CN101598703B - dGTpase蛋白在制备用于鉴别诊断唐氏胎儿药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明通过筛选在唐氏胎儿母体血清蛋白质中存在差异表达的蛋白，找到了一种在唐氏胎儿母体血清蛋白质中高表达的dGTpase蛋白，免疫印迹实验进一步证实了dGTpase蛋白的确在唐氏胎儿母体血清蛋白质中存在差异表达。鉴于dGTpase蛋白与唐氏胎儿的这种相关性，该蛋白可以用作制备用于鉴别诊断唐氏胎儿的药物。

Description

dGTpase蛋白在制备用于鉴别诊断唐氏胎儿药物中的应用

技术领域

本发明涉及dGTpase蛋白在制备用于鉴别诊断唐氏胎儿药物中的应用。

背景技术

据统计，中国是世界上出生缺陷婴儿的高发国家之一。在每年3000万左右的新生儿中，约有4％至6％的缺陷儿出生，其中3万名有唐氏综合征。

唐氏综合征(Down’s syndrome，DS)又称21-三体综合征、先天愚型，是最常见的常染色体畸形，35岁以上孕妇发生率为1/300，35岁以下为1/800^[1]。大多数医院都开展了孕妇血清学筛查唐氏综合征的实验。对筛查阳性的孕妇常规采用羊水细胞培养进行核型分析以确诊。但细胞培养要求条件高，方法烦琐，耗时长(10～14d)故很多医院尚不能常规开展。目前，早期产前筛查常以母体血清AFP、hCG等非特异生化指标联合应用，一般采用酶联免疫法(ELISA法)、化学发光法(CIA)、放射免疫法(IRMA)、时间分辨荧光免疫法(TRFIA)等，并结合孕龄、孕期、孕妇体重等其他因素，通过数学分析评估其发病风险，但准确度不高，仍缺乏灵敏、特异的DS早期诊断母体血清蛋白标志物。检查出少数高危者进行羊水穿刺行细胞学检查，虽能最大限度地检出染色体异常的胎儿，但操作属于损害的创伤性诊断检查并具有一定的风险性，所以发明一种准确、无创早期诊断唐氏综合症胎儿的方法成为迫切的需要。

dGTpase(EC 3.1.5.1)即脱氧鸟苷三磷酸酶(triphosphohydrolase)，(NCBInr蛋白数据库编号：51094783)属于水解酶，参与嘌呤代谢，反应公式为dGTP+H(2)O<＝>deoxyguanosine+triphosphate。其底物8-oxo-dGTPase是一个存在于从细菌到人所有组织中的酶，它作为防护自由基介导DNA损伤的第一道防御线，同时在阻止DNA的氧化修饰方面起重要作用^[2]。

参考文献：

[1]Mathew BC，Biju RS，Thapalia N.An overview of electrochemiluminescent(ECL)technology in laboratory investigations[J].Kathmandu Univ Med J.2005，3(1)：91-93.

[2]BalasubramanianK，SchroitAJ.Characterization ofphos-phatidylserinedependent beta 2-glycoprotein I macrophage interactions[J].Biol Chem，1998，273(10)：29272-29277.

发明内容

本发明从蛋白质组学出发，以比较蛋白质组学研究技术为手段，拟对唐氏综合征(21三体)和正常对照组孕中期(14～20周)的母体血清蛋白质进行整体水平研究。首先基于蛋白质的电荷和分子量大小两个独立的物化参数，利用二维凝胶电泳技术对血清蛋白质进行分离，然后进行染色、扫描，通过图像分析软件进行对比分析，找出表达水平差异的蛋白质点，建立血清蛋白差异图谱，筛选出表达水平差异的蛋白质；为保证蛋白质鉴定结果的准确性，应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对差异蛋白质进行分析，建立蛋白质的肽质量指纹图谱和肽序列标签，利用生物信息学软件搜索蛋白质数据库，找到了一种在唐氏胎儿母体血清中存在的差异表达的蛋白质，经质谱鉴定为dGTpase蛋白。进一步的免疫印迹试验证实，dGTpase蛋白的确在唐氏胎儿母体血清中存在差异表达。

