CN107949383A - 用于成像的含氮氧化合物的淀粉样蛋白结合剂和治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用氮氧化合物自旋标记的淀粉样蛋白β结合化合物对淀粉样蛋白成像的方法。本发明还提供了氮氧化合物自旋标记的淀粉样蛋白β结合化合物。

Description

用于成像的含氮氧化合物的淀粉样蛋白结合剂和治疗用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年8月18日提交的美国临时申请No.62/206,706的权益，其全部内容为所有目的被并入本文。
对在联邦政府赞助的研究和开发下所做发明的权利声明
本项工作得到了来自美国国家卫生研究院批准号P30 AG010129的支持。联邦政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
阿尔茨海默症(AD)目前在美国影响了500多万人，预计这一数字会急剧上升(Hebert等(2013)神经学80：1778)。AD是一种逐步发展的，潜伏的老化神经退行性疾病，导致认知功能的逐渐下降。AD以复杂的多因素病因学进展，然而目前在阿尔茨海默症中存在两个代表诊断和治疗努力靶标的病理学实体。这些靶标是不溶性细胞外淀粉状蛋白β(AB)斑块，和由过度磷酸化τ(一种微管相关蛋白)的聚集导致的细胞内神经元纤维缠结。尽管AB斑块的不溶性沉积物充当AD的标志物，但多条遗传和生物化学证据支持阿尔茨海默症的病原体是AB肽的可溶性寡聚形式(Viola和Klein(2015)Acta Neuropathol.129：183)的假设。当γ和β分泌酶(蛋白酶)切割淀粉样蛋白前体蛋白(APP)(一种在神经元质膜上组成性表达的蛋白质(张等(2011)Mol.Brain 4：3))时形成的可溶性AB肽的聚集产生AB斑块。由于因淀粉样蛋白斑块沉积造成的相当大的脑损伤通常发生在可进行明确痴呆诊断之前的10-20年(Sperling等，(2011)Alzheimers Dement.7：280和Bateman等，(2012)N.Eng.J.Med.367：795)，因此有必要开发能在尽可能早的阶段检测阿尔茨海默症过程的方法。目前AD唯一明确诊断是死后实施，临床诊断工具主要限于记忆测试和PET成像。一种能够早期检测脑中AB水平的可替代的非侵入性方法可用于鉴定疾病风险，促进临床试验，追踪疾病进展和指导治疗。
利用放射性标记的正电子发射断层摄影术(PET)或单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)的成像技术与淀粉样蛋白斑块中的AB肽结合具有直接评估淀粉样蛋白负荷的潜力(Klunk等(2004)Ann.Neurol.55：306)，但受于有限的可得性，高的成本以及对短寿命放射性同位素的依赖。在这方面，非常需要基于磁共振成像(MRI)的针对AD风险的检测方法。MRI可以提供优于PET和SPECT的优势，包括非放射活性探针的使用，增加的分辨率，以及定义可用于定量淀粉样蛋白斑块的解剖学细节的能力(Huddleston和Small(2005)Nat.Clin.Pract.Neurol.1：96)。
当足够量的内源性铁与斑块关联时，MRI可检测淀粉样蛋白斑块的沉积(Vanhoutte等(2005)Magn.Reson.Med.53：607)。金属尤其是斑块中的铁的存在产生加速的T2*松弛速率和在高富含铁的AB区域的负对比度(Vanhoette等(2005)和Jack等(2007)神经学家13：38)。然而由于T2*对比可能来源于不同来源，例如存在于红血细胞中的血红素铁或存在于脑组织中的非血红素铁，依赖内源性铁的方法受到阻碍(Jack等(2007)和Gelman等(2001)J.Neurochem.45：71)。另外，大脑的一些区域含有贫铁AB沉积物(Vanhoutte等(2005)和Ghribi等(2006)J.Neurochem.99：438)，使得通过铁诱导对比精确评估总AB负荷困难。
虽然富含铁的淀粉样蛋白斑块在MRI中提供了一些负对比度(Jack等(2007)和Wadghiri等(2012)Methods Mol.Biol.849：435)，但来自贫铁淀粉状蛋白信号的缺乏限制了大脑中AB水平一般评估方法的重要性(Adlard等，(2014)Front Neurosci.8：327)。向着使用MRI诊断AD的目标已经创建了各种靶向AB以在MRI中产生增强的对比度的制剂。例如，掺杂有超顺磁性铁的磁性纳米结构已被绑定于针对AB寡聚体形式的抗体以在AD小鼠的脑中产生对比(Viola等(2015)Nat.Nanotechnol.10：91)。此外，已开发几种基于Gd(III)的方法，将金属螯合剂与AB本身结合(Wadghiri等(2012)和Poduslo等(2002)Neurobiol.Dis.11：315)或与针对AB的抗原结合片段结合(Ramakrishnan et al.(2008)Pharm.Res.25：1861)。一些与AB组件具有亲和力的小分子也已经与Gd(III)螯合剂组合以在AB处产生对比度，然而向靶向分子添加螯合的Gd(III)减少了淀粉样蛋白结合和血脑屏障通透性(Bort等(2014)Eur.J.Med.Chem.87：843)。尽管含有金属和/或抗体导向的探针显示有希望，但关注和限制推动了对替代的小分子试剂的需求。例如，抗体导向试剂可以增加炎症级联反应(Fuller等(2015)130：699)，并且免疫球蛋白偶联的Gd(III)试剂的使用在大脑的实质中具有低运输性(Wadghiri等(2012))。此外，在许多患有肾脏或肝脏疾病的患者中禁止使用螯合的Gd(III)(Khawaja等(2015)Insights Imaging 6：553)。更重要的是，最近有证据表明对比增强的MRI(Karabulut(2015)Diagn.Interv.Radiol.21：269)为免疫球蛋白以及基于小分子的淀粉样特异性配体探索无钆成像选择提供动力多年后，钆在大脑中鳌合。
创建这种配体的一种选择是通过连接如氮氧化合物的自旋标记物。自旋标记的化合物已显示与AB肽寡聚体相互作用并表现出潜在的治疗价值(Altman等(2015)Biochim.Biophys.Acta 2854：1860；Petrlova等(2012)PLoS One 7：e35443；和Hong等(2010)Neurobiol.Aging 31：1690)。其他工作已显示使用标记的硫磺素化合物研究原纤维氧化还原状态随荧光和电子自旋共振的变化(Mito等(2011)Chem.Commun.47：5070)。然而在MRI应用中氮氧化合物自旋标记物的使用由于表现出的弱弛豫性而受到限制(Maliakal等(2003)J.Phys.Chem.A 107：8467；Winalski等(2008)Osteoarthritis Cartilage 16：815；和Rajca等(2012)J.Am.Chem.Soc.134：15724)。在解决这个限制时本发明令人惊讶地满足了对可及的和非侵入的淀粉样蛋白成像方法的需求以及其他需求。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供了一种淀粉样蛋白成像方法，该方法包括向受试者施用有效量的具有式I结构的化合物：
X-(Y)n(I)
使得该化合物与淀粉样蛋白结合。式I的X是淀粉样蛋白β结合化合物。式I的Y是氮氧化合物。下标n可以是从1到3的整数。该方法进一步包括检测与淀粉样蛋白结合的化合物，从而使淀粉样蛋白成像。
在第二个实施方案中，本发明提供了具有式II结构的化合物：
其中式I的R1和R2可以各自独立地为H或氮氧化合物。该氮氧化合物可以为：
R1和R2中至少一个为氮氧化合物。
在第三个实施方案中，本发明提供的化合物具有式III结构：
或式IV结构：
其中式III和IV的R1和R2可以各自独立地为H、
或氮氧化合物。该氮氧化合物可以是
R1和R2中至少一个为氮氧化合物。
在第四个实施方案中，本发明提供了具有式V结构的化合物：
其中R1可以是
R2可以是OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3或(OCH2CH2)3F。
在第五个实施方案中，本发明提供了具有式VI结构的化合物：
其中R1可以是
R2可以是OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3或(OCH2CH2)3F。
在第六个实施方案中，本发明提供了一种用于使淀粉样蛋白成像的诊断组合物，其包含式I化合物：
X-(Y)n(I)
其中式I的X是淀粉样蛋白β结合化合物，式I的Y是氮氧化合物，下标n可以是从1到3的整数。
在第七个实施方案中，本发明提供了一种治疗病症的方法，该方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的式(II)至(VI)中任一的化合物。
附图说明
图1显示了氮氧化合物自旋标记化合物SL-Res1的合成方案。
图2显示了氮氧化合物自旋标记化合物SL-Res2的合成方案。
图3显示了氮氧化合物自旋标记化合物SL-Res3的合成方案。
图4显示了氮氧化合物自旋标记的化合物SL-LRL1和SL-LRL2的合成方案。
图5显示了由来自5xFAD阿尔茨海默症小鼠模型的小鼠脑标本磁共振图像中的HO-4160氮氧化合物自旋标记氟(SLF)产生的负对比度，其在脑中产生提高的淀粉样蛋白β水平(Oakley等(2006)J.Neuorsci.26：10129)。对来自5xFAD和野生型(WT)小鼠样品进行了三个独立的实验(A，B，C)。在图标题中显示每列的样品来源和处理条件。每一行代表一个独立的实验，显示了选自在T2(上栏)或T2*(下栏)加权下提供最强烈切片图像位置的相同坐标的图像。每个图形下的数字代表缺乏空气的大脑区域或解剖物的强度值(x 105)。在每个实验中，两个5xFAD图像是来自同一动物的不同切片。
图6显示了施用SLF后APP-PS1小鼠脑标本的磁共振图像。APP-PS1小鼠冠状半球脑切片的T2*加权图像显示相对于左侧图中所示的无SLF样品，右侧图中所示的SLF标记的样品中的强度显著损失。
图7显示了与载体处理的5xFAD或SLF处理的WT的对照相比，5xFAD小鼠切片中由SLF引起的信号抑制幅度。误差线表示来自三个不同实验值中的标准误差。
