CZ20001685A3 - Sloučeniny pro diagnózu Alzheimerovy nemoci a in vivo zobrazení a prevenci deposit amyloidu - Google Patents

Abstract

Sloučeniny vázající amyloid, které jsou deriváty chrysaminu G, farmaceutické přípravky je obsahující a způsoby používající tyto sloučeniny k in vivo identifikování mozku zasaženého Alzheimerovou nemocí a k diagnostikování jiných patologických stavů charakterizovaných amyloidózou, jako Downova choroba. Jsou také popisovány farmaceutické přípravky obsahující chrysamin G ajeho deriváty a způsoby používající tyto přípravky k prevenci proti degeneraci buněk a toxicitě indukované amyloidem při stavech spojených amyloidózou a způsoby použití derivátů chrysaminu G ke značení nebo detekci depozit amyloidu při biopsii nebo v posmrtné tkáni a způsoby použití derivátů chrysaminu G ke stanovení množství depozit amyloidu u homogenátů při biopsii a v posmrtné tkáni.

Description

SLOUČENINY PRO DIAGNÓZU ALZHEIMEROVY NEMOCI A IN VIVO

ZOBRAZENÍ A PREVENCE DEPOZIT AMYLOIDU

Oblast techniky

Předložený vynález představuje pokrok vzhledem k derivátům chrysaminu G podle WO 96/34853 v tom, že sloučeniny podle předkládaného vynálezu představují rozmanité uhlíkaté skelety a funkční skupiny, které zvyšují hodnotu diagnózy Alzheimerovy nemoci, prevenci depozit amyloidu a jsou vhodné pro zobrazení in vivo u pacientů s Alzheimerovou nemocí ve srovnání se sloučeninami uvedenými ve WO 96/34853.

Předložený vynález se týká identifikace sloučenin, které jsou vhodné pro zobrazení depozit amyloidu u žijících pacientů. Podrobněji se předložený vynález týká způsobu in vivo zobrazení depozit amyloidu v mozku k umožnění předsmrtné diagnózy Alzheimerovy nemoci. Předložený vynálezu se také týká terapeutického použití těchto sloučenin.

Alzheimerova nemoc (dále jen zkratka z angličtiny „AD“) je neurodegenerativní onemocnění vyznačující se ztrátou paměti a jiných kognitivních deficit. McKhann et al., Neurology 34: 939 (1984). Ve Spojených státech je to nejběžnější příčina demence. AD může zasáhnout i mladou osobu (mezi 40 - 50), protože je těžké zjistit přítomnost této nemoci bez nebezpečné mozkové biopsie, doba vypuknutí je neznáma. Výskyt AD se zvyšuje s věkem, odhad postižené populace činí 40 - 50% mezi roky 85 - 90. Evans et al., JAMA 262: 2551 (1989); Katzmann, Neurology 13 (1993).

Podle definice je AD definitivně diagnostikováno vyšetřením mozkové tkáně, běžně autopsií. Khachaturian, Arch. Neurol. 42: 1097 (1985); McKhann et al., Neurology 34: 939 (1984).

Neuropatologicky je tato nemoc charakterizována přítomností neuritických plátů (dále jen anglická zkratka „NP“), neurofibrilních zauzlení(dále jen anglická zkratka „NFT‘ j a úbytkem neuronů společně s dalšími nálezy. Mann, Mech. AgeingDev. 31: 213 (1985). Posmrtné řezy mozkové tkáně obětí Alzheimerovy nemoci ukázaly přítomnost amyloidu ve formě proteinových extracelulámích jader neuritických plátů, které jsou charakteristické pro AD.

Amyloidová jádra těchto neuritických plátů jsou složena z proteinu nazývaného βamyloid (Αβ), který má struktura převážně β-skládaného listu (β-sheet). Moři et al., Journal of Biological Chemistry 267: 17082 (1992); Kirschner et al., PNAS 83: 503 (1986).

Neuritické pláty jsou časné a invariantní aspekty nemoci. Mann et al.,J. Neurol. Sci. 89: 169;

• · • · • · ··

Mann, Mech. AgeingDev. 31: 213 (1985); Terry et al.,J. Neuropathol. Exp. Neurol 46: 262 (1987).

Počáteční depozice Αβ se nejspíše vyskytuje dlouho před klinickými příznaky. V současné době jsou doporučena „minimální mikroskopická kritéria“ pro diagnózu AD založená na počtu neuritických plátů zjištěných v mozku. Khachaturian, Arch. Neurol., supra (1985). Bohužel posouzení počtu neuritických plátů musí být odloženo až na dobu po smrti.

Neuritické pláty obsahující amyloid jsou hlavním znakem míst v mozku při AD, jakož i Downovy choroby a u osob majících identické geny pro alelu apolipoproteinu E4, které jsou náchylní k rozvinutí AD. Corder et al., Science 261: 921 (1993); Divry, P., J. Neurol, Psych. 27: 643 - 657 (1927); Wisniewski et al., in Zimmerman, Η. M. (ed.): Progress in Neuropathology, (Grune and Stratton, Ν. Y. 1973) str. 1- 26. Mozkový amyloid je snadno prokazatelný pomocí značení míst v mozku thioflavinem S nebo kongočervení. Puchtler et al.,J. Histochem. Cytochem. 10: 35 (1962). Amyloid značený kongočervení je charakterizován dichroickým vnějším vzhledem, který vykazuje žlutozelenou polarizační barvu. Dichroická vazba je výsledek struktury β-skládaného listu (β-sheet) amyloidových proteinů. Glenner, N. Eng. J. Med. 302: 1283 (1980). Podrobnější informace z hlediska biochemie a histochemie amyloidu lze nalézt v Glenner, N. Eng. J. Med. 302: 1333 (1980).

Potud byla diagnóza AD provedena z větší části pomocí vyhodnocení klinických kritérií, mozkové biopsie a posmrtných studií tkáně. Výzkum se snaží rozvíjet způsoby in vivo diagnózy Alzheimerovy nemoci zahrnující (1) genetické testování, (2) metody prováděné pomocí imunochemických reakci a (3) techniky zobrazení.

Doklad, že odchýlení od normy u metabolismu Αβ jsou nezbytná a dostačující pro rozvinutí AD, je založen na objevení místa mutací v proteinovém prekurzoru Αβ u několika rodin s vzácnou autosomální, dominantní formou AD. Hardy, Nátuře Genetics 1: 233 (1992); Hardy et al., Science 256: 184 (1992). Tyto mutace se vyskytují blízko N-koncových a Ckoncových míst štěpení nezbytných pro generování Αβ z jeho proteinového prekurzoru. St. George-Hyslop et al., Science 235: 885 (1987); Kang et al., Nátuře 325: 733 (1987); Potter WO 92/17152. Avšak genetický rozbor velkého počtu rodin s AD prokázal, že AD je geneticky heterogenní.. St. George-Hyslop et al., Nátuře 347: 194 (1990). Chemická vazba na indikátory chromozomu 21 se projevuje jen u některých rodin s brzkým propuknutím AD a neprojevuje se u rodin, u kterých AD propukla později. V nedávné době gen na chromozomu 14, jehož produkt, o kterém se předpokládá, že obsahuje mnohačetné transmembránové domény a podobá se membránovému integrálnímu proteinu, byl identifikován Sherringtonem a spol., Nátuře 375: 754 - 760 (1995). Tento gen vysvětluje až 70% brzkého propuknutí • · • · · · • · · · autosomální, dominantní formy AD. Předběžné údaje dávají podnět k tomu, že tato mutace chromozomu 14 způsobuje zvýšení produkce Αβ. Scheuner et al., Soc. Neurosci. Abstr. 21: 1500 (1995). Mutace na velmi podobném genu byla identifikována na chromozomu 1 u příbuzenstva Volgy German s brzkým propuknutím AD. Levy-Lahad et al., Science 269: 973977 (1995).

Důkladné prozkoumání genotypu apolipoproteinu E bylo doporučeno jako pomoc při diagnóze AD. Scott, Nátuře 366: 502 (1993); Roses, Ann. Neurol. 38: 6-14 (1995). Nicméně se vyskytují obtíže při této technologii, protože alela apolipoproteinu E4 je pouze rizikový faktor pro AD a nikoliv příznak nemoci. Tento apolipoprotein chybí u mnoha pacientů s AD a je přítomen u mnoha starších, nedementních lidí. Bird, Ann. Neurol. 38: 2-4 (1995).

Byly vypracovány metody stanovení pomocí imunochemických reakcí pro detekci přítomnosti neurochemických indikátorů u pacientů s AD a k detekci s AD spojeným proteinem amyloidu v mozkovém míšním moku. Warner, Anal. Chem. 59: 1203A (1987); World Patent No. 92/17152 by Potter; Glenner et al., U.S. Patent No. 4,66,829. Tyto způsoby diagnózy AD se neosvědčily k detegování AD u všech pacientů, zvláště pak v raných stádiích nemoci a jsou relativně invazivní, které vyžadují spinální odsání tekutiny kanylou. Také byly provedeny pokusy k připravení monoklonálních protilátek jako sond pro zobrazení Αβ. Majocha et al., J. Nucl. Med., 33: 2184 (1992); Majocha et al., WO 89/06242 a Majocha et al., U.S.Patent 5,231,000. Hlavní nevýhodou těchto sond je potíž při procházení těchto velkých molekul přes hematoencefalickou bariéru. Použití protilátek pro in vivo diagnózu AD by vyžadovalo označení abnormalit v hematoencefalické bariéře k dosažení přístupu do mozku. Není žádný přesvědčující doklad o tom, že u AD abnormality v hematoencefalické bariéře spolehlivě existují. Kalaria, Cerebrovascular & Brain Metabolism Reviews 4: 226 (1992).

Protilátky Αβ jsou také znevýhodněné pro použití u diagnózy AD, protože specificky značí kromě neuritických plátů i difusní depozita Αβ . A difusní pláty často převažují. Yamaguchi et al., Acta Neuropathol., 77: 314 (1989). Difusní pláty mohou být separátní druh poranění a nemusí se nezbytně týkat procesu demence při onemocnění AD. Poslední zmíněné je vnuknuto nalezením difusních plátů v kognitivně normálních kontrolních vzorcích a u zestárlých psů. Moran et al., Medicína Clinica 98: 19 (1992); Shimada et al., Journal of Veterinary Medical Science 54: 137 (1992); Ishihara et al., Brain Res. 548: 196 (1991); Giaccone et al., Neurosci. Lett. 114: 178 (1990). I kdyby difusní pláty předcházely neuritickým plátům, mohl by být klíčový patologický jev u AD proces, který změní zdánlivě benigní difusní pláty na neuritické pláty (halo efekt degenerace). Proto je potřeba sond, které • 4 • * 4 · « · · • 4 4·· 4 4 4 · • 4 · 4 4 4 · · · • 4 4 4 · · · · 4 4 4 4 ·· ♦ · · · ·♦ 4 4 44 jsou specifické pro neuritické pláty a neurofibrilámí zauzlení jako specifičtější značení pro patofyziologii AD než protilátky, které by také mohly značit difusní pláty.

V poslední době byl používán Αβ peptid značený radioaktivním izotopem ke značení difusních, kompaktních a neuritických typů plátů v místech mozku zasaženého AD. Maggio et al., WO 93/04194. Nicméně tyto peptidy mají stejné nevýhody jako protilátky. Zvláště peptidy normálně neprostupují hematoencefalickou bariéru v množstvích potřebných pro zobrazení a protože tyto sondy reagují s difusními pláty nemohou být specifické pro AD.

Kongočerveň může být používána pro in vivo diagnózu amyloidózy v nemozkových parenchymálních tkání. Nicméně kongočerveň je pravděpodobně nevhodná pro in vivo diagnózu depozit Αβ v mozku, protože pouze 0,03% z injektované dávky jodované kongočerveni může. vstoupit do mozkového parenchymu. Tubis et al.,J. Amer. Pharm. Assn.

49: 422 (1960). Radiojodované sloučeniny bisdiazobenzidinu související s kongočerveni, takové jako Benzo Orange R a Direct Blue 4 byly navrženy jako použitelné sloučeniny pro in vivo a in vitro detekci přítomnosti a lokalizaci depozit amyloidu v orgánech pacienta. Quay et al., patentová přihláška U.S. číslo 5,039,511 a 4,933,156.

Nicméně stejně jako kongočerveň obsahují i všechny sloučeniny navržené Quayem silně kyselou skupinu sulfonové kyseliny, která silně limituje vstup těchto sloučenin do mozku a vytváří tak velmi těžko množství efektivní proto zobrazení nebo detegování v mozkovém parenchymu.

Nemožnost předsmrtného stanovení depozit amyloidu při AD zabraňuje studiu této devastující nemoci. Způsob předsmrtného stanovení depozit amyloidu je potřeba jak pro diagnostické nástroje při lehčích nebo klinických případech, tak i pro monitorování účinnosti terapií zaměřených na prevenci depozit Αβ. Proto je nej vyšší čás k odhalení bezpečného a specifického způsobu diagnózy AD před smrtí pomocí in vivo zobrazení amyloidu v mozkovém parenchymu. I kdyby v současné době byly provedeny různé pokusy k in vivo diagnostikování AD, nejsou zde žádné sondy pro mozkový amyloid. Žádný způsob nepoužívá sondy s vysokou afinitou pro amyloid, které mají malou toxicitu, mohou prostoupit hematoencefalickou bariéru a vážou se účiněji na mozek zasažený AD než na normální mozek, aby identifikovali AD depozita amyloidu v mozku před pacientovou smrtí. Nebyl publikován žádný in vivo způsob, který by splňoval tyto kritéria.

Nová data naznačují, že sloučeniny vázající amyloid budou terapeuticky výhodné při AD a diabetes mellitus typu 2. Jak je uvedeno výše, jsou zde dvě kategorie plátů v mozku zasaženém AD, difusní a neuritické (klasické). Difusní pláty se nemají k indukování morfologických reakcí, takových jako reaktivní astrocyty, dystrofické neurity, buněčné mikroglie, úbytek synapsí a plně komplementární aktivaci nalezených u neuritických plátů.

• 0 0 •0 00 • · · ♦ * * · · · • · · · · · · 4 • · · ♦ · 0 0 • · · · 0 « • · «0 «

Joachim etal., Am. J. Pathol. 135. 309 (1989); Masliah etal., loc. cit. 137: 1293 (1990); Lue and Rogers, Dementia 3: 308 (1992). Všechny tyto morfologické reakce naznačují, že neurotoxické a degenerativní procesy buněk se vyskytují v místech přiléhajících ke kompaktním depozitům Αβ neuritických plátů. Neurotoxicita a degenerace buněk indukovaná Αβ byla publikována u mnoha typů buněk in vitro. Yankner et al., Science 250: 279 (1990); Roher etal., BBRC 174: 572 (1991); Frautschy et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 88: 83362 (1991); Shearman etal., loc. cit. 91: 1470 (1994). Bylo ukázáno, že pro in vitro neurotoxicitu je nezbytné nakupení peptidu Αβ. Yankner, Neurobiol. Aging 13: 615 (1992). Rozdíly ve stadiu nakupení Αβ v difusních a neuritických plátech mohou vysvětlit nedostatek neurotoxické odpovědi difusního plát. Lorenzo and Yankner, Proč. Nati. Acad. Sci., 91: 12243 (1994).

V poslední době tři laboratoře publikovaly výsledky, které naznačují, že kongočerveň inhibuje in vitro neurotoxicitu a degeneraci buněk indukovanou Αβ. Burgevin et al., NeuroReport. 5: 2429 (1994); Lorenzo and Yankner, Proč. Nati. Acad Sci. 91: 12243 (1994); Pollack et al.,Neuroscience Letters 184: 113 (1995); Pollack et al., Neuroscience Letters 197: 211 (1995). Mechanismus se nejspíše týká jak inhibice formování fibril, tak i prevence proti neurotoxíckým vlastnostem formovaných fibril. Lorenzo and Yankner, Proč. Nati. Acad Sci. 91: 12243 (1994). Ukázalo se také, že kongočerveň chrání pankreatické ostrůvkové buňky proti toxicitě způsobené amylinem. Amyli^e fibrilámí peptid podobný Αβ, který akumuluje ve slinivce v diabetes mellitus typ 2.

Je známo v oboru, že určitá azobarviva mohou být karcinogenní. Morgan et al., Environmental Health Perspectives, 102(supp.) 2: 63 - 78, (1994). Tato eventuální karcinogenicita vypadá, že je do velké míry založena na faktu, že azobarviva jsou značně metabolizována na volný mateřský amin pomocí intestinálních bakterií. Cemiglia et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 107: 1224 - 1229, (1982). V případě benzidinbarviv (a mnoha jiných substituovaných benzidinů) je volný amin ten, který je karcinogenní. Tato fakta mají malé důsledeky pro studie zobrazení amyloidu, ve kteiých nepatrné množství barviv značených radioaktivním izotopem s vysoce specifickou aktivitou by mohlo být přímo injektováno do žíly. V tomto případě by množství aplikované mohlo být nepodstatné a barviva by mohla minout intestinální baktérie.

V případě terapeutického použití jsou tato fakta rozhodující. Uvolňování karcinogenů z terapeutických sloučenin je nepřijatelné. Druhý problém s metabolizmem diazobarviv je, že mnoho z aplikovaných léčiv je před absorpcí metabolizováno intestinálními bakteriemi. I • · • 4 • · • · ··

kdyby uvolňované metabolity byly benigní, utvrzuje tato nízká biologická dostupnost nevýhody.

Proto je potřeba mít sloučeniny vázající amyloid, které jsou podobné kongočerveni, ale které vstupují do mozku (kongočerveň nikoliv). Takové sloučeniny by mohly být používány při prevenci degenerace buněk spojené s formováním fibril a tím by ošetřovaly patologické stavy při nemocech spojených s amyloidem, taková jako AD a Downova choroba a při ošetření toxicity pankreatických ostrůvkových buněk při diabetes mellitus typu 2.

Dále je potřeba mít sloučeniny vázající amyloid, které jsou netoxické a biologicky dostupné a díky tomu mohou být používány při léčení.

Podstata vynálezu

Z důvodů uvedených výše je záměrem předloženého vynálezu poskytnout bezpečný, specifický způsob diagnózy AD před smrtí a in vivo zobrazení amyloidu v mozkovém parenchymu. Dalším záměrem předloženého vynálezu je poskytnout způsob identifikace depozit amyloidu AD v mozku před pacientovou smrtí použitím sondy s vysokou afinitou pro amyloid, která má nízkou toxicitu, může prostoupit hematoencefalickou bariéru a umí rozlišit mozek s AD od normálního mozku. Dalším záměrem předloženého vynálezu je poskytnout ošetření AD, které bude prevencí před depozicí nebo toxicitou Αβ. Dalším záměrem předloženého vynálezu je poskytnout techniky značení a detegování depozit amyloidu u vzorků biopsie nebo vzorků posmrtné tkáně. Dalším záměrem předloženého vynálezu je poskytnout způsob stanovení množství depozit amyloidu ve stejnorodých částí biopsie nebo vzorků posmrtné tkáně. K dosažení těchto a dalších záměrů jsou zde uvedeny, podle aspektu předloženého vynálezu, sloučeniny vázající amyloid vzorce (I) nebo jejich ve vodě rozpustné, netoxické soli:

• ·

kde;

je buď N=N-Q, CR'=N-Q, N=CR'-Q, CR'₂NR'-Q, NR'-CR'₂-Q, (CO)-NR-Q, NR'-(CO)-Q nebo NR -NR-Q (přičemž substituent R'reprezentuje atom vodíku nebo nižší alkylovou skupinu);

XjeC(R')₂ (přičemž každý substituent R je nezávisle atom vodíku, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH₂)„OR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂-CH₂-F, Och₂-ch₂-ch₂-f, cn, (c=o)-r; n(r)₂, no₂, (c=o)N(r)₂, o(co)r; or; sr; coor; Rph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituent R), tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

R'

(přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl);

nebo X je CR'=CR', N=N, C=O, O, NR' (přičemž R' reprezentuje atom vodíku nebo nižší alkyl), S, nebo SO₂;

• 9 99 • 9 9 • · 9 · · • · 9 9 • 9 9 9 η * 9 · · • · · ft • · · ft • · · 9 > ftft 9

9 99 každý ze substituentů Ri a R₂ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)„OR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂F, CH₂-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, CN, (C=O)-R; N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SR', COOR', Rph, CR -CR-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substítuenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substítuenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

R'

(přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

Ν' R₉ (přičemž substítuenty Rs a Rgjsou nižší alkyl) nebo

nebo /'ⁿ^_nx'ⁿ

každý substituent Q je nezávisle vybrán ze skupiny následujících struktur, každá z nich obsahuje karboxylovou kyselinu nebo kyselině podobnou funkční skupinu vybranou ze skupiny sestávající z hydroxy skupiny, sulfhydrylu, tetrazolu, oxadiazolu, cyklického amidu, isoindol-l,3(2H)-dionu, benzisoxazolu, 2,3-benzodiazin-l,4(2H, 3H)-dionu, 2,3benzoxazin-1,4(3H)-dionu, (2H) 1,3-benzoxazin-2,4(3H)-dionu, (3H)2-benzazin-1,3-(2H)dionu nebo NO₂;

ΙΑ, IB, IC, ID, IE, IF a IG, přičemž IA má následující strukturu:

(IA)

. ..

· 0 00 • · 0 0 • 0 0 0 « 0 0 0 kde:

každý ze substituentů R3, R4, R5, Rg nebo Ryje nezávisle definován jako výše uvedená definice substituentu Ri a kde alespoň jeden ze substituentů R3, R4, R₅, R₆ nebo R₇ je hydroxy skupina, tetrazol, oxadiazol, NO2 nebo karboxy skupina u obou substituentů Q;

s podmínkou, že (i) jestliže sloučenina vzorce (I) je :

pak alespoň jeden ze substituentů R¹ nebo R² je halogen;

(ii) jestliže sloučenina vzorce (I) je :

R-2 R₂

7 pak každý ze substituentů R -R je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR', kde index n je 1,2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂F, CH₂-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂,O(CO)R', OR', SH, COOR', Rph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R a R ), tnalkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

R' \

Ν-

'Ν

V^N nebo

Ν'

Ra ,N>

<4 «9 • 9 9 • · ♦»· » · · ' * 4 9 «| • » 4 · • 4 ·· ♦ 9 4 • 4 4 « « « · «

4 · « ··

9· • 4 4 • 4 4 • 4 4 1 » 4 * ₄ •4 9· (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

(přičemž substituenty R« a R9jsou nižší alkyl) nebo

nebo

(iii) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

pak každý ze substituentů R⁴a R⁶ je Vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH2)nOR', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH2-CH2F, O-CH2-CH2-F, CH2-CH2-CH2-F, O-CH2-CH2-CH2-F, N(R')₂, , (C=O)N(R')₂, O(CO)R',

OR', SH, COOR', Ra, CR'=CR'-R_Ph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

R’

nebo

N' (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

(přičemž substituenty Rs a Rgjsou nižší alkyl) nebo ,Ν

-Ν.

,N ·* • · ·· • 4 4 4 * * · · • * 4 • ♦ 444 • 4 4 4 • 4 4 4 »4 4 »4 4 • 4 4

4 4 nebo /-¼ /N.

N

(iv) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

pak každý ze substituentů R³a R⁷ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CHíjnOR', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH2-CH2F, o-ch₂-ch₂-f, CH2-CH2-CH2-F, 0-CH2-CH2-CH2-F, n(R)₂, (co)N(rr o(co)r; OR', SH, Rph, CR'=CR'-R_Ph, CR'2-CR'2-Rph (přičemž Rpi, reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

R'

(přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

(přičemž substituenty Rs a R9 jsou nižší alkyl) nebo nebo

(v) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

pak Substituent R⁵ vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)„OR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, OH, SH, COOR', Rph, CR'=CR'-R_Ph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

• 4 • »4 • · 4 44

4 4 • 4 4 • 4 44

4

444

4 4

4 4 • 4 44 » 4 4 9 > 4 4 4

nebo

(přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

(přičemž substituenty Rs a Rg jsou nižší alkyl) nebo

O nebo

(vi) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

pak alespoň jeden ze substituentů R²-R³ a R⁷je vybrán ze skupiny sestávající z F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH2)_n0R', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH2-CH2F, O-CH2-CH2-F, CH2CH2-CH2-F, O-CH2-CH2-CH2-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SH, COOR',

Rph, CR -CR'-Rph, CR'2-CR'2-Rph (přičemž R_Pi, reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových 12·' substituentů definovaných pro substituenty R a R ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

R’

nebo

N' (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

(přičemž substituenty Rs a R<> jsou nižší alkyl) nebo nebo

Ν'

* • · toto • · · • · * » to· • · to ··· * ·· # to ·· « • ·· « • ·· · toto toto nebo alespoň jeden ze substituentú R⁴ a R⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CHíjnOR/, kde index nje 1, 2 nebo 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2-F, CH2-CH2-CH2-F, O-CH2-CH2-CH2-F, N(R )₂, NO₂, (C=O)N(R )₂, O(CO)R', or; SH, COOR (kde R je nižší alkyl), Rph, CR=CR-Rp_h, CR'₂CR'2-Rph (přičemž Rpi, reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentú definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

R'

(přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

Ν' R₉ (přičemž substituenty Rs a R9 jsou nižší alkyl) nebo

nebo (vii) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

ánlze • « • ft pak substituenty R⁴ a R⁶ jsou vybrán/ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, nižšího alkylu, (CFhjnOR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH2-CH2F, O-CH2-CH2-F, CH₂CH2-CH2-F, O-CH2-CH2-CH2-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SH, COOR', Rph, CR'=CR'-Rph, CR'2-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

nebo

rc (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

R

(přičemž substituenty Rs a R9 jsou nižší alkyl) nebo ,N nebo (viii) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

Rt Rt

44 • 4 4 · 4«· * · 4 4 4 ♦ *4 4

44 ·« • 4 4

4 444 ·· ·

4 4 4

44

44 * 4 4 4 • 4 4 4

4 4 4 4

4 4 4

44

’ΥΚ substituent R² je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)„OR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OH, SH, COOR', Rph,

CR'=CR'-Rpi„ CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž Rph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentú definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

nebo

Ν'

N (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

(přičemž substituenty Rs a R9 jsou nižší alkyl) nebo *

,Ν

-Ν nebo /^Ν «« »

« 4 44 • · 4 *4 ♦ · · • * 4 • · · » · » « · (ix) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

pak substituenty R⁴ a R⁶ jsou vybrány ze skupiny sestávající z F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R j₂, O(CO)R', OR', SH, COOR' (kde substituent R'je nižší alkyl), R_Ph, CR'=CR'-Rpi„ CR'₂-CR'₂-Rpi, (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

R'

(přičemž substituent R'je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

(přičemž substituenty Rs a Rgjsou nižší alkyl) nebo nebo /N.

kde:

každý ze substituentů R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ nebo R¹⁶ je nezávisle definován jako výše definovaný substituent R¹ a kde alespoň jeden ze substituentů R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ nebo R¹⁶ je hydroxy skupina, tetrazol, oxadiazol, NO₂ nebo karboxy skupina u obou substituentů Q;

dále s podmínkou, že (x) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

pak alespoň jeden ze substituentů R¹ nebo R² je halogen a substituenty R¹⁰ a R¹¹ jsou stejné;

• φ φφ φφ • φ · • φ φφφ φ φ φ φ • φ φ φ • Φ ·» φ* »· • φ φ • Φφφφ • φ φ • Φ Φ 4 ΦΦ ΦΦ

ΦΦ ·· • Φ Φ Φ

ΦΦΦΦ Φ « Φ · Φ Φ Φ φ

Φ· ΦΦ (xi) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

R₂

pak substituenty R^u - R¹⁴ jsou vybrány ze skupiny sestávající , z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH2)_n0R', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH2-CH2F, O-CH2-CH2-F, OCH2-CH2-CH2-F, N(R')₂, NO2, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', or; SH, R_Ph, CR'=CR'-Rp_h, CI< 2CR'2-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

N>

“N nebo

N' (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

N R₉ (přičemž substituenty Rs a R9 jsou nižší alkyl) nebo

nebo ' N (xii) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

pak substituenty R¹⁰, R¹⁵ a R¹⁶ jsou vybrány ze skupiny sestávající z F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH2)„0R', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH2-CH2F, O-CH2-CH2-F, CH₂-CH₂CH₂~F, O-CH2-CH2-CH2-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')_2j SH, R^, CR'=CR'-R_Ph, CR ₂-CR'₂Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

R¹

N *' N *’ (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

Rg i

⁹ (přičemž substituenty R$ a Rgjsou nižší alkyl) nebo

-NT

Ν' 'N nebo

nebo

• 0 00

0· 00 00 «00 · 0 0 • · 000 · 0 000 • 0 · <00 00 00 ••00 0 00 0 • 0 0 0 • 0 0 0

0 0 0

0 0 0

00 (xíii) pokud sloučenina vzorce (I) definuje _a substituent R¹⁶ jako COOH, pak substituent R¹⁰ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br,

I, nižšího alkylu, (CH₂)„OR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF3, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R^z, OR'(kde substituent R' je nižší alkyl), SH, COOR', Rph, CR =CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R² ), tnalkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

R’

(přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

⁹ (přičemž substituenty Rs a R9 jsou nižší alkyl) nebo nebo /“V

IC má následující strukturu:

kde:

každý ze substituentů R¹⁷, R¹⁸, R¹⁹, R²⁰ nebo R²¹ je definován jako výše definovaný substituent R¹;

• · · ··· ···· • · · ·· · · · 0 · 0 00 0

• · · · 00 00 00 00

ID má následující strukturu:

kde:

oo 23 24 každý ze substituentů R , R nebo R je nezávisle definován jako výše definovaný substituent R¹ \_/ nereprezentuje heterocyklický kruh jednoho z následujících šesti vzorců:

HO' \₌/

Xo °=K \ / C=C

-ií rt

kde:

každý ze substituentů R , R nebo R nezávisle je definován jako výše definovaný substituent R¹ \_/ ,Č=C reprezentuje heterocyklický kruh jednoho ze šesti následujících vzorců:

HO' w \₌/ ϋ ÍT3 \_/

Ή g-0

kde:

právě jeden ze substituentů R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹ nebo R³² je vazba spojení definovaná pro výše uvedený vzorec (I) a každý další substituent R , R , R , R nebo R nezávisle je definován jako výše uvedený substituent R¹ a kde alespoň jeden ze substituentů R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹ nebo R³² je hydroxy skupina, sulfhydryl, tetrazol, oxadiazol, NO2 nebo karboxy skupina u obou substituentů Q;

• · · ft · · · ·

IG má následující strukturu:

kde:

ÍIG)

právě jeden ze substituentů R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶, R³⁷, R³⁸ nebo R³⁹ je vazba

spojení definovaná pro výše uvedený vzorec (I) a každý další substituent R³³, R³⁴, R³⁵,

0*7 OO Oíl 1

R , R , R nebo R nezávisle je definován jako výše definovaný substituent R a kde alespoň jeden ze substituentů R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶, R³⁷, R³⁸ nebo R³⁹ je hydroxy skupina, sulfhydryl, tetrazol, oxadiazol, N0₂ nebo karboxy skupina u obou Q;

nebo kde:

je NR'-N-Q (přičemž substituent R' reprezentuje atom vodíku nebo nižší alkyl) a každý j_e nezávisle vybrán z jedné z následujících skupin:

IIA nebo IIB, kde:

IIA má následující strukturu:

«42 • · · · • · ·· · ·· · kde:

každý ze substituentů R⁴⁰ - R⁴⁷ nezávisle je H, F, Cl, Br, I, nižší alkyl (CH2)n0R' kde index n je 1, 2 nebo 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, O-CH2-CH2-CH2F, CN, (c=o)-r;n(R')2,no2,(c=o)n(R')2,o(co)R',or;sh, coor;r^p\cr=cr'-r^p\ CR'2-CR'₂-R^ph, (kde substituent R^ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substítuenty fenylu, vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů, definovaných pro substituent R¹), trialkylcín, tetrazol nebo oxadiazol formy:

R'

(kde substituent R' je atom vodíku nebo nižší alkyl).