基于dGTpase蛋白与唐氏胎儿的这种相关性，该蛋白可以作为一个蛋白质分子标记，对其表达量进行检测可以用于检测唐氏胎儿。

本发明的目的之一在于提供一种dGTpase蛋白在制备用于鉴别诊断唐氏胎儿药物中的应用。

本发明的另一目的之一在于提供一种体外检测母体血清中dGTpase蛋白表达是否异常的方法，包括以下步骤：

A、用特异性抗dGTpase蛋白的抗体检测待测胎儿母体血清中dGTpase蛋白的数量；

B、将步骤A测得的dGTpase蛋白的数量与正常母体血清中的dGTpase蛋白的数量进行比较，如测得的蛋白数量高于正常值，则表示母体血清中dGTpase蛋白的表达上调。

dGTpase蛋白与唐氏胎儿的相关性为唐氏胎儿的诊断和/或治疗提供了一条全新的途径。

附图说明

图1为DS胎儿和正常胎儿母体血清蛋白的2-DE电泳图；

图2为DS胎儿和正常胎儿母体血清差异表达蛋白图谱；

图3为827号肽指纹图谱；

图4为DS胎儿和正常胎儿母体血清dGTPase蛋白免疫印迹放射自显影X胶片。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件操作或按照制造厂商建议的条件。

本发明通过二维凝胶电泳分离母体血清蛋白质，建立DS和对照组孕中期母体血清的差异蛋白图谱，用生物质谱技术对差异蛋白质进行分析，建立蛋白质肽指纹图谱和肽序列标签，结合生物信息学软件查询蛋白质数据库鉴定出蛋白质，找出了其中表达差异最为明显的dGTpase蛋白。然后采用免疫印迹法对已筛选出的蛋白进行验证，结果发现dGTpase蛋白的确在唐氏胎儿母体血清中存在差异表达。

实施例1、唐氏胎儿母体血清样品的制备：

1.标本采集

收集产科门诊孕中期(14～20周)进行唐氏综合征筛查的孕妇血液标本，血液室温凝集后高速离心(12000rpm/min，15min)，取血清放入-70℃冰箱保存备用。其中4例标本已被染色体检查和引产后病理解剖确诊为DS的母体血清作为实验组，并以同期出生后证实无DS的正常孕妇母体血清4例为正常组作为对照。

2.血清蛋白的提取

在实验组和正常对照组的每份血清标本中分别取200μL血清，等体积混匀，合并成组内混合样品800μL，两组各取400μL血清样品4℃12000g/min离心15min后，除去上层的油脂，吸取上清中间层。稀释后用0.22μm滤膜过滤，然后用Agilent Multiple Affinity Removal Column(购自Agilent)处理，去除高丰度蛋白。再用5K超滤管进行浓缩除盐，得到唐氏胎儿母体血清样品。

3.处理后的血清样品蛋白浓度测定

采用Bradford法进行蛋白定量，表明蛋白质样品总量在10μg-100μg的范围内，检测方法的线性响应关系较好，能用于血清蛋白质浓度的检测。根据标准曲线计算样品浓度正常组为：26.44μg/μL，异常组为22.98μg/μL。由此我们得出当血清上样总量为100μg时，正常组上样体积为3.78μL，异常组上样体积为4.35μL。

实施例2、差异蛋白的筛选

本实施例中，超纯尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、3-[(3-胆酰胺丙基)二乙胺]-1-丙磺酸(CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)、载体两性电解质(carrierampholyte，pH3-10NL)、低熔点琼脂糖、IPG覆盖油、碘乙酰胺(I A A)、溴酚蓝、考马斯亮蓝(R-350)均购自GE healthcare公司；罗氏cocktail酶抑制剂(购自Roche公司)；十二烷基磺酸钠(SDS)、甘氨酸(glycine)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(acrymide，30％)、甲叉双丙烯酰胺(BIS)、甘油(Glycerol)、过硫酸胺(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、蛋白质分析反应剂(protein assay reagent)均购自BIO-RAD公司；小样品研磨试剂盒(small samplegrinding kit)购自GE healthcare公司。IPG胶条为13cm(pH3-10NL)非线性胶条，GE healthcare公司产品。

