PL215711B1 - Nowe zwiazki pochodne tioflawiny, sposób syntezy zwiazków i ich zastosowanie, kompozycja farmaceutyczna zawierajaca zwiazki i zastosowanie kompozycji - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe, wiążące amyloid związki pochodne tioflawiny oraz sposób syntezy tych związków i ich zastosowanie, a także kompozycja farmaceutyczna zawierająca związki i zastosowanie kompozycji, szczególnie w zakresie obejmującym choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera.

Choroba Alzheimera (określana dalej skrótem „AD) jest chorobą neurodegeneracyjną charakteryzującą się utratą pamięci i innymi deficytami funkcji poznawczych. McKhann i in., Neurology 34: 939 (1984). Choroba ta jest najpowszechniejszą przyczyną występowania demencji w Stanach Zjednoczonych. AD może dotykać już osoby w wieku 40-50, a ponieważ choroba jest trudna do zdiagnozowania bez przeprowadzenia niebezpiecznej biopsji mózgu, moment jej rozpoczęcia pozostaje nie znany. Częstotliwość występowania AD zwiększa się wraz z wiekiem, i problem ten dotyczy 40-50% populacji w wieku 85-90 lat. Evans i in., JAMA 262: 2551 (1989); Katzman, Neurology 43: 13 (1993).

W praktyce AD diagnozuje się jednoznacznie poprzez badanie tkanki mózgowej, zazwyczaj podczas autopsji. Khachaturian, Arch. Neural. 42: 1097 (1985); McKhann i in., Neurology 34: 939 (1984). Neuropatologia tej choroby charakteryzuje się obecnością płytek starczych (NP), zmian zwyrodnieniowych nerwów włókienkowatych (NFT) i utraty komórek nerwowych oraz innych zmian. Mann, Mech. Ageing Dev. 31: 213 (1985). Badanie pośmiertne skrawków tkanki mózgowej osób zmarłych z powodu choroby Alzheimera wykazuje obecność amyloidu w postaci białkopodobnych, pozakomórkowych rdzeni płytek starczych charakterystycznych dla AD.

Rdzenie amyloidowe tych płytek zbudowane są z białka zwanego β-amyloidem (Αβ), który występuje w przeważającej mierze w konfiguracji beta-płaszczyzny. Mori i in., Journal of Biological Chemistry 267:17082 (1992); Kirschner i in., PNAS 83: 503 (1986). Występowanie płytek starczych jest wczesnym i niezmiennym aspektem tej choroby. Mann i in., J. Neurol. Sci. 89: 169; Mann, Mech. Ageing Dev. 31: 213 (1985); Terry i in., J. Neuropathol. Exp. Neurol 46: 262 (1987).

Αβ zaczyna odkładać się prawdopodobnie na długo przed wystąpieniem objawów klinicznych. Zalecane obecnie „minimalne kryteria mikroskopowe w diagnozowaniu AD opierają się na liczbie stwierdzonych w mózgu płytek starczych. Khachaturian, Arch. Neurol., powyżej (1985). Niestety, oceny liczby płytek starczych można dokonać dopiero po śmierci pacjenta.

Występowanie płytek starczych zawierających amyloid jest cechą charakterystyczną specyficznych obszarów w mózgu osób chorych na AD, zespół Downa i u osób homzygotycznych pod względem alleli apolipoproteiny E4, u których rozwój AD jest bardzo prawdopodobny. Corder i in., Science 261; 921 (1993); Divry, P., J. Neurol. Psych. 27: 643-657 (1927); Wisniewski i in., Zimmerman, H.M. (wyd.): Progress In Neuropathology (Grune i Stratton, N.Y. 1973) str. 1-26. Występowanie amyloidu mózgowego można łatwo wykazać metodą barwienia skrawków mózgu tioflawiną S lub czerwienią Congo. Puchtler i in., J. Histochem. Cytochem. 10: 35 (1962). Amyloid wybarwiony czerwienią Congo charakteryzuje się dwubarwnością, w postaci polaryzującego żółto-zielonego zabarwienia. Dwubarwność jest wynikiem struktury beta-płaszczyzny białka amyloidowego. Glenner, G. N. Eng. J. Med. 302: 1283 (1980). Szczegółowe omówienie biochemii i histochemii amyloidu można znaleźć w pracy Glennera, N. Eng. J. Med., 302: 1333 (1980).

Do tej pory AD diagnozowano przeważnie posługując się klinicznymi kryteriami oceny, biopsjami mózgu i pośmiertnymi badaniami tkanki. Wysiłki badawcze mające na celu opracowanie sposobu diagnozowania choroby Alzheimera in vivo obejmują (1) testy genetyczne, (2) testy immunologiczne i (3) techniki obrazowania.

Dowód, że nieprawidłowości w metabolizmie Αβ są niezbędne, ale i wystarczające do wywołania AD, opiera się na stwierdzeniu mutacji punktowych w białku prekursorowym Αβ u kilku rodzin z rzadką autosomalną dominującą postacią AD. Hardy, Nature Genetics 1: 233 (1992); Hardy i in., Science 256: 184 (1992). Mutacje te występują blisko N- i C-końcowych punktów rozszczepienia, które jest niezbędne do powstania Αβ z jego białka prekursorowego. St. George-Hyslop i in., Science 235: 885 (1987); Kang i in., Nature 325: 733 (1987); Potter zgłoszenie WO nr 92/17152. Analiza genetyczna dużej liczby rodzin z występującą AD wykazuje jednakże, że AD jest genetycznie heterogeniczna. St. George-Hyslop i in., Nature 347: 194 (1990). Wiązanie z markerami chromosomu 21 wykazano tylko u pewnych rodzin z wcześnie występującą AD i u żadnej rodziny z późno występującą AD. Ostatnio zidentyfikowano gen w chromosomie 14, którego produkt zawiera prawdopodobnie wielokrotne domeny przezbłonowe i przypomina białko wewnątrzbłonowe zidentyfikowane przez Sherringtona i in., Nature 375: 7 54-760 (1995). Obecność tego genu może tłumaczyć aż do 70% wczesnych

PL 215 711 B1 przypadków autosomalnej dominującej AD. Wstępne dane sugerują, że mutacja w chromosomie 14 powoduje zwiększenie produkcji Αβ. Scheuner i in., Soc. Neurosci. Abstr. 21:1500 (1995). Mutację w bardzo podobnym genie zidentyfikowano w chromosomie 1 u osób o tzw. pokrewieństwie Volga German z wczesną AD. Levy-Lahad i in., Science 269: 973-977 (1995).

Proponowanym środkiem w diagnozowaniu AD są badania przesiewowe na obecność genotypu apolipoproteiny E. Scott, Nature 366: 502 (1993); Roses, Ann. Neurol. 38: 6-14 (1995). Problemem w tej metodzie jest jednakże fakt, że allel apolipoproteiny E4 jest tylko czynnikiem ryzyka AD, a nie markerem chorobowym. Nie występuje u wielu pacjentów AD i występuje u wielu ludzi w starszym wieku, nie cierpiących na demencję. Bird, Ann. Neurol. 38: 2-4 (1995).

Opracowano testy immunologiczne wykrywające obecność markerów neurochemicznych u pacjentów cierpiących na AD oraz pokrewnego AD białka amyloidowego w płynie mózgowo-rdzeniowym. Warner, Anał. Chem. 59: 1203A (1987); zgłoszenie międzynarodowe WO 92/17152 Potter; Glenner i in., opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4666829. Przy zastosowaniu tych metod diagnozowania nie można wykryć AD u wszystkich pacjentów, szczególnie we wczesnych stadiach choroby, ponadto są to metody dość inwazyjne, wymagające wykonania nakłucia lędźwiowego. Przeprowadzono także próby opracowania przeciwciał monoklonalnych jako sond do obrazowania Αβ. Majocha i in., J. Nucl. Med., 33: 2184 (1992); Majocha i in., zgłoszenie międzynarodowe WO 89/06242 i Majocha i in., opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5231000. Główną wadą sond w postaci przeciwciał jest trudność w przenikaniu tych dużych cząsteczek przez barierę krew-mózg. Zastosowanie przeciwciał w diagnozie AD in vivo wymagałoby, w celu uzyskania dostępu do mózgu, znacznego zaburzenia bariery krewmózg. Nie ma przekonującego dowodu, że w AD rzeczywiście występują nieprawidłowości w barierze krew-mózg. Kalaria, Cerebrovascular & Brain Metabolism Reviews 4: 226 (1992).

W celu znakowania rozproszonych i zwartych płytek starczych w skrawkach mózgu osób chorych na AD stosuje się znakowany radioaktywnie peptyd Αβ. Patrz Maggio i in., zgłoszenie WO 93/04194. Jednakże, peptydy te posiadają wszystkie wady przeciwciał. Peptydy nie przenikają zazwyczaj bariery krew-mózg w ilościach koniecznych dla celów obrazowania, a ponieważ sondy te reagują z płytkami rozproszonymi, nie mogą być specyficzne dla AD.

Niemożność oceny odkładania się amyloidu w AD, aż do momentu śmierci pacjenta, hamuje proces badania tej wyniszczającej choroby. Sposób oznaczania ilościowego odkładania się amyloidu przed śmiercią jest niezbędny zarówno jako narzędzie diagnostyczne w przypadkach łagodnych lub klinicznie niejednoznacznych, jak również w procesie monitorowania skuteczności terapii mających na celu zapobieganie odkładaniu się Αβ. Dlatego też opracowanie bezpiecznego i specyficznego przedśmiertnego sposobu diagnozowania AD metodą obrazowania amyloidu w tkance mózgu in vivo pozostaje kwestią o priorytetowym znaczeniu. Mimo różnych prób, które przeprowadzono w celu diagnozowania AD in vivo, do tej pory nie opracowano jeszcze sond do przedśmiertnego badania amyloidu w mózgu. W żadnym sposobie nie posłużono się sondą o wysokim powinowactwie do amyloidu, która charakteryzowałaby się niską toksycznością, mogłaby przenikać barierę krew-mózg i łączyłaby się bardziej skutecznie z amyloidem w mózgu chorych na AD, niż z strukturami w mózgu zdrowym, umożliwiając identyfikację złogów amyloidowych w mózgu przed śmiercią pacjenta chorego na AD. Zatem, żaden sposób AD diagnozowania in vivo nie spełnia tych kryteriów.

Dane sugerują, że związki wiążące się z amyloidem mają potencjał terapeutyczny w przypadku AD i cukrzycy typu II. Reakcje morfologiczne obejmujące: astrocytozę, dystrofię neurytów, aktywację komórek mikrogleju, spadek liczby synaps i pełną aktywację układu dopełniacza wokół płytek starczych świadczą o tym, że w sąsiedztwie złogów Αβ dochodzi do procesów neurotoksycznych i zwyrodnieniowych. Joachim i in., Am. J. Pathol. 135: 309 (1989); Masliah i in., patrz wyżej 137: 1293 (1990); Lue i Rogers, Dementia 3: 308 (1992). W wielu typach komórek zaobserwowano in vitro neurotoksyczność i degenerację wywołaną przez Αβ. Yankner i in., Science 250: 279 (1990); Roher i in., BBRC 174: 572 (1991); Frautschy i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 83362 (1991); Shearman i in., patrz wyżej 91: 1470 (1994). Wykazano, że do wywołania neurotoksyczności in vitro niezbędna jest agregacja peptydu Αβ. Yankner, Neurobiol. Aging 13: 615 (1992). Ostatnio, w trzech laboratoriach uzyskano wyniki sugerujące, że czerwień Congo hamuje neurotoksyczność i degenerację komórek in vitro wywołaną przez Αβ. Burgevin i in., NeuroReport 5: 2429 (1994); Lorenzo i Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 12243 (1994); Pollack i in., Neuroscience Letters 184: 113 (1995); Pollack i in., Neuroscience Letters 197: 211 (1995). Mechanizm ten polega na jednoczesnym hamowaniu tworzenia się włókienek i na zapobieganiu ich neurotoksyczności. Lorenzo i Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 12243 (1994). Udowodniono, że czerwień Congo chroni komórki wysepek trzustkowych przed toksycznością amyli4

PL 215 711 B1 ny. Lorenzo i Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:1 2243 (1994). Amylina jest włókienkowym peptydem podobnym do Αβ, który gromadzi się w trzustce w cukrzycy typu II.