IIB má následující strukturu:

R49 kde:

každý ze substituentů R⁴⁸ a R⁴⁹ nezávisle je nižší alkyl, (CH2)nOR' kde index n je 1, 2 nebo 3, CF3, CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, CN, (C=O)-R\ NO2, (C=O)N(R')2, COOR', (C=O)-(CH2)n-(C6H5) kde index n je 1,2 nebo 3, R^Ph, CR'=CR'-R^ph, CR'2-CR'₂-R^ph (kde substituent R^ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substítuenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituent R¹), tetrazol nebo oxadiazol formy:

(kde substituent R' je atom vodíku nebo nižší alkyl) u obou substituentů Q.

kde alespoň jeden ze substituentů R⁴⁸ a R⁴⁹ je (C=O)R', NO₂, (C=O)N(R')₂, COOR', CN nebo tetrazol nebo oxadiazol formy:

• ·· ·

(kde substituent R' je atom vodíku nebo nižší alkyl) u obou substituentú Q.

Funkční skupina podobná kyselině Qje poskytnuta výhodně funkčními skupinami, které obsahují ionizovatelný proton s pK_a menším než 10, výhodně od 2 do 9 a výhodněji od 4 do 8. Funkční skupiny mohou být vybrány ze skupiny sestávající z hydroxy skupiny, suflhydrylu, tetrazolu, oxadiazolu, cyklického amidu, isoindol-l,3(2H)-dionu, benzisoxazolu, 2,3-benzodiazin-l,4(2H, 3H)-dionu, 2,3-benzoxazin-l,4(3H)-dionu, (2H)l,3-benzoxazin2,4(3H)-dionu, (3H)2-benzazin-l,3-(2H)-dionu nebo NO₂.

Skupiny nižšího alkylu jsou výhodně vybrány ze skupiny sestávající z methylu, ethylu nebo nerozvětveného řetězce, rozvětveného řetězce nebo cyklického propylu, butylu, pentylu nebo hexylu.

V rámci jednoho provedení poskytuje předložený vynález sloučeniny vázající amyloid výše definovaného vzorce (I) nebo jejich ve vodě rozpustné, netoxické soli, kde alespoň jeden ze substituentú R'-R⁷ a R¹⁰-R⁴⁹ je vybrán ze skupiny sestávající z ¹³¹I,¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F, ¹⁹F, ¹²⁵I, CH2-CH2-¹⁸F, o-ch2-ch₂-¹⁸f, ch₂-ch₂-ch₂-¹⁸f,

O-CH₂-CH₂-CH₂-^,8F a substituentu, který obsahuje uhlík, jak je specifikováno ve vzorci (I), kde alespoň jeden uhlík je ⁿC nebo ¹³C.

Vynález také poskytuje sloučeniny vázající amyloid vzorce (I), jak jsou definovány výše, nebo jejich ve vodě rozpustné, netoxické soli, přičemž se sloučenina váže na Αβ s disociační konstantou (K_D) mezi 0,0001 a 10,0 μΜ, pokud je měřena vazba na syntetický peptid Αβ nebo mozkovou tkáň zasaženou AD.

V dalším aspektu poskytuje předložený vynález způsob syntézy na amyloid vázající se sloučeniny vzorce (I), jak jsou výše definovány, nebo jejich ve vodě rozpustné, netoxické soli, kde alespoň jeden ze substituentú R'-R⁷ a R¹⁰-R⁴⁹ je vybrán ze skupiny sestávající z ¹³¹1,¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F, ¹⁹F, zahrnující krok, ve kterém reaguje na amyloid vázající se sloučenina vzorce (I), jak je výše definována, nebo její ve vodě rozpustná, netoxická sůl, kde alespoň jeden ze substituentú RÉR⁷ a R¹⁰-R⁴⁹ je trialkylcín, s halogenačním činidlem obsahujícím lSlj, 123j, 76_βη 75_βη 18_f> 19_R

V dalším aspektu poskytuje předložený vynález farmaceutický přípravek pro in vivo zobrazení depozit amyloidu obsahující (a) na amyloid vázající se sloučeninu vzorce (I), jak je

výše definována, nebo její ve vodě rozpustnou, netoxickou sůl, kde alespoň jeden ze substituentú R^!-R⁷ a R¹⁰-R⁴⁹ je vybrán ze skupiny sestávající se z ¹³¹I,¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ^lsF, ¹⁹F a substituent obsahující uhlík, jak je specifikováno ve vzorci (I), kde alespoň jeden uhlík je ^llC nebo ¹³C a (b) farmaceuticky přijatelný nosič.

V dalším aspektu, předložený vynález poskytuje u subjektu způsob in vivo detekce depozit amyloidu, zahrnující kroky: (a) aplikování detegovatelného množství výše uvedeného farmaceutického přípravku a (b) detekci vazby sloučeniny na depozit amyloidu u uvedeného subjektu. Příslušný aspekt předloženého vynálezu poskytuje u subjektu způsob in vivo detekce depozit amyloidu, kde depozit amyloidu je lokalizován v mozku subjektu. Tato metoda vynálezu může být používána u subjektu, který je podezřelý na amyloidózu spojenou s nemocí nebo syndromem vybraným ze skupiny sestávající se z Alzheimerovy nemoci, Downovy choroby a z osob majících identické geny pro alelu apolipoproteinu E4.

V dalším aspektu poskytuje předložený vynález farmaceutické přípravky a způsoby prevence proti degeneraci buněk a toxicitě spojené s formováním fibril při stavech spojených s amyloidózou, takových jako například AD a diabetes mellitus typu 2. Takové farmaceutické přípravky obsahují chrysamin G nebo jejich výše uvedené deriváty a farmaceuticky přijatelný nosič. Takové sloučeniny by mohly být netoxické.

Další aspekt předloženého vynálezu se vztahuje na použití sondy značené radioaktivním izotopem pro stanovení množství depozit amyloidu při biopsii nebo posmrtných vzorcích tkáně.

Další aspekt předloženého vynálezu se vztahuje na způsob rozlišení mozku zasaženého Alzheiměrovou nemocí od mozku normálního.

Další aspekty, charakteristiky a výhody předloženého vynálezu se vyjasní v průběhu následujícího detailního popis. Nicméně by mělo být z detailního popisu odborné veřejnosti jasné, že podrobný popis a specifické příklady při ilustraci výhodných provedení vynálezu jsou zde uvedeny pouze pro ilustraci a že různé změny a modifikace v duchu a v rámci tohoto vynálezu přicházejí v úvahu.

Stručný popis obrázků _p

Obrázek IA ilustruje chemické struktury chrysaminu G a několika analog^nebo derivátů chrysaminu G, které byly syntetizovány a testovány, včetně 3-jodderivátu (3-ICG),

3-joddimethoxyderivátu (3-ICG(OMe)2), derivátu dimethylesteru (CG(C00Me)2), fenoluderivátu kyseliny salicylové (SA), derivátu anilinu (1/2CG), kongočerveně, 3,3 dijodderivátu (3,3 '-I₂CG), 3,3 -dibromderivátu (3,3'-Br2CG), 3,3 '-dichlorderivátu (3,3'ChCG), 3-bromderivátu (3-BrCG) a derivátu 5-fluorsalicylové kyseliny ((5-FSA)CG). Čísla napsaná u každé sloučeniny uvádějí její Ki (v μΜ) k inhibování vazby [¹⁴C]chrysaminu G na syntetický peptid, Αβ (10 - 43).

o

4/

Obrázek IB ilustruje chemické struktury několika analog'a derivátů chrysaminu G, které byly syntetizovány a testovány, včetně derivátu 3,3 '-dikarboxylové kyseliny (3,3 '(COOFThCG), derivátu 2,2'-disulfonové kyseliny chrysaminu G (2,2'-(SO₃)2CG), 3bromderivátu 3-isopropylsalicylové kyseliny (3-Br-(3-iPrSA)CG), derivátu 3isopropylsalicylové kyseliny ((-iPrSA)CG), 2,4-difenolderivátu (2,4-difenol), derivátu γresorcylové kyseliny ((6-OHSA)CG), 3,3',5,5'-tetramethylbenzidinderivátu (3,3',5,5'(CH₃)₄CG), 3,3 '-dimethylderivát (3,3 '-(CHLj^CG), 2,2'-dimethylderivát (2,2'-(CH₃)2CG), derivát benzisoxazolu (CG benzisoxazol) a 3-karboxyalkynderivát (3-(COOH)-C3C). Čísla napsaná u každé sloučeniny uvádějí její Kj (v μΜ) k inhibování vazby [¹⁴C]chrysaminu G na syntetický peptid, Αβ (10 - 43).

Obrázky 2A - 2K ilustrují chemické struktury chrysaminu G a trialkylcínderiváty analog chrysaminu G v jednotlivých heterocykl ických analogách. Nicméně je třeba si povšimnout toho, že tyto struktury reprezentují polovičku molekuly, která je symetrická u uvedené vlnité vazby nahoře vpravo, vyjma toho, že trialkylcínová část může být pouze na jedné straně bifenylové skupiny. Deriváty trialkylcínu jsou stabilní meziprodukty a přímé prekurzory pro přípravu halogenovaných derivátů s vysoce specifickou aktivitou značených radioaktivním izotopem. Heterocyklická analoga reprezentují jiný možný způsob umístění slabě kyselých částí na stejné strukturní pozici jako středně kyselá skupina karboxylové kyseliny chrysaminu G. Tyto prekurzory trialkylcínu jsou uvedeny ve svých protonováných formách, nicméně odborná veřejnost snadno rozezná, že jejich deprotonované formy a tautomery jsou také zahrnuty v těchto obrázcích.

2A) chrysamin G

2B) Trialkylcínderiváty chrysaminu G

2C) Trialkylcínderiváty analogu 3-hydroxy-l,2-benzisoxazolu;

2D) Trialkylcínderiváty ftalimidu nebo analogu isoindol-l,3-(2H)-dionu;

2E) Trialkylcínderiváty ftalhydrazidu nebo analogu 2,3-benzodiazin-l,4-(2H,3H)-dionu

2F) Trialkylcínderiváty analogu 2,3-benzoxazin-l,4(3H)-dionu;

4 4 4 49

4

499

9 9 9 9 4 9 9 · · · 9 4 9 • 4 4 9 4 4 4 4 4 4 4 4 ·· 44 99 44 44 44

2G) TrialkyÍcínderiváty analogu (2H)l,3-benzoxazin-2,4(3H)-dionu;

2H) Trialkylcínderiváty analogu (3H)2-benzazin-l,3(2H)-dionu;

21) Trialkylcínderiváty analogu 1,8-naftalimidu;

2J) Trialkylcínderiváty analogu tetrazolu;

2K) Trialkylcínderiváty analogu oxadiazolu;

Obrázek 3 ukazuje křivky nahrazení vazby [¹⁴C]chrysaminu G na Αβ(10 - 43) několika strukturními analogy chrysaminu G. Zkratky se vztahují na ty, které byly používány v obrázku 1. Obrázek 3A) chrysamin G (bílé trojúhelníky); (5-FSA)CG (vybarvené kosočtverce); 3,3 '-(COOH)2CG (vybarvené čtverce); 2,2'-(SO₃)CG (vybarvené kruhy).

Obrázek 3B) chrysamin G (bílé trojúhelníky); kongočerveň (bílé kruhy); derivát anilinu (převrácené bílé trojúhelníky); derivát fenolu (bílé čtverce); kyselina salicylová (X). Křivky, které ukazují vzrůstající vazebnost při vyšších koncentracích jsou takové, protože dochází k formování micel. Bedaux, F. et al., Pharm. Weekblad 98: 189 (1963).

Obrázek 4A je diagram vazby chrysaminu G na Αβ(10 - 43) podle Scatcharda.

Zakřivená čára reprezentuje nelineární nejmenší čtverce odpovídající dvěma, nezávislým modelům vazebných míst. Rovné čáry reprezentuji jednotlivé komponenty.

Obrázek 4B je Scatchardova analýza vazby [¹⁴C]CG na kontrolní vzorky (kosočtverce) a na vzorky mozku zasažené AD(čtverce). Čárkovaná čára (—) má stejný slop jako čára AD a je zde míněna jako pomocný prostředek ke srovnání s kontrolním slopem.

Tento vzorek mozku zasaženého AD měl 48 NP/x200 faktor zvětšení, K_D 0,35 μΜ a B_max 790 fmol/pg proteinu. Kontrolní vzorek měl Kd 0,48 μΜ a B_max 614 fmol/pg proteinu.

Obrázek 5 je graf ilustrující lineárnost stanovení vazby vzhledem ke koncentraci peptidu. Při běžném stanovení bylo použito přibližně 0,9 pg Αβ (10 - 43).

Obrázek 6A je graf ilustrující časový průběh vázání chrysaminu G a Αβ (10 - 43).

Obrázek 6B je grafická ilustrace stanovení konstanty reakční rychlosti vázání (k₃).

Obrázek 6C je graf časového průběhu disociace chrysaminu G od Αβ (10 -43).

9 • 9 9*

9 • * · 9 4 9 9 • · >44 * 4 9 4 • ·4 444 44 9 • •4 4 4 44 9 ·· 4· 44 44

Obrázek 7 je grafická interpretace molekulárního modelu interakce mezi chrysaminem G a Αβ.

Obrázek 8A je graf ilustrující korelaci mezi množstvím vázaného [¹⁴C]chrysaminu G a počtem neuritických plátů (NP) ve vzorcích mozku zasaženého AD.

Obrázek 8B je graf ilustrující korelaci mezi množstvím vázaného [¹⁴C]chrysaminu G a počtem neurofibrilárních zauzlení (NFT) ve vzorcích zasažených AD. V obou obrázcích 8A a 8B reprezentuje x-ová souřadnice průměrnou hodnotu počtu NP nebo NFT na místo při faktoru zvětšení x200 ve značených sekcích podle Bielschowskyho buď homího/středního frontálního (n = 10) nebo horního temporálního kortexu (n = 10). Vybarvené symboly a tlusté Čáry indikují mozky bez amyloidové angiopatie, bílé symboly a čárkované čáry indikují mozky s amyloidovou angiopatií. Y-ová souřadnice reprezentuje celkovou, absolutní vazebnost [¹⁴C] chrysaminu G (fmol/pg proteinu) ve stejnorodých částech vzorků mozku přiléhajících k těm, které byly použity pro barvení. Byly používáno přibližně 75 pg proteinu a 150 nM [¹⁴C]chrysaminu G.

Obrázky 9A, 9B a 9C Vazba chrysaminu G na různá místa v mozku ve vzorcích mozku zasaženého AD majících více než 20 NPs/x200 faktor zvětšení, vztažené na „Mozky s AD s vysokým počtem plátů“(„High Plague AD Brains“), uvedeno na obrázku 9A. Vazba chrysaminu G na různá místa mozku ve vzorcích mozku zasaženého AD majících méně než 20 NPs/x200 faktor zvětšení, vztahuje se na „Mozky s AD s nízkým počtem plátů“(„Low Plague AD Brains“), uvedeno na obrázku 9B. Experimentální body reprezentují poměr vazby [¹⁴C]chrysaminu G ve značeném místě mozku ku vazbě [¹⁴C]chrysaminu G v mozečku (dále jen anglická zkratka CB) stejného mozku. Horizontální sloupce v grafu reprezentují střední hodnotu a chybové sloupce reprezentují standardní chybu pro kontrolní vzorek(kruhy) a mozek zasažený AD(kosočtverce v 9A a 9B). Místa v mozku zahrnují pól frontálního laloku mozku (FP), čelný caudatus (CAU), vrchní/střední frontální (SMF), vrchní temporální (ST), dolní parietální (IP) a okcipitální (OC) kortex. Asterisky indikují signifikantní rozdíly ve srovnání s kontrolním vzorkem (*p<0,05; **p<0,001). Dva vzorky mozku zasaženého Downovou chorobou jsou uvedeny v obrázku 9C. Kosočtverce v obrázku 9C reprezentují mozek 23 let starého pacienta zasaženého Downovou chorobou s ještě nesymptomatickou • · 4 · 9 9

9 999 9 9 999 • · 4 4 4 4 4 4 « •444 · 9 9 9

99 44 »·

4« • 4 4 4

4 4 ·

4 4 4

4 4 4

44

AD. Trojúhelníky v obrázku 9C reprezentují 51 let starého pacienta zasaženého Downovou chorobou, u kterého se rozvinula AD jako u rozsáhlé většiny pacientů s Downovou chorobou (kolem 40-tky).

Obrázek 10 je graf ilustrující hladinu chrysaminu G ve tkáni u myší injektovaných [¹⁴C]chrysaminem G do laterálního konce žíly a utracené v uvedených časech. Bílé symboly a tenké čáry reprezentují absolutní radioaktivitu v jednotkách cpm/g tkáně (levá souřadnice). Plné symboly a plné čáry reprezentují poměr radioaktivity mozku vztaženou ku radioaktivitě v ledvinách (horní) nebo v krvi (střední). Poměry jsou graficky znázorněny na pravé souřadnici.

Obrázek 11 Horní část: Část od spodního, temporálního lalůčku mozku zasaženého AD značeného chrysaminem G metodou Stokese a Trickeyho, J. Clin. Pathol. 26: 241 - 242 (1973). Dva neuritické pláty jsou zřetelně viditelné. Spodní část: Přiléhající části od temporálního lalůčku pacienta zasaženého AD s amyloidovou angiopatií. Levá část: Části mozku byly značeny metodou kongočerveně Puchtlera. Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10: 35 (1962). Pruh reprezentuje 20 mikro ů. Pravá část: Přilehlé části mozku značení pomocí Puchtlerovy metoy substitucí chrysaminu G za kongočerveň. Obě části pohotově demonstrují stejnou amyloidem zatíženou cévu. Malé množství autofluorescenčního pozadí z erythrocytů a lipoíuscinu je také viditelné. Všechny fotomikroskopické snímky byly získány použitím filtrů fluorescin izotiokyznátu (FITC).

Obrázek 12. Sloupcový graf ukazující účinek vzrůstajících koncentrací Αβ (25 - 35) v přítomnosti a za absence chrysaminu G na celulární redoxní aktivitu krysích buněk feochromocytomu (PC - 12), měřeno redukcí 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5difenyltetrazoliumbromidu, MTT. Redukční produkt MTT absorbuje při 560 nm, což je zachyceno na vertikální ose. Účinek samotného Αβ (25 - 35) je uveden ve vybarvených sloupcích a ukazuje na dávce závislé snížení při redukci MTT. Signifikantní rozdíly od kontrolního vzorku (bez Αβ (25 - 35) a bez chrysaminu G) jsou uvedeny v bílých polích uvnitř vybarvených sloupců. Ochranný účinek 20 μΜ chrysaminu G je uveden v nevybarvených sloupcích. Signifikantní rozdíly mezi redukcí MTT v přítomnosti a absenci chrysaminu G jsou uvedeny uvnitř nevybarvených sloupců.

· · • · · 99

9 9 • 9 9 9

44

Obrázek 13. Sloupcový graf ukazující ochranný účinek vzrůstajících koncentrací chrysaminu G oproti Αβ(25 - 35) indukované celulární redoxní aktivitě krysích buněk feochromocytomu (PC - 12), měřeno redukcí 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5difenyltetrazoliumbromidu, MTT. Produkt redukce MTT absorbuje při 560 nm, což je zachyceno na vertikální ose. Účinek chrysaminu G za absence Αβ (25 - 35) je uveden ve vybarvených sloupcích. Nebyl znám žádný signifikantní rozdíl mezi kontrolním vzorkem (bez Αβ (25 - 35) a bez chrysaminu G) a jakoukoliv z koncentrací chrysaminu G za absence Αβ(25 - 35). Redukce MTT v přítomnosti 1 μΜ Αβ(25 - 35) a vzrůstajících koncentrací chrysaminu G jsou uvedeny v nevybarvených sloupcích. Signifikantní rozdíly mezi redukcí MTT v přítomnosti a absenci Αβ(25 - 35) při jednotlivých koncentracích chrysaminu G jsou uvedeny uvnitř vybarvených sloupců. Signifikantní rozdíly při redukci MTT mezi kontrolním vzorkem Αβ(25 - 35) (bez chrysaminu G) a Αβ(25 - 35) plus vzrůstající koncentrace chrysaminu G jsou uvedeny uvnitř nevybarvených sloupců.

Obrázek 14. Srovnání účinků chrysaminu G a inaktivního derivátu fenolu na toxicitu indukovanou Αβ(25 - 35). Ve všech experimentech vyjma kontrolního experimentu bylo přítomno 1 μΜ Αβ(25 - 35). Chrysamin G projevuje ochranné účinky při 0,1 a 1 μΜ, ale derivát fenolu neprojevuje žádné ochranné účinky a snad zvyšuje toxicitu Αβ.

Podrobný popis výhodných provedení

Předložený vynález využívá schopnosti chrysaminu G a jeho derivátů značených radioaktivním izotopem prostoupit hematoencefalickou bariéru in vivo a vázat se na Αβ deponovaný v neuritických (ale ne difuzní) plátech, na Αβ deponovaný v cerebrovaskulárním amyloidu a na amyloid tvořený proteinem deponovaný v NFT. Chrysamin G je derivát kongočerveně s klíčovým rozdílem ve struktuře spočívajícím v tom, že části kyseliny sulfonové nacházející se v derivátu kongočerveně jsou nahrazeny skupinami karboxylové kyseliny v chrysaminu G (Obrázek 1). Tato strukturní záměna umožňuje chrysaminu G, aby vstupoval do mozku lépe než kongočerveň a velké makromolekuly takové jako protilátky. Tubis et al.,J. Am. Pharmaceut. Ass. 49: 422 (1960). Také může být chrysamin G specifičtější značení pro patofyziologii AD než protilátky, které by také mohly označovat difusní pláty, díky své zjevné specificitě pro neuritické pláty a NFT.

ΦΦ φφ • « • φφφ

·· ·· * ♦ · φ φ · φ φ φ φ φ φφ φφ φ φ φ φφ φφ φ φ φ φ φφ φφ

Deriváty chrysaminu G předloženého vynálezu mají každou z následujících charakteristik: (1) specifickou vazbu na syntetický Αβ in vitro, (2) vazebnost na neuritické, ale ne difuzní, pláty v částech mozku (3) schopnost prostoupit neoslabenou hematoencefalickou bariéru in vivo.

Způsob podle tohoto vynálezu determinuje přítomnost a lokalizaci depozit amyloidu v orgánu nebo místo v těle, výhodně mozku, pacienta. Předložený způsob zahrnuje aplikování detegovatelného množství farmaceutického přípravku obsahujícího sloučeninu vzorce (I), jak je definováno výše, nazvanou „detektovatelná sloučenina“ nebo její farmaceuticky přijatelnou ve vodě rozpustnou sůl pacientovi. „Detektovatelné množství“ znamená, že množství detektovatelné sloučeniny, která je aplikována, je dostačující k provedení detekce vazby sloučeniny na amylóid. „Množství efektivní pro zobrazení“ znamená, že množství detegovatelné sloučeniny, která je aplikována, je dostačující k provedení zobrazení vazby sloučeniny na amyloid.

Vynález využívá sond pro amyloid, které ve spojení s neinvazivními technikami neurozobrazení, takovými jako spektroskopie magnetické rezonance (MRS) nebo zobrazení magnetické rezonance (MRI) nebo zobrazení záření gama, jako tomografie pozitronové emise (PET) nebo jednofotonová emise měřená tomografií (SPÉCT), jsou používány ke stanovení množství depozit amyloidu in vivo. Termín „in vivo zobrazení“ se vztahuje na jakoukoliv metodu předloženého vynálezu, která dovoluje detekci značeného chrysaminu G, derivátu značeného chrysaminu G nebo značené sloučeniny vzorce (I), jak je popsáno výše. Pro zobrazení záření gama je záření emitované z orgánu či zkoumané oblasti měřeno a vyjádřeno buď jako celková vazebnost a nebo jako poměr, ve kterém je úplné připojení v jedné tkáni normalizováno na (například, děleno) úplné připojení v jiné tkáni stejného subjektu během stejné postupu in vivo zobrazení. Úplné připojení in vivo je definováno jako celistvý signál detegovaný ve tkáni pomocí technik in vivo zobrazení bez potřeby korekce druhou injekcí stejného množství značené sloučeniny spolu s velkým přebytkem neznačené, ale jinak chemicky identické, sloučeniny. Termín „subjekt“ se vztahuje na savce, výhodně lidské subjekty, a nejvýhodněji na lidské subjekty s podezřením na demenci.

Pro účely in vivo zobrazení je dostupný typ přístroje k detekci hlavním faktorem při výběru příslušného značení. Například radioaktivní izotopy a ¹⁹F jsou zvláště vhodné pro in vivo zobrazení ve způsobech předloženého vynálezu. Typ používaného přístroje bude ovlivňovat volbu radionuklidu nebo neradioaktivního izotopu. Například vybraný radionuklid

·· ·* ·« ·· ·· ·· *·· * ♦ · · > · · • · ··· · · «·· φ » · · • · · * « Φ · · · · « ·« « ···» · · ♦ · ···· *· ·· ·· »· ·· · · poločasu rozpadu radionuklidu. Poločas rozpadu by měl být dostatečně velký na to , aby byl detektovatelný ještě v čase maximální absorpce subjektem, ale krátký natolik, aby hostitel nebyl postižen zdraví škodlivou radiací. Sloučeniny značené radioaktivním izotopem mohou být detektovány použitím zobrazení gama zářeni, kde je detektováno emitované záření gama příslušné vlnové délky. Metody zobrazení gama záření zahrnují, ale není to nikterak limitováno, SPÉCT a PET. Výhodně, pro SPÉCT detekci, bude mít vybrané značení radioaktivním izotopem nedostatek emise částic, ale za to bude produkovat velké množství fotonů v rozpětí 140 - 200 keV. Pro PET detekci bude značení radioaktivním izotopem radionuklid emitující pozitrony takový jako ¹⁹F, který bude anihilovat za vzniku dvou 5511 ke V gama paprsků, které budou detegovány PET kamerou.

V předloženém vynálezu jsou uváděny sloučeniny/sondy vázající amyloid, které jsou účinné pro in vivo zobrazení a kvantifikaci depozit amyloidu. Tyto sloučeniny se používaly ve spojení s neinvazivními technikami neurozobrazení, jako spektroskopie magnetické rezonance (MRS) nebo zobrazení magnetické rezonance (MRI), tomografie pozitronové emise (PET) nebo jednofotonové emisní počítačová tomografií (SPÉCT). V souhlasu s tímto vynálezem mohou být deriváty chrysaminu G značeny ¹⁹F nebo ¹³C pro MRS/MRI pomocí obecných technik organické chemie, které jsou známy v tomto oboru. K nahlédnutí např., March, J. „ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY: REACTIONS, MECHANISMS, AND STRUCTURE (3^rd Edition, 1985), obsah knihy je zde doplněn jako odkaz. Deriváty chrysaminu G mohou být také značeny radioaktivním izotopem F, C, Br nebo Br pro PET pomocí technik, které jsou známy v tomto oboru a jsou popsány v Fowler, J. and Wolf, A. in POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY (Phelps, M„ Mazziota, J., and Schelbert, H. eds.) 391 - 450 (Raven Press, NY 1986), obsah knihy je zde doplněn jako odkaz. Deriváty chrysaminu G mohou být také značeny radioaktivním izotopem

9T

I pro SPÉCT pomocí technik, které jsou známy v tomto oboru. K nahlédnutí např.

Kulkami, Int. J. Rad. Appl. & Inst. (Part B) 18: 647 (1991), obsah knihy je zde doplněn jako odkaz. Kromě výše uvedeného, mohou být deriváty chrysaminu G také značeny radioaktivním izotopem jodu, takovým jako např., ale není to nikterak limitováno, ¹³¹1,¹²⁵I nebo ¹²³I pomocí jodace diazozized derivátem diazoaminu přímo via diazoniumjodidem, k nahlédnutí Greenbaum, F. Am. J. Pharm. 108: 17 (1936) nebo konverzí nestálého diazoaminu na stabilní triazen nebo konverzí neradioaktivního, halogenovaného prekurzoru na stálý derivát trialkylcínu, který pak může být konvertován na jodovanou sloučeninu několika způsoby dobře známými v tomto oboru. K nahlédnutí Satyamurthy and Barrio, J. Org. Chem. 48: 4394 (1983), Goodman et al., J. Org. Chem. 49: 2322 (1984), and Mathis et • ft »· • ftft • · · ·· * · · · • · · · ♦ ft ftft ft · · • · ftftft • ft ft ft • ft ftft • ft ftft • ftft · • ftft * • ftft · • ft ftft al.,J. Labell. Comp. and Radiopharm. 1994: 905; Chumpradit eí a/., J. Med. Chem. 34: 877 (1991); Zhuang et al., J. Med. Chem. 37: 1406 (1994); Chumpradit et al.,J. Med. Chem. 37: 4245 (1994). Například stálý triazen nebo derivát trialkylcínu chrysaminu G nebo jeho analoga se nechají reagovat s halogenačním činidlem obsahujícím ¹³*1, ¹²⁵1, ¹²³1, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F nebo ¹⁹F. To znamená, že v rozsahu předloženého vynálezu jsou stabilní deriváty trialkylcínu chrysaminu G a jeho analoga nové prekurzory použitelné pro syntézu mnoha sloučenin značených radioaktivním izotopem. Jako takové jsou tyto deriváty trialkylcínu v rámci jednoho provedení tohoto vynálezu.

