CN102690244A - 调节α-突触核蛋白积聚的物质及其制药用途 - Google Patents
调节α-突触核蛋白积聚的物质及其制药用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102690244A CN102690244A CN2011100698895A CN201110069889A CN102690244A CN 102690244 A CN102690244 A CN 102690244A CN 2011100698895 A CN2011100698895 A CN 2011100698895A CN 201110069889 A CN201110069889 A CN 201110069889A CN 102690244 A CN102690244 A CN 102690244A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alpha
- syn
- compound
- synapse nucleoprotein
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 0 C*(*)C(CC1)CC(*C(C2)C(*3)CC(C)(*)CC2*(*)*)C3C1(*)I Chemical compound C*(*)C(CC1)CC(*C(C2)C(*3)CC(C)(*)CC2*(*)*)C3C1(*)I 0.000 description 4
Images
Abstract
本发明涉及调节α-突触核蛋白积聚的物质及其制药用途。本发明首次揭示了一类化合物,这些化合物可与α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)相互作用,并且能够促进α-Syn蛋白二体的形成,从而加速α-Syn的积聚并形成纤维。一般地,α-Syn寡聚体对细胞的毒性最大。这些化合物能够促进α-Syn蛋白积聚成纤维或团块,从而减少α-Syn对细胞的毒性。并且,本发明还首次揭示α-突触核蛋白C-端的118~130位氨基酸序列区域是α-Syn与这些化合物相互作用的位点,并可作为潜在的药物靶点。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学和分子生物学的研究领域,具体涉及调节α-突触核蛋白积聚的物质及其制药用途。
背景技术
帕金森症(Parkinson’s Disease)是一种常见的神经退行性疾病,发病原因尚未明确,临床上病人主要表现为麻痹、震颤、运动障碍等,病理上病人脑组织中脑黑质的多巴胺能神经元大量丧失,而存活的神经元中有称为路易氏体(Lewy body)的小体形成。5-10%帕金森症病人有家族史,可能与α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)和Parkin等基因的突变有关;其它如氧化压力,线粒体功能障碍以及环境毒素等因素都可能引起类似帕金森病的表现,称为帕金森综合症。Lewy体中有许多种异常积聚的蛋白质,而α-Syn是Lewy体的主要组成成分,另外还包括synphilin1(Sph1)、parkin、SIAH I、泛素、以及蛋白酶体亚基等,说明这类疾病与蛋白质的异常积聚密切相关。
α-Syn是一种突触前神经末梢蛋白,由140个氨基酸组成。它在脑中含量丰富,分布广泛,在人体的其他器官中也有表达。在发育过程中α-Syn由细胞体逐渐向神经末梢聚集。α-Syn蛋白在体外很容易积聚成纤维样结构,其形态与生理病变所导致的纤维物形态相似。研究表明,α-Syn的突变体,剪切产物以及它们的过量表达,都可以导致神经退行性疾病的症状出现(Agorogiannis,E.I.;Agorogiannis,G.I.;Papadimitriou,A.;Hadjigeorgiou,G.M.Protein misfolding in neurodegenerativediseases,Neuropathol Appl Neurobiol,2004,30(3),215-224;Bucciantini,M.;Giannoni,E.;Chiti,F.;Baroni,F.;Formigli,L.;Zurdo,J.;Taddei,N.;Ramponi,G.;Dobson,C.M.;Stefani,M.Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for proteinmisfolding diseases,Nature,2002,416(6880),507-511),这表明α-Syn参与了PD病理过程(Spillantini,M.G.;Crowther,R.A.;Jakes,R.;Hasegawa,M.;Goedert,M.alpha-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson’s disease anddementia with lewy bodies,Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95(11),6469-6473;Spillantini,M.G.;Schmidt,M.L.;Lee,V.M.;Trojanowski,J.Q.;Jakes,R.;Goedert,M.Alpha-synuclein in Lewy bodies,Nature,1997,388(6645),839-840;Wakabayashi,K.;Matsumoto,K.;Takayama,K.;Yoshimoto,M.;Takahashi,H.NACP,a presynapticprotein,immunoreactivity in Lewy bodies in Parkinson′s disease,Neurosci Lett,1997,239(1),45-48)。单体的α-Syn对多巴胺能神经细胞没有毒性,而它的寡聚体对多巴胺能神经细胞具有毒性。蛋白质积聚后生成的寡聚体的毒性最大,成熟纤维的毒性较小,纤维的形成,是机体出于保护自身免受到伤害而从原纤维转化而成的。筛选能够与α-Syn相互作用并且能够影响其积聚的物质,有利于研究α-Syn蛋白积聚过程和分子机制,并且能够为抑制路易氏体形成和治疗帕金森症的药物研发提供基础。
因此,本领域需要对α-Syn蛋白积聚过程进行研究,找到调节其积聚过程的物质,以开发出临床可用的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供调节α-突触核蛋白积聚的物质及其制药用途。
在本发明的第一方面,提供式(I)、(II)或(III)结构的化合物或其药学上可接受的盐或水合物的用途,用于制备降低α-突触核蛋白的毒性(细胞毒性)的组合物;
其中,X或Y独立地选自N,S,或C;
R或R1独立地选自H,C1-C4烷基(较佳地C1-C3烷基;更佳地C1-C2烷基,如CH3),羟基,卤素;
在另一优选例中,所述的化合物选自:吩噻嗪类化合物;吖啶类化合物或吩嗪类化合物。
在另一优选例中,所述的化合物(在溶剂中,较佳地在水性溶剂中,更佳地在水溶液中)可以形成带有正电荷的形态。
在另一优选例中,在所述化合物的“N”的位置形成正电荷。
在另一优选例中,所述的化合物或其药学上可接受的盐或水合物选自:
在另一优选例中,所述的α-突触核蛋白包括其蛋白质片段。
在另一优选例中,所述的组合物还用于:促进α-突触核蛋白积聚成多聚体或不溶性纤维或团块。
在本发明的另一方面,提供一种制备药物的方法,所述的药物用于预防或治疗代谢性疾病,所述方法包括:将有效量的式(I)、(II)或(III)结构的化合物或其药学上可接受的盐或水合物与药学上可接受的载体混合:
在本发明的另一方面,提供一种体外降低α-突触核蛋白的毒性(优选非治疗性的方法)的方法,对细胞施用式(I)、(II)或(III)结构的化合物或其药学上可接受的盐或水合物:
在本发明的另一方面,提供一种多肽(较佳地为分离的多肽),所述多肽是:
具有SEQ ID NO:1中第118~130位所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中,所述的多肽不是SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中,所述的多肽与式(I)、(II)或(III)结构的化合物或其药学上可接受的盐或水合物相互作用。
在本发明的另一方面,提供一种多核苷酸(较佳地为分离的多核苷酸),其编码所述的多肽。
在本发明的另一方面,提供一种重组质粒,其含有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面,提供一种重组细胞,其含有所述的多核苷酸或所述的重组质粒。
所述的多肽或其编码核酸的用途,用于筛选降低α-突触核蛋白的毒性(细胞毒性)的物质(如化合物)。
在本发明的另一方面,提供一种筛选降低α-突触核蛋白的毒性(细胞毒性)的潜在物质的方法,所述方法包括:
(1)将候选物质与表达所述的多肽(具有SEQ ID NO:1中第118~130位所示氨基酸序列的多肽)的体系接触;
(2)筛选出与所述的多肽相互作用的物质,所述物质是对于降低α-突触核蛋白的毒性有用的潜在物质。
在另一优选例中,在测试组中,将候选物质加入到表达所述的多肽的体系中;和/或
步骤(2)包括:检测测试组的体系中候选物质与所述的多肽的相互作用情况,并与对照组比较,其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达所述的多肽的体系;
如果测试组中候选物质与所述的多肽的相互作用在统计学上强于(优选显著强于,如强30%以上,较佳的强60%以上;更佳的强100%以上)对照组,就表明该候选物质是对于降低α-突触核蛋白的毒性有用的潜在物质。
在另一优选例中,步骤(2)中,检测测试组的体系中候选物质与所述的多肽中相应于SEQ ID NO:1中第118~130位的氨基酸的相互作用情况。