1、二维凝胶电泳

1.1血清蛋白质样品水化与上样

从冰箱中取-20℃冷冻保存的样品水化缓冲液，置室温溶解。取样品水化缓冲液(3molTris，24μL甘油，0.8gSDS，0.3molDTT，少许溴酚蓝，定容至10μL)，加入上述处理的血清蛋白质样品100μg，总体积为250μL，充分混匀；再从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(购自GE healthcare)，室温中放置10分钟；沿着聚焦盘的边缘至左而右线性连贯地加入计算好的样品溶液；用镊子轻轻地去除预制IPG胶条上的保护层，胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条的正极对应于聚焦盘的正极，确保胶条两端与正负电极紧密接触。同时前后移动胶条，避免生成气泡；在每根胶条上覆盖IPG覆盖油，以盖住胶面为准，防止胶条水化过程中液体的蒸发；胶条对好于聚焦盘的正、负极，盖上盖子。加水化液[8mol/L尿素、2％W/V)CHAPS、2％IPG缓冲液、20mmol/L DTT(用前加)、少量溴酚蓝]同时上样，主要参考IPGTM等电聚焦系统操作指南和文献[14-16]的方法进行。30V低电压重泡胀12h后进行等电聚焦电泳，等电聚焦参数设置为200v 0.5h→500v→0.5h→2000v 0.5h→5000v 0.5h→8000v 10h，温度为20℃。

1.2第一向等电聚焦(IEF)

IPG胶条水化后，进行等电聚焦，电泳条件分别为：30v→12h，500v→1h，1000v→1h，8000v→6h，500v→4h；等电聚焦结束后，迅速将IPG胶条分别置于2μL平衡缓冲液A(50mmol/L Tris-HCl pH8.8，6mol/L尿素，30％甘油，1％SDS，0.2％DTT，痕量溴酚蓝)和2μL平衡缓冲液B(50mmol/L Tris-HCl pH8.8，6mol/L尿素，30％甘油，1％，SDS，3％碘乙酰胺，痕量溴酚蓝)中各平衡15分钟后，立即进行第二向SDS-PAGE电泳。

1.3第二向SDS-PAGE电泳

将12.5％的SDS凝胶溶液注入垂直玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用水饱和正丁醇封面，聚合1-3h；将平衡好的IPG胶条浸入电泳缓冲液中数秒钟以清理表面覆盖油；将IPG胶条小心地放置于SDS胶面上，使二者充分接触，其间不要产生任何气泡。用热的低熔点琼脂糖封胶；将制备好的凝胶转移至电泳槽中，15℃循环水冷却，进行电泳，15mA/胶30分钟，30mA/胶至溴酚蓝离胶下沿0.5cm时电泳结束。

1.4染色

分析胶采用GE healthcare公司《双向电泳实验手册》中推荐的硝酸银染色方法。银染步骤为：固定液(每块胶均按250μL计算，100μL甲醇，25μL乙酸，125μL纯净水)固定1小时，敏化(75μL甲醇，10μL 5％硫代硫酸钠，17g乙酸钠，165μL纯净水)1小时，然后把染色凝胶置于摇床上水清洗2小时，银(25μL 2.5％硝酸银，225μL纯净水)染色45分钟后，取出胶条水清洗3次，每次3分钟，显色(6.25g碳酸钠，100μL 36％甲醛溶液，250μL纯净水)五分钟后用终止液(1.46％EDTA溶液)终止15分钟，染色后的凝胶用干胶仪干胶，扫描。制备胶上样后，进行制备胶二维凝胶电泳(步骤与分离胶相同)。电泳后固定过夜，考马斯亮蓝染色，图像扫描。