Deriváty chrysaminu G mohou být také značeny radioaktivním izotopem vybraným ze známých kovů používaných k tomuto účelu, takové jako Technecium-99m (^99mTc).

Modifikace substituentů k zavedení ligandů, které vážou takové kovové ionty, může být provedena bez neobvyklého experimentování rutinní prací v oboru radioaktivního značení. Deriváty chrysaminu G značené radioaktivním izotopem kovu mohou pak být používány k detegování depozit amyloidu.

Ve způsobech předloženého vynálezu se mohou používat izotopy detektovatelné spektroskopií jaderné magnetické rezonance za účelem in vivo zobrazení a spektroskopie. Prvky použitelné ve spektroskopii jaderné magnetické rezonance zahrnují ¹⁹F a ¹³C.

Vhodné radioizotopy pro účely tohoto vynálezu zahrnují izotopy vyzařující gama záření, beta záření, pozitronové záření rentgenové paprsky. Tyto radioizotopy zahrnují ¹³¹I, ¹²³1,¹⁸F, ⁿC, ⁷⁵Br a ⁷⁶Br. Vhodné stabilní izotopy, podle tohoto vynálezu, pro použití v zobrazení magnetické rezonance (MRI) nebo spektroskopie magnetické rezonance (MRS) zahrnují ¹⁹F a ¹³C. Vhodné radioizotopy pro in vitro kvantifikaci amyloidu ve stejnorodých částech při biopsii nebo v posmrtné tkáni zahrnují ¹²⁵1,¹⁴C a ³H. Výhodné izotopy pro radioaktivní značení zahrnují ¹⁸F pro PET při in vivo zobrazení, ¹²³I pro použití v SPÉCT zobrazení, ¹⁹F pro MRS/MRI a ³H nebo ¹⁴C pro in vitro studie. Nicméně jakékoliv konvenční metody pro vizualizaci diagnostických sond mohou být využívány v souladu s tímto vynálezem.

Metoda by mohla být používána k určení diagnózy AD při mírných nebo klinicky nejasných případech. Tato technika by také umožňovala longitudinální studie depozit amyloidu pro lidské populace, které se nacházají ve vysokém riziku pokud jde o depozita amyloidu, taková jako Downova choroba, familiální AD a osoby s identickými geny pro alelu apolipoproteinu E4. Corder et al., Science 261: 921 (1993). Metoda, která umožňuje navazování temporálních sekvencí depozit amyloidu, může určovat, zdali se depozita vyskytují dlouho před propuknutím demence nebo zdali nesouvisejí s demenci. Tato metoda • · ftft ft ftft • ftftftft ft ftft · • ft ftft • ft ftft ft ftft • ftftftft ft ftft ft • ft ftft • ft ftft • ftft ft • ftft · • ftft · • ftft ft ftft ftft může být používána k monitorování účinnosti terapií zaměřených na zamezení depozit amyloidu.

Obecně bude dávka dete; ovatelně značeného derivátu chrysaminu G odlišná v závislosti na posouzení věku, kondice, pohlaví a míře onemocnění pacienta, kontraindikacích, probíhajících terapiích a jiných faktorech, které provádí lékař odborně kvalifikovaný v oboru. Dávka může být v rozpětí 0,001 mg/kg do 1000 mg/kg, výhodně od 0,1 mg/kg do 100 mg/kg. Aplikování dávky subjektu může být místní nebo soustavná a aplikovaná intravenózně, intraarteriálně, intratekálně (via míšní mok) nebo podobně. Aplikování dávky může být také intradermálně nebo intrakavitárně v závislosti na místě orgánu pro provedení vyšetření. Po dostatečně dlouhé době k vytvoření vazby sloučeniny na amyloid, např. od 30 minut do 48 hodin, se místo subjektu ve stadiu vyšetření prohlédne rutinními technikami zobrazení, takovými jako MRS/MRI, SPÉCT, planárním zobrazením scintilace, PET a také technikami zobrazení náhlých příhod. Exaktní protokol se bude nevyhnutelně odlišovat v závislosti na faktorech charakteristických na pacientovi, jak je uvedeno výše, a v závislosti na místě, ve kterém probíhá vyšetření, způsobu aplikace a typu používaného značení; pro kvalifikované v oboru by mělo být rutinní záležitostí určení specifických postupů. Pro zobrazení mozku je množství (celkové nebo specifické vazby) vázaného radioaktivně značeného chrysaminu G nebo derivátu chrysaminu G nebo jeho analog měřeno a srovnáváno (jako poměr) s množstvím značeného chrysaminu G nebo derivátu chrysaminu G vázaného na malý mozek pacienta. Tento poměr je pak porovnáván se stejným poměrem u normálního mozku shodného stáří.

Farmaceutické přípravky předloženého vynálezu jsou výhodně aplikovány ve formě injikovatelných přípravků. Běžný přípravek pro takový účel obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič. Například může přípravek obsahovat asi 10 mg lidského sérového albuminu a od asi 0,5 do 500 mikrogramů značeného chrysaminu G nebo derivátu chrysaminu G na mililitr fosfátového pufru obsahujícího NaCl. Jiné farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují vodné roztoky, netoxické excipienty, včetně solí, konzervační látky, pufry, apod. jak je popsáno např. v REMINGTONS PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15^thEd. Easton: Mack Publishing Co. 1405 - 1412 a 1461 - 1487 (1975) a THE NATIONAL FORMULARY XIV., 14^ώ Ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975), obsah je zde doplněn jako odkaz.

·· ·· • · · • · ··· ♦ »4 · • · 4 4

99

99 * · 4 • 4 44·

9 9 9

9 9 9

44 • 9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

99

Příklady bezvodých rozpouštědel jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinný olej a injikovatelné organické estery, jako ethyloleát. Vodné nosiče zahrnují vodu, roztok alkohol/voda, fyziologický roztok, parenterální přenašeče, takové jako chlorid sodný, Ringerova dextrosa, atd. Intravenózní přenašeče zahrnují tekuté a vyživující regenerátory. Konzervační látky zahrnují antimikrobiální, antioxidační, chelatační agens a inertní plyny. Přesná koncentrace a hodnota pH různých komponent farmaceutického přípravku je upravena podle rutinních dovedností. K nahlédnutí Goodman and Gilmans The Pharmacological Basis for Therapeutics (7^Ul Ed ). Zvláště výhodné farmaceutické přípravky předloženého vynálezu jsou takové, které kromě specifické vazby amyloidu in vivo a schopnosti prostoupit hematoencefalickou bariéru jsou také netoxické v příslušných hladinách dávek a mají dostačující délku účinku.

Molekulární modelování

Molekulární modelování bylo provedeno na počítačovém grafickém systému Evans and Sutherland PS-330 pomocí počítačového modelovacího programu MacroModel (Verze

2,5 dostupná u C. Still na Columbia University) ke generování peptidového řetězce Αβ v antiparalelní konformaci β-listu(beta-sheet). Kirschner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83: 503 (1986). Peptidy amyloidu byly používány bez dalšího strukturálního zpřesnění. Peptidy Αβ byly seřazeny tak, aby protilehlé řetězce byly umístěny od sebe na délku 4,76 A’, což je charakteristické pro β-list fibrily. Kirschner, supra. Chrysaminu G byla zmenšena energie na nejnižší míru a byl orientován podle modelu fibrily k maximalizování kontaktu s lysinem-16 Αβ(10 - 43) a hydrofóbní oblastí fenylalaninu-19 a fenylalaninu-20.

Charakteristika specifické vazby na syntetický peptid: afinita, kinetika, maximální vazebnost

Význačné rysy vazby chrysaminu G a derivátů chrysaminu G jsou nejprve analyzovány použitím syntetického peptidu Αβ nazývaného Αβ(10 - 43). Byl vybrán peptid(10 - 43) právě proto, protože se ukázalo, že tento peptid poskytuje modelový systém obsahující všechny charakteristické strukturální vlastnosti peptidů Αβ. Hilbich et al.,J. Mol. Biol. 218: 149 (1991). Fragment aminokyselin (počet monomerních jednotek 10 - 43) Αβ byl syntetizován chloromravenčanem 9-fluorenylmethylnatým (FMOC) za pomoci syntetického ♦ · ·» * · » • · ·<·« • · · · • β · · ·· »· ·« · · • · · β » »·· • »4 »

9 9 ·

4 »· ·· ·· • 4 · · • · · 9

9 9 9

9 9 9

99 zařízení pro tvorbu peptidu, které patří University of Pittsburgh. Peptid se stanovil hmotnostní spektrometrií a hlavní komponenta měla Mr 3600 g/mol (vypočteno 3598). Peptid se dále purifikoval metodou Hilbicha a spol., která, v krátkosti, zahrnuje sekvenčně-frakční chromatografickou exkluzy na sloupci Biogelu P10 (2 x 180 cm, počet 200 - 400, Biorad, Richmond, CA) v 70% kyselině mravenčí následované druhou eluci přes sloupec Biogelu P4 (2 x 180 cm, počet 200 - 400) v 1M kyselině octové. Hilbich et al., J. Mol. Biol. 218: 149 (1991). Peptid byl lyofiíizován a uložen do chladícího zařízení při teplotě -80°C do doby, než se nepoužil na stanoveni vazebnosti.

Sekvence aminokyselin Αβ(10 - 43) je následující:

10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21
Tyr	Glu	Val	His	His	Gin	Lys	Leu	Val	Phe	Phe	Ala
22	23	24	25	26	27	28	29	30	31	32	33
Glu	Asp	Val	Gly	Ser	Asn	Lys	Gly	Ala	Ile	Ile	Gly
34	35	36	37	38	39	40	41	42	43
Leu	Met	Val	Gly	Gly	Val	Val	Ile	Ala	Thr

Stanovení vazby na syntetický Αβ(10 - 43)

Stanovení vazby bylo provedeno ve 12 x 75 mm borokřemičitanových skleněných trubicích. Byly přidány různé koncentrace neradioaktivních derivátů chrysaminu G v 10% ethanol/vodě. Přítomnost ethanolu byla nezbytná pro zamezení formování micel, které se vyskytují s těmito deriváty diazobarviva, poněvadž jsou mi cely zachyceny filtrem rovnoměrně za absence peptidu. K výše uvedenému roztoku se přidá 25 μΐ 0,36 mg/ml suspenze Αβ(10 - 43) v H₂O a 10% ethanol k upravení objemu na 950 μΐ. Po 10 minutové inkubaci při pokojové teplotě se přidá 50 μΐ [¹⁴C]chrysaminu G ve 40% ethanolu, čímž se získá konečná koncentrace 100- 125 nM [¹⁴C]chrysaminu G v závislosti na přípravě používaného [¹⁴C]chrysaminu G. Vazebná směs se inkubovala po dobu 30 min při pokojové teplotě. Vázaná a volná radioaktivita se separovala vakuovou filtrací přes Whatman GF/B filtry použitím Brandel M-24R Cell Harvesteru (Gaithersburg, MD) následované promytím 2 x 3 ml 10% ethanol při pokojové teplotě. Filtry byly před měřením přes noc ekvilibrovány ve »· ·· ftft r· »«· ··· • · ··< · · ··· • *· ··· ·· **· ·· · ···· >··· ···· ·· ·· «>* ·· ·· ftft ftft • · l ft ftft ml Cytoscint®-ES scintilátoru (ICN Biomedicals, lne., Irvine, CA) v 7 ml umělohmotné nádobky scintilátoru. V tomto a všech dalších stanoveních byly inkubace provedeny alespoň trojnásobně a výsledky vyjádřeny se střední kvadratickou odchylkou.

Kinetické studie

Studia kinetiky vazby [¹⁴C]chrysaminu G na Αβ(10 - 43) byly provedeny v 13 x 100 mm borokřemičitanových skleněných trubicích filtračním stanovením popsaným výše. Pro stanovení kinetiky asociace bylo 25 μΐ 0,36 mg/ml Αβ(10 - 43) umístněno do 475 μΐ 10% ethanolu a přidalo se v čase nula (počátek) 4,5 ml 125 nM [^I4C]chrysaminu G do roztoku. Směs se silně vortexovala a reakce při níž docházelo k vazbě se zastavila vakuovou filtrací přes Whatman GF/B filtry použitím Brandel M-24R Cell Harvesteru (gaithersburg, MD) následované promytím 2 x 3 ml 10% ethanolu při pokojové teplotě v časech 5, 10, 20, 30, 45, 60, 75, 135, 240 a 300 s< ; vázaná radioaktivita se stanovila tak, jak je uvedeno výše.

Pro stanovení kinetiky disociace bylo 25 μΐ 0,36 mg/ml Αβ(10 - 43) umístněno do 450 μΐ 10% ethanolu následované 25μ1 2,5 μΜ [¹⁴C]chrysaminu G ve 40% ethanolu. Tato směs se vortexovala a inkubovala po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Směs se zředila v čase nula (počátek) 4,5 ml 10 μΜ neradioaktivního chrysaminu G v 10% ethanolem, silně vortexovala a disociace se zastavila výše popsanou filtrací v časech 0,5, 1,5, 3, 5 a 15 min a vázaná radioaktivita se stanovila tak, jak je uvedeno výše.

Charakteristika specifické vazby na mozek zasažený Alzheimerovou nemocí

Vazba chrysaminu G na mozek zasažený AD a kontrolní mozek stejnorodých částí

Vzorky mozku z autopsie byly získány od Neuropathology Core of the Alzheimer s Disease Research Center of the University of Pittsburgh. Kontrolní vzorky byly definovány jako ty, které nesplňují neuropatologická kritéria pro AD (dostatečný počet NP nebo NFT) v souladu se standardy specifikovanými v publikované zprávě NIA konference. Khachaturian, Arch. Neurol. 42: 1097 (1985). Bylo studováno osm kontrolních vzorků mozku (stáří 58 75), jedenáct vzorků mozku zasažených AD (stáří 61 - 84) a dva vzorky mozku zasaženého Downovou chorobou (stáří 23 a 51), mezi kterými bylo šest mozků zasažených AD s vysokým počtem plátů (>20 neuritických plátů /x200 faktor zvětšení) a pět mozků zasažených AD s malým počtem plátů (<20 neuritických plátů /x200 faktor zvětšení). Dva kontrolní vzorky byly klinicky zasaženy demencí, nicméně neměly neuritické pláty nebo neurofibrilní zauzlení a obdržená diagnóza rozlišovací histologie na nepřítomnost demence („Dementia Lacking Distinctive Histology“) byla pozitivní. Knopman Dementia 4: 132 (1993). Jiný kontrolní vzorek měl demenci a olivopontocereberální atrofii. Další kontrolní vzorky neměly klinické nebo histologické příznaky neurologického onemocnění. Vzorky po autopsii byly okamžitě zmraženy -70°C a uchovány při této teplotě dokud nebyly homogenizovány. Počet neuritických plátů nebo neurofibrilních zauzlení byl počítán v částech pěti separovaných, ale sousedních, polích (x200 faktor zvětšení) mezi kortikálními vrstvami 2 a 4 v kortexu na uzlu horní a střední frontální brázdy(gyri) a horního temporálního isokortexu všech studovaných mozků. Bylo provedeno kvalitativní vyhodnocení přítomnosti amyloidové angiopatie v horním/středním frontálním kortexu. Byla použita Bielschowskyho metoda impregnace postříbřováním k identifikaci neuritických plátů nebo neurofibrilních zauzlení a k identifikaci cerebrální amyloidové angiopatie bylo použito značení kongočervení. Detaily tohoto postupu byly publikovány již dříve. Moossy et al.,Arch. Neurol. 45: 251 (1988). Vzorky používané pro vazbu CG na horní/střední frontální nebo horní temporální kortex byly podobné těm, které se po rozčlenění používaly pro počítání neuritických plátů a neurofibrilních zauzlení.

Přibližně 100 mg tkáně z uzlu horního a středního kortexu, horního temporálního kortexu, čelní oblasti, čela caudatu, dolního parietálního kortexu, okcipitálního kortexu nebo malého mozku byly homogenizovány tkáňovým homogenizérem značky Polytronem® (PT 10/35, Brinkman Instruments lne., Westbury, NY) po dobu 30 sekund při nastavení 6 v 10% ethanolu v koncentraci 10 - 20 mg mozku/ml. Ne všechny oblasti z každého mozku byly použitelné. Alikvotní části 25 - 150μ1 tkáně (asi 25 - 300μg proteinu metodou Lowryho a spol.,J. Biol., Chem. 193: 265 (1951)) byly inkubovány ve 12 x 75 mm borokřemičitanových skleněných trubicích při pokojové teplotě 10 - 750 nM [¹⁴C]CG (26,8 Ci/mol) v konečném objemu 1,0 ml 10%ethanolu po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Standardní podmínky pro studie poměru malého mozku vyžadovaly asi 150pg proteinu a 75 nM [¹⁴C]CG a pro korelační studie s neuritickými pláty, neurofibrilními zauzleními a amyloidovou angiopatií vyžadovaly asi 75 pg proteinu a 150 nM [¹⁴C]CG. Přítomnost ethanolu byla nezbytná pro zamezeni formování micel, které se vyskytují s těmito deriváty diazobarviva, poněvadž jsou micely zachyceny filtrem rovnoměrně za absence tkáně. Vázaná a volná radioaktivita se separovala vakuovou filtrací přes Whatman GF/B filtry použitím Brandel M-24R Cell Harvesteru (gaithersburg, MD) následované promytím 2 x 3 ml 10% ethanolu při pokojové teplotě. Filtry byly před měřením přes noc ekvilibrovány ve 4 ml Cytoscint®-ES scintilátoru (ICN Biomedicals, lne., Irvine, CA) v 7 ml umělohmotné nádobky scintilátoru. Nasycená (specifická) vazba byla definována jako úplná vazba, od které je odečtena reziduální (nenasycená) vazba, v přítomnosti 20μΜ neznačeného CG. Ve všech testech na vazebnost, pokud nebylo jinak specifikováno, byly inkubace provedeny alespoň trojnásobně a výsledky vyjádřeny jako střední kvadratická odchylka. Výsledky byly vyjádřeny buď v absolutních termínech fmol vázaného [^!4C]CG/pg proteinu v dané oblasti mozku nebo jako poměr fmol/jtg proteinu v dané oblasti mozku ku fmol/pg proteinu v mozečku stejného mozku.

Stanovení koncentrací na rozhraní oktanol/voda

Přibližně 75 μΜ roztoků chrysaminu G nebo jeho analog bylo připraveno v 5,0 ml 1oktanolu. Bylo přidáno 5 ml fyziologického roztoku tlumeného fosfátem (0,15 M NaCl, 5 nM fosforečnanu draselného, pH 7,4) a vrstvy se pořádně provortexovaly. Směs se pak centrifugovala při 1,000 g k usnadnění formování dvou Čistých fází. Vrstvy se separovaly použitím dělicí nálevky a 600 μΐ každé vrstvy se zředilo 400 μί ethanolu a pro chrysaminu G se změřila absorbance při 389 nm nebo pro každý analog se změřila λ„,_3Χ. Koncentrace se stanovily až po korekci molámích absorpčních rozdílů v obou rozpouštědlech a rozdělovacího koeficientu vyjádřeného jako koncentrace v oktanolové vrstvě dělená koncentrací ve vodné vrstvě. Experimenty se prováděly třikrát.

Zobrazení vazby chrysaminu G na depozita amyloidu v mozku zasaženého Alzheimerovou nemocí.

• o

Pro vizuální demonstrování vazby CG na tkáň byly značeny přilehlé 8 mikro. ti?ckh parafínové části mozku zasaženého AD masivními depozity cerebrovaskulárního amyloidu pomocí CG a kongočerveně metodou alkalické kongočeveně Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10: 355 (1962) nebo metoda Stokese a Trickeyho, J. Clin. Pathol. 26: 241 - 242 (1973). Při postupu značení pomocí CG, byl nahrazen CG kongočervení, nicméně ostatní zůstalo stejné. Mikroskopická sklíčka, na kterých se prováděla vizualizace, byly prozkoumány použitím fluorescin izotiokyznátu filtru (FITC).

• · ·· φφ φφ φφ «φ φφ φφ

Stanovení schopnosti sloučenin k prostoupení hematoencefalické bariéry mozku

Studie na myších. Samicím myší Swiss-Webster bylo injektováno do laterální konce žíly přibližně 0,03 gCi/g [¹⁴C]chrysaminu G v 0,9% roztoku NaCl. Myši byly utraceny cervikální dislokací v intervalech 15 min, 35 min, 1 hodina, 4 hodiny a 24 hodin po injektování. Karotická krev, mozek, játra a ledviny byly rychle odebrány, zváženy a homogenizovány v předestilované/deionizované H2O pomocí homogenizéru se zábrusovým sklem. Alikvóní část byla navážena do 18,0 ml umělohmotné scintilační nádobky (Beckamn Poly-Q-Vial) a počítána po přidání 10,0 ml scintilačního roilolíH (Cytoscint®-ES (ICN)) a přes noc ekvilibrována. Obsah [¹⁴C]chrysaminu G ve tkáních byl vyjádřen jako cpm/mg tkáně.

Experimenty, ve kterých byla radioaktivita extrahována z tkání, byly prováděny tak, jak je uvedeno výše, vyjma toho, že bylo injektováno 0,05 pCi/g [¹⁴C]chrysaminu G a myši byly utraceny v 60 minutě. Mozek a játra se pak odstranily a extrahovaly postupem podle Folcha. Folch etal.,J. Biol. Chem. 226'. 447 (1957). V obou tkáních byla extrahovaná radioaktivita obsažena (přes 95%) v organické vrstvě. Organická vrstva se odpařila do sucha, znovu suspednovala v minimální/množství 10% methanol/90% ACN a injektovala na sloupec silikagelu (Prep Nova Pak HR Silica, 7,8 x 300 mm, Waters, Milford, MA) a isokraticky eluovala stejným rozpouštědlem. Za těchto podmínek se radioaktivita eluovala na čele rozpouštědla, nicméně většina lipidů byla zadržena déle, vytvářejíc frakci eluující na čele rozpouštědla vhodnou pro nástřik na reverzní fázy systému sloupce C4 popsaného výše. Veškeré čelo rozpouštědlo se spojilo, vysušilo a resuspendovalo v 10% ACN/90% pufru fosforečnanu sodného (5 mM, pH 6) a byl proveden nástřik společně s pravým neradioaktivnim chrysaminem G na sloupec C4. Frakce chytané po jedné minutě se spojily a vypočetli po přidání 10 ml Cytoscin®-ES.

V dalším provedení se vynález vztahuje na farmaceutický přípravek a způsob prevence proti degeneraci buněk a toxicitě spojené s formováním fibril za určitých „s amyloidózou spojených“ stavů, takových jako Alzheimerova nemoc, Downova choroba a diabetes mellitus typu 2, dědičná cerebrální krvácivá amyloidóza (holandská), amyloid A(reaktivní), sekundární amyloidóza, familiální mediterranean horečka, familiální amyloidová nefropatie s kopřivkou a hluchotou (Muckle-wells Syndrome),), amyloid s lambda L-řetězecem nebo amyloid s kappa L-řetězecem (idiopatický, spojený s myelomou nebo s markoglobulinemií) A beta 2M (chronická hemodialýza), ATTR (familiální amyloidová polyneuropatie (portugalská, japonská, švédská)), familiální amyloidová • · • ·

4·· kardiomyopatie (dánská), izolovaný kardiální amyloid, (soustavná senilní amyloidóza), AIAPP nebo inzulom amylinu, atriální natriuretický faktor (izolovaný atriální amyloid), prekurzor kalcitoninu (medulární karcinom štítné žlázy), gelsolin (familiální amyloidóza(finská)), cystatin C (dědičná cerebrální hemoragie s amyloidózou (islandská)), AApo-A-I (familiální amyloidotická poneuropatie - Iowa), AApo-A-II (urychlená senescence u myší), amyloid přidružený s fibrinogenem ; a Asor nebo Pr P-27 (skrapie, Creutzfeld Jakobova choroba, Gertsmann-Straussler-Scheinker syndrom, bovinní spongiformní encefalitida) nebo v případě osob, které jsou homozygotní pro alelu apolipoproteinu E4.

Tento způsob se týká aplikování farmaceutického přípravku, který obsahuje chrysamin G nebo jeden z jeho výše uvedených derivátů, subjektu, který je podezřelý, že má či se nachází ve velkém riziku vyvolání takových stavů spojených s amyloidózou.

Protože určité diazosloučeniny by mohly být karcinogenní, zahrnují terapeutické sloučeniny předloženého vynálezu pouze netoxické, nekarcinogenní sloučeniny. To znamená, že předložený vynález omezuje problémy s potenciální karcinogenicitou tím, že používá pouze diazosloučeniny založené na 3,3',5,5'-tetramethylbenzidinu, který je dobře prostudovaná nemutagenní, nekarcinogenní náhrada za benzidin. Holland et al., Tetrahedron, 30: 3299 - 3302, (1974). De Serres and Ashby (eds.) Evaluation of Short - Term Testsfor Carcinogens, Eísevier North - Holland, 1981. 3,3',5,5-Tetramethylbenzidin byl používán jako náhrada za benzidin při syntézách azobarviv. Josephy and Weerasooriya, Chem. - Biol. Interactions, 1984: 375 - 382, (1984). Ashby etal., Carcinogenesis 3: 1277 - 1282, (1982). Vynálezci syntetizovali tetramethylanalog chrysaminu G (4,4'-bis(3-karboxy-4hydroxyfenylazo)-3,3',5,5'-tetramethylbifenyl) a ukázali, že se váže na syntetický Αβ (10 43) s konstantou K; 0,75 ± 0,09 μΜ, hodnota asi dvakrát taková než u chrysaminu G.

Jakýmkoliv potenciálním problémům s nižší biologickou použitelností se dá vyhnout použitím alkenylderivátů a alkylnylderivátů azosloučenin. Tyto sloučeniny nejsou substráty pro redukci bakteriálními nebo savčími azoreduktasami.

Vskutku, sloučeniny předloženého vynálezu určené pro terapeutické použití jsou výhodnější než stávající sloučeniny, protože obsahují bud’ nemutagenní, nekarcinogenní deriváty benzídinu nebo alkenyl nebo alkynyl chemickou vazbu, která se ve vnitřnostech nestává substrátem pro bakteriální azoreduktasy

Studie in vitro ukázaly, že neurotoxicita Αβ vyžaduje formování fibril a je inhibována kongočervení. Zvláště bylo ukázáno, že barvivo kongočerveň vázající se na fibrilu amyloidu • ·

··· · · · · ···· «· »9 · · ·· · · ·· inhibuje fibrilární neurotoxicitu Αβ inhibici formování fibril nebo vázáním se na předformované fibrily. Lorenzo etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 12243 - 12247 (1994). Ukázalo se také, že kongočerveň inhibuje toxicitu amylinu spojeného s cukrovkou na pankreatické ostrůvkové buňky, jiný typ fibril amyloidu. Lorenzo et al., supra. K nahlédnutí také Burgevin et al. NeuroReport 5: 2429 (1994); Pollack etal., J. Neurosci. Letters 184: 113 - 116 (1995); Pollack et al. Neuroscience Letters 197:211 (1995). Tyto údaje ukazují, že sloučeniny vázající amyloid, takové jako chrysamin G a jeho deriváty, které jsou podobné kongočerveni, ale které na rozdíl od kongočerveni vnikají do mozku dobře, by mohly být účinnými při prevenci degenerace buněk a toxicitě spojené s formováním fibril za stavů spojených s amyloidózou.

V příkladě 8 a obrázcích 12 a 13 je ukázáno, že chrysamin G má účinky velmi podobné těm, které byly dříve publikovány pro kongočerveň, což znamená, že má na dávce závislé, chránící účinky na krysí feochromocytom. Proto tyto in vitro stanoveni poskytují způsoby pro vybrané sloučeniny k použití ve farmaceutických přípravcích určených pro prevenci proti degeneraci buněk a toxicitě spojené s formováním fibril.

Sloučeniny, takové jako chrysamin G a jeho výše popsané deriváty, byly testovány na in vivo účinnost prevence proti formování fibril amyloidu nebo spojené degenerace buněk způsobem, ve kterém se měřilo formování distrofických neuritů, úbytek synapsí, formování neurofíbrilárních zauzlení a gliózy na zvířecím modelu, takovém jako „senilní zvířecí“ model pro cerebrální amyloidózu, Wisniewski etal., J. Neuropathol. &Exp. Neurol. 32: 566 (1973), myší familiální model mediterranean horečky (Neurochem., Inc. Kingston, Ontario, Canada) a transgenový myší model neuropatologie Alzheimerova typu, Games et al., Nátuře 373: 523 527 (1995). V modelu familiální mediterranean horečky se u zvířat rozvíjí soustavná amyloidóza. V in vivo stanoveních podle předloženého vynálezu jsou porovnávány léčené a neléčené seiální nekropsie u zvířat pomocí sloučenin předloženého vynálezu k určení hodnoty inhibice formování amyloidu. Na zvířecích modelech pro formování cerebrálního amyloidu, kromě následujícího formování amyloidu, je degenerace spojená s výskytem amyloidu měřená jako formování dystrofických neuritů, úbytek synapsí, formování neurofibrilních zauzlení a glióza, a posuzuje se také v následných pitvách zvířat ošetřovaných či neošetřovaných sloučeninami předloženého vynálezu. Podle předloženého vynálezu je farmaceutický přípravek obsahující chrysamin G nebo jeho deriváty aplikován subjektům, u kteiých se předpokládá, že se formuje amyloid nebo fibrily amyloidu, degenerace buněk a jejich toxicita. V rámci výhodného provedení je takovým subjektem lidský subjekt a zahrnuje • * • · · Λ ♦ · • · ·· • ·· ··· ·· *·· · · » ···· ···· · · · · «· ·· ·· ·· ·· ·· např. ty, kteří jsou ve vysokém riziku rozvinutí cerebrálního amyloidu, včetně starší nedementní populace a pacientů majících nemoci spojené s amyloidózou a diabetes mellitus typu 2. Termín „preventivní“ je zamýšlen tak, aby zahrnoval pozitivní vývoj u degenerace buněk a toxicity spojené s formováním fibril. „Pozitivním vývojem“ je míněna prevence proti těžším formám degenerace buněk a toxicity u pacientů, u kterých se již projevily příznaky toxicity, takové jako například demence.

