BRPI0113470B1 - Composto de ligação amilóide, composição farmacêutica e métodos de síntese de composto, de detecção in vivo de depósitos amilóides num indivíduo e em tecido humano ou animal, de quantificação de depósito amilóide em tecido de biópsia ou postmortem e de distinção de um cérebro de doença de alzheimer de um cérebro normal - Google Patents

Abstract

"compostos de ligação amilóide, composição farmacêutica e métodos de síntese de composto, de detecção in vivo de depósitos amilóides num indivíduo e em tecido humano ou animal, de quantificação de depósito amilóide em tecido de biopsia ou post-mortem e de distinção de um cérebro de doença de alzheimer de um cérebro normal". esta invenção relaciona-se com novos derivados de tioflavina, métodos de uso dos derivados, por exemplo, na formação de imagens, in vivo, de pacientes corn placas neuríticas, composições farmacêuticas que compreendem os derivados de tioflavina e método de sintetização dos compostos. os compostos encontram uso particular no diagnóstico e tratamento de pacientes com doenças em que é prevalente a acumulação de placas neuríticas, como a doença de alzheimer, a doença de alzheimer familiar, a síndrome de down e homozigotos para a alela e4 da apolipoproteína.

Description

Compostos de ligação amilóide, composição farmacêutica e métodos de síntese de composto, de detecção ín vivo de depósitos amilóides num indivíduo e em tecido humano ou animal, de quantificação de depósito amilóide em tecido de biópsia ou postmortem e de distinção de um cérebro de doença de Alzbeimer de um cérebro normal

Relatório descritivo Referência cruzada a pedidos de patente correlatos

Este pedido é uma continuação do Pedido Americano 60/227.601, depositado em 24/8/2000, aqui incorporado por referência na sua integralidade.

Campo da invenção

A presente invenção refere-se à identificação de compostos que são adequados para a formação de imagens de depósitos amilóides em pacientes vivos. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a método de formação de imagens de depósitos amilóides no cérebro in vivo, de modo a permitir o diagnóstico antemortem. da Doença de Alzheimer. A presente invenção também se relaciona com os usos terapêuticos desses compostos.

Antecedentes da invenção

2/93

A Doença de Alzheimer (“AD”) é uma doença neurodegenerativa caracterizada por perda de memória e outras deficiências cognitivas, McKenn e colaboradores, Neurology 34:939 (1984). É a causa mais comum de demência nos Estados Unidos. A AD pode atingir pessoas jovens como a presença da de 40-50 anos, mas, doença é difícil de determinar sem a perigosa biópsia do cérebro, o IO tempo do estabelecimento é desconhecido. A prevalência da AD aumenta com a idade, com estimativas da população afetada chegando a atingir elevados valores de 40-50% nas idades de 85-90, Evans e colaboradores,

262:2551 (1989); Katzman, Neurology (1993).

Na prática, a AD é definitivamente diagnosticada através do cerebral, geralmente

Khachaturlan, Arch. Neurol Mckhann e colaboradores, (1984). Neuropatologicamente, esta doença é caracteri-zada pela presença de placas neuríticas (NP), emaranhados neurofibrilares 25 (NFT) e perda neuronial, junto com uma variedade de outros achados, Mann, Mach.

(1985). Os cortes cerebral de vítimas da exibem a presença de amilóides na forma de núcleos extracelulares proteináceos das placas neuríticas que são características da AD.

ΝΑΜΑ

43:13 exame do tecido na autópsia,

42:1097 (1985);

Neurology 34:939

Ageing Dev. 3 1:2 13 postmortem do tecido doença de Alzheimer

3/93 destas placas uma proteína que está disposta

·.

Os núcleos amilóides neuríticas são compostos de chamada β-amilóide (Αβ) numa configuração laminar predominantemente beta-dobrada, Mori e colaboradores, Journal of Biological Chemistry 267:17082 (1992);

Kirschner e colaboradores, PNAS 83:503 (1986). As placas neuríticas são um aspecto antecipado e invariável da doença, Mann e colaboradores, J. Neurol. Sci. 89:169; Mann, Mech Ageing Deu., 31:213 (1985); Terry e colaboradores, J.

Neuropathol. Exp. Neurol 46:262 (1987).

A deposição inicial de Αβ ocorre provavelmente muito antes de os sintomas clínicos serem observáveis. O “critério microscópico mínimo” correntemente recomendado para a diagnose da AD é baseado no número de placas neuríticas encontradas no cérebro, Khachaturian, Arch. Neurol., supra (1985). Infelizmente, o julgamento das contagens das placas neuríticas contadas deve ser atrasado para até depois da morte.

As placas neuríticas que contêm amilóides são uma característica proeminente de áreas seletivas do cérebro na AD, assim como Down e em pessoas a alela E4 da muito provavelmente de na síndrome homozigóticas para apolipoproteína, que desenvolverá AD, Corder e Science 261:921 (1993); Divry,

Psych. 27:643-657 (1927);

colaboradores, in Zimmerman, colaboradores, P., J. Neurol.

Wisnlewski e Η. M. (ed.):

4/93 ¢0

Progress in Neuropathology (Grune e Stratton, N. Y., 1973) pp. 1-26. O amilóide cerebral é prontamente demonstrado pelo manchamento de seções do cérebro com tioflavina S ou vermelho do Congo, Puchtler e colaboradores, d. Histochem. Cytochem. 10:35 (1962). O amilóide manchado pelo vermelho do Congo é caracterizado por uma aparência dicróica, exibindo uma cor de polarização amarelo-verde.

A ligação dicróica é o resultado da estrutura laminar beta-dobrada das proteínas amilóides, Glenner, G. N., Eng. J. Med. 302:1283 (1980).

Pode ser encontrada uma discussão detalhada da bioquímica e histoquímica do amilóide em

Glenner, N., Eng. J. Med., 302:1333 (1980).

Até agora, a diagnose da AD tem sido alcançada mais geralmente através da avaliação de critérios clínicos, biópsias cerebrais e estudos de tecidos postmortem. Os esforços de pesquisas para o desenvolvimento de métodos para o diagnóstico da doença de Alzheimer in vivo incluem (1) testes genéticos, (2) métodos de imunoensaios e (3) formação de imagens.

A prova de que são necessárias e suficientes anormalidades no metabolismo Αβ para o desenvolvimento da AD é baseada na descoberta de mutações pontuais na proteína do precursor de Αβ em várias famílias raras com uma forma dominante autossômica de AD,

Hardy, Nature Genetics 1:233 (1992); Hardy e colaboradores, Science 256:184 (1992). Estas mutações ocorrem próximo dos pontos de

5/93 él divagem dos terminais N e C necessários para a geração de Αβ a partir da sua proteína precursora, St. George-Hy slop e colaboradores, Science 235:885 (1987); Kang e colaboradores,

Nature 325:733 (1987); Potter WO 92/17152. A análise genética de um grande número de famílias AD demonstrou, contudo, que a AD é geneticamente heterogênea, St. George —Hyslop e colaboradores, Nature 347:194 (1990). A ligação aos marcadores de cromossomo 2 1 é mostrada apenas em algumas famílias com estabelecimen-to antecipado de AD e em nenhumas famílias com estabelecimento tardio de AD. Mais recentemente, foi identificado por

Sharrington e colaboradores, Nature 375:754760 (1995), um gene no cromossomo 14 cujo produto é predito como contendo múltiplos domínios de trans-membrana e parece-se com uma proteína de membrana integral Este gene pode responder por até 70% da AD dominante autossômíca de estabelecimento antecipado. Os dados prelimi-nares sugerem que esta mutação do cromossomo 14 cause um aumento na produção de Αβ, Scheuner e colaboradores, Soc.

Neurosci. Abstr. 21:1500 (1995). Foi identificada uma mutação num gene muito semelhante sobre o cromossomo 1 em parentes de Volga German com estabelecimento antecipado de AD, Levy-Lahad e colaboradores,

Science 269:973-977 (1995).

O rastreamento do genótipo E da apolipoproteína tem sido sugerido como uma

6/93

ajuda na diagnose da AD, Scott, N ature 366:502 (1993); Roses, Ann Neurol 38:6-14 (1995).

Contudo, levantam-se dificuldades com esta tecnologia porque o alelo E4 da apolipoproteína é apenas um fator de risco para a AD, não um marcador da doença. Ele está ausente em muitos pacientes de AD e presente em muitas pessoas mais idosas não dementes, Bird, Ann. Neurol. 38:2-4 (1995).

Desenvolveram-se métodos de imunoensaio para a detecção da presença de marcadores neuroquímicos em pacientes AD e para a detecção de uma proteína amilóide relacionada com a AD no fluido cerebral-espinal, Warner, Anal. Chem. 59:12O3A (1987); Patente mundial 92/17 152 de Potter; Glenner e colaboradores, Patente Americana 4.666.829. Estes métodos de diagnóstico da AD não provaram detectar a AD em todos os pacientes, particularmente, em estágios iniciais da doença, e são relativamente invasivos, exigindo punção espinbal. Também foram feitas tentativas de desenvolvimento de anticorpos monoclonais formação de imagens como sondas para a da Αβ, Majocha e colaboradores, d. Nucl. Med., 33:2184 (1992);

Majocba e colaboradores, WO 89/06242 e colaboradores, Patente Americana A desvantagem principal, das

Majocha e 5.23 1 ,OOO.

sondas monoclonais é a dificuldade em fazer passar estas moléculas barreira sangue-cérebro. para a diagnose in vivo grandes através da O uso de anticorpos da AD exigiría

7/93

Ó3 anormalidades acentuadas na barreira sanguecérebro, a fim de conseguir acesso ao cérebro. Não há prova funcional convincente de que existam confiavelmente anormalidades na barreira sangue-cérebro na AD, Kalaria, Cerebrovascular & Brain Metabolism Reviews

4:226 (1992).

Tem sido usado o peptídeo Αβ radiomarcado para marcar placas do tipo difusas, compactas e neuríticas em seções do cérebro AD. Veja-se Maggio e colaboradores, WO 93/04194. Contudo, estes peptídeos compartilham todas as desvantagens dos anticorpos. Especificamente, os peptídeos normalmente não atravessam a barreira sanguecérebro em quantidades necessárias para a formação de imagens e, como estas sondas reagem com placas difusas, podem não ser específicas para AD.

A incapacidade de avaliar a deposição amilóide na AD até depois da morte impede o estudo desta doença devastadora. É necessário um método de quantificar a deposição amilóide antes da morte, tanto como ferramenta de diagnóstico em casos moderados ou clinicamente confusos, como no monitoramento da efetividade de terapias que têm como alvo a prevenção da deposição Αβ. Portanto, permanece como sendo da maior importância desenvolver um método seguro e específico para o diagnóstico da AD antes da morte por formação de imagens dos amilóides no

8/93

Η parênquima cerebral in vivo. Embora tenham sido feitas várias tentativas para diagnosticar AD in vivo, correntemente, não existem sondas antemortem para os amilóides cerebrais. Nenhum método tem utilizado uma sonda de elevada afinidade para os amilóides que tenha baixa toxicidade, consiga cruzar a barreira sangue-cérebro e se ligue mais efetivamente ao cérebro AD do que ao cérebro normal, a fim de identificar depósitos amilóides AD no cérebro antes da morte do paciente. Assim, demonstrado nenhum método in vivo da AD que satisfizesse a não foi para a estes diagnose critérios.

Os dados sugerem que os compostos de ligação a amilóides terão potencial terapêutico na AD e na diabetes mellitus do tipo 2. As reações morfológicas que incluem astrocitose reativa, neurites distróficas, células microgliais ativadas, perda de sinapse e ativação de complemento integral encontrados em torno das placas neuríticas significam todos que estão ocorrendo processos neurotóxicos e degenerativos celulares nas áreas adjacentes a estes depósitos Αβ, Joachim e colaboradores, Am. J.

Pathol.

135:309

Masliah (1989);

colaboradores, loc. cít 137:1293 (1990); Lue e

Rogers, Dementia 3:308 (1992). Foi relatada neurotoxicidade e degeneração celular num certo número de tipos de células in vitro, Yankner e colaboradores, Science 250:279 (1990); Roher e colaboradores, BBRC 174:572

9/93

Q)Ó (199 1); Frauschy e colaborado-res, Proc. Natl Acad Sci. 88:83362 (1991); Shearman e colaboradores, loc. cit. 91:1470 (1994).

Mostrou-se que a agregação do peptídeo Αβ é necessária para a neurotoxicidade in vitro, Yankner, Neurobiol. Aging 13:815 (1992).

Recentemente, três laboratórios relataram resultados que sugerem que o vermelho do Congo inibe a neurotoxicidade Αβ e a degeneração celular in vitro, Burgevin e colaboradores, NeuroReport 5:2429 (1994);

Lorenzo e Yankner, Proc. Natl Acad Sci 9 1:12243 (1994); Pollack e colaboradores, Neuroscíence Letters 184:113 (1995); Pollack e colaboradores,

Neuroscíence Letters 197:211 (1995). O mecanismo parece envolver tanto a inibição da formação de fibrilas quanto a prevenção das propriedades neurotóxicas das fibrilas formadas, Lorenzo e Yankner, Proc. Natl Acad

Sci 91:12243 (1994). O vermelho do Congo ’ também mostrou proteger as células das ilhas pancreáticas da toxicidade causada pela amilina, Lorenzo e Yankner, Proc. Natl Acad Sci. 91:12243 (1994). A amilina é um peptídeo fibrilar semelhante a Αβ que se acumula no pâncreas na diabetes mellitus do tipo 2.

É sabido na técnica que certos corantes azo, tais como o vermelho do Congo, podem ser carcinogênicos, Morgan e colaboradores,

Environmental Health Perspectives, 102 (supl) 2:63-78 (1994). Esta carcinogenicidade potencial parece ser largamente baseada no fato de

10/93 (ú(&

que os corantes azo são metabolizados extensivamente na amina pai livre pelas bactérias intestinais, Carniglia e colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Com. 107: 1224-1229 (1982). No caso dos corantes da benzidina (e muitas outras benzidinas substituídas), é amina livre que é o carcinógeno. Estes fatos têm poucas implicações para os estudos de formação de imagens amilóides em que uma quantidade

IO extremamente diminuta do corante radiomarcado de elevada atividade específica seria diretamente injetada na corrente sanguínea. Neste caso, a quantidade administrada seria desprezível e o corante contornaria as bactérias intestinais.