染色后的凝胶经Image scaner扫描仪以及Lab scan扫描软件进行扫描，获取凝胶上的蛋白质图像(光学分辨率300DPI，像素深度8bits)，如图1所示。染色后的凝胶图像显示，电泳后的蛋白质斑点清晰可辨，蛋白质斑点数约为612-754之间和648-731之间。实验组及正常组的大部分蛋白质斑点均位于分子量15.5-120kD、pI 4.0-8.0的区域，特别是35-85kD、pI 4.5-7.5区域，蛋白质斑点分布密集，说明血清中pH极酸和极碱性蛋白质的含量均较少，通过进行2D图像扫描，在软件分析以及点检测和背景消减基础上，根据蛋白质点表达量与所有匹配蛋白质点表达量总和的比值大于3，且同组3块胶图谱中都出现相同变化的蛋白点，被认为是差异蛋白质点。正常组和实验组之间的差异蛋白位点肉眼即可见。

1.5建立血清蛋白质差异表达图谱

采用Imagemaster 2D Elite 4.01分析软件对异常组和正常组的2-DE银染图像依次进行强度检测，背景消减、匹配，1D(维)及2D(维)校正，建立平均凝胶，斑点位置的重复性按Corbett的方法进行计算。所有数据用SPSS 10.0软件进行统计分析。将实验组与正常组的灰度值相比较，采用t检验比较两组中相应蛋白斑点的强度，如P＜0.05，则表明两组样本中的该蛋白质表达差异显著，该蛋白点即为差异蛋白质点。

对4例正常组母体血清和4例唐氏综合征实验组母体血清进行2-DE实验，3次重复试验得到的6块电泳凝胶，分别用Imagemaster 2D Elite 4.01软件分析进行扫描分析，结果显示正常组平均检测蛋白质点(684.3±71.0)个，实验组平均检测蛋白质点(690.0±41.5)个。

通过Image scaner扫描仪以及Lab scan扫描软件进行扫描，分别将实验组和正常组电泳凝胶上斑点位置清晰的蛋白质点进行图像合成，得到2幅合成的电泳凝胶图像(实验组1幅，正常组1幅)，然后对2幅合成的电泳凝胶图像上的蛋白质点进行组间两两比较，以两组样品之间量变倍数大于1.5倍为差异表达判断标准，建立差异蛋白图谱(见图2)。图谱显示，除已用于DS筛查的标志物外，表达差异的蛋白质点共29个。

1.6差异蛋白质点的生物质谱分析与鉴定

分析胶上的差异蛋白点与考马斯亮蓝染色的制备胶上的蛋白点进行匹配后再切取该蛋白点，依次进行脱色、脱水、还原、酶解和萃取。操作步骤为：用脱色工作液(30mmol/L K₃Fe(CN)6∶100mmol/L Na₂S₂O₃＝1∶1)对银染胶块进行脱色，用含10mmol/L DTT的100mmol/LNH₄HCO₃于57℃还原1h后，再以含55mmol/L碘乙酰胺的100mmol/L NH₄HCO₃烷基化30min，冻干后以0.02g/L胰蛋白酶37℃酶解过夜，酶解后的肽片段依次用2份含50μL 5％TFA的50％乙腈萃取，最后用Zip-TipTM(10μL，Millipore)对萃取物进行脱盐和挂柱。所得蛋白质样品与CCA基质液充分混合，取混合液3μL点样于不锈钢点样板上，自然风干。将点样板按质谱分析仪操作程序置于质谱仪中，氮气激光设置在25Hz的采样率，进行MALDI-TOF-MS分析，获得肽质量指纹图，如图3所示。

1.7蛋白质数据库查询鉴定差异蛋白质

将MALDI-TOF-MS肽指纹图谱所得到的质荷比在Mascot数据库中进行比对，再通过NCBI数据库搜索匹配蛋白。查询参数：物种分类选择为人类；酶选择为Trypsin；允许的未酶切位点选择为1；固定修饰为carbamidomethyl(C)，变量修饰为oxidation(M)，量误差为0.5Da；肽片段容差选择为100ppm；离子选择为MH+和monoiso-tope；选择直接输入Mascot Search即可进行数据库检索。其中以匹配分值(mowse score)为基础的概率(P)评价数据库搜寻结果的质量，匹配分值的大小表示鉴定蛋白属于随机匹配的可能性，当匹配分值达到或超过66分时，待测蛋白的氨基酸序列与数据库中某已知蛋白的氨基酸序列覆盖率较高，认为匹配的可能性很大，统计学上有意义(P＜0.05)。