Farmaceutické přípravky pro účely prevence proti degeneraci buněk a toxicitě spojené s formováním fibril u nemocí spojených s amyloidózou obsahují serumalbumin, chrysamin G nebo derivát chrysaminu G a fosfátový pufru obsahující NaCl. Jiné farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují vodné roztoky, netoxické excipienty, včetně solí, konzervační látky, pufry, apod. jako je popsáno např. v Remington s pharmaceutical Sciences, 15^Λ Ed., Easton: Mack Publishing Co., 1405 - 1412 a 1461 - 1487 (1975) a The national formulary XIV., 14^Λ Ed. Washington. American Pharmaceutical Association (1975) a The United States Pharmacopeia XVIII. 18^Ul Ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1995), obsahy knih jsou zde doplněny jako odkaz.

Příklady bezvodých rozpouštědel zahrnují propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje a jejich injektovatelné organické estery, takové jako ethyloleát. Vodné nosiče zahrnují vodu, alkoholové/vodné roztoky, fyziologické roztoky, parenterální přenašeče, takové jako chlorid sodný, fyziologickou dextrosu, atd. Intravenózní přenašeče zahrnují fluidní a výživné regenerátory. Konzervační látky zahrnují bakteriostatika, antioxidanty, chelatační činidla a inertní plyny. Přesné koncentrace a pH různých komponent farmaceutického přípravku jsou upravena podle zkušeností v tomto oboru. K nahlédnutí Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis For Therapeutics (7^& Ed.).

Podle předloženého vynálezu mohou být takové farmaceutické přípravky aplikovány perorálně ve formě tekuté nebo pevné nebo inj ektovány intravenózně nebo intramuskulárně ve formě suspenze nebo roztoku. Termínem „farmaceuticky účinné množství“ je míněno množství, které zabraňuje degeneraci buněk a toxicitě spojené s formováním fibril. Takové množství bude nezbytně různé v závislosti na věku, váze a stavu pacienta a může být upraveno obvyklými postupy podle dobře známých metod. V rámci jednoho provedení může být dávka v rozmezí 0,1 a 100 mg/kg na den nebo dělena na menší dávky, aby ji bylo možné aplikovat dvakrát až čtyřikrát denně. Takovýto režim může trvat dále podle denní potřeby pro • ftft ··· · · · * • ftftftft · ftftftft ft ·· * • ftft ftftft ftft ftftft ·· · • ftft · ft ·· · · ·· · • ft ftft ftft ·· ·· ·· život pacienta. Nebo jinak se může farmaceutický přípravek aplikovat intramuskulárně v dávkách od 0,1 do 100 mg/kg jednou za šest týdnů.

V dalším provedení se předložený vynález týká způsobu detekce depozit amyloidu při biopsii nebo v posmrtné tkáni. Způsob se týká inkubace tkáně fixované formalinem s roztokem výše popsané sloučeniny vzorce (I). Výhodně je roztok 25 - 100% ethanol(zbytek je voda) nasycený sloučeninou vzorce (I). Po inkubaci se sloučenina barví nebo značí depozit amyloidu v tkáni a tento zbarvený nebo značený depozit může být detegován nebo vizualizován jakýmikoliv standardními metodami. Takovými metodami jsou míněny mikroskopické techniky, takové jako mikroskopie pro pozorování v jasném poli, fluorescence, laserkonfokální nebo příčně polarizační mikroskopie.

V dalším provedení se vynález týká způsobu kvantifikace množství amyloidu při biopsii nebo v posmrtné tkáni. Tento způsob se týká inkubace značeného derivátu chrysaminu G, výhodně sloučenin vzorce (I), nebo jeho ve vodě rozpustných, netoxických solí, s homogenátem z biopsie nebo posmrtné tkáně. Tkáň se získá a homogenizuje způsoby používanými v tomto oboru. Výhodné značení je značení radioaktivním izotopem, ačkoliv jiná značení, taková jako enzymová, chemiluminiskující a imunofluoreskující sloučeniny jsou dobře známa u odborné veřejnosti. Výhodné je značit radioaktivním izotopem ¹²⁵1,¹⁴C nebo ³H, výhodně je značený substituent vzorce (I) alespoň jeden ze substituentů R¹ - R⁷, R¹⁰ - R⁴⁹. Tkáň obsahující depozita amyloidu se bude vázat na značené deriváty chrysaminu G. Vázaná tkáň se pak separuje od nevázané tkáně jakýmkoliv mechanismem známým odborné veřejnosti, takovým jako např. filtrací. Vázaná tkáň se pak může kvantifikovat jakýmkoliv způsobem známým odborné veřejnosti. Jednotky udávající tkáň vázanou na radioaktivním izotopem značený derivát chrysaminu G jsou pak převedeny na jednotky vyjádřené v mikrogramech amyloidu na 100 mg tkáně porovnáním se standardní křivkou generovanou známými množstvími při inkubaci amyloidu značeného radioaktivním izotopem.

V dalším provedení se předložený vynález vztahuje na způsob rozlišení mozku zasaženého Alzheimerovou nemocí od normálního mozku týkající se získání tkáně z (i) malého mozku a (ii) další oblasti stejného mozku, jiné než malý mozek, od zdravých subjektů a od subjektů podezřelých na Alzheimerovu nemoc. K nahlédnutí příklad 3. Takovéto tkáně se separují na stejnorodé části použitím způsobu dobře známých odborné veřejnosti a pak se inkubují radioaktivním izotopem značenými deriváty chrysaminu G. Množství tkáně, která se váže na radioaktivním izotopem značené deriváty, se pak vypočítá pro každý typ zvláště (např. pro tkáň malého mozku, nezískanou z malého mozku, zdravou, abnormální) a vypočítá se také poměr vazby tkáně malého mozku vůči tkáni, která není z malého mozku, to vše u ♦ · «· φ · ·· φφ φφ « · · φ · · · • φφφφ · · ··» · • · · φφφ φ φ φφφ φ φ · • · φ · φφφφ φφφφ φφ φφ φφ φ · φ* ·· tkání získaných od zdravých pacientů a od pacientů zasažených Alzheimerovou nemocí. Tyto obdržené poměry se pak porovnávají. Pokud je poměr obdržený při výpočtech pro mozek pacienta podezřelého na AD vyšší 90% poměrů obdržených od pacientů se zdravými mozek, signalizuje to pozitivní nález Alzheimerovy nemoci. Normální poměry mohou být obdrženy z výše získaných dat (tabulka 3) nebo mohou být znovu vypočítána při studiu podezřelé tkáně mozku.

Příklady provedení

Příklad 1

Syntéza chrysaminu G a jeho derivátů

Syntéza chrysaminu G

Syntéza chrysaminu G (jmenovitě 4,4'-bis(3-karboxy-4-hydroxyfenylazo)-bifenyl) vyžaduje následující reakční kroky. Tyto reakční kroky budou označeny termínem obecný postup při „syntéze chrysaminu G“. Benzidin*2HCl (28,9 mg, 0,11 mmol, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) se přidá do 1,5 ml 1:1 DMSO:destilované/deionizované H₂O v 50 ml baňce s kulatým dnem. Každý z reakčních kroků se prováděl při teplotě 0°C, pokud není jinak specifikováno. Přidá se 29 μΐ koncentrované HCI, čímž se po míchání stane roztok čirým. K roztoku benzidinu se přidá po kapkách 15,5 mg (0,22 mmol) NaNO₂ ve 300 μΐ 1:1 DMSO/H₂O, čímž se pH změní na hodnotu 2-3. Reakční směs se míchá po dobu 45 min a pak se tato směs tetraazo váného benzidinu přidává po kapkách v průběhu 10 minut do 24,8 mg (0,18 mmol) salicylanu metylnatého (Aldrich) rozpuštěného v 2,0 ml 100% DMSO obsahujícího suspenzi 250 mg/ml Na₂CO3 za udržení hodnoty pH na 10,5. Výsledná směs se míchá po dobu 1 hodiny při teplotě 0°C a pak při pokojové teplotě přes noc.

Po této době se hodnota pH upraví na asi 7 a směs se extrahuje chloroformem (3 x 50 ml). Spojené chloroformové extrakty se promyjí H₂O (3 x 50 ml) a po té vysuší, čímž se získá dimethylester chrysaminu G (jmenovitě 4,4'-bis(3-methoxykarbonyl-4-hydroxyfenylazo)bifenyl), který se dále purifikuje rekrystalizaci ze směsi chloroform/hexan. Ester se pak hydrolyzuje rozpouštěním v asi 100 ml 1:1 ethanol:H₂O obsahujících 4 ekvivalenty NaOH a refluxuje po dobu 3 hodin. Odpaření ethanolu následované lyofilizací H₂O se získá tetrasodná sůl chrysaminu G. Volná kyselina chrysaminu G se formuje rozpouštěním tetrasodné soli v H₂O, jedním promytím chloroformem k odstranění jakéhokoliv nehydrolyzovaného esteru, snížením pH na hodnotu asi 2 a extrakcí ethylacetátem (3 x 50 ml). Spojené ethylacetátové * 4 • · · * • 4 4 4· · · 4 · · 4 • 44 4 · · 44 444 «4 4

4444 4444 4 444 · 44 · · 4 4 44 4 4 extrakty se promyjí FfeOO x 50 ml) a vysuší. Jiným způsobem lze hydrolýzu provést rozpouštěním esteru v THF a přidáním 15-20 molárních ekvivalentů pevného terč. butoxidu draselného při pokojové teplotě a mícháním po dobu 15 minut. Po okyselení se volná kyselina extrahuje do ethylacetátu, který se po té odpařuje. Tetrasodná sůl se formuje přidáváním methoxidu sodného do suspenze volné kyseliny v ethanolu dokud se hodnota pH nezmění na přibližně 9,5.

Za těchto podmínek by neměl zbýt žádný salicylan metylnatý, kyseliny salicylová nebo benzidin, ale pouze malé množství monosubstituovaného produtku, 4-hydroxy-4 '~(3karboxy-4-hydroxyfenylazo)-bifenyl, při použití HPLC chromatografie s převráceným poměrem fází provedená izokratickou eluci na sloupci C4 (Vydac 214-TP510) mobilní fází pufr fosforečnanu sodného(5 mM, pH 6):acetonitril (ACN) 90:10. V tomto systému se izokratická eluce provádí po dobu 10 minut a po té se následujících 20 minut zvýší na 50% ACN při průtoku 3,5 ml/min. Eluent ze sloupce se sleduje při 290 a 365 nm detektorem diodového pole (Perkin Elmer 235C) s duální vlnovou délkou.

Struktura chrysaminu G a jeho derivátů byla potvrzena protonovou NMR při 500 MHz v DMSO-dó s TMS jako vnitřním standardem. Určení píků tetrasodné soli chrysaminu G se bylo následovně - zkratkou SA se míní protony na specifikovaných pozicích v kruhu kyseliny salicylové a zkratkou BZ se míní protony na benzidinové části SA-3, duplet J=8,73 Hz na 6,75 ppm; SA-4 dublet dubletu J=8,73 a 2,72 Hz na 7,82 ppm; BZ-2/6, dublet J=8,44 na 7,91 ppm; BZ-3/5, dublet J=8,44 Hz na 7,95 ppm; a SA-6, dublet J=2,72 Hz na 8,28 ppm. UV/viditelné spektrum ve 40% ehtanolu vykazovalo λ,„₃χ při 389 nm. Molární absorptivita chrysaminu G byla stanovena vypočtením koncentrace chrysaminu G porovnáním ploch píků s vnitřním standardem pomocí NMR a pak se ihned provedla UV/viditelné spektrum alikvótní části NMR vzorku zředěného ve 40% ethanolu. Molární absorptivita ve 40% ethanolu při 389 nm byla 5,5 x 10⁴ AU/(cm*M).

[¹⁴C]chrysamin G se syntetizuje modifikováním výše uvedeného postupu. Tetraazotizace benzdidinu se provádí podle výše uvedeného postupu vyjma rozpuštění v 100% H2O. Přidá se 50 μϊ 2,5 M Na₂CO₃ v H₂O do 50 pCi krystalické salicylové karboxy-kyseliny-¹⁴C (Sigma) 0,5 ml skleněné kónické nádoby. Do této kónické nádobky se přidá 60 μϊ směsi tetra-azotizovaného benzidinu, vortexuje se a uchová při teplotě 0°C po dobu 1 hodiny. Kvůli zabránění formování monosubstituovaného vedlejšího produkt benzidinu se do reakční směsi přidá 12,5 μϊ 250 mM neradioaktivní kyseliny salicylové (Sigma) ve 2,5 M Na2CO₃ a teplotě se udržuje při 0°C po dobu 1 hodiny. Nádoba se nechá • · • * to t to ·*« • ·· to ·<

to· ·· • to to« to· ·· • · « to · ♦ • toto* · to· · ·· ··· ·· · • to · · ·· · stát přes noc při pokojové teplotě. Celá směs se rozpustí v minimálním množství 35% ACN a nanese se na výše uvedený sloupec C4. Pík odpovídající standardu chrysaminu G se spojí a lyofilizuje. Specifická aktivita 26,8 Ci/mol se vypočítá stanovením absorbance při 389 nm a pak spočtením radioaktivity v alikvotní části stejného vzorku. [^I4C]chrysamin G se uchovává ve 40% ethanolu. Pokud se znovu nanese purifikovaný [¹⁴C]chrysamin G na sloupec C4 a provede se izokratická eluce s 21% ACN při průtoku 3,5 ml/min, tak více než 98% radioaktivity paralelně eluuje s pra\ým chrysaminem G v 10,4 minutě. Mnoho derivátů chrysaminu G se syntetizuje použitím tohoto obecného postupu „syntézy chrysaminu G“ kromě výjimek uvedených níže. Struktury derivátů se ověřují NMR: Na obrázku 1 je ukázána chemická struktura chrysaminu G a několika jeho derivátů.

[³H]chrysamin G nebo jiné deriváty [³H]chrysaminu G, takové jako 4,4'-bis(3karboxy-4-hydroxa-5-fenylfenylazo)-3,3'-[³H]bifeyl, se syntetizují za použití 3,3[³H]benzidinu. 3,3'-[³H]benzidin (specifická aktivita 50 Ci/mmol) byl zakázkově syntetizován v American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, MO) expozicí 3,3'diiodobenzidinu (níže) velkému přebytku plynného tritia s vysoce specifickou aktivitou za přítomnosti jakéhokoliv z několika katalyzátorů hojně používaných v praxi a přebytku N,Ndi-isopropyl-ethylaminu ke spotřebování generované kyseliny při redukci. Po odstranění nestálého tritia se použije preparativní TLC k separování 3,3 '-[³H]benzidinu z malého množství neúplně redukované monojodbenzidinové nečistoty. Specificky se nechá 11 mmol

3,3 '-[³H]benzidinu v 562 μΐ 0,01 N HCl míchaného ve skleněné nádobce a za chlazení ledem reagovat v jednominutových intervalech s pěti díly 2,2 pmol NaNO₂ v 5 μΐ H₂O. Po poslední dávce se přidá 22 pmol 3-fenylsalicylové kyseliny (TCI) ve 250 μΐ 2,5 M Na₂CC>3 a led se odstraní. Po 5 minutách se přidá 50 μΐ 5 N HCl a následně 887 μΐ ethanolu. Purifikace 4,4 bis(3-karboxy-4-hydroxy-5-fenylfenylazo)-3,3'-[³H]bifenylu se provádí HPLC chromatografií s převráceným poměrem fází (izokratickou eluci) na sloupci C4 (Vydac 214TP510) mobilní fází - pufr fosforečnanu sodného(5 mM, ρΗ(γ): ethanol (2,0 ml/min; 40 50% ethanol po dobu 10 minut s konkávním gradientem, po té 50% po dobu 15 minut). Produkt paralelně eluuje s pravým vzorkem.

Syntéza 3-isopropylsalicylového derivátu chrysaminu G

4,4'-bis(3-karboxy-4-hydroxy-5-isopropylfenylazo)-3-jodbifenyl se syntetizuje nahrazením 3-brombenzidinu (níže) za benzidin a 3-isopropylsalicylanu methylnatého za «4 44

4 4

4 444 ·· • 4 4

4 4·«

4 4 4

4 4 ·

4«

4 4 · • 4 44

44

4 4 4 • 4 4 4

44 salicylan methylnatý ve výše uvedené syntéze chrysaminu G. Takto získaný bromderivát se konvertuje na trialkylcín a po té na jodderivát postupy uvedenými níže.

Syntéza 3-fenyl-, 3-(2-fenylethen)- a 3-(2-fenylethyl)-salicylového derivátu chrysaminu G

4,4'-bis(3-karboxy-4-hydroxy-5-fenylfenylazo)-3-jodbifenyl se syntetizuje nahrazením 3-brombenzidinu (níže) za benzidin a 3-fenylsalicylanu methylnatého (vyroben esterifíkací 3-fenylsalicylové kyseliny (TCI America, Portland, OR)) za salicylan methylnatý ve výše uvedené syntéze chrysaminu G. Takto získaný bromderivát se konvertuje na trialkylcín a po té na jodderivát postupy uvedenými níže. Jiné deriváty využívající benzidin nebo další benzidiny popsané níže se připraví nahrazením příslušného derivátu benzidinu.

4,4 -bis(3-karboxy-4-hydroxy-5-(2-fenylethen)-(fenylazo)-3-jodbifenyl se připraví výše uvedeným postupem použitím 3-(2-fenylethen)-salicylanu methylnatého místo salicylanu methylnatého. 3-(2-fenylethen)-salicylan se syntetizuje kuplováním diethylbenzylfosforitanu (Aldrich) na 3-formylsalicylovou kyselinu (Aldrich) postupy popsanými níže pro syntézu vinylderivátů(OC) chrysaminu G.

4,4 '-bis(3-karboxy-4-hydroxy-5-(2-fenylethyl)-(fenylazo)-3-jodbifenyl se připraví výše uvedeným postupem použitím 3-(2-fenylethyl)-salicylanu methylnatého místo salicylanu methylnatého. 3-(2-fenylethyl)-salicylan se syntetizuje redukcí 3-(2-fenylethen)-salicylanu vodíkem na aktivním uhlí při použití palladia nebo platiny jako katalyzátoru.

Syntéza vinylderivátů (C=C) chrysaminu G

4,4'-bifenyldikarboxylová kyselina (Aldrich) se konvertuje redukci s L1AIH4 na 4,4 bis(hydroxymethyl)bifenyl, který konvertuje na 4,4 -bis(jodmethyl)bifenyl redukcí s Nai a BF₃-etherátem v ACN. Sloučenina jodu se zahřívá při teplotě 90°C po dobu 1 hodiny s přebytkem triethylfosfitu k získání tetraethyl-(4,4'-bifenyldimethylfosforitanu). Podobná reakce 1,4-naftalen-dikarboxylové kyseliny (Aldrich) nebo 9,10-anthracen-dikarboxylové kyseliny (Aldrich) poskytne tetraethyl-fosforitany. Po rekrystalizací z hexanu se fosforita rozpustí v DMF a nechá se reagovat s desetinásobným přebytkem methoxidu sodného následované 2 ekvivalenty 5-formylsalicylové kyseliny v DMF. Po 24 hodinovém míchání při pokojové teplotě se reakční směs nalije do vody. OkyseKní vody pomocí HCI na hodnotu pH 5,0 zapříčiní precipitaci fluorescenčního produktu, 4,4'-bis(3-karboxy-4hydroxyfenylethenyl)-bifenyl, který se může selektivně extrahovat do ethylacetátu

00 « 0 0

0 000

9· ·

9 9 · • 9 ··

9 90

0 0 φ 9 0 90 • 0 0 · • 9 0 * ♦ ♦ 0·

9 9

9 9

9 9

9 9 • 9 z jakéhokoliv monosubstituovaného vedlejšího produktu. Podobná reakce tetraethyl-(pxylylendifosforitanu)(TCI America) s 5-formylsalicylovou kyselinou nebo jejími deriváty se získá l,4-bis(3-karboxy-4-hydroxyfenylethenyl)benzen. Podobnou reakcí diethylbenzylfosforitanu (Aldrich) s 3-formylsalicylovou kyselinou se získá 3-(2-fenylethen)salicylová kyselina. Podobně l,4-bis(3-karboxy-4-hydroxyfenylethenyl)-naftalen nebo 9,10bis(3-karboxy-4-hydroxyfenylethenyl)anthracen se obdrží reakcí příslušného fosforitanu s 5formylsalicylovou kyselinou. Další deriváty se obdrží použitím jiných vyhovujících derivátů formylsalicylové kyseliny, formylbenzoových kyselin nebo hydroxybenzaldehydů nebo methoxybenzaldehydů.

Syntéza amidderivátů chrysaminu G

4,4'-bifenyldikarboxy lová kyselina (Aldrich) se konvertuje na chlorid se přebytkem thionylchloridu v DMF. Po odstranění zbývajícího thionylchloridu na rotační odparce se tento chlorid kyseliny přidá do roztoku dvou ekvivalentů 5-aminosalicylové kyseliny a triethylaminu. 4,4'-bis(3-karboxy-4-hydroxyfenylamido)-bifenyl precipituje po nalití roztoku DMF do zředěné HCI.

kysíiny reakcí

Syntéza iminderivátů (CH=N) chrysaminu G

4,4'-bifenyldikarboxylová kyselina (Aldrich) se konvertuje redukcí s LiAlFL» na 4,4'bis(hydroxymethyl)bifenyl, který se konvertuje na 4,4'-bifenyldikarboxaldehyd reakcí s BaMnO₄ v ethylacetátu. Dialdehyd se rozpustí v DMF a nechá se reagovat s 5aminosalicylovou kyselinou rozpuštěnou v DMF. Výsledná suspenze Schiffovy báze se přidá do deseti dílů vody a extrahuje do ethylacetátu k získání požadovaného produktu. Nebo jinak se může 3-formylsalicylová kyselina nebo 5-formylsalicylová kyselina kuplovat analogický způsobem, aby se substituovala nebo nesubstituovala benzidinová analoga.

Syntéza aminderivátů chrysaminu G

Suspenze Schiffovy báze v DMF popsaná výše se nechá reagovat s přebytkem NaBH₄ rozpuštěným v ethanolu a pak se refluxuje po dobu 1 hodiny. Výsledný sekundární amin se izoluje neutralizací přebytku NaBH₄ pomocí HCI, nalitím roztoku do deseti dílů vody a extrahováním do ethylacetátu.

• φ φ φφφ φφ φ » φ φ φφφφ φφφφ φφφφ φφ φφ φφ ·Φ

Φ· φφ Φ Φ * 1 • φ φ <

φ φ φ * • Φ φ 1

Syntéza hydrazoderivátů (ΝΗ-ΝΗ) chrysaminu G

Chrysamin G a jiné azosloučeniny se rozpustí v ethanolu a nechají se reagovat se 2 ekvivalenty PdCl₂ a 10 ekvivalenty NaBELt při pokojové teplotě. Roztok rychle ztrácí svoji barvu. Ethanolová suspenze se filtruje k odstranění redukovaného palladia, nalije se do zředěné HCI a extrahuje do ethylacetátu.

Syntéza hydrazonderivátů (NH-N=C)

Obecně se hydrazony připravují reakcí 4,4'-dihydrazinobifenylu s vhodným ketonem nebo reakcí substituovaných nebo nesubstituovaných derivátů tetra-azovaného benzidinu se sloučeninami s aktivním vodíkem. Následuje specifický příklad novější metody. Benzidin se tetra-azotizuje stejným postupem použitím pro syntézu chrysaminu G. Tento tetra-azovaný roztok se přidá do roztoku 2 ekvivalentů 4-hydroxy-5-methyl-4-cyklopenten-l,3-dionu (Aldrich) rozpuštěného v DMSO obsahujícím 250 mg/ml Na₂CO₂ v suspenzi, za udržení hodnoty pH na asi 10,5. Výsledná směs se míchá po dobu 1 hodiny při teplotě 0°C a pak přes noc při pokojové teplotě. Hydrazon se obdrží rozředěním reakční směsi do deseti dílů vody, okyselením HCI a extrakcí do ethylacetátu.

Syntéza pyridinderivátů a diazinderivátů chrysaminu G 4,4'-bis(5-karboxy-6-hydroxy-3-pyridylazo)-3-jodbifenyl a příslušné deriváty hydroxypyridinkarboxylové kyseliny nebo hydroxydiazinkarboxylové kyseliny chrysaminu G se syntetizuje nahrazením 3-brombenzidinu (níže) za benzidin a 2-hydroxynikotinové kyseliny(nebo pro příslušné deriváty 6-hydroxynikotinová kyselina, 3-hydroxypikolinová kyselina, hydroxydiazinkarboxylové kyseliny, jako 4-hydroxypyrimidin-6-karboxylová kyselina) za salicylan methylnatý ve výše popsané syntéze chrysaminu G. Takto získaný brom derivát se přeměňuje na trialkylcín a po té na jododerivát, postupy uvedenými níže.

Syntéza naftalenderivátů, chinoliderivátů a benzodiazinderivátů chrysaminu G) 4,4 -bis(3-karboxy-4-hydroxy-naftylazo)-3-jobifenyl a příslušné deriváty hydroxynaftoové, hydroxychinolinkarboxylové nebo hydroxybenzodiazinkarboxylové ·* φφ • · φ φ φφφφ φ φ φ φ φφ φφ «φ φφ • φ φ φ φφφφ φ φ φ φ • φ φ φ φφ φφ φφ φφ * φ φ * φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ kyseliny chrysaminu G se syntetizují nahrazením 3-brombenzidinu (níže) za benzidin a 1hydroxy-2-naftoové kyseliny (nebo za příslušné deriváty jiné izomery hydroxynaftoových kyselin, takové jako kyselina kynurenová nebo hydroxybenzodiazinkarboxylové kyseliny, takové jako 5-hydroxachinoxalin-6-karboxylová kyselina) za salicylan methylnatý ve výše popsané syntéze chrysaminu G. Takto získaný bromderivát se konvertuje na trialkylcín a po té na jodderivát postupy uvedenými níže.

Syntéza nitrofenolderivátů chrysaminu G

4,4'-bis(3-nitro-4-hydroxy-fenylazo)-3-jodbifenyl a příslušné nitrofenolderiváty chrysaminu G se syntetizují nahrazením 3-brombenzidinu (níže) za benzidin a 2-nitrofenolu (nebo jiné izomery nitrofenolu za příslušné deriváty) za salicylan methylnatý ve výše popsané syntéze chrysaminu G. Takto získaný bromderivát se konvertuje na trialkylcín a po té na jodderivát postupy uvedenými níže.

Alternativní způsoby syntézy diazosloučenin

Jako alternativní způsob formování azosloučenin, nitroso sloučenin je kuplování na aminy v kyselině ledové octové podle Millsovy reakce. Badger, G. et al., Aust. J Chem. 17: 1036 (1964). Nitroso sloučeniny se dají připravit způsobem podle Colemana a spol., Organic Synthesis Collective Vol. III: 688. Například 3-nitrobenzoová kyselina (Aldrich Chem. Co., Milwaukee, WI) (2,44 mmol) a roztok 150 mg NH4CI v 5 ml vody se spojí v 50 ml baňce s kulatým dnem a silně se míchají. Přidává se po dobu 5 minut v malých dávkách ráškový zinek (372 mg). Po přidání veškerého zinku začne teplota mírně vzrůstat, nicméně je udržována mezi 50 a 55°C za použití ledové lázně. Směs se míchá při této teplotě po dobu 20 mint a pak se zbytky zinku filtrují a promyjí vařící vodou. Spojené filtráty a výplachy se v kádince zchladí na teplotu 0°C přidáním ledu. Do této ledové směsi se za stálého míchání přidají hydroxylamin, studený roztok kyseliny sírové (750 pl koncentrované kyseliny plus dostatek ledu k ochlazení na teplotu -5°C). Do ledem zchlazeného roztoku se naráz přidá 170 mg dihydrátu dvojchromanu sodného v 750 pl vody. Takto získaná 3-nitrosobenzoová kyselina se spojí s jednou polovičkou ekvivalentu benzidinu, 2,7-diaminofluorenu nebo jiného derivátu benzidinu v kyselině ledové octové a zahřívá se na teplotu 70°C - 80°C po dobu 7 hodin a po té se může nechat stát přes noc pří pokojové teplotě. Směs se zředí vodou a extrahuje ethylacetátem, čímž se získá 4,4'- bis(3-karboxy-fenylazo)-bifenyl), 2,7-bis(3-karboxy• 4 4

4 444 ·♦ ·» • * * • · 4 44 • · · 4 • 4 · 4 ·· 44

4 4 4

44 « 4 4

4 4 ♦

4 4 ·

4 4 4

44 fenylazo)-fluoren nebo odpovídající derivát bis(3-karboxy-fenylazo) jednotlivých použitých derivátů benzidinu.

Syntéza methoxyderivátů

Methoxyderiváty všech fenolových sloučenin se syntetizují následujícím postupem. Do jednoho ekvivalentu fenolesterderivátu chrysaminu G rozpuštěného v acetonu přibližné koncentrace 5 mg/ml se přidá 10 ekvivalentů methyljodidu (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) a 10 ekvivalentů K2CO3. Suspenze se refluxuje po dobu 6-24 hodin, vysuší se na rotační vakuové odparce a extrahuje chloroformem. Ester se hydrolyzuje přidáním 1:1 THF/0,1 N NaOH na koncentraci přibližně 1 mg/ml a míchá při pokojové teplotě po dobu 24 -72 hodin. Nezhydrolyzovaný methoxyester se odstraní extrakcí chloroformem, hodnota pH se upraví na asi 2 a methoxy kyselina se extrahuje ethylacetátu.

Syntéza substituovaných derivátů benzidinu

Pro sloučeniny substituovaného benzidinu se postupuje podle výše popsaného obecného postupu syntézy chrysaminu G vyjma toho, že 3,3'-dichlorbenzidin (Pfaltz &

Bauer, Waterbury, CT), 4,4'-diaminoktafluorbifenyl, 3,3 ',5,5'-tetramethylbenzidin (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI), 3,3 '-dimethylbenzidin (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI), 3,3 -dimethoxybenzidin (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI), benzidin-3,3 '-dikarboxylová kyselina (Pfaltz & Bauer, Waterbury, CT) nebo její nižší alkylestery nebo 3,3 -dinitrobenzidin (Fluka Chemical Corp., Ronkonkoma, NY) se použijí místo nesubstituovaného benzidinu. Další substituované benzidiny včetně, ale není to nikterak limitováno, těch uvedených níže se syntetizují citovanými způsoby a také mohou být používány místo nesubstituovaného benzidinu: 3,3 - dibrombenzidin a 3,3 - dijodbenzidin (Snyder, H. et al., J. Am. Chem. Soc. 71: 289- 291, 1949); 3-brombenzidin a 3-jodbenzidin (Badger, G. etal.,Aust. J. Chem. 17: 1036 - 1049, 1964; Holland, V. etal., Tetrahedron 30: 3299-3302, 1974).

