JP5654748B2 - タンパク質凝集の阻害物質 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は一般に、パーキンソン病（ＰＤ）などの神経変性疾患に関連するα−シヌクレインタンパク質の凝集およびこのような凝集を調節できるジアミノフェノチアジン化合物に関する。

発明の背景
パーキンソン病は、一般的なヒト神経変性運動障害であり、高齢者人口の１％に影響を及ぼしている（Kapurniotu (2004) Chemistry & Biology 11, pp 1476-1478による議論を参照）。ＰＤの主な臨床症状は、運動緩徐、静止時振戦、筋固縮およびバランス困難である。ＰＤは、ドーパミン作動性ニューロンの顕著な、そして進行性の変性によって、そして黒質および脳の他の領域における線維性細胞質内封入体（レビ小体［ＬＢ］）およびジストロフィー性神経突起（レビ神経突起［ＬＮ］）の存在によって神経病理学的に特徴付けられる（Recchia et al. (2004) FASEB J 18: 617-626）。

ドーパミンニューロンの消失は、ＰＤの主な臨床症状に確かに関連しているが、この多因性疾患の原因および病原はもちろんのこと、関連する「シヌクレイノパチー」の原因および病原もなお大部分は不明である。

ＬＢおよびＬＮの両方の主成分は、α−シヌクレインの線維性凝集である。α−シヌクレインは、膜結合プロセスおよびシナプス可塑性で役割を果たすように考えられ、学習および発育プロセスに関連している、広範に発現された神経シナプス前タンパク質である。ＬＢおよびＬＮの形成の（単数または複数の）機構およびＰＤとのそれらの関連はまだ理解されていないが、いくつかの証拠が、α−シヌクレイン線維化がＰＤと関連していることと、α−シヌクレイン線維化が毒性を引き起こすことを示唆している（例えばMasliah et al., Science, 287:1265-1269 (2000); Feany et al., Nature 404:394-8 (2000)）。

α−シヌクレインに加えて、β−シヌクレインも神経変性シヌクレイノパチーに関与している。ヒトβ−シヌクレインは、α−シヌクレインに７８％相同性である１３４残基神経タンパク質である。αおよびβ−シヌクレインは、３個の同様に配置されたチロシン残基を持つ保存Ｃ末端を共有する。α−シヌクレイン含有ＬＢおよびＬＮに加えて、ＬＢによるＰＤおよび認知症の展開は、これらの疾患の発症および進行においてα−シヌクレインに加えてβ−シヌクレインを巻き込む、海馬における新規なαおよびβ−シヌクレイン陽性病変の出現を伴う（Galvin et al. 1999）。β−シヌクレインがα−シヌクレインの線維化を制御して、おそらくα−シヌクレインの凝集を最小限に抑えるシャペロンとして作用することが指摘されている（Hashimoto et al. 2001; Uversky et al. 2002; Park and Lansbury, 2002）。したがって、β−シヌクレインのレベルの低下は、ＰＤ病因の考えられる因子として見なされてきた（Uversky et al. 2002）。

それゆえ、シヌクレイン凝集の阻害または逆転は、治療的に有益であると考えられる。

Li et al. (2004) Chemistry & Biology 11: pp 1513-1521は、抗生物質リファンピシンによるα−シヌクレイン線維化の阻害、および原線維の脱凝集について論じている。

Zhu et al. (2004) Journal of Biological Chemistry 279, 26: pp 26846-26857は、フラボノイドのバイカレインによるα−シヌクレイン線維化の阻害、および原線維の脱凝集について論じている。

このような凝集の阻害物質に関係すると言われる他の刊行物が当分野に多数ある。これらとしては、"Compositions for inhibiting the aggregation pathway of alpha-synuclein" (US6780971 - 2004-08-24); "Polyhydroxylated aromatic compounds for the treatment of amyloidosis and alpha-synuclein fibril diseases" (US2004152760 - 2004-08-05); Peptide and peptide derivatives for the treatment of alpha-synuclein related diseases (WO2004009625 - 2004-01-29); Proanthocyanidins for the treatment of amyloid and alpha-synuclein diseases (EP1377287 - 2004-01-07); Methods for preventing neural tissue damage and for the treatment of alpha-synuclein diseases (CN1440420T - 2003-09-03)が挙げられる。

しかしながらシヌクレイン凝集を阻害できることが先に既知でなかった化合物の供給は、当分野への寄与を与えることが理解されるであろう。

発明の開示
本発明者らは、シヌクレインタンパク質の凝集を阻害するためにジアミノフェノチアジン化合物が使用されうることを初めて証明した。

簡潔には、発明者らは２つの形のα−シヌクレインを発現させて精製して、そして自己集合および原線維形成のアッセイにそれらを使用した。α−シヌクレインの切断型（ｔｓｙｎ）は、原線維形成で特に有効であることが見出され、このような集合ｔｓｙｎはチオフラビンＴの蛍光を高めることが示された。発明者らは、他の化合物と同様にジアミノフェノチアジンの原線維破壊活性をアッセイした。ジアミノフェノチアジンは、集合α−シヌクレインを１μM未満に破壊することが見出された。

シヌクレイン結合についての固相アッセイも考案され、これを、チオニニウムクロリドなどのジアミノフェノチアジン、およびフラボンが結合を阻害することを示すために使用した。

当業者によって理解されるように、本開示に照らして、これらの結果は特に、シヌクレイン凝集に関連する疾患（例えばＰＤおよび本明細書で議論するその他の疾患）の根底にある原因の処置におけるこのような化合物の有用性を証明する。

Piotrowski, G. (1936) "The treatment of parkinsonian tremor. Medical Record, 144:322-323"は、メチレンブルー（メチルチオニニウムクロリド−ＭＴＣ）を使用する４個体の試験でのパーキンソン振戦の症状軽減を報告した。ＭＴＣは、１または２mg／ｋｇ用量で静脈内投与した。８グレイン（＝５１８mg）／日の経口投与は、副作用のため中止した。振戦に対する報告された効果は強力でなく、限定された時間のみ続いたが、別の症状（固縮）は大きな影響を受けなかった。チオニンによる別の試験は結果を与えなかった。したがって、開示の要点は、副交感神経作用を有することが既知であったＭＴＣが特に、パーキンソン病の１つの症状、すなわち「パーキンソン振戦」に限定された効果を有したことである。

対照的に、本発明は、疾患の症状出現よりも根底にある疾患プロセス自体を目的とする処置に関する。

ジアミノフェノチアジンは、タウタンパク質凝集を阻害することと、ＰＨＦの構造を破壊して、ＰＨＦコアのタンパク質分解安定性を逆転させることとが先に示されている（WO 96/30766, F Hoffman-La Rocheを参照）。このような化合物は、アルツハイマー病およびレビ小体病を含む種々の疾患の処置における使用について開示された。

加えて、WO 02/055720 (The University Court of the University of Aberdeen)は、特に多様なタンパク質凝集疾患の処置のためのジアミノフェノチアジンの還元型の使用について考察しているが、開示は主にタウオパシー(tauopathies)に関連している。

WO 2005/030676 (The University Court of the University of Aberdeen)は、放射性標識フェノチアジン、ならびに例えばタウオパシーの診断および治療でのそれらの使用について考察している。

しかしながら、これらの刊行物のいずれも、特にα−シヌクレイン凝集の阻害または逆転のためのジアミノフェノチアジン、特に非還元型の使用を具体的に開示していない。

ジアミノフェノチアジン化合物
本発明は、次の式の１つを有する、ある一定のジアミノフェノチアジン化合物およびその類似体、ならびにその製薬的に許容される塩、水和物、および溶媒和物（本明細書ではまとめて「ジアミノフェノチアジン」または「ジアミノフェノチアジン化合物」と称する）に関する：

式（１）は、還元型の化合物を示すが、式（２）、（３）、および（４）それぞれは酸化型の化合物を示している。

一実施形態において、化合物は、式（１）の化合物、その製薬的に許容される塩、水和物、および溶媒和物より選択される。

一実施形態において、化合物は、式（２）または（３）の化合物、その製薬的に許容される塩、水和物、および溶媒和物より選択される。

一実施形態において、化合物は、式（４）の化合物、その製薬的に許容される塩、水和物、および溶媒和物より選択される。

上記の構造のそれぞれ１つが、多くの等価の共鳴構造のうちのただ１つであり、そのすべてがその代表的な構造によって含まれるものとする。例えば、構造（４）は、多くの等価の共鳴構造のうちのただ１つであり、その一部は以下に示されており、そのすべてが構造（４）によって含まれることが意図される：

炭素環元素置換基
上の式のそれぞれ１つにおいて、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、およびＲ^９のそれぞれ１つは、
−Ｈ；
−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；
−ＯＨ；−ＯＲ；
−ＳＨ；−ＳＲ；
−ＮＯ_２；
−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ；
−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ；
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^２；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｎ１Ｒ^Ｎ２；
−ＮＨ_２；−ＮＨＲ；−ＮＲ^２；−ＮＲ^Ｎ１Ｒ^Ｎ２；
−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ；−ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｈ；−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ；−ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｒ；
−Ｒ；
より独立して選択され；
各Ｒは、
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール；置換Ｃ_６〜１０カルボアリール；
非置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール；置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル；置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル；
より独立して選択され；
各基−ＮＲ^Ｎ１Ｒ^Ｎ２において、独立して、Ｒ^Ｎ１およびＲ^Ｎ２はそれらが結合された窒素原子と一緒になって、３〜７個の環原子を有する環を形成する。

Ｒ^Ｎ１およびＲ^Ｎ２が、それらが結合された窒素原子と一緒になって、３〜７個の環原子を有する環を形成する、基−ＮＲ^Ｎ１Ｒ^Ｎ２の例としては、ピロリジノ、ピペリジノ、ピペラジノ、モルホリノ、ピロリル、および置換型、例えばＮ置換型、例えばＮ−メチルピペラジノが挙げられる。

一実施形態において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、およびＲ^９のそれぞれ１つは、
−Ｈ；
−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；
−ＯＨ；−ＯＲ；
−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ；
−Ｒ
より独立して選択される。

一実施形態において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、およびＲ^９のそれぞれ１つは、
−Ｈ；
−Ｒ
より独立して選択される。

一実施形態において、各Ｒは、
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；置換Ｃ_３〜６シクロアルキル
より独立して選択される。

一実施形態において、各Ｒは、
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル
より独立して選択される。

一実施形態において、各Ｒは、−Ｍｅ、−Ｅｔ、−ｎＰｒ、および−ｉＰｒより独立して選択される。
一実施形態において、各Ｒは、−Ｍｅおよび−Ｅｔより独立して選択される。

一実施形態において、Ｃ_１〜６アルキル基は、Ｃ_１〜４アルキル基である。
一実施形態において、Ｃ_２〜６アルケニル基は、Ｃ_２〜４アルケニル基である。
一実施形態において、Ｃ_３〜６シクロアルキル基は、Ｃ_３〜４シクロアルキル基である。

非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソ−ペンチル、tert−ペンチル、ネオ−ペンチル、ヘキシル、イソ−ヘキシルなどが挙げられる。

非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル基の例としては、プロペン−１−イル、プロペン−２−イル、ブテン−１−イル、ブテン−２−イル、ブテン−３−イルなどが挙げられる。

非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロプロピル−メチル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。

一実施形態において、Ｃ_６〜１０カルボアリール基は、Ｃ_６カルボアリール基である。
一実施形態において、Ｃ_５〜１０ヘテロアリール基は、Ｃ_５〜６ヘテロアリール基である。
一実施形態において、Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル基は、Ｃ_６カルボアリール−Ｃ_１〜２アルキル基である。

非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール基の例としては、フェニル、ナフチルが挙げられる。

非置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、チエニル、フリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニルが挙げられる。

非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル基の例としては、ベンジル、フェニルエチルが挙げられる。

一実施形態において、任意の置換基（例えば、脂肪族Ｃ_１〜６アルキル、脂肪族Ｃ_１〜６アルケニル、Ｃ_３〜６シクロアルキル、Ｃ_６〜１０カルボアリール、Ｃ_５〜１０ヘテロアリール、Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル上の）は、
−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；
−ＯＨ；−ＯＲ’；
−ＳＨ；−ＳＲ’；
−ＮＯ_２；
−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’；
−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’；
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ’；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’_２；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’^Ｎ１Ｒ’^Ｎ２；
−ＮＨ_２；−ＮＨＲ’；−ＮＲ’_２；−ＮＲ’^Ｎ１Ｒ’^Ｎ２；
−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ；−Ｎ’ＲＣ（＝Ｏ）Ｈ；−ＮＨＣ（＝Ｏ）’Ｒ；−Ｎ’ＲＣ（＝Ｏ）’Ｒ；
−Ｒ’；
より独立して選択され；
各Ｒ’は：
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール；置換Ｃ_６〜１０カルボアリール；
非置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール；置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル；置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル；より独立して選択され；
各基−ＮＲ’^Ｎ１Ｒ’^Ｎ２において、Ｒ’^Ｎ１およびＲ’^Ｎ２は独立して、それらが結合された窒素原子と一緒になって、３〜７個の環原子を有する環を形成する。

一実施形態において、任意の置換基（例えば、脂肪族Ｃ_１〜６アルキル、脂肪族Ｃ_１〜６アルケニル、Ｃ_３〜６シクロアルキル、Ｃ_６〜１０カルボアリール、Ｃ_５〜１０ヘテロアリール、Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル上の）は：
−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；
−ＯＨ；−ＯＲ；
−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’；
−Ｒ’
より独立して選択される。

一実施形態において、任意の置換基（例えば、脂肪族Ｃ_１〜６アルキル、脂肪族Ｃ_１〜６アルケニル、Ｃ_３〜６シクロアルキル、Ｃ_６〜１０カルボアリール、Ｃ_５〜１０ヘテロアリール、Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル上の）は、各Ｒ’が、
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール；
非置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル；
より独立して選択されることを除いて、上で定義するとおりである。

一実施形態において、任意の置換基（例えば、脂肪族Ｃ_１〜６アルキル、脂肪族Ｃ_１〜６アルケニル、Ｃ_３〜６シクロアルキル、Ｃ_６〜１０カルボアリール、Ｃ_５〜１０ヘテロアリール、Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル上の）は、各Ｒ’が、
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル
より独立して選択されることを除いて、上で定義するとおりである。

一実施形態において、任意の置換基（例えば、脂肪族Ｃ_１〜６アルキル、脂肪族Ｃ_１〜６アルケニル、Ｃ_３〜６シクロアルキル、Ｃ_６〜１０カルボアリール、Ｃ_５〜１０ヘテロアリール、Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル上の）は、各Ｒ’が、
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル
より独立して選択されることを除いて、上で定義するとおりである。

