WO2017138696A1 - 단백질 응집형의 검출 방법, 전기화학적 검출 키트 및 이를 이용한 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법 및 전기화학적 진단 키트 - Google Patents

단백질 응집형의 검출 방법, 전기화학적 검출 키트 및 이를 이용한 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법 및 전기화학적 진단 키트 Download PDF

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protein
impedance
disease
antibody
protein aggregation
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PCT/KR2016/015393
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조원우
고경옥
박종배
르반롱
이준옥
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주식회사 캔티스
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/02—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting protein aggregation, an electrochemical detection kit, and a method for diagnosing abnormal protein aggregation-related diseases and an electrochemical diagnostic kit using the same.
  • Alzheimer's disease which is caused by degenerative brain neuropathy, accounts for 60% to 80% of the dementia. Symptoms usually begin with a name and recent events. Swallowing disorders appear and lead to death. The disease is characterized by a slow onset, normal function for a long time after birth, and symptoms, and once developed, the disease continues for several years or decades until death. It is not developed.
  • Alzheimer's disease is known to be caused by an increase in the proportion of beta amyloid oligomers present in the brain, and beta amyloid is a water-soluble substance that is known to pass through the blood brain barrier. Efforts are being made to diagnose and diagnose Alzheimer's disease.
  • Beta amyloid is a toxic protein that accumulates in the brain and destroys neuronal cells, and gradually becomes a plaque in which beta amyloid aggregates out of nerve cells.
  • proteins in nerve cells tau proteins
  • tau proteins proteins in nerve cells
  • neurotransmitters that decrease as Alzheimer's progresses to improve the symptoms of the disease. Therefore, it is necessary to early diagnose and solve the problem of aggregation or misfolding of beta amyloid and tau protein which are increased in vivo from several decades before Alzheimer's disease progresses.
  • An object of the present invention is to provide a method and a detection kit for accurately detecting protein aggregates such as beta amyloid by a simple method.
  • An object of the present invention is to provide a method and a diagnostic kit for diagnosing abnormal protein aggregation-related diseases using the method and kit.
  • the present invention measures the monomerization process of proteins in real time electrochemically, thereby preventing diagnostic errors due to non-specific binding of complex materials included in raw samples such as blood, cerebrospinal fluid, runny nose, saliva and the complex processing of diagnosis.
  • the present invention provides a detection kit and a diagnostic kit capable of detecting protein aggregates more accurately by detecting an amount of sensor change caused by monomerization of a target substance and diagnosing related diseases.
  • a method of diagnosing a disease by measuring polymers of beta amyloid and tau protein in blood or plasma without a control or a comparison group.
  • the protein aggregation type detection method which compares a 3rd impedance also at the time of a comparison of a 1st and 2nd impedance.
  • the protein is a group consisting of beta amyloid, tau, alpha-synuclein, prion (Prion), polyglutamine, tosin A (torsinA), amyloid transthyretin and amyloid protein Protein aggregation detection method selected from.
  • the raw sample is selected from the group consisting of blood, plasma, spinal fluid, brain homogenate, lymph, saliva and semen.
  • the first impedance is a protein aggregate detection method of the impedance of each protein aggregate is bound to each antibody.
  • the monomerization is at least one method selected from the group consisting of a method of adding a monomerizing composition to a protein aggregate bound to an antibody, a method of applying an electric field, a method of applying a microwave and a method of applying an infrared laser. Method for detecting protein aggregates performed.
  • the monomerizing composition is a protein aggregation type detection method of a surfactant comprising a compound represented by the following formula (1):
  • the second impedance is an impedance of a state in which individual proteins bind to antibodies, respectively.
  • a method for diagnosing abnormal protein aggregation related diseases comprising the method of any one of 2 to 12 above.
  • the abnormal protein aggregation-related diseases are Parkinson's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis, polyglutamine expansion disease, spinocerebellar ataxia ataxia, spinal and bulbar muscular atrophy, tauopathy, dystonia, serpin deficiency, cirrhosis, type II diabetes, primary systemic amyloidosis, Secondary systemic amyloidosis, Fronto-temporal dementias, geriatric systemic amyloidosis, familial amyloid polyneuropathy, hereditary cerebral amyloidangiopathy, hemodialysis-related macular degeneration age-related macular degeneration, Alzheimer's disease, and radiotherapy induced dementia mentia, axon injury, acute cortical spreading depression, alpha-synucleinopathies, brainischemia, permanent focal cerebralischemia, peripheral Abnormal protein aggregation selected from the group consisting of peripheral nerveregeneration, post-status epilepticusmodel, spinal cord injury, spor
  • an impedance measuring unit for measuring impedance by comparing the amplitude and phase of the AC signal input and output from the electrode unit.
  • the protein is a group consisting of beta amyloid, tau, alpha-synuclein, prion (Prion), polyglutamine, tosin A (torsinA), amyloid transthyretin and amyloid protein Protein aggregation detection kits selected from.
  • a diagnostic kit for abnormal protein aggregation related diseases comprising the detection kit of any one of 15 to 17 above.
  • the abnormal protein aggregation-related diseases include Parkinson's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis, polyglutamine expansion disease, spinocerebellar ataxia ataxia, spinal and bulbar muscular atrophy, tauopathy, dystonia, serpin deficiency, cirrhosis, type II diabetes, primary systemic amyloidosis, Secondary systemic amyloidosis, Fronto-temporal dementias, geriatric systemic amyloidosis, familial amyloid polyneuropathy, hereditary cerebral amyloidangiopathy, hemodialysis-related macular degeneration age-related macular degeneration, Alzheimer's disease, and radiotherapy induced d ementia, axon injury, acute cortical spreading depression, alpha-synucleinopathies, brainischemia, permanent focal cerebralischemia, peripheral Abnormal protein aggregation selected from the group consisting of peripheral nerveregeneration, post-status epilepticusmodel, spinal cord injury,
  • the protein aggregate detection method of the present invention can quantitatively and real time analyze how much protein is present in aggregate in a raw sample by a simple method. Thus, it can be widely used as a diagnostic method for diseases related to abnormal protein aggregation.
  • the method and diagnostic kit of the present invention is a complex of diagnostics and complex materials contained in biological samples such as blood, cerebrospinal fluid, runny nose, saliva by reacting the raw sample with the diagnostic kit and then measuring the monomer monomerization process of the protein electrochemically in real time. Diagnostic errors due to non-specific binding according to the treatment process can be prevented, and sensor changes due to monomerization of the target material can be detected to quantitatively detect protein aggregates and diagnose related diseases.
  • FIG. 1 is a front view schematically showing an antibody portion in which an antibody is immobilized in a protein aggregation detection kit according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a front view showing a case where the protein and its aggregates are bound to the antibody by adding a plasma containing protein aggregates to the antibody portion in the protein aggregate detection kit according to an embodiment of the present invention, the rest is removed with PBS buffer .
  • FIG. 3 is a front view illustrating a case where the protein aggregate is monomerized by adding the monomerizing composition in FIG. 2.
  • FIG. 4 is a diagram showing that the amount of change in impedance increases as the degree of aggregation of protein increases.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a case where the protein aggregate is monomerized by applying an electric field to the protein aggregate.
  • Figure 6 shows the change in the absolute value of impedance according to the degree of beta amyloid aggregation between Alzheimer's dementia patients and normal people.
  • the present invention comprises the steps of adding a raw sample containing a protein aggregate to a plurality of antibodies of the protein to measure the first impedance; Monomerizing the protein aggregate to measure a second impedance; And comparing the first and second impedances to quantitatively analyze in real time how many proteins are present in the raw sample in a simple manner, thereby diagnosing a disease associated with abnormal protein aggregation.
  • the present invention relates to a protein aggregation detection method and a detection kit that can be widely used.
  • the present invention is a disease associated with abnormal aggregation or misfolding of proteins by dissolving and analyzing the aggregated protein in the blood of diseases or diseases such as Alzheimer's disease and other diseases or disorders caused by the aggregation of the protein caused by aggregation of beta amyloid Or an accurate diagnosis system of the disease.
  • the diagnostic system attempts to surface-modify a thiol group or an aldehyde group on a gold electrode or plate, form an amino group according to the amine group of the protein, fix the antibody to the sensor surface, and electrically measure the biochemical properties of the protein bound to the antibody.