Syntéza derivátů fenantracenu, benzo(c)cinnolinu, fluorenu, fluorenonu, karbazolu, dibenzofuranu, dibenzothiofenu a dibenzothiofen-9,9-dioxidu • ft ftft • ftft ft · ftftft ft* ftft • ♦ * • ftftftft • ftft · ft ftft ft ftft ftft ft ftft · • ft ftft • ft ftft • ftft ft • ftft ft • ftft · • ft ftft

Fluoren-(2,2'-methylenbifenyl)-deriváty chrysaminu G se syntetizují nahrazením 2,7diamino-fluorenu (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) za benzidin v postupu tetraazotizace a pak se kuplují podle stejných postupů používaných pro tetra-azovaný benzidin. Podobně 2,7-diaminofenanthracen, 2,7-diamino-3,6-dimethylbenzo[c]cinnolin, 2,7dimanofluorenon, 9-methyl-2,7-diaminokarbazol, 3,7-diaminodibenzofuran (na rozdíl od zbytku těchto polycyklických sloučenin přiřazuje konvenční systém číslování atomu kyslíku dibenzoíuranů 5-pozice místo 9-pozice, proto aminosubstituenty jsou na 3,7-pozicích spíše než na 2,7-pozicích jako i na dalších sloučeninách, i kdyby byly pozice prostorově ekvivalentní), 2,7-diaminodibenzothifen a 2,7-diaminodibenzothiofen-9-dioxid („benzidinsulfon“) se nahradí za benzidin ve standardní postupu tetra-azování a kuplování. Pokud je požadován nesubstituovaný karbazol mohou být sloučeniny 9-methyl-2,7diaminokarbazolu N-demethylovány. 2,7-Diaminofenanthracen se syntetizuje redukcí 2,7dinitrofenanthracenu připraveného z 2-amino3 ',5-dinitro-c/s-stilbenu metodou podle UllmannaaMalletaBer. 31:1694-1696, 1898 aNunna, A. et. al.,J. Chem. Soc. 1952: 27972803. 2,7-Diamino-3,6dimethylbenzo[c]cinnolin se připraví oxidací NaOBr korespondující hydrazosloučeniny formované via redukci 3,3 -dimethyl-6,6'-dinitrobenzidinu (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) se zinkem ve vodném NaOH metodou podle Snydera a spol.,J. Amer. Chem. Soc. 71: 289 (1949). Jiným způsobem je možno 3,3-dimethyl6,6'dinitrobenzidin místo benzidinu nejprve tetra-azovat a kuplovat a po té nechat reagovat s Zn/NaOH a NaOBr, jak je výše uvedeno. 2,7-Diaminofluoren se syntetizuje redukcí 2,7dinitrofluorenonu připraveného z 2-amino-3 ',5-dinitrobenzofenonu metodou podle Ullmanna a Malleta Ber. 31:1694 - 1696, 1898 a Nunna, A. et. al., J. Chem. Soc. 1952: 2797 - 2803. 9Methyl-2,7-diaminokarbazol se syntetizuje redukcí 9-methyl-2,7-dinitrokarbazolu připraveného N-methylací 2,7-dinitrokarbazolu připraveného z 2-amino-3 ',5dinitrodifenylaminu, jak je popsáno v Saunders, K.H. and Allen, R.L.M. Aromatic Diazo Compounds 625 - 640 (Edward Arnold, London, 1985), veškerý obsah je zde uveden jako odkaz. 3,7-Diaminodibenzofuran se syntetizuje redukcí 3,7-dinitrodibenzofuranu připraveného z 2-amino3 ',5-dinitrodifenyletheru, jak je uvedeno v Saunders, K.H. and Allen, R.L.M. Aromatic Diazo Compounds 625 - 640 (Edward Arnold, London, 1985), veškerý obsah je zde uveden jako odkaz. 2,7-Diaminodibenzothiofen a 2,7-diaminodibenzothiofen9,9-dioxid se připraví metodami podle Courtota a Evaina, Bull. Soc. Chim. 49(iv): 528, 1931 a Cullinanea a Daviesa, Rec. Trav. Chim. 55: 881 - 886 (1936).

• ft ftft • ·· • · · ftft ft ftft » • ftft · • ft ftft • A ftft ft *· • ftftftft ft ·· · • ft ·· • ft ftft • « ft · • ftft · • ftft ft ft ftft « • · ftft

Syntéza alkynylderivátů (C=C) chrysaminu G

5-Jodsalicylová kyselina (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) se konvertuje na methylester reakcí s methanolem, methyl-orthoformiátem a kyselinou sírovou. Takto obdržený methylester 5-jodsalicylové kyseliny se nechá reagovat s (trimethylsilyl)acetylenem (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) za přítomnosti palladia. Trimethylsilylová skupina se odstraní a 2 ekvivalenty výsledného methylesteru 5-acetylenylsalicylové kyseliny se nechají reagovat s4,4'-dibrombifenylem (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) za přítomnosti výše uvedeného palladia. Výsledný alkynylanalog chrysaminu G, 4,4 -bis(3methoxykarbonyl-4-hydroxyfenylacethylenyl)-bifenyl, se připraví hydrolýzou esteru, jak je popsáno výše. Tento alkynylanalog se redukuje konvenčními metodami za vzniku vinylanalogu chrysaminu G.

Syntéza derivátu dijodsalicylové kyseliny chrysaminu G

Derivátu dijodsalicylové kyseliny chrysaminu G, 4,4'-bis(3-karboxy-4-hydroxy-5jodfenylazo)-bifenyl, se syntetizuje jodací 5-jodsalicylové kyseliny (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) na 3-pozici následovanou selektivní dejodací na 5-pozici. Po formování methylesteru a rekrystalizaci se světle hnědý voskovitý 3-jodderivát nahradí ve výše popsaném postupu syntézy chrysaminu G za salicylan methylnatý. Požadovaný produkt se separuje eluci na sloupci silikagelu mobilní fází (75% CHCl₃/25% hexan). Ester se pak hydrolyzuje rozpuštěním v 1:1 ehtanolu:H₂O obsahujícím 4 ekvivalenty NaOH a refluxuje se po dobu 3 hodin.

Syntéza difluoroderivátu chrysaminu G

5-Fluoroderivát, 4,4'-bis(2-hydroxy-3-karboxy-5-fluorfenylazo)-bifenyl, se syntetizuje nahrazením 5-fluorsalicylové kyseliny (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) za salicylovou kyselinu. [¹⁸F]arylfluoridderiváty chrysaminu G mohou být připraveny substitucí prekurzorů značených ¹⁸F, takových jako [¹⁸F]LiBF4, v Schiemannově reakci, via rozložení triazenu s Cs[¹⁸F] nebo via nukleofilní substituci ¹⁸F za X, kde X = tosyl, triflát, NO2, ⁺N(CH3)₃ nebo halogen. K nahlédnutí Fowler, J. and Wolf A., Positron Emission Tomography and Autoradiography (Phelps, M., Mazziota, T, and Schelbert, H. eds.) 391 450 (Raven Press, NY, 1986) and Kilbourn, M. Fluorine-18 labeling of radiopharmaceuticals.

(Nati. Acad. Press, Washington, D.C.) (1990).

·« 49 44 49 94 94 • * · · » ♦ ♦ * · · • « · »« · · ··· · · · ·

4 4 4 4 9 4 9 9 9 4 4 9 ·

4 4 4 4 9 4 4 4 9 4 4

99 44 94 44 44

Syntéza aromatického fluoralkylderívátů a fluoralkoxyderivátů

Aromatické fluoralkylderiváty se syntetizují použitím metody podle Bishop a spol.,J.

Med. Chem. 34: 1612 (1991), ve kterých Claisenova kondenzace příslušného O-allyletherů formuje aromatický aílylderivát, který může být dále funkcionalizován k získání fluorethylderivátů nebo fluorpropylderivátů. Jiným způsobem je možno aromatický jodid snadno konvertovat na aromatický alkyn v délce od 2 do 5 atomů uhlíku použitím kuplování za přítomnosti palladia metodikou podle Sonogashira etal., Tetrahedron Letters 4467 - 4470 (1975). Následující derivatizace alkynu poskytne fluoralkylderivát. Fluoralkoxyderiváty mohou být připraveny metodou Chumpradita et al., J. Med. Chem. 36: 21 (1993), ve které poskytne alkylace příslušného fenolu s příslušným l-brom(nebo jod nebo sulfonyloxy)omegaflualkanem korespondující fluoralkoxyderivát.

Radiofluorace aromatických alkylsulfonyloxyderivátů a alkoxysulfonyloxyderivátů Radiofluorace k získání aromatických alkylsulfonyloxyderivátů a alkoxysulfonyloxyderivátů se provádí metodou Mathis et al., Nucl. Med. Biol. 19: 571 (1992), ve které se aromatické alkylderiváty nebo alkoxysulfonyloxyderiváty(jmenovitě alkoxytosyláty) substitují [¹⁸F]ťluoridem k získání aromatických sloučenin [¹⁸F]fluoralkylu a [¹⁸F]fluoralkoxylu.

Radiojodace a radiobromace derivátů chrysaminu G způsobem pomocí trialkylcínu

Syntéza trialkylcínderivátů chrysaminu G

Obecná struktura trialkylcínderivátů chrysaminu G je uvedena ve obrázku 2B. Obecně se bude trialkylcínová skupina substituovat na 3-pozici na jedné straně bifenylové části, ale druhá pozice včetně salicylové kyseliny nebo heterocyklické části, které také zůstávají potenciálním cílem. Tyto trialkylcínderiváty jsou stabilní přímé prekurzory pro přípravu radiojodovaných a radiobromovaných sloučenin k používání u lidských subjektů. Přesněji it ·* · · • · ··· • · 4 · · • · · · ·· ·· • · ♦ * · 4 · • 4 «4· 4 · · · • · · 4 4 · » · 4 »999 4 4 4 4 • 4 44 ·♦ *· řečeno jsou tyto trialkylcínderiváty používány k připravení halogenovaných radioaktivních sloučenin aplikovatelných pro použití při in vivo zobrazení amyloidu.

Obecné postupy syntézy trialkylcínderivátů

Trialkylcínderiváty se připraví z příslušných arylhalogenidů, [(θ6Η₅)₃Ρ]₃Ρά(0), a hexaalkyltidinů pomocí výše uvedených postupů včetně Kosugi, M., et al., Chem. Lett. 1981: 829; Heck, R. Pure and Appl. Chem. 1978: 691; Echavarren, A. and Stille, J. J. Am. Chem. Soc. 1987: 5478; Mithcell, T. J. Organometallic Chem. 1986: 1; and Stille, J. Pure and Applied Chem. 1985: 1771. Tyto deriváty se také mohou získat použitím η-BuLi a trialkylcínchloridu v postupu podle Mathise et al., J. Labell. Comp. and Radiopharm. 1994:905.

Syntéza3-trialkylcínderivátů4,4'-bis(3-methoxykarbonyl-4-hydroxyfenylazo)bifenylu

3-Brom-4,4 '-bis(3-methoxykarbonyl-4-hydroxyfenylazo)-bifenyl nebo 3-jod-4,4 bis(3-methoxykarbonyl-4-hydroxyfenylazo)-bifenyl nebo jejich dimethylethery se připraví syntézou 3-brombenzidinu nebo 3-jodbenzidinu (výše), tetra-azováním a kuplováním na salicylan methylnatý, pokud jde o syntézu chrysaminu G, a methylací fenolu, jak je popsáno výše v bodě, kde požadována methoxy sloučenina. Pod atmosférou argonu se zahřívají 1 mmol fenolického esteru nebo methoxyesteru, [(C6H5)₃P]₃Pd(0) (0,1 až 0,2 mmol), hexabutylditin nebo hexamethylditin (1,25 mmol) a dioxan (25 ml) při teplotě 70°C po dobu 16 hodin. Reakční směs se ochladí a rozpouštědlo se odpaří. Trialkylcínhalogenid se odstraní vodným KF. Organické vrstvy se extrahují ethylacetátem, suší nad MgSO₄, filtrují a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se purifikuje na sloupci silikagelu k získání

3-alkyltrialkylcín-4,4'-bis(3-methoxykarbonyl-4-hydroxyfenylazo)-bifenyl.

Radiojodace a radiobromace trialkylcínderivátů

Tributylcínderiváty nebo trimethylcínderiváty se radiojodují Na[¹²⁵I] nebo Na[¹²³I] nebo radiobromují Na[⁷⁵Br] nebo Na[⁷⁶Br] podle publikovaných prostupů, takových jako Mathis et al.,J. Labell. Comp. and Radiopharm. 1994: 905; Chumpradit et al., J. Med. Chem.

·· ΦΦ

ΦΦ ·♦ • · · • · ··· • · · · • · · ·

ΦΦ φ* • φ φ ΦΦΦ φ φ φ φ φ φ

ΦΦ ΦΦ

ΦΦ ΦΦ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ

ΦΦ ΦΦ φ

φ •

φ

34: 877 (1991); Zhuang et al., J. Med Chem. 37: 4245 (1994); Chumpradit et al., J. Med. Chem. 37: 4245 (1994). Podle obecného postupu se 0,5 mg sloučeniny trialkylcínu, 0,2 ml bezvodého acetonitrilu, 10 μϊ 2M H3PO4, 2 - 100 μΐ roztoku o vysoké specifické aktivitě(>2000 Ci/mmol) Na[¹²⁵I] nebo Na[¹²³I](nebo Na[⁷⁵Br] nebo Na[⁷⁶Brj) v NaOH s pH 9 - 12 a dichloramin-T (DCT) (20 μϊ 2,5 mg/ml DCT v acetonitrilu) umístní do 1 ml reakční nádobky. Reakce se sleduje pomocí HPLC a po 30 min se zřJíjt-50 μϊ 2M Na2S2O₃. Produkt se purifikuje standardními chromatografickými technikami. Mathis et al., J. Labell. Comp. and Radiopharm. 1994: 905. Podobně, analogickými postupy, se připraví deriváty ¹⁸F s malou specifickou aktivitou.

Obecné postupy přípravy neradioaktivních I, Cl, Br, F a -SH derivátů Obecným způsobem se 3-aminoderiváty nebo 4-aminoderiváty salicylové kyseliny nebo korespondující deriváty heterocyklických analog Salicylové kyseliny uvedených v obrázku 2 konvertují na korespondující diazosloučeniny dusitanem sodným a HCI nebo H2SO4. Jodderiváty se připraví přímo formováním diazonium jodidu, který se pak konvertuje na aryljodid, nebo cestou přes meziprodukty triazenu. K nahlédnutí např. Greenbaum, F. Am. J. Pharm. 108: 17 (1936), Satyamurthy, N. and Barrio, J., J. Org. Chem. 48: 4394 (1983) a Goodman, M. etal., J. Org. Chem. 49: 2322 (1984). Arylbromidy a arylchloridy se připraví z diazosloučenin reakcí s CuCl nebo CuBr podle Sandmeyerovy reakce nebo via triazen jako u jodderivátů. Arylfluoridy se připraví reakcí diazosloučenin s NaBF₄, HBF₄ nebo NH₄BF₄ podle Schiemannovy reakce nebo via degradaci triazenu podobnou jako u jodderivátů. Arylthioly se připraví z diazosloučenin reakcí nukleofily, které obsahují síru, takové jako HS', EtO-CSS' a S2²'. Jiným způsobem lze arylthioly připravit nahrazením arylhalogenidů nukleofily, které obsahují síru. Tyto reakce jsou popsány v March, J., Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (3^rdEdition, 1985).

Obecný postup přípravy radioaktivních C, F a Tc derivátů

Kromě výše uvedených postupů se vysoce specifická aktivita radioaktivního značení s ⁹⁹ⁱⁿTc pro SPÉCT nebo s radionuklidy emitujícími pozitron ⁿC, ¹⁸F, ⁷⁵Br a ⁷⁶Br provádí na základě v literatuře uvedených metod, které jsou dobře známy odborné veřejnosti. Některé potenciální specifické metody jsou popsány níže, nicméně jsou metody velmi používané • · • · ··

.........

odbornou veřejností, které lze nalézt v Fowler, J. and Wolf, A. Positron emitter-labeled compounds in Positron Emission Tomography and Autoradiography (Phelps, M., Mazziota, J., and Schelbert, H. eds.) 391 - 450 (Raven Press, NY) (1986), Coenen, H. et al., Radiochimica Acta 34: 47 (1983) a Kulkami, Int. J. Rad. Appl. & Inst. (Part B) 18: 647 (1991), obsahy jsou zde uvedeny jako odkaz.

Deriváty ^99mTc se připraví komplexováním s arylthioly. Radioaktivní značení izotopem ^HC se může snadno provést via N-methylaci, O-methylaci, jak je uvedeno výše, substituováním [Cjmethyljodidu, [ⁿC]alkylace nebo [^uC]karboxylace vhodného analogu chrysaminu G. [¹⁸F]arylfluoridderiváty se mohou připravit substituováním prekurzom značeného ¹⁸F, takového jako[¹⁸F]LiB4 ve výše uvedené Schiemannově reakci, via degradaci triazenu s Cs[¹⁸F] nebo via nukleofilní substituci ¹⁸F za X, kde X = tosyl, triflát, NO2, ⁺N(CH3)3 nebo halogen. Radiobromování pomocí ⁷⁵Br a⁷⁶Br se může provádět použitím bud elektrofilní (Br⁺) nebo nukleofilní (Br) substitucí analogickou k radiojodaci, k nahlédnutí Coenen, H., supra.

Syntéza 3-hydroxy-l,2-benzisoxazolderivátu a příslušných derivátů (Obrázek 2C)

Methylester 2,6-dihydroxybenzoové kyseliny (γ-resorcylová kyselina) (TCI America, Portland, OR) se konvertuje na hydroxamovou kyselinu použitím hydroxylaminhydrochloridu podle metody Boshagen (Chem. Ber 100: 954 - 960; 1967). Hydroxamová kyselina se také podle metody Boshagena (Chem. Ber 100: 954 - 960; 1967) konvertuje na korespondující 3hydroxy-l,2-benzisoxazol pomocí SOC1₂ a pak triethylaminu. Tato sloučenina se pak kupluje benzidinem, 3-brombenzidinem nebo jiným derivátem benzidinu stejným způsobem jako pro deriváty kyseliny salicylové. Bromderiváty se pak mohou konvertovat na trialkylcínderiváty nebo jodderiváty podle postupu popsaného výše.

Při alternativním způsobu se salicylan methylnatý kupluje na benzidin obvyklou metodou a výsledný 4,4'-bis(3-methoxykarbonyl-4-hydroxyfenylazo)-bifenyl (nebo dimethylester chrysaminu G) konvertuje na hydroxamovou kyselinu a pak benzisoxazol výše popsanou metodou podle Boshagena. Při třetím způsobu syntézy 3-hydroxy-l,2benzisoxazolu z dimethylesterů několika izomerických dihydroxybenzenkarboxylových kyselin, 3,6-dihydroxaftalové kyseliny a 2,5-dihydroxytereftalové kyseliny (Aldrich Chem. Co., Milwaukee, WI). Po kuplování na benzidin nebo jeho deriváty standardními postupy se dihydroxy/diestery konvertují na dihydroxy/dihyroxamové kyseliny reakcí s hydroxylaminem • ·· ··· ·· ··· · · · • · · · ···· · · · · • · · · ·· ·· ·· · · podle výše uvedené metody Boshagena. Konverze na dvojitý benzisoxazol je účinná reakcí znovu s SOCI2 a triethylaminem znovu podle výše popsané metody podle Boshagena.

Syntéza ftalimidderivátu nebo isoindol-1,3-(2H)-dionderivátu (Obrázek 2D)

3-Hydroxyftalimid připravený z anhydridu 3-hydroxyftalové kyseliny (Aldrich

Chemical Company, Milwaukee, WI) se kupluje s benzidinem nebo jeho deriváty stejným postupem jako pro deriváty kyseliny salicylové, pak se konvertuje na trialkylcínderiváty nebo jodderiváty podle postupu popsaného výše.

Syntéza ftalhydrazidderivátu nebo 2,3-benzodiazin-l,4(2H,3H)-dionderivátu (Obrázek 2E)

3-Hydroxyftalhydrazid připravený z anhydridu 3-hydroxyftalové kyseliny (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) se kupluje s benzidinem nebo jeho deriváty stejným postupem jako pro deriváty kyseliny salicylové, pak se konvertuje na trialkylcínderiváty nebo jodderiváty podle postupu popsaného výše.

Syntéza 2,3-benzoxazin-l,4(3H)-dionderivátu (Obrázek 2F)

Anhydrid 3-hydroxyftalové kyseliny (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) se kupluje na 2,3-benzoxazin použitím hydroxylaminu. Benzoxazinderivát se pak kupluje s benzidinem nebo jeho deriváty stejným postupem jako pro deriváty kyseliny salicylové, pak se konvertuje na trialkylcínderiváty nebo jodderiváty podle postupu popsaného výše.

Syntéza (2H)l,3-benzoxazin-2,4(3H)-dionderivátu (Obrázek 2G)

Tato sloučenina se syntetizuje metodou podle Effenbergera et al., (Chem. Ber. 105:

1926 - 1942; 1972). Stručně řečeno se fenol kupluje s benzidinem nebo jeho deriváty stejným postupem jako pro deriváty kyseliny salicylové. Tento produkt adice se pak konvertuje na karbamát reakcí s ethoxykarbonylisokyanátem (O=C=N-CO-O-Et) za přítomnosti triethylaminu. Tento substituovaný karbamát (nebo fenylester N-ethoxykarbonyl-karbamové kyseliny) se konvertuje na benzoxazindion zahřátím v difenyletheru. Benzoxazindion se pak konvertuje na trialkylcínderiváty a jodderiváty podle postupů uvedených výše.

• · • · · · • · · · • 4 · · · · • ·· 4 4 4 4 4 4 4 4 • » 4 4 4··· 4 44 4 ·· ·· 44 44 44 44

Syntéza (3H)2-benzazin-l,3(2H)-dionderivátu (Obrázek 2H)

3-Hydroxyfenyloctová kyselina (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) se konvertuje na amid a pak kupluje s benzidinem nebo jeho deriváty stejným postupem jako pro deriváty kyseliny salicylové. Tento produkt adice se pak konvertuje na ethylesterderivát N-(3hydroxyfenylacetoxy)-karbamovou kyselinu reakcí s ethyl-chloroformiátem. Tento substituovaný karbamát se konvertuje na benzoxazindion zahřátím v difenyletheru. Benzoxazindion se pak konvertuje na trialkylcínderiváty a jodderiváty podle postupů uvedených výše.

Syntéza 1,8-Naftalimidderivátu (Obrázek 21)

4-Amino-l,8-naftalimid se kupluje s benzidinem nebo jeho deriváty standardními postupy pro diazokuplování arylaminů, jak je popsáno v Saunders, Κ. H. and Allen, R.L.M. Aromatic Diazo Compounds (Edward Arnold, London, 1985), veškeré obsahy jsou zde uvedeny jako odkaz. Diazonaftalimid se pak kupluje na trialkylcínderiváty a jodderiváty podle postupů uvedených výše.

Syntéza tetrazolderivátů a oxadiazolderivátů (Obrázek 2J a 2K)

2-Kyanofenol (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) se konvertuje na tetrazol reakcí s azidem sodným nebo hlinitým způsobem podle Hollanda a Pereira J. Med. Chem. 10: 149 (1967) a holandského U.S.patentu číslo 3,448,107. Stručně řečeno se 2kyanofenolderiváty nebo kyanofenolderiváty chrysaminu G (1 mmol) ve 40 ml DMF nechají reagovat s azidem sodným (10 mmol) a triethylaminhydrochloridem (10 mmol) pod atmosférou argonu. Směs se míchá při teplotě 120°C po dobu 2 hodin, po kterých se směs ochladí a zpracovává způsobem analogickým k výše popsanému pro chrysamin G.

Oxadiazoly se syntetizují reakcí tetrazolu, připraveného podle výše popsaného postupu, s anhydridem kyseliny ( jako anhydrid kyseliny octové). Alternativní způsob je uveden v Bamford et al., J. Med. Chem. 38: 3502 (1995). V tomto postupu se hydrazidderiváty chrysaminu G nebo salicylové kysel i neobdržené reakcí příslušných esterů s hydrazinem) nechají reagovat s m methylzotiokyanátem za přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu.

Syntéza derivátů chrysaminu G pro použití jako srovnávací pokus

Anilinderiváty se syntetizují nahrazením 2 ekvivalentů anilinu (Fischer Chemical Co.,

Fair Lawn, NJ) za každý ekvivalent benzidinu. Derivát 2,2'-disulfonové kyseliny se syntetizuje nahrazením benzidin-2,2'-disulfonové kyseliny (Pfaltz & Bauer, lne., Waterbury, CT) za benzidin. Fenolderiváty se syntetizují nahrazením 1 ekvivalentu fenolu za každý ekvivalent salicylové kyseliny. Kongočerveň (čistota deklarovaná firmou Aldrich) je dostupná komerčně.

Příklad 2

Specifická vazba chrysaminu G a derivátů chrysaminu G

Vazba na syntetický Αβ(10 - 43)

Chrysamin G se dobře váže in vitro na syntetický peptid Αβ(10 - 43). Obrázek 4A ukazuje Scatchardovu analýzu vazby chrysaminu G na Αβ(10 -43). Komponenta s vyšší afinitou má hodnotu Kd 0,257 μΜ a Β_ΜΧ 18,7 nmol chrysaminu G/mg Αβ(10 - 43). Komponenta s nižší afinitou reprezentuje vazbu chrysaminu G při vyšších koncentracích k zřetelnění, místo s nižší afinitou, toho, že se při přípravě neváže na nečistoty. Množství injektovaného chrysaminu G in vivo je tak nízké, že zde není jakákoliv vazba na komponentu s nižší afinitou. Při velmi nízkých koncentracích je poměr vysoké afinity ku nízké afinitě velmi velký.

Množství vazby chrysaminu G, jak je uvedeno v obrázku 5, je lineární s koncentrací peptidu v používané šíři.

Kinetika vazby

Studie kinetiky ukázaly docela prudkou asociaci (obrázek 6A), v podstatě kompletní za 1 min, při [chrysamin G] = 112 μΜ s Z, 8,9 ± 1,8 s a poněkud méně prudká disociace (obrázek 6C), Z, — 55 ± 9,4 s [rychlostní konstanta disociace (k_i) - 1,26 χ 10'² s'¹].

Obrázek 6B ukazuje transformaci kinetické data asociace podle metody Bennetta a Yamamury. Bennett, J.P. and Yamamura, H.I. in Neurotransmitter Receptor Binding (N.Y.: Raven Press 1985) 61 - 89. Lineární část křivky asociace v obrázku 6A je transformovánana do úsečky v obrázku 6B, ve kterém je ln[Beq/(Be<,-Bt)] vynesen oproti času, kde Bgq je množství vázaného chrysaminu G v rovnováze (4 min) a Bt je množství vázané v čase=t. Sklon této úsečky odpovídá kp_Ozorování a ki=(kp_OZOr_Ování - k.i)/[chrysamin G], kde k.i je rychlostní konstanta disociace stanovená z dat v obrázku 6C. Křivka v obrázku 6C je vytvořena na základě rovnice:

A_t = A_oe~^k-'‘ kde At je množství zbývající vazby chrysaminu G v čase = t, Ao je množství vázaného chrysaminu G v čase = 0, t je čas v minutách a k_i je rychlostní konstanta disociace. Z této analýzy je vypočtená lychlostní konstanta asociace (kj) 3,75 χ 10⁴ M¹, Kd = k.j/ki = 0,34 μΜ, což je v dobrém souladu s Scatchardovou analýzou.

Deriváty chrysaminu G mohou inhibovat vazbu chrysaminu G na Αβ

Hodnoty Kj pro inhibování vazby [¹⁴C]chrysaminu G na Αβ(10 - 43) pomocí analog chrysaminu G jsou uvedeny pod jednotlivými chemickými strukturami v obrázku 1 a v obrázku 3 je uvedeno několik křivek vyjadřujících průběh odstranění. Kj je definována jako IC5o/(1+[L]/K_d), kde [L] je koncentrace [¹⁴C]chrysaminu G při stanovení (0,100 - 0,125 μΜ) a Koje 0,26 μΜ, Kd chrysaminu G je stanovena výše uvedenou Scatchardovou analýzou. Kongočerveň má Kj 2,82 ± 0,84 μΜ. Difluorderivát chrysaminu G, (5-FSA)CG, (obrázek 1) je silný z jedné třetiny jako samotný chrysamin G (Kj = 1,16 ± 0,19 μΜ). Aktivita difluorderivátu chrysaminu G dává podnět k tomu, aby se ¹⁸F difluorderivát chrysaminu G použil pro PET a MRS/MRI zobrazení mozku.

3-ICG je nepatrně účinnější, než chrysamin G. Aktivita 3-ICG dává podnět k tomu, aby se ¹²³I difluorderivát chrysaminu G použil pro SPÉCT zobrazení. Methylací fenolu 3-ICG se desetinásobně sníží afinita v 3-GC(OMe)₂. Methylace karboxylátové skupiny ovlivní stejně velkým (x200) snížením afinitu u CG(COOMe)2. Úplným odstraněním kyselinové části, jako u fenolderivátu, se zcela zničí vazebná afinita.

u/

Tyto výsledky naznačují, že kyselinová část analog'chrysaminu G hraje hlavní roli při vazbě na Αβ a že fenolová část pouze dopomáhá této vazbě. Efekt fenolu by mohl spočívat ve vodíkové vazbě na kyselinu, která může stabilizovat strukturální orientaci kyselinové části.

Přítomnost fenolu v ortho pozici by mohla také měnit rozdělení nábojů kyseliny buď vodíkovou vazbou a nebo změnami v rozdělení nábojů aromatického systému jako celku.