一実施形態において、任意の置換基（例えば、脂肪族Ｃ_１〜６アルキル、脂肪族Ｃ_１〜６アルケニル、Ｃ_３〜６シクロアルキル、Ｃ_６〜１０カルボアリール、Ｃ_５〜１０ヘテロアリール、Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル上の）は、各Ｒ’が、−Ｍｅ、−Ｅｔ、−ｎＰｒ、および−ｉＰｒより独立して選択されることを除いて、上で定義するとおりである。

一実施形態において、任意の置換基（例えば、脂肪族Ｃ_１〜６アルキル、脂肪族Ｃ_１〜６アルケニル、Ｃ_３〜６シクロアルキル、Ｃ_６〜１０カルボアリール、Ｃ_５〜１０ヘテロアリール、Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル上の）は、各Ｒ’が、−Ｍｅおよび−Ｅｔより独立して選択されることを除いて、上で定義するとおりである。

一実施形態において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、およびＲ^９のそれぞれ１つは、−Ｈ、−Ｍｅ、−Ｅｔ、−ｎＰｒ、および−ｉＰｒより独立して選択される。

一実施形態において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、およびＲ^９のそれぞれ１つは、−Ｈ、−Ｍｅ、および−Ｅｔより独立して選択される。

一実施形態において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、およびＲ^９のそれぞれ１つは、−Ｈおよび−Ｍｅより独立して選択される。

一実施形態において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、およびＲ^９のうち４つを除くすべてが、−Ｈである。
一実施形態において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、およびＲ^９のうち２つを除くすべてが、−Ｈである。
一実施形態において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、およびＲ^９のうち１つを除くすべてが、−Ｈである。
一実施形態において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、およびＲ^９のそれぞれが、−Ｈである。

アミノ基
上の式のそれぞれ１つでは、各基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれ１つが独立して−Ｈであるか、またはＲについて上で定義したとおりであり；あるいはＲ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢは、それらが結合される窒素原子と一緒になって、３〜７環原子を有する環を形成する。

例えば、一実施形態では、各基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれ１つが独立して、Ｒについて上で定義したとおりであり；あるいはＲ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢは、それらが結合される窒素原子と一緒になって、３〜７環原子を有する環を形成する。

例えば、一実施形態では、各基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれ１つが、
−Ｈ；
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール；非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール；
非置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール；置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル；置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル；
より独立して選択されるか；
あるいはＲ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢは、それらが結合される窒素原子と一緒になって、３〜７環原子を有する環を形成する。

例えば、一実施形態では、各基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれ１つが、
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール；非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール；
非置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール；置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル；置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル；
より独立して選択されるか；
あるいはＲ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢは、それらが結合される窒素原子と一緒になって、３〜７環原子を有する環を形成する。

別の例で、一実施形態では、各基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれ１つが、
−Ｈ；
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；
より独立して選択されるか；
あるいはＲ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢは、それらが結合される窒素原子と一緒になって、３〜７環原子を有する環を形成する。

別の例で、一実施形態では、各基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれ１つが：
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；;置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；
より独立して選択されるか；
あるいはＲ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢは、それらが結合される窒素原子と一緒になって、３〜７環原子を有する環を形成する。

別の例で、一実施形態では、各基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれ１つが、
−Ｈ；
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；
より独立して選択されるか；
あるいはＲ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢは、それらが結合される窒素原子と一緒になって、３〜７環原子を有する環を形成する。

別の例で、一実施形態では、各基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれ１つが、
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；
より独立して選択されるか；
あるいはＲ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢは、それらが結合される窒素原子と一緒になって、３〜７環原子を有する環を形成する。

別の例で、一実施形態では、各基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれ１つが、−Ｈ、−Ｍｅ、−Ｅｔ、−ｎＰｒ、および−ｉＰｒより独立して選択される。

別の例で、一実施形態において、各基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれ１つが、−Ｈ、−Ｍｅ、および−Ｅｔより独立して選択される（例えば、−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＡが、−ＮＨ_２、−ＮＨＭｅ、−ＮＭｅ_２、−ＮＨＥｔ、−ＮＥｔ_２、または−ＮＭｅＥｔである）。

別の例で、一実施形態では、各基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれ１つが、−Ｈおよび−Ｍｅより独立して選択される（例えば、−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＡが、−ＮＨ_２、−ＮＨＭｅ、またはＮＭｅ_２である）。

まったく同様に、上の式のそれぞれ１つでは、各基−ＮＲ^７ＮＡＲ^７ＮＢにおいて、存在する場合、Ｒ^７ＮＡおよびＲ^７ＮＢのそれぞれ１つが独立して−Ｈであるか、またはＲについて上で定義したとおりであり；あるいはＲ^７ＮＡおよびＲ^７ＮＢは、それらが結合される窒素原子と一緒になって、３〜７環原子を有する環を形成する。

例えば、一実施形態では、各基−ＮＲ^７ＮＡＲ^７ＮＢにおいて、存在する場合、Ｒ^７ＮＡおよびＲ^７ＮＢのそれぞれ１つが独立して、Ｒについて上で定義したとおりであり；あるいはＲ^７ＮＡおよびＲ^７ＮＢは、それらが結合される窒素原子と一緒になって、３〜７環原子を有する環を形成する。

一実施形態において、−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢおよび−ＮＲ^７ＮＡＲ^７ＮＢは、どちらも存在する場合、同じである。

一実施形態において、−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢおよび−ＮＲ^７ＮＡＲ^７ＮＢは、どちらも存在する場合、異なる。

上の式のそれぞれ１つでは、各基＝ＮＲ^３ＮＣにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＣは独立して−Ｈであるか、またはＲについて上で定義したとおりである。

例えば、一実施形態では、各基＝ＮＲ^３ＮＣにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＣは、独立してＲについて上で定義したとおりである。

例えば、一実施形態では、各基＝ＮＲ^３ＮＣにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＣは、
−Ｈ；
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール；置換Ｃ_６〜１０カルボアリール；
非置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール；置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル；置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル
より独立して選択される。

例えば、一実施形態では、各基＝ＮＲ^３ＮＣにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＣは、
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール；置換Ｃ_６〜１０カルボアリール；
非置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール；置換Ｃ_５〜１０ヘテロアリール；
非置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル；置換Ｃ_６〜１０カルボアリール−Ｃ_１〜４アルキル
より独立して選択される。

別の例で、一実施形態では、各基＝ＮＲ^３ＮＣにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＣは、
−Ｈ；
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；置換Ｃ_３〜６シクロアルキル
より独立して選択される。

別の例で、一実施形態では、各基＝ＮＲ^３ＮＣにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＣは、
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル；置換Ｃ_３〜６シクロアルキル
より独立して選択される。

別の例で、一実施形態では、各基＝ＮＲ^３ＮＣにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＣは、
−Ｈ；
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル
より独立して選択される。

別の例で、一実施形態では、各基＝ＮＲ^３ＮＣにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＣは、
非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル；
非置換脂肪族Ｃ_２〜６アルケニル；
非置換Ｃ_３〜６シクロアルキル
より独立して選択される。

別の例では、一実施形態において、各基＝ＮＲ^３ＮＣにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＣは、−Ｈ、−Ｍｅ、−Ｅｔ、−ｎＰｒ、および−ｉＰｒより独立して選択される。

別の例では、一実施形態において、各基＝ＮＲ^３ＮＣにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＣは、−Ｈ、−Ｍｅ、および−Ｅｔより独立して選択される（例えば、＝ＮＲ^３ＮＣは、＝ＮＨ、＝ＮＭｅ、または＝ＮＥｔである）。

別の例では、一実施形態において、各基＝ＮＲ^３ＮＣにおいて、存在する場合、Ｒ^３ＮＣは、−Ｈおよび−Ｍｅより独立して選択される（例えば、＝ＮＲ^３ＮＣは、＝ＮＨまたは＝ＮＭｅである）。

まったく同様に、上の式のそれぞれ１つでは、各基＝ＮＲ^７ＮＣにおいて、存在する場合、Ｒ^７ＮＣは独立してＲ^３ＮＣについて上で定義したとおりである。

窒素環原子の置換基
また、まったく同様に、上の式のそれぞれ１つでは、Ｒ^Ｎ１０は、存在する場合、独立してＲ^３ＮＣ（またはＲ^７ＮＣ）について上で定義したとおりである。

例えば、一実施形態において、Ｒ^Ｎ１０は、存在する場合、−Ｈおよび非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキルより独立して選択される。

例えば、一実施形態において、Ｒ^Ｎ１０は、存在する場合、−Ｈ、−Ｍｅ、およびＥｔより独立して選択される。

例えば、一実施形態において、Ｒ^Ｎ１０は、存在する場合、−Ｈおよび−Ｍｅより独立して選択される。

例えば、一実施形態において、Ｒ^Ｎ１０は、存在する場合、独立して−Ｈである。

対イオン
Ｘ⁻は、存在する場合、１つ以上のアニオン性対イオンであり、電気的中性を達成する。

適切なアニオン性対イオンの例は、見出し「塩」のもとで以下考察する。

一実施形態において、Ｘ⁻は、独立してハロゲンアニオン（すなわちハライド）である。
一実施形態において、Ｘ⁻は、独立して、Ｃｌ⁻、Ｂｒ⁻、またはＩ⁻である。
一実施形態において、Ｘ⁻は、独立してＣｌ⁻である。

一実施形態において、Ｘ⁻は、独立してＮＯ_３ ⁻である。

組合せ
上記の実施形態の妥当と思われる組合せはすべて、各組合せが個々にそして明示的に引用されているかのように本明細書に開示される。

異性体
ある一定の化合物は、１つ以上の特定の幾何、光学、エナンチオマー、ジアステレオマー、エピマー、アトロプ、立体異性、互変異性、配座、またはアノマー形に存在し、シスおよびトランス形；ＥおよびＺ形；ｃ、ｔ、およびｒ形；エンドおよびエキソ形；Ｒ、Ｓ、およびメソ形；ＤおよびＬ形；およびｌ形；（＋）および（−）形；ケト、エノール、およびエノラート形；シンおよびアンチ形；向斜および背斜形；αおよびβ形；アキシャルおよびエクリトリアル形；舟、いす、ねじれ、エンベロープ、および半いす形、およびその組合せが挙げられ、以下集合的に「異性体」（または「異性形」）と呼ぶが、これらに限定されない。

互変異性形に関して、以下考察されるものを除いて、本明細書で使用するような「異性体」という用語から、特に除外されるものは、構造（structural）（または構造、constitutional）異性体（すなわち単に空間における原子の位置によってではなく、原子間の結合が異なる異性体）であることに注意すること。例えば、メトキシ基、−ＯＣＨ_３への言及は、その構造異性体、ヒドロキシメチル基、−ＣＨ_２ＯＨへの言及として解釈されない。同様に、オルト−クロロフェニルへの言及は、その構造異性体メタ−クロロフェニルへの言及として解釈されない。しかしながら、構造のクラスへの言及は、そのクラスに含まれる構造上異性の形を含むであろう（例えば、Ｃ_１〜７アルキルは、ｎ−プロピルおよびイソプロピルを含む；ブチルは、ｎ−、イソ−、sec−、およびtert−ブチルを含む；メトキシフェニルは、オルト−、メタ−、およびパラ−メトキシフェニルを含む）。

上記の除外は、例えば次の互変異性対におけるように、互変異性形、例えば、ケト、エノールおよびエノラート形には関係しない：ケト／エノール（下に示す）、イミン／エナミン、アミド／イミドアルコール、アミジン／アミジン、ニトロソ／オキシム、チオケトン／エネチオール、Ｎ−ニトロソ／ヒドロキシアゾ、およびニトロ／アシ−ニトロ。

「異性体」という用語に１つ以上の同位体置換が特に含まれることに注意のこと。例えば、Ｈは、^１Ｈ、^２Ｈ（Ｄ）、および^３Ｈ（Ｔ）を含むいずれの同位体形でもよい；Ｃは、^１１Ｃ、^１２Ｃ、^１３Ｃ、および^１４Ｃを含むいずれの同位体形でもよい；Ｏは、^１６Ｏおよび^１８Ｏを含むいずれの同位体形でもよい；などである。

特にことわりのない場合、特定の化合物への言及は、（全体または部分的に）ラセミおよびその他の混合物を含む、このようなすべての異性体形を含む。このような異性体形の調製（例えば不斉合成）および分離（例えば分別結晶化およびクロマトグラフィー手段）の方法は、当分野で既知であるか、あるいは本明細書で教示されている方法、または既知の方法を既知の方式で適合させることによって容易に得られる。

塩類
化合物の対応する塩、例えば製薬的に許容される塩を調製、精製、および／または処理することは好都合または所望でありうる。製薬的に許容される塩の例としては、Berge et al., 1977, "Pharmaceutically Acceptable Salts," J. Pharm. Sci., Vol. 66, pp. 1-19において考察されている。

例えば、化合物がアニオン性であるか、またはアニオン性である官能基（例えば、−ＣＯＯＨが、−ＣＯＯ⁻でありうる）を有する場合、塩は適切なカチオンで形成されうる。適切な無機カチオンの例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｎａ^＋およびＫ^＋などのアルカリ金属イオン、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋などのアルカリ土類金属、ならびにＡｌ^＋３などの他のカチオンが挙げられる。適切な有機カチオンの例としては、これらに限定されるわけではないが、アンモニウムイオン（すなわちＮＨ_４ ^＋）および置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ_３Ｒ^＋、ＮＨ_２Ｒ_２ ^＋、ＮＨＲ_３ ^＋、ＮＲ_４ ^＋）が挙げられる。ある適切な置換アンモニウムイオンは、エチルアミン、ジエチルアミン、ジクロロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミン、ならびに、リジンおよびアルギニンなどのアミノ酸より由来するアンモニウムイオンである。一般的な４級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ_３）_４ ^＋である。

化合物がカチオン性であるか、またはカチオン性である官能基（例えば、−ＮＨ_２が、−ＮＨ_３ ^＋でありうる）を有する場合、塩は適切なアニオンで形成されうる。適切な無機アニオンの例としては、これらに限定されるわけではないが、以下の無機酸、すなわち塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、および亜リン酸に由来するアニオンが挙げられる。

適切な有機アニオンの例としては、これらに限定されるわけではないが、以下の有機酸、すなわち２−アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、粘液酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモン酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、および吉草酸に由来するアニオンが挙げられる。適切なポリマー有機アニオンの例としては、これらに限定されるわけではないが、以下のポリマー酸、すなわちタンニン酸、カルボキシメチルセルロースに由来するものが挙げられる。

また、化合物は、混合塩（すなわち塩、または別の塩と組合せた化合物）の形で供給されうる。例えば、塩化メチル−チオニウム塩化亜鉛混合塩（ＭＴＺ）は、塩化メチル−チオニウム（ＭＴＣ）、塩化物塩、および別の塩、塩化亜鉛との混合塩である。このような混合塩は、「およびその製薬的に許容される塩」という用語によって含まれるものである。

