JP6630972B2 - アミロイドβペプチドを電気化学的に測定するためのバイオセンサ - Google Patents
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Description
きると見積もられているが、定量性は得られていない。また、非特許文献4では、抗体で修飾した金電極上でのp−アミノフェノールの酸化還元を用いて、pMレベルのAβ42及び全Aβ量を検出した報告もあるが、この方法では、特殊な抗体を用いる必要があるため、1測定当たりの費用が高額になるという欠点がある。
項1. 下記(1)又は(2)に示すペプチドが固定化されてなる電極を含む、アミロイドβペプチドを測定用のバイオセンサ:
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列を含むペプチド。
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列における第3〜7位以外のアミノ酸残基内、1又は数個が置換、欠失、又は挿入されてなるアミノ酸配列を含み、Aβを凝集させる作用を有するペプチド。
項2. 前記ペプチドが、下記(3)又は(4)に示すペプチドである、項1に記載のバイオセンサ:
(3)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
(4)配列番号2に示すアミノ酸配列において、第8〜12位以外のアミノ酸残基内、1又は数個が置換、欠失、付加、又は挿入されてなるアミノ酸配列からなり、Aβと凝集させる作用を有するペプチド。
項3. アルツハイマー型認知症の診断に使用される、項1又は2に記載のバイオセンサ。
項4. 項1〜3のいずれかに記載のバイオセンサを用いて、アミロイドβペプチドを測定する方法であって、
前記バイオセンサにおけるペプチドが固定化された電極に対して試料溶液を接触させる第1工程、
前記第1工程で試料溶液に接触させた電極に対して、銅2価イオンを接触させ、電流値を測定する第2工程、及び
前記第2工程で測定した電流値に基づいて、試料溶液中のアミロイドβペプチド量を求める第3工程。
項5. 前記試料溶液が、血漿又はその希釈液である、項4に記載の測定方法。
本発明は、バイオセンサは、Aβを電気化学的手法によって測定するために使用されるバイオセンサであって、配列番号1に示すアミノ酸配列又はその改変配列を含むペプチドが固定されている電極を含むことを特徴とする。以下、本発明のバイオセンサについて詳述する。
本発明のバイオセンサにおいて電極に固定化されるペプチドは、下記(1)又は(2)に示すペプチドである。下記(1)又は(2)に示すペプチドは、Aβを効率的に捕捉して凝集させる作用を有しており、当該ペプチドをAβ測定用バイオセンサに使用することにより、簡便、短時間、且つ高精度でのAβの定量が可能になる
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列(HDKLVFFYEVHH)を含むペプチド。
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列(HDKLVFFYEVHH)における第3〜7位以外のアミノ酸残基内、1又は数個が置換、欠失、又は挿入されてなるアミノ酸配列を含み、Aβを凝集させる作用を有するペプチド。
(3)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
(4)配列番号2に示すアミノ酸配列において、第8〜12位以外のアミノ酸残基内、1又は数個が置換、欠失、付加、又は挿入されてなるアミノ酸配列からなり、Aβと凝集させる作用を有するペプチド。
本発明のバイオセンサに使用される電極の構成素材については、導電性を示し、且つ前記ペプチドを固定化できることを限度として特に制限されないが、例えば、金、白金、パラジウム、ニッケル、ルテニウム、イリジウム等の金属電極;ITO(Tin-doped indium oxide)等の金属酸化物電極;グラッシーカーボン等の炭素電極等が挙げられる。これらの中でも好ましくは金属電極、更に好ましくは金電極が挙げられる。
本発明のバイオセンサにおいて、前記ペプチドの電極への固定化は、電極の素材に応じて公知のペプチド固定化方法によって行うことができる。