W tej dziedzinie powszechnie wiadomo, że pewne barwniki azowe, takie jak czerwień Congo, mogą być rakotwórcze. Morgan i in. Environmental Health Perspectives, 102 (supl.) 2: 63-78, (1994). Ta potencjalna rakotwórczość opera się głównie na fakcie, że barwniki azowe są szybko metabolizowane do wolnych amin macierzystych przez bakterie jelitowe. Cerniglia i in., Biochem. Biophys. Res. Com., 107: 1224-1229, (1982). W przypadku barwników benzydynowych (i wielu innych podstawionych benzydyn) substancją rakotwórczą jest właśnie ta wolna amina. Te właściwości mają niewielki wpływ na obrazowanie amyloidu, w przypadku którego bezpośrednio do strumienia krwi wstrzykuje się bardzo małą ilość znakowanego radioaktywnie barwnika o wysokiej specyficzności. W tym przypadku podawana ilość byłaby nieznaczna i można byłoby uniknąć działania bakterii jelitowych.

W przypadku zastosowania terapeutycznego, taki sposób podawania miałby znaczenie podstawowe. Uwalnianie ze związku terapeutycznego znanej substancji rakotwórczej jest niedopuszczalne. Drugim problemem w przypadku metabolizowania barwnika diazowego jest fakt, że duża część podawanego leku jest metabolizowana przez bakterie jelitowe przed jego absorpcją. Ta obniżona dostępność biologiczna stanowi wadę nawet wtedy, gdy uwalniane metabolity są nieszkodliwe.

Tioflawina T jest barwnikiem zasadowym, opisanym po raz pierwszy jako selektywny barwnik amyloidu w roku 1959 przez Vassara I Cullinga (Arch. Pathol. 68: 487 (1959)). Schwartz i in. (Zbl. Path. 106: 320 (1954)) jako pierwsi opisali zastosowanie tioflawiny S, barwnika kwasowego, jako barwnika dla amyloidu w roku 1964. Od tego czasu zbadano szczegółowo właściwości zarówno tioflawiny T jak i tioflawiny S. Kelenyi J. Histochem. Cytochem. 15: 172 (1967); Burns i in. J. Path. Bact. 94:337 (1967); Guntern i in. Experientia 48: 8 (1992); LeVine Meth. Enzymol. 309: 274 (1999). Tioflawinę S powszechnie stosowano w pośmiertnych badaniach odkładania się amyloidu w mózgu chorych na AD, w których technika ta okazała jedną spośród najbardziej czułych technik wykrywania płytek starczych. Vallet i in. Acta Neuropathol. 83: 170 (1992). Tioflawinę T stosowano często jako odczynnik w doświadczeniach nad agregacją rozpuszczalnego białka amyloidu i tworzenia włókienek o konformacji beta-płaszczyzny. LeVine Prot. Sci. 2: 404 (1 993). Jako środki do obrazowania amyloidu proponowano również pochodne amin czwartorzędowych pokrewne do tiofiawiny T, chociaż nie przedstawiono żadnego dowodu na wychwytywanie ich przez mózg. Capra i in. opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 6001331.

Dlatego też potrzebne są związki wiążące się z amyloidem, które przenikają do mózgu i selektywnie łączą się z amyloidem.

Potrzebne są również nietoksyczne i dostępne biologicznie związki wiążące się z amyloidem, które można w konsekwencji zastosować w lecznictwie.

Jednym z celów niniejszego wynalazku jest wytwarzanie związków służących do bezpiecznego i specyficznego przedśmiertnego diagnozowania AD metodą obrazowania amyloidu w tkance mózgowej in vivo.

Innym celem niniejszego wynalazku jest sposób identyfikacji złogów amyloidowych w mózgu osób chorych na AD przed ich śmiercią, przy zastosowaniu sondy o wysokim powinowactwie do amyloidu, charakteryzującej się niską toksycznością, przenikającą barierę krew-mózg i działającą wyłącznie w mózgu osób chorych na AD.

Wymienione cele osiągnąć można przez rozwiązania według wynalazku.

Zgodnie z jednym aspektem wynalazku, istotą wynalazku jest wiążący amyloid związek o wzorze ogólnym (I) lub jego nietoksyczna, rozpuszczalna w wodzie sól:

w którym Z oznacza atom S, 12 w którym Y oznacza NR¹R²,

PL 215 711 B1

w którym atom azotu nie jest czwartorzędową aminą;

w którym każdy R¹ i R² jest niezależnie wybrany z grupy obejmującej atom H i C1-C8-alkil, każdy z R³-R⁷, R⁹ i R¹⁰ oznacza atom wodoru,

R⁸ oznacza atom wodoru, C1-C8-alkil, lub OR', gdzie R' oznacza H albo grupę C1-C8-alkilową;

10 3 131 przy czym przynajmniej jeden z podstawników R¹-R¹⁰ jest wybrany z grupy obejmującej ³H, ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F, CH2-CH2-X*, O-CH2-CH2-X*, CH2-CH2-CH2-X*, O-CH2-CH2-CH2-X* (w którym

X* = ¹³¹I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br lub ¹⁸F), ¹⁹F, ¹²⁵I, podstawnik zawierający atom węgla jest wybrany z grupy obejmującej C1-C8-alkil, (CH2)nOR', CF3, CH2-CH2X, O-CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X, O-CH2-CH2-CH2X (w którym X = F, Cl, Br lub I), CN, (C=O)-R', (C=O)N(R')2, O(CO)R', COOR', CR'=CR'-Rph, i CR2'11 13 14

-CR2'-Rph, w którym przynajmniej jeden atom węgla oznacza ¹¹C, ¹³C lub ¹⁴C.

Dla związku według wynalazku korzystne jest, gdy znacznik radioaktywny przy jednym z pod3 10 131 123 18 11 75 76 stawników R³-R¹⁰ jest wybrany z grupy obejmującej ¹³¹I, ¹²³I, ¹⁸F, ¹¹C, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, a jeszcze korzystniej gdy ο ί ή Ί Ί Ί znacznik izotopowy przy jednym z podstawników R³-R¹⁰ jest wybrany z grupy obejmującej ¹¹C i ¹⁸F. 12

Korzystnie dla związku według wynalazku jest, gdy Z = S, Y = N, R' = H, R¹ = H, a R² = CH3,

1Π 19 8 a R³-R¹⁰ oznacza H, bardzie] korzystnie, gdy R¹ = H, R² = CH3, a R⁸ jest wybrany z grupy obejmującej CN, CH3, OH, i OCH3.

Najkorzystniej, gdy związkami według wynalazku są:

PL 215 711 B1

Inne rozwiązanie wynalazku dotyczy metody syntezowania związków.

Sposób syntezy związku według wynalazku, w którym przynajmniej jeden z podstawników

R³-R¹⁰ jest wybrany z grupy obejmującej ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F i ¹⁹F, charakteryzuje się tym, że ₁ obejmuje etap znakowania związku według wynalazku, w którym Z = S, Y = N, R¹ = H, i co najmniej 3 10 jeden spośród podstawników R³-R¹⁰ oznacza trialkilocynę, na drodze reakcji związku z substancją zawierającą ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F lub ¹⁹F.

Następnym rozwiązaniem według wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do obrazowania złogów amyloidowych in vivo.

Kompozycja farmaceutyczna do obrazowania in vivo złogów amyloidu, zawierająca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzuje się tym, że zawiera związek o wzorze ogólnym (I), określony tak jak w wynalazku, a korzystnie zawiera związek o wzorze ogólnym (I), w którym Z = S, Y = N, i R¹ = H.

Inne rozwiązanie według wynalazku obejmuje zastosowanie kompozycji.

Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej według wynalazku charakteryzuje się tym, że kompozycję stosuje się do wytwarzania preparatu do wykrywania in vivo złogów amyloidu u pacjenta, poprzez podawanie wykrywalnej ilości tego preparatu i wykrywanie wiązań związku zawartego w kompozycji ze złogami amyloidu. W zastosowaniu korzystnie jest, gdy złogi amyloidu znajdują się w mózgu pacjenta, a zwłaszcza pacjenta który cierpi na chorobę lub zespół chorobowy wybrany z grupy obejmującej chorobę Alzheimera, rodzinną postać choroby Alzheimera, zespół Downa, i jest homozygotą pod względem allelu E4 apolipoproteiny. Korzystne w zastosowaniu jest, gdy wykrywanie obejmuje takie metody jak obrazowanie przy użyciu promieniowania gamma, rezonans magnetyczny i spektroskopię rezonansu magnetycznego, zaś obrazowanie przy użyciu promieniowania gamma obejmuje tomografię pozytronową emisyjna (PET) albo tomografię komputerową z emisją pojedynczego fotonu (SPECT). Korzystnie jest też, gdy kompozycję farmaceutyczną podaje się stosując zastrzyk dożylny. W zastosowaniu kompozycji korzystnie jest, gdy stosunek (i) wiązania związku zawartego w kompozycji z obszarem mózgu innym niż móżdżek, do (ii) wiązania tego związku z móżdżkiem pacjenta, jest porównywany z takim stosunkiem u zdrowego pacjenta.

Inne rozwiązanie według wynalazku obejmuje zastosowanie związku.

Zastosowanie związku o wzorze ogólnym (I) określonego tak jak w wynalazku, lub jego nietoksycznej, rozpuszczalnej w wodzie soli, charakteryzuje się tym, że związek stosuje się do wytwarzania preparatu do wykrywania złogów amyloidu w próbce z biopsji lub pośmiertnej tkance ludzkiej lub zwierzęcej, poprzez:

(a) inkubację utrwalonej w formalinie lub świeżo zamrożonej tkanki z roztworem preparatu, do uzyskania wyznakowanych złogów, a następnie, (b) wykrywanie wyznakowanych złogów.

Dla powyższego zastosowania związku korzystne jest, gdy roztwór preparatu składa się z 25-100% etanolu, a pozostałość roztworu stanowi woda, przy czym roztwór jest nasycony związkiem o wzorze ogólnym (I) lub jego nietoksyczną, rozpuszczalną w wodzie solą, określonych tak jak w wynalazku. W szczególnie korzystnym aspekcie tego rozwiązania, roztwór preparatu składa się z wodnego buforu zawierającego 0-50% etanolu, przy czym roztwór zawiera od 0,0001 do 100 μΜ związku wiążącego amyloid. W szczególnie korzystnym aspekcie tego rozwiązania, wykrywanie przeprowadza się z zastosowaniem technik mikroskopowych wybranych z grupy obejmującej mikroskopię w jasnymi polu, mikroskopię fluorescencyjną, laserową mikroskopię konfokalną, i mikroskopię z polaryzacją krzyżową.

Zastosowanie związku o wzorze ogólnym (I), określonym tak jak w wynalazku, lub jego nietoksycznej, rozpuszczalnej w wodzie soli, w innym alternatywnym rozwiązaniu według wynalazku charakteryzuje się tym, że związek służy do wytwarzania preparatu do określania ilości amyloidu w próbce z biopsji lub w tkance pobranej pośmiertnie, poprzez:

(a) inkubację znakowanej radioaktywnie pochodnej związku zawartego w preparacie z homogenatem z biopsji lub tkanki pobranej pośmiertnie, przy czym co najmniej jeden spośród podstawniΊ Ί ΓΊ ή Οή ków R¹-R¹⁰ związku jest znakowany znacznikiem radioaktywnym wybranym z grupy obejmującej ¹²⁵I, 3 14 ³H i podstawnik zawierający atom węgla, w którym co najmniej jeden atom węgla oznacza ¹⁴C, (b) oddzielenie związanej z tkanką od niezwiązanej z tkanką znakowanej radioaktywnie pochodnej związku, (c) ilościowe określenie związanej z tkanką znakowanej radioaktywnie pochodnej związku, i

PL 215 711 B1

d) poddanie konwersji jednostek związanych z tkanką znakowanej radioaktywnie pochodnej związku do jednostek wyrażonych w mikrogramach amyloidu na 100 mg tkanki w porównaniu z wzorcem.

Inne modyfikacje rozwiązań według wynalazku będą oczywiste dla fachowców w dziedzinie, po zapoznaniu się z opisem i praktycznym zastosowaniu ujawnionego tu wynalazku. Dane w opisie należy traktować jako przykładowe, a właściwy zakres i myśl przewodnia wynalazku zostały ujęte w zastrzeżeniach patentowych.

Poniżej przedstawiono krótki opis załączonych do wynalazku rysunków.

Fig. 1 przedstawia wzory tioflawiny S i tioflawiny T.

