KR20230166389A - 단백질 응집체 검출용 형광 프로브 화합물 및 이를 이용한 단백질 응집체의 영상화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 3] 중 어느 하나로 표시되는 형광 프로브 화합물 및 이를 이용한 단백질 응집체 영상화 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 형광 프로브 화합물은 아밀로이드 베타와 과인산화 타우 단백질과 같은 단백질 응집체의 미세한 극성 차이를 서로 다른 최대 형광 방출 파장 생성을 통해 식별할 수 있는바, 다중 스펙트럼 형광 영상(MSFI) 기법에 유용하게 활용될 수 있고, 이를 통해 알츠하이머의 조기 진단 및 치료를 포함한 신경 퇴행성 질환의 연구 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
[화학식 1] [화학식 2]
[화학식 3]
.
[화학식 1] [화학식 2]
[화학식 3]
.
Description
본 발명은 단백질 응집체 검출용 형광 프로브 화합물 및 이를 이용한 단백질 응집체의 영상화 방법에 관한 것이다.
대표적인 퇴행성 뇌신경질환인 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)의 중요한 병리적 특징은 노인성 플라크(senile plaque)라고 불리는 펩티드 응집체의 형성이며, 이는 시냅스 기능장애 및 신경세포의 사멸을 유발한다. 이러한 노인성 플라크의 주성분은 40-42 아미노산 길이의 베타-아밀로이드(beta-amyloid; Aβ)이다. 베타-아밀로이드 단량체는 올리고머, 원섬유(protofibril) 및 베타-시트가 풍부한 섬유로 자가 조립(self-assemble)되기 쉽고, 신경 독성의 발병과 관련이 있다.
또한, 알츠하이머병의 주요한 병인적 특징 중 하나로 알려진 신경섬유엉킴(neurofibrillary tangles; NFT)은 타우(tau) 단백질의 과인산화(hyperphosphorylation)로 인해 발생한다. 타우 단백질은 교대로 이어져 있는 이성체로 존재하며, 미세관 결합 도메인에 해당하는 반복 서열의 3 또는 4 copy를 함유한다. 타우 단백질의 과인산화의 결과물로 이루어진 신경섬유엉킴은 알츠하이머병과 같은 뇌신경질환의 주요한 병인 중 하나로 알려져 있다. 과인산화된 타우단백질의 응집체는 마이크로 튜블의 불안정화를 야기하여 액손을 통한 여러 신호전달의 저해를 야기한다.
한편, 알츠하이머병의 병리학적 특성 및 그 주요 원인인 아밀로이드 베타 및 과인산화 타우 단백질 간의 상호 작용은 현재까지도 상당히 불명확하다. 따라서, 형광 영상 기법을 활용해 아밀로이드 베타 및 과인산화 타우 단백질의 침전물과 같은 비정상적 단백질 응집체(Aberrant proteinaceous aggregates)를 구분해내는 것은 기초 연구 단계에서 알츠하이머병의 병리학 결과를 초래하는 네트워크 및 그 특징을 규명하는데 유용하게 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 다중 스펙트럼 형광 영상(multispectral fluorescence imaging, MSFI)은 다색 형광 신호를 방출하는 단일 형광체를 사용하여 여러 분석물을 동시에 식별할 수 있는 기법으로서, 아밀로이드 베타 및 과인산화 타우 단백질에 대한 적용이 수 차례 시도된바 있다.
본 발명에서는 분자 내 전하이동(intramolecular charge transfer, ICT) 특성을 나타내는 N,N-dimethyl biannulated group이 도입되어, 아밀로이드 베타와 과인산화 타우 단백질과 같은 단백질 응집체의 미세한 극성 차이를 서로 다른 최대 형광 방출 파장 생성을 통해 식별할 수 있는, 벤즈이미다졸 기반의 단백질 응집체 검출용 신규 형광 프로브 화합물 및 이를 이용한 단백질 응집체의 영상화 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,
하기 [화학식 1] 내지 [화학식 3] 중 어느 하나로 표시되는 형광 프로브 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
.
