JP2012230124A - 神経変性疾患における異常型タンパク質凝集の迅速かつ高感度の検出 - Google Patents
神経変性疾患における異常型タンパク質凝集の迅速かつ高感度の検出 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】該技術は簡単で、非常に高感度であり、ただちに入手可能な構成要素を利用する。神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な結合種は、電極表面または粒子表面に固定されるか、溶液中で遊離した状態で供給され、原繊維形成種に結合および/または凝集体に包含される。
【選択図】なし
Description
1−40はそれ自体の上に原繊維および凝集を形成することができる一方で、Aβ 1−40を含む溶液は、可溶性の低い1−42ペプチドとの「混合物」であるか、または、予め形成されたペプチド原繊維の「核を有する」場合には、促進された原繊維形成を受ける。Aβ 1−40は神経炎プラーク内における優勢タンパク質であるが、これらの研究は、原繊維形成率が、1−40に対する1−42の濃度比率に依存すると思われることを示している。これらの研究結果に一致して、あらゆる形態の初期AD兆候は、1−42ペプチドの高い発現水準を伴う。
別の実施例では、この目的を含むがそれに限らず、薬品選別に利用することができ、その分野において重要な前進を示す発明の方法を提供する。方法には、アーティクル表面に固定されたか、または、固定されやすい形になった1結合種を投入して、随意、(最初に固定されていない場合には)その結合種を表面に固定し、さらに、神経変性疾患の凝集形成および原繊維形成種に結合することが含まれる。結合は、結合種を表面に固定する前もしくは後に行なうことができ、結合種は結合過程で凝集形成および原繊維形成種へは転化しない。第2アーティクルの表面に固定されたか、または、固定されやすい形になった第2の結合種は、凝集形成および原繊維形成種に結合できる。第2の結合種の凝集形成および原繊維形成種との結合は、この方法による他の処理に関連して随時行なうことができる。
詳細な説明
定義
本文中で「小型の分子」という場合は、5キロダルトン未満の分子を、より一般的には、1キロダルトン未満の分子を指す。
本文中で「コロイド」という場合は、生化学分野で通常用いられる意味で用いる。一般的に、コロイド粒子とは、どの断面で切っても250nm未満のもの、より一般的には、どの断面で切っても100nm未満のものをいう。
「試料」という用語は、生物学的採取源から得られた細胞、組織、体液のすべて(「生物学的試料」)、または、患者から得られた生物学的試料や、動物から得られた試料、人の食用を意図した食品から得られた試料、家畜飼料など動物の食用を意図した食品から得られた試料、臓器提供試料などを含むが、それに限らず、発明に従って有益と評価されるその他のすべての媒質を指す。
多数の薬剤をスクリーニングする場合に、各種サンプルを個別および空間的に位置指定できることは特に有用である。本発明の手法は、多ウェルプレートの各種プレート(図8を参照)および/または複数の電極などの、個別および空間的に位置指定可能な領域を用いて実施できる。 用いる態様とは無関係に、本発明のアッセイは凝集体または原繊維形成を阻害する化合物の薬剤ライブラリのスクリーニングを行うためにただちに改変できる。薬剤スクリーニングアッセイでは、結合種をコロイド(または他の粒子)に結合させて、凝集体形成または原繊維形成種および薬剤候補を含む溶液を用いて培養できる。該溶液は、ペプチドの原繊維内への包含を促進するために攪拌しても、しなくてもよい。結合種が凝集体または原繊維内に包含されるにつれ、あるいはその後凝集体または原繊維を形成する凝集体形成または原繊維形成種に包含されるにつれ、結合種は結合したコロイドを相互に接近させるため、コロイド溶液の色が変化する(たとえばピンク色の懸濁液から透明溶液中の暗青色の沈殿へ)。この変化は、明確に目視可能である。吸収分光測光法によると、569nmのピークはコロイドの凝集につれて低下する。
この系では、金属含有信号検出化合物を含まない磁気ビードがペプチドを有する。溶液中の遊離ペプチドが、これらの磁気ビードに結合したペプチドと相互作用可能である。推定薬品候補は金属含有信号検出化合物を含むコロイドに配置される。コロイド上の金属含有信号検出化合物は、凝集プロセスを中断し、磁気ビード上のペプチドと直接相互作用すると、信号伝達を行う。薬剤候補が凝集体と相互作用した場合にも信号が得られる。後者の情報は有用であるが、薬剤の作用箇所を判定するために、その後のマルチステップアッセイが必要な場合が多い。
薬剤候補は、予備形成原繊維、電子信号伝達コロイドに結合したペプチドおよび磁気ビードに結合したペプチドを含む溶液に添加される。培養時間の後、磁気ビードは検出電極に引き付けられ、ACVによって分析される。信号の損失は、薬剤候補が原繊維形成を阻害したことを示す。
1つの流体混合物を調製すると、移転または他の撹拌を用いずに、凝集体の生成またはその欠如を判定するために観察できる。あるいは特定のアッセイに、撹拌または別の形式のエネルギーを与えることができる。たとえば、ある例においては、特定の系にエネルギーを導入することが凝集形成に影響を与えるかどうかを判定することが望ましい。エネルギーは、かき混ぜ、振盪、振動、超音波処理または他の機械的撹拌などの撹拌、赤外線、紫外線または可視光などの電磁気放射への曝露、無線周波数エネルギー、マイクロ波放射またはスペクトルの任意の部分での実質的に任意の電磁放射への曝露の形で導入できる。ある例において、系のエネルギーへの曝露は、凝集の速度に影響を与え、このことは神経変性疾病プロセスに対するエネルギーの潜在的な影響を示す。
本実施例において、14μM His−Aβ(1−40)ペプチドを含む100μLの分割量および30μLのNTA−チオールコロイドを、1μM Aβ原繊維種、50pM Aβ原繊維種または原繊維なしで培養した。混合物を37℃にて30分間培養した後、キュベットに移し、日立U−2000分光光度計に配置した。各分割量について、569nmでの吸収を記録してから、キュベットを取り外し、ペプチドの原繊維内への包含を促進するために硬い表面に激しく叩きつけ、10分間放置した後、569nmで再度走査した。