图8显示了施用SLF后5xFAD小鼠脑标本的电子顺磁共振(EPR)检查结果。通过来自5xFAD SLF+小鼠冠状脑切片的固定氮氧化合物光谱的存在来显示SLF与AB的特异性结合。在5xFAD SLF-样品和WT SLF+样品中存在信号缺乏。
图9显示了针对5xFAD SLF+(左图)和WT(右图)小鼠脑冠状切片中的AB肽的抗体的近红外荧光图像。冠状切片包括海马和皮质。AB的弥散分布在5xFAD小鼠模型的整个表面区域显示为白点，与经SLF处理的5xFAD样品的T2*加权的MRI图像中所产生的负对比度的相对均匀分布相关。在对照小鼠中没有这种特征。下面框中的放大图提供了选定区域的更多细节。
图10显示了来自静脉注射浓度约为3mg/kg SLF后的5个月大的5xFAD转基因小鼠(左上)和野生型小鼠(右下)的400-μm体外半冠状脑切片的T2*加权MR图像。与野生型样品相比，5xFAD样品在海马区域显示了明显的强度损失。每个切片的照片显示在右侧。
图11显示了如何通过体外大脑标本的EPR检查来揭示静脉注射化合物的5xFAD小鼠脑内的SLF结合。所显示的为从5xFAD小鼠和野生型小鼠注射24小时后收获的脑切片的100G X带EPR谱。两种小鼠均注射约3mg/kg SLF。
图12显示了经SL-LRL1处理的小鼠脑标本的MRI图像和EPR谱图。
图13显示了经SL-LRL2、SL-Res1、SL-Res2和SL-Res3处理的5xFAD和WT小鼠脑标本的MRI图像。
图14显示了ThT单独，与寡聚AB组合，或与RES/LRL化合物组合的荧光发射。与单独AB相比，ThT结合(如在478nm处的发射所显示)因RES1-3和LRL1-2而降低。
图15A和B显示了通过自旋捕获的LRL1-2和RES1-3抗氧化剂活性。图15A显示了具有羟基自由基的BMPO加合物的EPR检测(Eur J Med Chem，2014,77,343-50)。黑色曲线显示了在没有添加ROS清除剂情况下的BMPO-OH谱图。红色曲线显示了LRL1样品的BMPO-OH+氮氧化合物的复合EPR光谱。BMPO-OH信号的减少与ROS清除相关。与未添加BMPO-OH信号(黑色箭头)相比，清除活性被检测为在第二BMPO-OH线(红色箭头)的振幅中减少。图15B绘制了相对活性。
具体实施方式
I.综述
本发明提供了通过将氮氧化合物自旋标记的淀粉样蛋白β结合化合物施用于受试者并检测与淀粉样蛋白结合的化合物来使淀粉样蛋白成像的方法。本发明还提供了能够结合淀粉样蛋白的氮氧化合物自旋标记的化合物。
II.定义
本文使用的缩写具有其在化学和生物学领域常规含义。
“成像”是指在受试者体外使用装置来确定显像剂例如本发明化合物的位置。成像工具的实例包括但不限于正电子发射断层摄影术(PET)、磁共振成像(MRI)、电子顺磁共振(EPR)、电子自旋共振显微术(ESRM)、超声波、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)和x射线计算机断层扫描术(CT)。
“淀粉样蛋白”是指蛋白质的集合体。淀粉样蛋白的蛋白质可被错误折叠以至于它们错误折叠的形状促进了聚集。淀粉样蛋白可以包括，例如淀粉样蛋白β(AB)、糊精、α-突触核蛋白、亨廷顿蛋白、降血钙素、心房肽、载脂蛋白A1、血清淀粉样蛋白A、麦丁(medin)、催乳激素、甲状腺素运载蛋白、溶解酶、β-2-微球蛋白、凝溶胶蛋白、角膜上皮素、血清胱抑素或免疫球蛋白轻链AL。受试者体内的淀粉样蛋白可以以低聚物，斑块或原纤维的形式存在。淀粉样蛋白存在于受试者体内可破坏受试者体内组织和器官的健康生理功能。受试者体内的淀粉样蛋白的存在可与疾病的风险或发生率的增加有关。与淀粉样蛋白存在相关的疾病可以是，例如阿尔茨海默症、糖尿病、帕金森病、海绵状脑病、亨廷顿病、甲状腺癌、心房淀粉样蛋白病、动脉粥样硬化、关节炎、泌乳素瘤、多发性神经病、角膜营养不良或脑淀粉样蛋白血管病。淀粉样蛋白在受试者体内的存在可能与阿尔茨海默症的风险或发生率的增加有关。
“施用”是指口服施用、作为栓剂施用、局部接触、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌肉内、病灶内、鼻内或皮下施用，鞘内施用或向受试者植入缓释装置例如微渗透泵。
“受试者”是指诸如哺乳动物的动物，包括但不限于灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中，受试者是人。
“氮氧化合物”是指稳定的具有结构R2N-O·的基团或氨基氧自由基化合物，其中氮原子与氧原子单键结合。氮氧化合物的R基团可以相同或不同。R基团可以形成稠环。
“烷基”是指具有所示碳原子数的直链或支链饱和脂族基团。烷基可以包括任意数量的碳，例如C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C1-9、C1-10、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6和C5-6。例如，C1-6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。烷基还可以指具有至多20个碳原子的烷基，例如但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可以是取代的或未取代的。
“烷氧基”是指具有将烷基连接到连接点的氧原子的烷基：烷基-O-。如烷基，烷氧基可具有任意合适数目的碳原子，例如C1-6。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基可以进一步被本文所述的各种取代基取代。烷氧基可以为取代的或未取代的。
“卤代烷氧基”是指其中一些或全部氢原子被卤素原子取代的烷氧基。如烷基，卤代烷氧基可具有任意合适数目的碳原子，例如C1-6。烷氧基可被1、2、3或更多个卤素取代。当所有的氢被卤素例如氟取代时，这些化合物为全取代的，例如全氟化的。卤代烷氧基包括但不限于三氟甲氧基、2,2,2-三氟乙氧基、全氟乙氧基等。
“盐”是指用于本发明方法中的化合物的酸式或碱式盐。药学上可接受的盐的示例性实例是无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸等)盐、有机酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、柠檬酸等)盐、季铵(甲基碘、碘乙烷等)盐。应该理解，药学上可接受的盐是无毒的。关于合适的药学上可接受的盐的其他信息可以在雷明顿的药物科学，第17版，麦克出版公司，Easton，Pa.，1985中找到，其通过引用并入本文。
本发明酸性化合物的药学上可接受的盐是与碱形成的盐，即阳离子盐如碱金属和碱土金属盐如钠、锂、钾、钙、镁以及铵盐，如铵、三甲基铵、二乙基铵和三(羟甲基)甲基铵盐。
类似地，酸加成盐如无机酸、有机羧酸和有机磺酸，如盐酸，甲磺酸，马来酸的也是可能的，只要碱性基团如吡啶基构成结构的一部分。
化合物的中性形式可通过将盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物而再生。化合物的母体形式在某些物理性质上与各种盐形式不同，例如在极性溶剂中的溶解性，但在其他方面用于本发明目的盐与化合物的母体形式等同。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋体，非对映异构体，几何异构体和单独的异构体均被包括在本发明的范围内。
“水合物”是指与至少一个水分子络合的化合物。本发明的化合物可以与1至10个水分子络合。
“纳米颗粒”是指定义为典型的5至500个原子的颗粒。本发明纳米颗粒的典型尺寸在几纳米的范围内，可以是几十纳米。本发明的纳米颗粒通常具有小于100纳米的尺寸。
本文使用的“组合物”旨在包含含有特定量的特定成分的产品，以及直接或间接由特定量的特定成分组合产生的任何产品。“药学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂中的其它成分相容并对其接受者无害。
“药学上可接受的赋形剂”是指帮助将活性试剂给予受试者并被受试者吸收的物质。可用于本发明的药物赋形剂包括但不限于粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和着色剂。本领域技术人员将认识到其他药物赋形剂可用于本发明。
“治疗有效量或剂量”或“治疗足够的量或剂量”或“有效或足够的量或剂量”是指对被施用者产生治疗效果的剂量。确切的剂量取决于治疗的目的，并且可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如Lieberman，药物剂型(第13卷，1992)；Lloyd，The Art，药物配制的科学技术(1999)；Pickar，剂量计算(1999)；和雷明顿：药学的科学与实践，第20版，2003，Gennaro编，Lippincott，Williams&Wilkins)。在敏化细胞中，治疗有效剂量通常可以低于未致敏细胞的常规治疗有效剂量。
“治疗”、“治疗的”和“治疗方法”是指任何治疗或改善损伤，病理，病症或症状(例如疼痛)成功的迹象，包括任何客观或主观的参数如减少；缓解；症状减轻或使患者的症状，损伤，病理或病症更可耐受；减少症状或病症的频率或持续时间；或在某些情况下，预防症状的发作。症状的治疗或改善可以基于任何客观或主观的参数；包括例如体检结果。
III.淀粉样蛋白的成像方法
本发明提供了淀粉样蛋白成像的几种方法。该方法包括向受试者施用有效量的具有以下结构的化合物：
X-(Y)n (I)
其中式I的X是淀粉样蛋白β结合蛋白，Y是氮氧化合物，n为从1到3的整数。该施用使得化合物与淀粉样蛋白结合。该方法进一步包括检测与淀粉样蛋白结合的化合物，从而使该淀粉样蛋白成像。在一些实施方案中，式I的n为1。在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，n为3。
淀粉样蛋白结合化合物的检测可以发生在向受试者施用化合物之后的至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时或至少10小时。在一些实施方案中，检测发生在施用后至少60分钟。