特にことわりがない場合、特定の化合物への言及は、その塩の形態も含む。

水和物および溶媒和物
活性化合物の対応する溶媒和物を調製、精製、および／または処理することは、好都合または望ましいであろう。「溶媒和物」という用語は、溶質（例えば、化合物、化合物の塩）および溶媒の錯体を意味するために従来の意味で本明細書で使用される。溶媒が水である場合、溶媒和物を、水和物、例えば、１水和物、２水和物、３水和物と好都合に称することができる。

特にことわりがない場合り、特定の化合物への言及は、その溶媒和物の形態も含む。

いくつかの好適な例
いくつかの好適なジアミノフェノチアジンは、以下、およびその製薬的に許容される塩、水和物、および溶媒和物を含む：

一実施形態において、ジアミノフェノチアジンは、ＭＴＣ、ＥＴＣ、ＤＥＭＴＣ、ＤＥＥＴＣ、チオニン、および塩化トロニウム（トルイジンブルーＯとしても既知）より選択される。

本発明の好適な化合物は、本明細書に記載されるアッセイにおいて、高い活性を示す化合物である。

凝集の阻害
本発明のすべての治療的および他の局面において、ジアミノフェノチアジンが実質的に酸化された形態、例えば少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％の酸化形であることが好ましい。

したがって、本発明の第１の態様において、例えば細胞においてシヌクレイン、特にα−シヌクレインの凝集を阻害するためのジアミノフェンチアジンの使用を開示する。

凝集は、神経変性および／または臨床的認知症として表される疾患状態の状況においてでありうる。

別の態様において、本発明は、ヒトまたは動物の体の処置または治療方法での、例えばシヌクレイン、特にα−シヌクレインの凝集に関連する神経変性疾患および／または臨床的認知症の処置または予防の方法での使用のためにジアミノフェノチアジンを提供する。

別の態様において、本発明は、シヌクレイン、特にα−シヌクレインの凝集であって、神経変性および／または臨床的認知症として表される疾患状態に関連する凝集を阻害する薬剤、例えばシヌクレイン凝集に関連する神経変性疾患および／または臨床的認知症の処置または予防のための薬剤の製造におけるアミノフェノチアジンの使用を提供する。

別の態様において、本発明は、シヌクレイン、特にα−シヌクレインの凝集に関連する神経変性疾患および／または臨床的認知症の処置または予防の方法であって、シヌクレインの凝集を阻害するために、ジアミノフェノチアジン、またはそれを含む治療組成物の予防的または治療的有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。

別の態様において、本発明は、哺乳類の脳においてシヌクレイン、特にα−シヌクレインの凝集であって、後述するような疾患状態に関連する凝集を調節する方法を提供し、該処置はその処置が必要な前記哺乳類にジアミノフェノチアジンの予防的または治療的有効量を投与する工程を含む。

別の態様において、本発明は、哺乳類の脳におけるシヌクレイン、特にα−シヌクレイン凝集体の産生を阻害する方法を提供し、該処置は上記のとおりである。

別の態様において、本発明は、シヌクレイン、特にα−シヌクレイン凝集に関連する疾患の、それに罹患した哺乳類における処置のための薬物製品を提供し、該薬物製品は、薬物製品が前記疾患の処置用であることがラベル表示された、またはそのことを示すラベルが付いた容器を含み、該容器は、少なくとも１つの製薬的に許容される賦形剤と、活性成分としての、上に記載されたものより選択される単離された純ジアミノフェノチアジン化合物を含む１つ以上の投薬単位を含有する。

ジアミノフェノチアジンは、処置される状態または疾患に応じて、単独で、あるいは他の処置と同時にまたは連続的のいずれかで組合せて投与されうる。特に、関連するタンパク質凝集反応の他の阻害物質と共にジアミノフェノチアジンを使用または処方することが望ましいことがある。

好ましい組合せは、上述のジアミノフェノチアジン化合物のいずれか１つ以上と、処置される哺乳類のドーパミンレベルを調節する化合物である。このようなさらなる化合物としては、ｌｅｖｏ−ＤＯＰＡおよびドーパミン作動性アゴニスト、例えばロピニロールが挙げられる（例えば、Olanow, C.W. 2004, The scientific basis for the current treatment of Parkinson's disease, Ann. Rev. Med. 55:41-60を参照）。

それぞれの場合、哺乳類は好ましくはヒトである。

リガンド
α−シヌクレインの凝集を阻害できる、本明細書で考察されるジアミノフェノチアジン化合物は、α−シヌクレイン（または凝集α−シヌクレイン）のリガンドまたは標識として作用することもできるだろう。したがって、一実施形態において、ジアミノフェノチアジン化合物はリガンド、例えばシヌクレイン（または凝集シヌクレイン）、特にα−シヌクレインのリガンドである。

このようなジアミノフェノチアジン化合物（リガンド）は、他の化学基、例えば検出可能な標識、例えば安定および不安定な検出可能同位体、放射性同位体、陽電子放出原子、磁気共鳴標識、染料、蛍光マーカー、抗原基、治療部分、または予後、診断または治療用途を補助しうる他のいずれの部分を包含しうる、それらにコンジュゲートされうる、それらによってキレート化されうる、またはそうでなければそれらと結合しうることができる。

例えば、一実施形態において、ジアミノフェノチアジン化合物は、上で定義したとおりであるが、化合物が１つ以上（例えば１、２、３、４など）の同位体、放射性同位体、陽電子放出原子、磁気共鳴標識、染料、蛍光マーカー、抗原基、または治療部分を包含する、それらにコンジュゲートされる、それらによってキレート化される、またはそうでなければそれらと結合されるというさらなる制限を伴う。

一実施形態において、ジアミノフェノチアジン化合物は、標識、例えばα−シヌクレイン（または凝集α−シヌクレイン）の標識であるのと同様にリガンドであり、１つ以上の（例えば１、２、３、４など）の検出可能な標識を包含する、それらにコンジュゲートされる、それらによってキレート化される、またはそうでなければそれらと結合される。

例えば、一実施形態において、ジアミノフェノチアジン化合物は、上で定義したとおりであるが、化合物が１つ以上（例えば１、２、３、４など）の検出可能な標識を包含する、それらにコンジュゲートされる、それらによってキレート化される、またはそうでなければそれらと結合されるというさらなる制限を伴う。

一実施形態において、検出可能な標識は、安定な検出可能な同位体、不安定な検出可能な同位体、放射性同位体（例えば^９９Ｔｃ）、陽電子放出原子（例えば^１１Ｃ、^１８Ｆ）、磁気共鳴標識（例えば^１９Ｆ）、染料、蛍光基、または抗原基であるか、またはそれを包含する。

標識ジアミノフェノチアジン化合物（例えば、α−シヌクレインまたは凝集α−シヌクレインに結合したとき）は、いずれの適切な手段によっても描出または検出されて、当業者は、当分野で既知であるようないずれの適切な検出手段も使用されうることを理解するであろう。

例えば、ジアミノフェノチアジン化合物（リガンド標識）は、陽電子放出原子（例えば、^１１Ｃ）（例えば、１個以上のアルキル基置換基、例えば、メチル基置換基の炭素原子として）を包含して、当分野で既知であるように陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）を使用して化合物を検出することによって、適切に検出されうる。

例えば、一実施形態においてジアミノフェノチアジン化合物は、上のように定義されるが、ジアミノフェノチアジン化合物の環原子炭素の少なくとも１つ（例えば１、２、３、４など）が陽電子放出炭素原子、例えば^１１Ｃであり；および／または置換基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^３ＮＡ、Ｒ^３ＮＢ、Ｒ^３ＮＣ、Ｒ^７ＮＡ、Ｒ^７ＮＢ、Ｒ^７ＮＣ、およびＲ^N１０の少なくとも１つ（例えば１、２、３、４など）の炭素原子の少なくとも１つ（例えば１、２、３、４など）が陽電子放出炭素原子、例えば^１１Ｃであるというさらなる制限を伴う。

一実施形態において、置換基Ｒ^３ＮＡ、Ｒ^３ＮＢ、Ｒ^３ＮＣ、Ｒ^７ＮＡ、Ｒ^７ＮＢ、およびＲ^７ＮＣの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４など）の炭素原子の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４など）は、陽電子放出炭素原子、例えば^１１Ｃである。

一実施形態において、置換基Ｒ^３ＮＡ、Ｒ^３ＮＢ、Ｒ^３ＮＣ、Ｒ^７ＮＡ、Ｒ^７ＮＢ、およびＲ^７ＮＣの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４など）は、−^１１ＣＨ_３である。

このようなジアミノフェノチアジン化合物の例（すなわち、ＰＥＴによって検出可能な陽電子放出原子を包含する）は、以下を含む：

これらのおよび同様の^１１Ｃ標識ジアミノフェノチアジンを調製する適切な方法は、例えばＷＯ ０２／０７５３１８（図１１ａ、１１ｂ、１２を参照）およびＷＯ ２００５／０３０６７６に示されている。

あるいは、またはさらに、ジアミノフェノチアジン化合物は、検出可能な標識（例えば、放射性同位体、例えば^９９Ｔｃ）にキレートされるキレート基（例えば、錯体またはキレート形成によって別の分子または原子またはイオンへのコンジュゲーションに適切な部分）（例えば、放射性同位体キレート基、例えば、テクネチウムキレート基、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸基）にコンジュゲートされうる。

例えば、一実施形態において、ジアミノフェノチアジン化合物は、上で定義したとおりであるが、置換基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^３ＮＡ、Ｒ^３ＮＢ、Ｒ^３ＮＣ、Ｒ^７ＮＡ、Ｒ^７ＮＢ、Ｒ^７ＮＣ、およびＲ^N１０の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４など）が、検出可能な標識（例えば、放射性同位体、例えば、^９９Ｔｃ）をキレート化できるキレート基（例えば、テクネチウムキレート基、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸基）である、またはそれを包含するというさらなる制限を伴う。

あるいは、またはさらに、ジアミノフェノチアジン化合物は、磁気共鳴標識（例えば、^１９Ｆ）を包含することができるので、ＭＲＩ撮像に適切でありうる（例えば、Higuchi et al. Nat Neurosci. 2005 Apr; 8(4):527-33を参照）。

例えば、一実施形態において、ジアミノフェノチアジン化合物は、上で定義したとおりであるが、置換基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^３ＮＡ、Ｒ^３ＮＢ、Ｒ^３ＮＣ、Ｒ^７ＮＡ、Ｒ^７ＮＢ、Ｒ^７ＮＣ、およびＲ^N１０の少なくとも１つ（例えば１、２、３、４など）が、磁気共鳴標識（例えば、^１９Ｆ、例えば、−^１９Ｆ、−Ｃ（^１９Ｆ）_３など）である、またはそれを包含するというさらなる制限を伴う。

したがって、一態様において、本発明は、シヌクレイン（または凝集シヌクレイン）に検出可能な標識を包含する、それにコンジュゲートされた、それによってキレート化された、またはそうでなければそれと結合したジアミノフェノチアジン化合物を接触させる工程を含む、シヌクレイン（または凝集シヌクレイン）、特にα−シヌクレインを標識する方法を提供する。

別の態様において、本発明は、シヌクレイン（または凝集シヌクレイン）に検出可能な標識を包含する、それにコンジュゲートされた、それによってキレート化された、またはそうでなければそれと結合したジアミノフェノチアジン化合物を接触させる工程と、シヌクレイン（または凝集シヌクレイン）に結合した前記化合物の存在および／または量を検出する工程とを含む、シヌクレイン（または凝集シヌクレイン）、特にα−シヌクレインを検出する方法を提供する。

別の態様において、本発明は、シヌクレイノパシーに罹患したと考えられる対象（患者）における、シヌクレイノパシーの診断または予後評価の方法であって、
（ｉ）対象に、シヌクレインまたは凝集シヌクレイン、特にα−シヌクレインを標識できるジアミノフェノチアジン化合物（例えば、検出可能な標識を包含する、それにコンジュゲートされた、それによってキレート化された、またはそうでなければそれに結合されたジアミノフェノチアジン化合物）を導入する工程と、
（ｉｉ）対象の脳内でシヌクレインまたは凝集シヌクレインに結合した前記化合物の存在および／または量を決定する工程と；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で行った決定の結果を対象の疾患状態と相関させる工程と、
を含む方法を提供する。

別の態様において、本発明は、シヌクレイノシーの診断または予後評価の方法で使用するための、シヌクレインまたは凝集シヌクレイン、特にα−シヌクレインを標識できるジアミノフェノチアジン化合物（例えば、検出可能な標識を包含する、それにコンジュゲートされた、それによってキレート化された、またはそうでなければそれと結合したジアミノフェノチアジン化合物）を提供する。

別の態様において、本発明は、シヌクレイノパシーの診断または予後の方法で使用するための診断または予後試薬の製造方法における、シヌクレインまたは凝集シヌクレイン、特にα−シヌクレインを標識できるジアミノフェノチアジン化合物（例えば、検出可能な標識を包含する、それにコンジュゲートされた、それによってキレート化された、またはそうでなければそれと結合したジアミノフェノチアジン化合物）の使用を提供する。

当業者は、ジアミノフェノチアジンリガンド／標識を直接投与する代わりに、同じ対象に存在する、または同じ対象に投与される活性剤による活性形（例えば結合形、標識形）への変換のために、それらが前駆体の形態で投与されうることを理解するであろう。

疾患
本発明が関与する疾患状態は、シヌクレイノパシーである。

当業者が認識しているように、シヌクレイノパシーという用語は、ニューロンおよびグリアの選択的集合の細胞質において、特にシヌクレイン含有包含物の存在が疾患にとって疾病特徴的である、シヌクレインタンパク質、特にα−シヌクレインの線維状凝集体により特徴付けされる神経変性障害の群を名づけるために使用される。

これは、シヌクレイン含有包含物が他の病状に加えて存在する、または存在しない非シヌクレイノパシー障害とは区別されるべきである。

シヌクレイノパシーは現在、以下の障害、すなわちパーキンソン病（ＰＤ）、レビ小体による認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、薬物誘発パーキンソニズム（例えば１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン［ＭＰＴＰ］またはロテノンなどの殺虫剤によって生じる）、および純粋自律神経不全（ＰＡＦ）より成る。

レビ小体が見出されうる非シヌクレイノパシー障害は、以下、すなわちアルツハイマー病、ピック／前頭側頭認知症、クロイツフェルト−ヤコブ病、毛細血管拡張性運動失調、大脳皮質基底核変性症、ジストニア、進行性核上性麻痺、神経軸索ジストロフィー、亜急性硬化性汎脳炎、筋萎縮性側索硬化症、ＡＬＳ認知症グアム合併症（ALS-dementia Guam complex）、メージュ症候群およびハレルフォルデン−シュパッツ病（ＨＳＤ）（脳内鉄による神経変性）を含む。ＬＢは、多様な神経変性疾患において普通に発生する。研究は、神経ＬＢ中のα−シヌクレインの原線維の形態が、根底にある疾患とは無関係に基本的な類似性を示すことを指摘している。