在另一优选例中,所述的体系选自:细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在另一优选例中,所述方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验,以从候选物质中进一步选择和确定对于降低α-突触核蛋白的毒性有用的物质。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、Azure C与α-突触核蛋白C-端的相互作用。
(A)Azure C化学结构式;
(B)核磁共振化学位移干扰实验检验α-Syn与Azure C的相互作用,只有15N-α-Syn(200μM)1H-15N HSQC图谱(红色)与15N-α-Syn∶Azure C比例为1∶1~1∶10时的1H-15N HSQC图谱叠加(分别用不同颜色表示)。箭头指示发生化学位移氨基酸残基的谱峰。α-Syn中主链各酰胺基团的NMR化学位移归属见图9,下同。
图2、Azure B与α-突触核蛋白C-端的相互作用。
(A)Azure B化学结构式;
(B)核磁共振化学位移干扰实验检验α-Syn与Azure B的相互作用,只有15N-α-Syn(200μM)1H-15N HSQC图谱(红色)与15N-α-Syn∶Azure C比例为1∶1(绿色)和1∶5(蓝色)时的1H-15N HSQC图谱叠加。箭头指示发生化学位移氨基酸残基的谱峰。
图3、Methylene blue与α-突触核蛋白C-端的相互作用。
(A)Methylene blue化学结构式;
(B)核磁共振化学位移干扰实验检验α-Syn与Methylene blue的相互作用,只有15N-α-Syn(200μM)1H-15N HSQC图谱(红色)与15N-α-Syn∶Azure C比例为1∶1(绿色)和1∶5(蓝色)时的1H-15N HSQC图谱叠加。箭头指示发生化学位移氨基酸残基的谱峰。
图4、Proflavine hydrochloride与α-突触核蛋白C-端的相互作用。
(A)Proflavine hydrochloride化学结构式;
(B)核磁共振化学位移干扰实验检验α-Syn与Proflavine hydrochloride的相互作用,只有15N-α-Syn(200μM)1H-15N HSQC图谱(红色)与15N-α-Syn∶Azure C比例为1∶1(绿色)和1∶5(蓝色)时的1H-15N HSQC图谱叠加。箭头指示发生化学位移氨基酸残基的谱峰。
图5、Azure C促进α-突触核蛋白二体形成。
聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Azure C分别与α-Syn(A)和α-Syn 75-140(B)按不同浓度比混合后,样品上清和沉淀中的蛋白质二体。箭头表示蛋白质二体。S表示上清,P表示沉淀。
图6、分子凝胶过滤层析检测α-突触核蛋白二体。
(A)凝胶过滤分析实验显示,新鲜纯化的α-Syn蛋白(fresh)、37℃保温两天的α-Syn蛋白(CON)和加入Azure C(AC)共保温的α-Syn蛋白样品单体(峰P2)和二体(峰P1)比例的发生变化。
(B)聚丙烯酰胺凝胶电泳显示峰P1和峰P2的α-Syn蛋白成分。箭头表示蛋白质二体。
(C)新鲜纯化的α-Syn75-140蛋白、37℃保温两天的α-Syn75-140蛋白和加入Azure C共保温的α-Syn75-140蛋白样品单体(峰P4)和二体(峰P3)比例的变化。
(D)聚丙烯酰胺凝胶电泳显示峰P3和峰P4的α-Syn75-140蛋白成分。
图7、Azure C促进细胞内源的α-突触核蛋白二体形成。
HEK293T细胞经不同浓度Azure C处理后内源α-Syn蛋白二体量的变化。*号表示α-Syn蛋白二体。
图8、原子力显微镜检测Azure C对α-突触核蛋白纤维形态的影响。
37℃保温6天的α-Syn蛋白纤维(A)和加入Azure C共保温6天的α-Syn蛋白纤维(B)。
图9、α-Syn蛋白中所有主链酰胺基团的NMR化学位移归属图,这是用NMR鉴定化合物与蛋白质作用和结合位点的基础。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究,首次揭示了一类化合物这些化合物可与α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)相互作用,并且能够促进α-Syn蛋白二体形成,从而加速α-Syn的积聚形成纤维。一般,α-Syn寡聚体对细胞的毒性最大,这些化合物能够促进α-Syn蛋白积聚成纤维或团块,从而减少α-Syn对细胞的毒性。并且,本发明还首次揭示α-突触核蛋白C-端的118~130氨基酸序列区域是α-Syn与这些化合物相互作用的位点,并可作为为潜在的药物靶点。
术语
如本文所用,所述的“寡聚体”是指2-多条(一般例如2-10条)α-Syn蛋白链形成的低聚体。“寡聚体”通常是可溶性的,其对细胞的毒性较大。