No caso de uso terapêutico, estas fatos têm importância crítica. A liberação de carcinógeno conhecido a partir de um composto terapêutico é inaceitável. Um segundo problema com o metabolismo do corante diazo é ' que muita da droga administrada é metabolizada por bactérias intestinais antes da absorção. Esta biodisponibilidade rebaixada persiste como uma desvantagem, mesmo se os metabólitos liberados forem inócuos.

A tioflavina T é um corante básico descrito primeiramente como corante amílóide seletivo em 1959 por Vassar e Culling (Arch. Pathol. 68:487 (1959)). Schwartz e colaborado30 res (Zbl. Path. 106:320 (1964)) demonstrou pela primeira vez o uso da Tioflavina S, um corante acídico, como corante amilóide em 1964. As

6r

1/93

propriedades tanto da Tioflavina T como Tioflavina S foram estudadas desde então em detalhe, Kelenyl, J Histochem. Cytochem. 15:172 (1967); Burns e colaboradores, <J. Path. Bact. 94:337 (1967); Guntern e colaboradores,

Experientia 48:8 (1992); LeVine, Meth. Enzymol. 309:274 (1999). A Tioflavina S é comumente usada no estudo postmortem da deposição amilóide no cérebro AD em que se mostrou ser uma das técnicas mais sensíveis para a demonstração de placas senis, Vallet e colaboradores, Acta Neuropathol. 83:170 (1992). A Tioflavina T tem sido usada freqüêntemente como reagente para o estudo da agregação de proteínas amilóides solúveis em fibrilas laminares beta, LeVine, Prot. Sei. 2:404 (1993). Têm sido propostos derivados de aminas quaternárias relacionadas com a Tioflavina T como agentes de formação de imagens, embora não tenha sido apresentada nenhuma prova da captura cerebral destes agentes, Caprathe e colaboradores, Patente Americana 6.00 1.33 1.

Assim, existe a necessidade de compostos de ligação amilóide que entrem no cérebro e se liguem seletivamente aos amilóides.

Existe a necessidade adicional de compostos de ligação amilóide que sejam não tóxicos e biodisponíveis e, consequentemente, possam ser usados na terapêutica.

Sumário da invenção

12/93

É, portanto, uma modalidade da presente invenção proporcionar compostos que permitam um método seguro e específico de diagnóstico da AD antes da morte por formação de imagens in vivo de amilóides no parênquima cerebral.

É outra modalidade da presente invenção proporcionar uma abordagem para a identificação de depósitos amilóides da AD no cérebro antes da morte do paciente, usando uma sonda de elevada afinidade para os amilóides que tenha baixa toxicidade, possa cruzar a barreira sangue-cérebro e consiga distinguir o cérebro AD do cérebro normal.

Ao realizar estas e outras modalidades da invenção, proporciona-se, de acordo com um aspecto da invenção, um composto de ligação amilóide com uma das estruturas de A a E:

13/93

em que Z é S, NR’, O ou C(R’)2 caso em que a forma tautomérica correta do anel heterocíclico se torna um indol em que R’ é H ou grupo alquila inferior:

ΊΟ

14/93

em que Y é NR^XR², OR² ou SR²;

\ ou não é uma amina quaternária;

ou um composto de ligação amilóide com uma das estruturas de F a J ou um sal das mesmas, não tóxico, solúvel em água:

>1

15/93

em que cada Q é selecionado independentemente de uma das seguintes estruturas:

16/93 em que Z é S, NR’, O ou C(R’)2, em que R’ é H ou um grupo alquila inferior;

em que U é CR’ (em que R’ é H ou um grupo alquila inferior) ou N (exceto quando U = N, então, Q não é

em que Y é NR^XR², OR² ou SR²;

não é uma amina quaternária;

em cada R¹ e R² independentemente é selecionado do grupo que consiste em H, um grupo alquila inferior, (CH2)nOR’ (em que n=l, 2 ou 3), CF₃, CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2-X (em que X=F, Cl, Br ou I), (C = O)-R’, R_ph e (CH₂)nR_Ph (em que n= 1, 2, 3 ou 4 e R_pn representa um grupo fenila não substituído ou substituído em que os substituintes da fenila são escolhidos a partir de qualquer dos substituintes não fenílicos definidos abaixo para R³-R¹⁴ e R’ é H ou um grupo alquila inferior; e em que cada R³-R¹⁴ independentemente é selecionado do grupo que consiste em H, F, Cl, Br, I, um grupo alquila inferior, (CFhJnOR’ >3

17/93

(em que n=l, 2 ou 3), CF3, CH2-CH2X, O-CH2CH₂X, CH2-CH2-CH2X, O-CH2-CH2-CH2X (em que X==F, Cl, Br ou I), CN, (C = O)-R’, N(R’)₂, NO₂, (C = O)N(R’)₂, O(CO)R’, OR’, SR’, COOR’, R_ph, CR’=CR’-R_Ph, CR2 ’-CR₂ ’-Rph (em que Rph representa um grupo fenila substituído ou não substituído com os substituintes de fenila sendo escolhidos a partir de qualquer dos substituintes não fenílicos definidos para R¹-R¹⁴ e em que R’ é H ou um grupo alquila inferior), um trialquil-estanbo e um grupo quelante (com ou sem um grupo metálico quelado) da forma WL ou V-W-L, em que V é selecionado do grupo que consiste em -COO-, -CO-, -CH2O- e —CH2NH-; W é — (CH2)n em que n = 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; e L é

SH HS

N HN ,SH HS, 'N HN'

-C

H₂ c O <5

X\ll/ '

M y \-

em que M é consiste em Tc e Re;

ou em que quelante (com ou .SH HS

N HN

SH ou selecionado do cada sem

R¹ e um ς O o \ll/

M

V \o

Í7\/^{CH3 S}MzS

M / v grupo que

R² é um grupo grupo metálico

Ή

18/93

quelado) da forma W-L, em que W é -(CH2)n em que n = 2, 3, 4 ou 5; e L é:

^SH HS,

-SH HS

Çn hn^ s o o < \ll/ '

M k / \ , ;n n ^Z\_7 :n hn \PM / \ , N N

-SH HS, 'N HN'

-C

H₂

SH ou \ii/%

M s^Z V em que M é selecionado do grupo que consiste em Tc e Re; ou ou em que cada R^x-R¹⁴ independentemente é selecionado do grupo que consiste num grupo quelante (com ou sem um íon metálico quelado) da forma W-L e V-W-L, em que V é selecionado do grupo que consiste em —COO- e — CO-; W é — (CH2)_n, em que n = 0,l,2,3,4 ou 5; L é:

Ύό

19/93

em que R¹⁵ independentemente é selecionado dentre um dos seguintes:

ou um composto quelante de ligação amilóide (com ou sem um grupo metálico quelado) ou um sal do mesmo, solúvel em água,

20/93

V

R

I \ /^R1<

/

Νχ 'SH HS' R’ .(Ga

R'

R’

R”

R‘

R'

R'

^NR» ^R15

OU

Pie

I ^R1Í|I x''^Rl5 Gã'' em que R¹⁵ independentemente é selecionado dentre o seguinte:

HS

H, COOH, ''Y-CONHCHg , \—( ³ , \_

OH SH

HS HO e R¹⁶ é

em que Q é selecionado independentemente de uma das seguintes estruturas:

Rl7 /^R18 —/ Y—íCHz)/ em que n-0, 1, 2, 3 ou 4, R20 ^R19

21/93

em que Z é S, NR’, O ou C(R’)₂, em que R’ é H ou um grupo alquila inferior;

em que U é N ou CR’;

em que Y é NR!R², OR² ou SR²;

em que cada R¹⁷-R²⁴ independentemente é selecionado do grupo que consiste em H, F, Cl, Br, I, um grupo alquila inferior, (CHaJnOR’ (em que n=l, 2 ou 3), CF₃, CH2-CH2X, O-CH₂CH₂X, CH2-CH2-CH2X, O-CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I), CN, (C = O)-R’, N(R’)₂, NO₂, (C = O)N(R’)₂, O(CO)R’, OR’, SR’, COOR’, R_ph, CR’=CR’-R_Ph e CR’2-CR’2~R_Ph (em que Rph representa um grupo fenila não substituído ou substituído com os sendo escolhidos substituintes de fenila dentre qualquer dos substituintes não fenílicos definidos para R¹⁷R²⁰ e em que R’ é H ou um grupo alquila inferior).

Numa modalidade preferida, pelo menos, um dos substituintes R¹-R¹⁴ das estruturas de A a E ou de F a J é selecionado do grupo que consiste em ¹³¹I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F,

22/93

CH2-CH2X*, O-CH2-CH2-X*, CH2-CH2-CH2-X*, ΟCH2-CH2-CH2-X* (em que Χ* = ¹³¹Ι, ¹²³Ι, ⁷⁶Br, ⁷³Br F), ¹⁹F, ¹²⁵I, um substituinte contendo ou carbono como especificado acima, em que, pelo menos, um carbono é ¹¹C ou ¹³C e um grupo quelante (com grupo metálico quelado) da forma W-L* ou V--W-L*, em que V é selecionado do grupo que consiste em —COO-, -CO-, -CH2O- e — CH2NH-; W é — (CH2)n em que n = O, 1, 2, 3, 4 ou 5; e L* é:

o O o ^S\ll/

M* / \ Ή N ^z\_y s o o \ll/

M* / \

N N

ou /-“À/CH, \IIZ

M* s^Z em que M* é ^99mTc; e um grupo quelante (com grupo metálico quelado) da forma W-L* ou

V-W-L*, em que V é selecionado do grupo que consiste em —COO-, -CO-, -CH2O- e — CH2NH-; W é — (CH2)n em que n = 0, 1, 2, 4 ou 5; e L* é:

Rl5 /

..NÇh¹⁵

RisRl5

V_/ *15

Rií

Rl5^^N, j^r15

1/ ^R15 “Rl5

R’^x

R’ '3j£a⁶⁸' I R'

OU

R1Í e em que R¹⁵ independentemente selecionado dentre um dos seguintes:

ch₃ ξ_

OH SH

H,

-COOH

-CONHCH3 ,

ou o composto quelante (com grupo metálico quelado) da forma:

23/93

Ris,

Γ\_„

R-iõ'

V_7 ^rk ^Gr

R15 í N-^i R« = /

R-15 Rl5 ^_aá^^R16 ^15

R-I5

OU

R

R'

R'

Rl6

RÍS=^^R15 ^68

Ga em que R¹⁵ independentemente é selecionado 20 dentre um dos seguintes:

H, COOH, CONHCH₃ ch₃

OH

SH

e R¹⁶ é

em selecionado que Q dentre é independentemente uma das seguintes estruturas:

24/93

em que Z é S, NR’, O ou C(R’)2 em que R’ é H ou um grupo alquila inferior ;

em que U é N ou CR’; em que Y é NR!R², OR² ou SR²; em que cada R¹⁷-R²⁴ independentemente é selecionado do grupo que consiste em H, F, Cl, Br, I, um grupo alquila inferior, (CHs)nOR’ (em que n=l, 2 ou 3), CF₃, CH₂-CH₂X, O-CH₂-CH₂X, CH₂-CH₂-CH₂X, O-CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I), CN, (C = O)-R’, N(R’)₂,

O(CO)R’, OR’, SR’, COOR’, e CR’₂-CR’2-R_Ph (em que representa um grupo fenila não substituído ou substituído com os substituintes fenila sendo escolhidos dentre qualquer dos substituintes não fenílicos definidos para R¹⁷-R²⁰ e em que R’ é H ou um grupo alquila inferior).

Noutra modalidade preferida, os compostos de tioflavina são definidos em que Z=S, Y = N, R^{1 =} H; e ainda em que, quando o (C = O)N(R’)₂,

CR’=CR’-R_Ph

NO₂,

Rph, Rph

25/93

composto de ligação amilóide da presente invenção for a estrutura A ou E, então, R² é selecionado do grupo que consiste num grupo alquila inferior, (CH2)_nOR’ (em que n= 1, 2 ou 3), CF₃, CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I), (C = O)-R’, R_Ph e (CH2)_nR_Ph em que n=l, 2, 3 ou 4;

em que, quando o composto de ligação amilóide da reivindicação 1 for a estrutura B, então, R² é selecionado do grupo que consiste em (CH₂)nOR’ (em que n=l, 2 ou 3 e em que, quando R’=H ou CH3, n não é 1), CF3, CH2-CH2X e CH2-CH2-CH2X (em que X = F, Cl, Br ou I);

em que, quando o composto de ligação amilóide da reivindicação 1 for a estrutura C, então, R² é selecionado do grupo que consiste num grupo alquila inferior, (CH2)_nOR’ (em que n=l, 2 ou 3, CF₃), CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X (em que X = F, Cl, Br ou I), (C = O)-H, R_Ph e (CH2)nR_Ph em que n=l, 2, 3 ou 4; e em que, quando o composto de ligação amilóide da reivindicação 1 for a estrutura D, então, R² é selecionado do grupo que consiste em (CH2)nOR’ (em que n= 1, 2 ou 3), CF3, CH2CH2X, CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I), (C = O)-R’, Rph e (CH2)nRPh em que n= 1, 2, 3 ou 4, em que, quando R² for CH2RPh, R⁸ não é CH₃.

Noutra modalidade preferida, pelo menos, um dos substituintes R³-R¹⁴ do composto de ligação amilóide da presente invenção é selecionado do grupo que consiste em i3ii, i²³I, ⁷⁶Br, 75_Br, isp, CH2-CH2X*, O-CH₂30

26/93

CH2-X*, CH2-CH2-CH2-X*, O-CH2-CH2-CH2-X* (em que X*=i3ii, ΐ23_Ι? 76_Br> 75_Br ou ¹⁸F), ¹⁹F, i2_SI e um substituinte contendo carbono como especificado na definição dos compostos que têm uma das estruturas A a E, em que, pelo menos, um carbono é ^1XC ou ¹³C, um grupo quelante (com grupo metálico quelado) da forma W-L* ou V-W-L*, em que V é selecionado do grupo que consiste em —COO-, -CO-, -CH2O- e — CH2NH-; W é — (CH2)n em que n = 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; e L* é:

z\ ^S\H/^S /\

N N w

s o s ^s\ll/^s M* / \

N N •C

H₂ /TA/^{CH3 S}\n/^N' ^ou 7\.

_/S s

em que M* é ^99mTc;

e um grupo quelante (com grupo metálico quelado) da forma W-L* ou V-W-L*, em que V é selecionado do grupo que consiste em —COO-, CO-, -CH2O- e — CH2NH-; W é —(CH2)n em que n = O, 1, 2, 3, 4 ou 5; e L* é:

I J ^R15 ξ_I . R-15

Ris f?15 /Ga s

.Nc-^Ri

R· OU ^_Ga6$^^Rl5 e em que R¹⁵ selecionado dentre um dos independentemente seguintes:

e

Η.

