NO330176B1 - Amyloidbindende forbindelse, fremgangsmater for fremstilling og anvendelse derav, farmasoytisk sammensetning for in vivo-avbilding og anvendelse derav - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår identifiseringen av forbindelser som er egnet for avbildning av amyloide avsetninger hos levende pasienter. Mer spesifikt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for avbildning av amyloide avsetninger i hjernen in vivo for å muliggjøre en ante /wor/ew-diagnose av Alzheimers sykdom. Foreliggende oppfinnelse angår også terapeutiske anvendelser av slike forbindelser.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Alzheimers sykdom ("AD") er en nevrodegenererende sykdom som erkarakterisertved hukommelsestap og andre typer kognitiv svikt. McKhann et al, Neurology 34: 939 (1984). Den er den mest vanlige årsaken til dementia i USA. AD kan opptre hos personer så unge som 40-50 år, men ettersom nærværet av sykdommen er meget vanskelig å bestemme uten farlig hjernebiopsi, så er utviklingstidspunktet ukjent. Forekomsten av AD øker med alderen, og det er beregnet at i befolkningen kan gruppen med Alzheimers sykdom være så høy som 40-50% ved en alder på 85-90 år. Evans et al, JAMA 262: 2551 (1989); Katzman, Neurology 43: 13 (1993).

I praksis vil AD definitivt bli diagnostisert ved en undersøkelse av hjernevev, vanligvis ved en autopsi. Khachaturian, Arch Neurol 42: 1097 (1985); McKhann et al, Neurology 34: 939 (1984). Nevropatologisk er sykdommenkarakterisert vednærværet av såkalte nevritiske plakk (NP), nevrofibrillære nøster eller floker (NFT) og nevrontap sammen med en rekke andre observasjoner. Mann, Mech. Ageing Dev. 31: 213 (1985). Post mortem snitt av hjernevev hos pasienter med Alzheimers sykdom viser et nærvær av amyloid i form av de proteinaktige ekstracellulære kjernene i de nevrittiske plakk som er så karakteristiske for AD.

De amyloide kjernene i disse nevrittiske plakk er sammensatt av et protein som kalles P-amyloid (AP) som i alt vesentlig er arrangert i en betafoldet platekonfigurasjon. Mori et al, Journal of Biological Chemistry 267: 17082 (1992); Kirschner et al., PNAS 83: 503 (1986). Nevrittiske plakk er et tidlig og alltid tilstedeværende aspekt av sykdommen. Mann et al., J. Neurol Sei. 89: 169; Mann, Mech Ageing Dev 31: 213 (1985); Terry et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol 46: 262 (1987).

En første avsetning av Ap skjer sannsynligvis lenge før de kliniske symptomene lar seg observere. De for tiden anbefalte "minimumsmikroskopiske kriterier" for diagnosen av AD er basert på antallet nevritiske plakk som finnes i hjernen. Khachaturian, Arch Neurol, supra (1985). Dessverre må tellingen av nevritiske plakk utsettes inntil pasienten er død.

Amyloidholdige nevritiske plakk er et fremtredende trekk i selektive områder av hjernen hos AD-pasienter så vel som i Downs syndrom og i personer som er homozygote for apolipoprotein E4-allelel som meget sannsynligvis utvikler AD. Corder et al, Science 261: 921 (1993); Divry, P., J. Neurol. Psych. 27: 643-657

(1927); Wisniewski et al, i Zimmerman, H.M. (red.): PROGRESS IN NEUROPATHOLOGY (Grune and Stratton, N.Y. 1973) sidenel-26. Hjerneamyloid lar seg lett påvise ved å farge hjernesnitt med tioflavin S eller kongorødt. Puchtler et al, J Histochem. Cytochem 10: 35 (1962). Kongorødtfarget amyloid erkarakterisertmed et tofarget utseende og viser en gulgrønn polariseringsfarge. Denne tofargede bindingen er et resultat av den betafoldede platestrukturen til amyloide proteinene. Glenner, G. N Eng. J. Med. 302: 1283 (1980). En detaljert diskusjon av biokjemien og histokjemien for amyloid kan finnes i Glenner, N Eng. J. Med, 302: 1333 (1980).

Så langt er diagnosen av AD blitt fastslått stort sett ved en bedømmelse av kliniske kriterier, hjernebiopsier og post mortem vevsundersøkelser. Forskningsforsøk på å utvikle metoder for å diagnostisere Alzheimers sykdom in vivo innbefatter (1) genetisk testing, (2) immunprøvemetoder og (3) avbildningsteknikker.

Bevis på at abnormaliteter i AP-metabolismen er nødvendig og tilstrekkelig for utviklingen av AD er basert på oppdagelsen av punktmutasjoner i AP-forløperproteinet i flere sjeldne familier som har en autosomal dominant form av AD. Hardy, Nature Genetics 1: 233 (1992); Hardy et al., Science 256: 184 (1992). Disse mutasjonene opptrer nær de N- og C-terminale spaltningspunktene som er nødvendige for utviklingen av Ap fra sitt forløperprotein. St. George-Hyslop et al, Science 235: 885 (1987); Kang et al., Nature 325: 733 (1987); Potter WO 92/17152. Genetisk analyse av et stort antall AD-familier har imidlertid vist at AD er genetisk heterogent. St. George-Hyslop et al, Nature 347: 194 (1990). Forbindelse til kromosom 21-markører er bare påvist i enkelte familier som har en tidlig utvikling av AD, og ikke i noen familier som har sen utvikling av AD. Nyligere er et gen på kromosom 14, hvis produkt er forutsagt å inneholde multiple transmembrandomener og ligner et integralt membranprotein, blitt identifisert av Sherrington et al, Nature 375: 754-760 (1995). Dette genet kan være ansvarlig for opp til 70% av de tilfeller hvor det skjer en tidlig utvikling av autosomalt dominant AD. Preliminære data antyder at denne kromosom 14-mutasjonen forårsaker en økning i produksjonen av Ap. Scheuner et al., Soc. Neurosci. Abstr. 21: 1500 (1995). En mutasjon på et meget likt gen er blitt identifisert på kromosom 1 hos volgatyskere med tidlig utvikling av AD. Levy-Lahad et al, Science 269: 973-977 (1995).

Screening for apolipoprotein E-genotypen er blitt foreslått som en mulig hjelp ved diagnosen av AD. Scott, Nature 366: 502 (1993); Roses, Ann Neurol. 38: 6-14

(1995). Det er imidlertid vanskeligheter med denne teknologien, fordi apolipoprotein E4-allelet bare er en risikofaktor for AD og ikke en sykdomsmarkør. Dette allelet er fraværende hos mange AD-pasienter og tilstede hos mange ikke-demente eldre personer. Bird, Ann Neurol. 38: 2-4 (1995). Immunanalysemetoder er blitt utviklet for å påvise nærværet av nevrokjemiske markører i AD-pasienter og for å påvise et AD-relatert amyloid protein i den cerebrale ryggmargsvæsken. Warner, Anal Chem. 59: 1203A (1987); WO 92/17152 av Potter; Glenner et al, U.S. patent nr. 4,666,829. Disse metodene for å diagnostisere AD har ikke vist seg å kunne påvise AD i alle pasienter, spesielt i tidlige trinn av sykdommen, og er relativt invaderende, ettersom de krever et uttak av spinalvæske. Det har også vært gjort forsøk på å utvikle monoklonale antistoffer som prober for avbildning av Ap. Majocha et al., J. Nucl. Med, 33: 2184 (1992); Majocha et al., WO 89/06242 og Majocha et al., U.S. patent 5,231,000. Hovedulempen ved antistoffprober er vanskeligheten med å få disse relativt store molekylene over blod-hjernebarrieren. Anvendelse av antistoffer for in vivo-diagnose av AD ville kreve markante abnormaliteter i blod-hjernebarrieren for å få adgang til selve hjernen. Det er ingen overbevisende funksjonelle bevis på at abnormaliteter i blod-hjernebarrieren eksisterer som sådan i AD. Kalaria, Cerebrovascular & Brain Metabolism Review 4: 226 (1992).

Radiomerket AP-peptid har vært brukt for å merke diffuse, kompakte og plakk av den nevritiske typen i snitt av AD-hjernen. Se Maggio et al, WO 93/04194. Disse peptidene har imidlertid de samme ulempene som antistoffene. Mer spesifikt vil peptidene normalt ikke krysse blod-hjernebarrieren i mengder som er tilstrekkelige for avbildning, og fordi disse probene reagerer med diffuse plakk, så kan de derfor ikke sies å være spesifikke for AD.

Den manglende evnen til å bedømme amyloid avsetning i AD inntil pasienten er død, svekker undersøkelsene av denne nedbrytende sykdommen. En fremgangsmåte for å kvantifisere amyloid avsetning før død er nødvendig både som et diagnostisk verktøy i milde eller klinisk uklare tilfeller, så vel som i en kontroll av effektiviteten med hensyn til de terapier som er brukt for å hindre Ap-avsetning. Det er derfor av meget stor viktighet å kunne utvikle en sikker og spesifikk metode for å diagnostisere AD før død ved å avbilde amyloid i hjerneparenkym in vivo. Skjønt det har vært gjort forskjellig forsøk på å diagnostisere AD in vivo, så er det for tiden ingen ante mortem- prober for hjerneamyloid. Ingen metode har anvendt en høyaffinitetsprobe for amyloid som har lav toksisitet, som kan krysse blod-hjernebarrieren og binder seg mer effektivt til AD-hjernen enn til en normal hjerne, for derved å kunne identifisere AD-amyloide avsetninger i hjernen før pasienten dør. Det eksisterer således ingen in v/vo-metode for AD-diagnose som oppfyller disse kriteriene.

Data antyder at amyloidbindende forbindelser vil ha et terapeutisk potensial i AD og type 2 diabetes mellitus. Morfologiske reaksjoner som innbefatter reaktiv astrocytose, dystrofisk nevritt, aktiverte mikrogliaceller, synapsetap og full komplementaktivering er påvist omkring nevritiske plakk, og de betegner alle de nevrotoksiske og cellenedbrytende prosesser som opptrer i områder inntil disse AP- avsetningene. Joachim et al, Am J. Pathol 135: 309 (1989); Masliah et al, loe eit. 137: 1293 (1990); Lue og Rogers, Dementia 3: 308 (1992). Ap-indusert nevrotoksisitet og cellenedbrytning er blitt rapportert i en rekke celletyper in vitro. Yankner et al, Science 250: 279 (1990); Roher et al, BBRC 174: 572 (1991); Frautschy et al, Proe. Nati Acad Sei 88: 83362 (1991); Shearman et al, loe eit 91: 1470 (1994). Det er blitt vist at en aggregering av Ap-peptidet er nødvendig for in vitro nevrotoksisitet. Yankner, Neurobiol. Aging 13: 615 (1992). Nylig har tre laboratorier rapportert resultater som antyder at kongorødt hemmer AP-indusert nevrotoksisitet og celledegenerering in vitro. Burgevin et al, NeuroReport 5: 2429

(1994); Lorenzo og Yankner, Proe. Nati Acad Sei 91: 12243 (1994); Pollack et al, Neuroscience Letters 184: 113 (1995); Pollack et al, Neuroscience Letters 197: 211 (1995). Mekanismen synes å innbefatte både hemming av fibrilldannelse og hindring av de nevrotoksiske egenskapene i de dannede fibrillene. Lorenzo og Yankner, Proe Nati Acad. Sei. 91: 12243 (1994). Det er også blitt påvist at kongorødt beskytter øycellene i bukspyttkjertelen fra den toksisiteten som er forårsaket av amylin. Lorenzo og Yankner, Proe. Nati Acad. Sei. 91: 12243 (1994). Amylin er et fibrillært peptid som ligner AP, og som akkumuleres i bukspyttkjertelen hos pasienter med diabetes mellitus type 2.