본 발명에 따르면, 상기 형광 프로브 화합물은 단백질 응집체에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이때, 상기 단백질 응집체는 베타아밀로이드, 타우, 알파시뉴크레인(α-synuclein), 프리온(Prion), 폴리글루타민, 토신A(torsinA), 아밀로이드 트랜스티레틴 및 아밀로이드성 단백질의 응집체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 단백질 응집체는 베타아밀로이드 또는 타우의 응집체일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 [화학식 1] 내지 [화학식 3] 중 어느 하나로 표시되는 형광 프로브 화합물을 포함하는 단백질 응집체 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 [화학식 1] 내지 [화학식 3] 중 어느 하나로 표시되는 형광 프로브 화합물을 생체로부터 분리된 시료에 주입하는 단계; 상기 형광 프로브 화합물이 생체로부터 분리된 시료 내 단백질 응집체와 결합하는 단계; 상기 생체로부터 분리된 시료에 여기원(excitation source)을 조사하는 단계; 및 상기 형광 프로브 화합물로부터 발생하는 형광을 관측하는 단계;를 포함하는 단백질의 응집체의 영상화 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 형광 프로브 화합물은 아밀로이드 베타와 과인산화 타우 단백질과 같은 단백질 응집체의 미세한 극성 차이를 서로 다른 최대 형광 방출 파장 생성을 통해 식별할 수 있는바, 다중 스펙트럼 형광 영상(MSFI) 기법에 유용하게 활용될 수 있고, 이를 통해 알츠하이머의 조기 진단 및 치료를 포함한 신경 퇴행성 질환의 연구 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 PBS (1% DMSO) 용액 (pH 7.4)에서 [화학식 1] 내지 [화학식 3]으로 표시되는 화합물(BZ1, BZ2, BZ3)(10 μM)의 흡광도 및 형광 스펙트럼(각각 BZ1, BZ2 및 BZ3에 대해 λex = 395, 350 및 390nm)을 나타낸 것이다.
도 2의 (a)는 BZ1-BZ3의 최대 흡광도 파장과 용매 분극성 매개변수 간의 관계를 나타낸 것이고, (b)는 BZ1-BZ3의 최대 방출 파장과 용매 쌍극성 매개변수 간의 관계를 나타낸 것이다.
도 3 다양한 용매(DCB, MeOH, THF, 톨루엔 또는 DCM)에서 용매 유전 상수의 자연 로그와 BZ1-BZ3의 형광 양자 수율 간의 관계를 나타낸 것이다. 형광 양자 수율은 메탄올 중 Coumarin 153에 대해 결정되었다.
도 4는 다양한 용매(DCB, MeOH, THF, 톨루엔 또는 DCM)에서 용매 유전 상수의 자연 로그와 BZ1-BZ3의 스토크스 쉬프트(Stokes' shift) 간의 관계를 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 용매(DCB, MeOH, THF, toluene 또는 DCM)에 따른 용매 점도와 BZ1-BZ3의 최대 방출 파장 사이의 관계를 나타낸 것이다.
도 6은 다양한 단백질 종에 대한 BZ1-BZ3(각각 도 6의 (a) 내지 (c)) 및 Thioflavin S(ThS)(도 6의 (d))의 형광 반응 분석 결과를 나타낸 것이다 (BSA: PBS 중 0.5 mg/mL; Tau-pre: PBS 중 0.5 mg/mL 과인산화된 타우 pre-aggregates; Tau-agg: 헤파린(0.1 mg/mL) 및 DTT(0.1 mM)를 포함하는 PBS에 용해된 0.5 mg/mL 과인산화된 타우를 5일 동안 진탕하면서 37℃에서 인큐베이션; AβPBS 중 0.5 mg/mL Aβ1-40 ; AβPBS 중 0.5 mg/mL Aβ1 -40을 5일 동안 진탕하면서 37℃에서 인큐베이션). 단백질 용액 (100 μg/mL)을 20분 동안 50μL PBS에서 10μM 프로브와 혼합하였다. 각 혼합 용액은 400 nm에서 여기되었다.
도 2의 (a)는 BZ1-BZ3의 최대 흡광도 파장과 용매 분극성 매개변수 간의 관계를 나타낸 것이고, (b)는 BZ1-BZ3의 최대 방출 파장과 용매 쌍극성 매개변수 간의 관계를 나타낸 것이다.
도 3 다양한 용매(DCB, MeOH, THF, 톨루엔 또는 DCM)에서 용매 유전 상수의 자연 로그와 BZ1-BZ3의 형광 양자 수율 간의 관계를 나타낸 것이다. 형광 양자 수율은 메탄올 중 Coumarin 153에 대해 결정되었다.