COOH,

CONHCH3 .

OH SH W ^V_/ /

ou o composto quclante (com grupo metálico quelado) da forma:

R'

R16 ^R15. sV^R15 Ga⁶⁸ em que R¹⁵ independentemente é selecionado dentre um dos seguintes:

em selecionado estruturas:

que Q dentre é independentemente uma das seguintes

SM

28/93

em que Z é S, NR’, O ou C(R’)2 em que R’ é H ou um grupo alquila inferior;

em que U é N ou CR’;

em que Y é NR!R², OR² ou SR²;

em que cada R¹⁷-R²⁴ independentemente é selecionado do grupo que consiste em H, F, Cl, Br, I, um grupo alquila inferior, (CH2)nOR’ (em que n=l, 2 ou 3), CF₃, CH2-CH2X, O-CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X, O-CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I), CN, (C = O)-R’, N(R’)₂, NO₂, (C = O)N(R’)₂, O(CO)R’, OR’, SR’, COOR’, R_ph, CR’=CR’-R_ph e CR’₂-CR’₂-R_Ph (em que R_ph representa um grupo fenila não substituído ou substituído com os substituintes fenila sendo escolhidos dentre qualquer dos substituintes

29/93 não fenílicos definidos para R¹⁷-R²⁰ e em que R’ é H ou um grupo alquila inferior).

Em modalidades especialmente preferidas, o composto é selecionado a partir de estruturas de A a E e Z=S, Y = N, R’=H, R^{1 =} H, R² = CH₃ e R3-R14 são H;

Z=S, Y = O, R’=H, R² = CH₃ e R³-R¹⁴ são H;

Z=S, Y=N, R’=H, R¹⁴ = H, R⁵ = I e R⁶-R¹⁴ são H;

Z=S, Y=N, R’=H, R¹⁴ = H, R⁵ = I, R⁸ = OH e R⁶-R⁷ e R⁹-R¹⁴ são H;

Z=S, Y = N, R’=H, R^{1 =} H, R² = CH₂-CH₂-CH₂-F e R³R¹⁴ são H;

Z=S, Y = O, R’=H, R² = CH2-CH2-F e R³-R¹⁴ são H; Z=S, Y=N, R’=H, R^1_7 = H, RS = O-CH2-CH₂-F e R⁹R¹⁴ são H;

ou Z=S, Y = N, R’=H, R^CHs, R^{2 7} = H, R⁸ = O-CH₂CH₂-F e R⁹-R¹⁴ são H.

Em modalidades especialmente preferidas, o composto é selecionado a partir de estruturas de Fade Z=S, Y = N, R’=H, R^{1 =} H, R² = CH₃ e R³-R¹⁴ são H;

Z=S, Y = O, R’=H, R² = CH₃ e R³-R¹⁴ são H;

Z=S, Y = N, R’=H, R¹⁴ = H, R5 = I, e R6-R14 _são H;

Z=S, Y = N, R’=H, R^{1 4} = H, R⁵ = I, R⁸ = OH e R⁶-R⁷ e R9-R¹⁴ são H;

Z=S, Y=N, R’=H, Ri = H, R² = CH₂-CH₂-CH₂-F e R³R¹⁴ são H;

Z=S, Y = O, R’=H, R² = CH2-CH2-F e R³-Ri⁴ são H; Z=S, Y = N, R’=H, R1-⁷ = H, R⁸ = O-CH2-CH₂-F e R⁹R¹⁴ são H.

ou Z=S, Y = N, R’=H, R^CHs, R²⁷ = H, R⁸ = O-CH₂CH₂-F e R⁹-R¹⁴ são H.

30/93

Noutra modalidade especialmente preferida, pelo menos um dos substituintes R³-R¹⁴ é selecionado do grupo que consiste em CN, OCH₃, OH e NH₂.

Ainda noutra modalidade especialmente preferida, o composto de ligação amilóide é selecionado do grupo que consiste na estrutura B, na estrutura C e na estrutura D; em que R^{1 =} H, R² = CH₃ e R⁸ é selecionado do grupo que

IO consiste em CN, CH₃, OH, OCH3 e NH₂. Num aspecto preferido desta modalidade, R³-R⁷ e R⁹R¹⁴ são H.

Ainda noutra modalidade, os compostos de ligação amilóide da presente invenção ligam15 se a Αβ com uma constante de dissociação (Kd) entre 0,0001 e 10,0 μΜ, quando medida por ligação ao peptídeo sintético Αβ ou ao tecido do cérebro com doença de Alzheimer.

Outra modalidade da invenção diz respeito a método de síntese dos compostos de ligação amilóide da presente invenção com, pelo menos, um dos substituintes R^x-R¹⁴ selecionado do grupo que consiste em ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F e ¹⁹F, que compreende a etapa de marcação do composto de ligação amilóide, em que, pelo menos, um dos substituintes R¹-R¹⁴ é um trialquil-estanho, por reação do composto com uma substância que contém ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷&Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F e ¹⁹F.

Outra modalidade da invenção diz respeito a método de síntese dos compostos de ligação amilóide da presente invenção com, pelo

1/93 ·· · menos, um dos substituintes R³-R¹⁴ selecionado do grupo que consiste em ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F e ¹⁹F, que compreende a etapa de marcação de um composto de ligação amilóide 5 da estrutura de A a E ou de F a d, em que Z=S, Y=N, R^{1 =} H e, pelo menos, um dos substituintes R3-R14 é um trialquil-estanho, por reação do composto com uma substância que contém ¹³¹I, i25i_? ¹²³I, ⁷6Br, ⁷⁵Br, i«F e ¹⁹F.

Outra modalidade adicional da presente invenção diz respeito a composição farmacêutipara a formação de imagens in amilóides, que compreende composto de ligação amilóide escolhido dentre 15 as estruturas de A a E ou de F a J e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável. Um aspecto preferido da modalidade diz respeito a composição farmacêutica para a formação de imagens in vivo de depósitos amilóides, que 20 compreende (a) um composto de ligação amilóide escolhido dentre as estruturas de A a E ou de F a J, em que Z=S, Y=N, R^{1 =} H e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

Outra modalidade da invenção 25 método de detecção in amilóides num indivíduo, que compreende as etapas de: (a) administrar uma quantidade detectável de uma composição farmacêutica que compreende o composto marcado de ligação 30 amilóide e (b) detectar a ligação do composto a depósito amilóide no indivíduo. Num aspecto preferido desta modalidade, o depósito amilóide ca, depósitos vivo de (a) um e um vivo de depósitos

Μ

32/93 é localizado no cérebro do indivíduo. Num aspecto particularmente preferido desta modalidade, o indivíduo é suspeito de ter uma doença ou síndrome selecionada do grupo que consiste na doença de Alzheimer, na doença de Alzheimer familiar, na Síndrome de Down e homozigotos para o alelo E4 da apolipoproteína. Noutro aspecto particularmente preferido desta modalidade, a detecção é selecionada do grupo que consiste na formação de imagens gama, na formação de imagens por ressonância magnética e espetroscopia de ressonância magnética. Num aspecto preferido desta modalidade, a formação de imagens gama é quer por PET, quer por

SPECT. Noutro aspecto preferido desta modalidade, a composição farmacêutica é administrada por injeção intravenosa. Noutro aspecto preferido desta modalidade, a razão de (i) a ligação do composto a uma área do cérebro que não seja o cerebelo para (ii) a ligação do composto ao cerebelo, no indivíduo, é comparada com a razão num indivíduo normal.

Outra modalidade relaciona-se com método de detecção de depósitos amilóides em tecido humano ou animal, de biópsia ou post mortem, que compreende as etapas de: (a) incubar o tecido fixado em formalina ou fresco com uma solução de um composto de ligação amilóide da presente invenção de modo a formar um depósito marcado e, depois, (b) detectar os depósitos marcados. Num aspecto preferido desta modalidade, a solução é composta de 2533/93

100% etanol, com o restante da solução sendo água, em que a solução é saturada com um composto de ligação amilóide de acordo com a presente invenção. Num aspecto particularmente preferido desta modalidade, a solução é composta de um tampão aquoso (tal como tris ou fosfato) que contém 0-50% de etanol, em que a solução contém de 0,0001 a ΙΟΟρΜ de um composto de ligação amilóide de acordo com a presente invenção. Num aspecto particularmene preferido desta modalidade, a detecção é efetuada por técnicas microscópicas selecionaas do grupo que consiste em microscopia de campo luminoso, fluorescência, laser confocal e polarização cruzada.

Uma modalidade adicional relaciona-se com um método de quantificação da quantidade de depósito amilóide em tecido de biópsia ou postmortem, que compreende as etapas de: a) incubar um derivado radiomarcado de um composto de ligação amilóide da presente invenção com um homogenato de tecido de biópsia ou postmortem, em que, pelo menos, um dos substituintes R¹-R¹⁴ do composto é marcado com uma radiomarcador selecionado do grupo que consiste em ¹²⁵I, ³H e um substituinte contendo carbono conforme especificado pelas estruturas de A a E ou de F a J do composto de ligação amilóide, em que, pelo menos, um carbono é ¹⁴C; b) separar derivado radiomarcado ligado ao tecido do não ligado ao tecido de um composto de ligação amilóide da

34/93

presente invenção; c) quantificar o derivado radiomarcado ligado ao tecido de um composto de ligação amilóide da presente invenção e d) converter as unidades do derivado radiomarcado ligado ao tecido de um composto da presente invenção para unidades de microgramas de amilóide por 100 mg de tecido por comparação com um padrão.

Num aspecto particularmente preferido desta modalidade, o derivado radiomarcado do composto de ligação amilóide da presente invenção ou um sal do mesmo solúvel em água, não tóxico, é um composto de ligação amilóide com uma das fórmulas de A a E abaixo:

35/93

em que Z é S, NR’, O ou CR’, caso em que a forma tautomérica correta do anel heterocíclico se torna um indol em que R’ é H ou um grupo alquila inferior:

R’ /

N \

R' em que Y é NR¹R², OR² ou SR²;

36/93 em que o nitrogênio de qualquer grupo é ou

R'

não é uma amina quaternária;

ou o derivado radiomarcado do composto de ligação amilóide da presente invenção ou um sal do mesmo, não tóxico, solúvel em água, está de acordo com uma das fórmulas de F a J abaixo:

37/93

em que cada Q é selecionado independentemente a partir de uma das seguintes estruturas:

em que n = O, 1, 2, 3 ou 4

R4 ^R3

38/93

Re R5 üi

R4V-R3

Re ,^R5 y

Rs

R’ é H grupo então, em que Z é S, NR’, O ou C(R’)2, em que ou um grupo alquila inferior;

em que U é CR’ (em que R’ é H ou um alquila inferior) ou N (exceto quando U = N,

);

em que Y é NR^², OR² ou SR²;

não é uma amina quaternária;

em cada R¹ e R² independentemente é selecionado do grupo que consiste em H, um grupo alquila inferior, (CFhJnOR’ (em que n= 1, 2 ou 3), CF3, CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X (em que

39/93

X=F, Cl, Br ou I), (C = O)-R’, R_ph e (CH₂)nR_Ph (em que n=l, 2, 3 ou 4 e R_pu representa um grupo fenila não substituído ou substituído em que os substituintes da fenila são escolhidos a partir de qualquer dos substituintes não fenílicos definidos abaixo para R³-R¹⁴ e R’ é H ou um grupo alquila inferior);

e em que cada R³-R¹⁴ independentemente é selecionado do grupo que consiste em H, F. Cl, Br, I, um grupo alquila inferior, (CH₂)_nOR’ (em que n= 1, 2 ou 3), CF₃, CH₂-CH₂X, O-CH₂CH₂X, CH2-CH2-CH2X, O-CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I), CN, (C = O)-R’, N(R’)₂, NO₂, (C = O)N(R’)₂, O(CO)R’, OR’, SR’, COOR’, R_ph, CR’=CR’-R_Ph, CR2⁵-CR2’-R_Ph (em que R_Ph representa um grupo fenila substituído ou não substituído com os substituintes de fenila sendo escolhidos dentre qualquer dos substituintes não fenílicos definidos para R¹-R¹⁴ e em que R’ é H ou um grupo alquila inferior), um trialquil-estanho e um grupo quelante (com ou sem um grupo metálico quelado) da forma WL ou V-W-L, em que V é selecionado do grupo que consiste em -COO-, -CO-, -CH2O- e — CH2NH-; W é — (CH2)n em que n=0, 1, 2, 3, 4 ou 5; e L é %

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c 3. σο

-SH HS ;n hn

-γ\_7 o o

Z'

SH ou \IIZ

M s^Z\ em que M é selecionado do grupo que consiste em Tc e Re;

ou em que cada R¹ e R² é um grupo quelante (com ou sem um grupo metálico quelado) da forma W-L, em que W é —(CH2)n em que n = 2, 3, 4 ou 5; e L é:

SH HS

N HN v__/

A?z^s

Λ_/^Ν ,SH HS

N HN ς O o

-^s\ll/

M

O

h₂

SH

OU

Oz^Cít» ^sxSA / V em que M é selecionado do grupo que consiste em Tc e Re;

°yy /93 ou em que cada R^x-R¹⁴ independentemente é selecionado do grupo que consiste num grupo quelante (com ou sem um íon metálico quelado) da forma W-L e V-W-L, em que V é selecionado do grupo que consiste em —COO- e —CO-; W é —(CH2)n, em que n = 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; L é:

e em que R¹⁵ independentemente é selecionado dentre o seguinte:

42/93

ou u.m composto quelante de ligação 5 amilóide (com ou sem um grupo metálico quelado) ou um sal dos mesmos, solúvel em água, não tóxico, da forma:

R' R* R' R*

43/93

ou

Γ áfck

GÍ em que R¹⁵ independentemente é selecionado do 5 seguinte:

em que Q é selecionado independentemente de uma das seguintes estruturas:

em que Z é S, NR’, O ou C(R’)2, em que R’ é H ou um grupo alquila inferior;

Í£0

44/93

em que U é N ou CR’;

em que Y é NR!R², OR² ou SR²;

em que cada um de R¹⁷-R²⁴ independentemente é selecionado do grupo que consiste em H, F, Cl, Br, I um grupo alquila inferior, (CH₂)_nOR’ (em que n= 1, 2 ou 3), CF₃, CH2-CH2X, O-CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X, O-CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I), CN, (C = O)-R’, N(R’)₂, NO₂, (C = O)N(R’)₂, O(CO)R’, OR’, SR’, COOR’, R_ph, CR’=CR’-R_Ph e CR’₂-CR’₂-Rph (em que Rph representa um grupo fenila não substituído ou substituído com os substituintes de fenila sendo escolhidos dentre qualquer dos substituintes não fenílicos definidos para R¹⁷R²⁰ e em que R’ é H ou um grupo alquila inferior).