本実施例において、1.5mlの市販金コロイド(AmershamのAuro Dye)を微量遠心管内に入れ、高で10分間遠心分離してペレットにした。ペレットを100μLの貯蔵緩衝液(クエン酸ナトリウムおよびtween−20)中で再懸濁させた。40μM ニトリロトリ酢酸(NTA)−チオール、100μM フェロセン−チオールおよび500μM カルボキシ−末端チオールを含む100μLのジメチルホルムアミド(DMF)溶液を加えた(フェロセン信号実体は随意である)。チオール溶液で3時間培養した後、コロイドをペレットにし、上澄は廃棄した。ペレットはその後、100μLの400μM トリ−エチレングリコール末端チオールDMF溶液中で55℃にて2分間、37℃にて2分間、55℃にて1分間、37℃にて2分間、室温にて10分間培養した。次にコロイドをペレットにし、100μLの100mM NaClリン酸緩衝液を加えた。さらにコロイドを180μM NiSO4のコロイド貯蔵緩衝液を用いて、1:1に希釈した。
以下に示す実施例の一部において、該実施例はSAM形成、コラーゲンコーティング、細胞増殖、コロイド形成およびを含む交流ボルタメトリー(ACV)を含む。SAM形成の場合、ガラス製の顕微鏡スライドはTi層、次いでAu層によってスパッタリングされる。各電極は、10% メチル末端チオール(HS−(CH2)15CH3)、40% トリ−エチレングリコール末端チオール、HS(CH2)11(CH2CH2)3OH、(式)および50% ポリ(エチニルフェニル)チオール(C16H10S)を含む300μLのDMF溶液によって室温にて0.5時間培養した。次に2mlの400μM トリ−エチレングリコール末端チオールを、チップを含むシンチレーションバイアルに加え、該バイアルに対し、水浴中で次のような熱サイクルを行った:55℃で2分間;37℃で2分間;55℃で1分間;37℃で2分間、次に室温で10分間。次いで電極をEtOH中に漬け、さらに滅菌PBSですすいだ。
我々は、色の変化および視覚的な原繊維形成を時間の関数として監視することによって、事前に形成された凝集体、神経変性疾病の特徴を高感度に検出することができる。
ペプチドおよび原繊維の濃度が高くなると、大きなコロイド修飾原繊維構造が見られる。40μM NTA−Ni SAMを含むコロイドは実施例2に記載したように調製した。コロイドの30μLの分割量を96ウェルプレートに加えた。100μLの最終体積中で20μMの最終濃度となるように、ヒスチジン付加β−アミロイドペプチド(1−40)を加えた。100μMの最終体積中で最終濃度が20μMとなるように、予備形成β−アミロイド原繊維を加えた。
我々はヒスチジン付加β−アミロイド(1−40)ペプチドが原繊維を形成する条件を決定した。Sigma Aldrich RBI薬剤ライブラリによる薬剤候補を各アッセイ溶液に別々に加え、アルツハイマー病の特徴である原繊維形成を阻害する薬剤候補を判定した。結果を描出する方法として、(以前述べた)NTA−Ni−SAMsを含むコロイドを加えた。
結果:
色の変化(ピンクから青)によって、原繊維形成を阻害する薬剤が予測された。培養時間約2時間で、陽の対照を含む、すなわち薬剤を含まないウェルおよび負の対照を含む、すなわち薬剤を添加したがヒスチジン付加ペプチドがβ−アミロイドではなく、GSTであるウェルと、溶液の色を比較することによって、原繊維形成を阻害した薬剤を含むウェルを肉眼ではっきりと見ることができた。
実施例7:溶液中で遊離したペプチドの増幅への使用
NTA−Ni−SAMsを示すコロイドは、実施例2に記載したように調製した;1000μMのチオール総濃度において40μM NTA−チオールを使用した。ヒスチジン付加β−アミロイド(1−40)ペプチドを加えて、100μLの最終体積において最終濃度が58.2μMとなるようにした。負の対照として、無関係のヒスチジン付加ペプチド、GSTをβ−アミロイドペプチドの代わりにコロイド溶液に加えた。溶液は37℃で培養した。15分以内に大きな凝集体が溶液内ではっきり見えるようになり、それにはヒスチジン付加β−アミロイドペプチドが含まれていた。対照溶液中には構造物が見られなかった。β−アミロイドペプチドを含む溶液は灰色/紫に変化したが、負の対照溶液はピンクのままであった。これらの結果は、溶液中の遊離β−アミロイドペプチドが凝集し、凝集過程を増幅または加速するよう作用したという考えに矛盾しない。
β−アミロイド原繊維を電子的に検出する我々の戦略は最初に、ヒスチジン付加β−アミロイドペプチド(1−40)を、μ−アミロイド1−42ペプチドから作成した予備形成原繊維に含めることであった。電子信号伝達のために、NTAおよびフェロセン誘導体を含むコロイドを、少なくとも一部のHis付加βアミロイドペプチドがコロイド粒子に付加するように加えた。我々の目的は次に、コロイド修飾原繊維に結合する結合リガンドを押しのけて進み、それらを作用電極に磁気的に補充する磁気ビードを加えることであった。
ヒスチジン付加β−アミロイドペプチド(1−40)、NTA−Niおよびフェロセンを持つコロイド、さらに予備形成原繊維を含む溶液は、37℃にて20分間培養すると、コロイド粒子に結合したフェロセン誘導体(オクタメチルフェロセン)特徴的な酸化ポテンシャル(220mV)において2.0μAの電流ピークが生じた。図9の線Aを参照。 ヒスチジン付加ペプチドが原繊維に含有される直前に測定した同一の溶液は、図9の線Bに示すように、220mVにおいて約0.17μAのわずかなピークを生成した。
予備形成原繊維を含むが、ヒスチジン付加β−アミロイドペプチドの代わりにヒスチジン付加GSTタンパク質がコロイドに結合している第3の負の対照溶液は、電流ピークを生成しなかった(図9、線D)。
溶液中の粒子の平均直径を定量化する市販の光散乱装置を用いて、NTA−Ni−SAMコートコロイドおよびヒスチジン付加β−アミロイド(1−40)ペプチドを含む溶液を、予備形成原繊維のある場合とない場合に分析した。
1. 40μM NTA−SAM誘導体化コロイドのみ;直径=14.87nm