Fig. 2 przedstawia wzory dwóch pochodnych tioflawiny według wynalazku.

Fig. 3 przedstawia cztery kolejne wybarwione fluorescencyjnie skrawki czołowej części kory mózgowej pacjenta cierpiącego na AD.

Fig. 4 przedstawia proponowane miejsca wiązania chryzaminy G i tioflawiny T we włókienkach o konformacji β-płaszczyzny.

Fig. 5 przedstawia wyniki testu współzawodnictwa z zastosowaniem chryzaminy G, tioflawiny S i tioflawiny T i pochodnych według wynalazku (BTA-0, BTA-1 i BTA-2).

Fig. 6 przedstawia rozkład w czasie radioaktywności w korze czołowej pawianów po nastrzyknięciu znakowanymi BTA-1, 6-Meo-BTA-1 i 6-Me-BTA-1.

Fig. 7 przedstawia obraz uzyskany w wyniku poprzecznej pozytronowej tomografii emisyjnej dwóch poziomów mózgu pawiana po wstrzyknięciu dożylnym [N-metylo-¹¹C] BTA-1.

Fig. 8 przedstawia uzyskane pośmiertnie skrawki mózgu ludzkiego i transgenicznej myszy wybarwione pochodna według wynalazku (BTA-1).

Fig. 9 przedstawia znakowanie płytek amyloidowych i amyloidu naczyniowego in vivo barwionych pochodną według wynalazku (BTA-1) u żywych transgenicznych myszy odwzorowane przy zastosowaniu mikroskopii wielofotonowej.

Podstawą niniejszego wynalazku jest stwierdzenie zdolności związków tioflawiny i ich znakowanych radioaktywnie pochodnych do przenikania przez barierę krew-mózg in vivo i łączenia się z Αβ zgromadzonym w płytkach starczych (nie rozproszonych), z Αβ osadzonym w amyloidzie naczyń mózgowych i z amyloidem składającym się z białka osadzanego w NFT. Związki według niniejszego wynalazku są nie-czwartorzędowymi pochodnymi aminowymi tioflawiny S i T znanymi z tego, że barwią amyloid w skrawkach tkankowych i łączą się z syntetycznym Αβ in vitro. Kelenyi J. Histochem. Cytochem. 15: 172 (1967); Burns i In., J. Path. Bact. 94:337 (1967); Guntern i in. Experientia 48: 8 (1992); LeVine Meth. Enzymol. 309: 274 (1999).

Pochodne tioflawiny według niniejszego wynalazku wykazują następujące właściwości: (1) wiążą się specyficznie z syntetycznym Αβ in vitro i (2) wykazują zdolność do przenikania nie zaburzonej bariery krew-mózg in vivo.

Stosowany tu, w celu opisania pochodnych tioflawiny termin „niższy alkil oznacza rozgałęzioną lub prostołańcuchową grupę C1-C8, korzystnie C1-C6 i najkorzystniej C1-C4 (np. metyl, etyl, propyl lub 1 14 butyl). Gdy R¹-R¹⁴ określa się jako „trialkilocynę, wówczas grupa ta oznacza tri-C1-C8alkilo-Sn, korzystnie tri-C1-C6alkilo-Sn, najkorzystniej związek tri-C1-C4alkilo-Sn (np. metyl, etyl, propyl lub butyl).

Metoda według wynalazku określa występowanie i położenie złogów amyloidu w narządzie lub powierzchni ciała, korzystnie mózgu pacjenta. Obecna metoda obejmuje podawanie pacjentowi kompozycji farmaceutycznej w wykrywalnej ilości zawierającej związek wiążący amyloid wybrany spośród Struktur A-E lub F-J, jak zdefiniowano powyżej, zwany „wykrywalnym związkiem, lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól rozpuszczalną w wodzie. „Wykrywalna ilość oznacza, że ilość wykrywalnego związku tj. podawana ilość jest wystarczająca, by umożliwiać wykrywanie wiązania związku do amyloidu. „Obrazowanie skutecznej ilości oznacza, że ilość wykrywalnego związku tj. podawana ilość jest wystarczająca, aby umożliwiać obrazowanie wiązania związku do amyloidu.

Wynalazek wykorzystuje sondy amyloidu, które w połączeniu z nieinwazyjnymi technikami neuroodwzorowania takimi jak spektroskopia magnetycznego rezonansu (MRS) lub obrazowanie (MRI) albo obrazowanie gamma, takie jak tomografia pozytronowa emisyjna (PET) lub tomografia komputerowa z emisją pojedynczego fotonu (SPECT), stosuje się w celu ilościowego określenia złogów amyloidu in vivo. Termin „obrazowanie in vivo odnosi się do dowolnej metody, która umożliwia wykrywanie znakowanej pochodnej tioflawiny, która jest wybrana spośród opisanych powyżej Struktur A-E lub F-J. W przypadku obrazowania gamma, mierzy się promieniowanie emitowane z badanego narządu lub powierzchni i wyraża albo jako całkowite wiązanie lub jako stosunek, gdzie całkowite wiązanie w jed8

PL 215 711 B1 nej tkance odnosi się (np. przez dzielenie) do całkowitego wiązania w innej tkance dla takiego samego przypadku, podczas takiej samej procedury obrazowania in vivo. Całkowite wiązanie in vivo określa się jako cały sygnał wykrywany w tkance z zastosowaniem techniki obrazowania in vivo bez potrzeby korekcji przez drugi zastrzyk identycznej ilości znakowanego związku wraz z dużym nadmiarem nieznakowanego, ale chemicznie identycznego związku. Termin „podmiot oznacza ssaka, korzystnie człowieka i najkorzystniej człowieka z demencją.

W przypadku obrazowania in vivo, głównym czynnikiem kierującym wyborem danego znacznika jest typ dostępnego przyrządu do wykrywania. Na przykład do obrazowania in vivo z zastosowaniem 19 metod według niniejszego wynalazku szczególnie odpowiednie są radioaktywne izotopy i ¹⁹F. Wybór radionuklidu lub trwałego izotopu zależy od typu stosowanego przyrządu. Oznacza to, że dany typ przyrządu musi wykrywać wybrany radionuklid. Pod uwagę należy również wziąć okres półtrwania radionuklidu, który powinien być wystarczająco długi, aby można go było wciąż wykryć w czasie maksymalnego wychwytu przez tkankę docelową, a jednocześnie wystarczająco krótki, aby pacjent nie był poddawany szkodliwemu napromienianiu. Znakowane radioaktywnie związki według wynalazku można wykrywać z zastosowaniem obrazowania gamma, w którym wykrywa się emitowane promieniowanie gamma o odpowiedniej długości fali. Metody obrazowania gamma obejmują między innymi SPECT i PET. Korzystnie, w przypadku wykrywania metodą SPECT, wybrany znacznik radioaktywny nie charakteryzuje się jednorodną emisją, ale emituje dużą liczbę fotonów o energii w zakresie

140-200 keV. W przypadku wykrywania metodą PET, znacznikiem radioaktywnym będzie radionuklid 19 emitujący pozytron taki jak ¹⁹F, który rozpada się z wytworzeniem dwóch wiązek promieni gamma o energii 511 keV, co wykrywa kamera PET.

Związki według niniejszego wynalazku wiążące amyloid/sondy są przydatne do obrazowania mózgu in vivo i ilościowej oceny złogów amyloidu. Związki te można stosować w połączeniu z nieinwazyjnymi technikami takimi jak spektroskopia rezonansu magnetycznego (MRS) lub obrazowanie (MRI), emisyjna tomografia pozytronowa (PET) i tomografia komputerowa z emisją pojedynczego 19 fotonu (SPECT). Zgodnie z wynalazkiem, pochodne tioflawiny można znakować z zastosowaniem ¹⁹F 13 lub ¹³C w przypadku MRS/MRI przy użyciu ogólnych technik chemii organicznej znanych w tej dziedzinie. Patrz, np. March, J. Advanced Organic Chemistry: Reactions, mechanisms and structure (Wydanie 3, 1985), którego treść niniejszym załącza się na zasadzie odsyłacza. Pochodne tioflawiny można także znakować radioaktywnie stosując ¹⁸F, ¹¹C, ⁷⁵Br lub ⁷⁶Br w przypadku technik PET dobrze znanych w dziedzinie i opisanych przez Fowler'a, J. i Wolf'a, A. w Positron Emission Tomography and Autoradiography (Phelps, M., Mazziota, J i Schelbert, H. eds.), strony 391-450 (Raven Press, NY

1986), którego treść niniejszym załącza się na zasadzie odsyłacza. Pochodne tioflawiny można także 123 znakować radioaktywnie stosując ¹²³I przypadku SPECT według dowolnych technik znanych w dziedzinie. Patrz, np. Kulkarni, Int. J. Rad. Appl. & Inst. (Część B) 18: 647 (1991), którego treść załącza się niniejszym na zasadzie odsyłacza. Ponadto, pochodne tioflawiny można znakować z zastosowaniem dowolnych odpowiednich radioaktywnych izotopów jodu, takich jak, lecz nie ogranid O d d Q C ΊΟ⁷} czając się do nich, ¹³¹I, ¹²⁵I lub ¹²³I, metodą dwuazowego jodowania pochodnej aminowej bezpośrednio poprzez jodek dwuazoniowy, patrz Greenbaum, F. Am. J. Pharm. 108: 17 (1936) lub przez konwersję nietrwałej dwuazowej aminy do trwałego tria zenu lub też przez konwersję nieradioaktywnego fluorowcowanego prekursora w trwałą pochodną trialkilocyny, którą następnie można przekształcić w związek jodowy, stosując kilka metod dobrze znanych w tej dziedzinie. Patrz, Satyamurthy i Barrio J. Org. Chem. 48: 4394 (1983), Goodman i in., J. Org. Chem. 49: 2322 (1984) i Mathis i in., J. Labell. Comp. And Radiopharm. 1994: 905; Chumpradit i In., J. Med. Chem. 34: 877 (1991); Zhuang i in., J. Med. Chem. 37: 1406 (1994); Chumpradit etal., J. Med. Chem. 37: 4245 (1994). Na przykład trwały tria zen lub trailkilocynową pochodną tioflawiny lub jej analogi poddaje się reakcji z środkiem fluorowdod d d OO 7C 7C dfi d Q cującym obejmującym ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F lub ¹⁹F. Zatem, według niniejszego wynalazku trwałe trialkilocynowe pochodne tioflawiny i ich analogi stanowią nowe prekursory przydatne w syntezie wielu związków radioaktywnych. Trialkilocynowe pochodne stanowią jedno z rozwiązań według wynalazku.

Pochodne tioflawiny można także znakować radioaktywnie wykorzystując znane metaliczne znaczniki radioaktywne, takie jak Technet-99m (^99mTc). Modyfikację podstawników w celu wprowadzenia ligandów łączących takie jony metali można przeprowadzić, stosując nieskomplikowane metody znane w dziedzinie radioznakowania. Pochodną tioflawiny znakowaną metalem radioaktywnym można ponadto stosować do wykrywania złogów amyloidu. Sposób przygotowania znakowanej radioaktywnie pochodnej Tc^99m jest dobrze znane w dziedzinie. Patrz, np. Zhuang i in., „Neutral and stereospecyfic Tc-99m complexes: [99mTc]N-benzyl-3,4-di-(N-2-mercaptoethyl)-aminopyrrolidines

PL 215 711 B1 (P-BAT) Nuclear Medicine & Biology, 26 (2): 217-24, (1999); Oya i in., „Small and neutral Tc(v)0 BAT, bisaminoethanethiol (N2S2) complexes for developing new brain imaging agents Nuclear Medicine & Biology 25 (2): 135-40, (1998) i Horn i in., „Technetium-99m-labeled receptor-specyfic small-molecule radiopharmaceuticals: recent developments and encouraging results Nuclear Medicine & Biology 24 (6): 485-98, (1997).

W celu obrazowania in vivo w metodach według niniejszego wynalazku można stosować izotopy wykrywalne metodą spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego. Pierwiastki szczególnie

13 przydatne w spektroskopii rezonansu magnetycznego obejmują ¹⁹F i ¹³C.