Det er velkjent at visse azofargestoffer så som kongorødt kan være karsinogent. Morgan et al, Environmental Health Perspectives, 102 (supp.) 2: 63-78, (1994). Denne mulige karsinogeniteten synes i alt vesentlig å være basert på det faktum at azofargestoffer blir sterkt metabolisert til det frie aminet ved hjelp av bakterier i tarmkanalen. Cerniglia et al, Biochem. Biophys Res Com., 107: 1224-1229,

(1982). I forbindelse med benzidinfargestoffer (og mange andre substituerte benzidiner), så er det det frie aminet som er karsinogent. Disse fakta har små implikasjoner for amyloidavbildningsundersøkelser, hvor en ekstremt liten mengde av et meget spesifikt radiomerket fargestoff vil bli injisert direkte inn i blodstrømmen. I dette tilfellet vil den mengden som administreres være helt neglisjerbar, og fargestoffet vil omgå bakteriene i tarmkanalen.

I forbindelse med terapeutisk anvendelse, vil disse fakta være av kritisk viktighet. Frigjøring av et kjent karsinogen fra en terapeutisk forbindelse er helt uakseptabelt. Et annet problem med diazofargestoffmetabolismen er at mye av det administrerte medikamentet blir metabolisert av bakterier i tarmkanalen før absorpsjon. Denne nedsatte biotilgjengeligheten forblir en ulempe, selv om de frigjorte metabolittene er ufarlige.

Tioflavin T er et basisk fargestoff som først ble beskrevet som et selektivt amyloid fargestoff i 1959 av Vassar og Culling { Arch. Pathol. 68: 487 (1959)). Schwartz et al. ( Zbl Path 106: 320 (1964)) var de første som viste anvendelsen av tioflavin S, et surt fargestoff, som et amyloid fargestoff i 1964. Egenskapene for både tioflavin T og tioflavin S har senere blitt undersøkt i detalj. Kelenyi J. Histochem Cytochem.

15: 172 (1967); Burns et al, J. Path. Bact. 94: 337 (1967); Guntern et al, Experimentia 48: 8 (1992); LeVine Meth. Enzymol. 309: 274 (1999). Tioflavin S er vanligvis brukt ved post wortøw-undersøkelser av amyloid avsetning i AD-hjernen og har vist seg å være en av de mest følsomme teknikkene for å påvise senilt plakk. Vallet et al, Acta Neuropathol 83: 170 (1992). Tioflavin T har ofte blitt anvendt som en reagens for å undersøke aggregeringen av løselige amyloidproteiner i betaplatefibriller. LeVine Prot Sei 2: 404 (1993). Kvaternære aminderivater som er beslektet med tioflavin T er blitt foreslått som amoylidavbildende midler, skjønt det ikke er blitt presentert noe bevis på et hjerneopptak av disse midlene. Caprathe et al U.S. patent 6,001,331.

Det eksisterer således et behov for amyloidbindende forbindelser som trenger inn i hjernen og som selektivt binder seg til amyloid.

Det eksisterer videre et behov for amyloidbindende forbindelser som er ikke-toksiske og biotilgjengelige og som følgelig kan brukes som terapeutika.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

En utførelse av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forbindelser som muliggjør en sikker og spesifikk metode for å diagnostisere AD før død ved en in vivo-avbildning av amyloid i hjerneparenkym.

En annen utførelse av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for å identifisere AD-amyloide avsetninger i hjernen før pasienten dør ved å bruke en høyaffinitetsprobe for amyloid som har lav toksisitet, som kan krysse blod-hjernebarrieren og som kan skille en AD-hjerne fra en normal hjerne.

I overensstemmelse med disse og andre utførelser av oppfinnelsen, er det følgelig i overensstemmelse med ett aspekt av oppfinnelsen, tilveiebrakt en amyloidbindende forbindelse som har en strukturene D eller et vannløselig, ikke-toksisk salt derav

hvor Z er S, NR', O eller CR', i hvilket tilfelle den korrekte tautomere formen av den heterosykliske ringen blir et indol, R' er H eller en Ci-Cs alkylgruppe: hvor Y er NR1 R2, OR<2>eller SR<2>; hvor nitrogenatomet i

ikke er et kvarternært amin;

hvori hver R 1 og R 2 uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av H, en d-C8alkylgruppe, (CH2)nOR' (hvor n = 1, 2 eller 3), CF3, CH2-CH2-CH2X (hvor X = F, Cl, Br eller I), (C=0)-R', Rph, og (CH2)nRph, hvor n = 1, 2, 3 eller 4 og Rphrepresenterer en usubstituert eller substituert fenylgruppe, og hvor fenylsubstituentene er valgt fra halogen eller Cj-Cs alkyl;

eller hvori hver R<3->R<10>uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av H, F, Cl, Br, I, en d-C»alkylgruppe, (CH2)nOR' (hvor n = 1, 2 eller 3), CF3, CH2CH2X, 0-CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X, 0-CH2-CH2-CH2X (hvor X = F, Cl, Br eller I), CN, (C=0)-R', N(R')2, N02, (C=0)N(R')2, 0(CO)R', OR', SR<*>, COOR', Rph, CR-CR'-Rph, CR2'-RPh(hvori Rpher som definert over og hvori R' er H eller en Ci-C8alkylgruppe), en trialkyltinngruppe og en chelaterende gruppe (med eller uten en chelatert metallgruppe) med formen W-L eller V-W-L, hvor V er valgt fra gruppen

bestående av -COO-, -CO-, -CH20- og -CH2NH-; W er -(CH2)nhvor n = 0, 1, 2, 3, 4 eller 5; og L er:

hvor M er valgt fra gruppen bestående av Tc og Re; eller hvor hver R og R<2>er en chelaterende gruppe (med eller uten en chelatert metallgruppe) med formen W-L, hvor W er -(CH2)n, hvor n = 2, 3, 4 eller 5; og L er: hvor M er valgt fra gruppen bestående av Tc og Re; og hvor hver R<1->R<10>uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av en chelaterende gruppe (med eller uten et chelatert metallion) av formen W-L og V-W-L, hvor V er valgt fra gruppen bestående av -COO- og -CO-; W er -(CH2)n, hvor n = 0, 1,2, 3, 4 eller 5; og Ler: og hvor R<15>uavhengig av hverandre er valgt fra en av de følgende gruppene:

hvori i det minste en av substituentene R<1->R<10>er en markør valgt fra gruppen bestående av13<1>1,<1>231,<76>Br,<75>Br,<18>F, CH2-CH2-X<*>, 0-CH2-CH2-X<*>, CH2-CH2-CH2-X<*>, 0-CH2-CH2-CH2-X<*>(hvor X*=<I>31I,1<23>I,<76>Br,<75>Br eller 18F), ,9F, 125I, en karbonholdig substituent som angitt ovenfor, hvor minst ett karbonatom er<n>C eller

og videre forutsatt at forbindelsen ikke er 5- 18fluor-2-(4'-amino-3'metylfenyl)-benzotiazol eller 6- 18fluor-2-(4' -amino-3' metylfenyl)benzotiazol.

I følge et aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der Z = S, Y = N, R<1>= H; og hvori R<2>er valgt fra gruppen bestående av (CH2)nOR' (hvor n = 1, 2 eller 3), CF3, CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X (hvor X = F, Cl, Br eller I), (C=0)-R', Rph, og (CH2)nRphhvor n = 1, 2, 3 eller 4; hvori når R<2>CH2RpherR<8>forskjellig fra CH3.

I følge et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der minst en av substituentene R<1->R<10>er valgt fra gruppen bestående av<]>311,<123>1,<76>Br,<75>Br,<18>F, CH2-CH2-X<*>, 0-CH2-CH2-X<*>, CH2-CH2-CH2-X<*>, O-CH2-CH2-CH2-X<*>(hvor X*=13,I,<123>I,<76>Br,<75>Br eller<18>F),<19>F, ,25I og en karbonholdig substituent som angitt i krav 1, hvor minst ett karbonatom er<n>C eller13C. 1 følge et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der Z = S, Y = N, R' = H, R<1>= H, R2 = CH3og R<3->R<10>er H.

I følge et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der Z = S, Y = 0, R' = H, R<2>= CH3og R<3->R<10>er H.

I følge et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der Z = S, Y = N, R* = H, R<1>"<4>= H, R<5>= I og R<6->R<10>er H.

I følge et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der Z = S, Y = N, R' = H, R<1-4>= H, R<5>= I, R8 = OH og R<6->R<7>og R<9->R<l0>erH.

I følge et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der Z = S, Y = N, R' = H, R<1>= H, R2 = CH2-CH2-CH2-F og R<3->R<10>er

H.

I følge et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der Z = S, Y = O, R* = H, R<2>= CH2-CH2-F og R<3->R<10>er H.

I følge et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der Z = S, Y = N, R' = H, R1"7=H, R8 =0-CH2-CH2-F og R<9->R<10>er

H.

I følge et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der Z = S, Y = N, R' = H, R1 = CH3, R<2>"<7>= H,R<8>=0-CH2-CH2-F og R9-R10 er Ff.

I følge et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der minst en av substituentene R " X -R 1 fl er valgt fra gruppen bestående av CN, OCH3, OH og NH2.

I følge et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der R<1>= H, R2 = CH3og R<8>er valgt fra gruppen bestående av CN, CH3, OH, OCH3og NH2.

I følge et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der R<3->R<7>ogR<9->R10er H.

I følge et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser med strukturen D, der forbindelsen binder seg til Ap med en dissosiasjons-koeffisient (Kq) mellom 0,0001 og 10,0 uM når dette blir målt ved binding til syntetisk Ap-peptid eller Alzheimers sykdomhjernevev.

I følge et annet aspekt ved forbindelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for å syntetisere en forbindelse ifølge oppfinnelsen hvor minst en av substituentene R<1->R<10>er valgt fra gruppen bestående av<1>311,125I,1231, 76Br,<75>Br,<18>F og,<9>F,

hvori fremgangsmåten omfatter et trinn for å merke en forbindelse ifølge krav 1, hvor minst en av substituentene R<1->R<10>er et trialkyltinn, ved å reagere forbindelsen med et<131>I-,125I-,<1>23I-, 7<6>Br-,<75>Br-,<18>F- og<19>F-holdig stoff.