如本文所用,所述的“多聚体”是指多条(通常是多于10条)α-Syn蛋白聚合而成的聚合体。“多聚体”是不可溶的,以成熟纤维、包涵体或团块的形态存在,相对于“寡聚体”,所述的“多聚体”对细胞的毒性较小。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
化合物及其用途
本文所用的术语“烷基”指直链或支链饱和的、含有1-4个碳原子(较佳地1-3个碳原子;更佳地1-2个碳原子)的脂族烃类基团。例如,烷基包括但不限于甲基,乙基,正丙基,异丙基,正丁基,异丁基,叔丁基。
其中,烷基可以含有或不含有取代基。例如,它们可以被含有1-3个(更佳地1-2个)选自(但不限于)C1-4的烷基、羟基或卤素的基团所取代。
本文所用的术语“卤素”指F、Cl、Br、或I。
本文所用的术语“异构体”包括:几何异构体、对映异构体、非对映异构体(如顺反异构体,构象异构体)。
本发明首先提供了一种式(I)、(II)或(III)结构的化合物或其药学上可接受的盐或水合物的用途,用于制备降低α-突触核蛋白的毒性的组合物;
作为本发明的优选方式,所述的化合物具有式(II)所示的结构:
本发明还包括上述化合物的药学上可接受的盐、水合物或前体,只要它们也具有防治代谢性疾病的作用。所述的“药学上可接受的盐”是指一类化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于):(1)与如下无机酸形成的盐:如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸;(2)与如下有机酸形成的盐,如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐,以酯、氨基甲酸酯,或其它常规的“前体药物”的形式。
所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后,该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成具有式(I)、(II)或(III)结构的一种化合物,或结构式(I)、(II)或(III)所示结构的一个化合物所组成的盐或溶液。
本发明还包括上述化合物的异构体、外消旋体,只要它们也具有防治代谢性疾病的作用。化合物具有一个或多个不对称中心。所以,这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
作为本发明的一种优选方式,所述的化合物具有式(I)所示的结构。
本领域人员应理解,在得知了本发明化合物的结构以后,可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料,来获得本发明的化合物,比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取的方法,这些方法均包含在本发明中。
合成化学改造、保护官能团方法学(保护或去保护)对合成应用化合物是很有帮助的,并且是现有技术中公知的技术,如R.Larock,Comprehensive OrganicTransformations,VCH Publishers(1989);T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Ed.,John Wiley and Sons(1999);L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis,JohnWiley and Sons(1994);和L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for OrganicSynthesis,John Wiley and Sons(1995)中都有公开。
基于本发明人的新发现,本发明提供了具有式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体的用途,用于制备降低α-突触核蛋白的毒性(细胞毒性)的药物(或组合物)。(I)、(II)或(III)的化合物以往常常被用于作为染料或功能不清,而本发明人第一次揭示它们能够降低α-突触核蛋白对于细胞的毒性方面的用途。
所述的α-Syn的一些存在形态对于细胞的毒性是本领域人员已知的,单体的α-Syn对多巴胺能神经细胞没有毒性,而它的寡聚体对多巴胺能神经细胞具有毒性。蛋白质积聚后生成的寡聚体的毒性最大,成熟纤维的毒性较小。因此,根据本发明的实施例验证,得知本发明的化合物可以促进α-Syn蛋白积聚成成熟纤维或团块,则显然地、毫无疑义地可以得知本发明的化合物可以降低细胞毒性。
α-Syn蛋白片段
本发明人通过核磁共振化学位移干扰实验来,首次证实了本发明的式(I)、(II)或(III)化合物可以与α-Syn直接相互作用。并且,确证它们发生相互作用的位点为α-Syn蛋白的第118-130位氨基酸。
