KR101901594B1 - 단백질 응집형의 검출 방법, 전기화학적 검출 키트 및 이를 이용한 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법 및 전기화학적 진단 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 상기 단백질의 복수개의 항체에 가하여 제1 임피던스를 측정하는 단계; 상기 단백질 응집체를 단량체화하여 제2 임피던스를 측정하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 임피던스를 비교하는 단계;를 포함함으로써, 단백질이 생시료 내에서 얼마나 많이 응집형으로 존재하는지 여부를 간단한 방법으로 정량적으로 실시간 분석하여, 비정상 단백질 응집과 관련된 질병의 진단에 폭넓게 활용될 수 있는 단백질 응집형의 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.

Description

단백질 응집형의 검출 방법, 전기화학적 검출 키트 및 이를 이용한 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법 및 전기화학적 진단 키트{DETECTING METHOD AND ELECTROCHEMICAL KIT FOR PROTEIN AGGREGATION AND DIAGNOSING METHOD AND ELECTROCHEMICAL KIT USING THE SAME}

본 발명의 단백질 응집형의 검출 방법, 전기화학적 검출 키트 및 이를 이용한 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법 및 전기화학적 진단 키트에 관한 것이다.

최근 고령화와 함께 지난 4년간 노인인구가 17.4%가 증가하였으며 이중 치매노인의 수가 26.8%가 증가하였다. 보건복지부에 따르면 이러한 추이로 증가 시 2025년에는 100만명이 넘는 노인에게 치매가 올 것으로 예상하고 있다. 한편 이러한 치매는 퇴행성 뇌신경 질환으로 인한 알츠하이머성 치매가 60~80%를 차지하고 있는데, 증상은 주로 이름과 최근의 일을 기억 못하는 것으로 시작하여, 말기에는 판단착오, 길을 잃음, 행동 및 언어장애, 삼킴 장애 등이 나타나다 사망에 이르게 된다. 이러한 질환은 발병이 서서히 진행되고 출생 후 오랜 기간 동안 정상적인 기능을 하다가 증상이 나타나며, 일단 발병하면 사망할 때까지 몇 년 또는 몇십 년에 걸쳐 지속적으로 병이 진행되는 것이 특징인데, 현재 근본적인 치료 방법이 개발되지 않은 상황이다. 따라서 병의 증상을 완화시키고 병의 진행을 지연시킬 수 있는 약물의 치료 효과를 높이기 위해서는 무엇보다도 병을 조기에 발견하는 것이 중요하다. 알츠하이머병의 발병기전은 뇌에 존재하는 베타 아밀로이드의 올리고머의 비율이 증가하여 발병하는 것으로 알려져 있고 베타 아밀로이드는 수용성물질로 뇌혈관장벽(Blood Brain barrier)을 통과하는 것으로 알려져있어 혈액에서 베타 아밀로이드양을 측정하여 알츠하이머병을 진단하고자 하는 노력이 진행되고 있다.

베타 아밀로이드(beta amyloid)는 뇌에 축적되면서 뇌신경 세포를 파괴하는 독성 단백질로서, 점차 베타 아밀로이드가 뭉쳐 신경 세포 밖에서 덩어리를 이루는 구조(plaque)가 된다. 또한 신경 세포 안의 단백질(타우 단백질, tau protein)은 비정상적으로 꼬이는 구조(tangle)가 나타나면서 신경세포 및 신경세포 연접의 손상과 함께 뇌의 피질부로 확산되는 퇴행성 질병이다. 현재까지 알츠하이머병을 위한 치료 약물은 없고 단순히 병의 증상을 호전시키기 위하여 알츠하이머병이 진행되면서 감소되는 신경전달물질의 투여를 증가시키는 것이다. 따라서, 알츠하이머병이 진행되기 전의 수십 년 전부터 생체 내에서 증가되는 베타 아밀로이드와 타우 단백질의 응집 혹은 미스폴딩되는 현상을 조기진단하고, 문제를 해결하는 것이 필요하다.

한국등록특허 제1553967호

본 발명은 베타아밀로이드 등의 단백질 응집형을 간단한 방법으로 정확하게 검출하는 방법, 검출 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 방법, 키트를 이용한 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법 및 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 실시간 전기화학적으로 단백질의 단량체화 과정을 측정함으로써, 혈액, 뇌척수액, 콧물, 타액 등의 생시료에 포함된 복합 물질과 진단의 복잡한 처리 과정에 따른 비특이적인 결합으로 인한 진단 오류를 방지하고, 타겟 물질의 단량체화에 의한 센서 변화량을 감지하여 보다 정확하게 단백질 응집체를 검출하고 관련 질병을 진단할 수 있는 검출 키트, 진단 키트를 제공한다.

1. 혈액 또는 혈장 내 포함된 베타 아밀로이드 및 타우 단백질의 중합체를 대조군 혹은 비교군 없이 측정하여 질병을 진단하는 방법.