Odpowiednie radioizotopy dla celów wynalazku obejmują źródła promieniowania beta, źródła promieniowania gamma, źródła pozytronów i źródła promieniowania rentgenowskiego. Radioizotopy 131 123 18 11 75 76 obejmują ¹³¹I, ¹²³I, ¹⁸F, ¹¹C, ⁷⁵Br i ⁷⁶Br. Według wynalazku, odpowiednie trwałe izotopy do zastosowa19 nia w obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego (MRI) lub spektroskopii (MRS) obejmują ¹⁹F 13 i ¹³C. Odpowiednie radioizotopy do ilościowej oceny in vitro amyloidu w homogenatach z tkanki pobranej metodą biopsji lub pośmiertnie obejmują ¹²⁵I, ¹⁴C i ³H. Korzystnymi znacznikami radioaktywnymi

1118 198 są ¹¹C lub ¹⁸F do zastosowania w obrazowaniu PET in vivo, ¹²³I do zastosowania w obrazowaniu 19 3 14

SPECT, ¹⁹F w przypadku MRS/MRI i ³H lub ¹⁴C do badań in vitro. Jednakże, według wynalazku można stosować dowolne typowe metody obrazowania sond diagnostycznych.

Sposób ten można stosować do diagnozowania AD w łagodnych lub niepewnych klinicznie przypadkach. Technika ta umożliwia także długotrwałe badania odkładania się amyloidu w populacjach ludzkich o wysokim ryzyku powstawania takich złogów, w przypadkach takich jak zespół Downa, rodzinna AD i homozygotyczność pod względem alleli apolipoproteiny E4. Corder i in., Science 261: 921 (1993). Dzięki sposobowi, który umożliwia śledzenie zmian czasowych odkładania się amyloidu, można określić czy proces osadzania Αβ ma miejsce na długo przed wystąpieniem demencji lub czy osadzanie się Αβ nie jest związane z demencją. Sposób ten można stosować do monitorowania skuteczności terapii, której celem jest zapobieganie odkładaniu się amyloidu.

Zazwyczaj, dawkowanie znakowanej pochodnej tioflawiny będzie się zmieniać zależnie od czynników takich jak wiek, ogólny stan zdrowia, płeć i stan zaawansowania choroby, przeciwwskazań, jeśli występują, terapii towarzyszących i innych zmiennych, co podlega ocenie lekarza specjalisty. Dawkowanie może się wahać w zakresie od 0,001 ng/kg do 10 μg/kg, korzystnie od 0,01 μg/kg do 1,0 μg/kg.

Związki według wynalazku można podawać miejscowo lub systemowo: dożylnie, dotętniczo, dooponowo (poprzez płyn rdzeniowy) lub w podobny sposób. Można zastosować również podawanie doskórne lub do jamy ciała, zależnie od badanego miejsca w organizmie. Po czasie wystarczającym do związania się związku z amyloidem, np. 30 minut do 48 godzin, konkretny obszar ciała pacjenta bada się z zastosowaniem typowych technik obrazowania takich jak MRS/MRI, SPECT, scyntylacja planarna, PET oraz dowolnych innych technik obrazowania. Dokładna procedura będzie się zmieniać w zależności od czynników wskazanych powyżej oraz w zależności od badanego obszaru ciała, sposobu podawania i zastosowanego typu znacznika; wyznaczenie konkretnego sposobu jest dla fachowca zadaniem rutynowym. Korzystnie, w przypadku obrazowania mózgu, mierzy się ilość (całkowitą lub związaną specyficznie) związanej znakowanej radioaktywnie pochodnej tioflawiny lub jej analogu według niniejszego wynalazku i porównuje się (w formie proporcji) z ilością znakowanej pochodnej tioflawiny związanej z móżdżkiem pacjenta. Tę proporcję porównuje się następnie z odpowiednią proporcją uzyskaną w wyniku badania tkanki mózgowej zdrowego pacjenta w tym samym wieku.

Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku podaje się korzystnie w postaci do wstrzykiwania, lecz zapewne je także przygotować w postaci dobrze znanych układów do podawania leku [np. doustnie, doodbytniczo, pozajelitowo (dożylnie, domięśniowo lub podskórnie) podpotylicznie, dopochwowo, dootrzewnowo, miejscowo (proszki, maści lub krople) lub w postaci spraju podpoliczkowego lub donosowego]. Typowa kompozycja zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Przykładowo kompozycja może zawierać około 10 mg albuminy surowicy ludzkiej i od około 0,5 do 500 mikrogramów znakowanej pochodnej tioflawiny na mililitr buforu fosforanowego zawierającego NaCl. Inne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki obejmują roztwory wodne, nietoksyczne rozczynniki, obejmujące sole, środki konserwujące, bufory itp., opisane np. w Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 15. Easton: Mack Publishing Co. str. 1405-1412 i 1461-1487 (1975) i w National Formulary XIV., wyd. 14 Washington: American Pharmaceutical Association (1975), których treść załącza się niniejszym na zasadzie odsyłacza.

Przykłady niewodnych rozpuszczalników obejmują glikol propylenowy, glikol polietylenowy, olej roślinny i organiczne estry do wstrzykiwania takie jak oleinian etylu. Wodne nośniki obejmują wodę,

PL 215 711 B1 roztwory wodno-alkoholowe, roztwory solanki, rozczynniki do podawania pozajelitowego takie jak chlorek sodu, dekstroza Ringera itp. Rozczynniki do podawania dożylnego obejmują płynne i odżywcze środki uzupełniające. Środki konserwujące obejmują środki przeciwbakteryjne, przeciwutleniacze, środki chelatujące i obojętne gazy. Wartość pH i dokładną ilość różnych składników kompozycji farmaceutycznej można regulować typowymi technikami znanymi fachowcom w tej dziedzinie. Patrz, Goodman i Oilman Pharmacological Basis for Therapeutics (wyd. 7).

Szczególnie korzystnymi kompozycjami farmaceutycznymi według wynalazku są te które, oprócz właściwości specyficznego wiązania się z amyloidem in vivo i zdolności do przenikania bariery krew-mózg, są także nietoksyczne przy odpowiednich poziomach dawkowania i mają zadowalający czas działania.

Według niniejszego wynalazku, kompozycję farmaceutyczną zawierającą związki tioflawiny wiążące się z amyloidem, podaje się wymagającemu tego pacjentowi, u którego przewidywane jest powstawanie amyloidu lub włókienek amyloidowych. W korzystnym rozwiązaniu, pacjentem takim jest człowiek z grupy obejmującej ludzi zagrożonych ryzykiem wystąpienia amyloidu mózgowego, takich jak np. osoby w podeszłym wieku nie cierpiące na demencję i pacjenci cierpiący na choroby związane z amyloidozą i cukrzycę typu II. Termin „zapobieganie w zamierzeniu obejmuje łagodzenie procesu degeneracji komórek i toksyczności związanej z powstawaniem włókienek. Termin „poprawa oznacza leczenie lub zapobieganie cięższej postaci degeneracji komórek i toksyczności u pacjentów z występującymi już objawami takimi jak demencja.

Kompozycja farmaceutyczna zawiera opisane powyżej związki tioflawiny wiążące się z amyloidem i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W jednym rozwiązaniu, taka kompozycja farmaceutyczna zawiera albuminę surowicy, związki tioflawiny wiążące się z amyloidem i bufor fosforanowy zawierający NaCl. Inne farmaceutycznie dopuszczalny nośniki obejmują roztwory wodne, nietoksyczne rozczynniki, w tym sole, środki konserwujące, bufory itp., jak opisano np. w Remington Pharmaceutical Sciences, wyd. 15, Easton: Mack Publishing Co., str. 1405-1412 i 1461-1487 (1975) i w National Formulary XIV., wyd. 14 Washington: American Pharmaceutical Association (1975) I W United States Pharmacopeia XVIII, wyd. 18 Washington: American Pharmaceutical Association (1995), których treść załącza się niniejszym na zasadzie odsyłacza.

Przykłady niewodnych rozpuszczalników obejmują glikol propylenowy, glikol polietylenowy, olej roślinny i organiczne estry do wstrzykiwania takie jak oleinian etylu. Wodne nośniki obejmują wodę, roztwory wodno-alkoholowe, roztwory solanki, rozczynniki do podawania pozajelitowego takie jak chlorek sodu, dekstroza Ringera itp. Rozczynniki do podawania dożylnego obejmują płynne i odżywcze środki uzupełniające. Środki konserwujące obejmują środki przeciwbakteryjne, przeciwutleniacze, środki chelatujące i obojętne gazy. Wartość pH i dokładne stężenie różnych składników kompozycji farmaceutycznej można regulować typowymi technikami znanymi fachowcom w tej dziedzinie. Patrz, Goodman i Oilman Farmacological Basis for Therapeutics (wyd. 7).

Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku można podawać doustnie, w postaci ciekłej lub stałej, lub wstrzykiwać dożylnie lub domięśniowo, w postaci zawiesiny lub roztworu. Termin „farmaceutycznie skuteczna ilość oznacza ilość zapobiegającą degeneracji komórek i toksyczności związanej z powstawaniem włókienek. Taka ilość będzie się zmieniać w zależności od wieku, masy ciała i stanu pacjenta, i może być indywidualnie dostosowywana przez fachowców w tej dziedzinie zgodnie z dobrze znanymi procedurami. W jednym rozwiązaniu, dawkowanie mieści się w zakresie pomiędzy 0,1 i 100 mg/kg podawanych raz dziennie lub w przypadku mniejszych dawek od dwóch do czterech razy dziennie. Taki reżim powinien być utrzymywany przez cały pozostały okres życia pacjenta. Alternatywnie, kompozycję farmaceutyczną można podawać domięśniowo w dawkach w zakresie od 0,1 do 100 mg/kg w ostępach od 1 do 6 tygodni.

Według aspektu wynalazku dotyczącego sposobu wykrywania złogów amyloidowych w materiale biopsyjnym lub w pośmiertnie pobranej tkance, sposób ten obejmuje inkubację utrwalonej w formalinie tkanki z zastosowaniem roztworu związku tioflawiny wiążącego amyloid wybranego spośród związków o wzorze A-E lub F-J, opisanych powyżej. Korzystnie, roztwór ten zawiera 25-100% etanolu (resztę stanowi woda) i jest nasycony związkiem tioflawiny wiążącym amyloid według wynalazku. Po inkubacji, związek barwi lub znakuje złogi amyloidowe w tkance, przy czym zabarwienie lub znakowanie złogu można wykryć lub uwidocznić stosując dowolną standardową procedurę. Wykrywanie przeprowadza się z zastosowaniem technik mikroskopowych wybranych z grupy obejmującej badanie mikroskopowe w jasnym polu, fluorescencyjne, laserowo-konfokalne i polaryzacji krzyżowej.

PL 215 711 B1

Sposób ilościowego oznaczania amyloidu w materiale biopsyjnym lub w pobranej pośmiertnie tkance obejmuje inkubację znakowanej pochodnej tioflawiny według wynalazku lub jej rozpuszczalnej w wodzie, nietoksycznej soli, wraz z homogenatem tkanki pobranej w wyniku biopsji lub pobranej po śmierci. Tkankę pobiera się i homogenizuje przy zastosowaniu procedur dobrze znanych w tej dziedzinie. Korzystnym znacznikiem jest znacznik radioaktywny, chociaż można stosować inne znaczniki takie jak enzymy, związki chemiluminescencyjne i immunofIuorescencyjne dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie. Korzystnym znacznikiem radioaktywnym jest ¹²⁵I, ¹⁴C lub ³H, a korzystnym wyznakowanym podstawnikiem związku wiążącego amyloid wybranego spośród związków o wzorach A-E lub

14

F-J jest co najmniej jeden spośród R³-R¹⁴. Znakowane pochodne związków tioflawiny wiążące się z amyloidem według wynalazku wiążą się z tkanką zawierającą złogi amyloidowe. Tkankę związaną ze znacznikiem oddziela się następnie od tkanki niezwiązanej ze znacznikiem, stosując dowolną procedurę znaną fachowcom w tej dziedzinie, taką jak np. przesączanie. Ilość związanego z tkanką znacznika można następnie określić ilościowo stosując dowolne techniki znane fachowcom w tej dziedzinie. Jednostki określające ilość związanej z tkanką znakowanej radioaktywnie pochodnej tioflawiny przelicza się następnie na mikrogramy amyloidu na 100 mg tkanki, porównując z krzywą wzorcową wykreśloną na podstawie inkubacji znanych ilości amyloidu ze znakowaną radioaktywnie pochodną tioflawiny.