Outra modalidade diz respeito a método de distinção de um cérebro de doença de Alzheimer de um cérebro normal, que compreende as etapas de: a) obter tecido de (i) o cerebelo e (ii) outra área do mesmo cérebro que não seja o cerebelo a partir de indivíduos normais e a partir de indivíduos suspeitos de terem a doença de Alzheimer; b) incubar os tecidos com um derivado radiomarcado de um composto de ligação amilóide de tioflavina de acordo com a presente invenção de forma que o amilóide no tecido se ligue ao derivado radiomarcado de um composto de ligação amilóide da presente invenção; c) quantificar a quantidade de amilóide ligado ao derivado radiomarcado de um composto de ligação lOL

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amilóide da presente invenção segundo o método acima indicado; d) calcular a razão da quantidade de amilóide na área do cérebro que não é a do cerebelo para a quantidade de amilóide no cerebelo; e) comparar a razão da quantidade de amilóide no tecido a partir de indivíduos normais com a razão da quantidade de amilóide no tecido a partir de indivíduos suspeitos de terem a doença de Alzheimer; e f) determinar a presença da doença de Alzheimer, se a razão do cérebro de um indivíduo suspeito de ter a doença de Alzheimer estiver acima de 90% das razões obtidas a partir dos cérebros dos indivíduos normais.

Outras modalidades da invenção ficarão evidentes para os especialistas na técnica a partir da consideração do Relatório Descritivo e da prática da invenção aqui descrita. Pretendese que o Relatório Descritivo seja apenas considerado como exemplificativo, com o veraddeiro escopo e espírito da invenção sendo indicados pelas reivindicações a seguir. Adicionalmente, todos os documentos aqui referidos ficam expressamente incorporados por referência.

Breve descrição dos desenhos Figura 1 Mostra as estruturas de uma

Tioflavina S e Tioflavina T;

Figura 2 Mostra as estruturas de dois derivados de tioflavina de acordo com a invenção;

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Figura 3

Figura 4

Figura 5

V

Figura 6

Figura 7

Mostra quatro seções em série do córtex frontal cerebral de um paciente AD, coradas por fluorescência;

Mostra os sítios propostos de Crisamina G e Tioflavina T em fibrilas laminares β;

Mostra ensaio de competição que usa Crisamina G, Tioflavina S e Tioflavina T e derivados da presente invenção (BTA-O, BTA- 1 e BTA-2); Mostra a radioatividade no curso do tempo no córtex frontal de babuínos injetados com BTA-1, 6-Meo-BTA-l e 6-Me-BTA-l marcados; e

Mostra uma imagem transversal por tomografia de emissão de positron

Figura 8

de dois níveis	de cérebro	de
babuíno a seguir	a injeção i. v.	de
[N-metil-11CJBTA-1	•
Mostra seções	postmortem	de

Figura 9 cérebros bumano e de rato transgênico corados com um derivado da presente invenção (BTA-1). Mostra a marcação in vivo de placas amilóides e amilóides vasculares corados por um derivado da presente invenção (BTA-1) em ratos transgêncios vivos sujeitos à formação de imagens por microscopia multifotônica.

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Descrição detalhada da invenção

A presente invenção explicita a capacidade dos compostos de tioflavina e seus derivados radiomarcados de cruzarem a barreira 5 sangue-cérebro in vivo e de se ligarem a Αβ depositado em placas neuríticas (mas, não difusas), a Αβ depositado em amilóides cerebrovasculares e no amilóide que consiste na proteína depositada em NFT. Os compostos

IO presentes são derivados de amina não quaternária da Tioflavina S e T que se sabe que coram amilóides em seções de tecidos e se ligam ao Αβ sintético in vitro, Kelenyl, J. Histochem. Cytochem. 15:172 (1967); Burns e colaborado15 res, J. Path. Bact 94:337 (1967); Gunter e colaboradores, Experientia 48:8 (1992); LaVine

Meth. Enzymol. 309: 274 (1999).

Os derivados de tioflavina da presente invenção têm cada uma das seguintes 20 características: (1) ligação específica ao Αβ sintético in vitro e (2) capacidade de cruzar in vivo uma barreira sangue-cérebro não comprometida.

Conforme aqui usado para descrever os 25 derivados de tioflavina, alquila inferior” é uma cadeia ramificada ou reta Ci-Cs, de preferência, Ci-Ce e, com maior preferência, C1-C4 (por exemplo, metila, etila, propila ou butila). Quando R^x-R¹⁴ for definido como “trialquil 30 estanho”, a metade é uma metade alquil Sn, de preferência, metade tri-C 1 -Cs tri-C 1 -Cõ alquil Sn, com maior preferência metade tri-CiioH

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C4 alqu.il Sn (por exemplo, metade tri-Ci-Cô alquil Sn, com maior preferência, metade tri-CiC4 alquil Sn (por exemplo, metil, etil, propil ou butil).

O método desta invenção determina a presença e localização de depósitos amilóides num órgão ou área do corpo, de preferência, no cérebro do paciente. O presente método compreende a administração de uma quantidade detectável de uma composição farmacêutica que contém uma composto de ligação amilóide escolhido dentre as estruturas de A a E ou de F a d, conforme acima definidas, chamado de “composto detectável”, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável solúvel em água, ao paciente. “Quantidade detectável” significa que a quantidade do composto detectável que é administrada é suficiente para possibilitar a detecção de ligação do composto ao amilóide. “Quantidade efetiva para a formação de imagem” significa que a quantidade do composto detectável que é suficiente para possibilitar imagem de ligação do composto ao amilóide.

A invenção emprega sondas amilóides que, em conjunção com técnicas de formação de neuro-imagens não invasivas, tais como espetroscopia de ressonância magnética (MRS) ou imagens (MRI) ou formação de imagens gama tais como tomografia de emissão de positrons (PET) ou tomografia computorizada de emissão de fóton único (SPECT), são usadas para administrada é a formação de

ICtf

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quantificar in vivo a deposição de amilóides. O termo “formação de imagens in vivo” refere-se a qualquer método que permita a detecção de um derivado de tioflavina marcado que seja escolhido dentre as estrruturas de A a E ou de F a J, conforme acima descrito. Para a formação de imagens gama, a radiação emitida a partir do órgão ou área que está sendo examinada é medida e expressa, quer como ligação total, quer como uma razão em que a ligação total num tecido é normalizada (por exemplo, dividida por) pela ligação total noutro tecido do mesmo indivíduo durante o mesmo procedimento de formação de imagens in vivo. A ligação total in vivo é definida como o sinal integral detectado num tecido por uma técnica de formação de imagem in vivo sem a necessidade de correção por uma segunda injeção de quantidade idêntica de composto marcado junto com um grande excesso de composto não marcado, mas, de outra forma, quimicamente idêntico. Um “sujeito (ou indivíduo)” é um mamífero, de preferência, uma pessoa humana e, com maior preferência, uma pessoa humana suspeita de ter demência.

Para fins de formação de imagens in vivo, o tipo de instrumento de detecção disponível é um fator principal na seleção de um dado marcador. Por exemplo, isótopos radioativos e ¹⁹F são particularmente adequados para a formação de imagens in vivo nos métodos da presente invenção. O tipo de instrumento

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usado guiará a seleção do radionuclídeo ou isótopo estável. Por exemplo, o radionuclídeo escolhido deve ter um tipo de desintegração detectável por um dado tipo de instrumento. Outra consideração refere-se à meia-vida do radionuclídeo. A meia-vida deve ser suficientemente longa, de modo que seja ainda detectável no momento da máxima captura pelo alvo, mas. suficientemente curta, de modo que o hospedeiro não retenha radiação deletéria. Os compostos radiomarcados da invenção podem ser detectados usando a formação de imagens por radiação gama em que é detectada a radiação gama emitida do comprimento de onda adequado. Os métodos de formação de imagens por radiação gama incluem, sem limitação, SPECT e PET. Preferentemente, para a detecção SPECT, o radiomarcador escolhido não terá uma emissão particulada, mas, produzirá um grande número de fótons numa faixa 140-200 keV. Para a detecção PET, o radiomarcador será um radionuclídeo emissor de positrons tal como ¹⁹F que se aniquilará para formar dois raios gama de 511 keV que serão detectados pela câmara PET.

Na presente invenção, são feitos compostos/ sondas de ligação amilóide que são úteis para a formação de imagens in vivo e quantificação da deposição amilóide. Estes compostos devem ser usados em conjunção com técnicas não invasivas de formação de neuroimagens tais como espetroscopia de ressonância magnética (MRS) ou de formação de

Ιοί /93 imagens (MRI), tomografia de emissão de positrons (PET) e tomografia computorizada de emissão de fóton único (SPECT). De acordo com esta invenção, os derivados de tioflavina podem ser marcados com ¹⁹F ou ¹³C para MRS/MRI por técnicas gerais de química orgânica conhecidas do estado da técnica. Veja-se, por exemplo, March, J., Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure (3^a edição,

1985) , cujo teor é aqui incorporado por referência. Os derivados de tioflavina podem ser também radiomarcados com ¹⁸F, ^1XC, ⁷⁵Br ou ⁷⁶Br pela técnica PET bem conhecida no estado da técnica e são descritos por Fowler, d., e Wolf, A., em Positron Emission Tomography and Autoradiography (ed. Phelps, M., Mazziota, d., e Schelbert, H.) 391-450 (Raven Press, NY

1986) cujo teor é aqui incorporado por referência. Os derivados de tioflavina podem também ser radiomarcados com ¹²³I para SPECT por qualquer de várias técnicas conhecidas. Veja-se, por exemplo, Kulkarni, Int. J. Rad Appl. & Inst. (Parte B) 18:647 (1991), cujo teor é aqui referência. Além disso, os tioflavina incorporado por derivados de podem ser radiomarcados com qualquer isótopo de iodo radioativo adequado, tal como, sem limitação, i3ii_; i25j _Ou i23j p_Or iodação de um derivado amino diazotizado diretamente via um iodeto de diazônio, veja-se Greenbaum, F., Am. d. Pharm. 109:17 (1936), ou por conversão da amina diazotizada instável na triazina estável ou por

52/93

conversão de um precursor halogenado não radioativo a um derivado de tri-alquil estanho, que, então, pode ser convertido no composto de iodo por vários métodos bem conhecidos na técnica. Veja-se Satyamurthy e Barrio, d. Org. Chem. 48:4394 (1983), Goodman e colaboradores, d. Org. Chem. 49:2322 (1984) e

Mathis e colaboradores, d. Labell. Comp. and. Radiopharm. 1984:905; Chumpradit e colaboradores, d. Med. Chem. 34:877 (1991);

Zhuang e colaboradores, d. Med. Chem. 37:1406 (1994); Chumpradit e colaboradores, d. Med. Chem. 37:4245 (1994). Por exemplo, uma triazina ou derivado tri-alquil estanho da tioflavina ou seu análogo estável é feita reagir com um agente balogenante contendo ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, 76j3_r, ⁷SBr, ¹⁸F ou ¹⁹F. Assim, os derivados estáveis de tri-alquil estanho da tioflavina e seus análogos são precursores novos úteis para a síntese de muitos dos compostos radiomarcados na presente invenção. Como tal, estes derivados de tri-alquil estanho são uma modalidade desta invenção.

Os derivados de tioflavina podem também ser radiomarcados com radiomarcadores de metal conhecidos, tais como o tecnécio99m (^99mTc). A modificação dos substituintes para introduzir ligantes que liguem esses íons metálicos pode ser efetuada sem experimentação indevida por qualquer pessoa de conhecimento ordinário na técnica da radiomarcação. O derivado metálico de

53/93 de por res, “Sma.ll and bisaminoethanethiol tioflavina radiomarcado pode, então, ser usado para detectar depósitos amilóides. A preparação de derivados radiomar-cados Tc^99m q bem conhecida na técnica. Veja-se, exemplo, Zhuang e colaboradores, “Neutral and stereospecific Tc-99m complexes: [99mTc]Nbenzil-3,4-di-(N-2-mercaptoethyl) -amino pyrrolidines (P-BAT)” Nuclear Medicina &

Biology 26(2):2 17-24 (1999); Oya e colaboradoneutral Tc(v)O BAT, (N2S2) complexes for developing new brain imaging agents” Nuclear Medicina & Biology 25(2):135-40, (1998); e Horn e colaboradores, “Technetium-99m-labeled receptor-specific small-molecule radiopharmaceuticals: recent developments and encouring results” e colaboradores”, Nuclear Medicina & Biology 24(6):485-98, (1997).

Os métodos da presente invenção podem usar isótopos detectáveis por espetroscopia de ressonância magnética nuclear para fins de espetroscopia particular mente formação de imagens e in vivo. Elementos úteis em espetrosco-pia de ressonância magnética incluem ¹⁹F e ¹³C.

Radioisótopos adequados para fins desta invenção incluem beta-emissores, gamaemissores, positron-emissores e emissores de raios X. Estes radioisótopos incluem ¹³¹I, ¹²³I, ¹⁹F, ^1XC, ⁷⁵Br e ⁷⁶Br. Isótopos estáveis adequados para uso na formação de imagens por ressonância magnética (MRI) ou

54/93

espetroscopia (MRS), de acordo com esta invenção incluem ¹⁹F e ¹³C. Radioisótopos adequados para quantificação in vivo de amilóides em homogenatos de tecidos em biópsia ou postmortem incluem ¹²⁵I, ¹⁴C e ³H.

Os radiomarcadores preferidos são ⁿC ou ¹⁹F para uso na formação de imagens in vivo por PET, 1231 para uso na formação de imagens in vivo por SPECT, ¹⁹F para MRS/MRI e ³H para estudos in vivo. Contudo, qualquer método convencional de visualização de sondas de diagnóstico pode ser utilizado de acordo com esta invenção.

O método pode ser usado para diagnosticar AD em casos moderados ou clinicamente confusos. Esta técnica pode também permitir estudos longitudinais de deposição amilóide em populações humanas sob risco elevado de deposição amilóide, tais como síndrome de Down, AD familiar e homozigotos para o alelo E4 da apolipoproteína, Corder e colaboradores, Science 261:921 (1993). Um método que permite seguir a sequência temporal da deposição amilóide pode determinar se a deposição ocorre muito tempo antes da demência começar ou se a deposição não se relaciona com a demência.

ser usado para monitorar

Este método pode a efetividade de deposição visam prevenir terapias que amilóide.