2. 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 상기 단백질의 복수개의 항체에 가하여 제1 임피던스를 측정하는 단계;

상기 단백질 응집체를 단량체화하여 제2 임피던스를 측정하는 단계; 및

상기 제1 및 제2 임피던스를 비교하는 단계;를 포함하는 단백질 응집형의 검출 방법.

3. 위 2에 있어서, 상기 단백질 응집체의 단량체화 중에 제 3 임피던스를 1회 이상 더 측정하는 단계를 포함하고,

제1 및 제2 임피던스의 비교시에 제3 임피던스도 함께 비교하는 단백질 응집형의 검출 방법.

4. 위 1에 있어서, 상기 단백질은 베타아밀로이드, 타우, 알파시뉴크레인(α-synuclein), 프리온(Prion), 폴리글루타민, 토신A(torsinA), 아밀로이드 트랜스티레틴 및 아밀로이드성 단백질로 이루어진 군에서 선택된 것인 단백질 응집형의 검출 방법.

5. 위 1에 있어서, 상기 생시료는 혈액, 혈장, 척수액, 뇌 균질액, 림프액, 타액 및 정액으로 이루어진 군에서 선택된 것인 단백질 응집형의 검출 방법.

6. 위 1에 있어서, 상기 생시료를 상기 복수개의 항체가 고정된 항체부 상에 가하는 단백질 응집형의 검출 방법.

7. 위 1에 있어서, 상기 생시료를 가하고 제1 임피던스를 측정하기 전에 상기 생시료 중 항체와 결합하지 않은 부분을 제거하는 단계를 더 포함하는 단백질 응집형의 검출 방법.

8. 위 7에 있어서, 상기 제거는 상기 단백질이 결합된 항체에 탈이온수, PBS 버퍼, MOPS 버퍼 및 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 가하여 수행되는 단백질 응집형의 검출 방법.

9. 위 1에 있어서, 상기 제1 임피던스는 각 단백질 응집체가 각 항체에 결합된 상태의 임피던스인 단백질 응집형의 검출 방법.

10. 위 1에 있어서, 상기 단량체화는 항체에 결합된 단백질 응집체에 단량체화 조성물을 가하는 방법, 전기장을 가하는 방법, 마이크로파를 가하는 방법 및 적외선 레이저를 가하는 방법으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법으로 수행되는 단백질 응집형의 검출 방법.

11. 위 10에 있어서, 상기 단량체화 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 계면활성제인 단백질 응집형의 검출 방법:

[화학식 1]

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12. 위 1에 있어서, 상기 제2 임피던스는 개별 단백질이 각각 항체에 결합한 상태의 임피던스인 단백질 응집형의 검출 방법.

13. 위 2 내지 12 중 어느 한 항의 방법을 포함하는 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법.

14. 위 13에 있어서, 상기 비정상 단백질 응집 관련 질병은 파킨슨질환, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 폴리글루타민 확장증(polyglutamine expansion disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수 및 연수 근육위축(spinal and bulbar muscular atrophy), 타우증(tauopathy), 근육긴장 이상(dystonia), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloidangiopathy), 혈투석-관련 아밀로이드증, 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 뇌허혈(brainischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerveregeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis) 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택된 것인 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 방법.

15. 응집체를 이룰 수 있는 단백질에 대한 복수개의 항체가 고정된 항체부;

상기 항체부와 전기적으로 연결되며, 작업전극 및 상기 작업전극과의 전위차를 형성하는 상대전극을 포함하는 전극부; 및

상기 전극부에서 입출력되는 교류신호의 진폭 및 위상을 비교하여 임피던스를 측정하는 임피던스 측정부;를 포함하는 단백질 응집형의 검출 키트.

16. 위 15에 있어서, 상기 단백질은 베타아밀로이드, 타우, 알파시뉴크레인(α-synuclein), 프리온(Prion), 폴리글루타민, 토신A(torsinA), 아밀로이드 트랜스티레틴 및 아밀로이드성 단백질로 이루어진 군에서 선택된 것인 단백질 응집형의 검출 키트.

17. 위 15에 있어서, 복수회 측정된 임피던스 간의 변화량을 연산하는 임피던스 연산부; 및 상기 변화량을 표시하는 임피던스 표시부;를 더 포함하는 단백질 응집형의 검출 키트.

18. 위 15 내지 17 중 어느 한 항의 검출 키트를 포함하는 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 키트.

19. 위 18에 있어서, 상기 비정상 단백질 응집 관련 질병은 파킨슨질환, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 폴리글루타민 확장증(polyglutamine expansion disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수 및 연수 근육위축(spinal and bulbar muscular atrophy), 타우증(tauopathy), 근육긴장 이상(dystonia), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloidangiopathy), 혈투석-관련 아밀로이드증, 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 뇌허혈(brainischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerveregeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis) 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택된 것인 비정상 단백질 응집 관련 질병의 진단 키트.