Sposób odróżniania tkanki mózgowej pochodzącej od chorego na chorobę Alzheimera od zdrowej tkanki mózgowej obejmuje otrzymywanie tkanki z (i) móżdżku i (ii) innej niż móżdżek części tego samego mózgu, od osób zdrowych i od osób podejrzewanych o chorobę Alzheimera. Z tkanek tych przygotowuje się oddzielne homogenaty, stosując procedury dobrze znane fachowcom, a następnie inkubuje się je wraz z znakowanym radioaktywnie związkiem tioflawiny wiążącym amyloid. Ilość znakowanego radioaktywnie związku tioflawiny wiążącego amyloid, który łączy się z tkanką oblicza się następnie dla każdego typu tkanki (np. móżdżku, tkanki innej niż móżdżek, prawidłowej, nieprawidłowej) po czym oblicza się stosunek ilości związku związanego z tkanką inną niż móżdżek do ilości związku związanego z tkanką móżdżku dla tkanki pochodzącej od zdrowych osób i tkanki pochodzącej od pacjentów podejrzewanych o chorobę Alzheimera. Następnie te proporcje porównuje się. Jeśli wartość proporcji uzyskanej w wyniku porównania tkanki mózgowej pacjenta podejrzewanego o chorobę Alzheimera stanowi powyżej 90% wartości proporcji otrzymanej w wyniku badania prawidłowej tkanki mózgowej, można postawić diagnozę choroby Alzheimera. Prawidłowe proporcje można wyliczyć z uprzednio uzyskanych danych lub alternatywnie można podczas badania podejrzewanej tkanki mózgowej.

Modelowanie cząsteczek

Aby uzyskać łańcuchy peptydu Αβ o antyrównoległej konformacji beta-płaszczyzny przeprowadzono modelowanie cząsteczek, posługując się komputerowym programem modelującym Alchemy2000 Tripost, Inc. St. Louis, MO). Kirschner i in., Proc. Natl. Acad. Sci. opis patentowy U.S.A. nr. 83: 503 (1986). Peptydy amyloidowe umieszczono w pętlach w kształcie szpilki do włosów (Hilbich i in., J. Mol. Biol. 218: 149 (1991)) i użyto bez dodatkowej obróbki strukturalnej. Peptydy Αβ ułożono tak, aby naprzemianległe łańcuchy leżały w odległości 4,76 A, charakterystycznej dla włókienek o konformacji beta-płaszczyzny. Kirschner, powyżej. Pochodne tioflawiny T w konformacji najkorzystniejszej energetycznie ułożono w linii z modelem włókienkowym w celu zmaksymalizowania kontaktu z Asp-23/Gln-15/His-13 Αβ(1-42).

Charakterystyka specyficznego wiązania z syntetycznym peptydem Αβ: powinowactwo, kinetyka, maksymalne wiązanie

Właściwości wiązania pochodnej tioflawiny zanalizowano stosując syntetyczny Αβ (1-40) i 2-(4'-[¹¹C]metyloaminofenylo)benzotiazol ([N-metylo-¹¹C] BTA-1) w buforowanej fosforanem solance (pH

7,0) lub mieszaninie bufor glicynowy/20% etanol (pH 8,0), jak to opisano uprzednio dla wiązania chryzaminy G. Klunk i in., Neurobiol. Aging 15: 691 (1994).

PL 215 711 B1

Sekwencję aminokwasów Αβ (1-40) przedstawiono poniżej:

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Asp	Ala	Glu	Phe	Arg	His	Asp	Ser	Gly	Tyr	Glu	Val
13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23	24
His	His	Gln	Lys	Leu	Val	Phe	Phe	Ala	Glu	Asp	Val
25	26	27	28	29	30	31	32	33	34	35	36
Gly	Ser	Asn	Lys	Gly	Ala	Ile	Ile	Gly	Leu	Met	Val
37	38	39	40
Gly	Gly	Val	Val

Wytwarzanie pochodnych tioflawiny do barwienia tkanki

Zarówno tioflawinę S (ThS) jak i tioflawinę T (ThT) stosowano jako farmakofory (patrz np. Fig. 1). Należy zauważyć, że oba związki zawierają czwartorzędowe aminy i dzięki temu są w rezultacie raczej hydrofilowe.

Po syntezie związek [C-14]ThT zastosowano w celu określenia względnej lipofilowości, z wykorzystaniem współczynnika podziału oktanol-solanka buforowana fosforanem. Logarytm współczynnika podziału, logPoct dla [C-14]ThT wyniósł 0,57. Stwierdzono, że obecność czwartorzędowej aminy sprawia, że ThT jest zbyt polarna do skutecznego zastosowania jako środek obrazowania mózgu. Opierając się na wynikach uzyskanych w doświadczeniach nad lipofilowymi pochodnymi czerwieni Congo (nie obdarzone ładunkiem fenole w fizjologicznych wartościach pH, lecz potencjalnie podatne na jonizację z pKa ~8,5) (Klunk i in. Zgłoszenia międzynarodowe WO 96/34853 A1, WO 98/47969 A1, WO 99/24394 A2) w pochodnych ThT usunięto grupę metylową z atomu azotu benzotiazolu. Eliminacja grupy metylowej spowodowała usunięcie naładowanej czwartorzędowej aminy z heterocyklicznej części cząsteczki, pozostawiając aminę aromatyczną, o typowej wartości pKb ~5,5. Dla pochodnych ThT zastosowano skróconą nomenklaturę, w której BTA (benzotiazoloanilina) stanowi zasadowy łańcuch główny. Podstawniki w pierścieniu benzotiazolu umieszczono przed 'BC, a liczbę grup metylowych na atomie azotu aniliny umieszczono po 'A' (patrz np. Fig. 2).

i. Wstępne barwienie tkanki z zastosowaniem ThT i pochodnych

ThT (patrz, np. Fig. 1) jest fluorescencyjnym barwnikiem, który stosuje się do histologicznego barwienia amyloidu (Burns i in., The specifity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T Journal of Pathology & Bacteriology 94:337-344; 1967). ThT słabo barwi płytki (patrz, np. Fig. 3), sploty, włókna nerwowe i złogi amyloidu w naczyniach mózgowych (CVA) w mózgu chorych na AD. Wstępne barwienie tkanki wskazuje, że zarówno pierwszorzędowa amina 2-(4'-aminofenylo)-6-metylobenzotiazol (6-Me-BTA-O) jak i trzeciorzędowa amina 2-(4'-dimetyloaminofenylo)-6-metylobenzotiazol (6-Me-BTA-2) również barwią płytki i sploty w pobranej pośmiertnie tkance mózgowej pacjenta z AD (patrz, np. Fig. 3). Doświadczenia, w których stopniowo obniżano stężenia 6-Me-BTA-O i 6-Me-BTA-2 wykazały, że zabarwienia uzyskane przy zastosowaniu zarówno 6-Me-BTA-O jak i 6-Me-BTA-1 można w dalszym ciągu wykryć przy zastosowaniu roztworów barwiących zawierających tylko 10 nM związku BTA. Odwrotnie, BTP (2-fenylobenzotiazol) nie barwi płytek, jednakże, związek ten jest prawie tak samo fluorescencyjny jak pochodne BTA. Zatem, podczas opracowywania tych związków, wybarwianie tkanki miało na celu zarówno ocenę specyficzności barwienia tkanki mózgowej chorych osób na AD, jak również oszacowanie powinowactwa wiązania metodą testów przesiewowych roztworów barwiących w zakresach stężeń podobnych do stosowanych w testach wiązania.

ii. Modele wiązania pochodnych czerwieni Congo i ThT z Αβ

Istnieją pewne teorie dotyczące mechanizmu wiązania ThT z β-amyloidem, lecz żadna z nich nie została udowodniona, ani powszechnie zaakceptowana. Jednakże mechanizm ten jest specyficzny i powtarzalny (LeVine, „Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin

T Meth. Enzymol. 309:272-284; 1999). Zatem, na bazie następujących właściwości budowy i wiązania możliwa powinna być lokalizacja potencjalnego miejsca wiążącego (miejsc wiążących) na Αβ

PL 215 711 B1 i opracowanie modelu wiązania w sposób analogiczny do zastosowanego przy opracowaniu modelu wiązania czerwieni Congo (CR)/chryzamina-G (CG) (Klunk i in., „Development of small molecule probes for the beta-amyloid protein of Alzheimer's disease Neurobiol. Aging 15:691-698;1994.). Po pierwsze, ThT i CG przy fizjologicznych wartościach pH mają przeciwne ładunki i jest nieprawdopodobnym aby dzieliły one wspólne miejsce wiążące. Teza ta jest oparta na braku współzawodnictwa ₃ między ThT a [³H]CG w wiązaniu z włókienkami Αβ (patrz, np. Fig. 5).

Poprzednie badania budowy włókienek Αβ (Hilbich i in., „Aggregation and secondary structure of synthetic amyloid beta A4 peptides of Alzheimer's disease Journal of Molecular Biology 218:149-63; 1991) i wiązanie CR i CG z włókienkami Αβ, sugeruje model cząsteczkowy, w którym CG łączy się poprzez kombinację elektrostatycznych i hydrofobowych oddziaływań z obszarem Lys-16 (patrz, np. Fig. 4). Badania LeVine (LeVine powyżej) umożliwiają lokalizację miejsca wiązania ThT z Αβ, ujawniając, że ThT łączy się dobrze z Αβ12-28, lecz w niewielkim stopniu z Αβ25-35. Fakt ten sugeruje, że miejsce wiążące ThT leży pomiędzy 12, a 24 resztą Αβ. Prawdopodobnie, dodatnio naładowana cząsteczka ThT (amina czwartorzędowa) będzie przyciągana przez naładowaną ujemnie (kwasowej) resztę na Αβ. Pomiędzy aminokwasem 12 a 24, jedynymi resztami kwasowymi są Glu-22 i Asp-23. Obie te reszty są dobrymi kandydatami, lecz obecny model przewiduje, że Glu-22 konformacyjnie znajduje się w pobliżu Lys-16, miejsca wiążącego CG. W obecnie „funkcjonującym modelu miejsce wiążące ThT z częścią Asp-23 lokalizowane jest na przeciwnej stronie włókienka względem proponowanego miejsca wiążącego CG. Ponieważ kluczową cechą przy wiązaniu ThT (i CG) jest obecność włókienek o konformacji beta-płaszczyzny, wiązanie musi wymagać więcej niż tylko jednej reszty aminokwasowej. Miejsce wiążące może powstać wtedy gdy reszty nie oddziaływujące normalnie w monomerach występują obok siebie we włókienkach o konformacji beta-płaszczyzny. Dlatego też, nie wiążąc się z żadną teorią, przyjmuje się, że ThT oddziałuje również poprzez wiązania wodorowe z His-13 i Gln-15 znajdujących się na oddzielnej, sąsiadującej cząsteczce Αβ o konformacji betapłaszczyzny.

iii. Znakowanie radioaktywne ThT i testy wiązania wyznakowanego radioaktywnie liganda

Oszacowanie wiązania z tkanką metodą barwienia jest przydatne szczególnie w ocenie specyficzności. Związek BTP, który nie jest szczególnie fluorescencyjny, nie może dawać zabarwienia, ponieważ nie wiąże się wystarczająco dobrze lub nie jest wystarczająco fluorescencyjny. Oprócz barwienia tkanki AD, testy wiązania ilościowego można przeprowadzić metodą spektrofotometryczną (LeVine ibid). Test ten opiera się na przesunięciu widma metachromatycznego, które występuje gdy ThT łączy się z włókienkami amyloidowymi. Podczas gdy test ten może być przydatny jako indywidualny test przesiewowy wysoko fluorescencyjnych związków, wykazujących takie metachromatyczne przesunięcie, nie potwierdzono jego przydatności w testach współzawodnictwa. Przykładowo, powszechnie obserwuje się, że związki testowe (np. CG) wygaszają fluorescencję kompleksu ThT-Αβ (jak również samej ThT). Związki, które wygaszają, ale nie wiążą się z miejscem ThT, dawałyby fałszywy wynik.

Dlatego też korzystne jest zastosowanie znakowanej radioaktywnie ThT w typowych testy wiązania znakowanego radioaktywnie liganda ze zagregowanym Αβ. W teście tym, hamowanie wiązania znakowanej radioaktywnie ThT z Αβ wychwycone na filtrach odpowiada rzeczywistemu hamowaniu wiązania ThT, a związek testowy nie musi być wysoko fluorescencyjny.