I følge et annet aspekt ved forbindelsen tilveiebringes en farmasøytisk sammensetning for in vivo avbildning av amyloide avsetninger, omfattende (a) en forbindelse ifølge krav 1 og (b) en farmasøytisk akseptabel bærer.

I følge et annet aspekt består den farmasøytiske sammensetningen for in vivo-avbildning av amyloide avsetninger av (a) en forbindelse ifølge oppfinnelsen, hvor Z = S, Y = N, R<1>= H, og (b) en farmasøytisk akseptabel bærer.

I følge oppfinnelsen tilveiebringes også en anvendelse av en detekterbar mengde av det farmasøytiske preparatet i følge oppfinnelsen i en fremgangsmåte for fremstilling av et medikament for in vzvø-påvisning et amyloid avsetning i et individ. I følge en utførelsesform av nevnte anvendelse finnes amyloidavsetningene i hjernen til et individ. I følge en annen utførelsesform anvendes det farmasøytiske preparatet i følge oppfinnelsen ved mistanke om at individet har en sykdom eller et syndrom valgt fra gruppen bestående av Alzheimers sykdom, familiær Alzheimers sykdom, Downs syndrom og homozygoter for apolipoprotein E4-allelet.

I følge enda en oppfinnelse i henhold til dette aspekt er påvisningen valgt fra gruppen bestående av gammaavbildning, magnetisk resonnansavbildning og magnetisk resonnansspektroskopi. I følge ytterligere et annet aspekt skjer påvisningen ved gammaavbildning, og at gammaavbildningen enten er PET eller

SPECT.

I følge et ytterligere aspekt ved anvendelsen av en detekterbar mengde av det farmasøytiske preparatet ifølge oppfinnelsen sammenlikninges forholdet mellom (i) bindingen av forbindelsen til et hjerneområde som er forskjellig fra cerebellum og (ii) bindingen av forbindelsen til cerebellum i individet med forholdet i normale individer.

Ytterligere tilveiebringes en fremgangsmåte for å påvise amyloide avsetninger i biopsi eller post mortem humant vev eller dyrevev, hvori fremgangsmåten omfatter trinnene å (a) inkubere formalinfiksert eller ferskt frossent vev med en løsning av en forbindelse ifølge krav 1 for å danne en merket avsetning, og så (b) påvise de merkede avsetningene.

I et annet aspekt av denne fremgangsmåten inneholder løsningen fra 25 til 100% etanol, og hvor resten av løsningen er vann, og hvor løsningen er mettet med forbindelsen i følge oppfinnelsen.

I følge et annet aspekt ved fremgangsmåten i følge oppfinnelsen er løsningen sammensatt av en vandig buffer som inneholder fra 0 til 50% etanol, og hvor løsningen inneholder fra 0,0001 til 100 uM av forbindelsen i følge oppfinnelsen.

I følge ytterligere et aspekt ved denne fremgangsmåten i følge oppfinnelsen utføres påvisningen utføres ved en mikroskopiteknikk valgt fra gruppen bestående av klarfelt-, fluorescens-, laserkonfokal- og tverrpolariseringsmikroskopi.

I følge et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes også en fremgangsmåte for å kvantifisere mengden av amyloid i biopsi eller post mortem vev, hvori fremgangsmåten omfatter trinnene å a) inkubere et radiomerket derivat av en forbindelse ifølge oppfinnelsen med et homogenat av biopsi eller post mortem vev, hvor minst en av substituentene R<1->R<10>i forbindelsen er merket med en radiomarkør valgt fra gruppen bestående av<125>1,<3>H og en karbonholdig substituent som angitt i krav 1, og hvor minst ett karbonatom er<14>C, og b) separere det vevsbundede fra det ikke-vevsbundede radiomerkede derivatet av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, og

c) kvantifisere det vevsbundede radiomerkede derivatet av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, og endelig å d) omdanne enhetene av vevsbundet radiomerket derivat

av en forbindelse ifølge oppfinnelsen til enheter av mikrogram av amyloid pr 100 mg vev ved sammenligning med en standard.

I følge enda et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes også en fremgangsmåte for å skille en hjerne med Alzheimers sykdom fra en normal hjerne, hvori fremgangsmåten omfatter trinnene å a) oppnå vev fra (i) cerebellum og (ii) fra et annet område i samme hjerne, men forskjellig fra cerebellum, fra normale individer og fra individer hvor det er mistanke om Alzheimers sykdom; b) inkubere vevene med et radiomerket derivat av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, slik at amyloid i vevet binder seg til det radiomerkede derivatet av en forbindelse ifølge oppfinnelsen; c) kvantifisere mengden av amyloid som er bundet til det radiomerkede derivatet av en forbindelse ifølge krav 1 ved å administrere en påvisbar mengde av en farmasøytisk sammensetning som omfatter en forbindelse ifølge krav 1 med en farmasøytisk akseptabel bærer, og deretter påvise bindingen av forbindelsen til amyloidavsetningen i individet; d) beregne forholdet mellom mengden av amyloid i det hjerneområdet som er forskjellig fra cerebellum med mengden av amyloid i cerebellum; e) sammenligne forholdet for mengde av amyloid i vev fra normale individer med forholdet for mengde av amyloid i vev fra individer hvor det er mistanke om Alzheimers sykdom; og f) bestemme nærværet av Alzheimers sykdom hvis forholdet fra hjernen hos et individ hvor det er mistanke om Alzheimers sykdom er over 90% av forholdene oppnådd fra hjernene hos normale individer.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 Viser strukturene på et tioflavin S og tioflavin T; Figur 2 Viser strukturene for to tioflavinderivater ifølge foreliggende oppfinnelse; Figur 3 Viser fire seriesnitt som er fluorescerende farget fra den fremre hjernebarken hos en AD-pasient; Figur 4 Viser foreslåtte posisjoner for binding av krysamin G og tioflavin T i p-platefibriller; Figur 5 Viser en konkurranseanalyse ved å bruke krysamin G, tioflavin S og tioflavin T og derivater ifølge foreliggende oppfinnelse (BTA-O, BTA-1 og BTA-2); Figur 6 Viser tidsutviklingen for radioaktivitet i den fremre hjernebarken hos

bavianer injisert med merket BTA-1, g-Meo-BTA-1 og 6-Me-BTA-l; og

Figur 7 Viser et transvers positronemisjonstomografibilde av to nivåer i en

bavianhjerne etter i.v. injeksjon av [N-metyl-<n>C]BTA-l.

Figur 8 Viser post mortem- smii av humane og transgene musehjerner farget med

et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse (BTA-1).

Figur 9 Viser in v/vo-merking av amyloide plakk og vaskulært amyloid farget med et derivat ifølge foreliggende oppfinnelse (BTA-1) i levende transgene mus avbildet ved hjelp av multifotonmikroskopi.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse utnytter evnen til tioflavinforbindelser og deres radiomerkede derivater til å krysse blod-hjernebarrieren in vivo og binde seg til A(3 avsatt i nevritisk (men ikke diffuse) plakk, til Ap avsatt i cerebrovaskulært amyloid, og til det amyloid som består av proteinet avsatt i NFT. De foreliggende forbindelsene er ikke-kvaternære aminderivater av tioflavin S og -T som er kjente for å farge amyloid i vevssnitt og binde seg til syntetisk Ap in vitro. Kelenyi J Hislochem. Cytochem. 15: 172 (1967); Burns et al. J. Path. Bact. 94: 337 (1967); Guntern et al Experientia 48: 8 (1992); LeVine Meth. Enzymol 309: 274 (1999).

Tioflavinderivatene ifølge foreliggende oppfinnelse har hver de følgende egenskapene: (1) spesifikk binding til Ap in vitro og (2) evne til å krysse en ikke-kompromitert blod-hjernebarriere in vivo.

Slik det er brukt her for å beskrive tioflavinderivatene, betyr "lavere alkyl" en rett eller forgrenet CpCs-gruppe, fortrinnsvis C1-C6og mest foretrukket C1-C4(for eksempel metyl, etyl, propyl eller butyl). Når R'-R<14>er definert som "trialkyltinn", så er gruppen en tri-Ci-Cg-alkyl Sn-gruppe, fortrinnsvis tri-Ci-C6-alkyl Sn-gruppe, og mest foretrukket en tri-Ci-C4-alkyl Sn-gruppe (for eksempel metyl, etyl, propyl eller butyl).

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse bestemmer nærværet og plasseringen av amyloide avsetninger i et organ eller et kroppsområde, fortrinnsvis hjernen hos en pasient. Fremgangsmåten omfatter å administrere en påvisbar mengde av en farmasøytisk sammensetning som inneholder en amyloidbindende forbindelse med strukturen D slik disse er definert ovenfor, kalt en "påvisbar forbindelse" eller et farmasøytisk akseptabelt, vannløselig salt av disse, til en pasient. Med begrepet en "påvisbar mengde" menes at den mengden av den påvisbare forbindelsen som administreres, er tilstrekkelig til å kunne påvise at forbindelsen har bundet seg til amyloid. En "avbildende effektiv mengde" betyr at mengden av den påvisbare forbindelsen som administreres, er tilstrekkelig til at det er mulig å avbilde bindingen av forbindelsen til amyloid.

Oppfinnelsen anvender amyloidprober som sammen med ikke-invaderende nevroavbildende teknikker, så som magnetisk resonnansspektroskopi (MRS) eller avbildning (MRI), eller gammaavbildning så som positronemisjonstomografi (PET) eller enkeltfoton emisjonsberegnet tomografi (SPECT), blir brukt for å kvantifisere amyloid avsetning in vivo. Med begrepet "in vivo avbildning" forstås enhver fremgangsmåte som muliggjør påvisning av et merket tioflavinderivat som er valgt fra strukturene A-E eller F-J slik disse er beskrevet ovenfor. For gammaavbildning blir strålingen som blir emittert fra organet eller det området som undersøkes målt og uttrykt enten som total binding, eller som et forhold den totale bindingen i et vev blir normalisert til (for eksempel delt med) den totale bindingen i et annet vev hos det samme individet under den samme in vivo avbildningsprosedyren. Total binding in vivo er definert som hele det signalet som påvises i et vev ved en in vivo avbildningsteknikk uten at det er behov for korreksjon ved en andre injeksjon med en identisk mengde av en merket forbindelse sammen med et stort overskudd av en umerket, men ellers kjemisk identisk forbindelse. Et "individ" er et pattedyr, fortrinnsvis et menneske, og mest foretrukket et menneske hvor det er mistanke om demens.