본 발명의 단백질 응집형 검출 방법은 단백질이 생시료 내에서 얼마나 많이 응집형으로 존재하는지 여부를 간단한 방법으로 정량적으로 실시간 분석할 수 있다. 이에, 비정상 단백질 응집과 관련된 질병의 진단 방법으로서 폭넓게 활용될 수 있다.

본 발명의 방법 및 진단키트는 생시료를 진단키트와 반응시킨 후 단백질의 단량체화 과정을 전기화학적으로 실시간 측정함으로써, 혈액, 뇌척수액, 콧물, 타액 등의 생체시료에 포함된 복합 물질과 진단의 복잡한 처리 과정에 따른 비특이적인 결합으로 인한 진단 오류를 방지하고, 타겟 물질의 단량체화에 의한 센서 변화량을 감지하여 보다 정확하게 단백질 응집체를 정량 검출하고 관련 질병을 진단할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 단백질 응집형 검출 키트에서 항체가 고정된 항체부를 개략적으로 나타낸 정면도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 단백질 응집형 검출 키트에서 항체부에 단백질 응집체를 포함하는 혈장을 가하여 단백질 및 그 응집체를 항체에 결합시키고, 나머지 부분은 PBS 버퍼로 제거한 경우를 나타낸 정면도이다.
도 3은 도 2에서 단량체화 조성물을 가하여 단백질 응집체를 단량체화시킨 경우를 나타낸 정면도이다.
도 4는 단백질의 응집화 정도가 증가함에 따라 임피던스 변화량이 커짐을 나타내는 도면이다.
도 5는 단백질 응집체에 전기장을 가하여 단백질 응집체를 단량체화 하는 경우를 나타내는 도면이다.
도 6은 알츠하이머 치매 환자와 정상인의 베타아밀로이드 응집 정도에 따른 임피던스 절대값의 변화를 나타낸 것이다.

본 발명은 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 상기 단백질의 복수개의 항체에 가하여 제1 임피던스를 측정하는 단계; 상기 단백질 응집체를 단량체화하여 제2 임피던스를 측정하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 임피던스를 비교하는 단계;를 포함함으로써, 단백질이 생시료 내에서 얼마나 많이 응집형으로 존재하는지 여부를 간단한 방법으로 정량적으로 실시간 분석하여, 비정상 단백질 응집과 관련된 질병의 진단에 폭넓게 활용될 수 있는 단백질 응집형의 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 베타 아밀로이드의 응집을 원인으로 하는 알츠하이머 병 등의 질병 또는 질환과 단백질의 응집으로 인한 다른 질병 또는 질환의 혈액 중에 응집된 단백질을 용해하고 이를 분석하여 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환 또는 질병의 정확한 진단 시스템에 관한 것이다. 상기 진단시스템은 금 전극이나 플레이트 위에 티올기 혹은 알데히드기로 표면개질하고 단백질의 아민기에 따른 아미노기를 형성하여 항체를 센서 표면에 고정하고 항체와 결합되는 단백질의 생화학적 특성을 전기적으로 측정하고자 한다.

본 발명은 혈액 또는 혈장 내 포함된 베타 아밀로이드 및 타우 단백질의 중합체를 대조군 혹은 비교군 없이 측정하여 질병을 진단하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 베타 아밀로이드 중합체를 EPPS 혹은 디터전트를 포함하는 단량체화 조성물로 단량체로 분해하고, 분해된 베타 아밀로이드 antibody와 결합하는 과정을 전기적으로 측정하는 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환 또는 질병을 진단하는 시스템을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 중합체를 단량체화 조성물 이외에 Electric field, micro wave, IR을 가지고 단량체로 분해할 수 있는 것을 특징으로 하는 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환 또는 질병을 진단하는 시스템을 제공한다.

도 1은 센서 전극 사이에 베타 아밀로이드 antibody가 바인딩된 상태를 나타내는 도면이다.

유리 플레이트 위에 작업전극(working electrode)과 상대 전극(counter electrod)을 형성하고, 표면을 클리닝 한다. 이후, 표면처리 과정을 통해 전극 사이에 베타 아밀로이드 antibody를 바인딩 시킨다. 이때, 베타 아밀로이드 antibody는 수 fg/ml~수십 ug/ml의 농도로 PBS Buffer혹은 DI water에 섞어서 센서 전극이 형성된 웰에 주입시켜 바인딩 시킬 수 있다. 또한 바인딩 후 PBS Buffer 혹은 DI water로 워싱한다.

도 2에서 베타 아밀로이드가 포함된 혈장(플라즈마)을 도 1의 베타 아밀로이드 antibody가 안정적으로 형성된 웰에 주입한다. 이때 베타 아밀로이드와 베타 아밀로이드 antibody가 안정적으로 결합할 수 있도록 소정의 시간이 지난 후, DI water혹은 PBS Buffer를 가지고 센서가 형성된 well을 워싱한다.