2. ヒスチジン付加Aβ1−40ペプチドを示すコロイド;直径=14.96nm
3. 1μMβ−アミロイドペプチド(1−42)予備形成原繊維と混合したコロイド(表面固定化His付加Aβ1−40を除く);直径=15.93nm;t=0
実験:
1. ヒスチジン付加Aβ1−40ペプチドを示すコロイド、1μM β−アミロイドペプチド(1−42)予備形成原繊維と混合、t=0で測定 15.5nm
2. ヒスチジン付加Aβ1−40ペプチドを示すコロイド、1μM β−アミロイドペプチド(1−42)予備形成原繊維と混合、高輝度ランプのもとで、t=1.5時間で測定:直径=10,000nm超、図10を参照。
3. ヒスチジン付加Aβ1−40ペプチドを示すコロイド;予備形成原繊維の代わりに緩衝液を加えた;t=0で測定;直径=14.96nm。
誘導体化コロイドによって示されるβ−アミロイドペプチドが、通常の診断サンプル中に存在する原繊維種に非特異的に含まれるかどうかを判定するために、ウシ胎仔血清(FBS)中で目視アッセイを実施した(FBSは、他の原繊維種を含め、CSFの100倍以上の無関係なタンパク質を含む)。ヒスチジン付加Aβ1−40を示す40μM NTA−SAMコロイドの異なるFBS濃度の溶液30μlに、1μM Aβ 1−42原繊維を加えた。誘導体化コロイドの原繊維への凝集はFBS濃度の上昇とともに増加せず、アッセイは他のタンパク質や原繊維種によって生じるアーティファクトが起こりにくいことを示している。コロイドに固定化されたHis付加Aβ1−40を含むが、予備形成Aβ原繊維を含まない負の対照溶液は、ピンクのままであった;40または100倍拡大では構造体は見られなかった。
CSFサンプルを使用した盲検(サンプルの片方、両方がアルツハイマー病患者によるものか、あるい両方ともアルツハイマー病患者によるものでないことを作業者に知らせていない)において、実施例2に記載したように調製した、40μM NTA−SAMsを含むコロイドの30μMの分割量を96ウェルプレートのウェルに加えた。His付加Aβ(1−40)ペプチドは最終濃度が3.75μMとなるように加えた。2人のアルツハイマー病患者によるCSFの分割量をコロイド/ペプチド溶液に加えた。加えたCSFの量は、最終CSF濃度が12.5%または25%となるように変化させた。試験を行った各CSFサンプルについて、条件を次のように変化させた:(1)サンプル溶液は予備形成Aβ原繊維(1μM;1−42)を用いてドープまたは「播種」した;(2)溶液は予備形成Aβ原繊維(0.1μM;1−42)によって播種した;(3)溶液には何も播種しなかった;(4)負の対照として、プローブHis−Aβをコロイドに固定化しなかった。37℃にて3時間後、患者#101によるCSFを含む原繊維のマクロ構造が、負の対照を除くすべての試験溶液で見られた。原繊維構造の範囲は、CSF濃度の上昇とともに広がった。同様に、種濃度の上昇とともに構造形成も増大した。他のCSF含有溶液はピンクから紫に変化したが、40倍拡大では減繊維構造の形成は見られなかった。対照溶液(コロイドへの固定化His−Aβなし)はピンクのままであり、構造形成の徴候は一切見られなかった。
この仮説的な実施例では、少なくともHis付加ペプチドの一部がコロイドに結合するように、可溶形(未変換形)のHis付加PrPタンパク質を含む溶液にNTA−Niを示すコロイドを加える。伝染性PrPを含むと思われるサンプルを加える。伝染性PrPは、コロイド上の、および溶液中で遊離している正常なPrPタンパク質を、それらが他のPrPタンパク質を変換できるように変換する(アルファらせんから、正常なPrPとは異なり、プロテイナーゼK消化に対して耐性である、ひだ付きベータシートへのラジカル立体配座変化を含む凝集を引き起こす)。この種の信号増幅、すなわち変換増幅は、比色(ピンクから紫)変化としてただちに検出可能な塊状の凝集と、肉眼または光散乱装置によって検出可能である大規模なタンパク質凝集体の生成を引き起こす。添加した正常なPrPの変換によって生じるこの信号増幅の場合、添加PrP(His付加、またはなし)はサンプル中に予測されるPrPと同じ種に由来するか、PrPが伝染性サンプルによって変換可能な種に由来しなければならないことに注意する。
あるいは、定量的で上述した信号増幅を含まないアッセイ、あるいは未知の種起源のプリオン疾病を検出可能なアッセイが必要な場合がある。このような場合、シリアンハムスターPrPから切除した119−141(GAVVGGLG
GYMLGSAMSRPMMHF)に相同性の配列などの、プリオンタンパク質(PrP)に由来するペプチドまたはタンパク質は、好ましくはN末端にヒスチジン付加され、実施例2に記載したようなNTA−SAMsを示すコロイドに添加される。この配列は、変換または伝染性PrPの複数の部位に結合するため、他の正常なPrPタンパク質を「変換する」その能力を阻害することがわかっている。
サンプルが伝染性PrPを含む場合、コロイド結合ペプチドの凝集が発生し、上記と同様に検出できる。これらは、全長タンパク質に加えて、his付加され、このアッセイで使用できるハムスターPrPに由来する配列である。
106−128(KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGY)
109−141(MKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPMMHF)
113−141(AGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPMMHF)
119−141(GAVVGGLGGYMLGSAMSRPMMHF)
117−141(AAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPMMHF)
115−141(AAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPMMHF)
113−141(AGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPMMHF)