  • the present invention provides a method for diagnosing a disease by measuring a polymer of beta amyloid and tau protein contained in blood or plasma without a control or a comparison group.
  • the present invention is a disease or disorder associated with abnormal aggregation or misfolding of proteins that decompose the beta amyloid polymer into monomers containing EPPS or detergent and electrically measure the binding of the beta amyloid antibody to the monomer. It provides a system for diagnosing the problem.
  • the present invention provides a system for diagnosing diseases or disorders related to abnormal aggregation or misfolding of proteins, characterized in that the polymer can be decomposed into monomers having an electric field, micro wave, and IR in addition to the monomerizing composition. .
  • 1 is a view showing a state in which beta amyloid antibody is bound between sensor electrodes.
  • a working electrode and a counter electrod are formed on the glass plate and the surface is cleaned. Then, the beta amyloid antibody is bound between the electrodes through the surface treatment process. At this time, the beta amyloid antibody can be bound by injecting it into the well formed sensor electrode by mixing in PBS Buffer or DI water in the concentration of several fg / ml ⁇ several hundred ug / ml. After binding, wash with PBS buffer or DI water.
  • plasma (plasma) containing beta amyloid is injected into a well in which the beta amyloid antibody of FIG. 1 is stably formed.
  • the wells in which the sensor is formed are washed with DI water or PBS buffer.
  • beta amyloid in plasma may include monomers, dimers, trimers, and various types of polymers.
  • beta amyloid may be a biological sample such as whole blood, cerebrospinal fluid (CSF), endoplasmic reticulum, as well as substances in plasma (plasma).
  • CSF cerebrospinal fluid
  • endoplasmic reticulum as well as substances in plasma (plasma).
  • FIG. 3 is an injection of a monomerization composition capable of separating protein aggregation or misfolding.
  • the monomerization composition may be composed of EPPS or detergent type materials, and may be disposed in DI water (ultra pure water solution) or PBS buffer. A predetermined concentration such as?
  • the monomerizing composition separates polymer materials such as dimers and trimers of beta amyloid already combined with beta amyloid antibody into monomers, and a new antigen antibody reaction proceeds with beta amyloid antibody formed on the surface.
  • beta amyloid is bound to beta amyloid 40 or 42 polymers, fibril precursors, fibrils, plaques, beta amyloid aggregates, beta amyloid monomers and polymers linked to other proteins, beta amyloids bound to fats or carbohydrates, nucleic acids Beta-amyloid and the monomer associated with blood cells may be degraded.
  • polymers, aggregates or misfolded proteins of the tau may be degraded into monomers.
  • the antigen-antibody reaction is applied to a predetermined electrical signal to the electrode to electrically analyze the biochemical binding characteristics over time.
  • Figure 4 shows the impedance change over time after injecting the monomerizing composition after washing with DI water.
  • impedance refers to conductance and capacitance, which are exactly the inverses of impedance, and may include resistance and reactance.
  • the sensor of FIG. 2 may be applied to apply an electric field and decompose the polymer of beta amyloid into monomers.
  • beta amyloid measures the impedance value of the sensor based on the state of washing with DI water or PBS buffer after antigen antibody binding or the state of washing with DI water or PBS buffer.
  • a predetermined electrical field may be applied to electrically measure the process of newly binding to the beta amyloid antibody as the beta amyloid polymer is decomposed into monomers.
  • the present invention also provides a method for detecting protein aggregates.
  • a raw sample including protein aggregates is added to a plurality of antibodies of the protein to measure a first impedance.
  • Protein aggregation in the present specification means that the protein accumulates abnormally to form aggregates.
  • the protein is not particularly limited as long as it can form aggregates, for example beta amyloid, tau, alpha-synuclein, prion, polyglutamine, toxin, which can form toxic protein aggregates.
  • A torsinA
  • amyloid transthyretin amyloid protein.
  • proteins capable of forming protein aggregates particularly proteins capable of forming toxic protein aggregates, and proteins that cause diseases described below may all be applied.
  • beta amyloid examples include beta amyloid 40 or 42 polymer, fibrils precursors, fibrils, plaques, beta amyloid aggregates, beta amyloid monomers and polymers linked to other proteins, beta bound to fats or carbohydrates. Amyloid, beta amyloid bound to nucleic acids, and monomers bound to blood cells may be degraded.
  • a biosample is a sample containing the protein aggregate, and its kind is not particularly limited, and examples thereof include blood, plasma, spinal fluid, brain homogenate, lymph, saliva, and semen.
  • the raw sample may be one that is collected, removed, or discharged from the body (is separated into the body).
  • the raw sample containing the protein aggregate is added to the plurality of antibodies of the protein to measure the first impedance.
  • a raw sample including protein aggregates may include various types of protein aggregates such as protein dimers and polymers, and may also include monomers.
  • An antibody recognizes a specific binding site of the protein. In general, as shown in FIG. 2, one antibody (monomer or aggregate) is bound to one antibody.
  • the raw sample may be added on the antibody portion to which a plurality of antibodies are immobilized.
  • the raw sample is added to the antibody and its impedance (first impedance) is measured. That is, the first impedance may be an impedance of a state in which each protein aggregate is bound to each antibody.
  • the impedance may mean the inverse of the conductance and the capacitance, and may include the resistance and the reactance.
  • the present invention may further include removing a portion of the raw sample not bound to the antibody before adding the raw sample and measuring the first impedance.
  • the raw sample may include various components in addition to the protein capable of binding to the antibody and aggregates thereof, portions (components) of the raw sample not bound to the antibody may be removed before the measurement of the first impedance.
  • the removal may be performed by adding a liquid to the antibody to which the protein is bound to wash the portion.
  • the liquid may be, for example, deionized water, phosphate buffered saline (PBS) buffer, 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) buffer, surfactant, or the like.
  • the surfactant may be used without limitation so long as it does not cause structural modification or damage to proteins or antibodies, and examples thereof include twin surfactants, and specifically, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Tween 81, etc. are mentioned.
  • the surfactant may be used after dilution in water (for example, deionized water).
  • the protein aggregates are monomerized to measure a second impedance.
  • the monomerization method is not particularly limited, and may be, for example, a method of adding a monomerizing composition to a protein aggregate bound to an antibody, a method of applying an electric field, a method of applying a microwave, a method of applying an infrared laser, or the like. It can be based on one or more of the above methods.
  • the monomerizing composition is not particularly limited as long as it is a substance capable of dividing protein aggregates into individual monomers without damaging the binding site of the protein or antibody, and may be, for example, a surfactant, and specifically, a compound represented by the following Formula 1 It may include.
  • Monomerization compositions can be used with deionized water, PBS buffers, surfactants, and the like.
  • the use of the monomerizing composition in the solvent is not particularly limited and may be included, for example, at a concentration of 0.1 mM to 2000 mM.
  • an electric field of several to several thousand V / ⁇ m may be applied to the protein aggregate bound to the antibody for several picoseconds, and specifically, 1 V / ⁇ m to 5000 V for 1 picosecond to 5000 picoseconds.
  • An electric field of / ⁇ m may be applied, but is not limited thereto.
  • a microwave of a frequency of 10 MHz to 50 GHz can be added to the protein aggregate bound to the antibody with an output of 1 watt or less, but is not limited thereto.
  • a laser having a frequency corresponding to the resonance frequency of the protein aggregate may be added to the protein aggregate bound to the antibody.
  • a laser having a frequency of ⁇ 20% of the resonance frequency of the protein aggregate may be added, but is not limited thereto.
  • the resonance frequency of the protein aggregate can be known by a method known in the art, for example, it can be detected by an infrared detector, but is not limited thereto.
  • the resonant frequency of the protein aggregate may be different for each protein aggregate, rather than one specified value, and the frequency may be adjusted accordingly.
  • the second impedance is measured after monomerizing the protein aggregate bound to the antibody by various methods as described above.
  • the second impedance may be measured after removing the monomerizing composition, or may be measured in the presence of the monomerizing composition.
  • the first impedance is an impedance in a state in which a protein aggregate and an additional monomer are included in an antibody as illustrated in FIG. 2, and the second impedance is a protein aggregate as illustrated in FIG. 3. Since the impedance is coupled to the monomerized and empty antibody, the first and second impedances may show differences in their values.