도 2는 베타 아밀로이드와 베타 아밀로이드 antibody가 결합된 상태를 나타내며, 이때 혈장(플라즈마)내의 베타 아밀로이드는 단량체, 이량체, 삼량체 및 여러 형태의 중합체가 포함될 수 있다. 또한, 베타 아밀로이드는 혈장(플라즈마)에 있는 물질뿐만이 아니라 전혈, 뇌척수액(CSF), 소포체 등의 생체 시료가 될 수 있다.

도 3은 단백질의 응집 혹은 미스폴딩을 분리할 수 있는 단량체화 조성물을 주입시킨 것으로서, 단량체화 조성물은 화학식 1의 화합물 또는 디터전트 형태의 물질들로 구성될 수 있으며, DI water (초순수 용액) 혹은 PBS Buffer에 소정의 농도를 주입시킨다. 이때 단량체화 조성물은 이미 베타 아밀로이드 antibody와 결합된 베타 아밀로이드의 이량체, 삼량체 등의 중합체 물질을 단량체로 분리시키고, 표면에 형성된 베타 아밀로이드 antibody와 새로운 항원항체 반응이 진행된다.

여기서 베타 아밀로이드는 베타 아밀로이드 40 혹은 42번의 중합체, 피브릴 전구체, 피브릴, 플라크, 베타 아밀로이드 집적체, 타 단백질과 결합된 베타아밀로이드 단량체 및 중합체, 지방 혹은 탄수화물과 결합된 베타아밀로이드, 핵산과 결합된 베타아밀로이드 및 혈액세포와 결합된 단량체가 분해된 것일 수도 있다. 또한, 타우의 중합체, 응집체 혹은 미스폴딩된 단백질이 단량체로 분해된 것일 수도 있다. 한편, 이러한 항원항체 반응은 전극에 소정의 전기신호를 인가하여 시간에 따른 생화학적 결합특성을 전기적으로 분석한다.

도 4는 DI water로 워싱 후 상기 단량체화 조성물을 주입한 후 시간에 따른 임피던스 변화를 나타낸다. 여기서 혈장 내 전체 베타 아밀로이드에서 중합체로 형성된 비율이 높을수록 시간에 따른 임피던스 변화가 큰 것을 확인할 수 있다. 여기서 임피던스는 정확하게는 임피던스의 역수인 컨덕턴스와 캐패시턴스를 의미하며, 레지스턴스와 리액턴스도 포함될 수 있다.

한편, 도 2의 센서를 적용하여 전기적 필드를 적용하고 베타 아밀로이드의 중합체를 단량체로 분해할 수 있다. 이때 베타 아밀로이드는 항원항체 결합 후, DI water 혹은 PBS Buffer로 워싱한 상태 혹은 워싱 후 DI water 혹은 PBS buffer 를 채운상태를 기준으로 센서의 임피던스 값을 측정한다. 그 후, 소정의 전기적인 필드를 인가하여 베타 아밀로이드 중합체가 단량체로 분해되면서 새롭게 베타 아밀로이드 antibody에 결합하는 과정을 전기적으로 측정할 수 있다.

또한, 본 발명은 단백질 응집형의 검출 방법을 제공한다.

이하 본 발명의 일 구현예에 따른 단백질 응집형의 검출 방법을 상세히 설명한다.

먼저, 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 상기 단백질의 복수개의 항체에 가하여 제1 임피던스를 측정한다.

본 명세서에서 단백질 응집은 단백질이 비정상적으로 축적되면서 응집체를 형성하는 것을 의미한다.

상기 단백질은 응집체를 형성할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 독성 단백질 응집체를 형성할 수 있는 베타아밀로이드, 타우, 알파시뉴크레인(α-synuclein), 프리온(Prion), 폴리글루타민, 토신A(torsinA), 아밀로이드 트랜스티레틴, 아밀로이드성 단백질일 수 있다. 상기 외에도 단백질 응집체를 형성할 수 있는 단백질, 특히 독성 단백질 응집체를 형성할 수 있는 단백질, 그리고 후술하는 질병의 원인이 되는 단백질은 모두 적용 대상이 될 수 있다.

베타아밀로이드인 경우의 구체적인 예를 들면,베타아밀로이드 40 혹은 42번의 중합체, 피브릴 전구체, 피브릴, 플라크, 베타 아밀로이드 집적체, 타 단백질과 결합된 베타아밀로이드 단량체 및 중합체, 지방 혹은 탄수화물과 결합된 베타아밀로이드, 핵산과 결합된 베타아밀로이드 및 혈액세포와 결합된 단량체가 분해된 것일 수도 있다.

생시료(biosample)는 상기 단백질 응집체를 포함하는 시료로서, 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 혈액, 혈장, 척수액, 뇌 균질액, 림프액, 타액, 정액 등을 들 수 있다.

상기 생시료는 신체로부터 채취, 제거, 배출된 것(체외로 분리된 것)일 수 있다.

상기 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 상기 단백질의 복수개의 항체에 가하여 제1 임피던스를 측정한다.

단백질 응집체를 포함하는 생시료를 상기 단백질의 복수개의 항체에 가하면, 도 2에 예시된 바와 같이 단백질 응집체가 그 항체에 결합하게 된다.