Charby J, Caughey B, Chesebro B, J
Biol Chem 1998 May 22; 273(21):
13203−7; Residues 90−145 of Syrian
hamster PrP(シリアンハムスターPrPの残基90−145),
J. Mol. Biol.(1997) 270, 574−586
実施例13:電子的検出
この仮説的な実施例では、サンプル中のプリオン疾病の存在も電子的に検出できる。少なくともHis付加ペプチドの一部がコロイドに結合するように、可溶形(未変換形)のHis付加PrPタンパク質を含む溶液にNTA−Niを示すコロイドおよびオクタメチルフェロセンを加える。PrPまたはそれに対する抗体のいずれかを与える磁気粒子もアッセイに加える。伝染性PrPが含まれると思われるサンプルを加える。コロイド上の、および溶液中に遊離している伝染性PrPは正常なPrPを変換し、この正常なPrPを他のタンパク質の変換に関与させ、その結果として塊状凝集が起こる。磁気粒子およびコロイド粒子の両者が同一の凝集体に含まれる塊状凝集が生じ、これらの凝集体はSAMコート可能な電極に磁気的に引き付けられ、ACVによって分析される。
分子または細胞生物学の当業者に周知の技術を使用する。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)(Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学における現在のプロトコル), Volume 2 Immunology 11.2, John Wiley and Sons Inc.による著作権、1994−1998)。通常、ELISAを実施する場合は、第1の種を直接または間接的にプラスチック基質に結合させる。
glycoprotein D to infected nerve fibers and sensory neurons in vivo, Sanna PP, Deerinck TJ, and Ellisman MH, 1999, Journal of Virology Oct. Vol
73(108817−23)を参照)。便宜上、各抗体を酵素に結合させずにすむように、マウス抗体を特異性認識抗体として使用し、次に酵素結合ウサギ抗マウス抗体を添加することが最も多い。
このアッセイを用いて薬剤をスクリーニングしたい場合は、神経変性疾病を阻害する候補薬剤の存在下で、同様の手順を実施する。
この仮説的な実施例では、酵素β−分泌酵素およびγ−分泌酵素などの、神経変性疾病での凝集体形成または原繊維形成種の生成に関与する細胞プロセスに対する活性について候補薬剤を試験する方法について述べる(Wolfe, et
al., Nature, 1999 April 8; 398(6727);513−7; Haass, Nat. Med. December,
1999; 1(12);1291−6)。
Res., April, 1992, 31(4):635−45)。
Claims (160)
- 表面を持つ第1のアーティクルと;
表面を持つ第2のアーティクルと;
神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な複数の結合種より成るキットであり、
前記結合種の少なくとも一部が第1のアーティクルの表面に固定されている、または固定されるように改変され、前記結合種の少なくとも一部が第2のアーティクルの表面に固定されている、または固定されるように改変されているキット。 - 神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な結合種と;
結合種に対して固定化された電子信号伝達エンティティより成る組成物。 - アーティクルであって:
前記アーティクルの表面と;
前記表面に固定された神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な結合種と;
表面に固定された信号伝達エンティティより成るアーティクル。 - SPRアーティクルではない、表面を持つアーティクルと;
神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な複数の結合種より成るキットであり、前記結合種の少なくとも一部が前記表面に固定されている、または固定されるように改変されているキット。 - 表面を持つアーティクルと;
神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な複数の結合種より成るキットであり、前記結合種の少なくとも一部が前記表面に固定されている、または固定されるように改変されており、前記表面が凝集体形成または原繊維形成種の非特異性結合を実質的に阻害する化学機能性を備えているキット。 - 神経変性疾病原繊維または凝集体と、前記原繊維または凝集体に対して固定化された少なくとも2個の粒子より成る系。
- 神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種に対してそれぞれ固定化された少なくとも2個の粒子より成る系。
- 金属を配位できる部分に固定された神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な結合種より成る組成物。
- 第1の表面および前記表面に固定されている、または固定されるように改変された神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な複数の結合種を備えたアーティクルを供給することと;
前記第1の表面を神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を含むと考えられるサンプルに曝露することより成る方法。 - 神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を含むサンプル中で神経変性疾病凝集体または原繊維を形成することと;
前記凝集体または原繊維を、表面および凝集体、原繊維、凝集体形成種または原繊維形成種を結合可能な複数の結合種を備えたアーティクルに曝露することより成る方法であって、