도 4는 다양한 용매(DCB, MeOH, THF, 톨루엔 또는 DCM)에서 용매 유전 상수의 자연 로그와 BZ1-BZ3의 스토크스 쉬프트(Stokes' shift) 간의 관계를 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 용매(DCB, MeOH, THF, toluene 또는 DCM)에 따른 용매 점도와 BZ1-BZ3의 최대 방출 파장 사이의 관계를 나타낸 것이다.
도 6은 다양한 단백질 종에 대한 BZ1-BZ3(각각 도 6의 (a) 내지 (c)) 및 Thioflavin S(ThS)(도 6의 (d))의 형광 반응 분석 결과를 나타낸 것이다 (BSA: PBS 중 0.5 mg/mL; Tau-pre: PBS 중 0.5 mg/mL 과인산화된 타우 pre-aggregates; Tau-agg: 헤파린(0.1 mg/mL) 및 DTT(0.1 mM)를 포함하는 PBS에 용해된 0.5 mg/mL 과인산화된 타우를 5일 동안 진탕하면서 37℃에서 인큐베이션; AβPBS 중 0.5 mg/mL Aβ1-40 ; AβPBS 중 0.5 mg/mL Aβ1 -40을 5일 동안 진탕하면서 37℃에서 인큐베이션). 단백질 용액 (100 μg/mL)을 20분 동안 50μL PBS에서 10μM 프로브와 혼합하였다. 각 혼합 용액은 400 nm에서 여기되었다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실험 방법
재료, 방법 및 기기장치
모든 시약 및 용매는 Sigma-Aldrich(Merck), Alfa Aesar, TCI-Korea, Samchun, Duksan에서 구입하여 추가 정제없이 사용하였다. 실리카겔 100(Merck)을 고정상으로 사용하여 컬럼 크로마토그래피 정제를 수행하였다. 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)는 HPLC-grade 용매를 사용하여 YL9101S(YL-Clarity) 기기를 사용하여 수행하였다. 박막 크로마토그래피(TLC)는 Merck 60 F254(precoated sheets, 0.25 mm thick) 플레이트 상에서 수행하였다. 산소 및 수분에 민감한 반응은 불활성 기체(high purity grade Ar gas)에서 수행하였다. NMR 스펙트럼은 500 MHz Bruker NMR 분광계를 이용하여 수득하였다. 질량 분석은 Shimadzu LCMS-2020 ESI 질량 분석기에서 수행하였고, UV-Vis 스펙트럼 및 형광 스펙트럼은 UV-Vis 분광계(Jasco V-750) 및 분광 형광계(Jasco FP-8500)를 사용하여 각각 기록하였다. Flexstation2 분광광도계(Molecular Devices)를 사용하여 단백질 분석물(proteinaceous analytes)의 존재 하에 형광 스펙트럼을 얻었다. 합성 Aβ1 -40은 American Peptide Company(Sunnyvale)에서 구입하였고, 소 혈청 알부민(BSA)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
BZ1-BZ3의 합성
하기 [Scheme 1]에 개시된 합성 경로에 따라 본 발명에 따른 벤즈이미다졸 유래 형광 프로브 화합물 BZ1-BZ3([화학식 1] 내지 [화학식 3])을 합성하였다. 모든 중간체는 1H NMR로 확인하고, 모든 최종 화합물은 1H 및 13C NMR 및 ESI-MS를 통해 확인하였다.
[Scheme 1]
화합물 1의 합성
2-Bromo-1,1-diethoxyethane (1.22 mL, 8.10 mmol)을 무수 DMF (10 mL) 중 4-(dimethylamino)-2-hydroxylbenzaldehyde (0.67 g, 4.05 mmol)과 K2CO3 (2.24 g, 16.20 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 100℃에서 밤새 교반한 후, 생성된 혼합물을 실온으로 냉각시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(3 x 100 mL)로 추출하고 합한 유기층을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과 및 감압 하에서 농축하였다. 미정제 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (ethyl acetate/hexane, 1:3)로 정제하여 화합물 1을 수득하였다(수율: 73%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 10.21 (d, J = 0.7 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.32 (ddd, J = 8.9, 2.2, 0.6 Hz, 1H), 6.04 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.89 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.09 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 3.81 (dq, J = 9.3, 7.1 Hz, 2H), 3.67 (dq, J = 9.3, 7.0 Hz, 2H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 6H) ppm.