因此,包含α-Syn蛋白的第118-130位氨基酸的α-Syn蛋白片段可以作为一种筛选药物的靶点。
一旦分离获得了所述蛋白的序列,就可以用重组法来大批量地获得该蛋白(多肽)。这通常是将其编码基因克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到。此外,对于较短的蛋白而言,也可采用人工合成(如通过多肽合成仪合成)的方法来合成有关序列,人工合成的方法可简便且快速地得到所需要的蛋白。
本发明还包括了编码所述的α-Syn蛋白片段的分离的核酸,也可以是其互补链。编码α-Syn蛋白片段的DNA序列,可以全序列人工合成,也可用PCR扩增的方法获得。在获得了编码所述的α-Syn蛋白片段的DNA序列之后,将其连入合适的表达载体,再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞,通过分离纯化得到所要的蛋白。
本发明还包括了包含编码所述α-Syn蛋白片段的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列,以便于蛋白的表达。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况,即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如,如果启动子控制序列的转录,那么它就是可操作地连于编码序列。
此外,含有编码所述α-Syn蛋白片段核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等;例如可为大肠杆菌细胞(E.coli),如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
基于本发明人的新发现,本发明提供了α-Syn蛋白片段的用途,用于筛选降低α-突触核蛋白的毒性(细胞毒性)的物质(如化合物)。
筛选药物
在得知了所述的α-Syn蛋白片段是与所述化合物相互作用的关键位点后,可以基于该特征来筛选降低α-突触核蛋白的毒性的物质。
因此,本发明提供一种筛选降低α-突触核蛋白的毒性的潜在物质的方法,,所述方法包括:(1)将候选物质与表达所述的α-Syn蛋白片段的体系接触;
(2)筛选出与所述的α-Syn蛋白片段相互作用的物质,所述物质是对于降低α-突触核蛋白的毒性有用的潜在物质。
在本发明的优选方式中,在进行筛选时,为了更易于观察到相互作用的发生或强弱,还可设置对照组,所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达α-Syn蛋白片段的体系。
所述的体系包括(但不限于):溶液体系、亚细胞体系、细胞体系(或细胞培养物体系)、组织体系、器官体系、或动物体系。
作为本发明的优选方式,所述方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验,以从候选物质中进一步选择和确定对于降低α-突触核蛋白的毒性有用的物质。
另一方面,本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于调节躯体感觉的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库,以便于人们最终可以从中筛选出能够对于降低α-突触核蛋白的毒性真正有用的物质。
此外,基于本发明的新发现,还可以以α-突触核蛋白的全长蛋白来与候选物质接触,并进一步观察α-突触核蛋白中第118-130位氨基酸与所述候选物质的相互作用情况。
观察或测定待测物质是否与α-突触核蛋白相互作用的方法是已知的,例如通过核磁共振化学位移干扰实验来测定α-突触核蛋白或其片段中相应位点的位移情况。当候选物质也为蛋白时,可以借助于免疫共沉淀技术或酵母双杂交技术来进行测定。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2002)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、硫噻嗪类化合物与α-突触核蛋白相互作用
本发明人利用核磁共振技术,通过核磁共振化学位移干扰实验来寻找与α-Syn相互作用的小分子化合物。本发明人选取了吩噻嗪(phenothiazine)类化合物:Azure C、Azure A、Azure B、Thionin、Methylene blue和Toluidine Blue O;吖啶(Acridine)类化合物Acridine Orange和Proflavine hydrochloride;以及吩嗪(Phenazine)类化合物Neutral Red等进行检测,以上化合物均购自Sigma-Aldrich公司。
α-Syn全长氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1):
MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA
首先,本发明人进行了核磁共振化学位移干扰实验来验证Azure C是否与α-突触核蛋白(α-Syn)直接相互作用。将Azure C逐步按比例加入到15N标记的α-Syn蛋白中,然后在Varian INOVA 600兆核磁仪上收集HSQC谱,通过1H-15NHSQC图谱中谱峰化学位移的变化检测Azure C与α-Syn是否相互作用。本发明人归属了α-Syn蛋白主链,并将这些氨基酸残基标在HSQC谱上。
如图1所示,在滴定过程中氨基酸残基V118(其中,字母代表相应的氨基酸,数字代表氨基酸在蛋白序列中的位置,后同)、D119、D121、N122、E123、A124、Y125、E126、M127、S129和E130的谱峰有较大的化学位移,说明这些氨基酸残基参与α-Syn的相互作用。由此,可以确定α-Syn C-端的118~130这一段氨基酸残基是与Azure C相互作用所必需的。
接下来,本发明人用同样的方法对上述几种化合物进行检测发现这几种化合物都能够与α-Syn相互作用(图2-4)。实验结果如表1所述。
表1
实施例2、Azure C促进α-突触核蛋白二体形成
在确定Azure C与α-Syn蛋白相互作用以后,本发明人进一步研究这种相互作用对α-Syn积聚过程的影响。本发明人根据核磁共振化学位移干扰实验结果以及在先研究结果,构建了缺失α-Syn N-端的突变体α-Syn75-140,该蛋白突变体缺失了N端端74个氨基酸,仅包括α-Syn C端的75-140位氨基酸。并利用大肠杆菌表达纯化得到野生型α-Syn蛋白和突变体α-Syn75-140蛋白这两种蛋白质。
将Azure C分别加入到野生型α-Syn蛋白和突变体α-Syn75-140蛋白(所述蛋白存在于水溶液中,蛋白浓度200微摩尔)中,在37℃共保温两天,取出后高速20,000rcf离心30分钟,然后用SDS-PAGE检测。实验结果显示,与对照组(CON,不加入Azure C)相比,加入Azure C(AC)以后野生型α-Syn蛋白(A)和突变体α-Syn75-140蛋白(B)二体的量均明显增加。形成二体后,α-Syn75-140蛋白因为缺失66-74这段氨基酸残基而不能积聚成纤维状的多聚体,而野生型α-Syn蛋白,可以进一步积聚形成纤维状的多聚体(不溶性),二体是形成多聚体的基础。这些数据说明Azure C与α-Syn蛋白相互作用促进α-Syn蛋白二体形成而非α-Syn蛋白自身积聚所导致(图5)。
接下来,本发明人又用分子凝胶过滤层析对α-Syn或α-Syn75-140分别与Azure C共保温(在37℃温度下保温,蛋白浓度约200微摩尔,Azure C浓度200或400微摩尔)的样品心进行分析,同时新鲜纯化的蛋白质(fresh)和保温时未加入Azure C的样品作为对照(CON)。然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,相同流出体积样品中蛋白质量的变化。如图6所示,与对照组相比,加入Azure C以后野生型α-Syn蛋白(A、B)和突变体α-Syn75-140蛋白(C、D)二体峰中蛋白质的量均明显增加。
得到上述实验结果以后,本发明人又检测了Azure C是否促进细胞内源表达的α-Syn蛋白形成二体。实验前一天将HEK293T细胞(购自ATCC)以合适密度传代,第二天细胞满度达到约90%时,更换新鲜培养液并在培养液中分别加入终浓度1μM、5μM、10μM的Azure C。继续培养24小时后,收获细胞。样品中加入上样缓冲液后直接进行,SDS-PAGE电泳,然后western blot检测。
由图7可以看到,与没有加入Azure C(AC)处理的细胞相比,加入Azure C后细胞内源的α-Syn蛋白二体量明显增多。
实施例3、Azure C对α-突触核蛋白纤维形态的影响
接下来本发明人检测了Azure C是否影响α-Syn蛋白纤维形成。先用离子交换柱DEAE Sephadex A-25,然后再过XK 16/70Superdex75分子筛纯化得到α-Syn蛋白。定蛋白浓度为200μM,经0.22微米滤膜过滤除菌后,分别取300μL放入两个离心管中,向其中一管中加入终浓度为200μM的Azure C,另一管设为对照。避光37℃保温6天后取出,稀释至10μM后滴加在新解离的云母片上,然后用原子力显微镜(AFM)观察。
如图8所示,与不加入Azure C的对照相比,加入Azure C共保温6天的α-Syn蛋白纤维更容易交联在一起形成较大的团块。
讨论
本发明人利用核磁共振化学位移干扰实验找到多种与α-Syn蛋白相互作用的小分子化合物,分析了这些小分子化合物与α-Syn蛋白相互作用的分子机制,并以Azure C为例,深入研究了其与α-Syn蛋白相互作用后产生的效应。本发明人发现,Azure C促进体外纯化的和细胞内源的α-Syn蛋白二体形成,并且使α-Syn蛋白纤维更容易交联在一起。这对研究α-Syn蛋白积聚的分子机制和寻找影响α-Syn蛋白积聚的物质提供极大帮助。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (14)