  • the difference can also be greater depending on how much the protein is in aggregate.
  • the protein aggregation type detection method of the present invention may further measure the impedance (third impedance) one or more times during the monomerization of the protein aggregate.
  • Raw materials derived from raw materials such as proteins and antibodies may be affected by various conditions such as air, temperature, humidity, pH, and the like, and the absolute value of impedance may also be affected by such conditions.
  • the first and second impedances may also vary depending on other conditions as well as the monomerization of the protein aggregates.
  • the accuracy of detection can be further improved by analyzing the amount of change in real time from the start of the monomerization to the end of the monomerization.
  • the protein aggregation detection method of the present invention can quantitatively analyze in real time how much protein is present in aggregate in a raw sample.
  • the entire impedance measurement process can be continuously performed as a measurement sample using a plurality of antibodies to which a raw sample containing protein aggregates is added, without additional processing such as carrying out additional processing except for moving or washing the measurement sample. The process can be performed simply, thus minimizing factors that may affect the measured value.
  • the first impedance after washing was measured, and the real-time analysis and the second impedance were measured according to the treatment of the monomerizing composition without a separate reaction or additional process to measure the monomer of the protein. Only changes in process can be detected accurately.
  • the detection method of the protein aggregate type of the present invention can be used in various diagnostic methods, etc. If the protein forms a toxic protein aggregate, the disease associated with such toxic protein aggregate (abnormal protein aggregation) It can be utilized as a diagnostic method.
  • Abnormal protein aggregation-related diseases can be selected according to the type of protein, for example Parkinson's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis, polyglutamine expansion disease, spinocerebellar ataxia, spinal and bulbar muscular atrophy, tauopathy, dystonia, serpin deficiency, cirrhosis, Type II diabetes, primary systemic amyloidosis, secondary systemic amyloidosis, Fronto-temporal dementias, systemic amyloidosis in the elderly, familial amyloid polyneuropathy, hereditary cerebral amyloid angiopathy, hereditgio cerebral amyloidan Hemodialysis-related amyloidosis, age-related macular degeneration, Alzheimer's Disease, radiotherapy induced dementia, axon injury, acute cortical spreading depression, alpha-synucleinopathies, brain ischemia Permanent focal cerebralischemia, peripheral nerve regeneration, post-status epilepticusmodel, spinal cord injury, sporadic amyo
  • the present invention also provides a protein aggregation type electrochemical detection kit.
  • the protein aggregation type detection kit of the present invention includes an antibody portion, an electrode portion and an impedance measurement portion.
  • the antibody portion is a layer in which a plurality of antibodies against proteins capable of forming aggregates are immobilized.
  • the protein may be a protein exemplified above, and the antibody may be an antibody against that protein.
  • the antibody unit may be, for example, formed by fixing an antibody between sensing electrodes, but is not limited thereto.
  • the antibody can be injected by mixing in a solvent.
  • the solvent may be, for example, deionized water, PBS buffer, MOPS buffer, or the like. These can be used individually or in mixture of 2 or more types.
  • the antibody concentration may be, for example, several fg / ml to several tens mg / ml, and specifically, may be a concentration of 0.1 fg / ml to 80 mg / ml, but is not limited thereto.
  • a raw sample including protein aggregates may be applied to the antibody portion, and in the case where the antibody is injected into a well in which a sensing electrode is formed, for example, the raw sample may be added to the well. Thereby, protein aggregates contained in the raw sample can bind with the antibody.
  • An electrode part is energized with the antibody part and includes a working electrode and a counter electrode.
  • the energized means that current flows between each other, the electrode part and the antibody part may be energized through a conductor in the middle, or the electrode part and the antibody part may be in direct contact with each other.
  • the working electrode refers to an electrode used to cause a desired reaction among two electrodes used for flowing an electric current in a sample when an electrode reaction occurs, and any working material may be used without limitation.
  • the counter electrode measures the electrode potential of the working electrode
  • another separate electrode is prepared as a reference for the electrode potential to configure one battery, and the method of determining the open circuit voltage as the relative value of the electrode potential is taken. It means an electrode that is a reference of the time, it can be used without limitation as long as the conductive material.
  • the electrode may be composed of a plurality of working electrodes and counter electrodes, and they are formed at intervals of several nanometers to several hundred micrometers to increase detection sensitivity according to detection of a target protein.
  • the impedance measuring unit measures the impedance by comparing the amplitude and phase of the AC signal in the electrode unit.
  • the impedance may mean the inverse of the conductance and the capacitance, and may include the resistance and the reactance.
  • Impedance can be measured when the protein is bound to the antibody in aggregate and when monomerized.
  • the protein aggregation detection kit of the present invention can detect how much the protein is present in aggregate according to the change in the measured impedance value.
  • protein aggregation detection kit of the present invention may further include an impedance calculator and an impedance indicator.
  • the impedance calculator may calculate a change amount between the impedances measured plural times.
  • the impedance display unit may display the measured impedance or display the impedance change amount.
  • the present invention also provides an electrochemical diagnostic kit for abnormal protein aggregation-related diseases comprising the protein aggregation detection kit.
  • the protein aggregate detection kit can determine how aggregated the protein contained in the raw sample exists, if the protein forms a toxic protein aggregate, whether the disease caused by the protein aggregate has developed. Whether or not, the stage can be diagnosed.
  • the abnormal protein aggregation related diseases include, for example, Parkinson's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis, polyglutamine expansion disease, spinocerebellar ataxia, spinal cord And spinal and bulbar muscular atrophy, tauopathy, dystonia, serpin deficiency, cirrhosis, type II diabetes, primary systemic amyloidosis, secondary systemic amyloidosis, Fronto-temporal dementias, geriatric systemic amyloidosis, familial amyloid polyneuropathy, hereditary cerebral amyloidangiopathy, hemodialysis-related amyloidosis, macular degeneration degeneration), Alzheimer's disease, radiotherapy induced dementia, Axon injury, acute cortical spreading depression, alpha-synucleinopathies, brainischemia, permanent focal cerebralischemia, peripheral nerve regeneration ( peripheral nerve regeneration, post-status epilepticus model, spinal cord injury, sporadic amyotrophic lateral sclerosis and Creutzfeld
  • 1 is a view showing a state in which beta amyloid antibody is bound between sensor electrodes.
  • a plurality of working electrodes and counter electrodes were formed on the glass plate, and the sensor surface was acetone and plasma cleaned. Then, beta amyloid antibody was fixed between the electrodes through peptide bonds.
  • Beta amyloid antibody was immobilized by mixing the PBS buffer at a concentration of 10 ⁇ g / ml and injecting it into the flow path where the sensor electrode was formed. After fixing for about an hour, the remaining samples were cleaned without binding to PBS Buffer.
  • plasma (plasma) containing beta amyloid was injected into the flow path stably formed with beta amyloid antibody (as shown in FIG. 2). After about 30 minutes, amyloid and beta amyloid antibody were stably bound, and the flow path in which the sensor was formed was washed with PBS buffer.
  • beta amyloid may be composed of monomers, dimers, trimers, and polymers of various types, and thus may be fixed as shown in FIG. 2.
  • the polymerizing material such as dimers and trimers of beta amyloid is separated into monomers by the monomerizing composition, and a new antigen antibody reaction proceeds with beta amyloid antibody formed on the surface.
  • FIG. 4 is a graph illustrating the state in which the beta amyloid agglomerates and binds to the antibody formed on the surface, and measures the impedance over time while monomerizing it.
  • impedance refers to conductance and capacitance, which are exactly the inverses of impedance, and may include resistance and reactance.
  • 5 is a clinical test result using blood samples of dementia patients and normal people.
  • Blood samples from 10 patients with Alzheimer's dementia diagnosed with dementia through the PET-CT test from Seoul Atomic Hospital were compared with 10 normal blood samples.
  • Plasma of each blood sample was injected into the flow path of the kit, and then the experiment was performed in the same manner as described above.
  • the beta amyloid protein monomerization rate is high, so it can be seen that the amount of change in impedance relative to the initial impedance is large.
  • Eight sensors are included in one flow path, and the same sample is used for each sensor. 5 shows the values measured by each sensor. Based on the value of the Y-axis (about 0.05 in the figure), the amount of change in the monomerization of blood between patients and normal subjects is divided.