화합물 2의 합성
화합물 1 (0.53 mg, 1.88 mmol)을 acetic acid (glacial)(50 mL)에서 130℃, 24시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 대부분의 아세트산을 감압하에 증발시키고 잔류물을 diethyl ether (100 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 포화 수성 NaHCO3용액(3 x 20 mL)으로 세척하고 유기상을 Na2SO4로 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 컬럼 크로마토그래피 (ethyl acetate/hexane, 1:3)로 정제하여 화합물 2를 수득하였다(수율: 19%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 9.63 (s, 1H), 7.51 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 6.80 (dd, J = 8.9, 2.2 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 3.05 (s, 6H) ppm.
화합물 3의 합성
압력 밀봉 튜브에서, 2-chloro-6-bromoquinoline 및 Me2NH (2 M in THF, 11 mL, 22.0 mmol)를 90℃, 40시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 후속적으로 H2O로 비활성 시킨 후 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 ethyl acetate (3 x 100 mL)를 사용하여 추출하고, 염수로 세척한 후, 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과 및 진공에서 농축하였다. 미정제 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (ethyl acetate/hexane, 1:9)로 정제하여 화합물 3을 수득하였다(수율: 81%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.58 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 1.5 Hz, 2H), 6.68 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 3.09 (s, 6H) ppm.
화합물 4의 합성
아르곤 분위기 하, -78℃에서 무수 THF(5 mL) 중 화합물 3 (0.50 g, 2.0 mmol)의 용액에 n-butyl lithium (2.5 M in hexanes, 0.96 mL, 2.39 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반한 후, DMF를 첨가하고 0℃에서 추가적으로 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 10분에 걸쳐 포화 NH4Cl 용액 (10 mL)을 첨가하여 비활성화하였다. 다음으로, 반응 혼합물을 ethyl acetate (3 x 100 mL)로 추출하고, 합한 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과 및 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (ethyl acetate/hexane, 1:3)로 정제하여 화합물 4를 수득하였다(수율: 72%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 10.01 (s, 1H), 8.07 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.00 (dd, J = 8.7, 1.9 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 3.28 (s, 6H) ppm.
화합물 5의 합성
압력 플라스크에서 6-bromonaphthalen-2-ol (0.80 g, 3.58 mmol) 및 Na2S2O5 (1.40 g, 7.18 mmol)의 용액에 Me2NH (solution in 40% H2O, 2 mL, 17.95 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 120℃에서 72시간 동안 교반한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 침전물을 여과하고 찬물로 세척하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (ethyl acetate/hexane, 1:8)로 정제하여 화합물 5를 수득하였다(수율 64%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.81 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.13 (dd, J = 9.1, 2.6 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 3.02 (s, 6H) ppm.
화합물 6의 합성
화합물 4의 제조 방법과 동일한 절차에 따라, 화합물 5로부터 화합물 6을 수득하였다(수율 62%).
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.96 (s, 1H), 8.32 (s, 1H), 7.94 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.78-7.65 (m, 2H), 7.31 (dd, J = 9.1, 2.6 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 3.09 (s, 6H) ppm.
화합물 7의 합성
화합물 2(0.35 g, 1.85 mmol), malonic acid (0.24 g, 2.22 mmol) 및 acetonitrile (10 mL) 중 piperidine (0.28 mL, 2.78 mmol)을 100℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 불투명한 황색 용액으로 변화시킨 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 침전물을 여과에 의해 분리하고, dichloromethane으로 세척하고, 35℃의 진공 오븐에서 건조시켰다. 추가 정제 없이 화합물 7을 수득하였다(수율: 100%).
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 7.40 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.82 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.74 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 1H), 6.27-6.19 (d, 1H), 2.96 (s, 6H) ppm.
화합물 8, 9의 합성
화합물 7의 제조 방법과 동일한 절차에 따라, 화합물 4 및 화합물 6으로부터 각각 화합물 8 및 9를 수득하였다.
화합물 8(수율: 87%): 1H NMR (500 MHz, DMSOd6): δ 7.99 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.76 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.44 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 3.17 (s, 6H) ppm.
화합물 9(수율: 100%): 1H NMR (500 MHz, DMSOd6): δ 7.86 (s, 1H), 7.74 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.63 (s, 2H), 7.50 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.22 (dd, J = 9.1, 2.6 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 3.03 (s, 6H) ppm.