Geralmente, a dosagem do derivado de tioflavina radiomarcado detectavelmente variará

55/93 dependendo de considerações tais como a idade, condição, sexo e extensão da doença no paciente, contraindicações, se houver, terapias concomitantes ajustadas por técnica. A

,20 e outras variaveis, a serem um médico especializado na dosagem pode variar desde

OjOOlpgkg¹ a IO pgkg¹, de preferência, de 0,01 pgkg¹ a 1,0 pgkg¹.

A administração a um indivíduo pode ser local ou sistêmica e realizada intravenosa, intrarterial, intratecalmente (via fluido espinhal) ou semelhante. A administração pode ser também intradermica ou intracavitariamente, dependendo do local do corpo sob exame. Após ter passado um tempo suficiente para que o composto se ligue ao amilóide, por exemplo, de 30 minutos a 48 boras, a área do indivíduo sob investigação é examinada por técnicas rotineiras de formação de imagens, tais como MRS/MRI, SPECT, formação de imagens por cintilação plana, PET e também quaisquer técnicas emergentes de formação de imagens. O protoco-lo exato variará necessariamente dependendo de fatores esepcíficos do paciente, conforme acima indicado, e dependendo do local do corpo sob exame, do método de administração e do tipo de marcador usado; a determinação de procedimen-tos especiais será de rotina para operador especializado.

imagens do cérebro, quantidade (ligação total ou

Para a formação de preferência, específica) de a

do

56/93

derivado ou análogo de tioflavina ligado marcado radioativamente da presente invenção é medido e comparado (na forma de uma razão) com a quantidade de derivado de tioflavina marcado ligado ao cerebelo do paciente. Esta razão é, então, comparada com a mesma razão em cérebros normais da mesma idade.

As composições farmacêuticas da presente invenção são administradas de modo vantajoso na forma de composições injetáveis, mas, podem também ser formuladas em sistemas de fornecimento de drogas bem conhecidos (por exemplo, orais, retais, parenterais (intravenosos, intramusculares ou subcutâneos), intracisternais, intravaginais, intraperitonias, locais (pós, ungüentos ou gotas) ou como pulverizações bucais ou nasais. Uma composição típica para esse fim compreende um veículo farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, a composição pode conter cerca de 10 mg de albumina do soro humano e desde cerca de 0,5 a 500 micrograma do derivado de tioflavina marcado por mililitro de tampão de fosfato contendo NaCl. Outros veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas, excipientes não tóxicos, incluindo sais, preservativos, tampões e semelhantes, conforme descrito, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15^a edição Easton; Mack Publishing Co., pp 1405-1412 e 14611487 (1975) e The National Formulary XIV, 14^a edição Washington; American Pharmaceutical

57/93 llô

Association (1975), cujo teor é aqui incorporado por referência.

São exemplos de solventes não aquosos propilenoglicol, polietileno glicol, óleo vegetal e ésteres orgânicos injetáveis tais como etil oleato. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, soluções salinas, veículos parenterais tais como cloreto de sódio, dextrose de Ringer etc. Veículos intravenosos incluem ressupridores de fluidos e de nutrientes. Os preservativos incluem agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes e gases inertes. O pH e a concentração exata dos vários componentes da composição farmacêutica são ajustados de acordo com a perícia de rotina da técnica. Veja-se Boodman e Gilman, The

Pharmacological Basis for Therapeutics (7^a edição).

As composições farmacêuticas particularmente preferidas da presente invenção são aquelas que, além de se ligarem especificamente aos amilóides in vivo e serem capazes de cruzar a barreira sangue-cérebro, são também não tóxicas aos níveis de dosagem apropriados e têm uma duração de efeito satisfatória.

De acordo com a presente invenção, uma composição farmacêutica que compreende compostos de ligação amilóide de tioflavina é administrada a indivíduos em quem se prevê a formação de amilóides ou fibrilas amilóides. Na modalidade preferida, esse indivíduo é uma pessoa humana e inclui, por exemplo, aqueles

58/93 liq “melhoria” prevenção de fibrilas.

o tratamento mais severas

Por ou de que estão em risco de desenvolver amilóides cerebrais, incluindo a população mais velha não demente e pacientes com doenças associadas à amiloidose e diabetes mellitus do tipo 2. O termo “prevenir” pretende-se que inclua a melhoria da degeneração celular e toxicidade associadas à formação significa-se de formas degeneração celular e toxicidade em pacientes que já manifestam sinais de toxicidade, tais como dementes.

A composição farmacêutica compreende compostos de ligação amilóide de tioflavina 15 descritos acima e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa modalidade, essa composição farmacêutica compreende albumina do soro, compostos de ligação amilóide de tioflavina e um tampão de fosfato contendo NaCl. Outros 20 veículos farmaceuticamente aceitáveis soluções aquosas, excipientes não incluindo sais, preservativos, tampões similares, conforme descrito, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15^a 25 edição, Easton: Mack Publishing Co., pp 1405incluem tóxicos, e

The National Washington:

1412 e 1461-1487 (1975) e

Formulary XIV, 14^a edição American Pharmaceutical Association (1975) e United States Pharmacopeia, XVIII, 18^a Ed. Washington: American Pharmeceutical

Association (1995), cujo teor é aqui incorporado por referência.

59/93 llò

São exemplos de solventes não aquosos propilenoglicol, polietileno glicol, óleo vegetal e ésteres orgânicos injetáveis, tais como etil oleato. Veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, soluções salinas, veículos parenterais, tais como cloreto de sódio, dextrose de Ringer etc. Veículos intravenosos incluem ressupridores de fluidos e de nutrientes. Os preservativos incluem agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes e gases inertes. O pH e a concentração exata dos vários componentes da composição farmacêutica são ajustados de acordo com a perícia de rotina da técnica. Veja-se Boodman e Gilman, The

Pharmacological Basis for Therapeutics (7^a edição).

De acordo com a invenção, a composição farmacêutica inventiva poderá ser administrada oralmente, na forma de líquido ou sólido, ou injetada intravenosa ou intramuscularmente, na forma de uma suspensão ou solução. Pelo termo “quantidade farmaceuticamente efetiva” significa-se uma quantidade que impede a degeneração celular e a toxicidade associadas à formação de fibrilas. Essa quantidade variará necessariamente dependendo da idade, peso e condição do paciente e serã ajustada pelas pessoas de conhecimento ordinário na técnica de acordo com protocolos bem conhecidos. Numa modalidade, uma dosagem estaria entre 0,1 e 1OO mgkg¹ por dia ou dividida em dosagens

60/93 llé

menores a serem administradas de duas a quatro vezes ao dia. Esse regime seria continuado numa base diária por toda a vida do paciente. Alternativamente, a composição farmacêutica poderia ser administrada intramuscularmente em doses de 0,1 a 100 mgkg¹ de uma a seis semanas.

De acordo com um aspecto da invenção que diz respeito a método de detecção de depósitos amilóides em tecido de biópsia ou postmortem, o método envolve a incubação de tecido fixado por formalina com uma solução de um composto de ligação amilóide de tioflavina escolhido dentre as estruturas de A a E ou de F a d, descritas acima. De preferência, a solução é 25-100% em etanol (com o restante sendo água) saturada de composto de ligação amilóide de tioflavina de acordo com a invenção. Após incubação, o composto cora ou marca o depósito amilóide no tecido e o depósito corado ou marcado pode ser detectado ou visualizado por qualquer método padrão. Esses meios de detecção incluem técnicas microscópicas tais como microscopia de campo luminoso, de fluorescência, de laser confocal e de polarização cruzada.

O método de quantificação da quantidade de amilóide em tecido de biópsia ou post mortem envolve a incubação de derivado marcado de tioflavina de acordo com a presente invenção ou um sal do mesmo, solúvel em água, não tóxico, com homogenato de tecido de

1/93 lly biópsia ou postmortem. O tecido é obtido e homogenizado por métodos bem conhecidos na técnica. A marcação preferida é uma radiamarcação, embora outras marcações tais 5 como enzimas, compostos quimiluminescentes e imunofluorescentes sejam bem conhecidos dos operadores especializados. O radiomarcador preferido é ¹²⁸I, ¹⁴C ou ³H, sendo o substituinte marcador preferido de um composto de ligação 10 amilóide escolhido dentre as estruturas de A a E ou de F a «J, pelo menos, um de R³-R¹⁴. O tecido que contém depósitos amilóides ligar-se-á aos derivados marcados dos compostos de ligação amilóide de tioflavina da presente 15 invenção. O tecido ligado é, então, separado do tecido não ligado por qualquer mecanismo conhecido do operador especializado, tal como tecido ligado pode, então, ser através de qualquer meio 20 conhecido do operador especializado. As unidades de derivado de tioflavina radiomarcado ligado ao tecido são, então, convertidas em unidades de micrograma de amilóide por 100 mg de tecido por comparação com uma curva 25 padrão gerada por incubação conhecidas de amilóide com trioflavina radiomarcado.

O método de distinção do cérebro da doença de Alzheimer de um cérebro normal 30 envolve a obtenção de tecido de (i) cerebelo e (ii) outra área do mesmo cérebro, além do cerebelo, de indivíduos normais e de indivíduos suspeitos filtração. O quantificado conhecido do de quantidades o derivado de

62/93

de terem a doença de Alzheimer. Esses tecidos são feitos em homogenatos separados usando métodos bem conhecidos do operador especializado e, depois, são incubados com um composto de ligação amilóide de tioflavina radiomarcado. A quantidade de tecido que se liga ao composto de ligação amilóide de tioflavina radiomarcado é, então, calculada para cada tipo de tecido (por exemplo, cerebelo, não cerebelo, normal, anormal) e a razão da ligação do tecido de não cerebelo para o tecido de cerebelo é calculada para tecido de pessoas normais e para tecido de pacientes suspeitos de terem doença de Alzheimer. Estas razões são, então, comparadas. Se a razão do cérebro suspeito de ter a doença de Alzheimer for acima de 90% das razões obtidas a partir de cérebros normais, é feito o diagnóstico de doença de Alzheimer. As razões normais podem ser obtidas a partir de dados previamente obtidos ou, alternativamente, podem ser recalculadas, ao mesmo tempo que o tecido cerebral suspeito é estudado.

Modelagem molecular

A modelagem molecular foi feita usando o programa de modelagem por computador Alchemy2OOO Tripost, Inc., St. Louis, MO, para gerar as cadeias de peptídeos Αβ na conformação beta-laminar anti-paralela,

Kirschner e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Scí. U. S. A. 83:503 (1986). Os peptídeos amilóides

63/93

lld foram colocados em alças de alfinete de cabelo (Hilbich e colaboradores, J. Mol. Biol. 2 18:149 (1991)) e usados sem maior refinamento estrutural. Os peptídeos Αβ foram alinhados de forma que as cadeias alternadas ficassem espaçadas de 4,76Á, característico das fibrilas beta-laminares, Kirschner, supra. Os derivados de tioflavina T forma minimizados quanto à energia e alinhados com o modelo fibrilar para maximizar o contato com Asp-23 / Gin-1 5/His-1 3 de Αβ(1-42).

Caracterização da ligação específica ao peptídeo sintético Αβ:

afinidade, cinética e ligação máxima

As características da ligação do derivado de tioflavina foram analisadas usando Αβ(1-40) e 2-(4’-[¹¹C]metilamino-fenil)-benzotiazol( [N-metil- ¹¹C]BTA- 1 ] em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,0) ou tampão de glicina/20% de etanol (pH 8,0), conforme previamente descrito para a ligação quisaminaG, Klunk e colaboradores, Neurobiol. Aging 15:691 (1994)

A sequência de aminoácido para Αβ(1-4Ο) é como se segue:

64/93 iiZ)

1	2	3	4	5	6	Y	8	9	IO	11	12
Asp	Ala	Glu	Phe	Arg	His	Asp	Ser	Gly	Tyr	Glu	Vai
13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23	24
His	His	Gin	Lys	Leu	Vai	Phe	Phe	Ala	Glu	Asp	Vai
25	26	27	28	29	30	3 1	32	33	34	35	36
Gly	Ser	Asn	Lys	Gly	Ala	Ile	Ile	Gly	Leu	Met	Vai
37	38	39	40
Gly	Gly	Vai	Vai

Preparação de derivados de tioflavina para coloração de tecidos

Tanto a Tioflavina S (ThS) como a Tioflavina T (ThT) foram utilizadas como farmacóforos (veja-se, por exemplo, Figura 1). Observa-se que ambos os compostos contêm aminas quaternárias e são, portanto, muito bidrofílicos como resultado.

A [C-14]ThT foi sintetizada e usada para determinar a lipofilicidade relativa por partiona-mento entre octanol e solução salina tamponada com fosfato. O log do coeficiente de partição, log Pact, verificou-se ser de 0,57 para a[C-14]ThT. Determinou-se que a amina quaternária torna a THT demasiadamente polar para uso como agente efetivo de formação de imagens cerebrais. Com base nos resultados dos derivados do vermelho do Congo lipofílico (fenóis não carregados em pH fisiológico, mas,

65/93 ±11

potencialmente ionizáveis com u.m pK_a de ~8,5)(Kjunk e colaboradores, WO09634853A1, WO09847969A1, WO09924394A2), os inventores removeram o grupo metila do nitrogênio do benzotiazol para os derivados da THT. A remoção da metade metílica eliminou a amina quaternária carregada da parte heterocíclica da molécula, deixando uma amina aromática que tem tipicamente valores de pKb ~5,5. É usada nomenclatura abreviada para os derivados de ThT na qual o esqueleto básico é designado por BTA (para BenzoTiazolAnilina). Os substituintes sobre o anel de benzotiazol são colocados antes do “B”e o número de grupos metila sobre o nitrogênio da anilina é colocado após o “A” (veja-se, por exemplo, a Figura 2).

1.Coloração preliminar do tecido com TliT e derivados

A ThT (veja-se, por exemplo, a Figura 1) é um corante fluorescente que tem sido usado como corante histológico para amilóides (Burns e colaboradores, “The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T”, Journal of pathology & Bacteriology 94:337-344; 1967).

A ThT cora fracamente placas (veja-se, por exemplo, a Figura 3) emaranhados, filamentos de neurópilo e amilóides cerebrovasculares (CVA) no cérebro AD. A coloração preliminar do tecido mostra que tanto a amina primária 2-(4’amino fenil) - β-metil-benzotiazol (6-Me-BTA-O) como a amina terciária 2-(4’-dimetilaminofenil)30

66/93

Lu.