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Abstract

본 발명은 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 상기 단백질의 복수개의 항체에 가하여 제1 임피던스를 측정하는 단계; 상기 단백질 응집체를 단량체화하여 제2 임피던스를 측정하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 임피던스를 비교하는 단계;를 포함함으로써, 단백질이 생시료 내에서 얼마나 많이 응집형으로 존재하는지 여부를 간단한 방법으로 정량적으로 실시간 분석하여, 비정상 단백질 응집과 관련된 질병의 진단에 폭넓게 활용될 수 있는 단백질 응집형의 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.

Description

단백질 응집형의 검출 방법, 전기화학적 검출 키트 및 이를 이용한 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법 및 전기화학적 진단 키트
본 발명의 단백질 응집형의 검출 방법, 전기화학적 검출 키트 및 이를 이용한 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법 및 전기화학적 진단 키트에 관한 것이다.
최근 고령화와 함께 지난 4년간 노인인구가 17.4%가 증가하였으며 이중 치매노인의 수가 26.8%가 증가하였다. 보건복지부에 따르면 이러한 추이로 증가 시 2025년에는 100만명이 넘는 노인에게 치매가 올 것으로 예상하고 있다. 한편 이러한 치매는 퇴행성 뇌신경 질환으로 인한 알츠하이머성 치매가 60~80%를 차지하고 있는데, 증상은 주로 이름과 최근의 일을 기억 못하는 것으로 시작하여, 말기에는 판단착오, 길을 잃음, 행동 및 언어장애, 삼킴 장애 등이 나타나다 사망에 이르게 된다. 이러한 질환은 발병이 서서히 진행되고 출생 후 오랜 기간 동안 정상적인 기능을 하다가 증상이 나타나며, 일단 발병하면 사망할 때까지 몇 년 또는 몇십 년에 걸쳐 지속적으로 병이 진행되는 것이 특징인데, 현재 근본적인 치료 방법이 개발되지 않은 상황이다. 따라서 병의 증상을 완화시키고 병의 진행을 지연시킬 수 있는 약물의 치료 효과를 높이기 위해서는 무엇보다도 병을 조기에 발견하는 것이 중요하다. 알츠하이머병의 발병기전은 뇌에 존재하는 베타 아밀로이드의 올리고머의 비율이 증가하여 발병하는 것으로 알려져 있고 베타 아밀로이드는 수용성물질로 뇌혈관장벽(Blood Brain barrier)을 통과하는 것으로 알려져있어 혈액에서 베타 아밀로이드양을 측정하여 알츠하이머병을 진단하고자 하는 노력이 진행되고 있다.
베타 아밀로이드(beta amyloid)는 뇌에 축적되면서 뇌신경 세포를 파괴하는 독성 단백질로서, 점차 베타 아밀로이드가 뭉쳐 신경 세포 밖에서 덩어리를 이루는 구조(plaque)가 된다. 또한 신경 세포 안의 단백질(타우 단백질, tau protein)은 비정상적으로 꼬이는 구조(tangle)가 나타나면서 신경세포 및 신경세포 연접의 손상과 함께 뇌의 피질부로 확산되는 퇴행성 질병이다. 현재까지 알츠하이머병을 위한 치료 약물은 없고 단순히 병의 증상을 호전시키기 위하여 알츠하이머병이 진행되면서 감소되는 신경전달물질의 투여를 증가시키는 것이다. 따라서, 알츠하이머병이 진행되기 전의 수십 년 전부터 생체 내에서 증가되는 베타 아밀로이드와 타우 단백질의 응집 혹은 미스폴딩되는 현상을 조기진단하고, 문제를 해결하는 것이 필요하다.
본 발명은 베타아밀로이드 등의 단백질 응집형을 간단한 방법으로 정확하게 검출하는 방법, 검출 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 방법, 키트를 이용한 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법 및 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 실시간 전기화학적으로 단백질의 단량체화 과정을 측정함으로써, 혈액, 뇌척수액, 콧물, 타액 등의 생시료에 포함된 복합 물질과 진단의 복잡한 처리 과정에 따른 비특이적인 결합으로 인한 진단 오류를 방지하고, 타겟 물질의 단량체화에 의한 센서 변화량을 감지하여 보다 정확하게 단백질 응집체를 검출하고 관련 질병을 진단할 수 있는 검출 키트, 진단 키트를 제공한다.
1. 혈액 또는 혈장 내 포함된 베타 아밀로이드 및 타우 단백질의 중합체를 대조군 혹은 비교군 없이 측정하여 질병을 진단하는 방법.
2. 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 상기 단백질의 복수개의 항체에 가하여 제1 임피던스를 측정하는 단계;
상기 단백질 응집체를 단량체화하여 제2 임피던스를 측정하는 단계; 및
상기 제1 및 제2 임피던스를 비교하는 단계;를 포함하는 단백질 응집형의 검출 방법.
3. 위 2에 있어서, 상기 단백질 응집체의 단량체화 중에 제 3 임피던스를 1회 이상 더 측정하는 단계를 포함하고,
제1 및 제2 임피던스의 비교시에 제3 임피던스도 함께 비교하는 단백질 응집형의 검출 방법.
4. 위 2에 있어서, 상기 단백질은 베타아밀로이드, 타우, 알파시뉴크레인(α-synuclein), 프리온(Prion), 폴리글루타민, 토신A(torsinA), 아밀로이드 트랜스티레틴 및 아밀로이드성 단백질로 이루어진 군에서 선택된 것인 단백질 응집형의 검출 방법.
5. 위 2에 있어서, 상기 생시료는 혈액, 혈장, 척수액, 뇌 균질액, 림프액, 타액 및 정액으로 이루어진 군에서 선택된 것인 단백질 응집형의 검출 방법.
6. 위 2에 있어서, 상기 생시료를 상기 복수개의 항체가 고정된 항체부 상에 가하는 단백질 응집형의 검출 방법.
7. 위 2에 있어서, 상기 생시료를 가하고 제1 임피던스를 측정하기 전에 상기 생시료 중 항체와 결합하지 않은 부분을 제거하는 단계를 더 포함하는 단백질 응집형의 검출 방법.
8. 위 7에 있어서, 상기 제거는 상기 단백질이 결합된 항체에 탈이온수, PBS 버퍼, MOPS 버퍼 및 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 가하여 수행되는 단백질 응집형의 검출 방법.
9. 위 2에 있어서, 상기 제1 임피던스는 각 단백질 응집체가 각 항체에 결합된 상태의 임피던스인 단백질 응집형의 검출 방법.
10. 위 2에 있어서, 상기 단량체화는 항체에 결합된 단백질 응집체에 단량체화 조성물을 가하는 방법, 전기장을 가하는 방법, 마이크로파를 가하는 방법 및 적외선 레이저를 가하는 방법으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법으로 수행되는 단백질 응집형의 검출 방법.
11. 위 10에 있어서, 상기 단량체화 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 계면활성제인 단백질 응집형의 검출 방법:
[화학식 1]
Figure PCTKR2016015393-appb-I000001
.
12. 위 2에 있어서, 상기 제2 임피던스는 개별 단백질이 각각 항체에 결합한 상태의 임피던스인 단백질 응집형의 검출 방법.
13. 위 2 내지 12 중 어느 한 항의 방법을 포함하는 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법.
14. 위 13에 있어서, 상기 비정상 단백질 응집 관련 질병은파킨슨질환, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 폴리글루타민 확장증(polyglutamine expansion disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수 및 연수 근육위축(spinal and bulbar muscular atrophy), 타우증(tauopathy), 근육긴장 이상(dystonia), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloidangiopathy), 혈투석-관련 아밀로이드증, 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 뇌허혈(brainischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerveregeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis) 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택된 것인비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법.
15. 응집체를 이룰 수 있는 단백질에 대한 복수개의 항체가 고정된 항체부;
상기 항체부와 통전되며, 작업전극 및 상기 작업전극과의 전위차를 형성하는 상대전극을 포함하는 전극부; 및
상기 전극부에서 입출력되는 교류신호의 진폭 및 위상을 비교하여 임피던스를 측정하는 임피던스 측정부;를 포함하는 단백질 응집형의 검출 키트.