화합물 BZ1의 합성
화합물 7 (0.2 g, 0.83 mmol) 및 O-phenylenediamine을 POCl3 (0.77 mL, 8.26 mmol)에 용해시키고 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 얼음물에 부었다. 수용액을 20% 암모니아 수용액을 사용하여 pH ~ 8-9로 알칼리화하였다. 다음으로, 혼합물을 ethyl acetate (3 × 50 mL)를 사용하여 추출하고 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고 진공에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 HPLC로 정제하여 순수 화합물 BZ1을 수득하였다(수율: 13%).
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 7.57 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.55 - 7.53 (dd, 2H), 7.44 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 6.0, 3.1 Hz, 2H), 7.03 (s, 1H), 6.98 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 1H), 3.13-2.81 (m, 6H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 157.46, 151.42, 151.14, 151.08, 150.50, 122.75, 122.72, 121.98, 118.62, 115.10, 111.27, 110.76, 109.60, 94.24, 40.99 ppm; MS (ESI): C19H17N3O, m/z calcd 303.1372, [M+H]+ found 304.1).
화합물 BZ2, BZ3의 합성
화합물 BZ1의 제조 방법과 동일한 절차에 따라, 화합물 8 및 화합물 9로부터 각각 화합물 BZ2 및 BZ3를 수득하였다.
화합물 BZ2(수율: 28%): 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 8.37 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.11 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.77 (dd, J = 6.1, 3.1 Hz, 2H), 7.49 (dd, J = 6.1, 3.1 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 3.35 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, (CD3)2CO): δ 151.54, 149.36, 135.59, 135.10, 129.68, 129.11, 127.78, 126.82, 126.55, 123.50, 116.51, 115.44, 105.93, 105.75, 39.75 ppm; MS (ESI): C20H18N4, m/z calcd 314.1531, [M+H]+ found 315.1).
화합물 BZ3(수율: 6%): 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 12.58 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.80 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.77-7.68 (m, 3H), 7.59 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.25 (dd, J = 9.1, 2.5 Hz, 1H), 7.18 (m, J = 16.9, 9.7 Hz, 3H), 6.96 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.04 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 151.93, 149.42, 135.47, 135.37, 129.59, 128.08, 127.16, 126.37, 124.12, 122.75, 121.92, 118.91, 116.97, 115.97, 111.36, 106.07, 40.63 ppm; MS (ESI): C21H19N3, m/z calcd 313.1579, [M+H]+ found 314.1).
양자수율, 형광 방출 및 최대 파장 결정 (Quantum yield and determination of fluorescence emission and wavelength maxima)
형광 측정 시 내부 필터 효과를 방지하기 위해, HPLC 등급 용매 (1,2-dichlorobenzene, methanol, tetrahydrofuran, toluene, and dichloromethane)를 사용하여 여기 파장보다 길거나 같은 파장에서 0.1보다 낮은 흡광도로 데이터를 기록하였다. BZ1-BZ3의 형광 양자 수율을 Coumarin 153에 대비하여 MeOH에서 기록하였다(ФFl = 0.53)(Rurack, K., Spieles, M.: Fluorescence quantum yields of a series of red and near-infrared dyes emitting at 600-1000 nm. Anal. Chem. 83, 1232-1242 (2011)).
단백질
분석물의
준비
가장 긴 tau isoform (hTau40)의 미세소관 결합 반복 영역인 tauK18 fragment는 E. coli BL21(DE3)에서 발현 및 정제되었다(Haque, M et al., Inhibition of tau aggregation by a rosamine derivative that blocks tau intermolecular disulfide cross-linking. Amyloid 3, 185-190 (2014)). Tau pre-aggregation 혼합물은 tauK18 단편을 PBS (10 mM, pH 7.4) (0.5 mg/mL)에 용해시켜 제조하였다. Tau aggregation 혼합물은 tauK18 (0.5 mg/mL)을 100 μM DTT 및 0.1 mg/mL 헤파린과 함께 37℃에서 5일 동안 격렬하게 진탕하면서 (220 rpm) 배양하여 제조하였다. Aβ pre-aggregation 혼합물은 Aβ1-40 펩타이드를 PBS (10 mM, pH 7.4) (0.5 mg/mL)에 용해시켜 제조하였다. Aβ1-40 aggregation 혼합물은 Aβ1-40 (0.5 mg/mL)을 37℃에서 3일 동안 격렬하게 진탕하면서 (220 rpm) 배양하여 제조하였다. Aβ1-40 및 tau 응집은 Thioflavin S (ThS) 분석을 통해 확인하였다. BSA는 PBS (10 mM, pH 7.4)(0.5 mg/mL)에 용해시켰다.