β-metil-benzotiazol (6-Me-BTA-2) também coram placas e emaranhados no cérebro AD postmortem (veja-se, por exemplo, a Figura 3). Os experimentos em que as concentrações de 6Me-BTA-0 e 6-Me-BTA-2 foram progressivamente diminuídas mostraram que a coloração tanto por 6-Me-BTA-O como por 6-MeBTA-1 podiam ainda ser detectadas com soluções corantes contendo apenas lOnM do composto BTA. Em contraste, BTP (2fenilbenzotiazol) não parece corar placas, porém, este composto não é quase tão fluorescente quanto os derivados de BTA. Assim, no desenvolvimento destes compostos, a coloração dos tecidos serviu a finalidade dupla de avaliar a especificidade da coloração no tecido cerebral AD, assim afinidade de ligação por soluções corantes numa faixa de concentrações semelhante àquela empregada nos ensaios de ligação.

como avaliar rastreamento a

de

II. Modelos de ligação de derivados do vermelho do Congo e ThT a Αβ

Existem algumas teorias àcerca do mecanismo de ligação da ThT ao β-amilóide, mas, nenhuma teoria específica foi provada nem aceite. Contudo, o mecanismo parece ser específico e saturável (LeVine, “Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with tbioflavin T”, Meth. Enzymol. 309:272-284 (1999). Assim, seria possível localizar o(s)

67/93

CR ponto(s) de ligação potencial sobre Αβ e desenvolver um modelo de ligação de maneira análoga àquela usada para desenvolver o modelo de ligação vermelbo do Congo (CR) / 5 crisamina-G (CG) do (Klunk e colaboradores, “Developments of small molecule probes for tbe beta-amyloid protein of Alzheimer’s disease” Neurobiol. Aging 15:691-698; 1994) baseado nas propriedades estruturais e de ligação seguintes. 10 Primeiro, TbT e CG têm cargas opostas em pH fisiológico e é pouco provável que compartilbem um sítio de ligação comum. Isto é apoiado pela falta de competição da TbT pela ligação [³H]CG a fibrilas Αβ (veja-se, por exemplo, a Figura 5).

Estudos estruturais prévios de fibrilas

Αβ (Hilbich e colaboradores, “Aggregation and secondary structure of synthetic amyloid beta A4 peptides of Alzheimer’s disease”, Journal of Molecular Biology 2 1 8: 149-63; 199 1) e ligação a fibrilas Αβ sugeriram um modelo molecular em que CG se liga através de uma combinação de interação eletrostática e à área do Lys-16 (veja-se, por Figura 4). Os estudos de LeVine (LeVine, ibíd) ajudam a localizar o sítio da ligação ThT a Αβ mostrando que a ThT se liga bem a Αβ12-28, mas, desprezívelmente a Αβ2535. Isto sugere que o sítio de ligação da ThT se situa algures entre os resíduos 12 e 24 da Αβ. 30 É provável que a ThT carregada positivamente (amina quaternária) seja atraída para os resíduos carregados negativamente (acídicos) hidrofóbica exemplo, a

68/93

sobre a Αβ. Entre os aminoácidos 12 e 24, os únicos resíduos acídicos são Glu-22 e Asp-23. Embora ambos estes sejam candidatos, o modelo existente prediz que Glu-22 está envolvido muito próximo do sítio de ligação Lys16 para CG. O modelo corrente “operacional” localiza a ligação ThT para a área do Asp-23 — do lado oposto da fibrila a partir do sítio CG proposto. Uma vez que a característica chave da ligação da ThT (e CG) é a presença de uma fibrila beta-laminar, a ligação deve exigir mais do que apenas um único resíduo de aminoácido. O sítio de ligação existe quando os resíduos que normalmente não interatuam em monômeros são postos em conjunto na fibrila beta-laminar. Portanto, sem ficar ligado a nenhuma teoria particular, acredita-se que a ThT também interatue via ligações de hidrogênio com His-13 e Gin-15 de uma molécula Αβ adjacente separada que compreende a fibrila betalaminar.

III Radiomarcação de ThT e ensaios de ligação a radioligante

A avaliação da ligação por coloração tecidular é útil, particularmente para a avaliação da especificidade. O composto BTP, que não é muito fluorescente, pode não mostrar não se liga porque não é coloração, quer porque suficientemente bem, quer suficientemente fluorescente. Além da coloração do tecido AD, podem ser conduzidos

69/93

Uó

ensaios de quantitativos de ligação espetrofotometricamen-te (LeVine, ibid). Este ensaio depende do desvio metacromático espetral que ocorre, quando a ThT se liga à fibrila amilóide. Embora este ensaio possa ser útil para individualmente rastrear compostos altamente fluorescentes que mostrem este desvio metacromático, não foi determinado que seria útil para ensaios de competição. Por exempolo, é observado comumente que compostos de teste (por exemplo, CG) dominam a fluorescência do complexo ThT-Αβ (assim como a ThT sozinha) Os compostos que dominam, mas, não se ligam ao sítio da ThT parecerão enganadoramente ligar-se. Portanto, é preferível usar ThT radiomarcada em ensaios típicos de ligação de radioligante com Αβ agregada. Neste ensaio, a inibição da ligação ThT radiomarcada ao Αβ capturado em filtros representaria a inibição autêntica da ligação ThT e não exige que o composto de teste seja altamente fluorescente.

Os exemplos seguintes são dados para ilustração da presente invenção. É para ser entendido, contudo, que a invenção não deve ficar limitada às condições ou detalhes específicos descritos nestes exemplos. Através do Relatório Descritivo, quaisquer e todas as referências a documentos disponíveis publicamente, incluindo patentes americanas, ficam incorporadas especificamente neste pedido de patente por referência.

70/93

Exemplos

Todos os reagentes usados na síntese foram adquiridos de Aldrich Chemical Company e usados sem purificação adicional. Os pontos de fusão foram determinados em Mel-Temp II e não foram corrigidos. Os espetros NMR de todos os compostos foram medidos em Bruker 300 usando TMS como referência interna e estavam de acordo com as estruturas atribuídas. A TLC foi realizada usando Silica Gel 60 F254 de EM Sciences e detectada sob lâmpada UV. A cromatografia flash foi realizada sobre sílica gel 60 (malha 230-400, adquirida de Malinkrodt Company). A TLC de fase reversa foi adquirida de Whiteman Company.

Exemplos de sínteses Exemplol: síntese de derivados de base primulina:

Via 1: O exemplo da síntese de compostos de primulina está de acordo com o esquema de reação mostrado abaixo:

71/93 tu

Os derivados de primulina são preparados com base no método de Schubert (Schubert, M., Zur Kenntnis der

Dehydrothiotoluidin-and Primulin-sulfosáuren, Justus Liebigs Ann. Chem. 558, 10-33, 1947) através da condensação de 2-amino-5-metiltiofenol com cloreto de 2-(p-nitrofenil)-benzotiazol6-carboxílico e subsequente redução do grupo nitro com cloreto de estanho em etanol. Os derivados substituídos da base de primulina são sintetizados com os p-nitrobenzoilcloretos substituídos apropriados e 2-aminotiofenol R⁷R¹⁰ substituídos.

Seguindo a mesma estratégia acima, os outros derivados de primulina reivindicados podem ser sintetizados por substituição do derivado ácido 3-mercapto-4-aminobenzóico apropriado substituído (por exemplo, ácido 2-, 5- ou 6-metil-3-mercapto-4-aminobenzóico), o derivado apropriado de cloreto de 4-nitrobenzoíla (por exemplo, cloreto de 2- ou 3-metil4-nitro-benzoíla) ou o derivado apropriado de 230

72/93 amino-5-metiltiofenol (por exemplo, 3,5-, 4,5ou 5,6-dimetil-2-aminotiofenol).

Exemplo 2: síntese de derivados de 2-[2-(4’-aminofenil)e tilenil]-benzo tiazol

Via 3: Exemplo da síntese de BTEA-O, 1, 2 e BTAA-O, 1, 2 que são representativos do grupo de compostos BTEA e BTAA estava de acordo com o esquema de reação mostrado abaixo:

(a) Trans-2-(4-nitrofeniletenil)benzotiazol (11)

73/93

O cloreto de írans-4-nitrocinamila IO (l,77g, 9,5 mmol, 1,2 eq.) em DMF (20 ml) foi adicionado gota a gota a uma solução de 2aminotiofenol 9 (1,0 g, 8,0 mmol) em DMF (15 ml) à temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A mistura reacional foi vazada de 10% de carbonato de O particulado foi coletado pro pressão reduzida. A recristalização a partir do metanol deu 1,92 g (85,1%) do produto 11.

numa solução sódio(100 ml), filtração sob (b) 2-(4-aminofeniletenil)benzotiazol (12)

Submeteu-se a refluxo uma mistura de 2 - (4nitrofeniletenil)benzotiazol 11 (500 mg, 1,7 mmol) e dihidrato de cloreto de estanbo (II) (1,18 g, 5,2 mmol) em etanol anidro sob N₂ durante 4 horas. O etanol foi removido por evaporação a vácuo. O resíduo foi dissolvido em acetato de etila (20 ml), lavado com solução de NaOH (1 N, 3x 20 ml) e água (3 x 20 ml) e secado sobre MgSO4- A evaporação à secura deu 40 mg (8,0%) do produto 12.

(c) 2-(4-aminofeniletenil)benzotiazol (13)

Aqueceu-se uma mistura de 2-(4aminofeniletenil)benzotiazol 12 (7 mg), Mel (3,9 mg) e K2CO3 anidro (1OO mg) em DMSO (anidro, 0,5 ml) a 100°C durante 16 horas. A mistura reacional foi purificada com TLC de fase

74/93

1.39 invertida (MeOH :Η2θ = 7,1) para dar 2,5 mg (32,7%) do produto 13.

(d) 2-(4-aminofeniletenil)benzotiazol (14)

Dissolveu.-se 2 - (4-nitro fenile te nil) benzotiazol (30 mg, 0,10 mmol) em MeOH (10 ml). Adicionou-se Pd/C (1O%, 40 mg) e a mistura reacional foi agitada sob atmosfera de H2 à temperatura ambiente durante 60 boras. O catalisador foi filtrado e lavado com metanol (cerca de 2 ml). A evaporação do filtrado deu o produto crú que foi purificado com TLC (hexanos: acetato de etila=7O:4O) para dar 15 mg (50%) do produto. TOMR (300 MHz, MeOHd₄) 6:7,88 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7), 7,86 (d, J = 8,l

Hz, 1H,	H-4),	7,48 (dd, di=d2 = 6,2 Hz,	1H,	H-5
ou H-6),	7,38	(dd, Ji=J2 = 8,2 Hz, 1H, H	-5 ou H-
6), 6,96	(d,	J = 6,8Hz, 2H, H-2’, 6’),	6,62	(d,
J = 6,8Hz,	2H,	H-3’, 5’), 3,36 (t, J = 7,4Hz,	2H,

CH₂), 3,03 (t, J=7,4Hz, 2H, CH₂).

(e) 2-(4-dimetilaminofeniletenil)benzotiazol (16)

Aqueceu-se uma mistura de 225 aminotiofenol 9 (0,51 g, 4,1 mmol) ácido trans4-dimetilaminocinâmico 14 (0,79 g, 4,1 mmol) e PPA (lOg) a 220°C durante 4 horas. A mistura reacional foi arrefecida à temperatura ambiente e vazada em solução de carbonato de potássio a

1O% (-400 ml). O resíduo foi coletado por filtração sob pressão reduzida. A purificação com coluna de descarga (hexanos: etil ±31

75/93 acetato = 2:l) deu 560 mg (48,7 %) do produto 15 na forma de sólido amarelo.

(f) 2-(4-dime tilaminofenile tilenojbenzotiazol (17)

Dissolveu-se 2- (4-dime tilaminofenile tenil)benzotiazol (12mg, 0,038 mmol) em MeOH (5 ml). Adicionou-se Pd/C (10%, 20 mg) e a mistura reacional foi agitada sob atmosfera de H₂ ã temperatura ambiente durante 16 Horas. O catalisador foi filtrado e lavado com metanol (cerca de lml) A evaporação do filtrado deu 7 mg (58%) do produto iHNMR (300 MHz, acetona-do) 0:7,97 (d, J = 8,3

Hz,	1H, H-7), 7,93 (d, J =	= 8,1	Hz, 1H,	H-4),	7,48
(dt,	J = 6,2 Hz, J=l,lHz,	1H,	H-5 ou	H-6),	7,38
(dt,	J = 8,2 Hz, J=l,lHz,	1H,	H-5 ou	H-6),	7,13
(d,	J = 6,8Hz, 2H, H-2’, 6’)	, 6,	68 (d, J =	6,8Hz	, 2H,

H-3’, 5’), 3,37 (t, J=7,4Hz, 2H, CH₂), 3,09 (t,

J = 7,4Hz, 2H, CH₂), 2,88 (s, 6H, NMe₂).

Exemplo 3: síntese de derivados de 2-(4’-aminofenil)benzotiazol

Via 1: Exemplo da síntese de 6-MeO25 BTA-0, -1, -2, que são representativos do grupo de compostos BTA com substituintes R⁷-R¹⁰ assim como R³-R⁶ (Shi e colaboradores, “Antitumor Benzothiazoles. 3. Synthesis of 2(4-aminophenyl)benzothiazoles and Evaluation of Tbeir Activities Against Breast Câncer Cell Lines in Vitro and in Vivo”, J\ Med. Chem. 39:3375-3384, 1986):

76/93

ch₃i h₃co.

k₂co₃ 'N

(a) 4-metoxi-4’-nitrobenzanilida (3)

Dissolveu-se p-Anisidina 1 (1,0 g, 8,1 mmol) em piridina anidra (15 ml). Adicionou-se cloreto de 4-nitrobenzoíla 2 (1,5 g, 8,1 mmol). A mistura reacional foi deixada permanecer à temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura reacional foi vazada em água e o precipitado foi coletado com filtrado sob pressão de vácuo e lavado com bicarbonato de sódio a 5% (2 x 10 ml). O produto 3 foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. ^NMR (300 MHz, DMSO-do) 0:10,46 (s, 1H, NH), 8,37 (d, d = 5,5 Hz, 2H, H-3’, 5’) 8,17 (d, J = 6,3 Hz, 2H,

77/93

H-2’, 6’), 7,48 (d, d = 6,6 Hz, 2H), 6,97 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 3,75 (s, 3H, MeO).