For å utføre en in vivo avbildning, vil det påvisningsinstrumentet som er tilgjengelig være en avgjørende faktor ved valget av en gitt markør. For eksempel vil radioaktive isotoper og<19>F være spesielt godt egnet for in vivo avbildning i de foreliggende fremgangsmåtene. Den type av instrument som brukes vil gi en retningslinje for valget av radionukleid eller stabil isotop. For eksempel må det valgte radionukleidet ha en nedbrytningstype som lar seg påvise av en gitt type instrument. En annen betraktning angår radionukleidets halveringstid. Denne bør være tilstrekkelig langt til at det ennå lar seg påvirke på det tidspunktet da det skjer et maksimalt opptak i målet, men tilstrekkelig kort til at verten ikke blir utsatt for skadelig bestråling. De radiomerkede forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan påvises ved å bruke gammaavbildning, hvor det påvises en emittert gammastråling med passende bølgelengde. Fremgangsmåter for gammaavbildning innbefatter, men er ikke begrenset til, SPECT og PET. For SPECT-påvisning er det foretrukket at den valgte radiomarkøren vil mangle en partikkelemisjon, men vil produsere et stort antall fotoner i området fra 140 til 200 keV. For PET-påvisning, vil radiomarkøren være et positronemitterende radionukleid så som<19>F som vil forsvinne og danne to 511 keV gammastråler som vil bli påvist ved hjelp av et PET-kamera.

I den foreliggende oppfinnelsen blir det fremstilt amyloidbindende forbindelser/ prober som kan brukes for in v/vo-avbildning og kvantifisering av amyloid avsetning. Disse forbindelsene kan brukes sammen med ikke-invaderende nevroavbildningsteknikker så som magnetisk resonnansspektroskopi (MRS) eller - avbildning (MRI), positronemisjonstomografi (PET) og enkeltfoton emisjonsberegnet tomografi (SPECT). I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse kan tioflavinderivatene være merket med<19>F eller<I3>C for MRS/MRI ved hjelp av generelle organiske kjemiteknikker som er velkjente. Se for eksempel

March, J. ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY: REACTIONS, MECHANISMS,

AND STRUCTURE (3. utgave, 1985), hvis innhold her inngår som en referanse. Tioflavinderivatene kan også radiomerkes med<1>8F,nC,75Br eller<76>Br for PET ved teknikker som i seg selv er kjente, og som for eksempel er beskrevet av Fowler, J. og Wolf, A. i POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY (Phelps, M., Mazziota, J., og Schelbert, H. red.) 391-450 (Raven Press, NY 1986), hvis innhold her inngår som en referanse. Tioflavinderivatene kan også radiomerkes med<123>I for SPECT ved hjelp av flere

forskjellige kjente teknikker. Se for eksempel Kulkarni, Int. J. Rad. Appl. & Instr.

(Del B) 18: 647 (1991), hvis innhold her inngår som referanse. I tillegg kan tioflavinderivatene merkes med enhver egnet radioaktiv jodisotop så som for eksempel, men ikke begrenset til, I, I eller I ved jodinering av et diazotisert aminoderivat direkte via et diazoniumjodid, se Greenbaum, F. Am. J Pharm 108: 17 (1936), eller ved å omdanne det ustabile diazotiserte aminet til det stabile triazenet, eller ved å omdanne en ikke-radioaktiv halogenert forløper til et stabilt trialkyltinnderivat som så kan omdannes til jodforbindelsen ved flere fremgangsmåter som er velkjente. Se for eksempel Satyamurthy og Barrio J Org. Chem 48: 4394 (1983), Goodman et al, J Org Chem 49: 2322 (1984) og Mathis et al, J. Labell. Comp and Radiopharm. 1994: 905; Chumpradit et al, J. Med Chem. 34: 877 (1991); Zhuang et al, J. Med. Chem. 37: 1406 (1994); Chumpradit et al, J Med. Chem. 37: 4245 (1994). For eksempel kan et stabilt triazen- eller trialkyltinnderivat av tioflavin eller dets analoger reageres med halogeneringsmiddel som inneholder,<3>1I, ,25I,12<3>1,<76>Br,<75>Br,,<8>F eller<19>F. De

stabile trialkyltinnderivatene av tioflavin og deres analoger er således nye forløpere som kan brukes for syntese av mange radiomerkede forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse. Som sådan er disse trialkyltinnderivatene en utførelse av oppfinnelsen.

Tioflavinderivatene kan også radiomerkes med kjente metallradiomarkører så som

technetium-99m (<99m>Tc). Modifikasjon av substituentene for å innføre ligander som binder seg til slike metallioner kan utføres uten for omfattende eksperimentering av fagfolk som har kjennskap til radiomerking. Det metallradiomerkede tioflavinderivatet kan så brukes for å påvise amyloidavsetninger. Fremstilling av radiomerkede derivater av Tc<99m>er velkjent innen den organiske kjemien. Se for eksempel Zhuang et al., "Neutral and stereospecific Tc-99m complexes: [99mTc]N-benzyl-3,4-di-(N-2-mercaptoethyl)-amino-pyrrolidines (P-BAT)" Nuclear Medicine & Biology 26(2): 217-24, (1999); Oya et al., "Small and neutral Tc(v)0 BAT, bisaminoethanethiol (N2S2) complexes for developing new brain imaging agents" Nuclear Medicine & Biology 25(2): 135-40, (1998); og Hom et al., "Technetium-99m-labeled receptor-specific small-molecule radiopharmaceuticals: recent developments and encouraging results" Nuclear Medicine & Biology 24(6):'485-98,

(1997).

Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bruke isotoper som lar seg påvise ved kjernemagnetisk resonnansspektroskopi for in vzvø-avbildning og spektroskopi. Elementer som spesielt er brukbare ved magnetisk resonnansspektroskopi innbefatter 19F og<13>C.

Egnede radioisotoper for det foreliggende formålet innbefatter betaemittere, gammaemittere, positronemittere og røntgenemittere. Disse radioisotopene innbefatter<131>I,<123>I,<18>F,<n>C,<75>Br og<76>Br. Egnede stabile isotoper som kan brukes i magnetisk resonnansavbildning (MRI) eller -spektroskopi (MRS) ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefatterI9F og<13>C. Egnede radioisotoper for in vivo kvantifisering av amyloid i homogenater av biopsi eller post mortem- vev, innbefatter i TC I, i a C og n H. De foretrukne radiomarkørene er it C eller i oF for bruk i PET in vivo avbildning,123I for bruk i SPECT-avbildning,<19>F for MRS/MRI og<3>H eller<14>C for in vitro undersøkelser. Enhver hensiktsmessig og kjent fremgangsmåte for å visualisere diagnostiske prober kan imidlertid brukes i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse.

Fremgangsmåten kan brukes for å diagnostisere AD i milde eller klinisk uklare tilfeller. Denne teknikken vil også gjøre det mulig å utføre undersøkelser over lange tidsrom av amyloid avsetning i humane befolkningsgrupper hvor det er høy risiko for amyloid avsetning, for eksempel personer med Downs syndrom, familiær AD eller homozygoter for apolipoprotein E4-allelet. Corder et al, Science 261: 921

(1993). Fremgangsmåten gjør det mulig å følge den tidsmessige sekvensen med hensyn til amyloid avsetning og derved kunne bestemme hvorvidt avsetningen skjer lenge før demens begynner eller setter inn, eller hvis avsetningen ikke har noen forbindelse med demens. Denne fremgangsmåten kan brukes for å kontrollere effekten av de terapier som brukes for å hindre amyloid avsetning.

Generelt vil dosen av det påvisbare merkede tioflavinderivatet variere på bakgrunn av betraktninger så som alder, tilstand, kjønn og graden av sykdommen hos pasienten, og kontraindikasjoner hvis disse er tilstede i forbindelse med andre terapier, foruten andre variabler som må justeres av den behandlende legen. Dosen vil kunne variere fra 0,0001 jig/kg kroppsvekt til 10 p-g/kg, fortrinnsvis 0,01 |ig/kg til 1,0 jig/kg.

Administrering til individet kan være lokal eller systemisk, og kan utføres intravenøst, intraarterielt, intratekalt (via spinalvæsken) eller lignende. Administrering kan også være intradermal eller intrakavitær, avhengig av det kroppsområdet som undersøkes. Etter at det har gått tilstrekkelig tid til at forbindelsen har kunnet binde seg til amyloidet, for eksempel fra 30 minutter til 48 timer, så vil det området av individet eller pasienten som er under undersøkelse bli underkastet vanlig rutineavbildningsteknikker så som MRS/MRI, SPECT, planåer scintillasjonsavbildning, PET og enhver annen ønskelig avbildningsteknikk. Den nøyaktige protokollen vil nødvendigvis være avhengig av faktorer som er spesifikke for den enkelte pasient slik dette er angitt ovenfor, og avhengig av det kroppssted som skal undersøkes, administrasjonsmetoden og den type markør som brukes, og bestemmelse av de spesifikke fremgangsmåtene vil rutinemessig kunne bestemmes av den behandlende legen. For hjerneavbildning, vil fortrinnsvis mengden (total eller spesifikk binding) av det bundede radioaktivt merkede tioflavinderivatet eller en analog av dette ifølge foreliggende oppfinnelse, bli målt og sammenlignet (som et forhold) med den mengden av merket tioflavinderivat som er bundet til pasientens cerebellum. Dette forholdet blir så sammenlignet med det samme forholdet i en alderstilpasset normal hjerne.

Farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse blir fortrinnsvis administrert i form av injiserbare sammensetninger, men kan også opparbeides i velkjente medikamenttilførselssystemer (for eksempel oralt, rektalt, parenteralt (intravenøs, intramuskulært eller subkutant), intracisternalt, intravaginalt, intraperitonealt, lokalt (pulvere, salver eller dråper) eller som bukal eller nasal spray). En typisk sammensetning for et slikt formål omfatter vanligvis en farmasøytisk akseptabel bærer. For eksempel kan sammensetningen inneholde ca 10 mg av humant serum albumin og fra 0,5 til 500 mikrogram av det merkede tioflavinderivatet pr milliliter av fosfatbufferholdig NaCl. Andre farmasøytisk akseptable bærere innbefatter vandige løsninger, ikke-toksiske fortynningsmidler, inklusive salter, konserveringsmidler, buffere og lignende, slik det for eksempel er beskrevet i REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15. utgave, Easton: Mack Publishing Co. sidene 1405-1412 og 1461-1487 (1975) hvis innhold her inngår som en referanse.

Eksempler på ikke-vandige løsemidler er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer og injiserbare organiske estere så som etyloleat. Vandige bærere innbefatter vann, alkoholiske/vandige løsninger, saltløsninger, parenterale væsker så som natriumklorid, Ringers dekstrose etc. Intravenøse væsker innbefatter flytende løsninger for supplering av næringsstoffer. Konserveringsmidler innbefatter antimikrobielle midler, antioksidanter, chelaterende midler og inerte gasser. pH og den nøyaktige konsentrasjonen av de forskjellige komponentene i den farmasøytiske sammensetningen blir justert ifølge vanlige rutinemetoder innenfor den farmasøytiske industrien. Se Goodman og Gilman THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7. utgave).