パーキンソン病は、ＭＳＡ（１００，０００あたり４）と比較して、高い罹患率（１００，０００あたり約１００）を有する。

ＤＬＢは、以前存在した他の複数のものを含む共通名として採用された（McKeith, I. G. et al. (1996). "Consensus guidelines for the clinical and pathologic diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB): report of the consortium on DLB international workshop. Neurology, 47, 1113-1124."Neurology 47: 1113-1124）。これらは、レビ小体型の老年性認知症、アルツハイマー病のレビ小体変形、皮質性レビ小体認知症およびレビ小体認知症を含む。ＭＳＡは、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症および線条体黒質変性症を含む。ＤＬＢは、アルツハイマー病の次に、高齢者において２番目に一般的な認知症の形であると報告されている。

パーキンソン病は、黒質におけるＬＢを特徴とするが、それらは皮質にも見出されうる。ＤＬＢは、皮質ＬＢのより頻繁な発生を特徴とする。ＭＳＡでは、グリア細胞質封入体（ＧＣＩ）と呼ばれる線維状封入体が、主に乏突起膠細胞に見出される。ＬＢの成分フィラメントの性質は、２つの知見が主成分を確証する１９９７年まで不明であった：（ｉ）α−シヌクレインのミスセンス突然変異が、まれな型の家族性ＰＤを引き起こすことが見出された（Polymeropoulos, M. H. et al. (1997). "Mutation in the α-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease." Science 276: 2045-2047）および（ｉｉ）特発性ＰＤおよびＤＬＢにおけるＬＢおよびＬＮは、α−シヌクレインに対して免疫反応性であることが見出された（Spillantini, M. G. et al. (1997). "α-Synuclein in Lewy bodies." Nature 388: 839-840）。組み換えα−シヌクレインは、生体外でフィラメントを形成しうる。該タンパク質は、自然のままの折り畳まれていないタンパク質である。それが凝集する疾患において、それはβ−シート構造の原線維を形成する。

好ましくは、本発明の化合物は、ＰＤ、ＰＡＦ、ＭＳＡおよびＨＳＤより選択されるシヌクレイノパシーに関して使用される。

対象の選択
本明細書で開示するリガンドは、診断または予後の方法の一部として使用されうる。それは処置のための患者を選択するために、あるいは対象に投与された処置または治療薬、例えば、α−シヌクレイン関連の阻害物質の有効性を評価するために使用される。

方法に適切な対象は、従来の因子に基づいて選択されうる。したがって、患者の初期の選択は、経験のある臨床医による厳密な評価；補助研究所および他の調査によって可能である限り、非ＡＤ診断の除外；神経病理学的に検証されたバッテリを使用する認知機能のレベルの客観的評価のいずれか１つ以上を含みうる。

投薬単位、化合物の製剤および投与
本明細書に記載する化合物、組成物または薬剤の投与は、好ましくは「予防的有効量」または「治療的有効量」であり（場合によっては、予防が治療と見なされうるが）、これは個体への利点を示すのに十分である。

リガンドでは、量は、シヌクレイノパシーに罹患している患者において検出可能な結合を生じさせるであろう診断的有効量となるであろう。

薬剤では、実際の投与量、ならびに投与の速度および時間経過は、処置される疾患の性質および重症度によるであろう。処置の処方、例えば投薬量などの決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および開業医に既知の他の因子を考慮に入れる。

典型的には、哺乳類はヒトであるが、動物での使用（例えば試験目的、または動物治療目的で）も本発明に含まれる。

本発明のフェノチアジンの例は当分野で既知であり、標準テキストで言及されるプロセスによって製造されうる（例えば、Merck Manual, Houben-Weyl, Beilstein E III/IV 27, 1214 ff, J. Heterocycl. Chem 21, 613 (1984)など）。上の式の化合物、その製薬的に許容される塩、または提供されたアッセイで定義される特性を有する他の化合物は、（例えば、製薬調製物の形での）毒性についてのさらなる試験の後に、薬剤として使用されうる。

メトヘモグロビン血症の処置および躁うつ病の予防を含む、広範囲の医療適応症でのメチレンブルーの従来の製薬的使用が記載されており（Naylor (1986) Biol. Psychiatry 21, 915-920）、全身投与後のＣＮＳ侵入について記載されている（Muller (1992) Acta Anat., 144, 39-44）。アズールＡおよびＢの産生は、メチレンブルーの正常な代謝分解生成物として発生する（Disanto and Wagner (1972a) J. Pharm. Sci. 61, 598-602; Disanto and Wagner (1972b) J. Pharm. Sci. 61 1086-1094）。薬剤の投与は非経口的に、例えば、経口的に錠剤、コーティング錠、糖衣錠、硬および軟ゼラチンカプセル剤、液剤、エマルジョン剤または懸濁剤の形で）、経鼻的に（例えば、鼻腔用スプレーの形で）または経直腸的に（例えば、坐剤の形）で実施されうる。しかしながら、投与は、非経口的に、例えば筋肉内または静脈内に（例えば、注射液剤の形）も実施されうる。

組成物は、上の構成成分に加えて、製薬的に許容される賦形剤、保存剤、可溶化剤、増粘物質、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、着香料、浸透圧を変化させるための塩、緩衝剤、またはコーティング剤を含みうる。このような物質は非毒性であるべきであり、有効成分の有効性を妨害すべきではない。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路によって変化しうる。技法およびプロトコルの例は、"Remington's Pharmaceutical Sciences", 16^th edition, Osol, A. (ed.), 1980に見出すことができる。

組成物が、製薬組成物に処方される場合、その投与は非経口的に、例えば経口的に粉剤、錠剤、コーティング錠、糖衣錠、硬および軟ゼラチンカプセル剤、液剤、エマルジョン剤または懸濁剤の形で、経鼻的に（例えば、鼻腔用スプレーの形で）または経直腸的に（例えば、坐剤の形）実施されうる。しかしながら、投与は、非経口的に、例えば筋肉内に、静脈内に、皮膚に、皮下的に、または腹腔内に（例えば注射液剤の形で）も実施されうる。

したがって、例えば、製薬組成物が錠剤の形である場合、それはゼラチンまたは補助剤などの固体担体を含みうる。錠剤、コーティング錠、糖衣錠および硬ゼラチンカプセルの製造では、活性化合物およびその製薬的に許容される酸付加塩は、製薬的に不活性な無機または有機賦形剤と共に加工されうる。ラクトース、トウモロコシ、デンプンまたはその誘導体、タルク、ステアリン酸またはその塩などは、例えば、錠剤、糖衣錠および硬ゼラチンカプセル剤のこのような賦形剤として使用されうる。軟ゼラチンカプセルの適切な賦形剤は、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固体および液体ポリオールなどである。組成物が液体製薬製剤の形であるとき、それは一般に水、石油、動物または植物油、鉱油または合成油のような液体担体を含むであろう。生理食塩溶液、デキストロースまたは他のサッカライド溶液あるいはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールも含まれうる。液剤およびシロップ剤製造用の適切な賦形剤は例えば、水、ポリオール、スクロース、転化糖、グルコース、トリハロースなどである。注射用液剤に適切な賦形剤は、例えば水、アルコール、ポリオール、グリセロールおよび植物油などである。静脈内、皮膚または皮下注射、あるいは脳へのカテーテル内輸液では、有効成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形であろう。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸加リンガー注射液などの、等張性ビヒクルを使用する適切な液剤を十分に調製することができる。保存料、安定剤、緩衝剤および／または他の添加剤は、必要に応じて含まれうる。

本明細書において、リガンドとしての化合物の使用は、同様の担体または組成物を利用しうる。

したがって、ジアミノフェノチアジン（例えば、ＭＴＣ）がヒトまたは動物の体の処置または治療方法で使用される本発明の態様において、その方法は好ましくは、ジアミノフェノチアジンの有効量の経口での投与を包含するであろう。

好ましくは、薬剤は経口投与に適しており、好ましくは固体投薬単位形である。

好ましくは、投薬量は経口投与されるであろう。好ましくは、投薬量は４００、３００、２００、または１００mgの１日総用量に等しいか、それ未満であろう。例えば、投薬量は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６０、８０、９０、１００、１１０、１２０、または１３０mg t.i.d.（１日３回）の投薬単位より成りうる。

あるいはまた、投薬量は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００mg b.i.d.（１日２回）より成りうる。

好ましくは、処置は少なくとも２、３、または４週間以上継続される。

これらの投薬量に関する説明書は、書面の形で本発明の薬物製品の容器の表面または内部に含まれうる。

投薬が静脈内である場合、ジアミノフェノチアジンがＭＴＣでないことが好ましい。

本明細書で行ういずれの相互参照の開示も、本開示を補足するために当業者によって必要とされる限り、本明細書によって特に本明細書に組み入れられる。

本発明はここで、以下の非制限的な図面および実施例を参照して更に説明されるであろう。これらに照らして、本発明の他の実施形態を当業者は思い付くであろう。

実施例
化学的合成

以下の合成は、例示の目的のためのみに提供され、本明細書で記載されたように、本発明の範囲を限定することを意図しない。

合成１
エチル−チオニニウムクロリド（ＥＴＣ）

Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン（５ｇ、３０．４mmol）を、ジエチルエーテル（２５cm^３）に溶解し、塩酸（６cm^３、１０Ｍ）を加え、混合物を濃縮して、赤色／褐色の固体として標記化合物（７．２２ｇ、１００％）を得た。δ_H(250 MHz; D₂O): 7.68 (4H, m, ArH), 3.69 (4H, q, 7.32, NCH₂), 1.11 (6H, t, 7.32, CH₃); δ_C (62.9 MHz; D₂O): 12.1 (CH₃), 56.4 (NCH₂), 126.8 (ArC), 127.6 (ArC), 135.5 (ArC), 139.1 (ArC)。

エチル−チオニニウムクロリド
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩（７．２２ｇ、３０．４mmol）を、水（２５０cm^３）に溶解し、ｐＨをＨＣｌで１．６に調整し、硫化ナトリウム（＞６０％）（３．９５ｇ、３０．４mmol）を分けて加えた。懸濁液を、硫化ナトリウムがすべて溶解するまで撹拌した。水（２００cm^３）中の塩化鉄（III）（２７．１５ｇ、１００mmol）の溶液を調製して、溶液の半分を混合物に加えた。明黄色から青色に即時の色変化が生じた。次に、残りの塩化鉄（III）溶液を加える前に、溶液を１時間通気した。混合物を５℃に冷却し、濾過し、明緑色のスラッジを除去した。ＨＣｌ水溶液（１５cm^３、６Ｍ）を濾液、続けて塩化ナトリウム（６０ｇ）に加えて、濾過する前に懸濁液を５分間撹拌して、固体の生成物を得て、それをＤＣＭに溶解し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮して、紫色／緑色の固体（１．２８ｇ、２２％）を得た。この紫色／緑色の固体を分取Ｃ１８逆相カラム上に乗せて、水（１Ｌ）で、または黄色が消えるまで洗浄した。生成物をＭｅＯＨ／ＨＣｌ（ｐＨ２）でカラムから洗浄し、濃縮して、粘着性状の紫色の固体として標記化合物（０．６４ｇ、１１％）を得た。δ_H (250 MHz; D₂O): 1.26(12H, t, 6.5, CH₃), 3.56 (8H, q, 6.5, NCH₂), 7.01 (2H, s, ArH), 7.20 (2H, d, 9.25, ArH), 7.54 (2H, d, 9.25, ArH); m/z (ESI) 340.2 (100%, [M-Cl]⁺)。

合成２
１，９−ジメチル−メチル−チオニニウムクロリド（ＤＭＭＴＣ）

３−メチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルフェニレンジアミン二塩酸塩
２５０cm^３丸底フラスコに、水（１００cm^３）を加えて、温度を氷浴で５℃に下げた。この冷却された溶液に、注意深く硫酸（９８％、２２．５ｇ）を加えた。この溶液に、３−メチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（１０ｇ、７４mmol）、次に亜硝酸ナトリウム（５．６ｇ、８１．４mmol）を加えて、溶液を室温で１時間撹拌した。鉄（Ｆｅ）くず（１２．８ｇ、２２９mmol）を加えて、混合物をさらに２時間撹拌した。溶液を濾過し、次に飽和炭酸水素ナトリウム溶液で中和し、有機物を酢酸エチル（３ｘ１００cm^３）中に抽出した。抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮して、褐色の油状物を得た。油状物をジエチルエーテル（１００cm^３）に溶解し、濃塩酸（５０cm^３）を加えた。溶液を蒸発乾固して、明黄褐色の固体として標記化合物（１０ｇ、６０％）を得た。ν_max (KBr)/cm^-1: 2849 (CH), 2821 (CH), 2543 (CH), 2444 (CH), 1586 (C=N), 1487 (CH), 1445 (CH), 1415 (CH), 1138 (CH); δ_H (250 MHz; D₂O): 7.59 (1H, s, ArH), 7.50 (2H, s, ArH), 3.24 (6H, s, CH₃), 2.39 (3H, s, CH₃); d_C(62.9 MHz; D₂O) 18.9 (CH₃), 48.8 (CH₃), 122.1 (ArC), 126.2 (ArC), 127.6 (ArC), 133.7 (ArC), 137.4 (ArC), 144.4 (ArC)。

ジメチルメチルチオニニウムクロリド
５００cm^３丸底フラスコに、３−メチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−フェニレン−ジアミン二塩酸塩（０．９ｇ、４．０３mmol）を加え、それを、硫化ナトリウム（＞６０％）（０．５２ｇ、４．０３mmol）を加える前に塩酸水溶液（５０cm^３、３Ｍ）に溶解した。塩化鉄（III）六水和物（７．２６ｇ、２７mmol）を水（５０cm^３）に溶解し、この溶液の半分を反応混合物に注ぐと、即時に青色を呈した。次に、残りの塩化鉄（III）水溶液を加える前に、溶液を２時間通気した。混合物を５℃に冷却し、濾過した；沈殿物を沸騰水（６０cm^３）に溶解し、濾過し、冷却した。塩酸（１０cm^３、６Ｍ）を、冷却した溶液に加え、次にそれを濾過し、紫色／青色の固体として標記化合物（０．２２ｇ、１６％）を得た。ν_max (KBr)/cm^-1: 2926 (CH), 1604 (C=N), 1535, 1496, 1444 (CH), 1404 (CH), 1315 (CH), 1185 (CH);δ_H (250 MHz; DMSO): 7.29 (2H, s, ArH), 7.23 (2H, s, ArH), 3.29 (12H, s, CH₃), 2.55 (6H, s, CH₃); δ_C (62.9 MHz; DMSO): 18.9 (CH₃), 41.5 (CH₃), 105.7 (ArC), 118.7 (ArC), 133.6 (ArC), 134.5 (ArC), 147.2 (ArC), 154.2 (ArC); 分析、C₁₈H₂₂N₃S.3H₂Oとしての計算値: C, 51.98; H, 6.74; N, 10.11; S, 7.70. 実測値: C, 52.03; H, 6.59; N, 10.05; S, 7.66.