구체적으로, 단백질 응집체를 포함하는 생시료 내에는 단백질 이량체, 중합체 등 다양한 종류의 단백질 응집체가 포함되어 있을 수 있고, 또한 단량체도 포함되어 있을 수 있는데, 항체는 그 단백질의 특정 결합 부위를 인식하는 것이므로 대체적으로 도 2와 같이 1개의 덩어리(단량체 또는 응집체)별로 1개의 항체에 결합하게 된다.

생시료는 복수개의 항체가 고정된 항체부 상에 가해질 수도 있다.

생시료를 항체에 가하여 그 임피던스(제1 임피던스)를 측정한다. 즉, 제1 임피던스는 각 단백질 응집체가 각 항체에 결합된 상태의 임피던스일 수 있다.

구체적으로, 임피던스는 그 역수인 컨덕턴스와 캐패시턴스를 의미하는 것일 수 있고, 레지스턴스와 리액턴스도 포함될 수 있다.

필요에 따라, 본 발명은 상기 생시료를 가하고 제1 임피던스를 측정하기 전에 상기 생시료 중 항체와 결합하지 않은 부분을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.

생시료는 상기 항체와 결합할 수 있는 단백질과 그 응집체 외에도 다양한 성분들을 포함할 수 있으므로, 제1 임피던스의 측정 전에 생시료중 항체와 결합하지 않은 부분(성분)들은 제거할 수 있다.

상기 제거는 단백질이 결합된 항체에 액체를 가하여 상기 부분을 씻어냄으로써 수행할 수 있다. 상기 액체는 예를 들면 탈이온수, PBS(phosphate buffered saline) 버퍼, MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) 버퍼, 계면활성제 등일 수 있다.

상기 계면활성제는 단백질, 항체의 구조적인 변형, 손상을 유발하는 것이 아니라면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 트윈계 계면활성제를 들 수 있고, 구체적으로 Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Tween 81 등을 들 수 있다. 상기 계면활성제는 물(예를 들면 탈이온수)에 희석하여 사용할 수 있다.

이후, 상기 단백질 응집체를 단량체화하여 제2 임피던스를 측정한다.

상기 단백질 응집체가 단량체화되면 도 3에 예시된 바와 같이 개별 단량체가 단백질과 결합하지 않은 비어있는 항체에 결합할 수 있다.

단량체화 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 항체에 결합된 단백질 응집체에 단량체화 조성물을 가하는 방법, 전기장을 가하는 방법, 마이크로파를 가하는 방법, 적외선 레이저를 가하는 방법 등에 의할 수 있다. 상기 중 1개 이상의 방법에 의할 수 있다.

단량체화 조성물은 상기 단백질, 항체의 결합 부위를 손상시키지 않으면서 단백질 응집체를 개별 단량체로 나눌 수 있는 물질이라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 계면활성제일 수 있고, 구체적으로 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.

[화학식 1]

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단량체화 조성물은 탈이온수, PBS 버퍼, 계면활성제 등과 함께 사용될 수 있다.

단량체화 조성물의 상기 용매 내 용도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 0.1mM 내지 2000mM의 농도로 포함될 수 있다.

전기장을 가하는 방법의 경우, 예를 들면 항체에 결합된 단백질 응집체에수 피코초 동안 수 내지 수천 V/㎛의 전기장을 가할 수 있고, 구체적으로, 1피코초 내지 5000피코초 동안 1V/㎛ 내지 5000V/㎛의 전기장을 가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

마이크로파를 가하는 방법의 경우, 예를 들면 항체에 결합된 단백질 응집체에 10MHz 내지 50GHz의 주파수의 마이크로파를 1와트 이하의 출력으로 가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

적외선 레이저를 가하는 방법의 경우, 예를 들면 상기 단백질 응집체의 공진 주파수에 대응되는 주파수를 갖는 레이저를 항체에 결합된 단백질 응집체에 가할 수 있다. 구체적으로, 단백질 응집체의 공진 주파수 ±20%의 주파수를 갖는 레이저를 가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 응집체의 공진 주파수는 당 분야에 공지된 방법으로 알 수 있으며, 예를 들면 적외선 디텍터로 검출 가능하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서 단백질 응집체 각 개체별로 응집된 단백질 수가 상이할 수 있으므로, 단백질 응집체의 공진 주파수는 하나의 특정된 값이 아니라, 각 단백질 응집체 별로 상이할 수 있으며, 그에 따라 주파수를 조절하여 가할 수 있다.

상기와 같은 다양한 방법에 의해 항체에 결합된 단백질 응집체를 단량체화한 후에 제2 임피던스를 측정한다.

상기 제2 임피던스는 단량체화 조성물을 제거한 이후에 측정할 수도 있고, 단량체화 조성물이 존재하는 상태로 측정할 수도 있다.

이후, 상기 제1 및 제2 임피던스를 비교한다.