检测可以包括使用一种或多种医学成像技术。在一些实施方式中，检测包括磁共振成像(MRI)、电子顺磁共振成像或光谱模式(EPR、也称为电子自旋共振(ESR))、正电子发射断层摄影技术(PET)或电子自旋共振显微术(ESRM)。在一些实施方式中，检测包括MRI。在一些实施方式中，检测包括MRI和PET两种。
EPR是一种磁共振技术，它基于通过置于外部磁场内的不成对电子获得的自旋。该自旋可以被定向从而使其与外部磁场相反或一致。未配对的电子将响应于具有与未配对的电子能级差等同能量的光子从而在能级之间转换。通过用不成对电子的材料按这样的方式量化所吸收的能量，可以获得材料的EPR谱。由于很少天然发生的材料具有不成对的电子，因此EPR最常用于研究稳定自由基(如氮氧化合物)与这些天然发生的材料的相互作用，而不是对天然发生的材料本身进行成像。
MRI是一种替代的磁共振技术，它基于通过置于外部磁场中的核质子获得的自旋。用于MRI的磁场通常为场梯度的形式。由于共振频率直接与磁场成正比，因此该磁梯度导致共振频率梯度。通过描绘不同共振频率下的能量吸收强度，可以确定材料中质子的数量和位置。许多天然发生的材料可以用这种方式成像。例如，可以通过探测与水质子相关的磁共振来检测存在于软组织中水的量和位置。以这种方式，MRI不仅可以用于对施用于受试者的化合物(例如氮氧化合物自旋标记的化合物)进行成像，而且还可以用来对探针附近的受试者的解剖特征进行成像。
PET是一种用于观察受试者代谢过程的辐射检测技术。在该技术中，从施用的放射性示踪化合物发射的正电子与电子相互作用，产生在大致相反方向上移动的伽马射线对。这些伽玛射线被位于受试者周围扫描装置的闪烁基数器检测。然后使用与这些检测事件相关的数据来构建示踪剂化合物集中的组织位置的绘图或成像。
在一些实施例中，检测和成像使用T1加权的MRI来完成。在一些实施例中，检测和成像使用T2*加权的MRI来完成。在某些情况下T2*加权的MRI可以为氮氧化合物自旋标记化合物提供更大的成像对比度。
在一些实施方案中，淀粉样蛋白包含淀粉样蛋白聚集体。在一些实施方案中，淀粉样蛋白包含淀粉样蛋白β。淀粉样蛋白可以是可溶性淀粉样蛋白或淀粉样蛋白β低聚物，或不溶性的斑块或纤维的形式。淀粉样蛋白可以在受试者的大脑中。在一些实施方案中，该受试者处于阿尔茨海默氏症风险下或目前被诊断患有阿尔茨海默氏症。在一些实施方案中，受试者没有接受用于治疗目的的化合物。在一些实施方案中，化合物穿透完整的血脑屏障以结合脑淀粉样蛋白β聚集体。
淀粉样蛋白β结合化合物可以是具有足够特异性和亲和力的靶向淀粉样蛋白β的任何化合物。在一些实施方案中，式I的淀粉样蛋白β结合化合物可以是：
其中Ra和Rb可以各自独立地为H或C1-4烷基；Z可以是I、123I、125I、131I、Br、76Br、77Br、F、18F或–O-甲苯磺酰基；和q可以为2至5的整数。
在一些实施方案中，该淀粉样蛋白β结合化合物可以是：
在一些实施方案中，式I的氮氧化合物可以是：
在一些实施例中，氮氧化合物可以是：
在一些实施方案中，式I化合物可以是：
其中Ra和Rb可以各自独立地为H或C1-4烷基。R1可以是：
R2可以是OH、烷基、烷氧基或卤代烷氧基。在一些实施例中，R2可以是OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3、或(OCH2CH2)3F。
在一些实施方案中，式I化合物可以是：
其中R1可以是：
R2可以是OH、烷基、烷氧基或卤代烷氧基。在一些实施例中，R2可以是OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3或(OCH2CH2)3F。
在一些实施方案中，式I化合物具有以下结构：
其中R1为甲基或氮氧化合物。R1的氮氧化合物可以是：
R2可以是丙胺或氮氧化合物。R2的氮氧化合物可以是：
R1和R2中的至少一个为氮氧化合物。
在一些实施方案中，式I化合物可以是：
其中R1、R2和R3可各自独立地为：
在一些实施方案中，式I化合物可以是：
其中R1和R2可各自独立地为H或氮氧化合物。所述氮氧化合物可以是：
R1和R2中的至少一个是氮氧化合物。在一些实施方案中，式I化合物为
其中R1和R2可各自独立地为H或氮氧化合物。所述氮氧化合物可以是：
R1和R2中的至少一个是氮氧化合物。在一些实施方案中，式I化合物可以是：
其中R1为H且R2为氮氧化合物。R2的氮氧化合物可以是：
在一些实施方案中，式I化合物可以是：
其中R1和R2可以各自独立地为H、或氮氧化合物。所述氮氧化合物可以是：
R1和R2中的至少一个是氮氧化合物。
在一些实施方案中，式I化合物可以是：
其中R可以是
在一些实施方案中，式I化合物具有结构：
在一些实施方案中，式I化合物可以是：
在一些实施方案中，式I化合物可以是：
在一些实施方案中，式I化合物与细胞外淀粉样蛋白结合。在一些实施方案中，所述化合物与神经元内淀粉样蛋白结合。式I化合物可以被设计为抗化学还原。例如，化合物的氮氧化合物基团可以包含四乙基环取代来代替四甲基取代。四乙基取代可降低在施用化合物后氮氧化合物基团的N-O部分与细胞内还原剂反应的速率。
IV.化合物
在一些实施方案中，本发明提供了几种氮氧化合物自旋标记的淀粉样蛋白结合化合物。在一些实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物：
其中式II的R1和R2可各自独立地为H或氮氧化合物。所述氮氧化合物可以是
R1和R2中的至少一个为氮氧化合物。
在一些实施方案中，式II的R1和R2各自独立地为氮氧化合物。在一些实施方案中，R1为H且R2为氮氧化合物。在一些实施方案中，R1为氮氧化合物且R2为H。
在一些实施方案中，式II的R1和R2可各自独立地为H或氮氧化合物。所述氮氧化合物可以是
在一些实施方案中，式II化合物可以是：
在一些实施方案中，式II化合物可以是：
在一些实施方案中，式II化合物可以是：
在一些实施方案中，式II化合物可以是：
在一些实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物
其中式III和IV的R1和R2可各自独立地为H、或氮氧化合物。所述氮氧化合物可以是
R1和R2中的至少一个为氮氧化合物。
在一些实施方案中，式III和IV的R1和R2各自独立地为氮氧化合物。在一些实施方案中，R1为H、且R2为氮氧化合物。在一些实施方案中，R1为氮氧化合物且R2为H、
在一些实施方案中，式III和IV的R1和R2可各自独立地为H、或氮氧化合物。所述氮氧化合物可以是
R1和R2中的至少一个为氮氧化合物。
在一些实施方案中，式IV化合物可以是：
在一些实施方案中，式IV化合物可以是：
在一些实施方案中，式IV化合物可以是：
在一些实施方案中，本发明提供具有以下结构的化合物
其中R1可以是
R2可以是OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3，或(OCH2CH2)3F。
在一些实施方案中，本发明提供具有以下结构的化合物
其中R1可以是
R2可以是OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3或(OCH2CH2)3F。在其他实施方案中，R2可以是OH、Me、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3或(OCH2CH2)3F。
在一些实施方案中，本发明提供具有以下结构的化合物
其中R1可以是
R2可以是OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3或(OCH2CH2)3F。在其他实施方案中，R2可以是OH、Me、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3或(OCH2CH2)3F。
在一些实施方案中，本发明提供具有以下结构的化合物
其中R1可以是
Ra和Rb可各自独立地为H和C1-4烷基。
在一些实施方案中，本发明提供具有以下结构的化合物
其中R1可以是
R2可以是OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3或(OCH2CH2)3F。在其他实施方案中，R2可以是OH、Me、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3或(OCH2CH2)3F。
在一些实施方案中，所述化合物可以是
在一些实施方案中，所述化合物可以是
本发明化合物也可以是其盐和异构体。在一些实施方案中，本发明化合物包括其盐形式。适用的盐形式的例子包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、酒石酸盐(例如(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或其包括外消旋混合物的混合物)、琥珀酸盐、苯甲酸盐和与氨基酸如谷氨酸形成的盐。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法制备。当本发明化合物含有相对碱性的官能团时，可以通过将中性形式的该化合物与足够量的所需酸在无溶剂或在合适惰性溶剂中接触来获得酸加成盐。可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等的那些酸加成盐，以及衍生自如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等有机酸的盐。还包括如精氨酸等的氨基酸盐，以及如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的有机酸盐(参见例如Berge等，“药用盐”，药物科学杂质，1977，66，1-19)。本发明的某些具体化合物含有碱性酸性官能团，使得该化合物转化为碱加成盐。关于合适的药学上可接受的盐的其它信息可以在雷明顿药物科学，第17版，麦克出版公司，Easton，Pa.，1985中找到，其通过引用并入本文。
化合物的中性形式优选通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物而再生。化合物的母体形式在某些物理性质上不同于各种盐形式，例如在极性溶剂中的溶解性。