Poniższe przykłady podano w celu ilustracji niniejszego wynalazku. Powinno być jednakże zrozumiałe, że specyficzne warunki lub szczegóły opisane w tych przykładach nie ograniczają zakresu wynalazku. W opisie tym, wszystkie ogólnie dostępne odsyłacze literaturowe, w tym opisy patentowe St. Zjedn. Ameryki nr, załącza się tu na zasadzie odsyłaczy.

P r z y k ł a d y

Wszystkie reagenty stosowane w syntezie zakupiono z firmy Aidrich Chemicai Company i użyto bez dalszego oczyszczania. Temperatury topnienia określono z zastosowaniem Mel-TEMP II i były ₁ niekorygowane. ¹H widmo NMR wszystkich związków zmierzono na aparacie Bruker 300 stosując TMS jako wzorzec wewnętrzny i były one zgodne z przypisanymi strukturami. Analizę TLC przeprowadzono stosując żel krzemionkowy 60 F254 z firmy EM Sciences i do detekcji stosowano lampę UV. Szybką chromatografię przeprowadzono na żelu krzemionkowym 60, rozmiar sita 230-400, zakupionym z firmy Mallinckrodt Company. TLC w fazie odwróconej zakupiono z firmy Whiteman Company.

P r z y k ł a d y s y n t e z

P r z y k ł a d 1: Synteza:

Droga 1: Przykład syntezy związków prymulinowych według przedstawionego poniżej schematu reakcji:

PL 215 711 B1

Pochodne prymulinowe wytwarza się według metody Schubert'a (Schubert, M. Zur Kenntnis der Dehydrotiotoluidinand Primulin-sulfosauren, Justus Liebigs Ann. Chem. 558, 10-33, 1947) poprzez kondensację 2-amino-5-metylotiofenolu z zastosowaniem chlorku 2-(p-nitrofenylo)benzotiazolo-6-karboksylowego i późniejszą redukcję grupy nitrowej z zastosowaniem chlorku cyny w etanolu. Podstawione pochodne zasady prymulinowej syntetyzuje się stosując odpowiedn ie podstawione

10 p-nitrobenzoilochlorki i R⁷-R¹⁰ podstawiony 2-aminotiofenol.

Postępując według takiej samej procedury jak powyżej, inne primuliny można syntetyzować przez zastąpienie odpowiednio podstawionej pochodnej kwasu 3-merkapto-4-aminobenzoesowego (np. kwasu 2-, 5- lub 6-metylo-3-merkapto-4-aminobenzoesowego), odpowiedniej pochodnej chlorku

4-nitrobenzoilu (np. chlorku 2- lub 3-metylo-4-nitrobenzoilu) lub odpowiedniej pochodnej 2-amino-5-metylotiofenolu (np. 3,5-, 4,5- lub 5,6-dimetylo-2-aminotiofenolu).

P r z y k ł a d 2: Synteza pochodnych 2-[2-(4'-aminofenylo)etylenylo)benzotiazolu

Droga 3: Przykład syntezy BTEA-0, 1, 2 i BTAA-0, 1, 2, przedstawicieli grupy związków typu BTEA i BTAA według przedstawionego poniżej schematu reakcji:

Chlorek trans-4-nitrocynamylu 10 (1,77 g, 9,5 mmola, 1.2 równoważnika) w DMF (20 ml) dodano kroplami do roztworu 2-aminotiofenolu 9 (1,0 g, 8,0 mmoli) w DMF (15 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, a następnie wlano do

PL 215 711 B1

10% roztworu węglanu sodu (100 ml). Osad zebrano przez filtrację pod zmniejszonym ciśnieniem. Po rekrystalizacji z metanolu uzyskano 1,92 g (85,1%) produktu 11.

(b) 2-(4-aminofenyloetenylo)benzotiazol (12)

Mieszaninę 2-(4-nitrofenyloetenylo)bentiazolu 11 (500 mg, 1,7 mmola) i dwuhydratu chlorku cyny(II) (1,18 g, 5,2 mmol) w bezwodnym etanolu (20 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną w atmosferze azotu przez 4 godziny. Etanol usunięto stosując wyparkę próżniową. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (20 ml), przemyto roztworem NaOH (1N, 3 x 20 ml) i wodą (3 x 20 ml), po czym osuszono nad MgSO4. Odparowanie do suchej masy dało 40 mg (8,0%) produktu 12.

(c) 2-(4-metylominofenyloetenylo)benzotiazol (13)

Mieszaninę 2-(4-aminofenyloetenylo)benzotiazolu 12 (7 mg), MeI (3,9 mg) i bezwodnego K2CO3 (100 mg) w DMSO (bezwodny, 0,5 ml) ogrzewano w temperaturze 100°C przez 16 godzin. Mieszaninę reakcyjną oczyszczono metodą TLC w układzie z odwróconymi fazami (MeOH:H2O = 7:1) uzyskując 2,5 mg (32,7%) produktu 13.

(d) 2-(4-aminofenyloetylen)benzotiazol (14)

2-(4-nitrofenyloetenylo)benzotiazol (30 mg, 0,10 mmola) rozpuszczono w MeOH (10 mL). Dodano Pd/C (10%, 40 mg) i mieszaninę reakcyjną mieszano w atmosferze H2 w temperaturze pokojowej przez 60 godzin. Katalizator odsączono i przemyto metanolem (około 2 ml). Po odparowaniu przesączu uzyskano surowy produkt, który oczyszczono metodą TLC (heksany:octan etylu =70:40) z wytworzeniem 15 mg produktu (50%). ¹H NMR (300 MHz, MeOH-dą) δ: 7,88 (d, J=8,3Hz, 1H, H-7), 7,86 (d, J=8,1Hz, 1H, H-4), 7,48 (dd, J1=J2=6,2Hz, 1H, H-5 lub H-6), 7,38 (dd, J1=J2=8,2Hz, 1H, H-5 lub H-6), 6,96 (d, J=6,8Hz, 2H, H-2', 6'), 6,62 (d, J=6,8Hz, 2H, H-3',5'), 3,36 (t, J=7,4Hz, 2H, CH2), 3,03 (t, J=7,4Hz, 2H, CH2).

(e) 2-(4-dimetyloaminofenyloetenylo)benzotiazol (16)

Mieszaninę 2-aminotiofenolu 9 (0,51 g, 4,1 mmola), kwasu trans-4-dimetyloaminocynamonowego 14 (0,79 g, 4,1 mmola) i PPA (10 g) ogrzewano w temperaturze 220°C przez 4 godziny. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej i wylano do 10% roztworu węglanu potasu (~400 ml). Pozostałość zebrano przez filtrację pod zmniejszonym ciśnieniem. Po oczyszczeniu metodą szybkiej kolumnowej chromatografii (heksany:octan etylu =2:1) uzyskano 560 mg (48,7%) produktu 15 w postaci żółtego ciała stałego.

(f) 2-(4-dimetyloaminofenyloetylen)benzotiazol (17)

2-(4-dimetyloaminofenyloetenylo)benzotiazol (12 mg, 0,038 mmol) rozpuszczono w MeOH (5 ml). Dodano Pd/C (10%, 20 mg) i mieszaninę reakcyjną mieszano w atmosferze H2 w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Katalizator odsączono i przemyto metanolem (około 1 ml). Po odparowaniu przesączu uzyskano 7 mg (58%) produktu. ¹H NMR (300 MHz, aceton-d6) δ: 7,97 (d, J=8,3Hz, 1H, H-7), 7,93 (d, J=8,1Hz, 1H, H-4), 7,48 (dt, J=6,2Hz, J=1,1Hz 1H, H-5 lub H-6), 7,38 (dt, J=8,2Hz, J=1,1Hz, 1H, H-5 lub H-6), 7,13 (d, J=6,8Hz, 2H, H-2',6'), 6,68 (d, J=6,8Hz, 2H, H-3',5'), 3,37 (t, J=7,4Hz, 2H, CH2), 3,09 (t, J=7,4Hz, 2H, CH2), 2,88 (s, 6H, NMe2).

P r z y k ł a d 3: Synteza pochodnych 2-(4'-aminofenylo)benzotiazolu

Droga 1: Przykład syntezy 6-MeO-BTA-0, -1, -2, przedstawicieli grupy związków BTA zawierającymi podstawniki R7-R10, jak również R3-R6 (Shi i in., „Antitumor Benzothiazols. 3. Synthesis of 2-(4-aminophenyl)benzothiazols and evaluation of their activities against breast cancer cell lines in vitro

PL 215 711 B1 (a) 4-metoksy-4'-nitrobenzanilid (3) p-anizydynę 1 (1,0 g, 8,1 mmola) rozpuszczono w bezwodnej pirydynie (15 ml), dodano chlorek 4-nitrobenzoilu 2 (1,5 g, 8,1 mmola). Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do odstania w temperaturze pokojowej przez 15 godzin. Mieszaninę reakcyjną wlano do wody i osad zebrano z przesączu pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym przemyto 5% roztworem wodorowęglanu sodu (2 x 10 ml). Pro•1 dukt 3 użyto w następnym etapie bez dalszego oczyszczania. H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 10,46 (s, 1H, NH), 8,37 (d, J=5,5Hz, 2H, H-3',5'), 8,17 (d, J=6,3Hz, 2H, H-2',6'), 7,48 (d, J=6,6Hz, 2H), 6,97 (d, J=6,5Hz, 2H), 3,75 (s, 3H, MeO).

(b) 4-metoksy-4'-nitrotiobenzanilid (4)

Mieszaninę 4-metoksy-4'-nitrotiobenzaniliny 3 (1,0 g, 3,7 mmola) i odczynnika Lawesson'a (0,89 g, 2,2 mmola, 0,6 równoważnika) w chlorobenzenie (15 mL) ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 4 godziny. Rozpuszczalnik odparowano i pozostałość oczyszczono metodą szybkiej kolumnowej chromatografii (heksan:octan etylu=4:1) uzyskując 820 mg (77,4%) produktu 4 w postaci pomarańczowego ciała stałego. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 8,29 (d, 2H, H-3',5'), 8,00 (d, J=8,5Hz, 2H, H-2',6'), 7,76 (d, 2H), 7,03 (d, J=8,4Hz, 2H), 3,808, 37 (d, J=5,5Hz, 2H, H-3',5'), 8,17 (d, J=6,3Hz, 2H, H-2',6'), 7,48 (d, J=6,6Hz, 2H), 6,97 (d, J=6,5Hz, 2H), 3,75(s, 3H, MeO), (s, 3H, MeO).

(c) 6-metoksy-2-(4-nitrofenylo)benzotiazol (5)

4-metoksy-4'-nitrotiobenzanilid 4 (0,5 g, 1,74 mmola) zwilżono niewielką ilością etanolu (około 0,5 mL) i dodano 30% wodny roztwór wodorotlenku sodu (556 mg, 13,9 mmola, 8 równoważnika). Mieszaninę rozcieńczono wodą uzyskując końcowy roztwór/zawiesinę 10% wodnego roztworu wodorotlenku sodu. Mieszaninę tę dodawano porcjami w 1 minutowych przedziałach czasu do mieszanego roztworu żelazicyjanku potasu (2,29 g, 6,9 mmola, 4 równoważniki) w wodzie (5 mL) w temperaturze 80-90°C. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano przez kolejne 0,5 godziny i następnie pozostawiono do ochłodzenia. Osad zebrano przez filtrację pod zmniejszonym ciśnieniem i przemyto wodą, oczyszczono metodą szybkiej kolumnowej chromatografii (heksan:octan etylu=4:1) uzyskując 130 mg (26%) produktu 5. ¹H NMR (300 MHz, aceton-d6) δ: 8,45 (m, 4H), 8,07 (d, J=8,5Hz, 1H, H-4), 7,69 (s, 1H, H-7), 7,22 (d, J=9,0Hz, 1H, H-5), 3,90 (s, 3H, MeO).

(d) 6-metoksy-2-(4-aminofenylo)benzotiazol (6)

Mieszaninę 6-metoksy-2-(4-nitrofeylo)benzotiazolu 5 (22 mg, 0,077 mmola) i dwuhydratu chlorku cyny(II) (132 mg, 0,45 mmola) we wrzącym etanolu mieszano w atmosferze azotu przez 4 godziny. Etanol odparowano i pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (10 ml), przemyto 1N roztworem wodorotlenku sodu (2 ml) i wodą (5 mL), po czym osuszono nad MgSO4. Odparowanie rozpuszczalnika dało 19 mg (97%) produktu 6 w postaci żółtego ciała stałego.