合成３
１，９−ジエチル−メチル−チオニニウムクロリド（ＤＥＭＴＣ）

Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−エチルアニリン
１００cm^３丸底フラスコに、３−エチルアニリン（１０ｇ、８２．５mmol）、エタノール（１５cm^３）、炭酸ナトリウム（１１．８１ｇ、１１１．４mmol）を加えた。ヨウ化メチル（３１．６３ｇ、２２２mmol）を滴下した。次に、混合物を４５℃で１０時間加熱してから、室温に冷却して水（１００cm^３）を加えた。混合物をジエチルエーテル中に抽出して（３ｘ１００cm^３）、抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮し、明黄色の油状物として標記化合物（４．６８ｇ、３８％）を得た。ν_max (neat)/cm^-1: 3045 (CH), 2960 (CH), 2920 (CH), 2891 (CH), 2797 (CH), 1597 (C=N), 1494 (CH), 1438 (CH), 1352 (CH), 1225 (CH);δ_H (250 MHz; CDCl₃): 7.22 (1H, t, 7.75, ArH), 6.63 (3H, m, ArH), 2.97 (6H, s, NCH₃), 2.63 (2H, q, 7.5, CH₂), 1.27 (3H, t, 7.5, CH₃);δ_C (62.9 MHz; CDCl₃): 15.8 (CH₃ ), 29.5 (NCH₂), 40.8 (NCH₃ ), 110.3 (ArC), 112.4 (ArC), 116.5 (ArC), 129.1 (ArC), 145.3 (ArC), 150.9 (ArC).

Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−エチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩
２５０cm^３丸底フラスコに、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−エチルアニリン（４．６８ｇ、３１．３mmol）、水（１００cm^３）および塩酸（８．５cm^３、３７％）を加え、溶液を５℃に冷却した。次に、亜硝酸ナトリウム（２．４６ｇ、３．５７mmol）の水溶液（８０cm^３）を、アニリン混合物に滴下して、３時間室温で撹拌した。鉄（Ｆｅ）くず（５．２４ｇ、９４mmol）および塩酸（８．５cm^３、３７％）を加え、混合物を室温で３時間撹拌した。懸濁液を濾過し、濾液を重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ７に調整してから酢酸エチル（３ｘ５０cm^３）中に抽出した。合わせた抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮して、褐色の油状物を得た。油状物をエタノール（１００cm^３）およびジエチルエーテル（８０cm^３）に溶解し、塩酸（７cm^３、３７％）を注意深く加え、明黄褐色の固体として標記化合物（７．４２ｇ、７２％）を得た。ν_max (KBr)/cm^-1: 2976 (CH), 2894 (CH), 2859 (CH), 2753 (CH), 1583 (C=N), 1508 (CH), 1486 (CH), 1459 (CH), 1183 (CH);δ_H (250 MHz; D₂O): 7.66 (1H, s, ArH), 7.56 (2H, s, ArH), 3.29 (6H, s, NCH₃), 2.74 (2H, q, 7.5, CH₂), 1.25 (3H, t, 7.5, CH₃);δ_C (62.9 MHz; CDCl₃): 15.5 (CH₃) 25.6 (NCH₂), 48.9 (NCH₃), 122.1 (ArC), 124.6 (ArC), 128.1 (ArC), 132.6 (ArC), 143.3 (ArC), 144.9 (ArC).

１，９−ジエチルメチルチオニニウムクロリド
Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−エチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩（１．３ｇ、５．５mmol）を水（５０cm^３）に溶解し、溶液をｐＨ１．６に調整した。次に、硫化ナトリウム＞６０％（０．７１ｇ、５．５mmol）をピンク色の溶液に分けて加えた。懸濁液に、塩化鉄（III）の水溶液（２．２３ｇ、水５０cm^３中に８．２mmol）を加えると、紫色に即時の色変化をした。次に、塩化鉄（III）溶液（２．２３ｇ、水５０cm^３中に８．２mmol）の第二の分割量を加える前に、溶液を１時間通気した。濾過および水で沈殿物を洗浄する前に、溶液を５℃に冷却した。濾液に塩化ナトリウム（５０ｇ）を加え、溶液を１０分間撹拌し、生成物が塩析されるにつれて、溶液の色は赤色／紫色に変化した。懸濁液を濾過し、硫酸マグネシウム上で乾燥する前に、固体をジクロロメタン（１００cm^３）およびメタノール（１０cm^３）に溶解した。濾過し、濃縮すると、緑色の固体として標記化合物（０．１５ｇ、１５％）を得た。ν_max (KBr)/cm^-1: 3408 (CH), 2613 (CH), 1606 (C=N), 1399 (CH), 1316 (CH);δ_H (250 MHz; D₂O): 6.55 (2H, s, ArH), 6.23 (2H, s, ArH), 2.92 (12H, s, NCH₃), 2.56 (4H, q, 7.5, CH₂), 0.99 (6H, t, 7.5, CH₃); (ESI), 340.4 (100%, [M - Cl]⁺)。場合により、溶離液として１０％メタノール：９０％ジクロロメタンと、シリカ４０−６３μ ６０Åを使用して、フラッシュカラムクロマトグラフィーを行って塩化鉄残留物を除去した。

合成４
１，９−ジメチル−エチル−チオニニウムクロリド（ＤＭＥＴＣ）

Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−メチル−４−フェニレンジアミン二塩酸塩（１０．７４ｇ、５０mmol）を水（４００cm^３）に溶解し、ｐＨを１．６に調整し、次にそれを硫化ナトリウム（＞６０％）（３．９０ｇ、５０mmol）に加えた。塩化鉄（III）（２０．２８ｇ、７５mmol）を水溶液（１７５cm^３）として加えると、黄色から深青色に即時の色変化が得られた。混合物を１時間通気してから、塩化鉄（III）水溶液（２０．２８ｇ、１７５cm^３中７５mmol）の第二のアリコートを加えた。濾過の前に、溶液を５℃に冷却して、その温度で１時間維持した。濾液に塩化ナトリウム（２００ｇ）を加え、濾過して、青色／紫色の固体として粗生成物を得た。粗固体をカラムクロマトグラフィーにより精製して（溶離液は、１０％ ＭｅＯＨ、９０％ ＤＣＭであり、シリカ４０−６３μ ６０Åを使用する）、緑色／紫色の固体として標記化合物（０．８０ｇ、４％）を得た。ν_max (KBr)/cm^-1: 2971 (CH), 2921 (CH), 2865 (CH), 1600 (C=N), 1412 (CH), 1326 (CH); δ_H (250 MHz; D₂O): 6.62 (2H, s, ArH), 6.39 (2H, s, ArH), 3.30 (8H, q, NCH₂), 1.89 (6H, s, ArCH₃), 1.09 (12H, t, CH₃);δ_C(62.9 MHz; D₂O) 12.6 (CH₃ ), 18.0 (CH₃), 46.2 (NCH₂), 103.6 (ArC), 117.1 (ArC), 132.3 (ArC), 133.9 (ArC), 147.3 (ArC), 151.9 (ArC); m/z (ESI) 368.1 (100%, [M-Cl]⁺).

合成５
１，９−ジエチル−エチル−チオニニウムクロリド（ＤＥＥＴＣ）

Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−エチルアニリン
１００cm^３丸底フラスコに、３−エチルアニリン（５．０ｇ、４１．３mmol）、エタノール（７．５cm^３）、炭酸ナトリウム（５．９ｇ、５５．７mmol）を加えた。ヨウ化エチル（１７．３８ｇ、１１１．４mmol）を滴下した。次に、混合物を４５℃で１２時間加熱した後、室温に冷却し、水（５０cm^３）を加えた。混合物をジエチルエーテル（３ｘ５０cm^３）中に抽出し、抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮し、明黄色の油状物として標記化合物（７．０３ｇ、９６％）を得た。δ_H (250 MHz; CDCl₃): 7.20 (1H, dd, 9, 7.25, ArH), 6.60 (3H, m, ArH), 3.43 (4H, q, 7, NCH₂), 2.69 (2H, q, 7.25, CH₂), 1.32 (3H, t, 7.5, CH₃), 1.23 (6H, t, 7, CH₃);δ_C (62.9 MHz; CDCl₃): 12.7 (CH₃ ), 15.8 (CH₃ ), 29.5 (CH₂), 44.4 (NCH₃ ), 109.4 (ArC), 111.4 (ArC), 115.1 (ArC), 129.2 (ArC), 145.4 (ArC), 147.9 (ArC).

Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−エチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩
２５０cm^３丸底フラスコに、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−エチルアニリン（５ｇ、２８．２mmol）、水（５０cm^３）および塩酸（９cm^３、３７％）を加え、溶液を５℃に冷却した。次に、亜硝酸ナトリウム（２．１４ｇ、３１．０mmol）の水溶液（２０cm^３）を、アニリン混合物に滴下し、１時間、低温度で撹拌した。鉄（Ｆｅ）くず（４．７２ｇ、８４．６mmol）および塩酸（９cm^３、３７％）を加え、混合物を３０℃以下で２時間撹拌した。懸濁液を濾過し、濾液を重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ７に調整した後、酢酸エチル（３ｘ５０cm^３）中に抽出した。合わせた抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮し、褐色の油状物を得た。粗油状物をカラムクロマトグラフィーにより精製して（溶離液は、酢酸エチルであり、シリカ４０−６３μ ６０Åを使用する）、褐色の油状物としてフェニレンジアミン（２．２ｇ、４１％）を得た。油状物をジエチルエーテル（５０cm^３）に溶解し、塩酸を加え（２．５cm^３、３７％）、溶液を濃縮し、明褐色の固体として標記化合物（２．７６ｇ、４１％）を得た。δ_H (250 MHz; D₂O): 7.50 (3H, m, ArH), 3.59 (4H, q, 7.25, NCH₂), 2.69 (2H, q, 7.5, CH₂), 1.20 (3H, t, 7.5, CH₃), 1.03 (6H, t, 7.25, CH₃); δ_C (62.9 MHz; D₂O): 12.1 (CH₃), 15.5 (CH₃), 25.5 (CH₂), 56.3 (NCH₂), 123.9 (ArC), 126.0 (ArC), 127.9 (ArC), 133.1 (ArC), 139.4 (ArC), 143.3 (ArC).

１，９−ジエチル−エチルチオニニウムクロリド
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−エチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩（２ｇ、７．５mmol）を水（７５cm^３）に溶解し、溶液をｐＨ１．６に調整した。次に、ピンク色の溶液を硫化ナトリウム（＞６０％）（１．３５ｇ、１０．４mmol）に分けて加えた。懸濁液に塩化鉄（III）（４．２２ｇ、水３５cm^３中１５．６mmol）の水溶液を加える場合には、紫色への即時の色変化があった。次に、溶液を１時間通気した後、塩化鉄（III）溶液（４．２２ｇ、水３５cm^３中１５．６mmol）の第二の分割量を加えた。溶液を５℃に冷却した後、濾過し、沈殿物を水で洗浄した。また、沈殿物をエタノールで洗浄し、エタノールを濃縮して、粘着性状の紫色の固体を得た。水溶性濾液に塩化ナトリウム（５０ｇ）を加え、溶液を１０分間撹拌し、それにより、生成物が塩析するにつれて、色が赤色／紫色に変化した。懸濁液を濾過し、固体がジクロロメタン（１００cm^３）およびメタノール（１０cm^３）に溶解した後に硫酸マグネシウム上で乾燥した。濾過し、エタノール可溶性生成物で濃縮し、紫色の固体として標記化合物（０．０６ｇ、３％）を得た。δ_H (250 MHz; D₂O): 6.73 (2H, s, ArH), 6.48 (2H, s, ArH), 3.45 (8H, brdq, NCH₂), 2.46 (4H, q, 7.5, CH₂), 1.17 (12H, brdt, CH₃), 0.93 (6H, t, 7.5, CH₃); m/z (ESI) 396.2 (100%, [M-Cl]⁺)。場合により、溶離液として１０％メタノール：９０％ジクロロメタンと、シリカ４０−６３μ ６０Åを使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーを行って塩化鉄残留物を除去した。

合成６
エチル−チオニニウムクロリド 塩化亜鉛 複塩（ＥＴＺ）

Ｈ_２Ｏ（１００cm^３）およびＨ_２ＳＯ_４（濃、「９８％」、１cm^３）中のＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン（５．０ｇ、３０．４mmol）の撹拌した混合物を、非還元ＺｎＣｌ_２溶液（ＺｎＣｌ_２、７．６０ｇ、Ｎａ_２Ｃｒ_２Ｏ_７・２Ｈ_２Ｏを伴うＨ_２Ｏ １５cm^３中の５５mmol、１００mg）で処理して、赤みを帯びた反応混合物を生成した。Ａｌ_２（ＳＯ_４）_３・１６Ｈ_２Ｏ溶液（５．８０ｇ、Ｈ_２Ｏ １０cm^３中９．２mmol）、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３・５Ｈ_２Ｏ溶液（８．０ｇ、Ｈ_２Ｏ １０cm^３中３２．２mmol）およびＮａ_２Ｃｒ_２Ｏ_７・２Ｈ_２Ｏ（８．７ｇ、Ｈ_２Ｏ １５cm^３中２９．２mmol）の１／３溶液を加え、その後温度を４０℃に迅速に上昇させた。Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンの溶液（３．０ｇ、濃ＨＣｌ中２０．１mmol、４cm^３）を加え、続けて残りのＮａ_２Ｃｒ_２Ｏ_７・２Ｈ_２Ｏ溶液を加えた。暗緑色の沈殿物が観察された。温度を急速に７５℃に上昇させ、その後、活性化されたＭｎＯ_２のスラリー（３．８０ｇ、Ｈ_２Ｏ ５cm^３中４４．７mmol）を加えた。温度を８５℃に上げて、その温度で３０分間撹拌した。沈殿物を伴う青色の溶液が観察された。反応混合物を５０℃に冷却し、Ｈ_２ＳＯ_４（濃、１１cm^３）をゆっくり加えた。反応物をさらに２０℃に冷却し、減圧濾過し、沈殿物を回収し、次にそれをブライン（飽和塩水）で洗浄した。この黒色の固体をＨ_２Ｏ（２５０cm^３）に１００℃で再溶解し、冷却し、続けて減圧濾過をして、不溶性物質を除去した。濾液をＺｎＣｌ_２（４ｇ）およびＮａＣｌ（２３ｇ）で処理し、冷蔵庫に１６時間放置し、その後、得られた沈殿物を減圧濾過により回収し、ブライン（３０cm^３）で洗浄し、減圧オーブン中で３時間乾燥し、さびた赤色の粉末として標記化合物（５．７ｇ、７１％）を得た。δ_H (250 MHz, D₂O): 1.20 (12H, br t, CH₃), 3.50 (8H, br q, CH₂), 6.80 (2H, s, ArH), 7.05 (2H, br d, ArH) 及び 7.30 (2H, br d, ArH).。例えば、Fierz-David and Blangley, 1949, "F. Oxazine and Thiazine Dyes," in: Fundamental Processes of Dye Chemistry, published by Interscience (London, UK), pp. 308-314を参照。

合成７
メチル−チオニニウムヨージド（ＭＴＩ）

メチル−チオニニウムクロリド（２．００ｇ、６．２５mmol）を水（５０cm^３）に溶解し、ヨウ化カリウム（１．５６ｇ、９．４mmol）を撹拌下加えた。沈殿物が形成され、それを濾過し、固体を沸騰水（５０cm^３）から再結晶して、微細な緑色の針状晶として標記化合物（１．９８ｇ、７７％）を得た。δ_H (250 MHz; DMSO): 7.88 (2H, br d, ArH), 7.49 (4H, br s, ArH), 3.37 (12H, s, CH₃)。Ｃ_１６Ｈ_１８Ｎ_３ＳＩについての分析値：C, 46.72; H, 4.41; N, 10.22; S, 7.80; I, 30,85；実測値：C, 46.30; H, 4.21; N, 10.14; S, 7.86; I, 29.34。

合成８
メチル−チオニニウムヨージド ヨウ化水素 混合塩（ＭＴＩ．ＨＩ）

メチル−チオニニウムヨージド（０．５０ｇ、１．２２mmol）をメタノール（２０cm^３）に溶解して、ヨウ化メチル（１．９０ｇ、１３．３７mmol）を撹拌下加えた。さらにヨウ化メチル（０．４２ｇ、６．６９mmol）を加える前に、混合物を１８時間加熱還流し、混合物を再度加熱還流し、８時間撹拌した。混合物を室温に冷却し、濾過し、個体を得たが、それをメタノールで洗浄して、青銅の緑色の固体として標記化合物（０．３０ｇ、４６％）を得た。δ_H (250 MHz; DMSO): 7.82 (2H, d, J = 8.5, ArH), 7.42 (4H, s, ArH), 3.34 (12H, s, CH₃). δ_C (62.9 MHz; DMSO): 153.8 (ArC), 137.9 (ArC), 134.9 (ArC), 133.5 (ArC), 119.1 (ArC), 118.8 (ArC), 106.9 (ArC), 106.6 (ArC), 41.1 (NCH₃).