本发明的某些化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在，包括水合形式。通常，溶剂化形式相当于非溶剂化形式，并且包括在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以以多晶或无定形形式存在。通常，所有的物理形式对于本发明所考虑的用途是等同的，并且旨在本发明的范围内。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；就绝对立体化学而言，对映异构体、外消旋体、非对映异构体、互变异构体、几何异构体、立体异构形式可以定义为(R)-或(S)-，或对于氨基酸定义为(D)-或(L)-，并且各个异构体包括在本发明的范围内。本发明的化合物不包括那些本领域已知的太不稳定不能合成和/或分离的化合物。本发明意在包括外消旋形式和光学纯形式的化合物。光学活性的(R)-和(S)-，或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂来制备，或者使用常规技术来解决。
异构体包括具有相同数量和原子种类的化合物，因此具有相同的分子量，但是在原子的结构排列或构型方面不同。
对于本领域技术人员显而易见的是本发明某些化合物可以以互变异构形式存在，所有这些化合物的互变异构形式都在本发明的范围内。互变异构体是指处于平衡状态的并且容易从一种异构体转化为另一种异构体的两种或更多种结构异构体中的一种。
除非另有说明，本文所述结构还意在包括所有立体化学形式的结构；即每个不对称中心的R和S构型。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映体和非对映体混合物在本发明的范围内。
除非另有说明，本发明化合物还可以在构成此类化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。例如，本发明化合物可以用放射性同位素，例如氘(2H)、氚(3H)、碘-125(125I)、碳-13(13C)或碳-14(14C)放射性标记。本发明化合物的所有同位素变体，无论是否为放射性都包括在本发明的范围内。
除了盐形式之外，本发明提供了前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是那些在生理条件下容易发生化学变化以提供本发明化合物的那些化合物。此外，前药可以通过化学或生物化学方法在体外环境中转化成本发明的化合物。例如，当前药置于具有合适酶或化学试剂的透皮贴剂储层中时，可缓慢转化成本发明的化合物。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员已知的多种方法(参见ComprehensiveOrganic Transformations Richard C.Larock，1989)或通过一般熟知合成方法的适当组合来合成。用于合成本发明化合物的技术对于相关领域的技术人员来说都是显而易见和易于获得的。提供以下讨论以说明可用于组成本发明化合物的某些不同方法。然而，该讨论并非旨在限定用于制备本发明化合物的反应或反应步骤的范围。本领域技术人员将会理解，制备该化合物的其它方法可用于本发明。尽管所述的一些化合物可能显示相对立体化学，但是这些化合物可以作为外消旋混合物，或作为任一对映体存在。
通常，本发明的一些化合物可通过淀粉样蛋白β结合化合物与自旋标记的氮氧化合物的烷基化来合成。烷基化可以是，例如与市售的3-溴甲基-2,5-二氢-2,2,5,5-四甲基-1H-吡咯-1-基氧基(RBr)。烷基化可以是在碱存在下的N-烷基化。在一些实施方案中，碱是三乙胺(TEA)。烷基化可以是在还原剂存在下的还原性烷基化。在一些实施方案中，还原剂是三乙酰硼氢化钠。
V.给药
本发明提供了用于使淀粉样蛋白成像的诊断组合物。该组合物包括具有以下结构的化合物：
X-(Y)n (I)
其中式I的X是淀粉样蛋白β结合蛋白，Y是氮氧化合物，并且n是1至3的整数。本发明的化合物和组合物可以通过任何合适的方式递送，包括口服、肠胃外和局部方法。通过局部途径的透皮给药方法可以配制为涂药棒、溶液、悬浮液、乳液、凝胶、乳膏、软膏、糊剂、凝胶、涂料、粉剂和气雾剂。
药物制剂优选为单位剂型。在这种形式中，制剂被细分成含有适量本发明化合物和组合物的单位剂量。单位剂型可以是包装制剂，含有离散量制剂的包装，例如包装的片剂，胶囊和在小瓶或安瓿中的粉剂。另外，单位剂型可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者可以是包装形式的适当数量的任意这些剂型。
本发明的化合物和组合物可以与其他试剂共同给药。共同给药包括在其他试剂的0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20或24小时内施用本发明的化合物或组合物。共同给药还包括同时给药，大致同时给药(例如在彼此的约1、5、10、15、20或30分钟内)，或者以任何顺序依次给药。此外，本发明的化合物和组合物可以各自每天一次，或每天两次，三次，或更多次给药，以提供每天优选的剂量水平。
在一些实施方案中，共同给药可以通过共制剂完成，即制备包含本发明化合物和组合物以及任何其他试剂的单一药物组合物。或者，各种组分可以分开配制。
本发明的化合物和组合物，以及任何其它试剂可以以任何合适的量存在，并且可以依赖于各种因素，包括但不限于受试者的体重和年龄，受试者的疾病状态等。合适的剂量范围包括约0.1mg至约10,000mg，或约1mg至约1000mg，或约10mg至约750mg，或约25mg至约500mg，或约50mg至约250mg。合适的剂量还包括约1mg、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000mg。
本发明的化合物可以以任何合适的频率，间隔和持续时间施用。例如，本发明的化合物可以每小时一次，或者每小时两次，三次或更多次，每天一次，或者每天两次，三次或更多次，或者每2、3、4、5、6或7天一次，以提供优选的剂量水平。当本发明的化合物每天给予一次以上时，代表性的间隔包括5、10、15、20、30、45和60分钟，以及1、2、4、6、8、10、12、16、20和24小时。本发明的化合物可以每1小时、1至6小时、1至12小时、1至24小时、6至12小时、12至24小时、一天、一至七天、一周、一至四周、一个月、一至十二个月、一年或以上、甚至无限期给药1次、2次、或3次或更多次。
VI.制剂
本发明的化合物可以制备成口服，肠胃外和局部剂量制剂的多种剂型。口服制剂包括适于患者摄取的片剂、丸剂、粉剂、糖衣丸、胶囊、液体、锭剂、扁囊剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、悬浮剂等。本发明的组合物也可以通过注射，即静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内、腹膜内、脑内、鞘内、脊柱内或动脉内给药。此外，本文所述的组合物可以通过吸入施用，例如，鼻内施用。另外，本发明的组合物可以透皮给药。本发明的组合物还可以通过眼内、阴道内和直肠内途径给药，包括栓剂、吹入剂、粉剂和气雾剂(例如类固醇吸入剂，参见Rohatagi 1995J.Clin.Pharmacol.35：1187和Tjwa 1995Ann.Allergy AsthmaImmunol.75：107)。因此，本发明还提供了包含药学上可接受的载体或赋形剂和本发明化合物的药物组合物。
为从本发明化合物制备药物组合物，药学上可接受的载体可以是固体或液体。固体形式的制剂包括粉末、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒。固体载体可以是一种或多种物质，其也可用作稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料。制剂和给药的技术细节已在科学和专利文献中详细描述了，参见例如雷明顿的药物科学，马克出版公司，Easton PA(“雷明顿的”)的最新版本。
在粉末中，载体是细碎的固体，其与细碎的活性组分混合。在片剂中，将活性组分与具有必要粘合性质的载体以合适的比例混合并压制成所需的形状和大小。粉末和片剂优选含有5％或10％至70％的本发明化合物。
合适的固体赋形剂包括但不限于碳酸镁；硬脂酸镁；滑石；果胶；糊精；淀粉；黄蓍胶；低熔点蜡；可可脂；碳水化合物；糖包括但不限于乳糖，蔗糖，甘露糖醇或山梨糖醇，来自玉米，小麦，大米，马铃薯或其他植物的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；以及树胶，包括阿拉伯树胶和黄蓍胶；以及蛋白质，包括但不限于明胶和胶原蛋白。如果需要，可以加入崩解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，海藻酸或其盐，如海藻酸钠。
糖衣丸芯具有合适的包衣，例如浓缩的糖溶液，其也可以包含阿拉伯树胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，卡波姆凝胶，聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入到片剂或糖衣丸包衣中用于产品鉴定或表征活性化合物的量(即剂量)。本发明的药物制剂也可以口服使用，例如，由明胶制成的推入式胶囊，以及由明胶和甘油或山梨糖醇等包衣制成的软密封胶囊。推入式胶囊可含有与填充剂或粘合剂，例如乳糖或淀粉，润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁，以及任选的稳定剂相混合的本发明化合物。在软胶囊中，本发明的化合物可以溶解或悬浮于合适的液体中，例如脂肪油，液体石蜡或具有或不具有稳定剂的液体聚乙二醇。
为制备栓剂，首先将低熔点蜡(如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物)熔化，并将本发明化合物如通过搅拌均匀分散其中。然后将熔融的均匀混合物倒入合适大小的模具中，使其冷却并由此固化。
液体制剂包括溶液，悬浮液和乳液，例如，水或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射，液体制剂可以在聚乙二醇水溶液中配制成溶液。