Aβ과인산화된
타우
단백질 및 BSA 존재하에서의 분광학
Aβ1-40, 과인산화된 타우 단백질 및 BSA와 같은 다양한 분석물의 존재하에서 스펙트럼 측정을 위해, ThS 및 BZ1-BZ3의 스톡 용액을 DMSO(BioReagent, Merck)에서 준비하고, PBS (10 mM, pH 7.4)중 분석물의 용액에 첨가하여 PBS 중 1% DMSO를 포함하는 용액을 수득하였다. 37℃에서 15분 동안 교반한 후 마이크로플레이트 판독기를 통해 모든 방출 스펙트럼을 수득하였다.
결과 및 고찰
BZ1-BZ3의
광물리적
특성 및 분자 내 전하 전달(intramolecular charge transfer,
ICT
) 특성
형광 방출, 스토크스 이동(Stokes' shift) 및 형광 양자 수율과 같은 프로브 화합물 BZ1-BZ3의 광물리적 특성은 하기 표 1에 나열된 여러 용매에서 측정하였다. 도 1에 개시된 바와 같이, benzofuran, quinoline, naphthalene과 같은 서로 다른 전자공여부분을 포함하는 BZ1-BZ3은 PBS (1% DMSO)에서 서로 다른 흡수 및 방출 스펙트럼을 나타내었다. 여러 물리화학적 특성에 대한 광물리학적 특성의 강한 의존성은 다른 용매에 의해 유도되었다. 하기 표 1은 1,2-dichlorobenzene (DCB), methanol (MeOH), tetrahydrofuran (THF), toluene 및 dichloromethane (DCM)을 포함한 다양한 용매에서 BZ1-BZ3의 광물리적 특성을 나타낸 것이다.
BZ1-BZ3의 흡수 및 방출 모두의 최대 파장의 의존성은 Catalan 데이터 세트에 보고된 바와 같이 분극성(induced dipole)과 쌍극자(permanent dipole)를 별도로 처리하는 용매 극성에 대한 척도를 참조하여 결정되었다(도 2)(Catalan, J.: Toward a generalized treatment of the solvent effect based on Four Empirical Scales: dipolarity (SdP, a New Scale), polarizability (SP), acidity (SA), and basicity (SB) of the medium. J. Phys. Chem. B 113, 5951-5960 (2009)). BZ1-BZ3의 경우, 최대 흡광도 파장은 용매에 따라 다르지만 용매 분극성에 대한 명확한 경향은 없었다(도 2a). 일반적으로 이러한 흡수(absorption) 차이는 Franck-Condon 상태의 전자 안정화 에너지의 용매 효과에 의해 발생하며, 이는 주변 용매 분자와 형광단 사이의 상호 작용이 바닥(ground) 및 여기된(excited) 전자 상태에서 다를 때 고려할 수 있다(Thompson, M.J., Messina, M.: A quantitative explanation of the dynamics underlying the FranckCondon principle: a mostly classical viewpoint. J. Chem. Educ. 96, 1171-1177 (2019)). 따라서 얻어진 결과는 유도 쌍극자 모멘트가 분자의 전자 상태에 크게 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 대조적으로, 최대 방출 파장은 BZ1-BZ3의 여기 상태의 기하학적 이완 후 용매 케이지의 재배열을 통해 용매 쌍극성과 일관된 경향을 보였다(도 2b). 벤즈이미다졸의 질소 원자와 -NH의 수소 원자는 케이지 내 주변 용매와 여기 상태 분자 사이에 1차 수소 결합을 형성하기 때문이다. 동적 수소 결합 모드에서 흡수 및 방출 스펙트럼은 약간의 적색 이동을 겪는다. 아마도 N,N-dimethyl 2환형(biannulated) 전자 공여체 그룹에서 수소 결합된 벤즈이미다졸 그룹으로의 전하 이동이 향상되었기 때문일 수 있다(Nandi, A., Kushwaha, A., Das, D., Ghosh, R.: Protonationinduced ultrafast torsional dynamics in 9-anthrylbenzimidazole: a pH activated molecular rotor. Phys. Chem. Chem. Phys. 20, 7014-7020 (2018)). 따라서, 높은 용매 쌍극성은 강력한 수소 결합 모드로 향상된 용매-분자 상호작용을 유도할 수 있다. 종합적으로, 이러한 결과는 여기 상태(excited state)가 바닥 상태(ground state)보다 현저하게 더 높은 쌍극자-쌍극자 모멘트를 가지며, 이는 ICT를 나타내는 형광단의 중요한 특성인 솔바토크로믹(solvatochromic) 특성으로 이어진다는 것을 나타낸다((Lee, J.Y., Kim, K.S., Mhin, B.J.: Intramolecular charge transfer of π-conjugated push-pull systems in terms of polarizability and electronegativity. J. Chem. Phys. 20, 9484 (2001)).