前記結合種が前記アーティクルの表面に固定されている、または固定されるように改変された方法。 - 第1のアーティクルの表面に固定されている、または固定されるように改変された、神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種ではないが、神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種を結合可能な結合種を供給することと;
前記結合種を神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種に変換することより成る方法。 - 神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種ではないが、神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種を結合可能な結合種を供給することと;
前記結合種を神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種と相互作用させることによって、神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種に変換し、神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種の存在時の凝集特性に関与させることと、
神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種の存在時の凝集特性を検出することより成る方法。 - 神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種を結合可能で、アーティクルの表面に固定されている、または固定されるように改変された結合種を供給することと;
随意に前記結合種を前記アーティクルの表面に固定させることと;
前記結合種を神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種に変換せずに、神経変性疾病凝集形成または原繊維形成種に結合させることと、
第2のアーティクルの表面に固定されている、または固定されるように改変された第2の結合種を、前記凝集形成または原繊維形成種に結合させることより成る方法。 - 結合種がペプチドである、上述の請求項のいずれかに記載のキット、方法、組成物、系またはアーティクル。
- 結合種がタンパク質である、請求項1〜5のいずれかに記載のキット、方法、組成物、系またはアーティクル。
- 結合種がタンパク質からの配列である、請求項1〜5のいずれかに記載のキット、方法、組成物、系またはアーティクル。
- 結合種が小規模の分子である、請求項1〜5のいずれかに記載のキット、方法、組成物、系またはアーティクル。
- 小規模の分子がコンゴレッドまたはチオフラビンTである、請求項17に記載のキット。
- 結合種が凝集形成または原繊維種に対する抗体である、請求項1〜5のいずれかに記載のキット、方法、組成物、系またはアーティクル。
- 結合種が神経変性原繊維または凝集体を結合可能である、請求項1に記載のキット、方法、組成物、系またはアーティクル。
- 結合種が複数の神経変性疾病原繊維または凝集体に結合した複数のアーティクルを含むマクロ構造を形成可能である、請求項20に記載のキット。
- 結合種が神経変性疾病に特徴的な凝集を持つタンパク質である、上述の請求項のいずれかに記載のキット、組成物、アーティクル、系または方法。
- 結合種がベータアミロイドタンパク質、アミロイドタンパク質、Tau、シンヌクレイン、PrP CJD、PrP BSE、PrP Scrapic、およびそのフラグメントならびに融合物である、上述の請求項のいずれかに記載のキット、組成物、アーティクル、系または方法。
- タンパク質、フラグメントまたは融合物が凝集体結合、凝集体形成耐性である、上述の請求項のいずれかに記載のキット、組成物、アーティクル、系または方法。
- アーティクルが流体中に浮遊可能で、単離可能な粒子である、請求項1−5に記載のキット。
- アーティクルがコロイド粒子である、請求項25に記載のキット。
[請求項26.1]
アーティクルが金コロイド粒子である、請求項25に記載のキット。 - アーティクルがSPRチップである、請求項1−5に記載のキット。
- 少なくとも一部の結合種に固定されている、または固定されるように改変された粒子をさらに含む、請求項22に記載のキット。
- 少なくとも一部の結合種に固定されている、または固定されるように改変された粒子をさらに含む、請求項1−5に記載のキット。
- アーティクルが粒子であり、キットがさらに少なくとも一部の結合種に固定されている、または固定されるように改変された追加の粒子をさらに含む、請求項1−5に記載のキット。
- 表面に固定されている、または固定されるように改変された結合種が金属結合タグ/金属/キレート結合によって表面に固定可能である、請求項1−5に記載のキット。
- 表面が、表面に対して固定化された金属を配位しているキレートを持ち、結合種がポリアミノ酸タグによって誘導体化される、請求項31に記載のキット。
- 表面が、表面に対して固定化された金属を配位しているキレートを持ち、結合種がヒスチジンタグによって誘導体化される、請求項31に記載のキット。
- 表面に固定されている、または固定されるように改変された結合種が相補核酸配列対によって表面に固定可能である、請求項1−5に記載のキット。
- 結合種が末端システインを持ち、それにより表面に固定されている、請求項1−5に記載のキット。
- 少なくとも一部の結合種に固定された複数の粒子より成るキットであり、表面以外に固定化された補助凝集体形成または原繊維形成種がない場合に、補助凝集体または原繊維形成種が存在しない場合の凝集を補助凝集体または原繊維形成種が存在する場合の凝集と比較可能な時間内に、粒子上または粒子曝露時の粒子凝集が十分に阻害される低い表面濃度において、結合種が粒子の表面に対して固定化されている、請求項30に記載のキット。