适合于口服使用的水溶液可以通过将本发明的化合物溶于水中并根据需要加入合适的着色剂，调味剂，稳定剂和增稠剂来制备。可以通过将细碎的活性组分分散在具有粘性物质如天然或合成树胶，树脂，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素，海藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮，黄蓍胶和阿拉伯树胶，以及分散剂或润湿剂如天然产生的磷脂(例如卵磷脂)，氧化烯与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七烷氧基鲸蜡醇)，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)的水中来制备适用于口服使用的水悬浮液。水悬浮液还可含有一种或多种防腐剂，如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，如蔗糖，阿斯巴甜或糖精。制剂可以为渗透压而调整。
还包括固体形式的制剂，其意在使用前立即转化为用于口服给药的液体形式。这种液体形式包括溶液、混悬液和乳液。除了活性组分外，这些制剂还可含有着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
油悬浮液可以通过将本发明的化合物悬浮在植物油如花生油，橄榄油，芝麻油或椰子油，或矿物油如液体石蜡；或它们的混合物中来配制。油悬浮液可以含有增稠剂，如蜂蜡，硬石蜡或十六烷醇。可以添加甜味剂以提供可口的口服制剂，例如甘油，山梨糖醇或蔗糖。这些制剂可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸来保存。作为可注射油载体的例子，参见Minto 1997J.Pharmacol.Exp.Ther.281：93。本发明的药物制剂也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是如上所述的植物油或矿物油，或它们的混合物。合适的乳化剂包括天然产生的树胶例如阿拉伯树胶和黄蓍胶，天然产生的磷脂例如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯例如山梨糖醇酐单油酸酯，以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳剂也可以含有甜味剂和调味剂，如在糖浆剂和酏剂中。这样的制剂还可以含有缓和剂，防腐剂或着色剂。
本发明的组合物也可以作为微球在体内缓慢释放。例如，微球可配制成通过含有药物微球的皮内注射施用，所述微球缓慢地皮下释放(参见Rao 1995 J.BiomaterSci.Polym.Ed.7：623)；作为生物可降解的和可注射的凝胶制剂(参见，例如Gao 1995Pharm.Res.12：857)；或作为口服给药的微球(参见例如Eyles 1997J.Pharm.Pharmacol.49：669)。经皮和皮内途径都可持续递送几周或几个月。
在另一个实施方案中，本发明的组合物可以配制成肠胃外给药，例如静脉内(IV)给药或者施用到器官的体腔或内腔中。用于给药的制剂通常包含溶解在药学上可接受的载体中的本发明组合物的溶液。在可接受的载体和溶剂中，可以使用的是水和林格溶液，即等渗氯化钠。另外，通常可以使用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸也可以用于制备注射剂。这些溶液是无菌的并且通常没有不良的问题。这些制剂可以通过常规的，众所周知的灭菌技术进行灭菌。所述制剂可以根据接近生理条件的需要含有药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂，毒性调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。本发明组合物在这些制剂中的浓度可以在很宽的范围内变化，并且将根据所选择的特定给药模式和患者的需要主要基于流体体积，粘度，体重等来选择。对于IV给药，制剂可以是无菌可注射制剂，例如无菌注射用水性或油性悬浮液。该悬浮液可以根据已知技术使用那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是无菌注射溶液或在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如1,3-丁二醇溶液)中的混悬液。
在另一个实施方案中，本发明组合物的制剂可使用与细胞膜融合或被内吞的脂质体递送，即通过使用连接脂质体或直接连接寡核苷酸的配体，与细胞表面膜蛋白受体结合导致内吞作用。通过使用脂质体，特别是在脂质体表面携带对靶细胞特异性的配体或者优先指向特定器官的情况下，可以将本发明组合物的递送集中在体内靶细胞中。(参见例如Al-Muhammed 1996 J.Microencapsul.13：293；Chonn1995 Curr.Opin.Biotechnol.6：698；和Ostro 1989Am.J.Hosp.Pharm.46：1576)。
基于脂质的药物递送系统包括脂质溶液、脂质乳剂、脂质分散剂、自乳化药物递送系统(SEDDS)和自微乳化药物递送系统(SMEDDS)。特别是SEDDS和SMEDDS是脂质，表面活性剂和辅助表面活性剂的各向同性混合物，能够在水性介质中自发分散并形成精细乳液(SEDDS)或微乳液(SMEDDS)。可用于本发明制剂的脂质包括任何天然或合成的脂质，包括但不限于芝麻籽油、橄榄油、蓖麻油、花生油、脂肪酸酯、甘油酯、 和
在另一个实施方案中，本发明组合物的制剂可以通过使用纳米颗粒递送。例如，在Li等(2012)ACS Nano.6：9485中讨论了自旋标记荧光团的应用。纳米颗粒已经成为递送常规抗癌药物主要类型的载体。纳米颗粒药物递送系统具有几个独特的优点，例如控制释放和延长的循环时间，以及被动和主动肿瘤靶向(Cabral等(2011)Nat.Nanotechnol.6：815；Gref等(1994)Science 263：1600；Liu和Allen(2006)Curr.Pharm.12：4685；和Li等(2009)Nanotechnology 20：065-104)。在一些实施方案中，氮氧化合物自旋标记的化合物是疏水性的并且可以容易地装载在纳米胶束内部。纳米胶束可以包含非交联的胶束纳米粒子(NCMN)。纳米胶束可以包含二硫化物交联的胶束纳米粒子(DCMN)。在一些实施方案中，纳米颗粒的表面装饰有一个或多个脑靶向分子的拷贝。例如，脑靶向分子可以是载脂蛋白E(apoE)。
在一些实施方案中，本发明组合物的制剂包含溶解助剂。例如，溶解助剂可以是环糊精。美国专利申请公开号US 2015/0018327和US 2015/0313915中讨论了环糊精作为高度水不溶性类固醇的溶解助剂的应用。例如，环糊精可以是β-环糊精。在一些实施方案中，环糊精是磺基丁基醚β-环糊精。
VII.治疗疾病的方法
在一些实施方案中，本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包括向需要所述治疗的受试者施用治疗有效量的本发明化合物，从而治疗所述疾病。在一些实施方案中，本发明的化合物是用于治疗或改善阿尔茨海默症的氮氧化合物自旋标记的淀粉样蛋白β结合化合物。可以延长寿命或减轻症状为目的给予药剂。在一些实施方案中，用有效量的氮氧化合物自旋标记的淀粉样蛋白β结合化合物治疗破坏蛋白质的聚集以形成淀粉样蛋白。在一些实施方案中，破坏阻止新寡聚体，斑块或原纤维的形成。在一些实施方案中，破坏改变了现有寡聚体斑块或原纤维的结构。
适用于本发明的疾病或病症的实施例包括但不限于阿尔茨海默氏症、糖尿病、帕金森病、海绵状脑病、亨廷顿舞蹈病、甲状腺癌、心房淀粉样变性、动脉粥样硬化、关节炎、泌乳素瘤、多发性神经病、角膜营养不良或脑淀粉样血管病。
VIII.实施例
根据标准IUPAC命名使用CambridgeSoft ChemDraw命名包命名下面的实施例结构。
实施例1.SL-Res1.(E)-3-(4-羟基苯乙烯基)-5-((2,2,5,5-四甲基-1-氧基-2,5-二 氢-1H-吡咯-3-基)甲氧基)苯酚自由基
合成如图1所示。向1.5mL微量离心管中加入白藜芦醇3,4'-二乙酸酯(多伦多研究化学，多伦多，加拿大，8.3mg，0.0266mmol)，3-羟甲基-(1-氧-2,2,5,5-四甲基吡咯啉)(5mg，0.0294mmol)，三苯基膦(PPh3，8.0mg，0.0305mmol)和无水四氢呋喃(THF，0.2mL)。然后将反应管降低到42-kHz超声波浴中(Cole-Parmer)并超声2分钟。超声时，将偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD，6.6μL，0.0335mmol)加入到反应混合物中。反应混合物超声25分钟。将反应混合物加入到KOH溶液(20μL，10％水溶液)中，然后在室温下搅拌30分钟。用0.05％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液中和该反应液，然后用制备型反相高效液相色谱(HPLC)纯化。收集洗脱液并冻干得到粉末SL-Res1。
在具有C18柱(Vydac，10μm，2.2cm内径×25cm)的System Gold 126NMP溶剂模块(贝克曼)上进行HPLC。经46分钟使用25-100％B的梯度洗脱，流速5毫升/分钟(溶剂A，H2O/0.1％TFA；B，乙腈/0.1％TFA)。用轨道阱ESI-MS确认其化学性质，C23H26NO4的计算质量为380.19，观察质量为381.20和382.20。
实施例2.SL-Res2.(E)-2-(3-羟基-5-(4-羟基苯乙烯基)苯氧基)-N-(2,2,5,5-四甲 基-1-氧基吡咯烷-3-基)乙酰胺自由基
合成如图2所示。将Cs2CO3(20mg，0.0624mmol)加入到白藜芦醇3,4'-二乙酸酯(13mg，0.0416mmol)的无水二甲基甲酰胺(DMF，1mL)溶液中，反应混合物在室温下搅拌45分钟。然后将3-(2'-碘乙酰胺基)-2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷基-1-氧基(13.5mg，0.0415mmol)加入到该溶液中，所得混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物加入到KOH溶液(20μL，10％水溶液)中，然后在室温下搅拌30分钟。该溶液用0.05％TFA的乙腈溶液中和，然后使用上述条件进行HPLC纯化。将洗脱液冻干得到粉末SL-Res2。