또한, BZ1과 BZ2는 형광 양자 수율과 용매 유전 상수의 관계에서 거의 유사한 거동을 보였다. 도 3에 나타난 바와 같이, BZ3를 제외하고 용매 유전상수가 증가하면 형광 양자 수율이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 방사(radiative) 및 비방사(non-radiative) 이완 경로 사이에서 전이 상태의 에너지 준위는 극성 용매에서 덜 감소한다. 이러한 상황에서, 비방사성 붕괴의 동역학(kinetics of non-radiative decay)은 연관 극성 환경(associating polar environment)에서 증가하고, 이러한 강화된 비방사성 이완은 형광 방출 효율 감소에 기인할 수 있다(Hoche, J., Schulz, A., Dietrich, L.M., Humeniuk, A., Stolte, M., Schmidt, D., Brixner, T., Wurthner, F., Mitric, R.: The origin of the solvent dependence of fluorescence quantum yields in dipolar merocyanine dyes. Chem. Sci. 10, 11013-11022 (2019)). 메탄올과 같은 극성 용매를 사용하면 비방사성 붕괴 경로를 통해 형광 양자 수율이 크게 감소한다.
동시에 스토크스 이동(Stokes' shift)과 용매 유전 상수 사이에서도 유사한 경향이 관찰되었다(도 4). 즉, 벤즈이미다졸 유도체의 여기 상태 용매화 효과는 용매 극성이 증가할수록 더 크게 나타났다. 여기 상태의 Franck-Condon 포인트는 쌍극자 모멘트가 가장 크고, 따라서 에너지 준위는 용매의 극성에 의해 낮아진다. 이에 비해 바닥 상태는 상대적으로 작은 쌍극자 모멘트를 보이며, 동일한 조건에서도 더 적게 낮아진다. 극성 용매 매질에서, 여기 상태 형광단과 용매의 쌍극자 모멘트가 재정렬되어 Franck-Condon 여기 상태를 안정화할 수 있다. 따라서 위치 에너지 이동은 용매 극성이 증가함에 따라 바닥 상태와 여기 상태 사이의 에너지 갭 감소를 초래한다. 바닥 상태와 여기 상태 사이의 감소된 에너지 분리는 형광 방출의 장파장 쪽 옮김(bathochromic shift)을 초래한다. 이러한 관찰은 ICT 기반 형광단에서 일반적으로 관찰되는 광물리적 특성으로, ICT 존재에 대한 증거를 강화하는 것이다(Jia, M., Ma, X., Yan, L., Wang, H., Guo, Q., Wang, X., Wang, Y., Zhan, X., Xia, A.: Photophysical properties of intramolecular charge transfer in two newly synthesized tribranched donor-π-acceptor chromophores. J. Phys. Chem. A 114, 7345-7352 (2010)).
또한, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 어떠한 프로브도 용매 점도 의존적 거동을 나타내지 않았다. 이는 벤즈이미다졸 유도체의 형광 방출이 점성보다는 주변 용매 극성에 의해 주로 영향을 받는다는 것을 나타낸다. 또한, 최대 방출 파장에서 용매 점도로의 변화 경향이 없다는 것은 장파장 쪽 옮김 방출이 Aβ의 점도와 과인산화 타우 응집체의 미세 환경에 의존하지 않는다는 것을 의미한다.