Spesielt foretrukne farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse er de som i tillegg til den spesifikke bindingen til amyloid in vivo og som er i stand til å krysse blod-hjernebarrieren, også er ikke-toksiske ved passende doseringsnivåer og har en tilfredsstillende varighet med hensyn til effekt.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen, blir en farmasøytisk sammensetning som omfatter tioflavin amyloidbindende forbindelser administrert til individer hvor det er antatt at det er skjedd en amyloid eller amyloid fibrilldannelse. I den foretrukne utførelsen er et slikt individ et menneske, og innbefatter for eksempel de som har en risiko for å utvikle cerebralt amyloid, heri inngår den eldre ikke-demente befolkningen og pasienter med amyloidoseassosierte sykdommer og type 2 diabetes mellitus. Med begrepet "å hindre", forstås å innbefatte en lindring av celledegenerering og toksisitet som er assosiert med fibrilldannelse. Med begrepet "lindring" forstås en behandling eller å kunne hindre mer alvorlige former av celledegenerering og toksisitet i pasienter som allerede har manifestert tegn på toksisitet, så som demens.

Den farmasøytiske sammensetningen omfatter tioflavin amyloidbindende forbindelser som beskrevet ovenfor, og en farmasøytisk akseptabel bærer. I en utførelse vil en slik farmasøytisk sammensetning omfatte serum albumin, tioflavin amyloidbindende forbindelser og en fosfatbuffer som inneholder NaCl. Andre farmasøytisk akseptable bærere som innbefatter vandige løsninger, ikke-toksiske fortynningsmidler, inklusive salter, konserveringsmidler, buffere og lignende, er for eksempel beskrevet i REMINGTON<*>S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15. utgave, Easton: Mack Publishing Co. sidene 1405-1412 og 1461-1487 (1975) og THE NATIONAL FORMULARY XIV., 14. utgave Washington: American Pharmaceutical Association (1975) og UNITED STATES PHARMACOPEIA XVIII. 18. utgave Washington: American Pharmaceutical Association (1995), hvis innhold her inngår som referanser.

Eksempler på ikke-vandige løsemidler er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer og injiserbare organiske estere så som etyl ol eat. Vandige bærere innbefatter vann, alkoholiske/vandige løsninger, saltløsninger, parenterale væsker så som natriumklorid, Ringers dekstrose etc. Intravenøse væsker innbefatter flytende løsninger for supplering av næringsstoffer. Konserveringsmidler innbefatter antimikrobielle midler, antioksidanter, chelaterende midler og inerte gasser. pH og den nøyaktige konsentrasjonen av de forskjellige komponentene i den farmasøytiske sammensetningen blir justert ifølge vanlige rutinemetoder innenfor den farmasøytiske industrien. Se Goodman og Gilman THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7. utgave).

Ifølge foreliggende oppfinnelse, kan de foreliggende farmasøytiske sammensetningene administreres oralt, i form av en væske eller et fast stoff, eller kan injiseres intravenøst eller intramuskulært i form av en suspensjon eller løsning. Med begrepet "farmasøytisk effektiv mengde" forstås en mengde som hindrer celledegenerering og toksisitet som er assosiert med fibrilldannelse. En slik mengde vil nødvendigvis være avhengig av pasientens alder, vekt og tilstand, og vil lett kunne justeres av den behandlende legen i overensstemmelse med velkjente protokoller og fremgangsmåter. I en utførelse vil dosen være mellom 0,1 og 100 mg/kg pr dag, eller oppdelt i mindre doser som kan administreres fra to til fire ganger pr dag. Et slikt regime bør fortsette på daglig basis for resten av pasientens liv. Alternativt bør den farmasøytiske sammensetningen administreres intramuskulært i doser på fra 0,1 til 100 mg/kg pr uke i opptil seks uker.

Ifølge det aspektet av oppfinnelsen som angår en fremgangsmåte for å påvise amyloide avsetninger i biopsier eller post mortem-\ ev, så innbefatter fremgangsmåten å inkubere formalinfiksert vev i en løsning av den tioflavinamyloidbindende forbindelsen valgt fra strukturene A-E eller F-J slik dette er beskrevet ovenfor. Det er foretrukket at løsningen inneholder fra 25 til 100 % etanol (mens resten er vann) mettet med en tioflavin amyloidbindende forbindelse ifølge oppfinnelsen. Ved innkuberingen vil forbindelsen farge eller merke amyloidavsetningene i vevet, hvoretter de fargede eller merkede avsetningene kan påvises eller visualiseres ved enhver standardmetode. En slik påvisning kan utføres ved hjelp av mikroskopiske teknikker så som lysfelt-, fluorescens-, laserkonfokal-og tverrpolariseringsmikroskopi.

Fremgangsmåten for å kvantifisere mengden av amyloid i biopsi eller post mortem vev innbefatter å inkubere et merket derivat av tioflavin ifølge foreliggende oppfinnelse, eller et av dets vannløselige, ikke-toksiske salter, med et homogenat av en biopsiprøve eller et post mortem- vev. Vevet kan oppnås og homogeniseres ved fremgangsmåter som i seg selv er kjente. Den foretrukne markøren er en radiomarkør, skjønt det også er mulig å bruke andre markører, for eksempel enzymer, kjemiluminescerende og immunofluorescerende forbindelser av velkjent type. Den foretrukne radiomarkøren er<125>I,14C eller<3>H, og den foretrukne markørsubstituenten er minst en av R<3->R<14>for en amyloidbindende forbindelse valgt fra strukturene A-E eller F-J. Vev som inneholder amyloidavsetninger vil binde seg til de merkede derivatene av tioflavin amyloidbindende forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse. Det bundede vevet kan så skilles ut fra ubundet vev ved hjelp av enhver velkjent fremgangsmåte, for eksempel filtrering. Det bundede vevet kan så kvantifiseres ved hjelp av enhver fremgangsmåte som er velkjent innen den organiske kjemien. Enhetene av vevsbundet radiomerket tioflavinderivat kan så omdannes til enheter av mikrogram av amyloid pr 100 mg vev, ved sammenligning med en standardkurve utviklet ved å inkubere kjente mengder av amyloid med det radiomerkede tioflavinderivatet.

Fremgangsmåten for å skille en hjerne med Alzheimers sykdom fra en normal hjerne, innbefatter å oppnå vev fra (i) cerebellum og (ii) et annet område i den samme hjernen, men forskjellig fra cerebellum, fra normale individer og fra individer hvor det er mistanke om Alzheimers sykdom. Slikt vev kan så opparbeides til separate homogenater ved hjelp av fremgangsmåter som i seg selv er kjente, og så inkuberes med en radiomerkede tioflavin amyloidbindende forbindelse. Den mengde av vev som binder seg til den radiomerkede tioflavin amyloidbindende forbindelsen kan så beregnes for hver vevstype (det vil si cerebellum, ikke-cerebellum, normal og unormal) og deretter kan forholdet mellom bindingen i ikke-cerebellum- og til cerebellumvevet beregnes for vev fra normale individer for vev fra pasienter hvor det er mistanke om Alzheimers sykdom. Disse forholdene kan så sammenlignes. Hvis forholdet fra hjernen hvor det er mistanke om Alzheimers sykdom er over 90% av de forhold som oppnås fra normale hjerner, så vil dette gi en diagnose på Alzheimers sykdom. De normale forholdene kan oppnås fra tidligere kjente data, eller alternativt kan de beregnes på nytt samtidig som det mistenkte hjernevevet undersøkes.

Molekylær modellering

Molekylær modellering ble utført ved å bruke datamodellprogrammet Alchemy2000 (Tripost, Inc. St. Louis, MO) for å utvikle A(3-peptidkjedene i en anti-parallell betaplatekonformasjon. Kirschner et al., Proe. Nati Acad Sei. U. S. A. 83: 503

(1986). Amyloidpeptidene ble plassert i hårnålssløyfer (Hilbich et al., J. Mol. Biol. 218: 149 (1991)) og brukt uten ytterligere strukturell finjustering. Ap-peptidene ble parallellsammenlignet slik at de alternerende kjedene ble skilt med en avstand på 4, 76 Å, noe som er karakteristisk for betaplatefibriller. Kirschner, supra. Tioflavin T-derivatene ble så energiminimalisert og parallellsammenlignet med fibrillmodellen for å maksimalisere kontakten med Asp-23/Gln-15/His-13 i AP(l-42).

Karakterisering av spesifikk binding til AP-syntetisk peptid: Affinitet, kinetikk og maksimal binding

Karakteristika for tioflavinderivatbinding ble analysert ved å bruke syntetisk AP(1-40) og 2-(4'-[<n>C]metylamino-fenyl)benzotiazol ([N-metyl-<n>C]BTA-l) i fosfatbufret saltløsning (pH 7,0) eller glysinbuffer/20% etanol (pH 8,0) slik det tidligere er beskrevet for krysamin-G-binding. Klunk et al. Neurobiol. Aging 15: 691 (1994).

Aminosyresekvens for Afi( l- 40) er som følger:

Fremstilling av tioflavinderivater for vevsfarging

Både tioflavin S (ThS) og tioflavin T (ThT) ble brukt som farmakoforer (se for eksempel figur 1). Det skal bemerkes at begge forbindelsene inneholder kvaternære aminer, noe som gjør at de blir relativt hydrofile.

[C-14]ThT ble syntetisert og brukt for å bestemme den relative lipofiliteten ved deling mellom oktanol og en fosfatbufret saltløsning. Logaritmeverdien for delingskoeffisienten, logPoct, var 0,57 for [C-14]ThT. Det ble bestemt at det kvaternære aminet gjorde ThT for polart til at kan brukes som et effektivt hjerneavbildningsmiddel. Basert på resultatene av lipofile kongorødtderivater

(fenoler uladet ved fysiologisk pH, men potensielt ioniserbare med en pKapå ~8,5)

(Klunk et al. WO09634853A1, WO09847969A1, WO09924394A2), så fjernet de foreliggende oppfinnere metylgruppen fra benzotiazolringatomet i ThT-derivatene. Denne fjerningen av metylgruppen eliminerte det ladede kvaternære aminet fra den heterosykliske delen av molekylet, noe som ga et aromatisk amin som typisk har pKb-verdier på ~5,5. Det er brukt stenografisk nomenklatur for ThT-derivatene når den basiske hovedkjeden er betegnet BTA (for Benzotiazolanilin). Substituentene på benzotiazolringen er plassert før "B", og antallet metylgrupper på anilinnitrogenatomet er plassert etter "A" (se for eksempel figur 2).