使用轨道阱ESI-MS确认化学特征，C24H29N2O5的计算质量为425.21，观察质量为426.22和427.22。
实施例3.SL-Res3.(E)-4-(3,5-二羟基苯乙烯基)苯基-2,2,5,5-四甲基-1-氧基-2,5- 二氢-1H-吡咯-3-羧酸酯自由基
合成如图3所示。首先通过将N，N'-二环己基碳化二亚胺(DCC，56mg，0.271mmol)加入到2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧基-3-羧酸自由基(100mg，0.542mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液中制备2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧基-3-羧酸酐自由基。混合物在室温下搅拌1小时。滤出沉淀，将澄清溶液浓缩并真空干燥获得SL-酸酐。
向圆底烧瓶中白藜芦醇(25.3mg，0.11mmol)的1mL无水二甲基亚砜(DMSO)溶液中加入氢化钠(11mg，60％分散在矿物油中)。所得混合物在室温下搅拌20分钟，随后加入自旋标记酸酐(38.5mg，0.11mmol)。反应液在室温下搅拌2小时。将反应用水(100μL)淬灭，然后将5mL冷水(含有0.1％乙酸)加入到溶液中。通过离心分离固体并将其重新溶解在80％乙腈水溶液(含有0.05％TFA)中并如上所述通过HPLC纯化。
使用轨道阱ESI-MS确认化学特性，C23H24NO5的计算质量为394.16，观测质量为395.18和396.18。
实施例4.SL-LRL1.3-(3-碘苄基)-8-甲基-6-氧代-2-((2-(2,2,5,5-四甲基-1-氧基吡 咯烷-3-甲酰胺基)乙基)氨基)-3,6-二氢苯并吡喃并[6,7-d]咪唑-7-甲酰胺自由基
合成如图4所示。通过用自旋标记异硫氰酸酯环化香豆素二胺来实现SL-LRL1和SL-LRL2的合成。香豆素二胺TFA盐在Rink酰胺MBHA树脂(0.503mmol/g负载量)上合成，并用TFA裂解。简而言之，用20％4-甲基哌啶的DMF(5分钟，然后15分钟)溶液将Fmoc从0.2克Rink树脂中除去。用DMF(x3)，甲醇(MeOH，x3)和DMF(x3)洗涤后，在6-Cl HOBt(50.9mg，0.3mmol)和N，N'-二异丙基碳化二亚胺(DIC，46μL，0.3mmol)的DMF溶液存在下，将7-氟-4-甲基-6-硝基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羧酸(支架，80.2mg，0.3mmol)与Rink树脂偶合。反应在室温下旋转直到Kaiser测试为阴性。过滤后，用DMF(x3)，MeOH(x3)和DMF(x3)洗涤珠粒。将3-碘苄胺(53.6μL，0.4024mmol)和二异丙基乙胺(DIEA，140μL，0.8048mmol)的DMF溶液加入珠粒中并旋转过夜。洗涤后，用5mL 2M SnCl2·2H2O的DMF溶液处理1-2天实现NO2还原，两次。用DMF，MeOH和二氯甲烷充分洗涤后，在香豆素二胺用TFA(95％)/三异丙基硅烷(TIS，2.5％)/H2O(2.5％)裂解2小时之前，将珠粒真空干燥。香豆素二胺TFA盐用冷乙醚沉淀，用乙醚洗涤两次，然后真空干燥。
向香豆素二胺TFA盐(20.0mg，0.0295mmol)和DIEA(25.8μL，0.148mmol)的无水DMF(1.0mL)溶液中加入3-(2-异硫氰基-乙基氨基甲酰基-吡咯烷氧(proxyl)，自由基(15mg，0.0555mmol)的无水DMF(0.3mL溶液。所得混合物在室温下搅拌5分钟，加入DIC(17μL，0.11mmol)搅拌2h，加入额外的DIC(34μL，0.22mmol)，反应液在室温下搅拌过夜，向溶液中加入冷水，离心收集沉淀，弃去液体，将固体再溶于80％乙腈水溶液(含有0.05％TFA)中并如上所述通过HPLC纯化。
使用轨道阱ESI-MS确认化学特性，C30H34IN6O5的计算质量为685.16，观测质量为686.17。
实施例5.SL-LRL2.3-(3-碘苄基)-8-甲基-6-氧代-2-(((2,2,5,5-四甲基-1-氧代-2, 5-二氢-1H-吡咯-3-基)甲基)氨基)-3,6-二氢苯并吡喃并[6,7-d]咪唑-7-甲酰胺自由基
合成如图4所示。向香豆素二胺TFA盐(21.5mg，0.0317mmol)和DIEA(22μL，0.1268mmol)的无水DMF(1.2mL)溶液中加入3-(异硫氰基甲基)-2,2,5,5-四甲基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基氧自由基(7.5mg，0.0355mmol)。所得溶液搅拌5分钟，加入DIC(11μL，0.071mmol)。反应液在室温下搅拌2小时。再加入额外的DIC(22μL)，所得溶液在室温下搅拌过夜。向溶液中加入冷水。通过离心收集沉淀，弃去液体。将固体重新溶解于80％乙腈水溶液(含有0.05％TFA)中并如上所述通过HPLC纯化。
使用轨道阱ESI-MS确认化学特性，C28H29IN5O4的计算质量为626.12，观测质量为627.13。
实施例6.SL-G8的合成
向100mL圆底瓶中加入2,6-二甲基喹啉(628.8mg，4.0mmol)，4-硝基苯甲醛(635mg，4.2mmol)和乙酸酐(50mL)。混合物回流24小时。让反应混合物冷却至室温。过滤黄色晶体，用水洗涤后用乙醇水溶液洗涤，然后真空干燥得到750mg(E)-6-甲基-2-(4-硝基苯乙烯基)喹诺酮，产率64.4％。化学特性通过轨道阱ESI-MS确认。C18H14N2O2的计算值：290.11，实测值：291.11。
使用二氯化锡实现硝基还原。将二氯化锡(2.0g，10.54mmol)加入到(E)-6-甲基-2-(4-硝基苯乙烯基)喹啉(612mg，2.108mol)的乙醇(18mL)溶液中，然后加入浓盐酸(1.0mL)。使溶液回流5小时，并冷却至室温搅拌过夜。让反应混合物冷却至室温。过滤收集深红色固体，用二氯甲烷洗涤，然后用二氯甲烷和乙醇(2:1)的混合物洗涤。将红色固体重新悬浮于乙醇(60mL)中，然后加入K2CO3水溶液直至红色消失，并且pH达到9-10。将水(60mL)加入到悬浮液中并混合。离心后，过滤收集固体，用水、70％乙醇水溶液洗涤，真空干燥得到495mg褐色固体(E)-4-(2-(6-甲基喹啉-2-基)乙烯基)苯胺，收率90％。化学特性通过轨道阱ESI-MS确认。对于C18H16N2计算值：260.13，实测值：261.14。
将(E)-4-(2-(6-甲基喹啉-2-基)乙烯基)苯胺(9.3mg，0.0357mmol)，(1-氧基-2,2,5,5-四甲基-Δ3-吡咯啉)甲醛(6mg，0.0357mmol)和对甲苯磺酸(1mg，0.0058mmol)的乙醇(1.5mL)和无水THF(0.8mL)混合物的悬浮液超声5分钟，然后在室温下再搅拌15分钟。所得溶液用冰水浴冷却后，加入NaBH4(27mg，0.714mmol)。混合物在室温下搅拌过夜后，加入水(20mL)。离心后收集沉淀，并重新溶解于80％乙腈水溶液(含0.05％TFA)中，使用SL-Res1合成中所述的梯度进行HPLC纯化。收集洗脱液并冻干，得到深红色粉末SL-G8。化学特性通过轨道阱ESI-MS确认。C27H30N3O的计算值：412.24，实测值：413.25。
实施例7.SL-Sb1的合成
向(E)-4-(4-硝基苯乙烯基)苯酚(1.2g，5mmol)的乙醇(40mL)溶液中加入二氯化锡(4.74g，25mmol)，然后加入浓盐酸(2.0mL)。溶液回流3小时，并冷却至室温搅拌过夜。过滤收集深棕色沉淀，用少量乙醇洗涤，得到850mg淡褐色粉末(E)-4-(4-氨基苯乙烯基)苯酚盐酸盐，收率68.4％。C14H13NO的轨道阱ESI-MS计算值211.10，实测值212.10。
向(E)-4-(4-氨基苯乙烯基)苯酚盐酸盐(495.4mg，2.0mmol)，多聚甲醛(600mg，20mmol)和氰基硼氢化钠(378mg，6.0mmol)的混合物中加入乙酸(20mL)。加热所得混合物直至溶液变澄清并在室温下搅拌过夜。向反应液中加入200mL水。加入碳酸钠调节pH至8-9。用二氯甲烷(3×40mL)萃取后，将合并的二氯甲烷层用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤收集液体并通过旋转蒸发浓缩，得到144mg浅灰色固体(E)-4-(4-(二甲基氨基)苯乙烯基)苯酚，产率30％。C16H17NO的轨道阱ESI-MS计算值239.13，实测值240.14。
向1.5mL微量离心管中加入(E)-4-(4-(二甲基氨基)苯乙烯基)苯酚(7.7mg，0.032mmol)，3-羟甲基-(1-氧-2,2,5,5-四甲基吡咯啉)(6.0mg，0.0352mmol)，三苯基膦(PPh3，9.7mg，0.0368mmol)和无水四氢呋喃(THF，0.3mL)。然后将反应管降低到42-kHz超声浴(Cole-Parmer)中并超声2分钟。超声处理时，将偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，7.9μL，0.04mmol)加入到反应混合物中。反应混合物超声15分钟，重复三次，共45分钟。将反应混合物用2mL 50％乙腈/水(0.05％TFA)稀释，然后使用SL-Res1合成中所述的梯度进行HPLC纯化。收集洗脱液并冻干，得到SL-Sb1，为深棕色粉末。C25H31N2O2的轨道阱ESI-MS 391.24，实测值392.25。
实施例8.SL-Sb2的合成