本発明のバイオセンサは、前記ペプチドが固定化された電極を作用極として使用して電気化学的分析器を構成すればよい。即ち、本発明のバイオセンサでは、前記ペプチドが固定化された電極(作用極)と共に、更に、対極と、発生した電流値を測定する電流測定装置とを備えていればよい。
本発明のAβの測定方法は、前記バイオセンサを用いてAβを測定する方法であり、以下の第1工程〜第3工程を含むことを特徴とする。
第1工程:前記バイオセンサの前記ペプチドが固定化された電極に対して試料溶液を接触させる。
第2工程:前記第1工程で試料溶液に接触させた電極に対して、銅2価イオンを接触させ、電流値を測定する。
第3工程:前記第2工程で測定した電流値に基づいて、試料溶液中のAβ量を求める。
本発明のAβの測定方法において、測定対象となる試料溶液については、Aβの測定、特に定量が求められるものである限り、特に制限されず、例えば、組織抽出液、培養上清、脳脊椎液、血漿等の生体由来試料;Aβを含む試薬;これらの希釈液等が挙げられる。前述するように、血漿中のAβはアルツハイマー型認知症のバイオマーカーであるため、測定対象となる試料溶液として、好ましくは血漿又はその希釈液が挙げられる。
本発明のAβの測定方法では、先ず、前記センサの前記ペプチドが固定された電極に対して試料溶液を接触させる(第1工程)。本第1工程によって、試料溶液に含まれるAβが、電極に固定された前記ペプチド上に凝集する。
前記第1工程後に、試料溶液に接触させた電極に、銅2価イオンを接触させ、電流値を測定する(第2工程)。前記第1工程後にAβが凝集している電極に対して銅2価イオンを接触させると、当該Aβが銅2価イオンと結合し、銅2価イオンと電極間で電流が発生する。
前記第2工程で測定した電流値に基づいて、試料溶液中のAβ量を求める(第3工程)。試料溶液中のAβ量と前記第2工程で測定した電流値は比例関係にあるので、前記第2工程で測定した電流値から、試料溶液中のAβ量が定量される。
また、前記バイオセンサは、一旦Aβの測定を行った後に、前記ペプチドが固定化された電極を洗浄することによって、凝集しているAβと当該Aβに結合している銅2価イオンを除去できるので、繰り返し使用することができる。
配列番号2に示すアミノ酸配列からなるペプチド(以下、「AFPP」と表記する)と、当該AFPPのN末端にシステインを結合させたペプチド(以下、「AFPPcys」と表記する)を合成し、これらのペプチドを用いて、Aβの凝集促進効果を確認した。具体的には、pH7.0に調整したN−エチルモルフォリン緩衝溶液に対して、Aβを10μM、AFPPを10μM、Aβを5μM且つAFPPを10μM、AFPPcysを10μM、又はAβを5μM且つAFPPcysを5μMとなるように添加し、同時にアミロイド線維検出に用いられる蛍光色素チオフラビンT(ThT)を50μMとなるように添加した。これを室温で8時間静置し、経時的に蛍光強度(487nm)の測定を行った。
AFPPcysを固定化した金電極を用いて、Aβの測定を行った。具体的には、先ず、電極を50μMのAFPPcysを含むN−エチルモルフォリン緩衝溶液(pH7.0)400μl中に浸し、一晩静置することによってAFPPcysを金電極上に固定した。次いで、5μMのAβを含むN−エチルモルフォリン緩衝溶液(pH7.0)400μlを当該金属電極に固定化させたAFPPcysの上に添加し、室温で60分間静置したその後、電極上に200μMの塩化銅を含むTris/HCl緩衝溶液(pH7.0)400μlを添加した後に、サイクリックボルタンメトリーの測定を行い、電流値の測定を行った。また、Aβを含む液を添加しなかったこと以外は、前記と同条件で測定を行い、バックグランド電流値の測定も行った。
AFPPcysを固定化した金電極を用いて、Aβの定量を行った。具体的には、先ず、前記実施例1と同様の方法で、AFPPcysを固定した金電極を作製した。次いで、0〜5μMのAβを含むN−エチルモルフォリン緩衝溶液(pH7.0)400μlを当該金属電極に固定化させたAFPPcysの上に添加し、室温で60分間静置した。次いで、電極をN−エチルモルフォリン緩衝溶液(pH7.0)で洗浄した。洗浄した電極上に、200μMの塩化銅を含むTris/HCl緩衝溶液(pH7.0)400μlを添加し、過剰の銅2価イオンをTris/HCl緩衝溶液(pH7.0)で洗浄した後に、サイクリックボルタンメトリーの測定を行い、電流値の測定を行った。