i. Preliminær vevsfarging med ThT og derivater

ThT (se for eksempel figur 1) er et fluorescerende fargestoff som har vært brukt som et histologisk fargestoff for amyloid (Burns et al., "The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T" Journal of Pathology & Bacteriology 94: 337-344; 1967). ThT farger svakt plakk (se for eksempel figur 3), nervebunter, nevrofile tråder og cerebrovaskulært amyloid (CVA) i en AD-hjerne. Preliminær vevsfarging viser at både det primære aminet 2-(4'aminofenyl)-6-metyl-benzotiazol (6-Me-BTA-O) og det tertiære aminet (2-(4'-dimetylaminofenyl)-6-metyl-benzotiazol (6-Me-BTA-2) også farger plakk og nervebunter i post mortem AD-hjerne (se for eksempel figur 3). Eksperimenter hvor konsentrasjonene av 6-Me-BTA-0 og 6-Me-BTA-2 ble progressivt nedsatt, viste at farging med både 6-Me-BTA-0 og 6-Me-BTA-l kunne enda påvises med fargeløsninger som bare inneholdt 10 nM av BTA-forbindelsen. I motsetning til dette synes BTP (2-fenylbenzotiazol) ikke å farge plakk, og denne forbindelsen er også imidlertid ikke på langt nær så fluorescerende som BTA-derivatene. Ved utviklingen av disse forbindelsene, ble således vevsfargingen brukt både for å bedømme spesifiteten med hensyn til farging i AD-hjernevev så vel som å bedømme bindingsaffiniteten ved å undersøke fargende løsninger over et større konsentrasjonsområde, på lignende måte som det ble brukt i bindingsprøvene.

ii. Bindingsmodeller for kongorødtderivater og ThT til AP

Det foreligger visse teorier med hensyn til bindingsmekanismen for ThT til P-amyloid, men ingen spesifikk teori er blitt bevist eller allment akseptert. Mekanismen synes imidlertid å være spesifikk og mettbar (LeVine, "Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T" Meth. Enzymol. 309: 272-284; 1999). Det skulle således være mulig å lokalisere de mulige bindingssetene på Ap og utvikle en bindingsmodell på en måte som er analog til det som ble brukt for å utvikle kongorødt (CR)/krysamin-G (CG) bindendingsmodellen (Klunk et al., "Developments of small molecule probes for the beta-amyloid protein of Alzheimers disease" Neurobiol Aging 15: 691-698; 1994) basert på de følgende strukturelle og bindende egenskapene. For det første har ThT og CG motsatte ladninger ved fysiologisk pH, og det er derfor usannsynlig at de har et felles bindingssete. Dette er understøttet ved mangelen på konkurranse for ThT for [<3>H]CG-binding til AP-fibriller (se for eksempel figur 5).

Tidligere strukturelle studier av AP-fibriller (Hilbich et al., "Aggregation and secondary structure of synthetic amyloid beta A4 peptides of Alzheimer's disease" Journal of Molecular Biology 218: 149-63; 1991) og CR- og CG-binding til Ap-fibriller, antyder en molekylær modell hvor CG binder seg gjennom en kombinasjon av elektrostatisk og hydrofob interaksjon til området for Lys-16 (se for eksempel figur 4). Undersøkelsene til LeVine (LeVine ibid) hjalp til å lokalisere setet for

. ThT-binding til A(3 ved å vise at ThT binder seg bra til A012-28, men neglisjerbart til AP25-35. Dette antyder at ThT-bindingssetene ligger et sted mellom gruppene 12 og 24 på Ap. Det er sannsynlig at det positivt ladede ThT (et kvaternært amin) vil bli tiltrukket av negativt ladede (sure) grupper på Ap. Mellom aminosyrene 12 og 14 er Glu-22 og Asp-23 de eneste sure gruppene. Mens begge disse to er kandidater, så vil den eksisterende modellen forutsi at Glu-22 inngår meget nær Lys-16-bindingssetet for CG. Den "arbeids"-modellen som for tiden brukes lokaliserer ThT-bindingen til området omkring Asp-23, det vil si på den motsatte siden av fibrillen i forhold til det foreslåtte CG-setet. Ettersom et viktig trekk ved ThT- (og CG) binding er et nærvær av en betaplatefibrill, så må bindingen kreve mer enn akkurat en enkelt aminosyregruppe. Bindingssetet opptrer når grupper som normalt ikke virker sammen i monomerer bringes sammen i betaplatefibrillen. Uten derfor å være bundet til en spesifikk teori, så er det derfor antatt at ThT også virker via hydrogenbindinger til His-13 og Gin-15 i et separat, men tilstøtende AP-molekyl som omfatter betaplatefibrillen. iii. Radiomerking av ThT og radioligandbindingsprøver Undersøkelse av binding ved hjelp av vevsfarging kan blant annet brukes for å bedømme eller undersøke spesifitet. Forbindelsen BTP som ikke er særlig fluorescerende, viser heller ikke farging fordi den ikke binder seg tilstrekkelig godt nok, eller for at den ikke er tilstrekkelig fluorescerende. I tillegg til AD-vevsfargingen, så kan kvantitative bindingsprøver utføres spektrofotometrisk (LeVine ibid). Denne prøven er avhengig av et metakromatisk spektralskift som skjer når ThT binder seg til amyloidfibrillen. Skjønt denne prøven kan brukes for individuelt å undersøke sterkt fluorescerende forbindelser som viser dette metakromatiske skiftet, så er den hittil ikke blitt angitt å kunne brukes for konkurranseprøver. Det er for eksempel vanlig observert at prøveforbindelsene (for eksempel CG) stopper fluorescensen for ThT-AP-komplekset (så vel som ThT alene). Forbindelser som har denne egenskapen, men som ikke binder seg til ThT-setet, vil falskt synes nettopp å være bindende.

Det er derfor foretrukket å bruke radiomerket ThT i typiske radioligandbindingsprøver med aggregert Ap. I denne prøven vil en inhibering av radiomerket ThT-binding til AP være fanget inn på filtre, virkelig representerer en inhibering av ThT-binding, og krever således ikke at prøveforbindelsen er sterkt fluorescerende.

EKSEMPLER

Alle de reagenser som ble brukt i syntesene ble kjøpt fra Aldrich Chemical Company og ble brukt uten ytterligere rensing. Smeltepunktene ble bestemt på Mel-TEMP II og er ukorrigerte. 'H NMR-spektrene for alle forbindelsene ble målt på et Bruker 300-apparat ved å bruke TMS som indre referanse, og var i overensstemmelse med de angitte strukturene. TLC ble utført ved å bruke silikagel 60 F254fra EM Sciences, og påvist under en UV-lampe. Flashkromatografi ble utført på silikagel 60 (230-400 mesh) kjøpt fra Mallinckrodt Company. Den reversfase TLC ble kjøpt fra Whiteman Company.

Synteseeksempler

Eksempel 1: Syntese av primulinbasederivater:

Syntesevei 1: Eksempel på syntesen av primulinforbindelser ifølge det reaksjonsskjemaet som er vist nedenfor:

Primulinderivatene ble fremstilt basert på Schuberts metode (Schubert, M. Zur Kenntnis der Dehydrothiotoluidin- and Primulin-sulfosåuren, Justus Liebigs Ann. Chem. 558, 10-33, 1947) ved en kondensering av 2-amino-5-metyltiofenol med 2-(p-nitrofenyl)benzotiazol-6-karboksylsyreklorid og en etterfølgende reduksjon av nitrogruppen med tinnklorid i etanol. Substituerte derivater av primulinbasen ble syntetisert med passende substituerte p-nitrobenzoylklorider og R<7->R<10->substituerte 2-aminotiofenoler.

Ved å bruke den samme strategien som ovenfor, ble de andre angitte primulinderivatene syntetisert ved å anvende det passende substituerte 3-merkapto-4-aminobenzosyrederivatet (for eksempel 2-, 5- eller 6-metyl-3-merkapto-4-aminobenzosyre), det passende 4-nitrobenzoylkloridderivatet (for eksempel 2- eller 3-metyl-4-nitrobenzoylklorid) eller det passende 2-amino-5-metyltiofenolderivatet (for eksempel 3,5-, 4,5- eller 5,6-dimetyl-2-aminotiofenol).

Eksempel 2: Syntese av 2-[2-(4'aminofenyl)etylenyl]benzotiazolderivater Syntesevei 3: Eksempler på syntesen av BTEA-O, 1, 2 og BTAA-O, 1, 2 som er representative for gruppen av BTEA- og BTAA-forbindelser, ble utført ved hjelp av det nedenforstående reaksjonsskjemaet:

(a) 7>ans-2-(4-nitrofenyletenyl)benzotiazol (11)

fran.y-4-nitrocinnamylklorid 10 (1,77 g, 9,5 mmol, 1,2 ekvivalenter) i 20 ml DMF ble dråpevis tilsatt en løsning av 2-aminotiofenol 9 (1,0 g, 8,0 mmol) i 15 ml DMF ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur over natten. Den ble så helt over i 100 ml av en løsning av 10% natriumkarbonat. Bunnfallet ble frafiltrert under redusert trykk. Omkrystallisering fra metanol ga 1,92 g (85,1%) av produktet 11.

(b) 2-(4-aminofenyletenyl)benzotiazol (12)

En blanding av 2-(4-nitrofenyletenyl)benzotiazol 11 (500 mg, 1,7 mmol) og tinn(II)kloriddihydrat (1,18 g, 5,2 mmol) i 20 ml vannfri etanol ble kokt under tilbakeløp under nitrogen i 4 timer. Etanolen ble så fjernet ved vakkumfordampning. Resten ble løst i 20 ml etylacetat, vasket med 3 x 20 ml av en 1 N NaOH-løsning og 3 x 20 ml vann og så tørket over magnesiumsulfat. Fordampning til tørrhet ga 40 mg (8,0%) av produktet 12.

(c) 2-(4-metylaminofenyletenyl)benzotiazol (13)

En blanding av 2-(4-aminofenyletenyl)benzotiazol 12 (7 mg), 3,9 mg Mel og 100 ml vannfri K2C03i 0,5 ml vannfri DMSO ble holdt på 100°C i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble renset ved revers fase TLC (metanol:vann = 7:1), noe som ga 2,5 mg (32,7%) av produktet 13.

(d) 2-(4-aminofenyletylen)benzotiazol (14)

2-(4-nitrofenyletenyl)benzotiazol (30 mg, 0,10 mmol) ble løst i 10 ml metanol. 40 mg Pd/C (10%) ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble rørt i en hydrogenatmosfære ved romtemperatur i 60 timer. Katalysatoren ble frafiltrert og vasket med 2 ml metanol. Fordampning av filtratet ga råproduktet som ble renset med TLC (heksanenetylacetat = 70:40), og dette ga 15 mg (50%) av produktet. 'H NMR (300 MHz, MeOH-d4) 5: 7,88 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7), 7,86 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-4), 7,48 (dd, J, = J2= 6,2 Hz, 1H, H-5 eller H-6), 7,38 (dd, J, = J2= 8,2 Hz, 1H, H-5 eller H-6), 6,96 (d, J = 6,8 Hz, 2H, H-2<*>, 6<*>), 6,62 (d, J = 6,8 Hz, 2H, H-3', 5'), 3,36 (t, J = 7,4 Hz, 2H, CH2), 3,03 (t, J = 7,4 Hz, 2H, CH2).