本发明的dGTpase蛋白得分100远高于66分，且在绿色域值以外说明结果可信。gi号为蛋白在库里的编号，Mass代表蛋白的分子量827号分子量为17KD，Expect为输入的搜库数据可以得到对应蛋白的几率。在29个显著差异蛋白质点中分别选择差异倍数最大的编号为827，830号异常蛋白质点进行质谱分析。结果在NCBI数据库中共发现了多个蛋白与之匹配并可能性具有统计学意义(即匹配的程度)，搜索鉴定结果见表1。

表1  差异蛋白质的搜索查询结果及评分值

注：数据库源自NCBI BLAST，评分大于66为蛋白质匹配评价具有显著性意义(P＜0.05)

实施例3、dGTpase蛋白差异表达的免疫印迹验证

为确认dGTpase蛋白的差异表达，取孕中期(14-20周)已被染色体检查和引产后病理解剖确诊为DS的母体血清3例孕妇血液标本，血液室温凝集后高速离心(12000rpm/min，15min)，取血清-70℃冰箱保存备用。并以同期出生后证实无DS的正常孕妇母体血清标本1例，正常未怀孕育龄妇女血清标本1例作为对照。用购买的抗dGTpase蛋白抗体进行免疫印迹分析，具体过程如下：

1、本实施例所使用的试验试剂

1.1.鼠抗Apolipoprotrin H单克隆抗体(ab11733)，鼠抗MTH1单克隆抗体(ab55527)，小鼠抗Beta-actin单克隆抗体(NB 600-501)，Biotinylated Protein LadderMaker(#7727，Cell Signaling)。

1.2.二抗：抗小鼠IgG-HRPSigma，A4174

1.3.甲基磺酰氟PMSF(Sigma，美国)

1.4.Aprotinin(Sigma，美国)

1.5.Leupeptin(Sigma，美国)

1.6.丙烯酰胺Acrylamide(Promega，美国)

1.7.甲叉双丙烯酰胺N，N’-Methylene-Bis-Acrymide(Promega，美国)

1.8.二硫苏糖醇DTT(Sigma，美国)

1.9.过硫酸胺Ammonium Persulfate，APS(Sigma，美国)

1.10.十二烷基磺酸钠SDS(Sigma，美国)

1.11.TEMED(Sigma，美国)

1.12.三羟甲基氨基甲烷Tris(Sigma，美国)

1.13.甘氨酸Glycine(Sigma，美国)

1.14.溴酚蓝Brophenol Blue(Sigma，美国)

1.15.考马斯亮蓝G-250 Coomassia Blue G-250(Sigma，美国)

1.16.牛血清白蛋白(BSA，Sigma，美国)

1.17.PVDF膜(DUPONT，美国)

1.18.化学增强发光试剂盒Western Blot Chemiluminescence Reagent Plus

1.19.PBS 2L：NaCl 18.0g，KCl 0.44g，Na₂HPO₄ 2.84g，NaH₂PO₄ 0.432g，溶于ddH₂O，调pH 7.2，定容至2L。必要时，临用前加入1μg/μL aprotinin，1μg/μL leupeptin，1mM PMSF，pH 8.0。

1.20.载样缓冲液10μL：10％SDS 2μL，甘油1μL，0.5M Tris 1.6μL，ddH₂O5.2μL，用前按9∶0.5∶0.5加入溴酚蓝、0.5％DTT储备液。

1.21.30％丙烯酰胺(Arcylamide)溶液100μL：丙烯酰胺29g，双丙烯酰胺1g，用蒸馏水溶解，先调pH，再定容至100μL。

1.22.3M Tris-HCl：Tris 36.3g溶于水，调pH至8.9，定容至100μL。

1.23.0.5M Tris-HCl：Tris5.98g溶于水，调pH至6.7，定容至100μL。

1.24.电转液1L：Glycine 14.42g，Tris 3.02g，ddH₂O 800μL，Methanol(甲醇)200μL，10％SDS 2μL，调pH至8.2-8.3，定容至1000μL。