전술한 바와 같이 제1 임피던스는 도 2에 예시된 바와 같이 항체에 단백질 응집체, 그리고 추가로 포함될 수 있는 단량체가 결합된 상태에서의 임피던스이고, 제2 임피던스는 도 3에 예시된 바와 같이 단백질 응집체가 단량체화되어 비어있는 항체에까지 결합된 상태의 임피던스이므로, 제1 및 제2 임피던스는 그 값에 차이가 나타날 수 있다.

또한, 그 차이는 단백질이 얼마나 많이 응집체 상태로 존재하느냐에 따라 더 커질 수 있다.

따라서, 상기 제1 및 제2 임피던스값을 비교함으로써, 해당 단백질이 얼마나 응집형으로 존재하는지를 알 수 있다.

필요에 따라, 본 발명의 단백질 응집형의 검출 방법은 상기 단백질 응집체의 단량체화 중에 임피던스(제 3 임피던스)를 1회 이상 더 측정할 수 있다.

단백질, 항체 등의 생시료 유래 물질은 대기, 온도, 습도, pH 등의 다양한 조건에 영향을 받을 수 있으므로, 그 임피던스의 절대값도 그러한 조건에 영향을 받아 달라질 수 있다. 따라서, 제1 및 제2 임피던스도 단백질 응집체의 단량체화 뿐만 아니라 다른 조건에 의해서도 달라질 수 있다.

그러나, 상기 단백질의 단량체화 중에도 임피던스를 1회 이상 측정하여, 제1 및 제2 임피던스 뿐만 아니라 제3 임피던스도 함께 비교함으로써 다른 요인에 의해 검출 정확도가 떨어지는 것을 줄일 수 있다.

뿐만 아니라, 제3 임피던스를 1회 이상, 구체적으로 단량체화 중에 계속 측정함으로써, 단량체화 시작부터 단량체화 종료시까지의 전과정을 실시간으로 변화량을 분석하여 검출 정확도를 더욱 높일 수 있다.

또한, 이를 통해 단순히 단량체화 전 후의 임피던스 변화 뿐만 아니라, 미분, 적분 등을 통해 단량체화 과정에서의 임피던스의 변화 값을 확인할 수 있다.

상기와 같은 본 발명의 단백질 응집형 검출 방법은 단백질이 생시료 내에서 얼마나 많이 응집형으로 존재하는지 여부를 간단한 방법으로 정량적으로 실시간 분석할 수 있다. 뿐만 아니라, 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 가한 복수개의 항체를 측정 시료로서 전체 임피던스 측정 과정을 연속적으로 수행가능하여, 측정 시료를 옮기거나 워싱하는 것 이외에는 별도의 추가 처리를 하는 등의 추가 공정 없이 간단하게 공정 수행이 가능하고, 이에 따라 측정값에 영향을 줄 수 있는 요인들을 최소화 할 수 있다.

뿐만 아니라, 항체에 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 가한 후, 워싱 후 제 1 임피던스를 측정하고 별도의 반응이나 추가 공정 없이 단량체화 조성물의 처리에 따른 실시간 분석 및 제 2임피던스를 측정하여 단백질의 단량체화에 따른 변화과정만을 정확하게 검출할 수 있다.

상기 단백질이 어떠한 단백질인지에 따라 본 발명의 단백질 응집형의 검출 방법은 다양한 진단 방법 등에 활용될 수 있는데, 독성 단백질 응집체를 형성하는 단백질이라면 그와 같은 독성 단백질 응집체(비정상 단백질 응집)에 관련된 질병의 진단 방법으로서 활용될 수 있다.

상기의 방법에 의해 해당 단백질이 얼마나 응집형으로 존재하는지를 알 수 있으므로, 그 단백질 응집체가 유발하는 질병이 발병했는지 여부, 병기 등을 진단할 수 있다.

비정상 단백질 응집 관련 질병은 그 단백질의 종류에 따라서 다양하게 선택될 수 있는 것으로서, 예를 들면 파킨슨질환, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 폴리글루타민 확장증(polyglutamine expansion disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수 및 연수 근육위축(spinal and bulbar muscular atrophy), 타우증(tauopathy), 근육긴장 이상(dystonia), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloidangiopathy), 혈투석-관련 아밀로이드증, 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 뇌허혈(brainischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerveregeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis), 크로이츠펠트-야콥병 등의 질병일 수 있다.

또한, 본 발명은 단백질 응집형의 전기화학적 검출 키트를 제공한다.

본 발명의 단백질 응집형의 검출 키트는 항체부, 전극부 및 임피던스 측정부를 포함한다.

항체부는 응집체를 이룰 수 있는 단백질에 대한 복수개의 항체가 고정된 층이다.

상기 단백질은 앞서 예시한 단백질일 수 있고, 항체는 그 단백질에 대한 항체일 수 있다.