(e) 2-(4-dimetylaminofenyletenyl)benzotiazol (16)

En blanding av 2-aminotiofenol 9 (0,51 g, 4,1 mmol) trans-4-dimetylaminokanelsyre 14 (0,79 g, 4,1 mmol) og 10 g PP A ble holdt på 220°C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og så helt over i 400 ml av en 10% kaliumkarbonatløsning. Resten ble frafiltrert under redusert trykk. Rensing ved flashkromatografi (heksanenetylacetat = 2:1) ga 560 mg (48,7%) av produkt 15 som et gult fast stoff.

(f) 2-(4-dimetylaminofenyletylen)benzotiazol (17)

2-(4-dimetylaminofenyletenyl)benzotiazol (12 mg, 0,038 mmol) ble løst i 5 ml metanol. 20 mg Pd/C (10%) ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble rørt i en hydrogenatmosfære ved romtemperatur i 16 timer. Katalysatoren ble frafiltrert og

vasket med ca 1 ml metanol. Fordampning av filtratet ga 7 mg (58%) av produktet.<!>H NMR (300 MHz, aceton-d4) 8: 7,97 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7), 7,93 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-4), 7,48 (dt, J = 6,2 Hz, J = 1,1 Hz 1H, H-5 eller H-6), 7,38 (dt, J = 8,2 Hz, J = 1,1 Hz, 1H, H-5 eller H-6), 7,13 (d, J = 6,8 Hz, 2H, H-2', 6'), 6,68 (d, J = 6,8 Hz, 2H, H-3', 5'), 3,37 (t, J = 7,4 Hz, 2H, CH2), 3,09 (t, J = 7,4 Hz, 2H, CH2), 2,88 (s, 6H, NMe2).

Eksempel 3: Syntese av 2-(4'-aminofenyl)bcnzotiazolderivater

Syntesevei 1: Eksempel på syntesen av 6-MeO-BTA-O, -1,-2 som er representative for gruppen av BTA-forbindelser med substituenterR7-R<10>så vel som R<3->R<6>(Shi et al., "Antitumor Benzothiazoles. 3. Synthesis of 2-(4-Aminophenyl)benzothiazoles and Evaluation of Their Activities against Breast Cancer Cell Lines in Vitro and in Vivo" J. Med. Chem. 39: 3375-3384, 1996):

(a) 4-metoksy-4'-nitrobenzanilid (3)

p-anisidin 1 (1,0 g, 8,1 mmol) ble løst i 15 ml vannfri pyridin og så tilsatt 4-nitrobenzoylklorid 2 (1,5 g, 8,1 mmol). Reaksjonsblandingen ble hensatt ved romtemperatur i 16 timer. Den ble så helt over i vann og bunnfallet frafiltrert under vakuumtrykk og vasket med 2x10 5% natriumbikarbonat. Produktet 3 ble brukt i neste trinn uten ytterligere rensing.<*>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 10,46 (s, 1H, NH), 8,37 (d, J = 5,5 Hz, 2H, H-3', 5'), 8,17 (d, J = 6,3 Hz, 2H, H-2', 6'), 7,48 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 6,97 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 3,75 (s, 3H, MeO).

(b) 4-metoksy-4'nitrotiobenzanilid (4)

En blanding av 4-metoksy-4'-nitrotiobenzanilid 3 (1,0 g, 3,7 mmol) og Lawessons reagens (0,89 g, 2,2 mmol, 0,6 ekvivalenter) i 15 ml klorbenzen ble kokt under tilbakeløp i 4 timer. Løsemiddelet ble fordampet, og resten ble renset ved flushkolonne (heksan:etylacetat = 4:1), og dette ga 820 mg (77,4%) av produkt 4 som et oransje fast stoff.<!>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 8,29 (d, 2H, H-3', 5'), 8,00 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-2', 6'), 7,76 (d, 2H), 7,03 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 3,808,37 (d, J = 5,5 Hz, 2H, H-3', 5'), 8,17 (d, J = 6,3 Hz, 2H, H-2', 6'), 7,48 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 6,97 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 3,75 (s, 3H, MeO). (s, 3H, MeO).

(c) 6-metoksy-2-(4-nitrofenyl)benzotiazol (5)

4-metoksy-4'-nitrotiobenzanilid 4 (0,5 g, 1,74 mmol) ble fuktet med ca 0,5 ml etanol og så tilsatt 30% vandig natriumhydroksidløsning (556 ml, 13,9 mmol, 8 ekvivalenter). Blandingen ble fortynnet med vann til en sluttløsning/suspensjon på 10% vandig natriumhydroksid. Porsjoner av denne blandingen ble med 1 minutts mellomrom tilsatt en rørt løsning av kaliumferricyanid (2,29 g, 6,9 mmol, 4 ekvivalenter) i 5 ml vann ved 80-90°C. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet i ytterligere 30 minutter og så hensatt for avkjøling. Bunnfallet ble frafiltrert under vakuum og vasket med vann, og deretter renset ved hjelp av flushkolonne (heksametylacetat = 4:1), og dette ga 130 mg (26%) av produkt 5. 'H NMR (300 MHz, aceton-d6) 8: 8,45 (m, 4H), 8,07 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-4), 7,69 (s, 1H, H-7), 7,22 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-5), 3,90 (s, 3H, MeO).

(d) 6-metoksy-2-(4-aminofenyl)benzotiazol (6)

En blanding av 6-metoksy-2-(4-nitrofenyl)benzotiazol 5 (22 mg, 0,077 mmol) og tinn(II)kloriddihydrat (132 mg, 0,45 mmol) i kokende etanol ble rørt under nitrogen i 4 timer. Etanolen ble fordampet, og resten ble løst i 10 ml etylacetat, og så vasket med 2 ml 1 N natriumhydroksid og så 5 ml vann og til slutt tørket over magnesiumsulfat. Fordampning av løsemiddelet ga 19 mg (97%) av produktet 6 som et gult fast stoff.

(e) 6-metoksy-2-(4-metylaminofenyl)benzotiazol (7) og 6-metoksy-2-(4-dimetylaminofenyl)benzotiazol (8)

En blanding av 6-metoksy-2-(4-aminofenyl)benzotiazol 6 (15 mg, 0,059 mmol), Mel (8,3 mg, 0,060 mmol) og K2C03(100 mg, 0,72 mmol) i 0,5 ml vannfri DMSO ble holdt på 100°C i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble renset ved revers fase TLC (metanohvann = 7,1), og dette ga 2,0 mg (13,3%) av 6-metoksy-2-(4-metylaminofenyl)benzotiazol 7 og 6 mg (40% ) av 6-metoksy-2-(4-dimetylaminofenyl)benzotiazol 8.<*>H NMR av 7 (300 MHz, aceton-d6) 8: 7,85 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-2' 6'), 7,75 (dd, J = 8,8 Hz, J = 1,3 Hz, 1H, H-4), 7,49 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-7), 7,01 (dd, J = 8,8 Hz, J = 2,4 Hz, H-5), 6,78 (d, J = 7,6 Hz, 2H, H-3' 5'), 3,84 (s, 3H, MeO), 2,91 (s, 3H, NMe), 'H NMR av 8 (300 MHz, aceton-d6) 8: 7,85 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-2' 6'), 7,75 (dd, J = 8,8 Hz, J = 1,3 Hz, 1H, H-4), 7,49 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-7), 7,01 (dd, J = 8,8 Hz, J = 2,4 Hz, H-5), 6,78 (d, J = 7,6 Hz, 2H, H-3' 5'), 3,84 (s, 3H, MeO), 3,01 (s, 6H, NMe2).

Ved å bruke den samme strategien som beskrevet ovenfor, så kan de andre 2-(4'-aminofenyl)benzotiazolderivatene syntetiseres ved å anvende passende substituerte anilinderivater (for eksempel 2-, 3- eller 4-metylanilin) og et passende 4-nitrobenzoylkloridderivat (for eksempel 2- eller 3-metyl-4-nitrobenzoylklorid).

Eksempel 4: Syntese av BTA-derivater uten R<7->R<10->substitusjon

Syntesevei 2: Eksempel på syntesen av BTA-O, -1, -2-forbindelser som er representative for gruppen av BTA-forbindelser uten R 7 -R 1 fl (Garmaise et al., "Anthelmintic Quaternary Salts. III. Benzothiazolium Salts" /. Med. Chem. 12: 30-36 1969):

(a) 2-(4-nitrofenyl)benzotiazol (19)

En løsning av 4-nitrobenzoylklorid (1,49 g, 8,0 mmol) i 10 ml vannfri benzen ble dråpevis tilsatt 2-aminotiofenol (1,0 g, 8,0 mmol) i 10 ml benzen ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble så rørt i 16 timer. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 20 ml vann. Det vandige laget ble utskilt og ekstrahert med 3 x 10 ml etylacetat. De samlede organiske lagene ble så tørket og fordampet. Råproduktet ble renset ved flushkolonne (heksametylacetat = 85:15), noe som ga 1,5 g (83,2%) av produktet som et lysegult fast stoff.

(b) 2-(4-aminofenyl)benzotiazol (20)

En blanding av 2-(4-nitrofenyl)benzotiazol (105 mg, 0,40 mmol) og

tinn(II)kloridhydrat (205 mg, 0,91 mmol) i 20 ml etanol ble kokt under tilbakeløp i nitrogenatmosfære i 4 timer. Deretter ble etanolen fjernet ved vakuumfordampning. Resten ble løst i 20 ml etylacetat og vasket med 3 x 20 ml av en 1 N NaOH-løsning, deretter med 3 x 20 ml vann og til slutt tørket og fordampet til tørrhet, noe som ga 102 mg (97%) av produktet.

(c) 2-(4-metylaminofenyl)benzotiazol (21) og 2-(4-dimetylaminofenyl)benzotiazol (23)

En blanding av 2-(4-aminofenyl)benzotiazol 20 (15 mg, 0,066 mmol), Mel (9m4 mg, 0,066 mmol) og kaliumkarbonat (135 mg, 0,81 mmol) i 0,5 ml vannfri DMSO ble holdt på 100°C i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble renset ved revers fase TLC

(metanol:vann = 6:1), og dette ga 1,5 mg (10%) av 2-(4-metylaminofenyl)benzotiazol 21 og 2-(4-dimetylaminofenyl)benzotiazol 23.

(d) 2-(4-dimetylaminofcnyl)benzotiazol (23)

En blanding av 2-aminotiofenol 9 (0,5 g, 4,0 mmol) 4-dimetylaminobenzosyre 22 (0,66 g, 4,0 mmol) og 10 g PP A ble holdt på 220°C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og helt over i 400 ml av en løsning av 10% kaliumkarbonat. Bunnfallet ble frafiltrert under vakuumtrykk, noe som ga 964 mg av produkt 23 som var 90% rent basert på<*>H NMR-analyse. Omkrystallisering av 100 mg av 23 i metanol ga 80 mg av det rene produktet.<*>H NMR av 7 (300 MHz, aceton-de) 5: 7,12 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-7), 7,01 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-4), 6,98 (d, J = 9,1 Hz, 2H, H-2', 6'), 6,56 (t, J = 7,8 Hz, J = 7,3 Hz, 1H, H-5 eller H-6), 5,92 (d, J = 8,9 Hz, 1H, H-3<*>, 5'), 2,50 (s, 6H, NMe2).