V alternativním způsobu může fenol přímo participovat při vazbě na amyloid dvojzubatým připojení obou fenolů a kyseliny na místo vazby amyloidu. Přidáním druhého fenolu v ortho poloze ke karboxylátu, jako u derivátů kyseliny resorcylové (6-0HSA)CG), vzniká sloučenina s největší afinitou v této skupině mající K; 0,094 ± 0,02 μΜ.

Se stoupající lipofilitou hlavní řetězce bifenylu trochu narůstá afinita. Všechny dihalogenderiváty, 3,3 -I₂CG, 3,3 -Br₂CG a 3,3 -C1₂CG, mají velmi podobné hodnoty K;, které jsou asi poloviční než u chrysaminu G.

Deformací diedrálního úhlu mezi fenylovými kruhy bifenylové skupiny substitucí na 2-pozici významně zeslabý afinitu, což je demonstrováno inertností derivátů 2,2 -disulfonové kyseliny chrysaminu G, 2,2-(SChjCG. Poněvadž 3,3 '-dikarboxylový derivát, 3,3 (COOH)₂CG, vykazuje pouze sedminásobnou ztrátu aktivity vzhledem k chrysaminu G, je nepravděpodobněme další kyselinové části jsou jedinou příčinou ztráty aktivity u 2,2 disulfonové kyseliny. Tento 2,2'-derivát je unikátní v tom, že prostorově náročné sulfonátové skupiny na 2-pozici deformují planámi uspořádání bifenylové skupiny. Při zkoumání za pomoci molekulárního modelování se ukázalo, že diedrální úhel mezi dvěma benzenovými kruhy bifenylu v derivátu 2,2'-disulfonové kyseliny chrysaminu G je 83°. Tento úhel je u chrysaminu G a dalších aktivních derivátů přibližně 35 - 45°.

Při pokusu prozkoumat význam dvojzub. ého tvaru funkčních skupin chrysaminu G, se zkoumala vazba anilinderivátu, který reprezentuje jednu polovičku molekuly chrysaminu G(obrázek 1). Aproximace vazebné energie může být vypočítána z rovnice:

Δσ = -7?Πη^_β} kde AGje energie vazebné reakce, Rje molární plynová konstanta [8,31441 J/(mol»°K)], T je teplota v °K a Ke_q je rovnovážná konstanta reakce:

[čidlo] + [peptid] = [probe*peptid] a Keq = 1/K_D»1/Kj. Při použití hodnoty 0,26 μΜ pro K_D chrysaminu G je vazebná energie zhruba 38 kJ/mol. Pokud s anilinderivát váže poloviční energií bude vazebná energie okolo 19 kJ/mol. Z hodnoty K; 73 μΜ pro anilinderivát je vazebná energie 23 kJ/mol, která v přijatelné shodě s vypočítanou hodnotou. Význam hydrofobní oblasti chrysaminu G a anilinderivátů je demonstrován na naprosté ztrátě schopnosti vázat kyselinu salicylovou.

Afinita chrysaminu G pro Αβ se ukazuje, že je několikrát větší než afinita kongočerveně pro tento peptid. Vazba je reverzibilní s disociační konstantou přibližně 250 9 9 * 99 • 9 99 • 99 9*9 99 990 00 9 • 99 9 ···· 9 9 9 9 ·9 ·· «9 «· 99 ··

ΟΟ

400 ηΜ, bez ohledu na to zdaje meřena Scatchardovou analýzou, kinetickými metodami či inhibici vazby. Kvůli nekrystaličnosti a slabé rozpustnostnoti fibril amyloidu nebyly nikdy struktury komplexů kongočerveni nebo chrysamin G s amyloidem definovány pomocí precizních technik pro určení struktury, takových jako rentgenostrukturní analýza krystalických látek nebo vícerozměrová NMR. Byly navrženy modely interakcí kongočerveni s amyloidem. Cooper, Lab. Invest. 31: 232 (1974); Romhanyi, Virchows Arch. 354: 209 (1971). Tato práce uvádí, že se kongočerveň neváže na jednotlivou molekulu peptidu amyloidu, ale že se váže na několik molekul Αβ orientovaných podle p-listu(P-sheet) fibrily.

Klunk etal.,J. Histochem. Cytochem. 37: 1273 (1989).

Obrázek 7 ukazuje schématický model, vytvořený pomocí programu MacroModel 2,5,ve kterém se chrysamin G rozestupuje na 5 peptivodých řetězců v antiparalelní konformaci β-listu. Peptidy jsou používány bez dalšího upravení a orientovány tak, že protilehlé peptidové řetězce jsou od sebe na vzdálenost 4,76 Ά, což je charakteristické pro βlist fibril. Alternativní peptidové řetězce jsou nakresleny v černé a bílé. Chrysamin G (černý) je energeticky minimalizován a uspořádán společně s fibrilovým modelem k maximalizaci kontaktu s lysinem-16 (světle šedé ovály v horní části obrázku) a s hydrofóbní oblastí fenylalaninu 19/20 (spodní část obrázku). Pohledy na stejný typ modelu se od sebe liší pouze úhlem (jeden od druhého 90°). Bílé šipky indikují směr druhého pohledu.

Vzdálenost 19,1 *A mezi částmi karboxylové kyseliny chrysaminu G dobře odpovídá délce 19,0 *A napříč 5 řetězci (4 x 4,76 ‘A mezi sousedními řetězci uvedenými Kirchnerem et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83: 503 (1986)). Pokud se nativní struktura Αβ týká struktury vlásenkové smyčky jako u Hilbicha et al., (Hilbich et al., J. Mol. Biol. 218: 149 (1991)), pak by řetězce 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, atd. mohly být složeny z poloviční části stejné molekuly při zachování stejného modelu. Také je nutné se zmínit o nezbytné potřebě pozitivně nabitých zbytků aminokyselin v tomto modelu, takových jako lysin-16 v Αβ.

Předešlá práce ukázala, že vazba kongočerveně dobře koreluje s počtem pozitivně nabitých aminokyselin ve vzorku fibril amyloidu. Klunk et al.,J. Histochem. Cytochem. 37: 1273 (1989). Dvojzub, ý tvar modelu v obrázku 7 a důležitost hydrofóbních interakcí je o podporována snížením afinity monozubatého anilinanalogu chrysaminu G a inertnosti salicylové kyseliny, jakož i zvýšenou účinností lipofilnějších sloučenin majících na benzidinové části dva halogeny(obrázek 1). Důležitost téměř planární bifenylové skupiny je podněcována inertnosti derivátu 2,2'-disulfonové kyseliny.

Příklad 3

Chrysamin G rozlišuje mozek zasažený Alzheimerovou nemocí od zdravého mozku

Charakteristika vazby chrysaminu G na mozek zasažený AD

Scatchardova analýza vazby chrysaminu G a derivátů chrysaminu G na vzorky mozku zasaženého AD se prováděla za účelem pochopení vzrůstající vazby chrysaminu G na mozek zasažený AD. (Obrázek 4B, tabulka 1). Za použitých podmínek vykazoval zdravý a zasažený mozek vazbu jedné složky. Kd u zasaženého mozku byla o 16% nižší než u zdravého, ale rozdíl nebyl signifikantní (p=0,29). B_max u zasaženého mozku byla o 36% vyšší než B_max u zdravého, ale rozdíl opět nebyl signifikantní (p=0,09). Proto se vzrůstající vazba u mozku zasaženého AD vzniká hlavně v důsledku přítomnosti podobnější složky vazby, která existuje ve zdravém mozku spíše než přítomnost výjimečné složky.

Tabulka 1

Srovnání parametrů vazby u mozku zasaženého AD a zdravého mozku

	KD (μΜ)	Bmax(pmol/pg prot)
Zdravý mozek (n = 6)	0,47 ± 0,049	0,576 ± 0,092
Mozek zasažený AD (n = 5)	0,39 ± 0,048	0,784 ±0,061

Vazba CG na mozek zasažený AD signifikantně koreluje s počtem neuritických plátů v asociovaných kůrách mozku. Obrázek 8A ukazuje korelaci vazby [¹⁴C]CG s počtem neuritických plátů v horním/středním frontálním a horním temporálním kortexu mozku zasaženého AD. Korelace se neuritickými pláty byla signifikantní, nezávisle na tom zda se uvažovalo včetně kontrolních vzorků (r = 0,69; p = 0,001) či bez nich (r = 0,59; p = 0,007). Obrázek 8B ukazuje podobnou korelaci s počtem neurofíbrilárních zauzlení. Jako u neuritických plátů byla i korelace u neurofíbrilárních zauzlení signifikantní bez ohledu na to, zda se uvažovalo včetně kontrolních vzorků (r = 0,60; p = 0,001) či bez nich (r = 0,50; p = 0,026). Korelace s neurofibrilárními zauzlení mi není překvapující, poněvadž CG je derivát kongočerveni, která zbarvuje neurofibrilámí zauzlení. Počet neuritických plátů byl signifikantně korelován s počtem neurofíbrilárních zauzlení.

• 4 • 4 ·»

Byla dostupná pouze kvalitativní data udávající přítomnosti nebo nepřítomnost amyloidové angiopatie pro mozky používaná při této studii, tzn. že podobné korelace mezi vazbou CG a hladinou cerebrovaskulárního amyloidu nemohly být provedeny. Ukazuje se, že přítomnost amyloidové angiopatie nestálým způsobem ovlivňuje korelace vazby CG s počtem neuritických plátů. Obrázek 8A ukazuje vylepšenou korelaci mezi vazbou CG a počtem neuritických plátů u mozků bez amyloidové angiopatie (r - 0,79; p = 0,01) v porovnání s mozky s cerebrovaskulárními depozity amyloidu (r = 0,49; p = 0,15). Podobné vylepšení se nedosáhlo u korelace s počtem neurofibrilárních zauzlení.

Kd pro vazbu [¹⁴C]chrysaminu G na mozek zasažený AD je podobná k již zjištěné hodnotě pro in vitro vazbu [¹⁴C]chrysaminu G na syntetický Αβ, která naznačuje, že vazba ve stejnorodých částech mozku může také reprezentovat interakci s Αβ. Korelace mezi vazbou chrysaminu G a neurofibrilárními zauzlení mi může indikovat to, že se chrysamin G váže také na tyto struktury ve stejnorodých částech mozku.

Jinak řečeno, poněvadž počet neurofibrilárních zauzlení úzce koreluje s počtem neuritických plátů, může být právě korelace mezi vazbou [¹⁴C]chrysaminu G a neurofibrilárními zauzleními epifenoménem mezi vazbou chrysaminu G a neuritickými pláty.

Zde poskytnuté účinné deriváty a analog chrysaminu G mají takové afinity k vazbě, které jsou alespoň v rozpětí od 0,01 do 10,0 μΜ Kd, měřena vazba bud’ na syntetický peptid Αβ a nebo na tkáň mozku zasaženého AD; sloučeniny s vyšší afinitou mají takové afinity k vazbě, které jsou v rozpětí od 0,0001 do 0,01 μΜ, a jsou účinné ve způsobu předloženého vynálezu.

Pokud se uváží výše popsané, pak nemůže být vazba chrysaminu G specifická pro Αβ. Místo toho může vazba chrysaminu G odrážet celkové „zanesení“ mozku amyloidem tvořené nahromaděnými depozity Αβ v neuritických plátech a v cerebrovaskulárním amyloidu. Depozita fosforylovaného tau proteinu v neurofibrilárních zauzleních mohou také přispívat k vazbě chrysaminu G. Goedert, M. etal.,PNAS 85: 4051 (1988). Neurofibrilární zauzlení jsou také složena z podobných antiparalelních β-listů fibril ve kvatemární struktuře k fibrilám Αβ. Kirschner etal., Proč. Nati. Acad. U.S.A. 83: 503 (1986).

Celková a relativní vazba chrysaminu G, který rozlišuje mozek zasažený Alzheimerovou nemocí od zdravého mozku » * 4

4 4 44

Φ 4 • 4 44

Stanovení vazby in vitro, takové jako výše a níže popsané jsou široce používány v tomto oboru jako modely ke screeningu sloučenin in vivo pro vazbu v mozku a k předpovědění úspěchu při studiích in vivo zobrazení. K nahlédnutí Young, A. et al., Receptor Assays·. In Vitro and In Vivo. in Positron Emission Tomography and Autoradiography (Phelps, M., Mazziota, J., and Schelbert, H. eds.) 73- 111 (1986). Značený chrysamin G a značené deriváty chrysaminu G předloženého vynálezu mohou také být používány ve výše a níže popsaných in vivo stanoveních vazby ke stanovení množství depozit amyloidu při biopsii nebo u posmrtných vzorků.

K nasycení schopná (specifická) vazba [¹⁴C]chrysaminu G byla pozorována jak u mozku zasaženého AD, tak i u stejnorodých částí kontrolního mozku a přestavovala 60 - 80% celkové vazby v mozku zasaženého AD. K nasycení neschopná vazba byla velmi podobná v kontrolním a zasaženém mozku. K nasycení schopná a celková vazba byla větší u zasaženého mozku než u kontrolního. Ačkoliv je použití celkové vazby méně citlivé,je tato charakteristická veličina prediktivnější úspěchu při in vivo studiích, kteréjsou základním záměrem předloženého vynálezu. Také pro účel rozšíření na in vivo studie je výhodná, jestliže vazba chrysaminu G v kortikálních oblastech je normalizována na mozkovou oblast, ve které je vazba chrysaminu G velmi podobná jak zasaženému, tak i kontrolnímu mozku. To odstraňuje nutnost výpočtu absolutního vázaného množství, což by se jinak velmi těžko provádělo in vivo. Bylo provedeno vyšetření vazby v malém mozku jako potenciální kontrolní oblast, protože výskyt klasických neuritických plátů v této oblasti mozku je velmi zřídka vý (Joachim etal.,Am. J. Pathol. 135: 309 (1989)).

Průměrné množství [¹⁴C]chrysaminu G vázaného na kontrolní malý mozek je téměř identické k množství vázanému na malý mozek zasažený AD (tabulka 2), za předpokladu použití malého mozku jako interní kontroly. Proto cerebelámí poměr (angí. krátká CBR) přesně odráží absolutní množství vázaného [¹⁴C]chrysaminu G a nabízí pro každý mozek zvýhodnění poskytování interní kontroly. Pokud se vazba vyjádří v absolutních termínech fmol/pg proteinu (tabulka 2) nebo jako míra vazby v mozečku stejného mozku (tabulka 3), je větší u mozku zasaženého AD. Cerebelární poměr je citlivější měření a mezi mozky jeví menší variabilitu. Použití celkové vazby a cereberálního poměru citelně ulehčí přenesení těchto ex vivo výsledků na in vivo studie. Obdobně jsou níže uvedené výsledky pro patřičnost vyjádřeny v těchto termínech.

Tabulka 2 • · · 70 ·* ’

Oblast mozku	Kontrolní mozek (fmol/pg proteinu)	Zasažený mozek (fmol/pg proteinu)	Hodnota p
Malý mozek	75 ± 13 (n = 8)	73 ± 9 (n= 11)	p = 0,91
Frontální pole	58 + 8 (n = 6)	124±16(n=10)	p < 0,006
Homí/střední frontální pole	54 ± 10(n = 8)	130±21(n=ll)	P < 0,005
Horní temporální pole	66±17(n = 8)	121 ± 14 (n-11)	P < 0,02
Čelo caudatu pole	73 ± 11 (n = 4)	123±22(n = 7)	p = 0,14
Spodní parietální pole	76 ± 13 (n = 8)	137 + 19 (n = 11)	p < 0,03
Okcipitální pole	64 ± 16(n = 8)	95 ± 12 (n = 11)	p = 0,15

údaje z mozků zasažených AD s nízkým a vysokým počtem plátů jsou sloučeny

Tabulka 3

Porovnání vazby v kontrolním a AD zasaženém mozku vyjádřené jako poměr k malému mozku*

Oblast mozku	Kontrolní mozek (CBR)	Zasažený mozek (CBR)	Hodnota p
Frontální pole	0,87 ± 0,04 (n = 6)	1,87 ± 0,25 (n= 10)	p < 0,004
Homí/střední frontální pole	0,73 ± 0,02 (n = 8)	1,84 ± 0,18 (n= 11)	P < 0,001
Horní temporální pole	0,86 ± 0,08 (n = 8)	1,63 ± 0,17 (n- 11)	P < 0,002
v Celo caudatu pole	0,95 ± 0,04 (n = 4)	1,76 ±0,31 (n = 7)	p < 0,04
Spodní parietální pole	0,90 ± 0,08 (n = 8)	1,93 ± 0,20 (n= 11)	p < 0,001
Okcipitální pole	0,77 ± 0,13 (n = 8)	1,44 ± 0,20 (n= 11)	p < 0,02

ftftft · ft ♦ 4 4 9 9 ft ftft ftft ♦ ftftft· ft ftft · • ftft «I»· ftft ftftft ftft ft • ftftft ftftftft ftftftft • ft ftft ftft ftft ftft ftft *cereberální poměr (CBR) pro každý vzorek je získán dělením absolutní hodnoty vazby [¹⁴C]chrysaminu G ve vzorku absolutní hodnotou vazby [¹⁴C]chrysaminu G v cereberálním mozku ve stejném mozku. Hodnoty v tabulce jsou průměrné cereberální poměry z každé oblasti mozku (± SEM). Údaje z mozků zasažených AD s nízkým a vysokým počtem plátů jsou sloučeny.

Obrázek 9A a 9B ukazuje vazbu [’⁴C]chrysaminu G na šest míst v mozku normalizovanou na mozeček stejného mozku. Vazba chrysaminu G na oblasti mozku v AD zasažených mozcích majících více než 20 neuritických plátů/x200 faktor zvětšení, „mozky zasažené AD s vysokým počtem plátů “, je uvedena na obrázku 9A. Vazba chrysaminu G na oblasti mozku v AD zasažených mozcích majících méně než 20 neuritických plátů/x200 faktor zvětšení, „mozky zasaženém AD s nízkým počtem plátů“, je uvedena na obrázku 9B. Ve všech oblastech mozku je vazba na zasažený mozek signifikantně větší než vazba na kontrolní mozek (tabulka 3). V homím/středním frontálním kortexu není překryv mezi kontrolními a jakýmikoliv vzorky. Ve všech oblastech mozku vyjma okcipitálního kortexu není překryv mezi kontrolními vzorky a vzorky zasaženými AD majícími >20 neuritických plátů/x200 faktor zvětšení. V oblastech mozku s nejnižší depozicí klasických neuritických plátů, takových jako okcipitální kortex (a malý mozek), byl pozorován největší překryv mezi mezi kontrolními vzorky a vzorky ze zasaženého mozku.

Obrázek 9C ukazuje údaje získané od dvou pacientů, kteří měli Downovu chorobu. U všech pacientů s Downovou chorobou a mnoha s Alzheimerovou nemocí se depozita Αβ rozvíjejí od čtyřicítky. Wisniewski et al., Neurology 35: 957 (1985); Schapiro et al., Neurobiol. Aging 13, 723 (1992). Oba typy pacientů vykazovaly výše vazebnost [¹⁴C]chrysaminu G nad kontrolním vzorkem. Poněvadž mladší pacienti (23 let) měli depozita amyloidu, nicméně nebyli ještě klinicky dementní, naznačuje obrázek 9C, že chrysamin G může detektovat rozdíly z kontrolního vzorku nedementních pacientů, u kterých se uvažuje rozvinutí AD dlouho předtím než je demence klinicky evidentní.

Sloučeniny a způsob předloženého vynálezu poskytují dvě účinné měření rozlišující mozek zasažený AD od normálního mozku; buď (1) celková vazba chrysaminu G (tabulka 2) a nebo (2) poměr vazby chrysaminu G v dané oblasti mozku ku vazbě v mozečku stejného mozku (tabulka 3). Tyto měření poskytují dva významné pokroky pro in vivo stanovení množství neuritických plátů AD. První tím, že poskytuje prostředky k měření celkové vazby •4 44

4 4

4 4 44 • 4 4 4

4 4 4

4 4 4

4

4 9

4 4 99

4 4 4

44

99 • 9 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4

94

Αβ spíše než specifické Αβ. Běžný vynález může poskytovat stanovení množství depozit Αβ, aniž by vystavil subjekt druhé injekci radioaktivní látky, aby měřil specifickou vazbu.

V důsledku toho jsou údaje vyjádřena pouze jako celková vazba. Ve všech předložených experimentech poskytují údaje o specifické vazbě rovnoměrně větší rozdíly mezi kontrolním a AD zasaženým mozkem.

Druhý tím, že změny absorpce derivátů chrysaminu G v mozku ovlivní absolutní koncentraci chrysaminu G v mozku. Proto je pro tyto změny mezi subjekty nezbytné provést výpočty některých mechanismů. Každý pacient může svým kontrolováním objevit oblast mozku, která vykazuje malou depozici Αβ (jmenovitě experimentální „slepý pokus“). Poněvadž klasické neuritické pláty se vyskytují v neobyčejně hojném množství v malém mozku (Joachim et al., Am. J. Pathol. 135: 309 (1989)), používala se vazba chrysaminu G na malý mozek jako kontrolní pro každý studovaný mozek. Výsledky se vyjádřily jako poměr vazby chrysaminu G v oblasti mozku ku vazbě v mozečku stejného mozku (Obrázek 9 a tabulka3). Pro účely in vivo stanovení množství amyloidu při AD by se měl uvážit efekt mozkové atrofie. Proto, pri in vivo použití chrysaminu G derivátů chrysaminu G jako sond ke stanovení množství amyloidu, může být mozková atrofie korigována na základě MRI měření objemu. MRI měření objemu prováděné v kombinaci se způsobem předloženého vynálezu jsou analogická k běžně prováděným v tomto oboru. K nahlédnutí Pearlson, G. and Marsh, L. Magnetic Resonance Imaging in Psychiatry in Annual Review of Psychiatry (Vol. 12)

Oldham, J. et al., eds. 347-381 (1993). Proto se při způsobu stanovení celkové radioactivity na objem oblasti mozku používá následující rovnice:

Celkový SPÉCT nebo PET signál z oblasti mozku „A“

MRI měření objem mozku(s vyloučením CSF) v oblasti mozku „A“

Označení tohoto měření jako signál/objem pro oblast mozku „A“ nebo S/V_A znamená, že cereberální poměr může být vyjádřen jako:

_D ^S/VA

Pomelr, --— s/v_CB kde S/Vcb je signál/objem v malém mozku stejného subjektu během stejného zobrazení. Tento poměr z jakékoliv oblasti mozku, jiný než malého mozku pacienta podezřelého na AD nebo na jiné patologické stavy charakterizované depozity amyloidu, by pak mohl být porovnán s běžným rozsahem hodnot analogického poměru ze stejné oblasti mozku skupiny ·♦ ·· ·· ·· ·· ·· ♦ Φ · ·«· 4 9 4 9 • 4 4 44 4 4 4 44 4 4 9 · * 4 9 4 9 4 9 4 4 9 9 9 4 4

4 9 4 4 4 4 4 4 4 4 4

44 44 44 44 94 věkově přizpůsobených zdravých kontrolních subjektů. Poměr vazby na oblasti mozku s vysokými depozity neuritických plátů ku malému mozku může být používán jako charakteristická veličina k rozlišení kontrolních subjektů od subjektů zasažených Alzheimerovou nemocí.

Příklad 4

Rozdělovači koeficienty oktanol-voda chrysaminu G, derivátů chrysaminu G a kongoěenveni

Rozdělovači koeficient oktanol-voda je měření relativní lipofilnosti sloučenin. Čím více lipofilnější sloučenina, tím pravděpodobněji prostoupí hematoencefalickou bariéru.

K nahlédnutí Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7^th Ed.). Rozdělovači koeficient oktanol/voda chrysaminu G je 60,22 ± 3,97 a kongočerveni 0,665 ± 0,037 (p < 0,001). To naznačuje, že chrysamin G je přibližně 90x lipofilnější než kongočerveň a proto teoreticky snaději prostoupí hematoencefalickou bariéru. Rozdělovači koeficienty oktanol/voda pro 3-jodderiváty a 3,3 '-dijodderiváty chrysaminu G (obrázek 1) jsou 72,53 + 0,74 a 112,9 ± 7,3. Tyto rozdělovači koeficienty oktanol/voda ukazují, že tyto deriváty, které jsou neradioaktivními analogy některých derivátů chrysaminu G značených radioaktivním izotopem a mohou být používány pro in vivo studie, jsou až 170x lipofilnější než kongočerveň a až 2x tak lipofilnější, jak chrysamin G. To naznačuje, že budou vstupovat do mozku o mnoho lépe než buď kongočerveň a nebo chrysamin G.

Příklad 5

Schopnost chrysaminu G a derivátů chrysaminu G prostoupit hematoencefalickou bariéru a metabolizmus chrysaminu G

Použití amyloidových sond k in vivo diagnostikování AD vyžaduje, aby byly amyloidové sondy schopné prostoupit hematoencefalickou bariéru a dosáhnout přístupu k parenchymálním depozitům amyloidu.

to to • to • · · to ·· « • ·· · to· to· ·· ·· • ·· • to · ·« to ·· « ·« ·· • toto · • ·· · • ·· · • ·· · ·· ♦·

Schopnost chrysaminu G prostoupit hematoencefalickou bariéru byla studována na Swiss-Webster myších. Po intravenózní injekci byl poměr mozek/krev měřený v 15 minutě více jak 10:1 a v 35 minutě se blížil 20:1 (obrázek 10). V průběhu této periody zůstávala radioaktivita v mozku téměř konstantní, ale v krvi se snížila a v játrech zvýšila. Poměr mozek/ledviny byl nejvyšší v 15 minutě a blížil se 0,5. Pokud se mozek a játra extrahovaly 60 min po intravenózní injekci [¹⁴C]chrysaminu G, eluovalo > 95% regenerované radioaktivity paralelně s autentickým chrysaminem G při HPLC chromatografii s převráceným poměrem fází, což ukazovalo na nevýznamný metabolizmus chrysaminu G v průběhu této doby.

Cbrysamin G se dostane do normální mozku myši a poměr mozek/krev je vysoký. Radioactivita v mozku zůstává relativně konstantní v průběhu prvních 30 minut, zatímco se snižuje v krvi a zvyšuje v játrech. To naznačuje, že vysoký poměr mozek/krev je více výsledkem účinného odstranění chrysaminu G z krve v játrech než že by se akumuloval v mozku. Kongočerveň neprostupuje hematoencefalickou bariéru dobře. Tubis et al.,J.

Amer. Pharm. Assn. 49: 422 (1960). Většina kongočerveně je čištěna játry a slezinou a poměr mozek/játra získaný z morčat je přibližně 0,07. Tubis et al., supra. Chrysamin G je také čištěn játry, ale lépe vstupuje do mozku.

In vivo testování na zvířatech poskytlo ještě další základy pro stanovení rozpětí dávky a to účinnost přechodu přes hematoencefalickou bariéru a schopnost vazby. Zvláště výhodné pro tento záměr jsou myši transgenického modelu, Games et al., (Nátuře 373: 523 (1995)), a model „senilního zvířete“ pro cerebrální amyloidózu; jmenovitě, taková zvířata jako transgenické myši nebo staří psi nebo opice, o kterých se ví, že se u nich dobře rozvíjí různý počet cerebrálních neuritických plátů Alzheimerova typu, jsou testována na účinnost vazby a detekce.

k nahlédnutí Wisniewski et al.,J. Neuropathol. & Exp. Neurol. 32: 566 (1973), Selkoe et al., Science 235: 873 (1987). Toto in vivo stanovení vyžaduje monitorování kontrolní biopsie nebo nekropsie k potvrzeni a stanovení množství přítomných depozit amyloidu.

Další vhodné zvířecí modely pro použití v testovacích přípravcích a způsobech předloženého vynálezu jsou vytvářeny transgenicky. Například Quon etal., Nátuře, 352: 239 - 241 (1991) využíval promotor inhibiční oblasti krysí specificky neurální enolasy k připravení transgenických myší. K nahlédnutí také Wirak et al., Science, 253: 323 - 325 (1991). Ještě další modely byly produkovány intrakraniální aplikací β/Α4 peptidu přímo do zvířat (Tate etal., Bull. Clin. Neurosci., 56: 131- 139(1991).

φφ φ

φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φ* «φ • φ · • φφφφ φ φ φ • φ φ φφ φφ φφ φ · φ φ φφφφ • φ φ φ φφ «φ

Je známo, že žádný z in vivo modelů zvířat se nemůže osvědčit jako neobyčejně dobrý model pro neuropatologii AD. Místo toho mohou být věrnějšími modely depozit amyloidu normálního stárnutí. To je velmi pravdivé u modelů starých zvířat. Všechny tyto modely vykazují převahu difusních plátů jak je diskutováno výše u modelu zestárlého psa. Zatímco se vyskytuje nějaký cerebrovaskulámí amyloid, je zde jen málo neuritických plátů, vyjma v transgenním modelu myši autora Games et al.. Ostatní transgenní modely myši často vykazují pouze difusní pláty . Proto, zatímco tyto modely mohou být užitečné pro studium distribuce sond v mozku, je zde dosti nízká pravděpodobnost, že tyto modely by mohly vykazovat stejné kvantitativní rozdíly, které by se dali očekávat, že budou vidět v mozku zasaženém AD na základě výše uvedených in vitro studií vazby chrysaminu G na mozek zasažený AD.

Stanovení schopnosti derivátů chrysaminu G prostoupit hematoencefalickou bariéru u lidských subjektů

Dávka přibližně 10 mCi derivátu chrysaminu G patřičně značeného radioaktivním izotopem se specifickou aktivitou přibližně 500 Ci/mol nebo vyšší je intravenózně injektována do zdravých subjektů a pacientů podezřelých na AD a monitorována pomocí SPÉCT nebo PET zobrazení k analyzování detegovatelnosti derivátu v mozku relativní k jiným orgánům a k definování časového průběhu detegovatelnosti v mozku. Dávka, která může být spolehlivě detektovatelná, je definována jako „efektivní dávka k zobrazení“.