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的化合物选自:吩噻嗪类化合物;吖啶类化合物或吩嗪类化合物。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的化合物可以形成带有正电荷的形态。
5.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的组合物还用于:促进α-突触核蛋白积聚成多聚体或不溶性纤维或团块。
8.一种多肽,其特征在于,所述多肽是:
具有SEQ ID NO:1中第118~130位所示氨基酸序列的多肽。
9.一种多核苷酸,其特征在于,其编码权利要求5所述的多肽。
10.一种重组质粒,其特征在于,其含有权利要求9所述的多核苷酸。
11.一种重组细胞,其特征在于,其含有权利要求9所述的多核苷酸或权利要求10所述的重组质粒。
12.权利要求8所述的多肽或其编码核酸的用途,用于筛选降低α-突触核蛋白的毒性的物质。
13.一种筛选降低α-突触核蛋白的毒性的潜在物质的方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)将候选物质与表达权利要求8所述的多肽的体系接触;
(2)筛选出与权利要求8所述的多肽相互作用的物质,所述物质是对于降低α-突触核蛋白的毒性有用的潜在物质。
14.如权利要求13所述的方法,其特征在于,在测试组中,将候选物质加入到表达权利要求8所述的多肽的体系中;和/或
步骤(2)包括:检测测试组的体系中候选物质与权利要求8所述的多肽的相互作用情况,并与对照组比较,其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达权利要求8所述的多肽的体系;
如果测试组中候选物质与权利要求8所述的多肽的相互作用在统计学上强于对照组,就表明该候选物质是对于降低α-突触核蛋白的毒性有用的潜在物质。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011100698895A CN102690244A (zh) | 2011-03-22 | 2011-03-22 | 调节α-突触核蛋白积聚的物质及其制药用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011100698895A CN102690244A (zh) | 2011-03-22 | 2011-03-22 | 调节α-突触核蛋白积聚的物质及其制药用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102690244A true CN102690244A (zh) | 2012-09-26 |
Family
ID=46855995
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2011100698895A Pending CN102690244A (zh) | 2011-03-22 | 2011-03-22 | 调节α-突触核蛋白积聚的物质及其制药用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102690244A (zh) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20010047032A1 (en) * | 1999-12-30 | 2001-11-29 | Castillo Gerardo M. | Polyhydroxylated aromatic compounds for the treatment of amyloidosis and alpha-synuclein fibril diseases |
CN101460222A (zh) * | 2006-03-29 | 2009-06-17 | 维斯塔实验室有限公司 | 锍化合物及其用途 |
CN101460157A (zh) * | 2006-03-29 | 2009-06-17 | 维斯塔实验室有限公司 | 蛋白聚集抑制剂 |
CN101883567A (zh) * | 2007-10-03 | 2010-11-10 | 维斯塔实验室有限公司 | 二氨基吩噻嗪的治疗用途 |
WO2011012722A1 (en) * | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ascendis Pharma As | Prodrugs containing an aromatic amine connected by an amido bond to a linker |
-
2011