1.25.10×电泳缓冲液400μL：Tris 12.2g，甘氨酸57.76g，溶于ddH₂O，调pH至8.4，定容至400μL，用前稀释成1×的工作液，并加入SDS，使其浓度为0.1％。

1.26.脱色液1号：甲醇250μL，冰醋酸50μL，加ddH₂O至500μL。

1.27.脱色液2号：甲醇100μL，冰醋酸75μL，加ddH₂O至1000μL。

1.28.考马斯亮蓝定量液：考马斯亮蓝G-250 50mg，95％乙醇25μL，磷酸50μL，用ddH₂O定容至500μL。(先用5μL乙醇溶解后，用1μL移液器移至500μL定量瓶内，逐步用5μL乙醇溶解，洗涤至25μL，再向定量瓶内加50μL 85％磷酸，最后加超纯水至500μL，厚滤纸过滤装瓶，4℃保存备用。

1.29.考马斯亮蓝染液：甲醇45μL，ddH₂O 45μL，考马斯亮蓝R-250 0.25g，冰醋酸10μL，过滤备用。

1.30.膜固定液500μL：冰醋酸50μL，异丙醇125μL，ddH₂O 325μL。

1.31.0.4M PMSF：称PMSF(Sigma)0.7g+propanol(北京分装)10μL。

1.32.0.5M 1.10-phenanthroline：称1.10-phenanthroline(Sigma P9375)0.991g加Ethanol 10μL。

1.33.0.5M Iodoacethamide：称Iodoacetamide(Sigma)0.925g+dH₂O 10μL。

1.34.0.5Mm PepstatinA：称Pepstatin A(Sigma)3.43mg+dH₂O 10μL。

1.35.X光背景洗涤液(cat No：21065，Pierce)。

1.36.匀浆缓冲液：NaH₂PO₄ 0.08mol/L，Na₂HPO₄ 0.32mol/L，NaCl 3.6％。

2、试验方法

2.1标本采集：

收集产科门诊孕中期(14-20周)进行唐氏综合征筛查的孕妇血液标本，血液室温凝集后高速离心(12000rpm/min，15min)，取血清-70℃冰箱保存备用。并以同期出生后证实无DS的正常孕妇母体血清标本1例，正常未怀孕育龄(25-30岁)妇女血清标本1例作为对照。

2.2用蛋白考马斯亮蓝法对血清标本中的蛋白进行定量。

2.3免疫印记

2.3.1.SDS-PAGE

1).配胶：制11％分离胶：DW 8.72μL，3M Tris-HCl pH8.8 6μL，30％Arc8.8μL，10％SDS 0.48μL，10％APS 0.24μL，TEMED  20μL；4％；积层胶：DW 7.248μL，0.5M Tris-HCl pH6.8 3μL，30％Arc 1.56μL，10％SDS 120μL，10％APS 60μL，TEMED 12μL。

2).上样前样品处理：

取每样本10μL，100℃，煮沸3分钟、迅速放入冰水中冷却5min，离心1min；每个样本中分别加入生物素标记Maker 10μL，载样缓冲液10μL，100℃，煮沸2分钟、迅速放入冰水中冷却5min，离心1min。

加样顺序：生物素标记Maker、1#(正常未怀孕育龄妇女血清标本)2#(正常孕妇母体血清标本)、3#、4#、5#(均为DS母体血清标本)。

3).通电电泳：积层胶电泳电压40V左右，分离胶电泳电压50-65V，75min左右。

2.3.2.电转移

将滤纸、PVDF膜切成与凝胶尺寸大小，PVDF膜置于95％乙醇平衡5分钟，置于DM中浸透5分钟，电转液平衡15分钟；用二张大滤纸贴于两张多孔垫料，将PVDF膜、胶夹于中间，在PVDF膜与大滤纸之间垫小滤纸。PVDF膜朝正极，50V恒压转移2小时；取下PVDF膜杂交，凝胶染色看效果：考马斯亮蓝染液染色1h，然后用1号脱色液脱色1h，2号脱色液脱色2h，无明显条带，说明转印完全。