Stanovení schopností chrysaminu G a derivátů chrysaminu G k rozlišení mozku zasaženého AD od věkově přizpůsobených kontrolních mozků u lidských subjektů

Efektivní dávka k zobrazení derivátu chrysaminu G patřičně značeného radioaktivním izotopem je inj ekto vána do subjektů podezřelých na depozita amyloidu v důsledku patologických stavů, takových jako AD. Po době 15 minut až 24 hodin je signál od radioaktivního izotopu detektován pomocí SPÉCT nebo PET. Radioaktivita je paralelně detektována ve všech oblastech mozku včetně v zorném poli detektoru. Zorné pole se nastaví tak, aby zabíralo velké části malého mozku, horní temporální kortex, homí/střední frontální kortex a zasahující místa mozku. Podrobné zkoumání pomocí MRI se provádí před studiem ft* ftft • · ft • ftft·· ft ftft • ftft • ft ftft ftft · · • ftft • ftftftft • ftft · ftft ftft ftft ftft • ftft ft ft ftft · • ftft · ft ftft * • ft ftft tak, aby korekce mohly být provedeny pro mozkovou atrofii v místech zkoumání metodami rozebíranými v příkladu 3. Poměry S/V_A, S/Vcb a Poměr_A rozebírané v příkladu 3 se vypočítají a porovnají s analogickými normativními poměry, které se již dříve obdrželi od věkem přizpůsobených zdravých kontrolních subjektů.

Příklad 6

Histologická lokalizace vazby chrysaminu G na cerebrovaskulámí amyloid

Horní část obrázku 11 demonstruje dva neuritické pláty značené chrysaminem G. Způsob značení byl podle Stokese a Trickeyho, J. Clin. Pathol. 26: 241 - 242 (1973) s nahrazením chrysaminu G za kongočerveň. S výjimkou poněkud nižší intenzity jsou tyto depozita indentická k těm, které jsou značena kongočerveni (nejsou ukázány). Spodní část mikrofotografických snímků v obrázku 11 ukazuje přilehlá místa z temporálního laloku pacienta zasaženého AD s amyloidovou angiopatií. Místo v levé dolní části bylo značeno kongočerveni použitím metody podle Puchtlera. Puchtler etal.,J. Histochem. Cytochem. 10: 35 (1962). Místo v pravé dolní části obrázku 11 bylo značeno Puchtlerovou metodou nahrazením chrysaminu G za kongočerveň. Obě místa pohotově demonstrují stejný objekt zaplněný amyloidem. Je také viditelné malé množství v pozadí vyskytující se autoflurescence z erytrocytů a lipofuscinu. Oba fotomikroskopické snímky byly získány mikroskopem s konfokálním laserem použitím filtrů fluorescin izotiokyznátu (FITC). Mřížka reprezentuje 20 mikrometrů.

Příklad 7

Stanovení toxicity chrysaminu G a derivátů chrysaminu G

Při dávce 10 a 100 mg/kg neradioaktivního chrysaminu G aplikované intraperitoneálně nebyly pozorovány u myší žádné patrné účinky na chování nebo toxicita po dobu 72 hodin. Dávky [¹⁴C]chrysaminu G aplikované byly v řádu 1 mg/kg.

Chrysamin G vykazoval malou akutní toxicitou při pokusech stanovit LD50. Kdykoli byl maximální objem, který může být injektován do myši bez toho, aby ji poškodil, pouze podle účinků tekutého objemu (přibližně 0,025 ml/g) nasyceného roztoku chrysaminu G, injektován myši (100 mg/kg), nebyly pozorovány žádné změny v chování v průběhu alespoň

Μ «4 »♦ 44 44 44 • 4 4 444 4 * 4 4

4 444 4 4 444 4 4 4 4 • »4 4»· * · 44« · 4 ♦ •444 4444 4444

44 44 44 44 44 hodin, nejdelší doba testovaní. Dávky nezbytné pro detekci derivátů značených radioaktivním izotopem pomocí SPÉCT nebo PET by mohly být pod hodnotou této dávky.

Kongočerveň byla bezpečně inj ekto vána lidem v množstvích o mnoho větších, než které by se používaly pro radioaktivní deriváty chrysaminu G. Hodnota LD₅o pro kongočerveň byla 190 mg/kg myši (Tubis etal.,J. Amer. Pharm. Assoc. 49: 422 (1960)), což je velmi podobné u prokázané hodnoty LD50 (> 100 mg/kg) pro chrysamin G. Proto tyto dvě chemicky podobné sloučeniny zapříčiňují podobně nízké toxicity u myší.

Další deriváty chrysaminu G mohou být podobně testovány na toxicitu u myší a jiných vyšších savců inj ekto váním širokého rozpětí koncentrací a studováním různých projevů toxicity na zvířatech pomocí metod používaných v tomto oboru. K nahlédnutí Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7^th Ed.).

Příklad 8

Stanovení schopnosti chrysaminu G chránit před toxicitou indukovanou Αβ (25 - 35)

Chránění před toxicitou indukovanou Αβ (25 - 35) v buňkách PC-12

Krysí buňky feochromocytomu(PC-12) byly kultivovány v mediu RPMI 1640 s 10% fetálním hovězím séru. Přibližně 5,000 exponenciálně vykultivované buňky byly naočkovány do 96 plátů v objemu 100 μΐ media a přes noc se provedla inkubace při teplotě 37°C. Αβ (25 35), který se preagregoval při 37°C po dobu 7 dnů, se předinkuboval chrysaminem G (CG) nebo příslušnými sloučeninami ve vodném roztoku před přidáním 20 μΐ k dosažení daných finálních koncentrací (0,01 až 10 μΜ Αβ (25 - 35) a 0,03 do 20 μΜ CG). Buňky se inkubovaly po dobu 24 hodin před přidáním 13,3 μΐ MTT (5 mg/ml) (3,(4,5-dimethylthiazol2-yl)2,5-difenyltetrazoliumbromid) ve sterilním fyziologickém roztoku, který je tlumen fosfátem. Po 4,5 hodinách při teplotě 37°C se přidalo 100 μΐ extrakěního pufru (20% w/v SDS v 50% DMF/vodě; hodnota pH upravená na 4,7 2,5% kyseliny octové(80%) a 2,5% IN HCI) a pláty se inkubovaly přes noc. Hansen et al.,J. Immunol. Methods 119: 203 (1989). Vyvíjení barvy se pak měřilo při 560 nm. Maximální životnost byla definována jako absorbance kontrolních plátů, De kterým bylo přidáno pouze 20 μΐ destilované, deionizo váné H₂O. Maximální toxicita byla definována pláty, ve kterých byly buňky lyžovány přidáním 0,1% (finální koncentrace) Tritonu X-100.

·* ·* ** t· *« ν» »·» ·»» · ,« · « ··»« » »»·· · «· · » ·· · » · »« ··« * · · *··· *«·· ··* •9 ·9 99 ·· ··

Inkubace buněk PC-12 s Αβ(25 - 35) měla za výsledek na koncentraci závislé snížení schopnosti těchto buněk redukovat MTT (obrázek 12). Obrázek 12 ukazuje účinek zvyšujících se koncentrací Αβ (25 -35) v přítomnosti a absenci chrysaminu G na celulární redoxní aktivitu buněk PC-12, jak je měřeno redukcí MTT. Produkt redukce MTT absorbuje při 560 nm, což je nakresleno na vertikální ose. Účinek samotného Αβ(25 -35) je uveden ve vyplněných sloupcích a ukazuje na dávce závislé snížení redukce MTT. Signifikantní rozdíly od kontrolního vzorku (bez Αβ, bez chrysaminu G) jsou uvedeny v bílých číslech uvnitř vyplněných sloupců. Ochranný účinek 20 μΜ chrysaminu G je uveden v bííých(nevyplněných) sloupcích. Signifikantní rozdíly mezi redukcí MTT v přítomnosti a za absence chrysaminu G jsou uvedeny v černých číslech uvnitř bílých(nevyplněných) sloupců.

Obrázek 13 demonstruje ochranný účinek zvyšujících se koncentrací chrysaminu G proti Αβ(25 -35) indukované redukci celulární redoxní aktivity buněk PC12. Účinek chrysaminu G za absence Αβ(25 -35) je uveden ve plných sloupcích. Nebyl zde žádný signifikantní rozdíl mezi kontrolní (bez Αβ, bez chrysaminu G) a jakoukoliv koncentrací chrysaminu G za absence Αβ(25 -35). Redukce MTT v přítomnosti ΙμΜ Αβ(25 -35) a zvyšující se koncentrace chrysaminu G je uvedena v bílých(nevyplněných) sloupcích.

Signifikantní rozdíly při redukci MTT mezi přítomností a absencí Αβ(25 - 35) při každé koncentraci chrysaminu G jsou uvedeny v bílých číslech uvnitř plných sloupců. Signifikantní rozdíly při redukci MTT mezi kontrolním vzorkem Αβ(25 - 35) (bez chrysaminu G) a Αβ(25 - 35) plus vzrůstající koncentrace chrysaminu G jsou uvedeny uvnitř nevybarvených sloupců.

Jak již bylo dříve uvedeno^ chrání kongočerveň proti toxicitě indukované Αβ při koncentracích nad 2 μΜ. K dosažení plné ochrany je třeba 20 μΜ. Burgevin et al.,

NeuroReport 5: 2429 (1994); Lorenzo and Yankner, Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 12243 (1994);

Pollack et al., Neuroscience Letters 184: 113 (1995); Pollack et al., Neuroscience Letters 197:

211 (1995); Chrysamin G vykazuje ochranný účinek, který je závislý jak na koncentraci Αβ(25 -35) (obrázek 12), tak i na koncentraci samotného chrysaminu G (obrázek 13).

Ochranný účinek chrysaminu G je patrný při 0,2 μΜ, koncentrace velmi blízká ke Ki chrysaminu G pro vazbu na syntetický Αβ, 0,37 μΜ (obrázek 1). Chrysamin G se jeví jako více účinný než kongočerveň (vykazuje účinky v rozpětí od 0,1 do 1,0 μΜ). To je konsistentí s hodnotami Kj pro vazbu na syntetický Αβ 0,37 μΜ pro chrysamin G a 2,8 μΜ pro kongočerveň (obrázek 1).

• 4 4« 9» 44

9 444 4944 • 4 449 4 4 494 9 9 4 9 » 44 444 44 444 44 4 4444 4444 4444

4» 44 44 44 44 »4

V dalším experimentu (obrázek 14) byl zkoumán účinek chrysaminu G a fenolderivátů (obrázek 1), které nevážou Αβ, v buňkách inkubovaných ΙμΜ Αβ(25 - 35). Chrysamin G vykazoval ochranné účinky při 0,1 a 1 μΜ, ale fenolderivát nevykazoval žádné účinky a nejspíše zvyšuje toxicitu Αβ.

Tyto výsledky naznačují, že lipofilní deriváty kongočerveně, chrysaminu G, zabraňují cytotoxicitě indukované Αβ v buněčných kulturách při koncentracích velmi podobných k těm, při kterých vážou Αβ. Ochrana tímto způsobem představuje strukturální specifičnost, poněvadž fenolderivát, který se neváže na Αβ také nezabraňuje cytotoxicitě indukované Αβ.

Poněvadž se chrysamin G velmi dobře dostává do mozku, poskytují tyto výsledky doklad o tom, že chrysamin G a deriváty chrysaminu G vázající se na Αβ mají terapeutický potenciál při ošetření AD.

Mechanismus ochranného účinku chrysaminu G je zatím neznámý. Existují dvě možnosti vysvětlení. První, chrysamin G by mohl interferovat se shlukem Αβ. Druhá, chrysamin G by mohl interferovat s účinky (přímo nebo nepřímo) Αβ na cílové buňky.

Kongočerveň inhibuje shluky Αβ stejně tak jako chrání proti toxickým účinkům nakupení Αβ. Lorenzo and Yankner, Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 12243 (1994). Ve výše uvedených experimentech je interference se shlukem Αβ je nepravděpodobná, poněvadž Αβ byl před inkubací shlukován . Takto se může inhibice shlukování Αβ ukázat jako důležitý terapeutický účinek chrysaminu G, ale není vhodného vysvětlení pro ochranné účinky chrysaminu G proti předshluknutému Αβ. Model vazby chrysaminu G na Αβ uvedený v obrázku 7 ukazuje, jak by chrysamin G mohl „obalovat“ povrch Αβ. Toto se může měnit podle toho, jak se fibrilární depozita rozpoznávají receptory na povrchu buněk nebo jinými makromolekulami, takovými jako komplementární proteiny a interferovat s toxickými účinky Αβ, které mohou být zprostředkovány těmito makromolekulami. Je pravděpodobné, že chrysamin G a kongočerveň projevují vícenásobný účinek jak před, tak i po shlukování Αβ. To je velmi výhodné z terapeutického hlediska, poněvadž se jakýkoliv pacient pravděpodobně nachází ve stavu, kdy lze nalézt preexistující shluky Αβ, jakož i vytvářející se depozita amyloidu.

1. Na amyloid vázající se sloučenina vzorce (I) nebo její ve vodě rozpustná,

Claims (33)

1. PATENTOVÉ NÁROKY (Změněné) kde:

   CCQ je buď N=N-Q, CR'=N-Q, N=CR'-Q, CR'₂NR'-Q, NR'-CR'₂-Q, (CO)-NR'-Q, NR'-(CO)-Q nebo NR'-NR'-Q (přičemž substituent R'nezávisle reprezentuje atom vodíku nebo nižší alkylovou skupinu);

   XjeC(R”)₂ (přičemž každý substituent R je nezávisle atom vodíku, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH₂)_nOR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂-CH₂-F, OCH₂-CH₂-CH₂-F, CN, (C=O)-R', N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SR', COOR', Rph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž Rph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentú definovaných pro substituent R), tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   R • · · · · • · · · · · · • · (přičemž substituent R'je atom vodíku nebo nižší alkyl);

   nebo X je CR'=CR', N=N, C=O, O, NR' (přičemž R' reprezentuje atom vodíku nebo nižší alkyl), S, nebo SO₂;

   každý ze substituentů Ri a R₂ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F,

   Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR', kde index nje 1,2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂F, CH₂-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, CN, (OO)-R', N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SR', COOR', R_Ph, CR-CR'-R_Ph, CR'₂-CR'₂-R_Ph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R a R ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   R' (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

   ⁹ (přičemž substituenty Rg a Rg jsou nižší alkyl) nebo nebo

   N každý substituent Q je nezávisle vybrán ze skupiny následujících struktur, každá z nich obsahuje karboxylovou kyselinu nebo kyselině podobnou fDnkční skupinu vybranou ze skupiny sestávající z hydroxy skupiny, sulfhydrylu, tetrazolu, oxadiazolu, cyklického amidu, isoindol-l,3(2H)-dionu, benzisoxazolu, 2,3-benzodiazin-l,4(2H, 3H)-dionu, 2,3-benzoxazinl,4(3H)-dionu, (2H)l,3-benzoxazin-2,4(3H)-dionu, (3H)2-benzazin-l,3-(2H)-dionu nebo NO₂;

   IA, IB, IC, ID, IE, IF a IG, přičemž IA má následující strukturu:

   kde:

   každý ze substituentů R₃, R4, R5, Ró nebo R7 je nezávisle definován jako výše uvedená definice substituentu Ri a kde alespoň jeden ze substituentů R₃, R4, R5, Ró nebo R7 je hydroxy skupina, tetrazol, oxadiazol, NO₂ nebo karboxy skupina u obou substituentů Q;

   s podmínkou, že (i) jestliže sloučenina vzorce (I) je :

   pak alespoň jeden ze substituentů R¹ nebo R² je halogen;

   (ii) jestliže sloučenina vzorce (I) je :

   R₂ R₂ pak každý ze substituentů R*-R⁷ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR', kde index n je 1,2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂F, CH₂-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SH, trialkylcín, R_Ph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových • · · · substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   R' (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

   ⁹ (přičemž substituenty Rg a R9JS0U nižší alkyl) nebo (iii) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

   pak každý ze substituentů R⁴a R⁶ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z H, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR; kde index n je 1,2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂ch₂-ch₂-f, o-ch₂-ch₂-ch₂-f, n(r')₂, (c=o)N(R')₂, o(co)r; or; sh, coor; R_Ph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   R *8 • · · · ·

   9 9 99 9 4 4 99 (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy.

   R« (přičemž substituenty Rg a R₉jsou nižší alkyl) nebo nebo ,n.

   ,N.

   (iv) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

   pak každý ze substituentů R³a R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂),,OR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SH, Rph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   R’ (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

   *8 (přičemž substituenty Rs a R₉ jsou nižší alkyl) nebo ··· · ♦ · · · · · • · ··· · · ··· · · · · • · · ··· ·· ··· ·· · nebo

   N (v) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

   pak substituent R⁵vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R )₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, OH, SH, COOR', Rph, CR'=CR'-R_Ph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž Rph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   R' (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

   (přičemž substituenty Rs a Rg jsou nižší alkyl) nebo nebo

   N· (vi) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

   pak alespoň jeden ze substituentů R²-R³ a R⁷je vybrán ze skupiny sestávající z F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)„OR', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SH, COOR',

   Rph, CR -CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž Rph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových 1 2 substituentů definovaných pro substituenty R a R ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   • · ft ft ♦ ftft • ftftftft • ft ftft • ftft • ftftftft • ft ftft ft ftft ft • ftft · ftft ftft ftft ftft ftft ftft

   N'

   N (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

   ⁹ (přičemž substítuenty Rs a Rg jsou nižší alkyl) nebo nebo

   N nebo alespoň jeden ze substituentů R⁴ a R⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)„OR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SH,

   COOR (kde R je nižší alkyl), Rph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž Rph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substítuenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substítuenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   nebo (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

   ⁹ (přičemž substítuenty Rs a Rg jsou nižší alkyl) nebo nebo (vii) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

   pak substituenty R⁴ a R⁶ jsou vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, nižšího alkylu, (Cř^OR', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH2-CH2F, O-CH2-CH2-F, CH2CH2-CH2-F, 0-CH2-CH2-CH2-F, n(R)₂, no₂, (c=o)N(R)₂, o(co)r; or; sh, coor;

   Rph, CR=CR -Rph, CR'₂-CR '2-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R² ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   R' \

   N~ nebo

   -N

   Ν N (přičemž substituent R'je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

   r₅ (přičemž substituenty R« a R9 jsou nižší alkyl) nebo nebo (viii) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

   ·· ···· • · · pak substituent R² je vybrán ze skupiny sestávající (CH₂)_nOR', kde index n je 1,2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, no₂, (C=O)N(R')₂,O(CO)R', OH, SH, COOR', R_Ph, CR '=CR'-R_Ph, CR'₂-CR'₂-R_Ph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   R’ (přičemž substituent R'je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

   ,N ,N>

   (přičemž substituenty Rs a Rgjsou nižší alkyl) nebo

   4 4 «4 • · 4

   4 4 4 44 • 4 4 4 • 4 4 4 • 4 44

   4 4 4

   4 4 444

   4 4 4 4

   44 44 ♦ 4 4

   4 4 4

   44 4« nebo (ix) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

   pak substituenty R⁴ a R⁶ jsou vybrány ze skupiny sestávající z F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR', kde index nje 1,2 nebo 3, CF3, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂-CH₂-F, OCH₂-CH₂-CH₂-F, N(R j₂, NO₂, (C=O)N(R )₂, O(CO)R', OR', SH, COOR' (kde substituent R je nižší alkyl), Ra, CR =CR'-Ra, CR'₂-CR'₂-R_Ph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   R’ nebo

   N'

   N (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

   ⁹ (přičemž substituenty Rs a R9jsou nižší alkyl) nebo nebo

   N.

   φφφ φ • · t·· · • · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· ·

   9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

   ΦΦΦΦ ΦΦ 99 99 99 « φ * ·ΦΦ

   ΙΒ má následující strukturu:

   nebo kde:

   každý ze substituentů R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ nebo R¹⁶ je nezávisle definován jako výše definovaný substituent R¹ a kde alespoň jeden ze substituentů R^w, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ nebo R¹⁶ je hydroxy skupina, tetrazol, oxadiazol, NO₂ nebo karboxy skupina u obou substituentů Q;

   dále s podmínkou, že (x) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

   R.3 ^R12 \ /r\

   Rt Ri Ri Rt nebo

   R i R i Rt ^R12 ^R13 ^R10 ^R16

   12 Λ11

   pak alespoň jeden ze substituentů R¹ nebo R² je halogen a substituenty R¹⁰ a R¹¹ jsou stejné;

   ·♦ toto • ·· • · · toto • to ·· • «to · to toto · to* ·· • ·· • · ··* «··· ···· ···· «· ·· to* toto ·· ·· (xi) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

   ^R2 ^R2

   Q—N

   N—Q pak substituenty R¹¹ - R¹⁴ jsou vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH2-CH2F, O-CH2-CH2-F, CH₂CH2-CH2-F, 0-CH2-CH2-CH2-F, n(r')₂, no₂, (c=o)n(R)₂, o(co)r; or; sh, R_Ph, CR'=CR'-Rpi„ CR '₂-CR'₂-Rpi, (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentú definovaných pro substituenty R¹ a R² ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   nebo

   Vⁿ (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

   Rg

   I ⁹ (přičemž substituenty Rs a R9 jsou nižší alkyl) nebo nebo (xii) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

   • « ftftft* • · • ftftft ft ft • · pak substituenty R¹⁰, R¹⁵ a R¹⁶ jsou vybrány ze skupiny sestávající z H, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)„ORkde index n je 1, 2 nebo 3, CF% CH2-CH2F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, SH, Rp_h, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂Rph (přičemž Rpi, reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   nebo

   N' (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

   ⁹ (přičemž substituenty Rs a Ryj sou nižší alkyl) nebo nebo =>

   • · • ··« • · · ··· · · ··· Μ · * · · · · » · · ···« ·· ·· ·· ·* ·· ·· (xiii) pokud sloučenina vzorce (I) definuje jako N=CH-Q a substituent R¹⁶ jako COOH, pak substituent R¹⁰ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br,

   I, nižšího alkylu, (CH₂)„OR', kde index n je 1,2 nebo 3, CF₃, CH2-CH2F, O-CH2-CH2-F, CH₂-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR'(kde substituent R'je nižší alkyl), SH, COOR', Rph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž Rph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R² ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

   R' (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

   f^{8 9} (přičemž substituenty Rs a R9 jsou nižší alkyl) nebo nebo

   IC má následující strukturu:

   kde.

   každý ze substituentů R¹⁷, R¹⁸, R¹⁹, R²⁰ nebo R²¹ je definován jako výše definovaný substituent R¹;

   • 9 » · » • * ··« * 9 9 9

   9 9 9 9

   99 9 9

   99 99 • · 9

   9 9 999

   9 9 9 9

   99 99

   99 99

   9 9 9 9

   9 9 9 9

   9 9 9 « • · · · ·· ··

   ID má následující strukturu:

   kde:

   00 00 04 každý ze substituentú R , R neboR je nezávisle definován jako výše definovaný substituent R¹ \_/ ,c--reprezentuje heterocyklický kruh jednoho z následujících šesti vzorců:

   KO \ / c=c \

   /° N \ / c=c \ / c=c tj-o \ /

   O

   IE má následující strukturu:

   kde:

   každý ze substituentú R²⁵, R²⁶ nebo R²⁷ nezávisle je definován jako výše definovaný substituent R¹

   9 9 9

   9 9 999

   9 9 9 9

   9 9 9 9

   99 9 ·

   9 9 9 999

   9 9 9 9 ί» · 99

   9 9 9 9

   9 9 9 9

   9 9 9 9 • · · · ·* 99 \_/ reprezentuje heterocyklický kruh jednoho ze šesti následujících vzorců:

   \ / \ / \ / '_r__c C=C C=C „□-V- oáa ^N 8 m \ / c=c

   C==<^ ^=0 g-° \_/ /^{c c}\ 0=^ .0 lí kde:

   právě jeden ze substituentů R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹ nebo R³² je vazba spojení definovaná pro výše uvedený vzorec (I) a každý další substituent R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹ nebo R³² nezávisle je definován jako výše uvedený substituent R¹ a kde alespoň jeden ze substituentů R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹ nebo R³² je hydroxy skupina, sulfhydryl, tetrazol, oxadiazol, N0₂ nebo karboxy skupina u obou substituentů Q;

   kde:

   právě jeden ze substituentů R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶, R³⁷, R³⁸ nebo R³⁹ je vazba spojení definovaná pro výše uvedený vzorec (I) a každý další substituent R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶, R³⁷, R³⁸ nebo R³⁹ nezávisle je definován jako výše definovaný substituent R¹ a kde alespoň jeden ze substituentů R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶, R³⁷, R³⁸ nebo R³⁹ je hydroxy skupina, sulfhydryl, tetrazol, oxadiazol, NO₂ nebo karboxy skupina u obou Q;

   nebo kde:

   zCzQq je NR'-N=Q (přičemž substituent R' reprezentuje atom vodíku nebo nižší alkyl) a každý ^u je nezávisle vybrán z jedné z následujících skupin: IIA nebo IIB, kde:

   IIA má následující strukturu:

   ΦΦ ·· ·· Φ· kde:

   každý ze substituentů R⁴⁰ - R⁴⁷ nezávisle je H, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH2)nOR' kde index n je 1,2 nebo 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, O-CH2-CH2-CH2F, CN, (c=o)-r; n(R')2, no2, (c=o)N(R')2, o(co)r; or; sh, coor', r^p\ cr'=cr'-r^p\ CR'2-CR'₂-R^ph, (kde substituent R^ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu, vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů, definovaných pro substituent R¹), trialkyl cín, tetrazol nebo oxadiazol formy:

   R‘ (kde substituent R' je atom vodíku nebo nižší alkyl).

   IIB má následující strukturu:

   (113

   R49 kde:

   každý ze substituentů R⁴⁸ a R⁴⁹ je nezávisle nižší alkyl, (CH2)nOR' kde index n je 1,2 nebo 3, CF3, CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, CN, (C=O)-R', NO2, (C=O)N(R')2, COOR', (C=O)-(CH2)n-(C6H5) kde index n je 1, 2 nebo 3, R^Ph, CR'=CR'-R^Ph, CR'2-CR'₂-R^Ph (kde substituent R^ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituent R¹), tetrazol nebo oxadiazol formy:

   R* (kde substituent R' je atom vodíku nebo nižší alkyl kde alespoň jeden ze substituentů R⁴⁸ a R⁴⁹ je (C=O)R', NO₂, (C=O)N(R')₂, COOR', CN nebo tetrazol nebo oxadiazol formy:

   ··»· ·« ·*·· \ ¹¹ V^N (kde substituent R' je atom vodíku nebo nižší alkyl) u obou substituentů Q.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, kde alespoň jeden ze substituentů R1-R7 a R10-R49 je vybrán ze skupiny sestávající z Rph, CR'=CR'-Rph, CR'2-CR'2-Rph.
3. 3. Sloučenina podle nároku 1, kde alespoň jeden ze substituentů R1-R7 a R10-R49 je vybrán ze skupiny sestávající z ¹³¹I, ¹²³1, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F, ¹⁹F, ¹²⁵I, CH2-CH2-¹⁸F, O-CH2CH₂-¹⁸F, CH2-CH2-CH2-¹⁸F, O-CH2-CH₂-CH₂-¹⁸F a substituentu, který obsahuje uhlík, jak je

   11 17 specifikováno ve vzorci (I), kde alespoň jeden uhlík je C nebo C.
4. 4. Sloučenina podle nároku 1, kde se uvedená sloučenina váže na Αβ s disociační konstantou (Kd) mezi 0,0001 a 10,0 μΜ, pokud je měřena vazba na syntetický peptid Αβ nebo na tkáň mozku zasaženého Alzheimerovou nemocí.
5. 5. Způsob syntézy sloučenin podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň jeden ze substituentů R1-R7 a R10-R49 je vybrán ze skupiny sestávající z ¹³¹1, ¹²³1, ¹²⁵I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F a ¹⁹F, zahrnující krok značení sloučeniny podle nároku 1, kde alespoň jeden ze substituentů rLr⁷ a R¹⁰-R⁴⁹ je trialkylcín nebo triazen, reakcí sloučeniny podle nároku 1 s radioaktivně značeným halogenačním činidlem, které zahrnuje radioaktivně značenou látku vybranou ze skupiny sestávající z ¹³¹1, ¹²⁵1, ¹²³1, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F nebo ¹⁹F.
6. 6. Farmaceutický přípravek pro in vivo zobrazení depozit amyloidu vyznačující se tím, že obsahuje (a) sloučeninu podle nároku 3 nebo její sůl a (b) farmaceuticky přijatelný nosič.
7. 7. In vivo způsob detekce depozit amyloidu u subjektu vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

   • ft • ftftft

   100 (a) podání detekovatelného množství farmaceutického přípravku podle nároku 6 a (b) detekování vazby uvedené sloučeniny nebo její soli na depozita amyloidu u uvedeného subjektu.
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedená depozita amyloidu jsou lokalizována v mozku subjektu.
9. 9. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedený subjekt je podezřelý na nemoc nebo syndrom vybraný ze skupiny sestávající z Alzheimerovy nemoci, familiální Alzheimerovy nemoci, Downovy choroby a homozygotů pro alelu apolipoproteinu E4.
10. 10. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedené detekování je vybráno ze skupiny sestávající ze zobrazení gama záření, spektroskopie magnetické rezonance nebo zobrazení magnetické rezonance.

    /hl·/
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedené zobrazení gama záření je buď PET nebo SPÉCT
12. 12. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedený farmaceutický přípravek je podán intravenózní injekcí.
13. 13. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že poměr (i) vazby uvedené sloučeniny na místo v mozku jiné než malý mozek ku (ii) vazbě uvedené sloučeniny na malý mozek, v uvedeném subjektu, je porovnáno s uvedeným poměrem u zdravých subjektů.