从(E)-4-(4-氨基苯乙烯基)苯酚合成SL-Sb2。将其HCl盐(200mg)悬浮于乙醇(25mL)中，然后加入K2CO3水溶液直至pH为9。向该悬浮液中加入水(25mL)并混合。离心后，过滤收集固体，用水、70％乙醇水溶液洗涤，真空干燥，得到(E)-4-(4-氨基苯乙烯基)苯酚，为褐色固体。将(E)-4-(4-氨基苯乙烯基)苯酚(7.6mg，0.0357mmol)，(1-氧基-2,2,5,5-四甲基-Δ3-吡咯烷)甲醛(6mg，0.0357mmol)和对甲苯磺酸(1mg，0.0058mmol)的乙醇(1.5mL)和无水THF(0.8mL)混合物的悬浮液超声5分钟，直到溶液变澄清并在室温下再搅拌15分钟。所得溶液用冰水浴冷却后，加入NaBH4(27mg，0.714mmol)。混合物室温下搅拌过夜后，加入水(20mL)。离心后收集沉淀，并重新溶解于80％乙腈水溶液(含0.05％TFA)中，使用SL-Res1合成中所述的梯度进行HPLC纯化。收集洗脱液并冻干，得到深棕色粉末SL-G8。化学特性通过轨道阱ESI-MS确认。C23H27N2O2计算值：363.21，实测值：364.22，365.22。
实施例9.SL-AV45的合成
在氮气下，将对甲苯磺酰氯(7.50g，40.0mmol)加入到三甘醇(60.0g，40.0mmol)的吡啶(6.5mL)和二氯甲烷(DCM，400mL)溶液中。室温下搅拌18小时后，通过旋转蒸发除去溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯(200mL)中并用盐水(3×100mL)洗涤。乙酸乙酯溶液经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液蒸发至干，得到粗产物，将其在硅胶柱上纯化，得到透明油状的8-甲苯磺酰氧基-3,6-二氧辛烷-1-醇(8.68g，71.3％)。C13H20O6S的轨道阱ESI-MS计算值304.10；实测值：305.11。
在氮气下向8-甲苯磺酰氧基-3,6-二氧辛烷-1-醇(8.5g，27.93mmol)的无水THF(28mL)溶液中滴加1.0M四丁基氟化铵的THF溶液(TBAF，32mL，32.0mmol)。反应液在氮气下室温搅拌过夜。通过旋转蒸发除去THF。蒸馏残余物得到浅棕色液体。再次蒸馏之后，得无色液体1-氟-3,6-二氧辛烷-1-醇，2.55g，产率60％。C6H13FO3的轨道阱ESI-MS计算值152.08，实测值153.20。
将甲醇钠(1M甲醇溶液，10.0ml)缓慢加入到4-硝基苄基膦酸二乙酯(1.092g，4.0mmol)和6-氯吡啶-3-甲醛(566mg，4.0mmol)的甲醇(10.0mL)溶液中。反应混合物回流2小时，然后冷却至0℃。过滤收集黄色沉淀，用冷甲醇洗涤，真空干燥，得782mg(E)-2-氯-5-(4-硝基苯乙烯基)吡啶，收率75％。C13H9ClN2O2的轨道阱ESI-MS计算值260.04，实测值261.08。
将1-氟-3,6-二氧辛烷-1-醇(600mg，3.92mmol)在0℃下加到氢化钠(528mg，60％分散在矿物油中，13.2mmol)的无水DMF(30mL)混合物中。所得混合物在室温下搅拌0.5小时，然后加入(E)-2-氯-5-(4-硝基苯乙烯基)吡啶(866mg，3.32mmol)。反应混合物在100℃下搅拌2小时，冷却。加入乙酸乙酯和水，分离有机层，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，旋转蒸发滤液。通过硅胶柱纯化残余物，得到480mg产物(E)-2-(2-(2-(2-氟乙氧基)乙氧基)乙氧基)-5-(4-硝基苯乙烯基)吡啶，产率38％。C19H21FN2O5的轨道阱ESI-MS计算值376.14，实测值377.16。
向(E)-2-(2-(2-(2-氟乙氧基)乙氧基)乙氧基)-5-(4-硝基苯乙烯基)吡啶(450mg，1.193mmol)的乙醇(12mL)溶液中加入二氯化锡(1.13g，5.965mmol)，然后加入浓盐酸(1.13mL)。溶液回流3小时，然后在室温下搅拌过夜。过滤收集沉淀物，重新悬浮于乙醇中，然后用K2CO3水溶液中和至pH 9。加入冷水沉淀。离心之后，过滤收集固体并用水洗涤并真空干燥，得到352mg(E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-氟乙氧基)乙氧基)乙氧基)吡啶-3-基)乙烯基)苯胺，收率85％。C19H23FN2O3的轨道阱ESI-MS计算值346.17，实测值347.17。
向(E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-氟乙氧基)乙氧基)乙氧基)吡啶-3-基)乙烯基)苯胺(11.3mg，0.0325mmol)和(1-氧基-2,2,5,5-四甲基-Δ3-吡咯烷)甲醛(6mg，0.0357mmol)的乙醇(1.5mL)和无水THF(0.8mL)混合物中加入对甲苯磺酸(1mg，0.0058mmol)(0.8毫升)。所得混合物超声5分钟，在室温下再搅拌30分钟。在0℃下加入NaBH4(27mg，0.714mmol)。混合物室温下搅拌过夜后，加入水(20mL)。离心后收集沉淀，并重新溶解于80％乙腈水溶液(含0.05％TFA)中，使用SL-Res1合成中所述的梯度进行HPLC纯化。收集洗脱液并冻干以产生SL-AV45。化学特性通过轨道阱ESI-MS确认。C28H37FN3O4的计算值：498.28，实测值：499.30。
实施例10.HO-4160标记促进AD转基因小鼠模型脑标本中淀粉样蛋白斑块的体外检测
通过暴露和未暴露于HO-4160氮氧化合物自旋标记的氟(SLF)中，从转基因AD小鼠模型(5xFAD)获得冠状脑切片(400μm厚)的MR成像，其中SLF阴性样品用与SLF暴露的样品等同的DMSO载体处理。在SLF或DMSO载体对照的标记期之后，将脑切片嵌入琼脂糖中并通过MRI成像。每个实验中使用来自独特AD和野生型(WT)小鼠的切片在三个独立的实验中进行测量。SLF在T1加权的图像强度中不提供可观察的对比度。然而，T2和T2*加权的成像在SLF处理的样品中显示负对比(图5)。
与平均值2.6±0.1x 105的未处理样品的T2加权图像相比，经SLF处理的5xFAD脑切片的强度降低至平均值1.6±0.1x 105。通过非配对t测试评估两组支持了这些组之间的显著差异(p<0.01)。就T2*而言，在两组5xFAD标本之间也有显著的(p<0.02)强度差异，经SLF处理的标本的平均强度为1.4±0.2x 105，未经处理的样品的平均强度为2.3±0.1x105。另外，来自WT小鼠相应切片的T2和T2*加权成像显示SLF处理和SLF阴性(未显示)样本之间没有差异。因此，SLF诱导的负对比度对于含有高AB负载的AD模型小鼠样本是特异性的。
此外，来自WT小鼠的相应切片的T2和T2*加权成像显示SLF处理和SLF阴性样本之间没有差异(图6)。因此，SLF诱导的负对比度对于含有高AB负载的样本是特定的。当使用来自PS/APP小鼠模型的脑样本时，获得类似的定性结果，其中样品经SLF处理在T2*加权的MRI成像中导致显著的负对比(图6)。
实施例11.通过MRI检测的SLF标记的淀粉样蛋白斑块的阴性对比量化
在三个实验的每一个中计算T2和T2*信号抑制。平均抑制值根据以下等式计算：
SS％＝[(SIref-SI)/SIref]*100
其中SI是5xFAD SLF+部分的平均信号强度，SIref是5xFAD SLF-或WT SLF+部分的平均信号强度。计算结果绘制在图7中，其中灰色和白色条代表SLF处理后在5xFAD样本中发现的MRI强度抑制。灰色条显示涉及未经处理的5xFAD脑的信号抑制，而白色条比较涉及来自WT小鼠的SLF处理样本的抑制。相对于两种对照，SLF对携带高淀粉样蛋白-β负载的样品产生约40％的信号抑制。在没有SLF的情况下，5xFAD脑切片的平均强度比WT小鼠样本具有稍低的T2/T2*MRI强度。这可归因于先前在AD模型小鼠的MRI分析中观察到的与AB沉积结合的铁(Vanhoutte等(2005)；Jack等(2007)；和Wadghiri等(2012)))。因此，当将+SLF AD样品与+SLF WT样品比较时，相对抑制略高。这一发现清楚地表明了SLF能够特异性标记淀粉样蛋白斑块并在MR成像上产生负对比。
实施例12.EPR分析支持SLF与淀粉样蛋白的存在高特异性结合
将样品装载到石英池中并通过电子顺磁共振(EPR)光谱检测。如图8所示，从SLF处理的5xFAD脑组织获得了强烈的EPR信号，但是从经类似处理的WT脑组织没有获得信号。因此，与MRI测量结果一致，来自WT+SLF脑切片的EPR信号缺乏排除了这些组织样品中SLF的非特异性结合。正如所料，缺乏SLF处理的5xFAD样品没有显示EPR信号。来自+SLF 5xFAD的EPR广谱反映出强烈固定的旋转探针，与与固化基质的高亲和力结合相一致。在可溶性AB中没有观察到这种SLF的高度固定状态，其中由于该物种内的快速旋转扩散，该分子显示高度的运动平均(Altman等(2015))。
实施例13.抗AB免疫组织化学与MRI检测的淀粉样蛋白斑块的分布相关
用抗-β-淀粉样蛋白，17-24(4G8)单克隆抗体对来自施用SLF的5xFAD转基因小鼠脑切片进行免疫染色。图9中显示的结果通过抗体荧光表现为具有白点图案的黑暗区域表明存在淀粉样蛋白斑块。这种抗体荧光与T2*加权MRI图像中的整个5xFAD+SLF小鼠脑切片中观察到的扩散黑暗模式(强度损失)相关。
实施例14.SLF血脑分布评估
下表1报导了以10mg/kg剂量腹膜内注射三只小鼠后SLF化合物的血浆和脑水平。施用后20、40和60分钟从每只小鼠测量总SLF血浆浓度。注射后60分钟使小鼠安乐死，并且将它们的脑取出并储存在-80℃下。样品中SLF的UPLC-MS/MS分析发现脑浓度约为血浆浓度的50％，相应于0.5的脑/血浆比率。这些数据综合起来表明，SLF具有足够的脑渗透性，可用作成像探针。
表1.小鼠脑和血浆中SLF的注射后水平。
平均值的不确定性以标准误差给出。
实施例15.SLF体内顺磁性和积累的证明
通过尾静脉将SLF注射(i.v.，3mg/kg)到一只5xFAD小鼠和一只WT小鼠中用于脑组织中SLF的离体分析。24小时后，将小鼠安乐死并将它们的脑取出，在4％多聚甲醛中4-8℃固定过夜。从这些脑样品中制备400μm冠状切片并嵌入琼脂糖中。图10提供了5xFAD和WT小鼠的半冠状切片(在前囟-2.12)的MR图像。5xFAD脑组织的T2*加权图像显示了对于在相应于腹侧海马和丘脑区域的5xFAD小鼠冠状切片的轻微负对比。在WT小鼠的样本中没有这种负对比。