16. 위 15에 있어서, 상기 단백질은 베타아밀로이드, 타우, 알파시뉴크레인(α-synuclein), 프리온(Prion), 폴리글루타민, 토신A(torsinA), 아밀로이드 트랜스티레틴 및 아밀로이드성 단백질로 이루어진 군에서 선택된 것인 단백질 응집형의 검출 키트.
17. 위 15에 있어서, 복수회 측정된 임피던스 간의 변화량을 연산하는 임피던스 연산부; 및 상기 변화량을 표시하는 임피던스 표시부;를 더 포함하는 단백질 응집형의 검출 키트.
18. 위 15 내지 17 중 어느 한 항의 검출 키트를 포함하는 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 키트.
19. 위 18에 있어서, 상기 비정상 단백질 응집 관련 질병은 파킨슨질환, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 폴리글루타민 확장증(polyglutamine expansion disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수 및 연수 근육위축(spinal and bulbar muscular atrophy), 타우증(tauopathy), 근육긴장 이상(dystonia), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloidangiopathy), 혈투석-관련 아밀로이드증, 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 뇌허혈(brainischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerveregeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis) 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택된 것인비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 키트.
본 발명의 단백질 응집형 검출 방법은 단백질이 생시료 내에서 얼마나 많이 응집형으로 존재하는지 여부를 간단한 방법으로 정량적으로 실시간 분석할 수 있다. 이에, 비정상 단백질 응집과 관련된 질병의 진단 방법으로서 폭넓게 활용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 진단키트는 생시료를 진단키트와 반응시킨 후 단백질의 단량체화 과정을 전기화학적으로 실시간 측정함으로써, 혈액, 뇌척수액, 콧물, 타액 등의 생체시료에 포함된 복합 물질과 진단의 복잡한 처리 과정에 따른 비특이적인 결합으로 인한 진단 오류를 방지하고, 타겟 물질의 단량체화에 의한 센서 변화량을 감지하여 보다 정확하게 단백질 응집체를 정량 검출하고 관련 질병을 진단할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 단백질 응집형 검출 키트에서 항체가 고정된 항체부를 개략적으로 나타낸 정면도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 단백질 응집형 검출 키트에서 항체부에 단백질 응집체를 포함하는 혈장을 가하여 단백질 및 그 응집체를 항체에 결합시키고, 나머지 부분은 PBS 버퍼로 제거한 경우를 나타낸 정면도이다.
도 3은 도 2에서 단량체화 조성물을 가하여 단백질 응집체를 단량체화시킨 경우를 나타낸 정면도이다.
도 4는 단백질의 응집화 정도가 증가함에 따라 임피던스 변화량이 커짐을 나타내는 도면이다.
도 5는 단백질 응집체에 전기장을 가하여 단백질 응집체를 단량체화 하는 경우를 나타내는 도면이다.
도 6은 알츠하이머 치매 환자와 정상인의 베타아밀로이드 응집 정도에 따른 임피던스 절대값의 변화를 나타낸 것이다.
본 발명은 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 상기 단백질의 복수개의 항체에 가하여 제1 임피던스를 측정하는 단계; 상기 단백질 응집체를 단량체화하여 제2 임피던스를 측정하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 임피던스를 비교하는 단계;를 포함함으로써, 단백질이 생시료 내에서 얼마나 많이 응집형으로 존재하는지 여부를 간단한 방법으로 정량적으로 실시간 분석하여, 비정상 단백질 응집과 관련된 질병의 진단에 폭넓게 활용될 수 있는 단백질 응집형의 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 베타 아밀로이드의 응집을 원인으로 하는 알츠하이머 병 등의 질병 또는 질환과 단백질의 응집으로 인한 다른 질병 또는 질환의 혈액 중에 응집된 단백질을 용해하고 이를 분석하여 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환 또는 질병의 정확한 진단 시스템에 관한 것이다. 상기 진단시스템은 금 전극이나 플레이트 위에 티올기 혹은 알데히드기로 표면개질하고 단백질의 아민기에 따른 아미노기를 형성하여 항체를 센서 표면에 고정하고 항체와 결합되는 단백질의 생화학적 특성을 전기적으로 측정하고자 한다.
본 발명은 혈액 또는 혈장 내 포함된 베타 아밀로이드 및 타우 단백질의 중합체를 대조군 혹은 비교군 없이 측정하여 질병을 진단하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 베타 아밀로이드 중합체를 EPPS 혹은 디터전트를 포함하는 단량체화 조성물로 단량체로 분해하고, 분해된 베타 아밀로이드 antibody와 결합하는 과정을 전기적으로 측정하는 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환 또는 질병을 진단하는 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 중합체를 단량체화 조성물 이외에 Electric field, micro wave, IR을 가지고 단량체로 분해할 수 있는 것을 특징으로 하는 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환 또는 질병을 진단하는 시스템을 제공한다.
도 1은 센서 전극 사이에 베타 아밀로이드 antibody가 바인딩된 상태를 나타내는 도면이다.
유리 플레이트 위에 작업전극(working electrode)과 상대 전극(counter electrod)을 형성하고, 표면을 클리닝 한다. 이후, 표면처리 과정을 통해 전극 사이에 베타 아밀로이드 antibody를 바인딩 시킨다. 이때, 베타 아밀로이드 antibody는 수 fg/ml~수십 ug/ml의 농도로 PBS Buffer혹은 DI water에 섞어서 센서 전극이 형성된 웰에 주입시켜 바인딩 시킬 수 있다. 또한 바인딩 후 PBS Buffer 혹은 DI water로 워싱한다.
도 2에서 베타 아밀로이드가 포함된 혈장(플라즈마)을 도 1의 베타 아밀로이드 antibody가 안정적으로 형성된 웰에 주입한다. 이때 베타 아밀로이드와 베타 아밀로이드 antibody가 안정적으로 결합할 수 있도록 소정의 시간이 지난 후, DI water혹은 PBS Buffer를 가지고 센서가 형성된 well을 워싱한다.
도 2는 베타 아밀로이드와 베타 아밀로이드 antibody가 결합된 상태를 나타내며, 이때 혈장(플라즈마)내의 베타 아밀로이드는 단량체, 이량체, 삼량체 및 여러 형태의 중합체가 포함될 수 있다. 또한, 베타 아밀로이드는 혈장(플라즈마)에 있는 물질뿐만이 아니라 전혈, 뇌척수액(CSF), 소포체 등의 생체 시료가 될 수 있다.
도 3은 단백질의 응집 혹은 미스폴딩을 분리할 수 있는 단량체화 조성물을 주입시킨 것으로서, 단량체화 조성물은 EPPS 또는 디터전트 형태의 물질들로 구성될 수 있으며, DI water (초순수 용액) 혹은 PBS Buffer에 ?등의 소정의 농도를 주입시킨다. 이때 단량체화 조성물은 이미 베타 아밀로이드 antibody와 결합된 베타 아밀로이드의 이량체, 삼량체 등의 중합체 물질을 단량체로 분리시키고, 표면에 형성된 베타 아밀로이드 antibody와 새로운 항원항체 반응이 진행된다.
여기서 베타 아밀로이드는 베타 아밀로이드 40 혹은 42번의 중합체, 피브릴 전구체, 피브릴, 플라크, 베타 아밀로이드 집적체, 타 단백질과 결합된 베타아밀로이드 단량체 및 중합체, 지방 혹은 탄수화물과 결합된 베타아밀로이드, 핵산과 결합된 베타아밀로이드 및 혈액세포와 결합된 단량체가 분해된 것일 수도 있다. 또한, 타우의 중합체, 응집체 혹은 미스폴딩된 단백질이 단량체로 분해된 것일 수도 있다. 한편, 이러한 항원항체 반응은 전극에 소정의 전기신호를 인가하여 시간에 따른 생화학적 결합특성을 전기적으로 분석한다.
도 4는 DI water로 워싱 후 상기 단량체화 조성물을 주입한 후 시간에 따른 임피던스 변화를 나타낸다. 여기서 혈장 내 전체 베타 아밀로이드에서 중합체로 형성된 비율이 높을수록 시간에 따른 임피던스 변화가 큰 것을 확인할 수 있다. 여기서 임피던스는 정확하게는 임피던스의 역수인 컨덕턴스와 캐패시턴스를 의미하며, 레지스턴스와 리액턴스도 포함될 수 있다.