Ved å bruke den samme strategien som beskrevet ovenfor, ble de andre søkte 2-(4'-aminofenyl)benzotiazolderivatene syntetisert ved å anvende passende 4-nitrobenzoylkloridderivater (for eksempel 2- eller 3-metyl-4-nitrobenzoylklorid) eller et passende 4-dimetylaminobenzosyrederivat (for eksempel 2- eller 3-metyl-4-dimetylaminobenzosyre).

Eksempel 5: Syntese av bis-2,2'-(4'-aminofenyl)dibenzotiazolderivater Syntesevei 1: Ved å anvende den generelle fremgangsmåten for 6-MeO-BTA-forbindelsene som er beskrevet ovenfor, men ved å anvende benzidin i stedet for p-anisidin og ved å bruke 16 ekvivalenter av 4-nitrobenzoylklorid, ga den følgende forbindelsen:

Ved å bruke den samme strategien som beskrevet ovenfor, kan de andre bis-2,2'-(4'-aminofenyl)dibenzotiazolderivatene syntetiseres via passende substituerte benzinderivater (for eksempel 2,2'- eller 3,3'-dimetylbenzidin) og et passende 4-nitrobenzoylkloridderivat (for eksempel 2- eller 3-metyl-4-nitrobenzoylklorid).

Syntesevei 2: De usymmetriske bis-2,2'-(4'-aminofenyl)dibenzotiazolderivatene kan syntetiseres via en palladiumkatalysert Suzukikobling av de passende substituerte 6-jod-(2-p-nitrofenyl)benzotiazolene, som kan fremstilles ved å bruke den samme strategien som for 6-MeO-BTA-forbindelsene med en etterfølgende reduksjon av nitrogruppene (Ishiyama et al., "Palladium (O)-Catalyzed Cross-Coupling Reaction of Alkoxydiboron with Haloarenes: A Direct Procedure for Arylboronic Esters" Tetrahedron Lett, 38, 3447, 1997).

Biologiske eksempler

Eksempel 6: Bestemmelse av affinitet for Ap og hjerneopptak av tioflavinderivater

Innledende konkurrerende bindingsundersøkelser ved å bruke [<3>H]CG og syntetisk AP(l-40) ble utført for å bestemme hvorvidt CG, ThS og ThT binder seg til de samme setene. Det ble påvist at ThS konkurrerer med [<3>H]CG for bindingsseter på AP(l-40), noe som ikke var tilfellet med ThT (se for eksempel figur 5). Høyspesifikk aktiv [N-metyl-<n>C]BTA-l (se tabell 1) ble så syntetisert ved metylering av BTA-0. Bindingsstudier ble utført med [N-metyl-<u>C]BTA-l og 200 nM Ap(l-40) fibriller. Den spesifikke bindingen av [N-metyl-<n>C]BTA-l var ~70%. Figur 5 (se den høyre figuren) viser konkurransekurvene for Ap-setene av ThT, BTA-0, BTA-1 og BTA-2 ved å bruke [N-metyl-<1>'C]BTA-l-bindingsprøven. Ki-verdiene var 3,0 ± 0,8 nM for BTA-2; 9,6 ± 1,8 nM for BTA-1; 100 ± 16 nM for BTA-0; og 1900 ±510 nM for ThT. Ikke bare var det kvaternære aminet av ThT unødvendig for binding til Ap-fibrillene, men synes dessuten å nedsette bindingsaffiniteten.

I tabell 1 nedenfor er det angitt fem forskjellige "C-merkede BTA-derivater hvor deres in vitro-bindingsegenskaper, logP-verdier og hjerneopptak in vivo og bibeholdelsesegenskaper i mus er blitt bestemt.

De data som er vist i tabell 1 er bemerkelsesverdige, da spesielt for<n>C-merket 6-MeO-BTA-1 og BTA-1-derivatene. Disse forbindelsene viser relativt høy affinitet for Ap, med Ki-verdier < 10 nM, og trengte lett inn i musehjernen med opptaksverdier > 0,4% ID/g<*>kg (eller > 13% ID/g for 30 g dyr). Videre var radioaktivitetskonsentrasjonsverdiene etter 30 minutter i hjernen mindre enn 0,1% ID/g<*>kg, noe som resulterte i 2 til 30 minutters konsentrasjonsforhold som var > 4. Begge N,N-dimetylforbindelsene ble raskere fjernet fra musehjernevevet enn N-metylderivatene. På lignende måte viste det eneste primære aminet som for tiden er undersøkt, det vil si 6-MeO-BTA-O dårlig fjerning fra hjernen. Disse overraskende og uventede resultatene understøtter den spesifikke bruken av det sekundære aminet (for eksempel -NHCH3) som in vivo-avbildningsmiddel.

Eksempel 7: In vivo PET-avbildningseksperimenter i bavianer

Store mengder (> 2000 Ci/mmol) av<n>C-merket BTA-1, 6-Me-BTA-l og 6-MeO-BTA-1 med høy spesifikk aktivitet ble fremstilt for hjerneavbildningsundersøkelser i fra 20 til 30 kg bedøvede bavianer ved å bruke Siemens /CTI HR+-tomografen i en tredimensjonal dataoppsamlingsinnstilling (nominal FWHM-oppløsning 4,5 mm). Hjerneavbildningsundersøkelsene ble utført etter en intravenøs injeksjon av fra 3 til 5 mCi av en radiomarkør. Typiske uttynnings- og nedbrytningskorrigerte tidsaktivitetskurver for et fremre hjernebarkområde av interesse for hver av de tre forbindelsene er vist på figur 6. Det skal bemerkes at det absolutte hjerneopptaket av disse tre forbindelsene i bavianer er meget likt det som ble observert i mus (det vil si ca 0,47 til 0,39 % ID/g<*>kg). Den normale fjerningen av disse tre radiomerkede forbindelsene fra hjernen var imidlertid betydelig langsommere hos bavianer sammenlignet med mus, med en topp til 60 minutters forhold i området fra 2,4 til 1,6 sammenlignet med forhold så høye som 7,7 etter 30 minutter hos mus. Størrelsesordenen med hensyn til maksimalt hjerneopptak og fjerning fra hjernen for de tre forbindelsene var også de samme hos mus og bavianer. Hjerneopptaket av de tre radiomerkede forbindelsene synes ikke å være blodstrømsbegrenset (figur 6, innsetting). Det ble tatt prøver av arterieblodet hos bavianene etter injeksjon av alle tre forbindelsene, og viste at deres metabolske profiler var ganske like. Bare sterkt polare metabolitter ble eluert nær tilførselsvolumet (4 ml) i den revers fase analytiske HPLC-kolonnen ble observert i plasma på alle tidspunkter etter injeksjonen, mens den umetaboliserte radiomarkøren ble eluert ved et volum på ca 20 ml. Typiske mengder av umetabolisert injektat i plasma for alle tre forbindelsene var ca 90% etter 2 minutter, 35% etter 30 minutter og 20% etter 60 minutter.

Transverse PET-bilder av to nivåer av bavianhjernen etter i.v. injeksjon av 3 mCi [N-mety-<n>C]BTA-l er vist på figur 7. Emisjonsprofilene oppsamlet 5-15 minutter etter injeksjon er slått sammen for å tilveiebringe bildene. Hjerneområdene innbefatter: Ctx (cortex); Thl (talamus); Occ (oksipital cortex); og Cer (cerebellum). Bemerk den jevne fordelingen av radioaktivitet i hele hjernen, noe som indikerer en mangel på regional bindingsspesifitet i en normal hjerne.

Eksempel 8: Farging av amyloide avsetninger i post mortem AD- og Tg-musehjerne

Post morrem-hjernevevssnitt fra en AD-hjerne og en 8 måneder gammel transgen PS1/APP [forklarer hva denne modellen blir brukt til å vise] mus ble farget med umerket BTA-1. PSl/APP-musemodellen kombinerer to humane genmutasjoner som er kjent for å frembringe Alzheimers sykdom i en dobbelt transgen mus som avsetter AP-fibriller i amyloid plakk i hjernen så tidlig som ved en alder på 3 måneder. Typiske fluorescensmikrodskopbilder er vist på figur 8, og fargingen av amyloid plakk av BTA-1 både i post mortem- AD- og PSl/APP-hjernevev er klart synlige. Cerebrovaskulært amyloid ble også klart farget (figur 8, høyre side). De andre karakteristiske nevropatologiske tegnene på AD-hjerne, nevrofibrillære nøster (NFT) er mer svakere farget av BTA-1 i AD-hjernen (figur på, venstre side). NFT er ikke blitt observert i transgene musemodeller på amyloid avsetning.

Eksempel 9: In vivo merking og påvisning av amyloide avsetninger i transgene mus

Tre 17 måneder gamle PS 1/APP-transgene mus ble injisert intraperitonealt (ip) med en enkelt dose på 10 mg/kg BTA-1 i en løsning av DMSO, propylenglykol og pH 7,5 PBS (v/v/v 10/45/45). 24 timer senere ble multifoton fluorescensmikroskopi

brukt for å oppnå høyoppløsningsbilder av hjernene hos levende mus ved å bruke en såkalt hjernevindusteknikk. Typiske in vivo bilder av BTA-1 i en levende PS1/APP-mus er vist på figur 9, og plakk og cerebrovaskulært amyloid er klart fremtredende. Multifotonmikroskopiundersøkelsen viser in vivo spesifiteten for BTA-1 for AP i levende PSl/APP-transgene mus.

Claims (1)

1 .Amyloidbindende forbindelse, karakterisert vedstrukturen D eller et vannløselig, ikke-toksisk salt derav

hvor Z er S, NR', O eller CR', i hvilket tilfelle den korrekte tautomere formen av den heterosykliske ringen blir et indol, R' er H eller en Ci-Cg alkylgruppe:

hvor Y er NR^<2>,OR<2>eller SR<2>; hvor nitrogenatomet i kvarternært amin; 12 hvori hver R og R uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av H, en Ci-C8alkylgruppe, (CH2)nOR' (hvor n = 1, 2 eller 3), CF3, CH2-CH2-CH2X (hvor X = F, Cl, Br eller I), (C-O)-R', Rph, og (CH2)nRPh, hvor n = 1, 2, 3 eller 4 og Rphrepresenterer en usubstituert eller substituert fenylgruppe, og hvor fenylsubstituentene er valgt fra halogen eller Ci-Cs alkyl; eller hvori hver R O -R 1 A uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av H, F, Cl, Br, I, en Ci-Cg alkylgruppe, (CH2)nOR' (hvor n = 1, 2 eller 3), CF3, CH2CH2X, O-CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X, O-CH2-CH2-CH2X (hvor X = F, Cl, Br eller I), CN, (C=0)-R\ N(R')2, N02, (C=0)N(R')2, 0(CO)R', OR', SR', COOR', Rph,