- さらに神経変性疾病を阻害する候補薬剤より成る、請求項30に記載のキット。
- 表面に自己集合単層を持つ、請求項3−5に記載のキット。
- 自己集合単層がコロイド/コロイド自己凝集を阻害する種より成る、請求項38に記載のキット。
- 自己集合単層が荷電部分を含む、請求項39に記載のキット。
- 自己集合単層がカルボキシ末端種を含む、請求項39に記載のキット。
- 荷電部分がニトリロトリ酢酸、2,2−ビス(サリチリデンアミノ)−6,6−デメチルジフェニル、または1,8−ビス(a−ピリジル)−3,6−ジチアオクタンを含む、請求項40に記載のキット。
- 荷電部分がニトリロトリ酢酸より成る、請求項42に記載のキット。
- 自己集合単層がオリゴヌクレオチドより成る、請求項38に記載のキット。
- 自己集合単層がDNA部分より成る、請求項44に記載のキット。
- 自己集合単層が荷電ペプチドを含む、請求項38に記載のキット。
- 自己集合単層が界面活性剤を含む溶液より表面上に付着した、請求項38に記載のキット。
- 自己集合単層がカルボン酸塩を含む溶液より表面上に付着した、請求項38に記載のキット。
- 自己集合単層がコロイド粒子自体の形成中以外に表面に付着した、請求項38に記載のキット。
- 自己集合単層が流体中に浮遊状態に保たれた表面に付着し、粒子が流体−流体界面に存在しない、請求項38に記載のキット。
- 自己集合単層がさらに結合種より成る混合自己集合単層である、請求項38に記載のキット。
- 結合種が末端システインを持つペプチドであり、表面が金である、請求項1および3−5に記載のキット。
- 結合種が神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種ではない、上述のいずれかの請求項に記載のキット、方法、組成物、系またはアーティクル。
- 結合種が他の結合種を神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種に変換することができない、請求項53に記載のキット、方法、組成物、系またはアーティクル。
- 結合種が神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種によって凝集体形成または原繊維形成種に変換される、上述のいずれかの請求項に記載のキット、方法、組成物、系またはアーティクル。
- 凝集体形成または原繊維形成種に変換された結合種が、他の結合種を凝集体形成または原繊維形成種に変換可能である、請求項55に記載のキット、方法、組成物、系またはアーティクル。
- 金属を配位可能な部分がポリアミノ酸タグより成る、請求項8に記載の組成物。
- 金属を配位可能な部分がヒスチジンタグより成る、請求項8に記載の組成物。
- 結合種が金属を配位可能な部分にN−末端で固定されたペプチドである、請求項20に記載の組成物。
- さらにアーティクルの表面に対して固定化された金属を配位可能な部分より成る、請求項26に記載のキット。
- 結合種が少なくとも1個のキレート、カルボン酸塩基、n−ヒドロキシ−スクシンイミド、核酸配列、グルタチオニン、ビオチン、ストレプトアビジン、またはそのフラグメントによって表面に固定されている、または固定されるように改変された、請求項1−5に記載のキット。
- 流体中に浮遊可能で、単離可能な粒子の断面がいずれの方向でも250nmを超えない、請求項25に記載のアーティクル。
- 流体中に浮遊可能で、単離可能な粒子の断面がいずれの方向でも100nmを超えない、請求項25に記載のアーティクル。
- コロイド粒子および金属を配位可能な部分より成る該粒子の表面上の自己集合単層より成る、請求項60に記載のアーティクル。
- 自己集合単層がキレートを含む、請求項65に記載のアーティクル。
- 自己集合単層がニトリロトリ酢酸、2,2−ビス(サリチリデンアミノ)−6,6−デメチルジフェニル、または1,8−ビス(a−ピリジル)−3,6−ジチアオクタンを含む、請求項66に記載のアーティクル。
- 自己集合単層が、自己集合単層形成種を含む混合自己集合単層であり、すべてでなく一部の自己集合単層形成種が金属を配位可能な部分を含む、請求項65に記載のアーティクル。
[請求項68.1]
さらに信号伝達エンティティより成る、請求項60に記載のアーティクル。 - 複数の信号伝達エンティティより成る、請求項68に記載のアーティクル。
- コロイド粒子に固定された複数の信号伝達エンティティより成る、請求項68に記載のアーティクル。
- 少なくとも2個の粒子がそれぞれ神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合する結合種に固定されている、請求項7に記載の系。
- 少なくとも2個の粒子がそれぞれ、粒子に固定され、原繊維または凝集体を結合する結合種によって原繊維または凝集体に対して固定化されている、請求項6に記載の系。
- 少なくとも2個の粒子に対して固定化されている原繊維または凝集体より成り、少なくとも1個の粒子が第2の原繊維または凝集体に対して固定化されている、請求項72に記載の系。
- 粒子および原繊維または凝集体がヒトの肉眼で見える構造体を形成する、請求項73に記載の系。
- 凝集体または原繊維を結合種に固定可能な複数のコロイドに曝露することと、それによってコロイドを原繊維または凝集体に結合することをより成る、請求項10に記載の方法。
- コロイドの添加によって原繊維または凝集体を目視検出可能にすることより成る、請求項75に記載の方法。
- 表面が粒子の表面であって、
前記表面に固定化された結合種を持つ複数の粒子を供給することと; 前記粒子をサンプルに曝露することより成る、請求項9に記載の方法。 - さらに、サンプル中に存在する神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を示す、粒子の凝集範囲を決定することより成る、請求項77に記載の方法。
- 表面が粒子の表面であって、
粒子の表面に固定されている、または固定されるように改変された複数の粒子および結合種を供給することと;