2.3.3.杂交过程

1).取下PVDF膜，做好标记，PBS荡洗一次，放入膜固定液15min。

2).膜用PBS洗2次，每次10min，入6％non-fat milk的pH7.2的PBS中封闭，室温1-2h，置4℃冰箱过夜。

3).将封闭的膜先用PBS洗1次15min，再洗4次每次5min。

4).加入一抗：3％BSA 10μL，加入鼠抗MTH1单克隆抗体(ab55527)50 1，使体积比为1∶200，同时加入小鼠抗Beta-actin单抗5μL，使体积比为1∶2000室温反应1h。注意摇匀。

5).先用pH7.2 PBS洗1次15min，再洗4次每次5min。

6).加入二抗：抗鼠HRP-IgG 3％BSA 30μL+加12μL，工作浓度为1∶2500，同时加入抗生物素-HRP抗体30μL，工作浓度为1∶1000，室温反应1h。

7).用PBS洗1次15min，再洗4次每次5min。

2.4.化学发光试剂(ECL)检测

混合等体积Bottle 1和2与PVDF膜共孵育1min；将PVDF膜与X光片一同放入暗盒内曝光3min，室温；显影后清水漂洗，再定影。

2.5.背景洗涤

再将X光片一同放入250μL的x光背景洗涤液10分钟；X光片清水漂洗，再定影，凉干。

本研究对5个标本重复进行了4次免疫印迹实验，得到放射自显影X光片图(见图4)。从图中可以看出，内参照物Beta-actin在各泳道的强度一致，证明WB实验结果可靠。dGTPase蛋白条带位于17KD处，与其分子量符合，1号泳道(正常未孕育龄妇女)中未出现特异的蛋白条带，2、3、4、5号泳道在17KD处均有蛋白条带，2号泳道为正常孕妇血清标本，3、4、5号为DS胎儿母体血清，表明dGTPase蛋白在DS胎儿和正常孕妇血清中均有表达，但正常孕妇血清中的dGTPase蛋白条带明显弱于DS胎儿孕妇血清。

用自显影X光片蛋白质条带用分析软件系统(LabworksTM AnalysisSoftware，美国)扫描，得到其对应的积分光密度值，即蛋白带的积分光密度值，代表蛋白条带的蛋白质相对含量，以正常未孕育龄妇女血清样品为空白对照，r1表示Beta-actin的积分光密度值，r2表示目的蛋白的积分光密度值，DS胎儿和正常对照组积分光密度值减去空白对照，以相对蛋白质含量表，结果见表2。结果表明，DS胎儿母体血清dGTPase蛋白条带的积分光密度值明显高于正常胎儿母体血清(P＜0.05)。提示dGTPase蛋白在DS胎儿孕妇血清中高表达，可以作为DS早期筛查的母体血清蛋白新标志物。

表2  DS胎儿和正常胎儿母体血清dGTPase蛋白带积分光密度值

*与2号比较P＜0.05，有统计学意义

免疫印迹验证结论表明，dGTPase蛋白在DS胎儿和正常胎儿母体血清中表达差异显著，与质谱结果吻合，进一步验证了质谱鉴定结果的准确性。

综上所述，dGTpase蛋白在唐氏胎儿母体中存在差异表达，显然与唐氏胎儿的发生发展有着密切的相关性，因此以dGTpase蛋白作为一个蛋白质分子标记对其表达量进行检测可以用于检测唐氏胎儿。相应的，特异性抗dGTpase蛋白的抗体，包括各种抗dGTpase蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，由于其能够用于检测dGTpase蛋白的表达量，因而可以用于检测唐氏胎儿，或者用于制各检测唐氏胎儿的制剂或试剂盒等，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

Claims (1)

1.dGTpase蛋白抗体在制备用于鉴别诊断唐氏胎儿制剂或试剂盒中的应用。

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