한편, 도2의 센서를 적용하여 전기적 필드를 적용하고 베타 아밀로이드의 중합체를 단량체로 분해할 수 있다. 이때 베타 아밀로이드는 항원항체 결합 후, DI water 혹은 PBS Buffer로 워싱한 상태 혹은 워싱 후 DI water 혹은 PBS buffer 를 채운상태를 기준으로 센서의 임피던스 값을 측정한다. 그 후, 소정의 전기적인 필드를 인가하여 베타 아밀로이드 중합체가 단량체로 분해되면서 새롭게 베타 아밀로이드 antibody에 결합하는 과정을 전기적으로 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 단백질 응집형의 검출 방법을 제공한다.
이하 본 발명의 일 구현예에 따른 단백질 응집형의 검출 방법을 상세히 설명한다.
먼저, 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 상기 단백질의 복수개의 항체에 가하여 제1 임피던스를 측정한다.
본 명세서에서 단백질 응집은 단백질이 비정상적으로 축적되면서 응집체를 형성하는 것을 의미한다.
상기 단백질은 응집체를 형성할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 독성 단백질 응집체를 형성할 수 있는 베타아밀로이드, 타우, 알파시뉴크레인(α-synuclein), 프리온(Prion), 폴리글루타민, 토신A(torsinA), 아밀로이드 트랜스티레틴, 아밀로이드성 단백질일 수 있다. 상기 외에도 단백질 응집체를 형성할 수 있는 단백질, 특히 독성 단백질 응집체를 형성할 수 있는 단백질, 그리고 후술하는 질병의 원인이 되는 단백질은 모두 적용 대상이 될 수 있다.
베타아밀로이드인 경우의 구체적인 예를 들면,베타아밀로이드 40 혹은 42번의 중합체, 피브릴 전구체, 피브릴, 플라크, 베타 아밀로이드 집적체, 타 단백질과 결합된 베타아밀로이드 단량체 및 중합체, 지방 혹은 탄수화물과 결합된 베타아밀로이드, 핵산과 결합된 베타아밀로이드 및 혈액세포와 결합된 단량체가 분해된 것일 수도 있다.
생시료(biosample)는 상기 단백질 응집체를 포함하는 시료로서, 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 혈액, 혈장, 척수액, 뇌 균질액, 림프액, 타액, 정액 등을 들 수 있다.
상기 생시료는 신체로부터 채취, 제거, 배출된 것(체외로 분리된 것)일 수 있다.
상기 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 상기 단백질의 복수개의 항체에 가하여 제1 임피던스를 측정한다.
단백질 응집체를 포함하는 생시료를 상기 단백질의 복수개의 항체에 가하면, 도 2에 예시된 바와 같이 단백질 응집체가 그 항체에 결합하게 된다.
구체적으로, 단백질 응집체를 포함하는 생시료 내에는 단백질 이량체, 중합체 등 다양한 종류의 단백질 응집체가 포함되어 있을 수 있고, 또한 단량체도 포함되어 있을 수 있는데, 항체는 그 단백질의 특정 결합 부위를 인식하는 것이므로 대체적으로 도 2와 같이 1개의 덩어리(단량체 또는 응집체)별로 1개의 항체에 결합하게 된다.
생시료는 복수개의 항체가 고정된 항체부 상에 가해질 수도 있다.
생시료를 항체에 가하여 그 임피던스(제1 임피던스)를 측정한다. 즉, 제1 임피던스는 각 단백질 응집체가 각 항체에 결합된 상태의 임피던스일 수 있다.
구체적으로, 임피던스는 그 역수인 컨덕턴스와 캐패시턴스를 의미하는 것일 수 있고, 레지스턴스와 리액턴스도 포함될 수 있다.
필요에 따라, 본 발명은 상기 생시료를 가하고 제1 임피던스를 측정하기 전에 상기 생시료 중 항체와 결합하지 않은 부분을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
생시료는 상기 항체와 결합할 수 있는 단백질과 그 응집체 외에도 다양한 성분들을 포함할 수 있으므로, 제1 임피던스의 측정 전에 생시료중 항체와 결합하지 않은 부분(성분)들은 제거할 수 있다.
상기 제거는 단백질이 결합된 항체에 액체를 가하여 상기 부분을 씻어냄으로써 수행할 수 있다. 상기 액체는 예를 들면 탈이온수, PBS(phosphate buffered saline) 버퍼, MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) 버퍼, 계면활성제 등일 수 있다.
상기 계면활성제는 단백질, 항체의 구조적인 변형, 손상을 유발하는 것이 아니라면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 트윈계 계면활성제를 들 수 있고, 구체적으로 Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Tween 81 등을 들 수 있다. 상기 계면활성제는 물(예를 들면 탈이온수)에 희석하여 사용할 수 있다.
이후, 상기 단백질 응집체를 단량체화하여 제2 임피던스를 측정한다.
상기 단백질 응집체가 단량체화되면 도 3에 예시된 바와 같이 개별 단량체가 단백질과 결합하지 않은 비어있는 항체에 결합할 수 있다.
단량체화 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 항체에 결합된 단백질 응집체에 단량체화 조성물을 가하는 방법, 전기장을 가하는 방법, 마이크로파를 가하는 방법, 적외선 레이저를 가하는 방법 등에 의할 수 있다. 상기 중 1개 이상의 방법에 의할 수 있다.
단량체화 조성물은 상기 단백질, 항체의 결합 부위를 손상시키지 않으면서 단백질 응집체를 개별 단량체로 나눌 수 있는 물질이라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 계면활성제일 수 있고, 구체적으로 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016015393-appb-I000002
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단량체화 조성물은 탈이온수, PBS 버퍼, 계면활성제 등과 함께 사용될 수 있다.
단량체화 조성물의 상기 용매 내 용도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 0.1mM 내지 2000mM의 농도로 포함될 수 있다.
전기장을 가하는 방법의 경우, 예를 들면 항체에 결합된 단백질 응집체에수 피코초 동안 수 내지 수천 V/㎛의 전기장을 가할 수 있고, 구체적으로, 1피코초 내지 5000피코초 동안 1V/㎛ 내지 5000V/㎛의 전기장을 가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
마이크로파를 가하는 방법의 경우, 예를 들면 항체에 결합된 단백질 응집체에 10MHz 내지 50GHz의 주파수의 마이크로파를 1와트 이하의 출력으로 가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
적외선 레이저를 가하는 방법의 경우, 예를 들면 상기 단백질 응집체의 공진 주파수에 대응되는 주파수를 갖는 레이저를 항체에 결합된 단백질 응집체에 가할 수 있다. 구체적으로, 단백질 응집체의 공진 주파수 ±20%의 주파수를 갖는 레이저를 가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 응집체의 공진 주파수는 당 분야에 공지된 방법으로 알 수 있으며, 예를 들면 적외선 디텍터로 검출 가능하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 단백질 응집체 각 개체별로 응집된 단백질 수가 상이할 수 있으므로, 단백질 응집체의 공진 주파수는 하나의 특정된 값이 아니라, 각 단백질 응집체 별로 상이할 수 있으며, 그에 따라 주파수를 조절하여 가할 수 있다.
상기와 같은 다양한 방법에 의해 항체에 결합된 단백질 응집체를 단량체화한 후에 제2 임피던스를 측정한다.
상기 제2 임피던스는 단량체화 조성물을 제거한 이후에 측정할 수도 있고, 단량체화 조성물이 존재하는 상태로 측정할 수도 있다.
이후, 상기 제1 및 제2 임피던스를 비교한다.
전술한 바와 같이 제1 임피던스는 도 2에 예시된 바와 같이 항체에 단백질 응집체, 그리고 추가로 포함될 수 있는 단량체가 결합된 상태에서의 임피던스이고, 제2 임피던스는 도 3에 예시된 바와 같이 단백질 응집체가 단량체화되어 비어있는 항체에까지 결합된 상태의 임피던스이므로, 제1 및 제2 임피던스는 그 값에 차이가 나타날 수 있다.
또한, 그 차이는 단백질이 얼마나 많이 응집체 상태로 존재하느냐에 따라 더 커질 수 있다.
