痛患者在置入冠状动脉支架72h后测定CRP水平，并进行连续1年的随访，CRP＞5 mg/L较CRP＜5mg/L的患者存活率显著降低。支架置入后再狭窄可能与慢性炎症有关， hs-CRP水平有助于预测再狭窄。冠状动脉搭桥手术治疗的冠心病患者通常在术后6h内CRP 增高，无并发症时应在72h以后开始下降至正常。对于冠状动脉搭桥手术后hs-CRP持续增高者如能排除感染因素，也可作为评估冠状动脉搭桥术后危险的指标。

常用的CRP检测方法有酶联免疫吸附试验、及乳胶免疫比浊等。酶联免疫吸附试验法采用双抗夹心法，检测灵敏度较低，目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目，并且反应时间较长。乳胶免疫比浊法是利用抗原抗体反应原理测定血清中CRP的含量。样品中CRP抗原的与包被的胶乳颗粒上的抗人CRP抗体形成免疫复合物，产生的浊度与样品中的CRP含量呈正比，用比浊法进行测定，从而求得样品中的CRP的含量，此方法无法兼顾灵敏度和线性，检测hs-CRP和普通CRP需要两套试剂盒完成。

为解决上述问题，如果能利用CRP的抗体，以双分子荧光互补技术为平台，研发出一种针对炎症和心血管疾病诊断的CRP快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比，具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点；将其应用于炎症和心血管疾病的监测，可以提高炎症和心血管疾病诊断的准确率。则就会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测CRP的检测试剂盒、其制备及使用方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种制备基于双分子荧光互补技术CRP检测试剂盒的方法，包括如下步骤：

1)抗CRP抗体偶联荧光蛋白N端片段；

2)抗CRP抗体偶联荧光蛋白C端片段；

在上述技术方案中，所述抗CRP抗体为针对CRP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

在上述方案中，所述抗CRP抗体偶联荧光蛋白N端片段的步骤中，荧光蛋白N端片段与抗CRP抗体的质量比为1∶1-10。

在上述方案中，所述抗CRP抗体偶联荧光蛋白C端片段的步骤中，荧光蛋白C端片段与抗CRP抗体的质量比为1∶1-10。

根据以上任一技术方案所述所制备的基于双分子荧光互补技术的CRP检测试剂盒。其主要组成包括：

1)抗CRP抗体偶联的荧光蛋白N端片段；

2)抗CRP抗体偶联的荧光蛋白C端片段。

以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗CRP抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗CRP抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的CRP检测试剂盒原理示意图，其中， 1-抗CRP抗体，2-连接剂，3-荧光蛋白N端片段，4-待测物(CRP)，5-抗CRP抗体，6-荧光蛋白C端片段，7-连接剂。

图2是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的CRP检测试剂盒检测线性范围图。

图3是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的CRP检测试剂盒结果相关性比较。

具体实施方式

以下参考附图对本发明的基于双分子荧光互补技术的CRP检测试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。

实施例1

抗CRP抗体偶联荧光蛋白N端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)1-154氨基酸的片段YFPN为例，具体实施过程为：

1)将0.1mg YFPN蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPN蛋白稀释到1mg/mL。

2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。

3)37℃水浴反应2h。

4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。

5)取0.1mg抗CRP抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/mL抗体，将活化的YFPN 蛋白和抗体混合。

6)4℃，反应过夜。

7)封闭：加入50μL 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。

8)4℃放置2h。

9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01 mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。

实施例2

抗CRP抗体偶联荧光蛋白C端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)155-238氨基酸的片段YFPC 为例，具体实施过程为：

1)将0.1mg YFPC蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPC蛋白稀释到1mg/mL。

2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。

3)37℃水浴反应2h。

4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/LpH9.5 CB透析除去过量戊二醛。

5)取0.1mg抗CRP抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/mL抗体，将活化的YFPC 蛋白和抗体混合。

6)4℃，反应过夜。

7)封闭：加入50μL 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。

8)4℃放置2h。

9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01 mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。

实施例3

试剂盒主要组成：

1)抗CRP抗体偶联的荧光蛋白N端片段；

2)抗CRP抗体偶联的荧光蛋白C端片段。

实施例4

试剂盒使用方法，包括如下步骤：

1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗CRP抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗CRP抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。

实施例5

本发明试剂盒方法学评价：

1.线性

配制浓度为0μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、300μg/mL的CRP标准品溶液。在反应孔中分别加入20μL标准品、加入50μL抗CRP抗体偶联的荧光蛋白N端片段，加入50μL抗CRP抗体偶联的荧光蛋白C端片段，37℃温育10min。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。

2.准确度

回收率试验：用已知量CRP标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算CRP的回收率。检测结果如下：

样本编号	加入CRP浓度(μg/mL)	测量CRP的浓度(μg/mL)	回收率(％)
				1	0.5	0.49	98.0
2	2	2.05	102.5
				3	20	19.94	99.7
4	100	101.90	101.9

3.精密度

选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果，计算平均偏差CV值。

4.分析灵敏度

分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为0.01μg/mL。

5.抗干扰性

检测本发明的基于双分子荧光互补技术的免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液分别取适量加入到CRP阳性血清标本中，使血清中血红蛋白的含量分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL。将甘油三酯溶液分别取适量加入到CRP阳性血清标本中，使血清中甘油三酯的含量分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL。将胆红素溶液分别取适量加入到CRP阳性血清标本中，使血清中胆红素的含量分别为25μg/mL、50μg/mL。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的CRP阳性标本进行测定。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在98.5％-100.7％之间。表明基于双分子荧光互补技术的CRP试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。

6.相关性

如图3所示，与日本积水CRP试剂盒的相关性为：y＝1.014x+0.125，R²＝0.999。

本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于双分子荧光互补技术的CRP检测试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：

1)试剂盒主要组成：抗CRP抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗CRP抗体偶联的荧光蛋白C端片段；

2)使用方法：在试剂盒的反应孔中加入样本、抗CRP抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗CRP抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；

3)检测方法：激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

2.一种基于双分子荧光互补技术的CRP检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)抗CRP抗体偶联荧光蛋白N端片段的制备；

2)抗CRP抗体偶联荧光蛋白C端片段的制备。

3.根据权利要求1所述的抗CRP抗体为针对CRP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的荧光蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白。

5.根据权利要求2所述的一种基于双分子荧光互补技术的CRP检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗CRP抗体偶联荧光蛋白N端片段步骤中，荧光蛋白N端片段与抗CRP抗体的质量比为1∶1-10。

6.根据权利要求2所述的基于双分子荧光互补技术的CRP检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗CRP抗体偶联荧光蛋白C端片段步骤中，荧光蛋白C端片段与抗CRP抗体的质量比为1∶1-10。

7.根据权利要求1所述的反应孔，包括但不限于微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管。