前記粒子および結合種をサンプルに曝露することより成る、請求項9に記載の方法。 - 結合種およびサンプルが多様な生物種より由来する、請求項78に記載の方法。
[請求項80.1]
相互作用する種およびサンプルが多様な生物種より由来する同一のタンパク質またはタンパク質フラグメントである、請求項80に記載の方法。 - さらに、粒子の凝集範囲を決定することより成る、請求項78に記載の方法。
- サンプルが神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を含み、曝露ステップが神経変性疾病原繊維または凝集体形成を阻害すると考えられる候補薬剤の存在下で粒子および結合種をサンプルに曝露することを含む、請求項81に記載の方法。
- サンプルが細胞から分泌される、請求項82に記載の方法。
- さらに、粒子の凝集範囲を決定することより成る、請求項83に記載の方法。
- 最初にサンプルを分泌する細胞を、神経変性疾病を阻害すると考えられる候補薬剤に曝露させることと、次に粒子および結合種を前記サンプルに曝露させることより成る、請求項84に記載の方法。
- 薬剤が、神経変性疾病に関連する活性を備えた酵素を阻害すると考えられる、請求項85に記載の方法。
- 候補薬剤がβ−分泌酵素を阻害すると考えられる、請求項86に記載の方法。
- 候補薬剤がγ−分泌酵素を阻害すると考えられる、請求項86に記載の方法。
- 曝露ステップが、1−38〜1−44のアミノ酸配列を含むβ−アミロイドの存在下で粒子をサンプルに曝露することを含む、請求項82に記載の方法。
- β−アミロイドペプチドが1−40のアミノ酸配列を含む、請求項89に記載の方法。
- 曝露ステップが、神経変性疾病に関連すると考えられるサンプルから得た生物試料に粒子を曝露させることより成る、請求項78に記載の方法。
- 試料を粒子および結合種に曝露することより成る、請求項91に記載の方法。
- サンプルが血液サンプルより成る、請求項91に記載の方法。
- サンプルをヒト患者より採取する、請求項91に記載の方法。
- サンプルを動物より採取する、請求項91に記載の方法。
- サンプルを家畜より採取する、請求項91に記載の方法。
- サンプルを家畜飼料より採取する、請求項91に記載の方法。
- サンプルを臓器提供サンプルより採取する、請求項91に記載の方法。
- さらに、粒子をサンプルに曝露したときに、目視可能なサンプルの変化を観察することより成る、請求項78に記載の方法。
- 目視可能な変化が粒子の凝集より成る、請求項107に記載の方法。
- 目視可能な変化が金コロイド粒子の凝集より成る、請求項108に記載の方法。
- 目視可能な変化が色の変化より成る、請求項107に記載の方法。
- さらに、サンプルに粒子を曝露させるときに、光散乱装置を使用して有効粒子/凝集サイズの変化を測定することより成る、請求項78に記載の方法。
- サンプルの画像をデジタル化することと、次にパターン認識を使用してどのサンプルが凝集体を含んでいるかを判定することより成る、請求項78に記載の方法。
- 表面以外に固定化された補助凝集体形成または原繊維形成種がない場合に、補助凝集体または原繊維形成種が存在しない場合の凝集を補助凝集体または原繊維形成種が存在する場合の凝集と比較可能な時間内に、粒子上または粒子曝露時の粒子凝集が十分に阻害される表面濃度において、結合種が粒子の表面に対して固定化されている、請求項91に記載の方法。
- さらに、結合種とサンプル中に存在するすべての凝集体形成または原繊維形成種との相互作用を判定することより成る、請求項9に記載の方法。
- 結合種およびサンプルが多様な生物種である、請求項9に記載の方法。
- 凝集体形成または原繊維形成種に結合する粒子に対して固定化された結合種の存在下で、サンプルに表面を曝露することより成る、請求項9に記載の方法。
- 粒子が補助信号伝達エンティティを備えている、請求項116に記載の方法。
- 補助信号伝達エンティティが、ワサビダイコンペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む、染料、色素、電子活性粒子、蛍光部分、アップレギュレーションリン光体、酵素固定信号伝達部分より成る、請求項117に記載の方法。
- 表面が電極表面であり、粒子が前記表面に固定化された電子活性種を備えている、請求項116に記載の方法。
- 粒子が複数の固定化された電子活性種を備えている、請求項119に記載の方法。
- 複数の電子活性種がメタロセンより成る、請求項120に記載の方法。
- 複数の電子活性種がフェロセンより成る、請求項120に記載の方法。
- アーティクルが磁気ビードである、請求項9に記載の方法。
- アーティクルがSPRチップである、請求項9に記載の方法。
- アーティクルが電極である、請求項9に記載の方法。
- アーティクルがELISAプレートである、請求項9に記載の方法。
- 表面が複数の個別および空間的に位置指定可能な領域より成る、請求項9に記載の方法。
- 個別および空間的に位置指定可能な領域が多ウェルプレートの別個のウェルより成る、請求項128に記載の方法。
- 神経変性疾病を阻害する候補薬剤の存在下で、表面にサンプルを曝露することより成る、請求項132に記載の方法。
- さらに、候補薬剤の存在による、凝集体形成または原繊維形成種と表面固定化結合種との相互作用の低下を観察することを含む、請求項133に記載の方法。
- サンプルが凝集体形成または原繊維形成種を含んでいても、含んでいなくてもよい、請求項9に記載の方法。
- サンプルが凝集体形成または原繊維形成種を含む薬剤スクリーニング調製物である、請求項145に記載の方法。
- 表面が粒子表面であり、
結合種、結合種に固定された粒子および固定種に固定可能な磁気ビードより成る、流体溶媒中に浮遊した組成物を作成することと;
前記組成物をサンプルに曝露することより成る、請求項9に記載の方法。 - 粒子および/または磁気ビードが固定化キレートを備え、少なくとも一部の結合種がキレートによって配位される金属に固定可能な金属結合タグを備えている、請求項135に記載の方法。
- 各粒子およびビードの少なくとも一部が結合種に固定されている、請求項137に記載の方法。