    • · · · ft ft ft · • ft ftft ftft ftft ·· ··

    101
14. 14. Způsob inhibice degenerace buněk a toxicity spojené s formováním fibril při stavech spojených s amyloidózou, vyznačující se tím, že uvedený způsob zahrnuje krok, při kterém je aplikován subjektu majícímu nebo podezřelému na takovéto výše uvedené stavy farmaceuticky účinné množství chrysaminu G nebo jeho derivátů.
15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedený derivát chrysaminu G je na amyloid vázající se sloučenina vzorce (I) nebo její ve vodě rozpustná, netoxická sůl:

    kde:

    2OzO^Q jebud’N=N-Q, CR'=N-Q, N=CR'-Q, CR'₂NR'-Q, NR'-CR'₂-Q, (CO)-NR-Q, NR'-(CO)-Q nebo NR'-NR'-Q (přičemž substituent R'reprezentuje atom vodíku nebo nižší alkylovou skupinu);

    XjeC(R)₂ (přičemž každý substituent R je nezávisle atom vodíku, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH₂)_nOR', kde index n je 1,2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂-CH₂-F, OCH₂-CH₂-CH₂-F, CN, (C=O)-R', N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂,0(CO)R', OR', SR', COOR', Rph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituent R), trialkylcínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    • · · « · · · (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl);

    nebo X je CR-CR', N=N, C=O, O, NR' (přičemž R' reprezentuje atom vodíku nebo nižší alkyl), S, nebo SO₂;

    každý ze substituentů Ri a R₂ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂F, CH₂-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, CN, (C=O)-R', N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR ', SR', COOR', Rph, CR -CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Pi, reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    R' (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

    ⁹ (přičemž substituenty Rs a Rgjsou nižší alkyl) nebo nebo a alespoň jede ze substituentů R² není H, OCH₃, CH₃ nebo halogen, pokud je sloučenina vzorce (I) 1,4-diazobenzen;

    každý substituent Q je nezávisle vybrán ze skupiny následujících struktur, každá z nich obsahuje karboxylovou kyselinu nebo kyselině podobnou funkční skupinu:

    IA, IB, IC, ID, IE, IF a IG, přičemž IA má následující strukturu:

    44 4···

    444«

    44 ·· • 4 4 «

    4 · ·

    4 4 · · « · · ’

    103 _(ΙΑ) kde:

    každý ze substituentů R3, R4, R5, R6 nebo Ryje nezávisle definován jako výše uvedená definice substituentu Ri a kde alespoň jeden ze substituentů R3, R4, R5, Ró nebo Ryje hydroxy skupina, tetrazol, oxadiazol, NO₂ nebo karboxy skupina u obou substituentů Q a kde alespoň jeden ze substituentů R¹ nebo R² je halogen, pokud sloučenina vzorce (I) je 4,4'-diazobifenylova sloučenina;

    IB má následující strukturu:

    nebo kde:

    každý ze substituentů R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ nebo R¹⁶ je nezávisle definován jako výše definovaný substituent R¹ a kde alespoň jeden ze substituentů R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ nebo R¹⁶ je hydroxy skupina, sulfhydryl, tetrazol, oxadiazol, NO₂ nebo karboxy skupina u obou substituentů Q a kde alespoň jeden ze substituentů R¹ nebo R² je halogen, pokud sloučenina vzorce (I) je 4,4'-diazobifenylová sloučenina;

    IC má následující strukturu:

    kde:

    (IC) • 0

    104

    99 99 • · 9 • 999 9

    9 9 9 9 9

    9 9 9 9

    99 99

    9 099 9 ·

    99 99

    9 9 9

    0 0 9

    0 9 9

    0 9 0 9

    09 99 každý ze substituentů R¹⁷, R¹⁸, R¹⁹, R²⁰ nebo R²¹ je definován jako výše definovaný substituent R¹;

    ID má následující strukturu:

    kde:

    • o 22 23 24 * * každý ze substituentů R , R nebo R je nezávisle definován jako výše definovaný substituent R¹ \_/ ,c— reprezentuje heterocyklický kruh jednoho z následujících šesti vzorců:

    \_c==/ \₌/ \₌/ ₀X„X=0 ^0=,( /= “ b irs \ / c=c

    N—O

    H \ / r·—► r

    IE má následující strukturu:

    (ΙΞ) ·· ·· toto to· to · · · · * • · ·«· > · • ·· ··· ·· · ·· ·· • ·· · to ·· t • ·· · • ·· to • · ·· kde:

    každý ze substituentú R²⁵, R²⁶ nebo R²⁷ nezávisle je definován jako výše definovaný substituent R¹ \_/ ,c=c reprezentuje heterocyklický kruh jednoho ze šesti následujících vzorců:

    \=/ \ / c=c \ / c=c «0-^%· /° C=V \=‘ N ! 8 \ / c=c \ / c=c \=z C=<^ ^=0 N—0 H 0=ý 0 ‘Q

    IF má následující strukturu:

    • · 4 9

    4 4 9

    4 4 9 44

    4 4t 4 « 4 4 4

    49 49

    106 *4 94 4« 99 ·· · 4 9 4 9

    4 4 494 4 »9 4 • ·· 444 99 4 • ·· 4 4 44 9 ·· 44 44 44 kde:

    v přeSně jeden ze substituentů R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹ nebo R³² je ^Kz spojení definované pro výše uvedený vzorec (I) a každý další substituent R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹ nebo R³² nezávisle je definován jako výše uvedený substituent R¹ a kde alespoň jeden ze substituentů R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹ nebo R³² je hydroxy skupina, sulfhydryl, tetrazol, oxadiazol, NO₂ nebo karboxy skupina u obou substituentů Q;

    IG má následující strukturu:

    kde:

    ftftftft ftft ·· ftftftft • ftft ftftft ftftftft • ftftftft ft · ftftft · ftft ft • ftft ftftft ftft ftftft ftft · • ft* · · ftft · ft ftft ft • ft ftft ftft ftft ftft ftft

    107 právě jeden ze substituentů R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶, R³⁷, R³⁸ nebo R³⁹ je ^Kspojení definované pro výše uvedený vzorec (I) a každý další substituent R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶, R³⁷, R³⁸ nebo R³⁹ nezávisle je definován jako výše definovaný substituent R¹ a kde alespoň jeden ze substituentů R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶, R³⁷, R³⁸ nebo R³⁹ je hydroxy skupina, sulfhydryl, tetrazol, oxadiazol, NO₂ nebo karboxy skupina u obou Q;

    nebo kde:

    je NR'-N=Q (přičemž substituent R' reprezentuje atom vodíku nebo nižší alkyl) a každý je nezávisle vybrán z jedné z následujících skupin:

    IIA nebo IIB, kde:

    IIA má následující strukturu:

    kde:

    každý ze substituentů R⁴⁰ - R⁴⁷ nezávisle je H, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH2)nOR' kde index n je 1, 2 nebo 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, O-CH2-CH2-CH2F, CN, (c=o)-r;n(R')2,no2,(c=o)N(R')2,o(co)r;or;sr; coor;r^p\cr=cr'-r^p\ CR'2-CR'₂-R^ph, (kde substituent R^ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substítuenty fenylu, vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů, definovaných pro substituent R¹),trialkylcín, tetrazol nebo oxadiazol formy:

    R' (kde substituent R' je atom vodíku nebo nižší alkyl).

    IIB má následující strukturu:

    ···· ·*··

    108 (113)

    R₄9 kde:

    každý ze substituentú R⁴⁸ a R⁴⁹ nezávisle je nižšího alkylu, (CH2)nOR' kde index n je 1, 2 nebo 3, CF3, CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, CN, (C=O)-R', NO2, (C=O)N(R')2, COOR', (C=O)-(CH2)n-(C6H5) kde index n je 1,2 nebo 3, R^ph, CR'=CR'-R^ph, CR'2-CR'₂-R^Ph (kde substituent R^ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentú definovaných pro substituent R¹), tetrazol nebo oxadiazol formy:

    (kde substituent R' je atom vodíku nebo nižší alkyl) kde alespoň jeden ze substituentú R⁴⁸ a R⁴⁹ je (C=O)R', NO₂, (C=O)N(R')₂, COOR', CN nebo tetrazol nebo oxadiazol formy:

    (kde substituent R' je atom vodíku nebo nižší alkyl) u obou substituentú Q.
16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že alespoň jeden ze substituentú R1-R7 a R10-R49 je vybrán ze skupiny sestávající z Rph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph.
17. 17. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že každý substituent R₂ je CH₃, je N=N-Q.

    109 φφ »« • · « • · φφφ • · · · c Φ Φ Φ φφ φφ ·· φφ φ · φ • φφφφ • φ φ φ φ φ φ · • Φ φφ φφ φφ • φ φ φ φ φ φ ί • φ φ φ • φ φ φ φφ φφ
18. 18. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedené stavy spojené s amyloidózou jsou vybrány ze skupiny sestávající z: Alzheimerovy nemoci, Downovy choroby a diabetes mellitus typu 2, dědičné cerebrální krvácivé amyloidózy (holandská), amyloidu A(reaktivní), sekundární amyloidózy, familiální mediterranean horečky, familiální amyloidové nefropatie s kopřivkou a hluchotou (Muckle-wells Syndrome), amyloidu s lambda L-řetězecem nebo amyloidu s kappa L-řetězecem (idiopatický, spojený s myelomou nebo s markoglobulinemií) A beta 2M (chronická hemodialýza), ATTR (familiální amyloidové polyneuropatie (portugalská, japonská, švédská)), familiální amyloidové kardiomyopatie (dánská), izolovaného kardiálního amyloidu, soustavné senilní amyloidózy, AIAPP nebo inzulom amylinu, atriální natriuretického faktoru (izolovaný atriální amyloid), prekurzoru kalcitoninu (medulámí karcinom štítné žlázy), gelsolinu (familiální amyloidóza(finská)), cystatinu C (dědičná cerebrální hemoragie s amyloidózou (islandská)), AApo-A-I (familiální amyloidotická polyneuropatie - Iowa), AApo-A-II (urychlená senescence u myší), amyloidu přidruženého s fibrinogenem; a Asor nebo Pr P-27 (skrapie, Creutzfeld Jakobovy choroby, Gertsmann-Straussler-Scheinker syndromu, bovinní spongiformní encefalitidy) nebo osob, které jsou homozygotní pro alelu apolipoproteinu E4 a stavů spojených s homozygositou pro alelu apolipoproteinu E4 nebo Huntingtonovu nemoc.
19. 19. Farmaceutický přípravek pro prevenci proti degeneraci buněk a toxicitě spojené s formováním fibril při stavech spojených s amyloidózou, vyznačující se tím, že obsahuje chrysamin G a farmaceuticky přijatelný nosič.
20. 20. Farmaceutický přípravek pro prevenci proti degeneraci buněk a toxicitě spojené s formováním fibril při stavech spojených s amyloidózou, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1 nebo její sůl a farmaceuticky přijatelný nosič.
21. 21. Způsob detekce depozit amyloidu při biopsii nebo v posmrtné lidské nebo zvířecí tkáni, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

    (a) inkubaci tkáně fixované formalinem roztokem sloučeniny podle nároku 1 nebo její soli k formování značených depozit a po té (b) detekci značených depozit.

    ·· ····

    99 9999

    9 ·

    110

    9 9 9

    9 9 9

    9 9 9

    99 9

    99 99

    9 9 9

    9 9 9

    9 9 9

    9 9 9 9

    99 99
22. 22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedený roztok je složen z 25 - 100% ethanolu(zbytek je voda) nasyceného sloučeninou podle nároku 1 nebo její solí.
23. 23. Způsob podle nároku 21, vyznačuj ící se tím, zeje uvedená detekce provedena mikroskopickými technikami vybranými ze skupiny sestávající z mikroskopie pro pozorování v jasném poli, fluorescence, laserkonfokální nebo příčně polarizační mikroskopie.
24. 24. Způsob stanovení množství amyloidu při biopsii nebo v posmrtné tkáni, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

    (a) inkubaci derivátu chrysaminu G značeného radioaktivním izotopem s homogenátem biopsie nebo posmrtné tkáně, (b) separaci tkáně vázané od tkáně nevázané derivátem chrysaminu G značeného radioaktivním izotopem.

    (c) stanovení množství tkáně vázané derivátem chrysaminu G značeného radioaktivním izotopem, (d) konvertování jednotek tkáně vázané derivátem chrysaminu G značený radioaktivním izotopem na jednotky mikrogramů amyloidu na 100 mg tkáně porovnáním se standardem.
25. 25. Způsob stanovení množství amyloidu při biopsii nebo v posmrtné tkáni, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

    (a) inkubaci derivátu chrysaminu G značeného radioaktivním izotopem s homogenátem biopsie nebo posmrtné tkáně, (b) separaci tkáně vázané od tkáně nevázané derivátem chrysaminu G značeného radioaktivním izotopem.

    (c) stanovení množství tkáně vázané derivátem chrysaminu G značeného radioaktivním izotopem, (d) konvertování jednotek tkáně vázané derivátem chrysaminu G značený radioaktivním izotopem na jednotky mikrogramů amyloidu na 100 mg tkáně porovnáním se standardem kde uvedeným derivátem chrysaminu G značený radioaktivním izotopem vázající se na amyloid jsou sloučeniny vzorce (I) nebo ve vodě jejich rozpustná toxická sůl:

    111 kde:

    zQzQG j_{e buď n=N}.q_? CR-N-Q, N=CR'-Q, CR'₂NR'-Q, NR'-CR'₂-Q, (CO)-NR'-Q, NR'-(CO)-Q nebo NR'-NR'-Q (přičemž substituent R'reprezentuje atom vodíku nebo nižší alkylovou skupinu);

    XjeC(R)₂ (přičemž každý substituent R je nezávisle atom vodíku, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH₂)_nOR', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂-CH₂-F, OCH₂-CH₂-CH₂-F, CN, (C=O)-R', N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂,O(CO)R', OR', SR', COOR', Rph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituent R), tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    R' (přičemž substituent R'je atom vodíku nebo nižší alkyl);

    • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ·· ♦·

    112 nebo X je CR-CR', N-N, C=O, O, NR' (přičemž R' reprezentuje atom vodíku nebo nižší alkyl), S, nebo SO₂;

    každý ze substituentů Ri a R₂ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂F, CH₂-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, CN, (C=O)-R', N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SR', COOR', Rph, CR-CR -Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž Rph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    R’ \

    NN'

    N

    II

    -N nebo

    N' (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy.

    ,N (přičemž substituenty Rs a Rg jsou nižší alkyl) nebo nebo každý substituent Q je nezávisle vybrán ze skupiny následujících struktur, každá z nich obsahuje karboxylovou kyselinu nebo kyselině podobnou funkční skupinu vybranou ze skupiny sestávající z hydroxy skupiny, sulfhydrylu, tetrazolu, oxadiazolu, cyklického amidu, isoindol-l,3(2H)-dionu, benzisoxazolu, 2,3-benzodiazin-l,4(2H, 3H)-dionu, 2,3benzoxazin-1,4(3 H)-dionu, (2H) 1,3 -benzoxazin-2,4(3 H)-dionu, (3 H)2-benzazin-1,3 -(2H)dionu nebo NO₂;

    ΙΑ, IB, IC, ID, IE, IF a IG, přičemž IA má následující strukturu:

    »· · · 9 9 · · (ΙΑ)

    113 kde:

    každý ze substituentů R3, R4, R5, R$ nebo Ryje nezávisle definován jako výše uvedená definice substituentu Ri a kde alespoň jeden ze substituentů R3, R4, R₅, Ry, nebo Ryje hydroxy skupina, tetrazol, oxadiazol, NO₂ nebo karboxy skupina u obou substituentů Q;

    s podmínkou, že (i) jestliže sloučenina vzorce (I) je :

    N=N

    Ri R₂ • 1 9 · pak alespoň jeden ze substituentů R neboR je halogen;

    (ii) jestliže sloučenina vzorce (I) je :

    i pak každý ze substituentů R‘-R^z je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR\ kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂F, CH₂-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (CO)N(R')₂,0(CO)R', OR', SH,

    Rph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových

    494

    9 9 ·· ···· λ *

    1 9 substituentů definovaných pro substituenty R a R ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    R' \

    NN' 'N

    II

    -N nebo (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

    (přičemž substituenty Rg a Rgjsou nižší alkyl) nebo .Ν nebo /N

    N (iii) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

    pak každý ze substituentů R⁴a R⁶ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR; kde index n je 1,2 nebo 3, CF₃, CH2-CH2F, O-CH₂ch₂-f, CH2-CH2-CH2-F, o-ch₂-ch₂-ch₂-f, n(R')₂, (c=o)N(r')₂, o(co)r; or; sh, COOR', Rph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž Rph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R a R ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    R’ nebo

    Ν' • · • * · · I • · · · · • · 49 9 · « 4

    115 (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

    N Re (přičemž substituenty Rs a R₉ jsou nižší alkyl) nebo s·^/ nebo

    Ν· (iv) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

    pak každý ze substituentů R³a R⁷ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)„OR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', or; SH, Ra, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R² ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    nebo

    N'

    N (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

    R (přičemž substituenty Rs a R₉jsou nižší alkyl) nebo

    116 • · 9 9 • ·· 9 • 9 ·· (v) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

    nebo /^N<55· /^N nebo

    Rt Rt nebo pak substituent R⁵vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)nOR', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH2-CH2F, O-CH2-CH2-F, CH2-CH2CH₂-F, O-CH2-CH2-CH2-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, OH, SH, COOR', Rpi„ CR'=CR'-R_Ph, CRZ-CRZ-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se

    117 .......

    substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentú definovaných pro substituenty R^l a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    R' (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy;

    Ν' R₉ (přičemž substituenty Rs a R9 jsou nižší alkyl) nebo ,N ,N nebo (vi) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

    pak alespoň jeden ze substituentú R²-R³ a R⁷je vybrán ze skupiny sestávající z F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂ch₂-ch₂-f, o-ch₂-ch₂-ch₂-f, n(r% no₂, (c=o)N(r% o(co)r; or; sh, coor; Rph, CR -CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž Rph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentú definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    118

    R' • · φ» • φ φ φ φφφφ • · φ φ · • φ φ φ φφ φφ φ φ φ φ Φφφφ ♦ φ φ φ φ φ φ φ φ» ·· φφ φφ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ ·· φφ (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy.

    ⁹ (přičemž substituenty Rg a R₉ jsou nižší alkyl) nebo nebo nebo alespoň jeden ze substituentů R⁴ a R⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CHíjnOR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH2-CH2F, O-CH2-CH2-F, CH₂CH2-CH2-F, 0-CH2-CH2-CH2-F, n(R)₂, no₂, (c=o)N(r)₂, o(co)r; or; sh,

    COOR'(kde R je nižší alkyl), R_Ph, CR'=CR'-R_Ph, CRÚ-CRYRpí, (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R a R ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    nebo (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

    Ro (přičemž substituenty Rs a R9 jsou nižší alkyl) nebo nebo (vií) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

    119 • 4

    4 4 44 • 4 4 · • · 4 ·· 44 ♦ · 44 ► 4 4 > 4 ·«« • 4 ·« • 4 4 4 • 4 4 4

    4 4 4 4 • 4 4 4

    44 44 pak substituenty R⁴ a R⁶ jsou vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, nižšího alkylu, (CH₂)„OR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SH, COOR',

    Rph, CR'=CR '-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentu definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    nebo

    N'

    N (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

    N Rq (přičemž substituenty Rs a R9 jsou nižší alkyl) nebo nebo (viii) jestliže sloučenina vzorce (I) je;

    ftft ftft·· •ft **··

    120 ft ft ft ftft • ftft • ftft ft ftft ft ft potom substituent R² je vybrán ze skupiny sestávající z (CH₂)_nOR', kde index n je 1, 2 nebo

    3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, no₂, (C=O)N(R')₂,O(CO)R', OH, SH, COOR', R_Ph, CR =CR'-R_Ph, CR'₂-CR'₂-R_Ph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substítuenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substítuenty R a R ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    nebo

    N'

    N (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

    Ν' Rg (přičemž substítuenty Rg a Rgjsou nižší alkyl) nebo

    121

    4 · · • 4 444 • 4 4 4 • 4 4 4

    4 4 4 9

    44 94 • 4 9 • 4 999

    9 4 4 9 9 • · · ·

    44 44 •

    44 44

    4 4

    4 4 4 4 4 4 /Ν Ν nebo (ix) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

    N.

    w

    N—Q pak substituenty R⁴ a R⁶ jsou vybrány ze skupiny sestávající z F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂-CH₂-CH₂-F, OCH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SH, COOR' (kde substituent R' je nižší alkyl), R_Ph, CR '=CR-Rph, CR'₂-CR'₂-R_Ph (přičemž R_Ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R²), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    R' (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

    *8 (přičemž substituenty Rg a R<>jsou nižší alkyl) nebo γ nebo

    IB má následující strukturu:

    (IB)

    122 nebo kde:

    každý ze substituentů R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ nebo R¹⁶ je nezávisle definován jako výše definovaný substituent R¹ a kde alespoň jeden ze substituentů R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵ nebo R¹⁶ je hydroxy skupina, tetrazol, oxadiazol, NO₂ nebo karboxy skupina u obou substituentů Q;

    dále s podmínkou, že (x) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

    nebo

    R₂ R, Rj r₂

    Rl5 ^k16 ^r16 ^15 pak alespoň jeden ze substituentů R¹ nebo R² je halogen a substituenty R¹⁰ a R¹¹ jsou stejné;

    123 (xi) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

    R₂ pak substituenty Rⁿ - R¹⁴ jsou vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR; kde index nje 1, 2 nebo 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂CH2-CH2-F, 0-CH2-CH2-CH2-F, n(R)₂, no₂, (c=o)N(r)₂, o(co)r; or; sh, R_Ph, CR'=CR'-R_Ph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž Rph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R² ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    R' (přičemž substituent R je atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

    R (přičemž substituenty Rs a R9 jsou nižší alkyl) nebo (xii) jestliže sloučenina vzorce (I) je:

    ΦΦ φφ φφ

    124 φφ φ φ φ φφφ • φ φ φ φ φ • φ φφ • φ φ φ Φφφφ • φ φ • φ φ ·· ·· φ φ φφ φφ pak substituenty R¹⁰, R¹⁵ a R¹⁶ jsou vybrány ze skupiny sestávající z H, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)nOR', kde index n je 1, 2 nebo 3, CF₃, CH2-CH2F, O-CH2-CH2-F, CH2-CH2CH₂-F, O-CH2-CH2-CH2-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, SH, Rph, CR -CR-Rp_h, CR₂-CR₂Rph (přičemž Rph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R¹ a R² ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    R' (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

    ⁹ (přičemž substituenty Rg a R₉ jsou nižší alkyl) nebo • 99 9 9 0 9 9 9 9 • · ··· 9 9 9 99 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 « 9 9 9 9 9 9 9

    0 0 0 0 9 99 9 9 99 9

    99 99 «· 99 99 99

    125 (xiii) pokud sloučenina vzorce (I) definuje jako n=CH-Q a substituent R¹⁶ jako COOH, pak substituent R¹⁰ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, F, Cl, Br, I, nižšího alkylu, (CH₂)_nOR', kde index nje 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-F, CH₂CH₂-CH₂-F, O-CH₂-CH₂-CH₂-F, N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR'(kde substituent R'je nižší alkyl), SH, COOR', Rph, CR'=CR'-Rph, CR'₂-CR'₂-Rph (přičemž Rph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituenty R a R ), trialkycínu, tetrazolu nebo oxadiazolu formy:

    nebo

    Ν'

    N (přičemž substituent Rje atom vodíku nebo nižší alkyl) nebo triazen formy:

    zN zNs (přičemž substituenty Rs a R9 jsou nižší alkyl) nebo zN

    IC má následující strukturu:

    (IC) kde:

    každý ze substituentů R¹⁷, R¹⁸, R¹⁹, R²⁰ nebo R²¹ je nezávisle definován jako výše definovaný substituent R¹;

    • to toto « · e * · ··♦ • · · ·· • · · · ·· ·· ·· to to

    126 • «·· «· · to· · to « • · to ·

    ID má následující strukturu:

    kde:

    každý ze substituentú R²², R²³ nebo R²⁴ je nezávisle definován jako výše definovaný substituent R¹ reprezentuje heterocyklický kruh jednoho z následujících šesti vzorců:

    \ / \ / C=C c=c

    HO'

    Q-—

    C—C :=c.

    /

    IE má následující strukturu:

    nebo kde:

    každý ze substituentú R²⁵, R²⁶ nebo R²⁷ nezávisle je definován jako výše definovaný substituent R¹ • ··· • · · · • · · · ·« ··

    127 «

    • · · · ··«· ♦ · ♦♦ ·· ·>

    \ /

    C==c reprezentuje heterocyklický kruh jednoho ze šesti následujících vzorců:

    w \_/ ^c>°

    ΙΓ8 \ / c=c r° o

    kde:

    právě jeden ze substituentů R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹ nebo R³² je vazba ^xspojení definovaná pro výše uvedený vzorec (I) a každý další substituent R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹ nebo R³² nezávisle je definován jako výše uvedený substituent R¹ a kde alespoň jeden ze substituentů R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹ nebo R³² je hydroxy skupina, sulfhydryl, tetrazol, oxadiazol, N0₂ nebo karboxy skupina u obou substituentů Q;

    ftft ftftftft « · · ft ftft • ft · · ft · · ft

    128 • · ftft· · • · • · · • · · • ftft ftft ft • ft

    IG má následující strukturu:

    kde:

    právě jeden ze substituentů R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶, R³⁷, R³⁸ nebo R³⁹ je vazba spojení definovaná pro výše uvedený vzorec (I) a každý další substituent R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶, R³⁷, R³⁸ nebo R³⁹ nezávisle je definován jako výše definovaný substituent R¹ a kde alespoň jeden ze substituentů R³³, R³⁴, R³⁵, R³⁶, R³⁷, R³⁸ nebo R³⁹ je hydroxy skupina, sulfhydryl, tetrazol, oxadiazol, NO₂ nebo karboxy skupina u obou Q;

    nebo kde:

    zO^OQ je NR'-N=Q (přičemž substituent R' reprezentuje atom vodíku nebo nižší alkyl) a každý je nezávisle vybrán z jedné z následujících skupin:

    IIA nebo IIB, kde:

    IIA má následující strukturu:

    2= «45O «43

    44 ····

    129 •

    • •6 4994

    4 4

    Λ 4 4

    4 4 ·

    4 4 4

    4 4 4

    4 4 4

    44 4

    4 ·4

    4 4 4 • 4 4 • · · • 4 •

    « «4 kde:

    každý ze substituentů R⁴⁰ - R⁴⁷ nezávisle je H, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH2)„OR' kde index n je 1, 2 nebo 3, CF3, CH2-CH2F, O-CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, O-CH2-CH2-CH2F, CN, (c=o)-r; n(R')2, no2, (c=o)N(R')2, o(co)r; or; sh, coor; r^p\ cr '=cr'-r^p\ CR'2-CR'₂-R^ph, (kde substituent R^ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu, vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů, definovaných pro substituent R¹), trialkylcín, tetrazol nebo oxadiazol formy:

    R¹ (kde substituent R' je atom vodíku nebo nižší alkyl).

    IIB má následující strukturu:

    ί 113)

    R49 kde:

    každý ze substituentů R⁴⁸ a R⁴⁹ je nezávisle nižší alkyl, (CH2)nOR' kde index n je 1, 2 nebo 3, CF3, CH2-CH2F, CH2-CH2-CH2F, CN, (C=O)-R', NO2, (C=O)N(R')2, COOR', (C=O)-(CH2)„-(C6H5) kde index nje 1,2 nebo 3, R^ph, CR'=CR'-R^Ph, CR'2-CR'₂-R^Ph (kde substituent R^ph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substituenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituent R¹), tetrazol nebo oxadiazol formy:

    R* (kde substituent R' je atom vodíku nebo nižší alkyl) u obou substituentů Q.

    kde alespoň jeden ze substituentů R⁴⁸ a R⁴⁹ je (C=O)R', NO₂, (C=O)N(R')₂, COOR', CN nebo tetrazol nebo oxadiazol formy:

    130 • · • · ·· • · · · • ftft «

    II nebo

    Ν- tr

    Ν' (kde substituent R' je atom vodíku nebo nižší alkyl) u obou substituentů Q.
26. 26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že alespoň jeden ze substituentů R’-R⁷ a R¹⁰-R⁴⁹ je vybrán ze skupiny sestávající z R^ph, CR'=CR'-R^ph, CR'2-CR'2-R^Ph(přičemž Rph reprezentuje nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl se substítuenty fenylu vybranými z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro substituent R¹)
27. 27. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že alespoň jeden ze substituentů Η¹-!?⁷ a R¹⁰-R⁴⁹ je značen radioaktivním izotopem vybraným ze skupiny sestávající z ¹²⁵1,³H a substituentu, který obsahuje uhlík, jak je specifikováno ve vzorci (I), kde alespoň jeden uhlík je ¹⁴C.
28. 28. Způsob syntézy sloučeniny bifenylu podle nároku 1, vyznačující se tím, že

    Π 3 3 substituent R je H, zahrnující provedení reakce 3,3'-[ Hjbenzidinu s vybraným kondenzačním činidlem k získání sloučeniny podle nároku 1.
29. 29. Způsob rozlišení mozku zasaženého Alzheimerovou nemocí od normálního mozku, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    (a) oddělenou inkubaci stejnorodé části odvážené tkáně z každého (i) malého mozku a (ii) dalšího místa stejného mozku jiného než malý mozek, subjeku podezřelého na Alzheimerovu nemoc, s derivátem chrysaminu G značeným radioaktivním izotopem tak, aby se amyloid v každé uvedené stejnorodé části tkáně vázal s uvedeným derivátem chrysaminu G značeným radioaktivním izotopem;

    (b) stanovení množství amyloidu vázaného na uvedený derivát chrysaminu G značený radioaktivním izotopem pomocí;

    (b 1) separací tkáně vázané od tkáně nevázané derivátem chrysaminu G značeným radioaktivním izotopem.

    ·« 4444

    4 4

    4 4

    131 • 4

    4 4 • · • ·

    44 4444 ♦ · 4 • · * *·

    4 4 4 4 4 4 4 4

    4» (b2) stanovení množství tkáně vázané derivátem chrysaminu G značeného radioaktivním izotopem, a

    (b3) konvertování jednotek tkáně vázané derivátem chrysaminu G značeného radioaktivním izotopem na jednotky mikrogramů amyloidu na 100 mg tkáně porovnáním se standardem.

    (c) vypočtení poměru množství amyloidu v místě mozku jiném než malý mozek ku množství amyloidu v malém mozku;

    (d) porovnání poměru množství amyloidu v tkáni ze subjeku s podezřením na Alzheimerovu nemoc s poměry pro množství amyloidu v uvedené tkáni od normálních subjektů; a (e) stanovení přítomnosti Alzheimerovy nemoci, pokud poměr od mozku subjektu podezřelého na Alzheimerovu nemoc je nad 90 % poměru obdrženého z mozků normálních subjektů.
30. 30. Sloučenina podle nároku 1, kde funkční skupina podobná kyselině je poskytnuta funkčními skupinami, které obsahují ionizovatelný proton s pK_a menším než 10.
31. 31. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že funkční skupina podobná kyselině je poskytnuta funkčními skupinami, které obsahují ionizovatelný proton s pK_a menším než 10.
32. 32. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že funkční skupina podobná kyselině je poskytnuta funkčními skupinami, které obsahují ionizovatelný proton s pK_a menším než 10.
33. 33. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že reakce je vybrána ze skupiny reakcí sestávající z azokuplování, amidkuplování nebo formování Schiffovy báze a kde vybraná vývojka je vybrána ze skupiny sestávající z derivátu kyseliny salicylové nebo derivátu kyseliny naftoové.