合成９
エチル−チオニニウムヨージド（ＥＴＩ）

塩酸水溶液（０．５Ｍ、２００cm^３）中のＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン（１０．０ｇ、６１mmol）の撹拌した混合物を、水酸化ナトリウム水溶液（１０％）でｐＨ２に調整した。Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３．５Ｈ_２Ｏ水溶液（１６．６５ｇ、Ｈ_２Ｏ ２０cm^３中６７mmol）を加える前に、ジアミン溶液を５℃に冷却した。Ｎａ_２Ｃｒ_２Ｏ_７．２Ｈ_２Ｏの水溶液（７．２７ｇ、Ｈ_２Ｏ ３５cm^３中２４mmol）を混合物に１５分にわたって滴下して、黒色の懸濁液を得た。この懸濁液を５℃で１時間撹拌した（ｐＨ＝８．０７、Ｔ＝３．７℃）。懸濁液に加える前に、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン（８．２５ｇ、６１mmol）、Ｈ_２ＳＯ_４（６ｇ）および水（１０cm^３）の溶液を５℃に冷却した。次に、Ｎａ_２Ｃｒ_２Ｏ_７．２Ｈ_２Ｏの水溶液（１９．０９ｇ、Ｈ_２Ｏ ５０cm^３中６４mmol）を、２０分にわたって混合物に滴下して、濃い暗緑色の懸濁液を得た。濾過前に、混合物を５℃で２時間撹拌した（ｐＨ＝６．７５、Ｔ＝６°Ｃ）。得られた緑紫色の固体を水（２ｘ５０cm^３）で洗浄した。固体を塩酸水溶液（３００cm^３、ｐＨ２）中にスラリーにして、２２℃でｐＨ＝６．３７の懸濁液を得た。懸濁液にＣｕＳＯ_４（１．５２ｇ、６．１mmol）を加えて、混合物を９０℃に加熱すると、深青色の溶液を形成した。この温度で１時間撹拌後、混合物を２５℃に冷却して濾過した。固体を水（２ｘ５０cm^３）で洗浄し、濾液をＴ＝２５℃、塩酸（５Ｍ）で、ｐＨ６．３３からｐＨ２．００に調整した。深青色の溶液を８０℃に加熱し、ヨウ化カリウム（１４ｇ）を加え、冷却すると、橙紫色の沈殿物が沈殿した。濾過して紫色の粉末（８．８ｇ、３１％）を得て、それを熱エタノール（４００cm^３）から再結晶化して、微細な紫色の針状晶として標記化合物を得た。融点２１１℃；ν_max (KBr)/cm^-1: 3574 (CH), 3484 (CH), 3028 (CH), 2965 (CH), 1662 (C=C), 1539 (CH), 1474 (CH), 1346 (CH);δ_C (62.9 MHz, CDCl₃): 1.33 (12H, t, 7, CH₃), 3.72 (8H, q, 7, NCH₂), 7.23 (2H, d, 9.75, ArH), 7.41 (2H, s, ArH), 7.83 (2H, d, 9.75, ArH);δ_H (62.9 MHz, CDCl₃):152.4, 138.8, 135.7, 135.2, 118.3, 106.4, 46.8, 13.2.

合成１０
エチル−チオニニウムヨージド ヨウ化水素 混合塩（ＥＴＩ．ＨＩ）

エチル−チオニニウムヨージド（２．００ｇ、４．２８mmol）をエタノール（１００cm^３）に溶解し、ヨウ化エチル（２７．３５ｇ、１７５mmol）を撹拌下加えた。混合物を１８時間加熱還流し、次に室温に冷却し、沈殿物を得て、それを濾過し、エタノールで洗浄し、青銅色の固体として標記化合物（１．０２ｇ、４０％）を得た。δ_H (250 MHz; D₂O): 7.90 (2H, br d, ArH), 7.42 (4H, s, ArH), 2.45 (8H, br q, NCH₂), 1.23 (12H, br t, CH₃).

合成１１
エチル−チオニニウムニトラート（ＥＴＮ）

塩酸水溶液（０．５Ｍ、２００cm^３）中のＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン（１０．０ｇ、６１mmol）の撹拌した混合物を、水酸化ナトリウム水溶液（１０％）でｐＨ２に調整した。Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３・５Ｈ_２Ｏ水溶液（１６．６５ｇ、Ｈ_２Ｏ ２０cm^３中６７mmol）を加える前に、ジアミン溶液を５℃に冷却した。Ｎａ_２Ｃｒ_２Ｏ_７・２Ｈ_２Ｏの水溶液（７．２７ｇ、Ｈ_２Ｏ ３５cm^３中２４mmol）を混合物に１５分にわたって滴下して、黒色の懸濁液を得た。懸濁液を５℃で１時間撹拌した（ｐＨ＝８．０７、Ｔ＝３．７℃）。懸濁液に加える前に、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン（８．２５ｇ、６１mmol）、Ｈ_２ＳＯ_４（６ｇ）および水（１０cm^３）の溶液を５℃に冷却した。次に、Ｎａ_２Ｃｒ_２Ｏ_７・２Ｈ_２Ｏの水溶液（１９．０９ｇ、Ｈ_２Ｏ ５０cm^３中６４mmol）を、２０分にわたって混合物に滴下して、濃い暗緑色の懸濁液を得た。濾過前に、混合物を５℃で２時間撹拌した（ｐＨ＝６．７５、Ｔ＝６°Ｃ）。得られた緑紫色の固体を水（２ｘ５０cm^３）で洗浄した。固体を塩酸水溶液（３００cm^３、ｐＨ２）中にスラリーにして、２２℃でｐＨ＝６．３７である懸濁液を得た。懸濁液にＣｕＳＯ_４（１．５２ｇ、６．１mmol）を加え、混合物を９０℃に加熱すると、深青色の溶液を形成した。この温度で１時間撹拌後、混合物を２５℃に冷却して濾過した。固体を水（２ｘ５０cm^３）で洗浄し、濾液をＴ＝２５℃、塩酸（５Ｍ）で、ｐＨ６．３３からｐＨ２．００に調整した。深青色の溶液を８０℃に加熱し、硝酸ナトリウム（５０ｇ）を加え、穏やかに撹拌しながら２５℃にゆっくり冷却した。生成物を緑色の針状晶（６．８０ｇ、２８％）として濾過した。δ_H (250 MHz, CDCl₃): 1.36 (12H, t, 7, CH₃), 3.72 (8H, q, 7, NCH₂), 7.23 (2H, d, 9.5, ArH), 7.39 (2H, s, ArH), 7.89 (2H, d, 9.5, ArH); δ_H (62.9 MHz, CDCl₃): 152.5, 138.8, 135.7, 135.6, 118.1, 106.4, 46.6, 12.9.

生物学的試験
方法
α−シヌクレインタンパク質の精製
Ｅ．ｃｏｌｉでのα−シヌクレインの発現のために２つのプラスミドを構築した。α−シヌクレインのコア凝集ドメイン（アミノ酸３１〜１０９）は、Ｎｉキレート化カラムでの精製を可能にするＮ末端ポリヒスチジンタグ（ｔｓｙｎ）を用いて発現させた。全長α−シヌクレイン（ｓｙｎ）は、タグなしで発現させ、ＤＥＡＥセファロースでのイオン交換クロマトグラフィーで精製し、一部の場合ではその後、ＣＭ−セファロースでの精製を行った。どちらのタンパク質でも、３０〜５０％硫酸アンモニウムカットを取ることによって、最初に細菌抽出物を濃縮した。カラムから溶離したタンパク質を２０mM ＣＡＰＳ、ｐＨ９．５または２０mM Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０mM ＮａＣｌ（詳細については表１を参照）で透析し、−７０℃で貯蔵した。

フィラメント集合のための蛍光アッセイ
α−シヌクレインタンパク質（ｔｓｙｎまたはｆｓｙｎ）は、原線維形成を誘発するために混合しながら、図の凡例に示した回数で３７℃にてインキュベートした。一部の場合では、原線維形成を向上させるために５０μg／mlヘパリンを含めた。

サンプル１０μlを次に、一部の場合では１μM、または０．２または５μMのチオフラビンＴまたはプリムリンを加えて、水で１００μlに希釈した。蛍光励起スペクトルは、発光波長４８０nmで、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｅｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計によって９６ウェルプレートにて測定した。励起スペクトルは、ｔｓｙｎなしで測定したシグナルおよびスペクトルから測定したピークシグナルについて補正した。データは化合物なしで測定した値に正規化し、化合物の濃度に対して正規化された蛍光のプロットからＰ５０値を測定した。

シヌクレイン−シヌクレイン結合のＥＬＩＳＡアッセイ
固相アッセイを使用して、α−シヌクレインの自己会合を測定した。炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈したｔｓｙｎをアッセイプレートに結合させ、全長α−シヌクレイン（ｆｓｙｎ）を水相に添加した。水相結合緩衝液は５０mMリン酸Ｎａ、ｐＨ６．０、２０mM ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１％魚皮ゼラチンであった。結合したｆｓｙｎは、ｔｓｙｎを認識しない市販抗体（２１１）を使用して検出した。

実施例１ α−シヌクレインの精製
図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、クマシーブルーで染色した、ｔｓｙｎの精製によるサンプルを示す。Ｎｉアフィニティカラムは、非常に効率的な精製を与えた；最終精製タンパク質（図１のｔｓｙｎ−８）は、９５％超の純度であり、細菌培養物７５０mlからタンパク質４４mgの収量であった。

図２は、ＤＥＡＥ−セファロースでのｆｓｙｎの精製を示す。この方法を使用する最終タンパク質は、あまり純粋でなかった（図２のｆｓｙｎ−９）。

図３は、ＤＥＡＥ−セファロースと、それに続くＣＭ−セファロースでのｆｓｙｎの精製を示す。この方法は、純度＞９５％のタンパク質を生成するが、収率は低い（ＤＥＡＥセファロース単独の８５mgと比較してタンパク質１２mg）。

α−シヌクレインのいくつかの異なる調製物を後述するアッセイで使用して、その精製の簡単な詳細事項を表１にまとめて示す。

熱処理によって調製したタンパク質は、アッセイでは不活性であった。ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーによって調製したタンパク質は、活性であった。したがって、ＣＭ−またはＳＰ−セファロースでのさらなる精製工程を実施した。ＣＭ−セファロースが最も清浄な調製物を与えるが、ＳＰ−セファロースよりも収率が低いことが見出された。これらの調製物を結合活性について比較した（実施例９を参照）。表１は、これらの実験に使用したシヌクレイン調製物をまとめて示している。

実施例２ 蛍光によるシヌクレイン集合のアッセイ
α−シヌクレインの集合および原線維形成がチオフラビンＴの蛍光を強化することが報告されている。我々は、チオフラビンＴの、そしてさらにプリムリンの蛍光に対するα−シヌクレインの効果について試験した。タンパク質は、５０μg／mlヘパリンを用いて、または用いずに３７℃でのインキュベーションによって集合を誘発させ、サンプルを種々の時点で１μMチオフラビンＴまたはプリムリンでアッセイした。

図４は、ｔｓｙｎおよびｆｓｙｎ調製物の集合の時間経過を示す。ヘパリンの非存在下では、どちらのタンパク質によってもチオフラビンＴ蛍光のごくわずかな出現がある（図４Ａ、４Ｂ）。ヘパリンの非存在下では、ｔｓｙｎタンパク質によって２０〜３０時間にわたるプリムリンシグナルの出現があり、ヘパリンの存在下では、プリムリンシグナルの出現の遅滞期はないが、蛍光の最終的な程度は、ヘパリンを用いても、用いなくても同様である（図４Ａ）。ヘパリンは、ｔｓｙｎでチオフラビンＴシグナルの出現をプリムリンと同様の程度まで刺激する（図４Ａ）。ヘパリンの非存在下では、ｆｓｙｎについてチオフラビンＴおよびプリムリンシグナル両方の非常にゆっくりとした出現がある。ヘパリンの存在下では、両方のフルオロフォアを持つシグナルの出現があるが、ｔｓｙｎで見られるよりも長い遅滞期を伴う（図４Ｂ）。プリムリンシグナルの出現での遅滞期は、チオフラビンＴのそれよりも短いが、チオフラビンＴシグナルの最終的な程度はプリムリンのそれよりも大きい（図４Ｂ）。プリムリンとチオフラビンＴとの間のシグナルの差は、これらの２つのフルオロフォアがシヌクレインの異なる集合状態を検出していることを示し、プリムリンが、チオフラビンＴによって検出される原線維形成前の早期の前駆集合状態を検出するという概念と一致している。