(e) 6-metoksy-2-(4-metyloaminofenylo)benzotiazol (7) i 6-metoksy-2-(4-dimetyloaminofenylo)benzotiazol (8)

Mieszaninę 6-metoksy-2-(4-aminofenylo)benzotiazolu 6 (15 mg, 0,059 mmola), Mel (8,3 mg, 0,060 mmola) i K2CO3 (100 mg, 0,72 mmola) w DMSO (bezwodny, 0,5 ml) ogrzewano w temperaturze 100°C przez 16 godzin. Mieszaninę reakcyjną oczyszczono metodą TLC w układzie faz odwróconych (MeOH:H2O=7:1) uzyskując 2,0 mg (13,3%) 6-metoksy-2-4-metyloaminofenyłobenzotiazolu 7 i 6 mg (40%) 6-metoksy-2-(4-dimetyloaminofenylo)benzotiazolu 8. ¹H NMR związku 7 (300 MHz, aceton-d6) δ: 7,85 (d, J=8,7Hz, 2H, H-2',6'), 7,75 (dd, J=8,8Hz, J=1,3Hz, 1H, H-4), 7,49 (d, J=2,4Hz, 1H, H-7), 7,01 (dd, J=8,8Hz, J=2,4Hz, H-5), 6,78 (d, J=7,6Hz, 2H, H-3',5'), 3,84 (s, 3H, MeO), 2,91 (s, 3H, NMe), ¹H NMR związku 8 (300 MHz, aceton-d6) δ: 7,85 (d, J=8,7Hz, 2H, H-2',6'), 7,75 (dd, J=8,8Hz, J=1,3Hz, 1H, H-4), 7,49 (d, J=2,4Hz, 1H, H-7), 7,01 (dd, J=8,8Hz, J=2,4Hz, H-5), 6,78 (d, J=7,6Hz, 2H, H-3',5'), 3,84 (s, 3H, MeO), 3,01 (s, 6H, NMe2).

Postępując według takiej samej procedury jak powyżej, inne pożądane pochodne 2-(4'-aminofenylo)benzotiazolu można zsyntetyzować przez zastąpienie odpowiednio podstawionej pochodnej aniliny (np. 2-, 3- lub 4-metyloaniliny) i odpowiedniej pochodnej chlorku 4-nitrobenzoilu (np. chlorku 2- lub 3-metylo-4-nitrobenzoilu).

10

P r z y k ł a d 4: Synteza pochodnych BTA bez podstawienia R⁷-R¹⁰

Droga 2: Przykład syntezy związków BTA-0, -1, -2, przedstawicieli grupy związków BTA bez

10 grup R⁷-R¹⁰ (Garmaise i in., „Anthelmintic quaternary salts. III. Benzothiazolium salts J. Med. Chem. 12:30-36 1969):

PL 215 711 B1

Roztwór chlorku 4-nitrobenzoilu (1,49 g, 8,0 mmoli) w benzenie (bezwodny, 10 mL) dodano kroplami do 2-aminotiofenolu (1,0 g, 8,0 mmoli w 10 ml benzenu) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 16 godzin. Reakcję zatrzymano dodając wodę (20 mL). Warstwę wodną oddzielono i ekstrahowano octanem etylu (3 x 10 ml). Połączone warstwy organiczne osuszono i odparowano. Surowy produkt oczyszczono metodą szybkiej kolumnowej chromatografii (heksan: octan etylu = 85:15) uzyskując 1,5 g (73,2%) produktu w postaci jasnożółtego ciała stałego.

(b) 2-(4-aminofenylo)benzotiazol (20)

Mieszaninę 2-(4-nitrofenylo)benzotiazolu (105 mg, 0,40 mmola) i dwuhydratu chlorku cyny(II) (205 mg, 0,91 mmola) w etanolu (20 mL) ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną w atmosferze N2 przez 4 godziny. Etanol usunięto stosując wyparkę próżniową. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (20 ml) i przemyto roztworem NaOH (1N, 3 x 20 ml) i wodą (3 x 20 ml), osuszono i odparowano do suchej masy uzyskując 102 mg (97%) produktu.

(c) 2-(4-metyloaminofenylo)benzotiazol (21) i 2-(4-dimetyIoaminofenylobenzotiazol (23)

Mieszaninę 2-(4-aminofenylo)benzotiazolu 20 (15 mg, 0,066 mmola), MeI (9,4 mg, 0, 066 mg) i K2CO3 (135 mg, 0,81 mmola) w DMSO (bezwodny, 0,5 ml) ogrzewano w temperaturze 100°C przez 16 godzin. Mieszaninę reakcyjną oczyszczono metodą TLC w układzie faz odwróconych (MeOH:H2O = 6:1) uzyskując 1,5 mg (10%) 2-(4-metylominofenylo)benzotiazolu 21 i 2,5 mg (16,7%) 2-(4-dimetyloaminofenylo)benzotiazolu 23.

(d) 2-(4-dimetyloaminofenylo)benzotiazol (23)

Mieszaninę 2-aminotiofenolu 9 (0,5 g, 4,0 mmole), kwasu 4-dimetyloaminobenzoesowego 22 (0,66 g, 4,0 mmole) i PPA (10 g) ogrzewano w temperaturze 220°C przez 4 godziny. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej i wlano do 10% roztworu węglanu potasu (~400 mL).

Pozostałość zebrano przez filtrację pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 964 mg produktu 23 ₁ o czystości około 90% według analizy ¹H NMR. Po rekrystalizacji 100 mg związku 23 z MeOH uzyskano 80 mg czystego produktu. ¹H NMR (300 MHz, aceton-da) δ: 7,12 (d, J=7,7Hz, 1H, H-7), 7,01 (d, J=9,0Hz, 1H, H-4), 6,98 (d, J=9,1Hz, 2H, H-2',6'), 6,56 (t, J=7,8Hz, J=7,3Hz, 1H, H-5 lub H-6), 5,92 (d, J=B,9Hz, 1H, H-3',5'), 2,50 (s, 6H, NMe2).

Postępując według takiej samej procedury jak powyżej, można zsyntetyzować inne pożądane pochodne 2-(4'-aminofenylo)benzotiazolu przez zastąpienie odpowiedniej pochodnej chlorku 4-nitrobenzoilu (np. chlorku 2- lub 3-metylo-4-nitrobenzoilu) lub odpowiedniej pochodnej kwasu 4-dimetyloaminobenzoesowego (np. kwasu 2- lub 3-metylo-4-dimetyloaminobenzoesowego).

P r z y k ł a d 5: Synteza pochodnych bis-2,2'-(4'-aminofenylo)dibenzotiazolu

Droga 1: Postępując według opisanej powyżej ogólnej procedury dla związków 6-MeO-BTA, lecz zastępując benzydynę p-anizydyną i stosując 16 równoważników chlorku 4-nitrobenzoilu uzyskano następujący związek:

PL 215 711 B1

Postępując według takiej samej procedury jak powyżej, inne pochodne bis-2,2'-(4'-aminofenylo)dibenzotiazolu można zsyntetyzować poprzez zastąpienie odpowiednio podstawionych pochodnych bezydyny (np. 2,2'-, 3,3'-dimetylobeznydyny) i odpowiedniej pochodnej chlorku 4-nitrobenzoilu (np. chlorku 2- lub 3-metylo-4-nitrobenzoilu).

Droga 2: Niesymetryczne pochodne bis-2,2'-(4'-aminofenylo)dibenzotiazolu można zsyntetyzować metodą sprzęgania Suzuki'ego katalizowanej palladem, odpowiednio podstawionych 6-jodo-(2-p-nitrofenylo)benzotiazoli, które można wytworzyć postępując według takiej samej procedury jak dla związków 6-MeO-BTA i późniejszą redukcję grupy nitrowej (Ishiyama i in., „Palladiunm (O)-catalyzed cross-coupling reaction of alkoxydiboron with haloarenes: A direct procedure for arylboronic esters

Tetrahedron Lett., 38, 3447, 1997).

Przykłady biologiczne

P r z y k ł a d 6

Określanie powinowactwa do Αβ i wychwytu mózgowego pochodnych tioflawiny ₃

Początkowo, konkurencyjne badania wiązania z zastosowaniem [³H]CG i syntetycznego Αβ (1-40) przeprowadzono w celu określenia, czy CG, ThS i ThT wiążą się do tego samego miejsca ₃ (miejsc). Stwierdzono, że ThS współzawodniczy z [³H]CG o miejsca wiążące na Αβ (1-40), natomiast ThT nie (patrz np. Fig. 5). Następnie zsyntetyzowano wysoce specyficzny czynny [N-metylo-¹¹C]BTA-1 (patrz Tablica 1) przez metylowanie BTA-0. Badania wiązania przeprowadzono z zastosowaniem [N-metylo-¹¹C]BTA-1 i 200 nM włókienek Αβ (1-40). Specyficzne wiązanie [N-metylo-¹¹C]BTA-1 wynosiło ~70%. Fig. 5 (patrz prawa tablica) przedstawia krzywe współzawodnictwa do miejsc Αβ przez ThT, BTA-0, BTA-1 i BTA-2 według testu wiązania [N-metylo-¹¹C]BTA-1. Wartości stałych Ki wynosiły: 3,0±0,8 nM dla BTA-2; 9,6±1,8 nM dla BTA-1; 100 i 16 nM dla BTA-0 i 1900±510 nM dla ThT. Czwartorzędowe aminy nie tylko nie są niezbędne do wiązania do włókienek Αβ, ale ponadto zmniejszają powinowactwo wiązania.

W Tablicy 1 poniżej zestawiono właściwości dla pięciu różnych ¹¹C-znakowanych pochodnych BTA. Wyznaczono ich wiązanie in vivo, wartości IogP i wychwyt mózgowy in vivo i tempo wydalania z organizmu u myszy.

PL 215 711 B1

Tablica 1. Właściwości kilku ^Oznakowanych pochodnych
tioflawiny T in vitro i	in vivo>
Struktura ^C-znakowanego	K± (nM)	logP	Wychwyt	Wychwyt	Wartość
związku BTA	do		mózgowy u	mózgowy u	stosunku
	fibryli		myszy w	myszy dla	wychwytu
	Αβ		czasie	30 minut	2 minuty/
			2 minut	(%lD/g*kg)	30 minuty
			(%ID/g*kg)
	21	3,3	0,32+0,07	0,17+0,05	1,9
-χο-οτ		(szac. )
[N-metylo-11C]6-Me-BTA-l
*CXK	nie badano	3,9 (szac.)	0,15+0,06	0,16+0,02	0,9
[N-metylo-11C]6-Me-BTA-2
	30	1, 9	0,60±0,04	0,39+0,05	1,5
		(szac.)
6-11CH3O-BTA-0
/=^ γη,	5,7	2,7	0, 43+0,11	0, 094+	4,6
WK				0,038
iN-metylo-11C]6-MeO-BTA-l
	2, 3	3,3 (szac.)	0,32+0,09	0,42+0,10	0,8
[N-metylo-H-C] 6-MeO-BTA-2
οχκ1	9,6	2,7	0, 44+0, 14	0,057+ 0,010	7,7
[N-metylo-nC] BTA-1

PL 215 711 B1

Dane przedstawione w Tablicy 1 są godne uwagi, szczególnie w przypadku pochodnych ¹¹C-znakowanych 6-MeO-BTA-1 i BTA-1. Związki te wykazują względnie wysokie powinowactwo do Λβ, ze stałą o wartości Ki < 10 nM i można je łatwo wprowadzić do mózgu myszy przy wartości wychwytu > 0,4 %ID/g*kg (lub > 13% ID/g na 30 gramowe zwierzęta). Ponadto, wartości stężenia związku radioaktywnego w czasie 30 minut w mózgu wynosiły poniżej 0,1 %ID/g*kg, prowadząc w efekcie do stosunku stężenia 2 minuty/30 minut > 4. Oba związki N,N-dimetylowe są wolniej wymywane z tkanki mózgu myszy niż pochodne N-metylowe. Podobnie, tylko pierwszorzędowa amina obecnie testowanego 6-MeO-BTA-0 charakteryzowała się mniejszym klierensem mózgowym. Ten niespodziewany i nieoczekiwany wynik umożliwił specyficzne zastosowanie drugorzędowej aminy (np. -NHCH3) jako czynnika obrazującego in vivo.