(b) 4-metoxi-4’-nitrobenzanilida (4)

Foi aquecida com refluxo u.ma mistura de 4-metoxi-4’-nitrotiobenzanilina 3 (1,0 g, 3,7 mmol) e reagente de Lawesson (0,89 g, 2,2 mmol, 0,6 equiv.) em clorobenzeno (15 ml) durante 4 boras. O solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado com coluna de descarga (hexano: acetato de etila=4:l) para dar 820 mg (77,4%) do produto 4 como sólido de cor laranja.

iHNMR (300 MHz, DMSO-do) 6:8,29 (d,

2H, H-3’, 5’), 8,00 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-2’, 6’)

7,76 (d, 2H), 7,03 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 3,808.37 (d, J = 5,5 Hz, 2H, H-3’, 5’), 8,17 (d, J=6,3Hz, 2H, H-2’, 6’), 7,48 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 6,97 (d,

J = 6,5Hz, 2H), 3,75 (s, 3H, MeO) (s, 3H, MeO).

(c) 4-metoxi-2-(4-nitrofenil)-benzotiazol (5)

Umidificou-se 4-metóxi-4 ’-nitro tio benzanilidas 4 (0,5 g, 1,74 mmol) com um pouco de etanol (~O,5 ml) e adicionou-se solução aquosa de hidróxido de sódio a 30% (556 mg 13,9 mmol, 8 equiv.). A mistura foi diluída com água para proporcionar uma solução /suspensão final de hidróxido de sódio aquoso a 10%. Adicionaram-se alíquotas desta mistura em intervalos de 1 minuto a uma solução agitada de ferricianeto de potássio (2,29 g, 6,9 mmol, 4 equiv) em água (5 ml) a 8O-9O°C. A mistura

78/93

reacional foi aquecida por mais 0,5 hora e, depois, deixada arrefecer. O particulado foi coletado por filtração sob pressão de vácuo e lavado com água, purificado com coluna de descarga (hexano: acetato de tila=4:l) para dar 130 mg (26%) do produto 5. ^XHNMR (300 MHz, acetona-do) 0:8,45 (m, 4H), 8,07 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-4) 7,69 (s, 1H, H-7), 7,22 (d, J = 9,O Hz, 1H, H-5), 3,90 (s, 3H, MeO).

(d) 6-metoxi-2-(4-aminofenil)benzotiazol (6)

Agitou-se uma mistura de 6-metoxi-2-(4nitrofenil)benzotiazóis 5 (22 mg, 0,077 mmol) e dibidrato de cloreto de estanho (II) (132 mg, 0,45 mmol) em etanol em ebulição sob nitrogênio durante 4 horas. O etanol foi evaporado e o resíduo foi dissolvido em acetato de etila (10 ml), lavado com hidróxido de sódio IN (2 ml) e água (5 ml) e seco sobre MgSÜ4. A evaporação do solvente deu 19 mg (97%) do produto 6 como sólido amarelo.

(e) 6-metoxi-2-(4-metiloaminofenil) benzotiazol (7) e 6-metoxi-2-(4-dimetil amino fenil)-benzotiazol (8)

Aqueceu-se uma mistura de 6-metoxi-2(4-aminofenil)benzotiazol 6 (15 mg, 0,059 mmol), Mel (8,3 mg, 0,060 mmol) e K2CO3 (1OO mg, 0,72 mmol) em DMSO (anidro, 0,5 ml) a

1OO°C durante 16 horas. A mistura reacional foi purificada por TLC de fase invertida (MeOH:H₂O = 7:1) para dar 2,0 mg (13,3%) de 679/93

metoxi-2-4-metilaminofenilbenzotiazol 7 e 6 mg de (40%) de 6-metoxi-2-(4-dimetilaminofenil)benzotiazol (8).

^XHNMR de 7 (300 MHz, acetona do) ô:7,86 (d, 3 = 8,7 Hz, 2H, H-2’, 6’), 7,75 (dd, = 8,8 Hz, J=l,3Hz, 1H, H-4) 7,49 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-7), 7,01 (dd, J = 8,8 Hz, J = 2,4 Hz, H-5),

6,78 (d, J = 7,6Hz, 2H, H-3’, 5’), 3,84 (s, 3H,

MeO), 2,91 (s, 3H, NMe).

^XHNMR de 8 (300 MHz, acetona do)

0:7,85 (d, 3 = 8,7 Hz, 2H, H-2’, 6’), 7,75 (dd, = 8,8 Hz, 3=1,3 Hz, 1H, H-4), 7,49 (d, 3 = 2,4 Hz, 1H, H-7), 7,01 (dd, 3 = 8,8 Hz, 3 = 2,4 Hz, H-5),

6,78 (d, 3 = 7,6Hz, 2H, H-3’, 5’), 3,48 (s, 3H,

MeO), 3,01 (s, 6H, NMe₂).

Seguindo a mesma estratégia acima, os outros derivados reivindicados 2-(4’-aminofenil)benzotiazol podem ser sintetizados substituindo o derivado de anilina substituída apropriado (por exemplo, 2-, 3- ou 4-metilanilina) e o derivado de cloreto de 4-nitro-benzoíla apropriado (por exemplo, cloreto de 2- ou 3metil-4-nitro-benzoíla).

Exemplo 4: síntese de derivados BTA sem substituição R⁷-R¹⁰

Via 2: exemplo da síntese de compostos BTA-0, -1, -2 que são representativos do grupo de compostos BTA sem R¹-R¹⁰ (Garmaise e colaboradores, “Antihelmintic Quaternary Salts. III. Benzothiazolium Salts”. 3. Med. Chem. 12:30-36 (1969):

80/93

(a) 2-(4-nitrofenil)benzotiazol (19)

Adicionou-se gota a gota uma solução de cloreto de 4-nitrobenzoíla (1,49 g, 8,0 mmol) em benzeno (anidro, 10 ml) a 2-aminotiofenol (1,0 25 g, 8,0 mmol em 10 ml de benzeno) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi deixada em agitação durante 16 horas. A reação foi parada com água (20 ml). A camada aquosa foi separada e extraída com acetato de etila (3 x 10 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas e evaporadas. O produto crú foi purifica-do com coluna de

81/93 descarga (hexano: acetato de etila=85:15) para dar 1,5 g (73,2 %) de produto na forma de sólido amarelo claro.

(b) 2-(4-aminofenil)benzotiazol (20)

Submeteu-se a refluxo uma mistura de 2-(4-nitrofenil)henzotiazol (105 mg, 0,40 mmol) e dihidrato de cloreto de estanho (II) (205 mg, 0,9 1 mmol) em etanol (20 ml) sob N₂ durante 4 horas. Após remover o etanol por evaporação a vácuo, o resíduo foi dissolvido em acetato de etila (20 ml) e lavado com solução de NaOH (IN, 3 x 20ml) e água (3 x 20 ml), seco e evaporado à secura para dar 102 mg (97%) do produto.

(c) 2-(4-metilaminofenil)benzotiazol (21) e 2-(4-dimetilaminofenil)benzotiazol (23)

Aqueceu-se uma mistura de 2-(4-amino fenil)benzotiazol 20 (15 mg, 0,066 mmol), Mel (9,4 mg, 0,066 mmol) e K2CO3 (135 mg, 0,81 mmol) em DMSO (anidro, 0,5 ml) a 1OO°C durante 16 horas. A mistura reacional foi purificada por TLC de fase inversa (MeOH:H₂O = 6:1) para dar 1,5 mg (10%) de 2-(4metilaminofeniljbenzotiazol 2 1 e 2,5 mg (16,7%) de 2-(4-dimetilaminofenil)benzotiazol 23.

(d) 2-(4-dimetilaminofenil)benzotiazol (23)

Aqueceu-se	a	mistura	de 2-
aminotiofenol 9 (0,5	g>	4,0 mmol)	ácido 4-
dimetilaminobenzói-co	22	(0,66 g, 4,0	mmol) e
PPA (10 g) a 22O°C durante 4 horas. A mistura

82/93

1-¾¾ reacional foi arrefe-cida à temperatura ambiente e vazada numa solução de carbonato de potássio a 10% ( — 400 ml). O resíduo foi coletado por filtração sob pressão de vácuo para dar 964 mg do produto 23, que era de cerca de 90% de pureza na análise ^XHNMR. A recristalização de 100 mg de 23 em MeOH deu 80 mg do produto puro.

¹HNMR (300 MHz, acetona-do) 6:7,12 (d, J = 7,7Hz, 1H, H-7), 7,01 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-4) 6,98 (d, J = 9,l Hz, 2H, H-2’, 6’), 6,56 (t, J = 7,8 Hz, J = 7,3 Hz, 1H, H-5 ou H-6), 5,92 (d, d = 8,9 Hz, 1H, H-3’, 5’), 2,50 (s, 6H, NMe₂).

Seguindo a mesma estratégia acima, os outros derivados reivindicados 2-(4’-aminofenil) benzotiazol 23 podem ser sintetizados substituindo o derivado apropriado de cloreto de 4nitro-benzoíla (por exemplo, cloreto de 2- ou 3metil-4-nitro-benzoíla) ou o derivado do ácido 4dimetilaminobenzóico (por exemplo, ácido 2- ou 3-metil-4-dimetilamino-benzoico).

Exemplo 5: síntese de derivados do bis-2,2’-(4’-aminofenil)-dibenzotiazol

Via 1: seguindo o procedimento geral para os compostos 6-Meo-BTA descritos acima, mas, substituindo benzidina por p-anisidina e usando 16 equivalentes de cloreto de 4nitrobenzoíla, resulta o seguinte composto:

83/93

Seguindo a mesma estratégia acima, os outros derivados bis-2,2 ’-(4’-aminofenil)-dibenzotiazol podem ser sintetizados via derivado de benzidina substituído apropriado (por exemplo, 2,2’-, 3,3’-dimetilbenzidina) e o derivado apropriado de cloreto de 4-nitrobenzoíla (por exemplo, cloreto de 2- ou 3-metil-4-nitrobenzoíla).

Via 2: os derivados assimétricos bissao de Suzuki 6-iodo- (2 -psubstituídos

2,2 ’-(4 amino fenil)-dibenzotiazol sintetizados através de ligação catalisada por paládio dos nitrofenil)benzotiazóis apropriados que podem ser preparados seguindo a mesma estratégia que os compostos 6-MeO-BTA e redução subseqüente de grupos nitro (Ishiyama e colaboradores, “Palladium (O)-Catalyzed Cross-Coupling Reaction of Alkoxydiboron witb Haloarenes: a Direct Procedure for Arylboronic Esters”, Tetrahedron Lett., 38, 3447, 1997).

84/93

1Η0 \=/ PdCl₂(d_PPf), KOAc \=/ PdCl₂(dppf),K₃PO₄

Exemplos biológicos

Exemplo 6: Determinação da afinidade para Αβ e captura cerebral de derivados de tioflavina

Conduziram-se estudos iniciais de ligação competitiva usando [³H]CG e Αβ(1-40) sintéticos para determinar-se se CG, ThS e ThT se ligavam no mesmo sítio. Foi determinado que ThS competia com [³H]CG quanto aos sítios de ligação em Αβ(1-4Ο), mas, ThT não (veja-se, por exemplo, a Figura 5). A [N-metil-¹¹C]BTA-1 de elevada atividade específica (veja-se a Tabela 1) foi, então, sintetizada por metilação de BTAO. Realizaram-se estudos de ligação com [Nmetil-¹¹C] BTA-1 e fibrilas de 200 nM de Αβ(140). A ligação específica de [N-metil-¹¹C]BTA-1 foi de -70%. A Figura 5 (veja-se o painel direito) mostra as curvas de competição para os sítios Αβ por ThT, BTA-0, BTA-1 e BtA-2 usando o ensaio de ligação do [N-metil-^{1 X}C]BTA- 1. Os Ki’ foram: 3,O±O,8 nM para BTA-2; 9,6±1,8 nM para o BTA-1; 1ΟΟ±16ηΜ para o BTA-O; e 1800+510 nM para ThT. Não apenas a amina

85/93

1Μ1 quaternária da ThT não é necessária para a ligação às fibrilas Αβ, parece decrescer a afinidade da ligação também.

Na Tabela 1 abaixo, estão cinco diferentes derivados BTA ¹¹C marcados em que foram determinadas as suas propriedades de ligação ín vitro, os valores de logP e as propriedades de captura e retenção pelo cérebro in vivo em ratos.

86/93

ri

V ri h

143

87/93

1ΜΗ

88/93

in

89/93 iHó

ΙΟ

Os dados mostrados na Tabela 1 são notáveis, particularmente para os derivados marcados com ^1XC 6-MeO-BTA-l e BTA-1. Estes compostos exibiram afinidade relativamente elevada para Αβ, com valores de Ki<lOnM e entraram prontamente no cérebro do rato com valores de captura >O,4%ID/g*kg (ou >13%ID/g para animais de 30 grama). Além disso, os valores de concentração da radioatividade no cérebro de 30 minutos eram menores do que O,l%ID/g*kg, resultando em razões de concentração de 2 minuto para 30 minuto >4. Ambos os compostos Ν,Ν-dimetila desapareceram menos rapidamente do tecido cerebral do rato do que os derivados N-metila. Da mesma forma, a única amina primária correntemente testável, 6-MeO-BTA-O, mostrou fraco desaparecimento do cérebro. Este resultado surpreendente e inesperado apoia o uso específico da amina segundária (por exemplo, -NHCH3), como agente de formação de imagens in vivo.

Exemplo 7: Experimentos de formação de imagens PET in vivo em babuínos

Preparam-se grandes quantidades de 6Me-BTA-1 e 6-MeO-BTA-l marcados com ^1:LC de elevada atividade específica (>2OOOCI/mmol) para estudos de formação de imagens cerebrais em babuínos anestesiados de 2O-3Okg usando o tomógrafo Siemens/CTI HR+ em modo de coleta de dados 3D (resolução nominal FW/HM 4,5 mm). Os estudos de formação de imagens cerebrais foram conduzidos seguindo-se a injeção intravenosa de 3-5mCi de radiotraçador.