実施例３ ＭＴＣおよびＥＴＣによる原線維破壊のアッセイ
蛍光効果は、集合したα−シヌクレインに対する化合物ＭＴＣおよびＥＴＣの効果をアッセイするのに使用した。

図５は、集合ｔｓｙｎによって誘起されたチオフラビンＴまたはプリムリンのどちらかの蛍光シグナルに対するＭＴＣおよびＥＴＣの効果を示し、トレースからのピーク蛍光値は、図７Ａの化合物の濃度の関数として示されている。図６は、集合ｆｓｙｎによって誘起されたチオフラビンＴまたはプリムリンのどちらかの蛍光シグナルに対するＭＴＣおよびＥＴＣの効果を示し、トレースからのピーク蛍光値は、図７Ｂの化合物の濃度の関数として示されている。図７のグラフから測定したｐ５０値を表２にまとめる。

チオフラビンＴおよびプリムリン蛍光に対する化合物の効果は、原線維の破壊よりもむしろ蛍光リガンドの競合のためでありうる。効果が競合による場合のみにＰ５０がフルオロフォア濃度に依存するので、このことを試験するために、フルオロフォアの３つの異なる濃度で実験を実施した。１つの実験によるデータを図８に示し、すべての実験からの平均Ｐ５０を表３に示す。フルオロフォア濃度の２５倍の差にわたって測定されたＰ５０値には有意差はなく、化合物の効果が原線維破壊のためであることを示している。

実施例４ in vitroでのα−シヌクレイン凝集体の集合に対する化合物の効果
集合したα−シヌクレイン凝集体に影響を及ぼすのはもちろんのこと、ＭＴＣは、プリムリンの結合の競合によって決定されたように、α−シヌクレインの凝集体への集合も阻害する。ｔｓｙｎおよびｆｓｙｎからの凝集体の集合のための最適条件が決定され、ＭＴＣの阻害効果を図１２に示す。ｔｓｙｎ（２０mM Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５＋５０μg／mlヘパリン中１mg／ml）は３７℃で２４時間にわたって集合させた。ＭＴＣは、５μMを超える濃度（○、白丸）でのｔｓｙｎ集合を阻害する。ｆｓｙｎは、ｆｓｙｎの濃度が２mg／mlで、インキュベーションが１２０時間である場合を除いて、同じ条件下で集合した。ＭＴＣは、ｔｓｙｎよりもｆｓｙｎによってより大きい阻害効果を示し、阻害はｆｓｙｎによって０．０５μMにて生じる（●、黒丸）。

ＭＴＣおよびＥＴＣによるα−シヌクレイン凝集の阻害（ｆｓｙｎ；上記のようにプリムリンアッセイを使用）は、ＤＥＭＴＣおよびＤＥＥＴＣによって観察された阻害と匹敵するか、それ以上であった。これらすべての化合物は５０μMの濃度にて集合を完全に阻害した。

チオフラビンＴも、ｆｓｙｎ集合を監視するために使用した。チオフラビンＴシグナルの発生はプリムリンシグナルより遅いが、より高いレベルに到達して、凝集の形成よりもむしろ原線維の伸長を知らせているように思われる。集合の後期の段階（１６０時間）でチオフラビンＴシグナルが水平域に達したときに、チオフラビンＴシグナルはプリムリンシグナルよりもＭＴＣによる阻害に対して感受性であり、著しい効果が０．０５μMにて見られた。これを図１２に示す。

実施例５ 固相ＥＬＩＳＡアッセイによるα−シヌクレイン結合のアッセイ
２つのα−シヌクレインタンパク質は、結合アッセイにも使用した。ｔｓｙｎは、固相で結合され、全長ｆｓｙｎは水相に添加した。ｔｓｙｎを認識しないα−シヌクレインのＣ末端エピトープに対する抗体を使用して、結合したｆｓｙｎを定量した。

図９は、ｔｓｙｎ−１３に結合するｆｓｙｎ−２０の水相および固相結合曲線を示す。ｆｓｙｎ２０の結合は〜５μMで水平となり、ｔｓｙｎ−１３結合は〜２μMで水平となる。これらの濃度を使用して、シヌクレイン−シヌクレイン結合に対する種々の塩化チオニニウムおよびフラボンの効果を試験した。

阻害曲線を図１０に示し、曲線から計算したＢ５０値を表４にまとめる。

結合アッセイで試験したすべてのフラボンは良好な阻害活性を有するが、これに対して塩化チオニニウムのほとんど、すなわちＭＴＣ、ＥＴＣ、ＤＭＭＴＣ、ＤＥＭＴＣ、ＤＭＥＴＣ、ＤＥＥＴＣ、チオニンおよび塩化トロニウムは活性であるが、その他、例えばアズールＡおよびアズールＢは不活性である。

表５ シヌクレイン−シヌクレイン結合の阻害のＰ５０およびＢ５０値。ヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む２０μＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）中で集合させて、２つのフルオロフォア（１μＭ）、チオフラビンＴまたはプリムリンのどちらかによってアッセイした１μｇ／ｍｌ ｔｓｙｎ−１６を用いて測定されたＰ５０。２０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を使用して、１μＭ ｔｓｙｎ−１６（固相）および５μＭ ｆｓｙｎ−２０（水相）を用いて測定したＢ５０。

実施例６ α−シヌクレイン凝集の細胞ベースのアッセイ
細胞ベースのアッセイは、Ｎ末端シグナル配列（ＳＳｆｓｙｎ）を含む全長α−シヌクレインを発現するように組み換えられたマウス神経芽腫細胞株ＮＩＥ−１１５を利用して、タンパク質の膜への取り込みを目標とした（ＷＯ０２／０５９１５０）。細胞がジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）（１mM）によって分化されたときに、α−シヌクレインタンパク質の発現が増加した。

α−シヌクレインタンパク質が、種々の抗α−シヌクレイン抗体を使用して免疫ブロットによって検出された。これらは、ｔｓｙｎ内のエピトープ（α−シヌクレインの残基３１〜１０９）を認識するｍＡｂ（BD Biosciences Cat No.610787）を含んでいた。α−シヌクレインに加えて、ｍＡｂ４２はより大きい分子量のタンパク質も非特異的に反応する（タンパク質は他の抗α−シヌクレイン抗体によって認識されない）。このタンパク質は、細胞におけるこのタンパク質のレベルが細胞密度と相関しているので、細胞数の推定値として使用した。これらの細胞によって薬物を試験し、阻害活性（ＥＣ５０）は、α−シヌクレインの非特異性バンドに対する比がｄｂｃＡＭＰのみで処置した細胞の値の５０％に低下した薬物濃度を決定することによって計算した。

ｄｂｃＡＭＰおよび薬物を加えるタイミングを変えて、細胞収集前に細胞が薬物＋ｄｂｃＡＭＰの存在下に放置される時間の長さも変えた。ＤＥＥＴＣについての代表的な結果を図１３に示す。

ＭＴＣは、細胞がＭＴＣおよびｄｂｃＡＭＰの存在下に２日間より長く放置されたときに阻害性があった。最も有効な化合物は、ｎＭ範囲で阻害したＤＥＥＴＣであった；ＤＥＭＴＣ、ＤＭＥＴＣおよびＥＴＣも阻害活性を示す（表６）。フラボン、ラムネチンも阻害性であった。

実施例７ 細胞ベースのアッセイにおけるα−シヌクレインの切断および凝集
ｄｂｃＡＭＰを使用してＤＨ６０．２１ ＮＩＥ細胞を分化させたときに、ｍＡｂ ４２（α−シヌクレインのコアを認識）またはｍＡｂ ２１１（α−シヌクレインのＣ末端エピトープを認識）を使用して検出されたように、ＳＳＦｓｙｎの発現の増加があった。加えて、約１５および１６ｋＤａの２つのより低い分子量のバンドが生成された。後者はシグナル配列のないＦｓｙｎに相当しうる。これらの２つのタンパク質の大きいほうがこれらの抗体の両方によって検出されたが、１５ｋＤａバンドはせいぜい、ｍＡｂ ２１１を使用してごく弱く検出された。代表的な例は図１４に示す。このことは、これがＣ末端切断されたタンパク質であることを示唆する。ＦＳｙｎより大きい見かけの移動度を持つさらなる２２ｋＤａバンドが観測されたが、ｍＡｂ ２１１ではなく、ｍＡｂ ４２のみを使用して観測された（図１４）。ＳＳＦｓｙｎバンドに対する２２ｋＤａの比は、使用した抗体に応じて有意に異なっていた（ｐ＜０．００１；表７）。このことはＮ末端およびＣ末端の両方で切断された凝集シヌクレインの存在を示唆する。この２２ｋＤａバンドは、ＳＳＦｓｙｎによって形質移入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞でも観測された。

ＳＳＦｓｙｎを発現する細胞を蛍光顕微鏡で検査したときに、凝集タンパク質を示唆する粒状性質の物質を含む、大量発現が観察された（図１５）。更に細胞中で観測された凝集体は、凝集タンパク質に結合するフルオロフォアである、プリムリンによって同時に認識された（図１６）。このことはα−シヌクレイン凝集がＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞の分化後に生じることを示す他の研究を確証させる（Hasegawa et al. 2004; Brain Res. 1013:51-59）。

実施例８ α−シヌクレインオリゴマー集合に対する、およびin vitroのαシヌクレイン結合に対するＭＴＣの効果
表５のシヌクレインアッセイにおけるＰ５０およびＢ５０測定の結果を参照すると、塩化チオニニウムは一般にシヌクレインアッセイでフラボンより低いＰ５０を有するが、フラボンの一部は塩化チオニニウムに匹敵する低いＢ５０を有することがわかる。このことは、両方のクラスの化合物がシヌクレインの自己凝集反応を阻害するのに有効であるが、塩化チオニニウムのみが事前に形成された凝集体を破壊する能力を有することを示唆する。

ＭＴＣの活性のさらなるアッセイとして、その効果をｔｓｙｎの集合の時間経過にわたって測定した（図１７）。図１７に示すように、ＭＴＣの非存在下には〜２時間の集合前の遅滞期がある。蛍光シグナルは、４〜５時間でピークに達して、次に２０時間にわたって徐々に低下する。蛍光の出現の時間経過は、２つのフルオロフォアで同様である。低濃度のＭＴＣ（０．０５μM）の存在下で、集合開始前の遅滞期は１時間に短縮され、２４時間後の最終蛍光シグナルはより高い。特に、プリムリンでは、最大蛍光はチオフラビンＴと比較して、プリムリンで高い。０．５μM ＭＴＣの存在下では、集合は対象よりも低速であるが、最終蛍光レベルは対照よりも高い。５μM ＭＴＣでは、最初の４〜５時間にわたる集合の時間経過は対照と類似しているが、次に蛍光のより迅速な低下があるものの、最終蛍光レベルは対照と同様である。５０μM ＭＴＣにおいて、実験の時間経過にわたって集合はない。図１７のデータは、シヌクレインの集合に対してＭＴＣが複雑な効果を有することを示す；低濃度では（シヌクレイン：ＭＴＣのモル比は、２０００：１）、ＭＴＣは集合をある程度まで明らかに刺激するが、これに対して高濃度では（シヌクレイン：ＭＴＣの最高モル比は２：１）、ＭＴＣは集合を完全に阻害する。理論に縛られたくはないが、ＭＴＣは凝集の阻害を可能にするには不十分であるが、凝集を促進するために１個を超えるシヌクレイン分子への化合物の結合を可能にする低いモル比にて、リガンド架橋効果を与えることが推測される。

実施例９ α−シヌクレイン固相結合アッセイの最適化
図１８は、実施例１で記載したような各種のシヌクレイン調製物の結合曲線を示す。最良の結合は最も純粋な調製物であるｓｙｎ−１０を使用して示され、最悪の結合は最も純度の低いｓｙｎ−１４を使用して示された。このことは第２の精製工程が結合を阻害する汚染物質を除去することと、これが収率を低下させるとしてもタンパク質が第２のＣＭ−セファロース工程によって精製されるべきであることとを示唆している。

Ｓｙｎ−１０は、３つの調製物のうちで最良の結合を示したが、最大結合程度は、まだかなり低い。ｔｓｙｎの２つの異なる固相調製物で試験を行うと、差は示されず、使用したｔｓｙｎの濃度が最適であることが示された（データは示さず）。したがって、水相工程の異なる緩衝液条件を試験した。

図１９Ａは、緩衝液、ＨＥＰＥＳおよびＭＥＳがｓｙｎの結合を完全に無効にしたことを示す。図１９Ｂは、ｐＨ７．０のＴｒｉｓ緩衝液は、先に使用したｐＨ７．５よりも良好な結合を可能にすることを示す。ｐＨ８．０のＴｒｉｓは最悪の結合を与えたので、より低いｐＨはｓｙｎ結合にとってより良好であると思われる。Ｔｒｉｓはより低いｐＨでは緩衝するために使用できないので、ｐＨ６．５での試験を可能にするためにリン酸緩衝液も試した。ｐＨ６．５のリン酸塩はｐＨ７．０のリン酸塩よりも良好な結合を与えた。実験間の結合の変化にもかかわらず、これらの結果は、緩衝液の化学的性質が、ｐＨと同様にｓｙｎの結合に影響を及ぼすことと、最良の緩衝液がＴｒｉｓ、ｐＨ７．０であることとを示した。

図１８のデータは、固相結合アッセイでのｓｙｎの最良の精製方法はＤＥＡＥクロマトグラフィーと、続いてのＣＭクロマトグラフィーであることを示している。この方法で精製したｓｙｎの更に３つの調製物もＴｒｉｓ（ｐＨ７．０）緩衝液中で試験した（図２０）。結果は、調製物間の結合特徴に多少の変動があることを証明している。さらなる方法では、タンパク質を高ｐＨ緩衝液で透析した（ｓｙｎ−２０）。このタンパク質の結合を図２１のｓｙｎ−１９と比較した。２μM後の結合の低下は高い非特異性結合のためであり、その値は結合から引かれる。ｓｙｎ−２０は、ｓｙｎ−１９より著しく良好な結合を示し、透析緩衝液の変化を確認した。

変動を試み、そして低減するために、より低いｐＨでのリン酸緩衝液の使用についても調査した。図２２Ａは、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液でアッセイしたｆｓｙｎ−２０はｐＨ７．０のＴｒｉｓまたはｐＨ５．５のリン酸塩よりも良好な結合を与えることを示す。重要なことに、上昇したバックグラウンドのためにより高いｆｓｙｎ濃度での曲線の低下はない。高いｐＨ ＣＡＰＳに対して透析した第２のｆｓｙｎ調製物（ｆｓｙｎ−２２）もｐＨ６．０のリン酸緩衝液で試験を行い、ｆｓｙｎ−２０への同様の結合を与えた（図２２Ｂ）。最後の高いｐＨ透析によって調製して、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液でアッセイしたｆｓｙｎは、固相阻害アッセイに使用した（実施例５）。