항체부는 예를 들면 센싱 전극 사이에 항체가 고정되어 형성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

항체는 용매에 혼합하여 주입될 수 있다. 상기 용매는 예를 들면 탈이온수, PBS 버퍼, MOPS 버퍼 등일 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

항체 농도는 예를 들면 수fg/ml 내지 수십mg/ml일 수 있고, 구체적으로 0.1fg/ml 내지 80mg/ml의 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항체부에 단백질 응집체를 포함하는 생시료가 가해질 수 있고, 센싱 전극이 형성된 웰에 항체를 주입시켜 형성된 경우의 구체적인 예를 들면, 상기 웰에 생시료가 가해질 수 있다. 그에 따라 생시료에 포함된 단백질 응집체가 항체와 결합할 수 있다.

전극부는 상기 항체부와 전기적으로 연결되며, 작업전극 및 상대전극을 포함한다.

작업전극은 전극 반응을 일으킬 때 시료 중에 전류를 흐르게 할 목적으로 사용하는 2개의 전극 중 목적하는 반응을 일으키기 위해 사용되는 전극을 의미하는 것으로, 전도성 물질이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

상대전극은 작용전극의 전극 전위를 측정하는 경우에 또 하나의 별도 전극을 전극 전위의 기준으로 준비하여 하나의 전지를 구성하고, 그 개회로 전압을 전극 전위의 상대값으로 정하는 방법이 취해지는데 이 때의 기준이 되는 전극을 의미하는 것으로, 마찬가지로 전도성 물질이라면 제한없이 사용될 수 있다.

또한, 상기 전극은 복수의 작업전극과 상대전극으로 구성될 수 있으며, 이들은 수 나노미터에서 수백 마이크로 미터의 간격으로 형성되어 타겟 단백질의 검출에 따른 검출 민감도를 높힐 수 있다.

임피던스 측정부는 상기 전극부에서 교류신호의 진폭 및 위상을 비교하여 임피던스를 측정한다.

구체적으로, 임피던스는 그 역수인 컨덕턴스와 캐패시턴스를 의미하는 것일 수 있고, 레지스턴스와 리액턴스도 포함될 수 있다.

임피던스는 단백질이 응집체 상태로 항체에 결합되어 있을 때와 단량체화 되었을때에 측정될 수 있다.

본 발명의 단백질 응집형의 검출 키트는 상기 측정되는 임피던스 값의 변화에 따라 해당 단백질이 얼마나 많이 응집형으로 존재하는 지를 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질 응집형의 검출 키트는 임피던스 연산부 및 임피던스 표시부를더 포함할 수 있다.

임피던스 연산부는 복수회 측정된 임피던스 간의 변화량을 연산할 수 있다.

임피던스 표시부는 측정된 임피던스를 표시하거나, 상기 임피던스 변화량을 표시할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 단백질 응집형 검출 키트를 포함하는 비정상 단백질 응집 관련 질병의 전기화학적 진단 키트를 제공한다.

단백질 응집형 검출 키트에 의해 생시료에 포함된 단백질이 얼마나 응집형으로 존재하는지 여부를 판단할 수 있으므로, 상기 단백질이 독성 단백질 응집체를 형성하는 단백질인 경우, 그 단백질 응집체가 유발하는 질병이 발병했는지 여부, 병기 등을 진단할 수 있다.

상기 비정상 단백질 응집 관련 질병은 예를 들면 파킨슨질환, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 폴리글루타민 확장증(polyglutamine expansion disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수 및 연수 근육위축(spinal and bulbar muscular atrophy), 타우증(tauopathy), 근육긴장 이상(dystonia), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloidangiopathy), 혈투석-관련 아밀로이드증, 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 뇌허혈(brainischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerveregeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis) 및 크로이츠펠트-야콥병 등일 수 있다.

실시예

단백질 응집형 검출 키트의 제조 및 단백질 응집형의 검출

도 1은 센서 전극 사이에 베타 아밀로이드 antibody가 바인딩된 상태를 나타내는 도면이다.

유리 플레이트 위에 복수의 작업전극(working electrode)과 상대 전극(counter electrode)을 형성하고, 센서 표면을 아세톤 및 플라즈마 클리닝하였다. 이후, 베타 아밀로이드 antibody가 펩티드 결합을 통해 전극 사이에 고정되도록 하였다.

베타 아밀로이드 antibody는 10㎍/ml의 농도로 PBS 버퍼에 섞어서 센서 전극이 형성된 유로에 주입시켜 고정시켰다. 한 시간 가량 고정 후 PBS Buffer로 결합되지 않고 남아있는 시료를 클리닝하였다.

이후 (도 2와 같이) 베타 아밀로이드가 포함된 혈장(플라즈마)을 베타 아밀로이드 antibody가 안정적으로 형성된 유로에 주입하였다. 30분 가량 시간이 지나고 아밀로이드와 베타 아밀로이드 antibody가 안정적으로 결합되면, PBS Buffer로 센서가 형성된 유로를 워싱하였다.

이때 베타 아밀로이드는 단량체, 이량체, 삼량체 및 여러 형태의 중합체로 이루어질 수 있어서 도2와 같이 고정될 수 있다.