90/93

As curvas típicas de atenuação e de atividade— tempo corrigido-desintegração para uma região de interesse do córtex frontal para cada um dos três compostos estão mostradas na Figura 6. Observa-se que a captura absoluta do cérebro destes 3 compostos em babuínos é muito semelhante à dos ratos (isto é, cerca de 0,47 a 0,39%ID/g*kg). Contudo, a taxa normal de desaparecimento do cérebro dos três radiotraçadores é consideravelmente mais baixa em babuínos em comparação com ratos, com razões de pico para 60 minutos na faixa de 2,4 a 1,6 em comparação com razões elevadas de 7,7 para 30 minutos nos ratos. A ordem de faixa de captura cerebral máxima e taxa de desaparecimento dos três compostos foram também as mesmas em ratos e em babuínos. A captura cerebral dos radiotraçadores não pareceu ser limitada pelo fluxo sanguíneo (Figura 6, inserção). Foram obtidas as amostras de sangue arterial nos babuínos a seguir à injeção de todos os três compostos e mostraram que os seus perfis metabólicos eram muito semelhantes. Apenas metabólitos altamente polares que eluíram próximo do volume vazio (4 ml) da coluna HPLC anlítica de fase inversa foram observados no plasma em todos os momentos a seguir à injeção, enquanto o traçador não metabolizado eluía a cerca de 20 ml. Qunatidades típicas de injetados não metabolizados no plasma para todos os três compostos foram de cerca de 90% em 2 minutos; 35% a 30 minutos; e 20% a 60 minutos.

1/93

Estão mostradas na Figura 7 imagens transversais PET em dois níveis do cérebro de babuíno a seguir à injeção i.v. de 3 mCi de [Nmetil-¹¹CJBTA-1. Os arquivos de emissão coletados 5-16 minutos pós-injeção foram somados para prover as imagens. As regiões cerebrais incluem: Ctx (córtex); Thl (tálamo); Occ (córtex occipital); e Cer (cerebelo). Observese a distribuição uniforme de radioatividade através do cérebro, indicando falta de especificidade de ligação regional no cérebro normal.

Exemplo 8: Coloração de depósitos amilóides no cérebro de ratos AD postmortem e Tg

Seções de tecidos cerebrais postmortem a partir de cérebro AD e um rato transgênico com 8 meses de idade PS 1 /APP [explicar o que este modelo costuma mostrar] foram coradas com BTA-1 não marcada. O modelo do rato PS 1/APP combina duas mutações de genes humanos conhecidos como causando a doença de Alzheimer num rato duplamente transgênico que deposita fibrilas Αβ em placas amilóides no cérebro começando aos 3 meses de idade. Mostram-se micrografias típicas de fluorescência na Figura 8 e a coloração das placas amilóides por BTA-1, tanto em tecido postmortem AD, como no tecido cerebral de

PS 1/APP, é claramente visível. O amilóide cerebrovascular também estava corado com brilho (Figura 8, à direita). A outra marcação neuropatológica característica do cérebro AD, emaranhados neurofibrilares (NFT), é mais

92/93

IMS fracamente corada pela BTA-1 no cérebro AD (Figura 8, ã esquerda). Não foi observado NFT nos modelos do rato transgênico de deposição amilóide.

Exemplo 9 — marcação e detecção in vivo de depósitos amilóides em ratos transgênicos

Três ratos transgênicos PS 1/APP de 17 meses de idade foram injetados intraperitoneal1O mente (ip) com dose única de IO mgkg¹ de BTA1 numa solução de DMSO, propilenoglicol e pH 7,5 PBS (v/v/v/ 10/45/45). Vinte e quatro horas mais tarde, empregou-se microscopia de fluorescência multifotônica para obter imagens 15 de elevada resolução nos cérebros de ratos vivos usando uma técnica de janela

Imagens típicas in vivo de PS 1/APP são mostradas claramente distinguíveis 20 cerebrovasculares. Os estudos de microscopia multifotônica demonstram a especificidade in vivo de BTA-1 para Αβ em ratos transgênicos PS 1 /APP.

Outras modalidades da invenção serão 25 evidentes aos especialistas na técnica a partir da consideração do Relatório Descritivo prática da invenção aqui revelada.

que o Relatório Descritivo seja apenas, como exemplificativo, com 30 espírito autênticos da invenção sendo indicados pelas reivindicações seguintes.

Conforme aqui usado e nas reivindicações seguintes, pretende-se que os artigos craniana.

BTA-1 num rato na Figura 9 e são placas e amilóides da

Pretende-se considerado o escopo e

93/93

143 singulares tais como “um”, “uma”, se refiram singular ou ao plural.

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Composto, caracterizado por que é da fórmula seguinte ou um sal do mesmo, solúvel em água, não tóxico:

   Y em que

   Z é S;

   Y é NR¹R²;

   R¹ é selecionado a partir do grupo que consiste em H, metil, propil, (CH2)nOR' (em que n=1, 2 ou 3 e R' é H ou um grupo alquila C1-C8), CF3, CH2-CH2X e CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I);

   R² é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo alquila C1-C8, (CH2)nOR' (em que n=1, 2 ou 3 e R' é H ou um grupo alquila C1-C8), CF3 e CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I);

   R³-R¹⁰ são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, F, Cl, Br, I, um grupo alquila C1-C8, (CH2)nOR' (em que n=1, 2 ou 3) e OR'; e

   R' é H ou um grupo alquila C1-C8;

   em que pelo menos um de R¹-R¹⁰ contém o radiomarcador ¹¹C, ¹²³I, ¹²⁵I ou ¹³¹I e ¹⁸F e os compostos são isentos de átomos de nitrogênio quaternário, com a condição de que o composto não seja 5-¹⁸fluor-2-(4'-amino3 'metilfenil) benzotiazol ou 6-¹⁸fluor-2- (4 '-amino-3 'metilfenil) benzotiazol.
2. 2/9

   2 - Composto, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que R¹ é H.
3. 3 - Composto, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por que R² é CH3 e R³ - R¹⁰ são H.
4. 4 - Composto, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por que

   R² é CH3, cada um de R³ - R⁷, R⁹ e R¹⁰ é H; e

   R⁸ é OH.
5. 5 - Composto, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por que R⁸ é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, OH e OCH3.
6. 6 - Composto, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por que cada um de R³ - R⁷ e R⁹ - R¹⁰ é H.
7. 7 - Composto, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-6, caracterizado por que o composto se liga a Ap com uma constante de dissociação (Kd) entre 0,0001 e 10,0pM, quando medido por ligação a peptídeo Ap sintético ou ao tecido do cérebro da doença de Alzheimer.
8. 8 - Composto, caracterizado por que é selecionado a partir do grupo que consiste em:
9. 9 - Composiç o Farmacêutica, caracterizada por que compreende um composto de qualquer uma das Reivindicações de 1 a 8 e um portador

   3/9 farmaceuticamente aceitável.
10. 10 - Método de Sintetizar Composto, caracterizado por que é da fórmula seguinte ou de um sal do mesmo, solúvel em água, não tóxico:

    Y em que

    Z é S;

    Y é NR¹R²;

    R¹ é selecionado a partir do grupo que consiste em H, metil, propil, (CH2)nOR' (em que n=1, 2 ou 3 e R’ é H ou um grupo alquila C1-C8), CF3, CH2-CH2X e CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I);

    R² é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo alquila C1-C8, (CH2)nOR’ (em que n=1, 2 ou 3 e R’ é H ou um grupo alquila C1-C8), CF3, CH2-CH2X e CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I);

    R³ - R¹⁰ são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, F, Cl, Br, I, um grupo alquila C1-C8, (CH2)nOR’ (em que n=1, 2 ou 3) e OR’; e

    R’ é H ou um grupo alquila C1-C8;

    em que pelo menos um de R¹-R¹⁰ contém o radiomarcador ¹¹C, ¹²³I, ¹²⁵i, ¹³¹i, ou ¹⁸F e os compostos são isentos de átomos de nitrogênio quaternário, com a condição de que o composto não seja 5-¹⁸fluor-2-(4’-amino3 'metilfenil) benzotiazol ou 6-¹⁸fluor-2- (4 ’-amino-3 'metilfenil) benzotiazol,

    4/9 compreendendo as etapas de proporcionar dito composto em que pelo menos um dos substituintes R¹-R¹⁰ é um tri-alquil estanho e fazer reagir dito composto tri-alquil estanho substituído com uma substância contendo ¹¹C, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I ou ¹⁸F.
11. 11 - Método de Detectar Depósitos Amilóides em Tecido Humano ou Animal de Biópsia ou Post-Mortem, caracterizado por que compreende as etapas de:

    (a) incubar tecido fixado em formalina ou congelado fresco com uma solução de composto da fórmula seguinte ou um sal do mesmo, solúvel em água, não tóxico:

    Y em que

    Z é S;

    Y é NR¹R²;

    R¹ é selecionado a partir do grupo que consiste em H, metil, propil, (CH2)nOR' (em que n=1, 2 ou 3 e R' é H ou um grupo alquila C1-C8), CF3, CH2-CH2X e CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I);

    R² é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo alquila C1-C8, (CH2)nOR' (em que n=1, 2 ou 3 e R' é H ou um grupo alquila C1-C8), CF3, CH2-CH2X e CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I);

    R³ - R¹⁰ são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, F, Cl, Br, I, um grupo alquila C1-C8, (CH2)nOR' (em que n=1, 2 ou 3) e OR'; e

    5/9

    R’ é H ou um grupo alquila Ci-Ce;

    em que pelo menos um de R¹-R¹⁰ contém o radiomarcador ¹¹C, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I ou ¹⁸F e os compostos são isentos de átomos de nitrogênio quaternário, para formar um depósito marcado e, então, (b) detectar os depósitos marcados.
12. 12 - Método de Detectar Depósitos Amilóides em Tecido Humano ou Animal de Biópsia ou Post-Mortem, de acordo com a Reivindicação

    11, caracterizado por que R¹ é H.
13. 13 - Método de Detectar Depósitos Amiloides em Tecido Humano ou Animal de Biópsia ou Post-Mortem, de acordo com a Reivindicação

    12, caracterizado por que R² é CH3 e R³ - R¹⁰ são H.
14. 14 - Método de Detectar Depósitos Amiloides em Tecido Humano ou Animal de Biópsia ou Post-Mortem, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que

    R² é CH3, cada um de R³ - R⁷, R⁹ e R¹⁰ é H; e

    R⁸ é OH.
15. 15 - Método de Detectar Depósitos Amiloides em Tecido Humano ou Animal de Biópsia ou Post-Mortem, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que R⁸ é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, OH e OCH3.
16. 16 - Método de Detectar Depósitos Amiloides em Tecido Humano ou Animal de Biópsia ou Post-Mortem, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que cada um de R³ - R⁷ e R⁹ - R¹⁰ é H.
17. 17 - Método de Detectar Depósitos Amiloides em Tecido Humano

    6/9 ou Animal de Biópsia ou Post-Mortem, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 11-16, caracterizado por que o composto se liga a

    Αβ com uma constante de dissociação (Kd) entre 0,0001 e 10,0qM quando medido por ligação a peptídeo sintético A[j ou tecido do cérebro da doença de Alzheimer.
18. 18 - Método de Detectar Depósitos Amilóides em Tecido Humano ou Animal de Biópsia ou Post-Mortem, caracterizado por que compreende as etapas de:

    (a) incubar tecido fixado com formalina ou congelado fresco com uma solução de um composto da fórmula seguinte ou um sal do mesmo, solúvel em água, não tóxico para formar um depósito marcado e, então, (b) detectar os depósitos marcados.
19. 19 - Método de Quantificar a Quantidade de Amiloi-de em Tecido de Biópsia ou Post-Mortem, caracterizado por que compreende as etapas de:

    (a) incubar um composto da fórmula seguinte ou um sal do mesmo, solúvel em água, não tóxico:

    7/9

    R7

    R9

    R8 ^R10

    Rr Rr

    N

    Y ^R4 ^R3 em que

    Z é S;

    Y é NR¹R²;

    R¹ é selecionado a partir do grupo que consiste em H, metil, propil, (CH₂)nOR’ (em que n=1, 2, ou 3 e R' é H ou um grupo alquila C1-C8), CF3, CH2-CH2X e CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I);

    R² é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo alquila C1-C8, (CH2)nOR' (em que n=1, 2 ou 3 e R' é H ou um grupo alquila C1-C8), CF3, CH2-CH2X e CH2-CH2-CH2X (em que X=F, Cl, Br ou I);

    R³ - R¹⁰ são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, F, Cl, Br, I, um grupo alquila C1-C8, (CH2)nOR' (em que n=1, 2 ou 3) e OR'; e

    R' é H ou um grupo alquila C1-C8;

    em que pelo menos um de R¹-R¹⁰ contém o radiomarcador ¹¹C, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I ou ¹⁸F e os compostos são isentos de átomos de nitrogênio quaternário, com um homogenato do tecido de biópsia ou post-mortem, (b) separar o composto ligado ao tecido do do tecido não ligado, (c) quantificar o composto ligado ao tecido e (d) converter as unidades do composto ligado ao tecido para as unidades de microgramas de amiloide por 100 mg de tecido em compa8/9 ração com um padrão.
20. 20 - Método de Quantificar a Quantidade de Amiloide em Tecido de Biópsia ou Post-Mortem, de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por que R¹ é H.
21. 21 - Método de Quantificar a Quantidade de Amiloide em Tecido de Biópsia ou Post-Mortem, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por que R² é CH3 e R³ - R¹⁰ são H.
22. 22 - Método de Quantificar a Quantidade de Amiloide em Tecido de Biópsia ou Post-Mortem, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por que

    R² é CH3, cada um de R³ - R⁷, R⁹ e R¹⁰ é H; e

    R⁸ é OH.
23. 23 - Método de Quantificar a Quantidade de Amiloide em Tecido de Biópsia ou Post-Mortem, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por que R⁸ é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, OH e OCH3.
24. 24 - Método de Quantificar a Quantidade de Amiloide em Tecido de Biópsia ou Post-Mortem, de acordo com a Reivindicação 23, caracterizado por que cada um de R³ - R⁷ e R⁹ - R¹⁰ é H.
25. 25 - Método de Quantificar a Quantidade de Amiloide em Tecido de Biópsia ou Post-Mortem, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 19-24, caracterizado por que o composto se liga a AP com uma constante de dissociação (Kd) entre 0,0001 e 10,0pM, quando medido por ligação a peptídeo sintético AP ou tecido do cérebro da doença de Alzheimer.
26. 26 - Método de Quantificar a Quantidade de Amiloide em Tecido de

    9/9

    Biópsia ou Post-Mortem, caracterizado por que compreende as etapas de:

    (a) incubar um composto da fórmula seguinte ou um sal do mesmo, solúvel em água, não tóxico:

    (b) separar o composto ligado ao tecido do do não ligado ao tecido, (c) quantificar o composto ligado ao tecido e (d) converter as unidades de composto ligado ao tecido em unidades de microgramas de amiloide por 100 mg de tecido em comparação com um padrão.