AFPPcysを固定した金電極の繰り返し使用が、測定精度に与える影響を評価するために、以下の試験を行った。先ず、前記実施例1と同様の方法で、AFPPcysを固定した金電極を作製した。次いで、以下の操作1、洗浄1、操作2、及び洗浄2を1サイクルとして、合計6サイクルを繰り返し行った。なお、最後の1サイクルは操作1のみを行った。
操作1:200μMの塩化銅を含むTris/HCl緩衝溶液(pH7.0)400μlを前記金属電極に固定化させたAFPPcysの上にした後に、サイクリックボルタンメトリーの測定を行い、電流値の測定を行った。
洗浄1:操作1で電流値の測定に使用した金電極を20μMのエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含むTris緩衝液に10分間浸漬した後に、超純水で洗浄した。更に、洗浄後の電極を10mMの水酸化ナトリウム水溶液に10分間浸漬した後に、超純水で洗浄した。
操作2:洗浄1で洗浄した金属電極のAFPPcysの上に5μMのAβを含むN−エチルモルフォリン緩衝溶液(pH7.0)400μlを添加し、室温で60分間静置した。その後、電極上に200μMの塩化銅を含むTris/HCl緩衝溶液(pH7.0)400μlを添加した後に、サイクリックボルタンメトリーの測定を行い、電流値の測定を行った。
洗浄2:操作2で電流値の測定に使用した金電極に対して、前記洗浄1と同条件で、エチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含むTris緩衝液による洗浄と、10mMの水酸化ナトリウム水溶液による洗浄を行った。
Aβと同様、アミロイド線維を形成することが知られているアミリンを試料として使用して、AFPPcysの凝集選択性を検討した。具体的には、Aβの代わりに、アミリンを使用したこと以外は、実施例1と同条件で電流値の測定を行った。
Claims (5)
- 下記(1)又は(2)に示すペプチドが固定化されてなる電極を含む、アミロイドβペプチドを測定用のバイオセンサ:
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列を含むペプチド。
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列における第3〜7位以外のアミノ酸残基内、1〜4個のアミノ酸残基が、置換、欠失、又は挿入されてなるアミノ酸配列を含み、Aβを凝集させる作用を有するペプチド。 - 前記ペプチドが、下記(3)又は(4)に示すペプチドである、請求項1に記載のバイオセンサ:
(3)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
(4)配列番号2に示すアミノ酸配列において、第8〜12位以外のアミノ酸残基内、1〜4個のアミノ酸残基が、置換、欠失、付加、又は挿入されてなるアミノ酸配列からなり、Aβと凝集させる作用を有するペプチド。 - アルツハイマー型認知症の診断に使用される、請求項1又は2に記載のバイオセンサ。
- 下記(1)又は(2)に示すペプチドが固定化されてなる電極を含むバイオセンサを用いて、アミロイドβペプチドを測定する方法であって:
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列を含むペプチド。
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列における第3〜7位以外のアミノ酸残基内、1又は数個が置換、欠失、又は挿入されてなるアミノ酸配列を含み、Aβを凝集させる作用を有するペプチド。
前記バイオセンサにおけるペプチドが固定化された電極に対して試料溶液を接触させる第1工程、
前記第1工程で試料溶液に接触させた電極に対して、銅2価イオンを接触させ、電流値を測定する第2工程、及び
前記第2工程で測定した電流値に基づいて、試料溶液中のアミロイドβペプチド量を求める第3工程。 - 前記試料溶液が、血漿又はその希釈液である、請求項4に記載の測定方法。
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