β-아밀로이드 및
과인산화된
타우
단백질 응집체의
인비트로
경쟁 형광 반응
이어서, BZ1-BZ3의 형광 반응과 일반적인 β시트 특이적 형광 염료인 thioflavin S(ThS)를 대조군으로, Aβ타우 단백질, BSA를 포함한 알츠하이머병과 관련된 다양한 단백질에 대한 프로브의 반응을 조사하였다(도 6). 실제로, BZ2 및 BZ3은 Aβ및 타우 응집체에 대해 검출 가능한 형광 강도 변화를 나타내었다. Aβ응집체의 경우, BZ2(490 nm에서)의 최대 형광은 단백질과 함께 배양하여 15분 후에 도달했으며, Aβ pre-aggregates 또는 BSA에 비해 각각 2.9배 또는 2.8배 더 높게 나타났다(도 6b). 응집된 타우 단백질의 경우, 520 nm에서 최대 형광 방출이 얻어졌으며, 타우 pre-aggregates 또는 BSA에 비해 각각 3.6배 또는 2.7배 더 높은 강도를 나타내었다. 또한, BZ3의 형광 방출 스펙트럼도 유사한 방식으로 얻어졌다(도 6c). Aβ 응집체의 경우, 560 nm에서의 최대 강도는 Aβ pre-aggregates 또는 BSA에 비해 각각 1.9배 또는 1.5배 증가하였다. 타우 응집체의 경우 최대 파장은 570nm로 측정되었으며, 타우 pre-aggregates 또는 BSA에 비해 강도가 각각 1.6배 또는 1.5배 더 높았다. 대조적으로, Aβ또는 tau 종의 존재 하에서 BZ1에 대해 형광 강도의 무시할 수 있는 변화(negligible change)가 감지되었다(도 6a).
형광 반응의 최대 방출 파장과 관련하여 벤즈이미다졸 유도체, 특히 BZ2는 Aβ와 타우 응집체 사이에서 구별 가능한 형광 스펙트럼을 보여주었다(표 2). 하기 표 2는 Aβ및 과인산화된 타우에 대한 결합 전후의 시험 화합물의 형광 프로파일을 나타낸 것이다. BZ2는 Aβ응집체의 경우 490 nm, 타우 응집체의 경우 520 nm에서 최대 형광 방출을 나타내어 방출 파장에서 대략 30 nm의 차이가 발생하였다. 반면 BZ1 및 BZ3의 경우 최대 방출 파장은 약간의 차이만 보였고 ThS에서는 방출 파장의 식별 가능한 차이가 관찰되지 않았다. 따라서 형광 방출에 차이가 없는 ThS와 비교하여 BZ1-BZ3의 결과는 벤즈이미다졸 모이어티가 실제로 각 미세 환경의 다른 극성에 대해 다른 형광 방출에 기여함을 나타낸다.
결론
본 발명에서는 Aβ및 tau 침전물을 구별 가능한 다색 형광 방출 방식으로 선택적으로 표지하기 위해 일련의 벤즈이미다졸 유도체 BZ1-BZ3을 제공한다. ICT 기반 형광단으로서 BZ1-BZ3은 다양한 유기 용매에서 전형적인 광물리적 특성을 보였다. 또한, 시험관 내 Aβ및 타우 응집체의 존재 하에 BZ2 및 BZ3은 특정 표적 분석물에 대한 선택적 결합 거동을 입증하였다. 특히 BZ2는 최대 형광 방출에서 약 30 nm의 장파장 쪽 옮김을 보였다. 종합적으로, BZ2 및 BZ3은 Aβ및 타우 단백질 응집체 모두에 대해 잠재적으로 MSFI에 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 AD 연구에서 중요한 분석 물질의 특정 식별 및 시각화를 위한 벤즈이미다졸 유래 ICT 기반 형광 프로브의 미래 세대 개발을 위한 도구를 제공할 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시형태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (5)
- 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 3] 중 어느 하나로 표시되는 형광 프로브 화합물:
[화학식 1] [화학식 2]
[화학식 3]
. - 제1항에 있어서,
상기 형광 프로브 화합물은 단백질 응집체에 결합하는 것을 특징으로 하는 형광 프로브 화합물. - 제2항에 있어서,
상기 단백질 응집체는 베타아밀로이드, 타우, 알파시뉴크레인(α-synuclein), 프리온(Prion), 폴리글루타민, 토신A(torsinA), 아밀로이드 트랜스티레틴 및 아밀로이드성 단백질의 응집체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 프로브 화합물. - 제1항에 따른 형광 프로브 화합물을 포함하는 단백질 응집체 검출용 조성물.
- 제1항에 따른 형광 프로브 화합물을 생체로부터 분리된 시료에 주입하는 단계;
상기 형광 프로브 화합물이 생체로부터 분리된 시료 내 단백질 응집체와 결합하는 단계;
상기 생체로부터 분리된 시료에 여기원(excitation source)을 조사하는 단계; 및
상기 형광 프로브 화합물로부터 발생하는 형광을 관측하는 단계;를 포함하는 단백질의 응집체의 영상화 방법.
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