硫酸アンモニウム分別およびＮｉアフィニティクロマトグラフィーによるｔｓｙｎの精製によるサンプル。サンプルは、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、クマシーブルーで染色して分析した。 硫酸アンモニウム分別およびＤＥＡＥ−セファロースアニオン交換クロマトグラフィーによるｔｓｙｎの精製によるサンプル。サンプルは、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、クマシーブルーで染色して分析した。 ＤＥＡＥ−セファロースアニオン交換およびＣＭ−セファロースカチオン交換クロマトグラフィーによるｔｓｙｎの精製によるサンプル。サンプルは、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、クマシーブルーで染色して分析した。 チオフラビンＴおよびプリムリンの蛍光によって監視したｔｓｙｎおよびｆｓｙｎによる原線維形成の時間経過。１mg／mlのｔｓｙｎ−８（Ａ）および２mg／mlのｆｓｙｎ−１４（Ｂ）を、指示された場合には５０μg／ml ヘパリンを加え、２０mM Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ ７．５中で３７℃にて混合しながらインキュベートした。原線維の形成は、インキュベーション１０μlを１μMチオフラビンＴまたはプリムリン１００μl全量に添加することによってアッセイして、励起スペクトルを発光波長４８０nmにて測定した。フルオロフォア単独のシグナルは、励起ピーク（プリムリンでは４２０nm、チオフラビンＴでは４５０nm）でのシグナルの測定前にスペクトルから差し引いた。 集合ｔｓｙｎによって誘発されたチオフラビンＴまたはプリムリンの蛍光に対するＭＴＣおよびＥＴＣの効果。５０μg／ml ヘパリンを加えた１mg／ml（〜９５μM）のＴｓｙｎ−１３を３７℃にて２０時間インキュベートし、その後、アリコートをＭＴＣ（Ａ、Ｃ）またはＥＴＣ（Ｂ、Ｄ）と混合し、示された濃度（μM）を得、そして更に１時間インキュベートした。タンパク質１０μlを１μMチオフラビンＴ（Ａ、Ｂ）またはプリムリン（Ｃ、Ｄ）１００μl全量に加えて、励起スペクトルを発光波長４８０nmにて測定した。示されたトレースは、化合物を加えたフルオロフォアのシグナルを、フルオロフォアおよび化合物を加えたタンパク質のシグナルから差し引いた結果である。 集合ｆｓｙｎ−１４によって誘発されたプリムリンの蛍光に対するＭＴＣおよびＥＴＣの効果。５０μg／ml ヘパリンを加えた２mg／ml（〜１４０μM）のタンパク質を３７℃にて４７時間インキュベートし、その後、アリコートをＭＴＣ（Ａ、Ｃ）またはＥＴＣ（Ｂ、Ｄ）と混合し、示された濃度（μM）を得、そして更に１時間インキュベートした。タンパク質１０μlをプリムリン（Ｃ、Ｄ）１００μl全量に加えて、励起スペクトルを発光波長４８０nmにて測定した。示されたトレースは、化合物を加えたフルオロフォアのシグナルを、フルオロフォアおよび化合物を加えたタンパク質のシグナルから差し引いた結果である。 集合ｔｓｙｎまたはｆｓｙｎによって誘発されたチオフラビンＴまたはプリムリンの蛍光に対するＭＴＣおよびＥＴＣの効果。蛍光値は、ｔｓｙｎ−８では図５（Ａ）またはｆｓｙｎ−１４では図６（Ｂ）に示すトレースから測定して、化合物なしで測定した値に正規化した。 チオフラビンＴおよびプレムリンの各種濃度にてアッセイした、集合ｔｓｙｎまたはｆｓｙｎによって誘発されたチオフラビンＴまたはプリムリンの蛍光に対するＭＴＣおよびＥＴＣの効果。Ｔｙｓｎ−１６を集合させて、チオフラビンＴおよびプリムリンが０．２、１または５μMであることを除いて、図５に記載したようにＭＴＣまたはＥＴＣの効果についてアッセイした。バックグラウンド補正後のピーク蛍光値を、化合物なしで測定した値に正規化して、化合物の濃度の関数としてプロットした。ＭＴＣ（Ａ、Ｂ）またはＥＴＣ（Ｃ、Ｄ）の効果はチオフラビンＴ（Ａ、Ｃ）またはプリムリン（Ｂ、Ｄ）を用いて監視した。 水相ｆｓｙｎの固相ｔｓｙｎへの結合。０〜１０μMのｆｓｙｎ−２０を、０〜２μMにて固相に結合したｔｓｙｎ−１３によってインキュベートし、結合したｆｓｙｎを抗体２１１を使用して検出した。 シヌクレイン−シヌクレイン結合に対する化合物の効果。５μMの水相ｆｓｙｎ−１０を、示した化合物の存在下で固相中１μMのｔｓｙｎ−１３でインキュベートした。 ｔｓｙｎおよびｆｓｙｎからの凝集体の集合のための最適条件が決定され、ＭＴＣの阻害効果を示す。ｔｓｙｎ（２０mM Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５＋５０μg／mlヘパリン）は３７℃で２４時間にわたって集合させた。ＭＴＣは、５μMを超える濃度（白丸）でのｔｓｙｎ集合を阻害する。ｆｓｙｎは、濃度が２mg／mlで、インキュベーションが１２０時間である場合を除いて、同じ条件下で集合した。ＭＴＣは、ｔｓｙｎよりもｆｓｙｎによってより大きい阻害効果を示し、阻害はｆｓｙｎによって０．０５μMにて生じる（黒丸）。 チオフラビンＴによるｆｓｙｎ集合の監視。集合の後期の段階（１６０時間 ）でチオフラビンシグナルが水平域に達したときに、チオフラビンＴシグナルはプリムリンシグナルよりもＭＴＣによる阻害に対して感受性であり、著しい効果が０．０５μMにて見られた。 ＮＩＥ細胞におけるＳＳＦｓｙｎ発現に対するＤＥＥＴＣの阻害作用。各薬物濃度（０〜１００ｎＭ）を３通り実施した。ｄｂｃＡＭＰおよび細胞を添加したＤＥＥＴＣは、ｍＡｂ４２の免疫ブロットによって２日後に分析した。 ｍＡｂ ２１１ではなく、ｍＡｂ ４２によって検出されるさらなるタンパク質バンドの存在。レーン１、未処置；レーン２、３、４は、ｄｂｃＡＭＰを用いて分化された３つの独立したプレート。 ＳＳＦｓｙｎを発現するＮＩＥ細胞中の凝集α−シヌクレイン。左パネル、ＳＳＦｓｙｎ細胞；右パネル、ｄｂｃＡＭＰ処置後の非形質移入、対照ＮＩＥ−１１５細胞。 ＳＳＦｓｙｎを発現するＮＩＥ細胞中の凝集α−シヌクレイン。テキサスレッド標識抗−α−シヌクレインによって染色したＳＳＦｓｙｎ細胞（左）；右パネル、プリムリン標識；中央パネル、抗体およびプレムリン標識の同時局在を示す、マージされた画像。 ｔｓｙｎの重合に対するＭＴＣの効果。２０mM Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５中の１mg／ml（９５μM）のｔｓｙｎ−１６、５０μg／ml ヘパリンを、示された濃度のＭＴＣの存在下で、３７℃にて混合しながらインキュベートした。サンプル（１０μl）を種々の時間に採取して、１μMのチオフラビンＴ（上パネル）またはプリムリン（下パネル）のどちらかの蛍光に対するその効果についてアッセイした。 各種のｓｙｎ調合物の結合曲線。ＥＬＩＳＡプレートに結合した１μMのＴｓｙｎ−１３を、示したような３つの異なるｓｙｎ調製物の希釈系列によってインキュベートした。水相緩衝液は、２０mM Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１％魚皮ゼラチンであった。 異なる緩衝液におけるｓｙｎ−１０の結合曲線。ＥＬＩＳＡプレートに結合した１μMのＴｓｙｎ−１３をｓｙｎ−１０の希釈系列によってインキュベートした。水相緩衝液はすべて２０mMで、５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１％魚皮ゼラチンを含んでいた。 異なるｓｙｎ調製物の結合曲線。ＥＬＩＳＡプレートに結合した１μMのＴｓｙｎ−１３を、示したようなｓｙｎ調製物の希釈系列によってインキュベートした。水相緩衝液は２０mM Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．０、５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１％魚皮ゼラチンであった。 異なるｓｙｎ調製物の結合曲線。ＥＬＩＳＡプレートに結合した１μMのＴｓｙｎ−１３を、示したようなｓｙｎ調製物の希釈系列によってインキュベートした。水相緩衝液は２０mM Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．０、５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１％魚皮ゼラチンであった。 異なる緩衝液におけるｆｓｙｎ−２０およびｆｓｙｎ−２２の結合曲線。Ａ．ＥＬＩＳＡプレートに結合した１μMのＴｓｙｎ−１３を２０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０または５０mM リン酸Ｎａ ｐＨ６．０または５．５中のｆｓｙｎ−２０の希釈系列によってインキュベートした。Ｂ．ＥＬＩＳＡプレートに結合した１μMのＴｓｙｎ−１３をリン酸Ｎａ ｐＨ６．０中のｆｓｙｎ−２０またはｆｓｙｎ−２２の希釈系列によってインキュベートした。どちらの場合も、緩衝液は、５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０および１％魚皮ゼラチンを含んでいた。

Claims (25)

1. シヌクレインの凝集を阻害または逆転する薬剤の製造におけるジアミノフェノチアジン化合物の使用であって、当該凝集が神経変性および／または臨床的認知症として表わされる疾患状態に関連しており、当該薬剤が当該疾患状態の処置のためのものであり、該処置において、当該ジアミノフェノチアジン化合物が経口的に１日投与総量が４００mgかそれ以下で投与され、該化合物が、次式：
   

   

   
   （式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^８、およびＲ^９は、
   −Ｈ；−Ｍｅ；および−Ｅｔより独立して選択され；
   基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて：
   Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれは、
   −Ｈ；
   非置換脂肪族Ｃ_１〜６アルキル
   より独立して選択され；
   基−ＮＲ^７ＮＡＲ^７ＮＢは基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢと同一であり：
   Ｘ⁻は、電気的中性を達成するための１つ以上のアニオン性対イオンである）
   で示される化合物、ならびにその製薬的に許容される塩、混合塩、水和物、および溶媒和物より選択される、ジアミノフェノチアジン化合物の使用。
2. 基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて、Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれが、−Ｈ、−Ｍｅ、−Ｅｔ、−ｎＰｒ、および−ｉＰｒより独立して選択される、請求項１記載の使用。
3. 各基−ＮＲ^３ＮＡＲ^３ＮＢにおいて、Ｒ^３ＮＡおよびＲ^３ＮＢのそれぞれが、−Ｈおよび−Ｍｅより独立して選択される、請求項１または２記載の使用。
4. Ｘ⁻が、Ｃｌ⁻、Ｂｒ⁻、またはＩ⁻より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の使用。
5. 化合物が次の化合物：
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   ならびにその製薬的に許容される塩、混合塩、水和物、および溶媒和物より選択される、請求項１記載の使用。
6. 前記処置が、前記ジアミノフェノチアジン化合物を、処置される哺乳類のドーパミンレベルを調節する化合物と組合せて投与することを含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の使用。
7. ３００、２００、または１００mgに等しいかそれ以上の１日総用量が投与される、請求項１〜６のいずれか一項記載の使用。
8. 約１０、２０、３０、４０、５０、６０、６０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１３０mgの用量単位が１日３回投与される、請求項１〜６のいずれか一項記載の使用。
9. 約１０、２０、３０、４０、５０、６０、６０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００mgの用量単位が１日２回投与される、請求項１〜６のいずれか一項記載の使用。
10. シヌクレインが、α−シヌクレインである、請求項１〜９のいずれか一項記載の使用。
11. 疾患が、パーキンソン病（ＰＤ）、レビ小体による認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、薬物誘発パーキンソニズムおよび純粋自律神経不全（ＰＡＦ）より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項記載の使用。
12. シヌクレイン凝集に関連する疾患状態に罹患した哺乳類におけるその疾患状態の処置のための薬物製品であって、薬物製品が前記疾患の処置用であることがラベル表示された、またはそのことを示すラベルが付いた容器を含み、該容器が、それぞれが少なくとも１つの製薬的に許容される賦形剤と、活性成分としての請求項１〜５のいずれか記載の単離された純ジアミノフェノチアジン化合物を含む１つ以上の投薬単位を含有する、当該疾患が神経変性および／または臨床的認知症として表わされ、当該処置において、当該ジアミノフェノチアジン化合物が経口的に１日投与総量が４００mgかそれ以下で投与される、薬物製品。
13. 前記処置が、前記ジアミノフェノチアジン化合物を、処置される哺乳類のドーパミンレベルを調節する化合物と組合せて投与することを含む、請求項１２記載の製品。
14. ３００、２００、または１００mgに等しいかそれ以上の１日総用量が投与される、請求項１２〜１３のいずれか一項記載の製品。
15. 約１０、２０、３０、４０、５０、６０、６０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１３０mgの用量単位が１日３回投与される、請求項１２〜１３のいずれか一項記載の製品。
16. 約１０、２０、３０、４０、５０、６０、６０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００mgの用量単位が１日２回投与される、請求項１２〜１３のいずれか一項記載の製品。
17. シヌクレインが、α−シヌクレインである、請求項１２〜１６のいずれか一項記載の製品。
18. 疾患が、パーキンソン病（ＰＤ）、レビ小体による認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、薬物誘発パーキンソニズムおよび純粋自律神経不全（ＰＡＦ）より選択される、請求項１２〜１７のいずれか一項記載の製品。
19. シヌクレイノパチー疾患状態の診断または予後評価で使用するための診断または予後試薬の製造における、凝集シヌクレインを標識できるジアミノフェノチアジン化合物の使用であって、前記ジアミノフェノチアジン化合物が、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物であり、１つ以上の同位体、放射性同位体、陽電子放出原子、磁気共鳴標識、染料、蛍光マーカー、または抗原基を取込むか、それにコンジュゲートされるか、それとキレート化されるか、またはそれに関連付けられる、使用。
20. ジアミノフェノチアジン化合物の少なくとも１個の環炭素原子が^１１Ｃであり、かつ／または置換基Ｒ^３ＮＡ、Ｒ^３ＮＢ、Ｒ^７ＮＡまたはＲ^７ＮＢの少なくとも１つの炭素原子の少なくとも１個が^１１Ｃである、請求項１９記載の使用。
21. 次の化合物：
    

    

    
    ならびにその製薬的に許容される塩、混合塩、水和物、および溶媒和物より選択される、請求項２０記載の使用。
22. シヌクレインが、α−シヌクレインである、請求項１９〜２１のいずれか一項記載の使用。
23. 疾患が、パーキンソン病（ＰＤ）、レビ小体による認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、薬物誘発パーキンソニズムおよび純粋自律神経不全（ＰＡＦ）より選択される、請求項１９〜２２のいずれか一項記載の使用。
24. 凝集シヌクレインに請求項１９〜２１のいずれか一項記載のジアミノフェノチアジン化合物を接触させる工程を含む、凝集シヌクレインを標識化する方法（但し、ヒトのインビボでの接触は除く）。
25. シヌクレインが、α−シヌクレインである、請求項２４記載の方法。

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