따라서, 상기 제1 및 제2 임피던스값을 비교함으로써, 해당 단백질이 얼마나 응집형으로 존재하는지를 알 수 있다.
필요에 따라, 본 발명의 단백질 응집형의 검출 방법은 상기 단백질 응집체의 단량체화 중에 임피던스(제 3 임피던스)를 1회 이상 더 측정할 수 있다.
단백질, 항체 등의 생시료 유래 물질은 대기, 온도, 습도, pH 등의 다양한 조건에 영향을 받을 수 있으므로, 그 임피던스의 절대값도 그러한 조건에 영향을 받아 달라질 수 있다. 따라서, 제1 및 제2 임피던스도 단백질 응집체의 단량체화 뿐만 아니라 다른 조건에 의해서도 달라질 수 있다.
그러나, 상기 단백질의 단량체화 중에도 임피던스를 1회 이상 측정하여, 제1 및 제2 임피던스 뿐만 아니라 제3 임피던스도 함께 비교함으로써 다른 요인에 의해 검출 정확도가 떨어지는 것을 줄일 수 있다.
뿐만 아니라, 제3 임피던스를 1회 이상, 구체적으로 단량체화 중에 계속 측정함으로써, 단량체화 시작부터 단량체화 종료시까지의 전과정을 실시간으로 변화량을 분석하여 검출 정확도를 더욱 높일 수 있다.
또한, 이를 통해 단순히 단량체화 전 후의 임피던스 변화 뿐만 아니라, 미분, 적분 등을 통해 단량체화 과정에서의 임피던스의 변화 값을 확인할 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 단백질 응집형 검출 방법은 단백질이 생시료 내에서 얼마나 많이 응집형으로 존재하는지 여부를 간단한 방법으로 정량적으로 실시간 분석할 수 있다. 뿐만 아니라, 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 가한 복수개의 항체를 측정 시료로서 전체 임피던스 측정 과정을 연속적으로 수행가능하여, 측정 시료를 옮기거나 워싱하는 것 이외에는 별도의 추가 처리를 하는 등의 추가 공정 없이 간단하게 공정 수행이 가능하고, 이에 따라 측정값에 영향을 줄 수 있는 요인들을 최소화 할 수 있다.
뿐만 아니라, 항체에 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 가한 후, 워싱 후 제 1 임피던스를 측정하고 별도의 반응이나 추가 공정 없이 단량체화 조성물의 처리에 따른 실시간 분석 및 제 2임피던스를 측정하여 단백질의 단량체화에 따른 변화과정만을 정확하게 검출할 수 있다.
상기 단백질이 어떠한 단백질인지에 따라 본 발명의 단백질 응집형의 검출 방법은 다양한 진단 방법 등에 활용될 수 있는데, 독성 단백질 응집체를 형성하는 단백질이라면 그와 같은 독성 단백질 응집체(비정상 단백질 응집)에 관련된 질병의 진단 방법으로서 활용될 수 있다.
상기의 방법에 의해 해당 단백질이 얼마나 응집형으로 존재하는지를 알 수 있으므로, 그 단백질 응집체가 유발하는 질병이 발병했는지 여부, 병기 등을 진단할 수 있다.
비정상 단백질 응집 관련 질병은 그 단백질의 종류에 따라서 다양하게 선택될 수 있는 것으로서, 예를 들면 파킨슨질환, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 폴리글루타민 확장증(polyglutamine expansion disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수 및 연수 근육위축(spinal and bulbar muscular atrophy), 타우증(tauopathy), 근육긴장 이상(dystonia), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloidangiopathy), 혈투석-관련 아밀로이드증, 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 뇌허혈(brainischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerveregeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis), 크로이츠펠트-야콥병 등의 질병일 수 있다.
또한, 본 발명은 단백질 응집형의 전기화학적 검출 키트를 제공한다.
본 발명의 단백질 응집형의 검출 키트는 항체부, 전극부 및 임피던스 측정부를 포함한다.
항체부는 응집체를 이룰 수 있는 단백질에 대한 복수개의 항체가 고정된 층이다.
상기 단백질은 앞서 예시한 단백질일 수 있고, 항체는 그 단백질에 대한 항체일 수 있다.
항체부는 예를 들면 센싱 전극 사이에 항체가 고정되어 형성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
항체는 용매에 혼합하여 주입될 수 있다. 상기 용매는 예를 들면 탈이온수, PBS 버퍼, MOPS 버퍼 등일 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
항체 농도는 예를 들면 수fg/ml 내지 수십mg/ml일 수 있고, 구체적으로 0.1fg/ml 내지 80mg/ml의 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체부에 단백질 응집체를 포함하는 생시료가 가해질 수 있고, 센싱 전극이 형성된 웰에 항체를 주입시켜 형성된 경우의 구체적인 예를 들면, 상기 웰에 생시료가 가해질 수 있다. 그에 따라 생시료에 포함된 단백질 응집체가 항체와 결합할 수 있다.
전극부는 상기 항체부와 통전되며, 작업전극 및 상대전극을 포함한다.
본 명세서에서 통전되었다는 것은 서로 전류가 통한다는 의미로서, 전극부와 항체부가 중간에 도체를 거쳐 통전될 수도 있고, 전극부와 항체부가 직접 접촉하여 통전될 수도 있다.
작업전극은 전극 반응을 일으킬 때 시료 중에 전류를 흐르게 할 목적으로 사용하는 2개의 전극 중 목적하는 반응을 일으키기 위해 사용되는 전극을 의미하는 것으로, 전도성 물질이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
상대전극은 작용전극의 전극 전위를 측정하는 경우에 또 하나의 별도 전극을 전극 전위의 기준으로 준비하여 하나의 전지를 구성하고, 그 개회로 전압을 전극 전위의 상대값으로 정하는 방법이 취해지는데 이 때의 기준이 되는 전극을 의미하는 것으로, 마찬가지로 전도성 물질이라면 제한없이 사용될 수 있다.
또한, 상기 전극은 복수의 작업전극과 상대전극으로 구성될 수 있으며, 이들은 수 나노미터에서 수백 마이크로 미터의 간격으로 형성되어 타겟 단백질의 검출에 따른 검출 민감도를 높힐 수 있다.
임피던스 측정부는 상기 전극부에서 교류신호의 진폭 및 위상을 비교하여 임피던스를 측정한다.
구체적으로, 임피던스는 그 역수인 컨덕턴스와 캐패시턴스를 의미하는 것일 수 있고, 레지스턴스와 리액턴스도 포함될 수 있다.
임피던스는 단백질이 응집체 상태로 항체에 결합되어 있을 때와 단량체화 되었을때에 측정될 수 있다.
본 발명의 단백질 응집형의 검출 키트는 상기 측정되는 임피던스 값의 변화에 따라 해당 단백질이 얼마나 많이 응집형으로 존재하는 지를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질 응집형의 검출 키트는 임피던스 연산부 및 임피던스 표시부를더 포함할 수 있다.
임피던스 연산부는 복수회 측정된 임피던스 간의 변화량을 연산할 수 있다.
임피던스 표시부는 측정된 임피던스를 표시하거나, 상기 임피던스 변화량을 표시할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 응집형 검출 키트를 포함하는 비정상 단백질 응집 관련 질병의 전기화학적 진단 키트를 제공한다.
단백질 응집형 검출 키트에 의해 생시료에 포함된 단백질이 얼마나 응집형으로 존재하는지 여부를 판단할 수 있으므로, 상기 단백질이 독성 단백질 응집체를 형성하는 단백질인 경우, 그 단백질 응집체가 유발하는 질병이 발병했는지 여부, 병기 등을 진단할 수 있다.
상기 비정상 단백질 응집 관련 질병은 예를 들면 파킨슨질환, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 폴리글루타민 확장증(polyglutamine expansion disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수 및 연수 근육위축(spinal and bulbar muscular atrophy), 타우증(tauopathy), 근육긴장 이상(dystonia), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloidangiopathy), 혈투석-관련 아밀로이드증, 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 뇌허혈(brainischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerveregeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis) 및 크로이츠펠트-야콥병 등일 수 있다.