- 組成物がさらに、粒子に固定されている、または固定可能な酸化還元活性種より成る、請求項137に記載の方法。
- さらに、神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を含むと考えられるサンプルに組成物を曝露することより成る、請求項137に記載の方法。
- さらに、神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種および神経変性疾病を阻害する候補薬剤を含むサンプルに組成物を曝露することより成る、請求項137に記載の方法。
- さらに、酸化還元活性剤を含む粒子に固定された凝集体形成または原繊維形成種に固定された少なくとも一部の磁気ビードを電極に引きつけることと、電極に近接した酸化還元活性剤の有無を判定することより成る、請求項142に記載の方法。
- 電極が非特異結合性の阻害剤によってコートされている、請求項144に記載の方法。
- 非特異結合性の阻害剤が自己集合単層より成る、請求項145に記載の方法。
- 自己集合単層がポリエチレングリコール末端自己集合単層形成種より成る、請求項146に記載の方法。
- 自己集合単層がさらに、電子に対する自己集合単層の透過性を向上させる種より成る、請求項146に記載の方法。
- 電子に対する透過性を向上させる種が、導電性自己集合単層形成種より成る、請求項149に記載の方法。
- 電子に対する透過性を向上させる種が、自己集合単層の欠陥部位を生じさせる種より成る、請求項149に記載の方法。
- 信号伝達エンティティが複数の信号伝達エンティティである、上述の請求項のいずれかに記載の組成物、アーティクル、方法、系またはキット。
- 結合種に他の結合種を神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種に変換させることより成る、請求項11に記載の方法。
- 結合種に神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種と相互作用させることと、それによって神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種に構造変換させることと、次に前記種を他の結合種に変換させることより成る、請求項153に記載の方法。
- 神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種でない、表面以外に結合した補助結合種に系を曝露することと、前記補助結合種を神経変性凝集体形成または原繊維形成種に変換させることより成る、請求項11に記載の方法。
- 結合種が最初にアーティクルの表面に固定される、請求項11に記載の方法。
- 結合種が最初にアーティクルの表面に固定されない、請求項11に記載の方法。
- 結合種および神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種が異なる生物分類種に由来する、請求項13に記載の方法。
- 表面を自己集合単層形成分子種および界面活性剤を含む媒体に曝露することによって、表面上に自己集合単層を作成することより成る方法。
- 表面を自己集合単層形成分子種およびカルボン酸塩を含む媒体に曝露することによって、表面上に自己集合単層を作成することより成る方法。
- コロイド粒子の表面上に、コロイド粒子自体の形成時以外に、自己集合単層を作成することより成る方法。
- 流体中で浮遊状態にあるコロイド粒子の表面上に自己集合単層を作成することより成り、前記粒子が流体−流体界面に存在していない方法。
- 自己集合単層形成分子種および界面活性剤を含む媒体が溶液または懸濁液である、請求項159および160に記載の方法。
- さらに、表面上に自己集合単層を作成した後に、自己集合単層から残留界面活性剤をすべて除去することより成る、請求項159に記載の方法。
- 神経変性疾病凝集体または原繊維形成種をそれぞれ結合可能であって、相互に固定化された、または相互に固定化されるように改変された少なくとも2個の結合種を供給することと、それによって神経変性疾病凝集体または原繊維リンカーを規定することと、
前記リンカーを、神経変性疾病凝集体または原繊維種を含むと考えられるサンプルあるいは神経変性疾病を阻害する候補薬剤を含む溶液に曝露することより成る方法。 - 神経変性疾病凝集体または原繊維形成種を分泌するよう改変された細胞を、神経変性疾病を阻害する候補薬剤に曝露することと、
神経変性疾病に特徴的な凝集体を形成する細胞から分泌される物質のポテンシャルを監視することより成る方法。 - 神経変性疾病凝集体形成または原繊維形成種を結合可能な種および神経変性疾病凝集体または原繊維形成を阻害する候補薬剤のための神経変性疾病凝集体または原繊維形成種を含むと考えられる1個のサンプルを含む溶液を作成することと、
成分を前記溶液に移したり、容器から溶液を取り出したりせずに、神経変性疾病に特徴的な溶液中の凝集体を検出することより成る方法。 - エネルギーを流体に導入することより成る方法。
- 原繊維または凝集体を見えるようにすることより成る、上述の請求項のいずれかに記載の方法。
- アーティクルが流体中に浮遊可能な粒子である、上述の請求項のいずれかに記載のアーティクル、方法、キット、系または組成物。
- アーティクルが磁気的に浮遊可能な粒子である、上述の請求項のいずれかに記載のアーティクル、方法、キット、系または組成物。
- アーティクルが自己浮遊可能な粒子である、上述の請求項のいずれかに記載のアーティクル、方法、キット、系または組成物。
- 結合種が表面に特異的に固定されている、または特異的に固定されるように改変される、上述の請求項のいずれかに記載の方法、アーティクル、系、キットまたは組成物。
- サンプルが天然型サンプルである、上述の請求項のいずれかに記載の方法、アーティクル、系、キットまたは組成物。
- サンプルが構造的に既定されたサンプルである、上述の請求項のいずれかに記載の方法、アーティクル、系、キットまたは組成物。
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