이후, 하기 화학식 1의 물질 0.1 내지 200mM을 첨가한 PBS 버퍼를 상기 유로에 주입시켰다.

[화학식 1]

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이후, 시간에 따라 단량체와 조성물에 의해 응집 혹은 미스폴딩된 단백질의 단량체화되는 과정을 임피던스 측정을 통해 분석하였다.

이때, 단량체화 조성물에 의해 베타 아밀로이드의 이량체, 삼량체 등의 중합체 물질이 단량체로 분리되고 표면에 형성된 베타 아밀로이드 antibody와 새로운 항원항체 반응이 진행된다.

도 4는 이러한 베타 아밀로이드를 응집시키고 표면에 형성된 antibody와 결합되는 상태를 그림으로 도식하고, 이를 단량체화하면서 시간에 따른 임피던스를 측정한 그래프이다.

이때 각각의 농도에 대해 정리하면 베타 아밀로이드의 농도가 높을수록 제1임피던스에서 제 2임피던스(마지막 임피던스 측정)로의 변화량이 큰 것을 확인할 수 있다. 여기서 임피던스는 정확하게는 임피던스의 역수인 컨덕턴스와 캐패시턴스를 의미하며, 레지스턴스와 리액턴스도 포함될 수 있다.

2. 알츠하이머 치매의 진단

도 5는 치매 환자와 정상인의 혈액 샘플을 이용한 임상실험결과이다.

서울원자력병원으로부터 PET-CT 검사를 통해 치매로 진단 받은 알츠하이머 치매 환자 10명의 혈액 샘플을 제공받아, 정상인 10명의 혈액 샘플과 비교 실험을 수행하였다.

상기 각 혈액 샘플의 혈장을 상기 키트의 유로에 주입하고 이후에는 상기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

도 5를 참조하면, 치매환자의 경우, 베타아밀로이드 단백질이 단량체화되는 비율이 높아서 초기 임피던스 대비 임피던스의 변화량이 큰 것을 확인할 수 있다.

유로 한 개에 복수의 센서를 갖는데, 색깔은 각 센서의 번호입니다. 하나의 유로에 센서 8개가 존재하고 동일한 시료가 들어갑니다. Y축의 값(그림에서는 0.05정도)를 기준으로 환자와 정상인에 따른 혈액의 단량체화 변화량이 구분됩니다.

Claims (19)

1. 삭제
2. 응집체를 이룰 수 있는 단백질에 대한 복수개의 항체가 고정된 항체부; 상기 항체부와 전기적으로 연결되며, 작업전극 및 상기 작업전극과의 전위차를 형성하는 상대전극을 포함하는 전극부; 및 상기 전극부에서 입출력되는 교류신호의 진폭 및 위상을 비교하여 임피던스를 측정하는 임피던스 측정부;를 포함하는 단백질 응집형의 검출 키트의 상기 항체부에 단백질 응집체를 포함하는 생시료를 가하여 상기 단백질 응집체를 상기 항체부의 복수개의 항체에 결합시킨 후 제1 임피던스를 측정하는 단계;
   상기 단백질 응집체에 단량체화 조성물, 전기장, 마이크로파 또는 적외선 레이저를 가하여 상기 단백질 응집체를 단량체화하면서 제3 임피던스를 1회 이상 측정하는 단계;
   상기 단백질 응집체의 단량체화 이후에, 단량체화된 단백질이 상기 항체 중 단백질이 결합하지 않은 항체에 결합된 상태로 제2 임피던스를 측정하는 단계; 및
   상기 제1 내지 제3 임피던스를 비교하는 단계;를 포함하는 단백질 응집형의 검출 방법.
   
3. 삭제
4. 청구항 2에 있어서, 상기 단백질은 베타아밀로이드, 타우, 알파시뉴크레인(α-synuclein), 프리온(Prion), 폴리글루타민, 토신A(torsinA), 아밀로이드 트랜스티레틴 및 아밀로이드성 단백질로 이루어진 군에서 선택된 것인 단백질 응집형의 검출 방법.
   
5. 청구항 2에 있어서, 상기 생시료는 혈액, 혈장, 척수액, 뇌 균질액, 림프액, 타액 및 정액으로 이루어진 군에서 선택된 것인 단백질 응집형의 검출 방법.
   
6. 삭제
7. 청구항 2에 있어서, 상기 생시료를 가하고 제1 임피던스를 측정하기 전에 상기 생시료 중 항체와 결합하지 않은 부분을 제거하는 단계를 더 포함하는 단백질 응집형의 검출 방법.
   
8. 청구항 7에 있어서, 상기 제거는 상기 단백질이 결합된 항체에 탈이온수, PBS 버퍼, MOPS 버퍼 및 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 가하여 수행되는 단백질 응집형의 검출 방법.
   
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11. 청구항 2에 있어서, 상기 단량체화 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 계면활성제인 단백질 응집형의 검출 방법:
    [화학식 1]
    

    

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