P r z y k ł a d 7

Obrazowanie PET in vivo u pawianów

Do przeprowadzenia doświadczenia obrazowania mózgu przygotowano dużą ilość znakowanych ¹¹C BTA-1, 6-Me-BTA-1 i 6-MeO-BTA-1 o wysokiej specyficznej aktywności (> 2000 Ci/mol). W badaniach posłużono się znieczulonymi pawianami o masie 20-30 kg, stosując tomograf Siemens/CTI HR+ pracujący w trybie 3D (nominalna rozdzielczość FWHM 4,5 mm). Obrazowanie mózgu przeprowadzono po podaniu dożylnego zastrzyku 3-5 mCi wskaźnika promieniotwórczego. Typowe krzywe aktywności każdego z trzech związków w funkcji czasu, skorygowane pod względem tłumienia i rozpadu, w obszarze kory czołowej zwierzęcia pokazano w Fig. 6. Zauważono, że bezwzględny wychwyt mózgowy tych 3 związków u pawianów jest bardzo podobny do zaobserwowanego u myszy (tj. około od 0,47 do 0,39 %ID/g*kg). Jednakże, normalna szybkość klirensu mózgowego wszystkich trzech wskaźników promieniotwórczych w porównaniu z myszami jest u pawianów znacznie mniejsza, ze szczytem po 60 minutach w zakresie od 2,4 do 1,6 w porównaniu z 7,7 po 30 minutach u myszy. Rząd wielkości maksymalnego wychwytu mózgowego i klirens trzech związków był u myszy i pawianów taki sam. Wychwytu mózgowego wskaźników promieniotwórczych nie ograniczał przepływ krwi (Fig. 6 wklejka). W próbkach krwi tętniczej pobranych od pawianów, które otrzymały zastrzyki wszystkich trzech związków, profile metaboliczne były bardzo podobne. Analizując próbki osocza na kolumnie HPLC w układzie faz odwróconych zaobserwowano obecne we wszystkich punktach czasowych od zastrzyku wysoko polarne metabolity, które eluowały blisko objętości międzyziarnowej (4 ml), podczas gdy niemetabolizowany wskaźnik eluował przy objętości 20 ml. Typowe ilości niemetabolizowanego związku w osoczu dla wszystkich trzech związków wynosiły odpowiednio: 90% po 2 minutach; 35% po 30 minutach; i 20% po 60 minutach.

Obrazy dwóch poziomów przekrojów poprzecznych mózgu pawiana wykonane po podaniu zastrzyku dożylnego 3 mCi [N-metylo-¹¹C]BTA-1 techniką PET przedstawiono w Fig. 7. Dane o emisji zebrane 5-15 minut po zastrzyku zsumowano, otrzymując obrazy. Obszary mózgu obejmują: Ctx (kora); Thl (wzgórze); Occ (kora potyliczna); i Cer (móżdżek). Rozkład radioaktywności w mózgu był jednorodny, co wskazuje na brak regionalnej specyficzności wiązania w mózgu prawidłowym.

P r z y k ł a d 8

Barwienie złogów amyloidowych w pobranej pośmiertnie tkance AD i w mózgu myszy transgenicznych

Skrawki pobranej pośmiertnie tkanki mózgowej AD i 8 miesięcznych transgenicznych myszy PSl/APP barwiono nieznakowanym BTA-1. Model mysi PS1/APP łączy dwie ludzkie mutacje genowe, o których wiadomo, że u podwójnie transgenicznych myszy powodują chorobę Alzheimera. U myszy tych odkładanie włókienek Αβ w płytki amyloidowe w mózgu rozpoczyna się już w wieku 3 miesięcy. Typowe mikrografie fluorescencyjne przedstawiono w Fig. 8. W obu typach tkanek: pobranej pośmiertnie tkance mózgowej AD i tkance mózgowej PS1/APP, wyraźnie widać wybarwione BTA-1 płytki amyloidowe. Amyloid naczyń mózgowych również barwi się bardzo wyraźnie (Fig. 8, strona prawa). Przy zastosowaniu BTA-1 inna charakterystyczna cecha neuropatologii mózgu AD, tj. zmiany zwyrodnieniowe nerwów włókienkowatych (NFT), w mózgu chorych na AD barwi się słabiej (Fig. 8, left). W modelach nie obserwowano odkładania się amyloidu u transgenicznych myszy NFT.

P r z y k ł a d 9

Znakowanie i wykrywanie złogów amyloidowych u transgenicznych myszy in vivo

Trzem transgenicznym myszom PS1/APR w wieku 17 miesięcy wstrzyknięto dootrzewnowe (ip) pojedynczą dawkę 10 mq/kq BTA-1 w roztworze DMSO, glikolu propylenowego i PBS o wartości pH

7,5 (objętościowo 10/45/45). Dwadzieścia cztery godziny później, posługując się techniką wielofotonowej mikroskopii fluorescencyjnej, otrzymano wysokie] rozdzielczości obrazy mózgów żywych myPL 215 711 B1 szy, poprzez otwór w czaszce. Typowe obrazy barwienia BTA-1 u żywych myszy PS1/APP in vivo przedstawiono na rysunku, Fig. 9. Płytki i amyloid naczyń mózgowych można wyraźnie rozróżnić. Wyniki badań z wykorzystaniem mikroskopii wielofotonowej wykazują specyficzność BTA-1 dla Αβ u żywych transgenicznych myszy PS1/APP in vivo.

Opis wynalazku zawiera jedynie przykładowe rozwiązania, a rzeczywisty zakres i myśl przewodnia wynalazku określają załączone zastrzeżenia patentowe.

Claims (3)

1. Związek o wzorze ogólnym (I) lub jego nietoksyczna, rozpuszczalna w wodzie sól:

w którym Z oznacza atom S, w którym Y oznacza NR¹R², w którym atom azotu nie jest czwartorzędową aminą;

2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że znacznik radioaktywny przy jednym z podstawników R³-R¹⁰ jest wybrany z grupy obejmującej ¹³¹I, ¹²³I, ¹⁸F, ¹¹C, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br.

3. Związek według zastrz. 2, znamienny tym, że znacznik izotopowy przy jednym z podstawniο ί η -| ί ί ω ków R³-R¹⁰ jest wybrany z grupy obejmującej ¹¹C i ¹⁸F.

4. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że Z = S, Y = N, R' = H, R¹ = H, a R² = CH3, a R³-R¹⁰ oznacza H.

5. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że R¹ = H, R² = CH3, a R⁸ jest wybrany z grupy obejmującej CN, CH3, OH, i OCH3.

6. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest związkiem o wzorze

7. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest związkiem o wzorze

8. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest związkiem o wzorze

PL 215 711 B1

9. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest związkiem o wzorze

10. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest związkiem o wzorze

11.Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest związkiem o wzorze

12. Sposób syntezy związku określonego w zastrz. 1, w którym przynajmniej jeden z podstawników R³-R¹⁰ jest wybrany z grupy obejmującej ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F i ¹⁹F, znamienny tym, że ₁ obejmuje etap znakowania związku określonego w zastrz. 1, w którym Z = S, Y = N, R¹ = H, i co naj3 10 mniej jeden spośród podstawników R³-R¹⁰ oznacza trialkilocynę, na drodze reakcji związku z substancją zawierającą ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F lub ¹⁹F.

13. Kompozycja farmaceutyczna do obrazowania in vivo złogów amyloidu, zawierająca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że zawiera związek o wzorze ogólnym (I), określony w zastrz. 1.

14. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 13, znamienna tym, że w związku o wzorze ogólnym (I), Z = S, Y = N, i R¹ = H.

15. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej określonej w zastrz. 13 albo zastrz. 14, do wytwarzania preparatu do wykrywania in vivo złogów amyloidu u pacjenta, poprzez podawanie wykrywalnej ilości tego preparatu i wykrywanie wiązań związku zawartego w kompozycji ze złogami amyloidu.

16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że złogi amyloidu znajdują się w mózgu pacjenta.

17. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że pacjent cierpi na chorobę lub zespół chorobowy wybrany z grupy obejmującej chorobę Alzheimera, rodzinną postać choroby Alzheimera, zespół Downa, i jest homozygotą pod względem allelu E4 apolipoproteiny.

18. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że wykrywanie obejmuje takie metody jak obrazowanie przy użyciu promieniowania gamma, rezonans magnetyczny I spektroskopię rezonansu magnetycznego.

19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że obrazowanie przy użyciu promieniowania gamma obejmuje tomografię pozytronową emisyjną (PET) albo tomografię komputerową z emisją pojedynczego fotonu (SPECT).

20. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że kompozycję farmaceutyczną podaje się stosując zastrzyk dożylny.

21. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że stosunek (i) wiązania związku zawartego w kompozycji z obszarem mózgu innym niż móżdżek, do (ii) wiązania tego związku z móżdżkiem pacjenta, jest porównywany z takim stosunkiem u zdrowego pacjenta.

22. Zastosowanie związku o wzorze ogólnym (I) określonego w zastrz. 1, lub jego nietoksycznej, rozpuszczalnej w wodzie soli, do wytwarzania preparatu do wykrywania złogów amyloidu w próbce z biopsji lub pośmiertnej tkance ludzkiej lub zwierzęcej, poprzez:

(a) inkubację utrwalonej w formalinie lub świeżo zamrożonej tkanki z roztworem preparatu, do uzyskania wyznakowanych złogów, a następnie, (b) wykrywanie wyznakowanych złogów.

23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że roztwór preparatu składa się z 25-100% etanolu, a pozostałość roztworu stanowi woda, przy czym roztwór jest nasycony związkiem o wzorze ogólnym (I) określonym w zastrz. 1 lub jego nietoksyczną, rozpuszczalną w wodzie solą.

24. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że roztwór preparatu składa się z wodnego buforu zawierającego 0-50% etanolu, przy czym roztwór zawiera od 0,0001 do 100 μΜ związku wiążącego amyloid.

PL 215 711 B1

25. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że wykrywanie przeprowadza się stosując techniki mikroskopowe wybrane z grupy obejmujące] mikroskopię w jasnym, polu, mikroskopię fluorescencyjna, laserową mikroskopię konfokalną, i mikroskopię z polaryzacją krzyżową.

26. Zastosowanie związku o wzorze ogólnym (I), określonego w zastrz. 1, lub jego nietoksycznej, rozpuszczalnej w wodzie soli, do wytwarzania preparatu do określania ilości amyloidu w próbce z biopsji lub w tkance pobranej pośmiertnie, poprzez:

(a) inkubację znakowanej radioaktywnie pochodnej związku zawartego w preparacie z homogenatem z biopsji lub tkanki pobranej pośmiertnie, przy czym co najmniej jeden spośród podstawników R¹-R¹⁰ związku jest znakowany znacznikiem radioaktywnym wybranym z grupy obejmującej ¹²⁵I,

₂ w którym każdy R1 i R² jest niezależnie wybrany z grupy obejmującej atom H i C1-C8-alkil, każdy z R³-R⁷, R⁹ i R¹⁰ oznacza atom wodoru,

R⁸ oznacza atom wodoru, C1-C8-alkil, lub OR', gdzie R' oznacza H albo grupę C1-C8-alkilową;

3 10 3 131 przy czym przynajmniej jeden z podstawników R³-R¹⁰ jest wybrany z grupy obejmującej ³H, ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F, CH2-CH2-X*, O-CH2-CH2-X*, CH2-CH2-CH2-X*, O-CH2-CH2-CH2-X* (w którym X* = ¹³¹I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br lub ¹⁸F), ¹⁹F, ¹²⁵I, podstawnik zawierający atom węgla jest wybrany z grupy obejmującej C1-C8-alkil, (CH2)nOR', CF3, CH2-CH2X, O-CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X, O-CH2-CH2-CH2X (w którym X = F, Cl, Br lub I), CN, (C=O)-R', (C=O)N(R')2, O(CO)R', COOR', CR'=CR'-Rph, i CR2'11 13 14

-CR2'-Rph, w którym przynajmniej jeden atom węgla oznacza ¹¹C, ¹³C lub ¹⁴C.

3 14 ³H i podstawnik zawierający atom węgla, w którym co najmniej jeden atom węgla oznacza ¹⁴C, (b) oddzielenie związanej z tkanką od niezwiązanej z tkanką znakowanej radioaktywnie pochodnej związku,

c) ilościowe określenie związanej z tkanką znakowanej radioaktywnie pochodnej związku, i

d) poddanie konwersji jednostek związanych z tkanką znakowanej radioaktywnie pochodnej związku do jednostek wyrażonych w mikrogramach amyloidu na 100 mg tkanki w porównaniu z wzorcem.