실시예
단백질 응집형 검출 키트의 제조 및 단백질 응집형의 검출
도 1은 센서 전극 사이에 베타 아밀로이드 antibody가 바인딩된 상태를 나타내는 도면이다.
유리 플레이트 위에 복수의 작업전극(working electrode)과 상대 전극(counter electrode)을 형성하고, 센서 표면을 아세톤 및 플라즈마 클리닝하였다. 이후, 베타 아밀로이드 antibody가 펩티드 결합을 통해 전극 사이에 고정되도록 하였다.
베타 아밀로이드 antibody는 10㎍/ml의 농도로 PBS 버퍼에 섞어서 센서 전극이 형성된 유로에 주입시켜 고정시켰다. 한 시간 가량 고정 후 PBS Buffer로 결합되지 않고 남아있는 시료를 클리닝하였다.
이후 (도 2와 같이) 베타 아밀로이드가 포함된 혈장(플라즈마)을 베타 아밀로이드 antibody가 안정적으로 형성된 유로에 주입하였다. 30분 가량 시간이 지나고 아밀로이드와 베타 아밀로이드 antibody가 안정적으로 결합되면, PBS Buffer로 센서가 형성된 유로를 워싱하였다.
이때 베타 아밀로이드는 단량체, 이량체, 삼량체 및 여러 형태의 중합체로 이루어질 수 있어서 도2와 같이 고정될 수 있다.
이후, 하기 화학식 1의 물질 0.1 내지 200mM을 첨가한 PBS 버퍼를 상기 유로에 주입시켰다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016015393-appb-I000003
.
이후, 시간에 따라 단량체와 조성물에 의해 응집 혹은 미스폴딩된 단백질의 단량체화되는 과정을 임피던스 측정을 통해 분석하였다.
이때, 단량체화 조성물에 의해 베타 아밀로이드의 이량체, 삼량체 등의 중합체 물질이 단량체로 분리되고 표면에 형성된 베타 아밀로이드 antibody와 새로운 항원항체 반응이 진행된다.
도 4는 이러한 베타 아밀로이드를 응집시키고 표면에 형성된 antibody와 결합되는 상태를 그림으로 도식하고, 이를 단량체화하면서 시간에 따른 임피던스를 측정한 그래프이다.
이때 각각의 농도에 대해 정리하면 베타 아밀로이드의 농도가 높을수록 제1임피던스에서 제 2임피던스(마지막 임피던스 측정)로의 변화량이 큰 것을 확인할 수 있다. 여기서 임피던스는 정확하게는 임피던스의 역수인 컨덕턴스와 캐패시턴스를 의미하며, 레지스턴스와 리액턴스도 포함될 수 있다.
2. 알츠하이머 치매의 진단
도 5는 치매 환자와 정상인의 혈액 샘플을 이용한 임상실험결과이다.
서울원자력병원으로부터 PET-CT 검사를 통해 치매로 진단 받은 알츠하이머 치매 환자 10명의 혈액 샘플을 제공받아, 정상인 10명의 혈액 샘플과 비교 실험을 수행하였다.
상기 각 혈액 샘플의 혈장을 상기 키트의 유로에 주입하고 이후에는 상기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
도 5를 참조하면, 치매환자의 경우, 베타아밀로이드 단백질이 단량체화되는 비율이 높아서 초기 임피던스 대비 임피던스의 변화량이 큰 것을 확인할 수 있다.
유로 한 개에 8개의 센서가 포함되고 각 센서에는 동일한 시료가 사용된다. 도 5에는 각 센서에서 측정된 값이 표시되어 있다. Y축의 값(그림에서는 0.05정도)를 기준으로 환자와 정상인에 따른 혈액의 단량체화 변화량이 구분된다.

Claims (19)

  1. 혈액 또는 혈장 내 포함된 베타 아밀로이드 및 타우 단백질의 중합체를 대조군 혹은 비교군 없이 측정하여 질병을 진단하는 방법.
  2. 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 상기 단백질의 복수개의 항체에 가하여 제1 임피던스를 측정하는 단계;
    상기 단백질 응집체를 단량체화하여 제2 임피던스를 측정하는 단계; 및
    상기 제1 및 제2 임피던스를 비교하는 단계;를 포함하는 단백질 응집형의 검출 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 단백질 응집체의 단량체화 중에 제 3 임피던스를 1회 이상 더 측정하는 단계를 포함하고,
    제1 및 제2 임피던스의 비교시에 제3 임피던스도 함께 비교하는 단백질 응집형의 검출 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 단백질은 베타아밀로이드, 타우, 알파시뉴크레인(α-synuclein), 프리온(Prion), 폴리글루타민, 토신A(torsinA), 아밀로이드 트랜스티레틴 및 아밀로이드성 단백질로 이루어진 군에서 선택된 것인 단백질 응집형의 검출 방법.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 생시료는 혈액, 혈장, 척수액, 뇌 균질액, 림프액, 타액 및 정액으로 이루어진 군에서 선택된 것인 단백질 응집형의 검출 방법.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 생시료를 상기 복수개의 항체가 고정된 항체부 상에 가하는 단백질 응집형의 검출 방법.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 생시료를 가하고 제1 임피던스를 측정하기 전에 상기 생시료 중 항체와 결합하지 않은 부분을 제거하는 단계를 더 포함하는 단백질 응집형의 검출 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 제거는 상기 단백질이 결합된 항체에 탈이온수, PBS 버퍼, MOPS 버퍼 및 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 가하여 수행되는 단백질 응집형의 검출 방법.
  9. 청구항 2에 있어서, 상기 제1 임피던스는 각 단백질 응집체가 각 항체에 결합된 상태의 임피던스인 단백질 응집형의 검출 방법.
  10. 청구항 2에 있어서, 상기 단량체화는 항체에 결합된 단백질 응집체에 단량체화 조성물을 가하는 방법, 전기장을 가하는 방법, 마이크로파를 가하는 방법 및 적외선 레이저를 가하는 방법으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법으로 수행되는 단백질 응집형의 검출 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 단량체화 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 계면활성제인 단백질 응집형의 검출 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016015393-appb-I000004
    .
  12. 청구항 2에 있어서, 상기 제2 임피던스는 개별 단백질이 각각 항체에 결합한 상태의 임피던스인 단백질 응집형의 검출 방법.
  13. 청구항 2 내지 12 중 어느 한 항의 방법을 포함하는 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 비정상 단백질 응집 관련 질병은파킨슨질환, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 폴리글루타민 확장증(polyglutamine expansion disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수 및 연수 근육위축(spinal and bulbar muscular atrophy), 타우증(tauopathy), 근육긴장 이상(dystonia), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloidangiopathy), 혈투석-관련 아밀로이드증, 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 뇌허혈(brainischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerveregeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis) 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택된 것인비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법.
  15. 응집체를 이룰 수 있는 단백질에 대한 복수개의 항체가 고정된 항체부;
    상기 항체부와 통전되며, 작업전극 및 상기 작업전극과의 전위차를 형성하는 상대전극을 포함하는 전극부; 및
    상기 전극부에서 입출력되는 교류신호의 진폭 및 위상을 비교하여 임피던스를 측정하는 임피던스 측정부;를 포함하는 단백질 응집형의 검출 키트.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 단백질은 베타아밀로이드, 타우, 알파시뉴크레인(α-synuclein), 프리온(Prion), 폴리글루타민, 토신A(torsinA), 아밀로이드 트랜스티레틴 및 아밀로이드성 단백질 로 이루어진 군에서 선택된 것인 단백질 응집형의 검출 키트.
  17. 청구항 15에 있어서, 복수회 측정된 임피던스 간의 변화량을 연산하는 임피던스 연산부; 및 상기 변화량을 표시하는 임피던스 표시부;를 더 포함하는 단백질 응집형의 검출 키트.
  18. 청구항 15 내지 17 중 어느 한 항의 검출 키트를 포함하는 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 키트.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 비정상 단백질 응집 관련 질병은 파킨슨질환, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 폴리글루타민 확장증(polyglutamine expansion disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수 및 연수 근육위축(spinal and bulbar muscular atrophy), 타우증(tauopathy), 근육긴장 이상(dystonia), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloidangiopathy), 혈투석-관련 아밀로이드증, 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 뇌허혈(brainischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerveregeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis) 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택된 것인비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 키트.
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