实施例16.验证顺磁性SLF的优先保留
将从上述实施例所述的注射SLF的小鼠收集的大脑样品从琼脂糖片上取出并分析其氮氧化合物EPR信号(图11)。与我们从脑切片的体外SLF标记的结果一致，WT小鼠大脑样本没有显示EPR信号，消除了所检测组织样品中SLF的非特异性结合，然而从SLF注射的5xFAD小鼠分离的脑切片产生清晰的EPR信号。与通过体外SLF标记(图8)获得的信号相比，图11中的5xFAD+SLF样品产生较弱的EPR信号。然而，图8中的样品完全浸泡在SLF中，而图11中的组织的SLF标记依赖于对脑脊液(CSF)的可及性。
实施例17.与脑组织结合的SL-LRL1的确认
合成氮氧化合物自旋标记的化合物LRL1，并与5xFAD小鼠大脑样本一起孵育。在图12的左图中，显然LRL1在5xFAD样本的T2*加权的MRI图像中产生强烈的负对比。图12的右图显示了MRI分析后的样品EPR谱图，证实了LRL1化合物与脑组织的结合。
实施例18.SL-LRL2、SL-Res1、SL-Res2和SL-Res3与脑组织结合的确认
合成氮氧化合物自旋标记的化合物LRL2、SL-Res1、SL-Res2和SL-Res3，并与5xFAD小鼠大脑样本一起孵育。图13显示，这四种化合物中的每一种在从5xFAD小鼠(左图)，而不是WT(正常)小鼠(右图)分离的大脑样本的T2*加权的MRI图像中都具有产生负对比的能力。
实施例19.SL-LRL1、SL-LRL2、SL-Res1、SL-Res2和SL-Res3的治疗效果的证据
可根据药物对MC65神经母细胞瘤细胞存活能力的影响来测定药物预防AB毒性的能力(Maezawa等(2008)J.Neurochem.104：457)。在MC65模型系统中，淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的C-末端区域(C99)的表达在不存在转基因抑制剂四环素(TC)的情况下被打开。在APP-C99诱导(TC-)后，AB通过含有条件表达的细胞γ-分泌酶水解后产生。在没有保护的情况下，MC65神经母细胞瘤细胞的死亡是由于寡聚AB(ABO)的细胞内积累造成的。作为一个例子，我们在Petrlova等(2012)中显示SLF提供了对AB毒性的预防，其效力比非自旋标记的母体芴K01-162高近一个数量级。在下表2中，我们报道了在MC65测试中SL-LRL1、SL-LRL2、SL-Res1、SL-Res2和SL-Res3化合物预防AB毒性的能力。
表2.新自旋标记的淀粉样蛋白试剂在预防由MC65测试测定的AB毒性中的效力。EC50表示达到最大效应50％的化合物浓度，其中所有化合物的最大效应是100％细胞活力。
化合物 EC50(μM)
SL-LRL1 4.5
SL-LRL2 3.5
SL-Res1 0.45
SL-Res2 0.68
SL-Res3 0.41
用于这些研究的细胞培养模型是配有淀粉样蛋白-β前体蛋白(APP-C99)羧基末端99残基的条件表达的人神经母细胞瘤细胞系(MC65)。AB由APP-C99经细胞γ-分泌酶蛋白水解后产生。为了诱导细胞AB产生，如前所述(Maezawa等(2008))，将转基因抑制剂四环素(TC)从培养基中除去。早在TC去除后4小时，细胞内ABO开始积累。TC去除后立即加入化合物，在测量细胞活力之前维持细胞3天而不更换培养基。使用比色MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物]细胞活力测试在第3天测定细胞毒性。
实施例20.AB致病性
AB的致病性可能与肽的可溶寡聚状态所特有的毒性构象相关。为了测试我们的试剂逆转AB毒性构象的能力，我们测量了LRL1-2和RES1-3对淀粉样蛋白染料硫磺素-T(ThT)对低聚AB结合的影响，其作为AB聚集和原纤维形成的一般指示物，提供了一种鉴定将AB重塑为无毒构型的试剂的简单方法。由于AB形成毒性聚集体时ThT在478nm处的荧光增加，我们测试了在寡聚AB存在下RES1-3和LRL1-2对ThT荧光的影响。如图14所示，相对于没有添加的样品，RES1-3和LRL1-2的添加抑制了AB和ThT混合物的478nm发射信号。这表明每种化合物直接作用AB并改变其淀粉样蛋白和毒性特征。
尽管已知AB破坏多种细胞功能，但是对蛋白质和脂质的氧化损伤是其致病机制的一般特征。由于氮氧化合物具有独特的抗氧化活性，因此我们的化合物具有很强的抵抗氧化应激的潜力。我们的化合物直接与AB作用，因此这些试剂被设计成通过使得抗氧化剂功能在AB处集中而特别有效地清除活性氧(ROS)和氮物质(NOS)。图15A和B显示LRL1-2和RES1-3是ROS的有效清除剂，如通过自旋捕获所测量。
尽管为了清楚理解的目的已经通过阐述和实例的方式详细描述了上述发明，但是本领域技术人员将会理解，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。此外，本文提供的每篇参考文献通过引用整体并入，如同每篇文献作为参考单独引入一样。当本申请与本文提供的参考文献存在冲突时，本申请占主导。

Claims (27)

1.一种使淀粉样蛋白成像的方法，包括：
向受试者施用有效量的具有式I结构的化合物：
X-(Y)n (I)
其中
X为淀粉样蛋白β结合化合物；
Y为氮氧化合物；且
n为从1到3的整数；
使得所述化合物与淀粉样蛋白结合；并且
检测与淀粉样蛋白结合的化合物，从而使该淀粉样蛋白成像。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述检测发生在施用后至少60分钟。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述检测包括磁共振成像(MRI)、电子顺磁共振(EPR)、正电子发射断层摄影(PET)或电子自旋共振显微术(ESRM)中的至少一种。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述淀粉样蛋白包含淀粉样蛋白β聚集体。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述淀粉样蛋白β结合化合物选自下组：
其中
Ra和Rb各自独立地为H或C1-4烷基；
Z选自下组：I、123I、125I、131I、Br、76Br、77Br、F、18F和–O-甲苯磺酰基；且
q为2至5的整数。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述氮氧化合物选自下组：
7.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自下组：
其中
R1选自：
且
R2选自下组：OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3和(OCH2CH2)3F。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物具有结构：
其中
R1为甲基或选自下组的氮氧化合物：
且
R2为丙胺或选自下组的氮氧化合物：
其中R1和R2中的至少一个为氮氧化合物。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自下组：
其中
R1、R2和R3各自独立地选自下组：
10.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自下组：
其中
R1和R2各自独立地为H或选自下组的氮氧化合物：
其中R1和R2中的至少一个是氮氧化合物。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自下组：
其中
R1和R2各自独立地为H、
或选自下组的氮氧化合物：
其中R1和R2中的至少一个是氮氧化合物。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自下组：
其中
R选自下组：
13.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物具有结构：
14.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自下组：
15.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自下组：
16.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自下组：
17.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者为非治疗目的接受所述化合物。
18.具有下式的化合物：
其中
R1和R2各自独立地为H或选自下组的氮氧化合物：
其中R1和R2中的至少一个是氮氧化合物。
19.如权利要求18所述的化合物，其中所述化合物选自下组：
20.具有下式的化合物：
其中
R1和R2各自独立地为H、
或选自下组的氮氧化合物：
其中R1和R2中的至少一个是氮氧化合物。
21.如权利要求20所述的化合物，其中所述化合物选自下组：
22.具有下式的化合物：
其中
R1选自下组：
且
R2选自下组：OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3和(OCH2CH2)3F。
23.具有下式的化合物：
其中
R1选自下组：
且
R2选自下组：OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2F、CH3和(OCH2CH2)3F。
24.选自下组的化合物：
25.一种用于淀粉样蛋白成像的诊断组合物，包括式I化合物：
X-(Y)n (I)
其中
X为淀粉样蛋白β结合化合物；
Y为氮氧化合物；且
n为从1到3的整数。
26.一种治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求18-23中的任一项的化合物。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述疾病为阿尔茨海默症。
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