- 2011-03-22 CN CN2011100698895A patent/CN102690244A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20010047032A1 (en) * | 1999-12-30 | 2001-11-29 | Castillo Gerardo M. | Polyhydroxylated aromatic compounds for the treatment of amyloidosis and alpha-synuclein fibril diseases |
CN101460222A (zh) * | 2006-03-29 | 2009-06-17 | 维斯塔实验室有限公司 | 锍化合物及其用途 |
CN101460157A (zh) * | 2006-03-29 | 2009-06-17 | 维斯塔实验室有限公司 | 蛋白聚集抑制剂 |
CN101883567A (zh) * | 2007-10-03 | 2010-11-10 | 维斯塔实验室有限公司 | 二氨基吩噻嗪的治疗用途 |
WO2011012722A1 (en) * | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ascendis Pharma As | Prodrugs containing an aromatic amine connected by an amido bond to a linker |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
《中国临床康复》 20050307 梁源 等 线粒体、alpha-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的作用 148-150 1-7 第9卷, 第9期 * |
MASAMI MASUDA,等: "Small Molecule Inhibitors of R-Synuclein Filament Assembly", 《BIOCHEMISTRY》 * |
YI WEN,等: "Alternative Mitochondrial Electron Transfer as a Novel Strategy for Neuroprotection", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
梁源 等: "线粒体、α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的作用", 《中国临床康复》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107557378A (zh) | 一种基于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas7‑3的真核基因编辑方法 | |
JPH04504052A (ja) | 新規なdna結合性タンパク質およびポリペプチドの生成・選択 | |
CN108676072B (zh) | 一种具有抗Aβ42蛋白聚集功能的多肽及其应用与编码该多肽的基因 | |
CN103951743A (zh) | 人sfrp1变体及其应用 | |
JP2023529315A (ja) | 機能的aavカプシドのハイスループット工学操作 | |
CN115960209B (zh) | 一种重组人源化胶原蛋白及其应用 | |
Ender et al. | Evidence for autocatalytic cross-linking of hydroxyproline-rich glycoproteins during extracellular matrix assembly in Volvox | |
EP3814510A1 (en) | Microhomology mediated repair of microduplication gene mutations | |
CN116574172B (zh) | 重组人源化i型胶原蛋白及其制备方法 | |
WO2021216674A1 (en) | Improved cas 12a/nls mediated therapeutic gene editing platforms | |
CN102690244A (zh) | 调节α-突触核蛋白积聚的物质及其制药用途 | |
Zullo | Gene therapy of mitochondrial DNA mutations: a brief, biased history of allotopic expression in mammalian cells | |
WO2016159536A1 (ko) | 신규 프로모터 및 이의 용도 | |
EP4121531A1 (en) | Compositions and methods comprising improved guide rnas | |
CN108795832B (zh) | 一种内源l-门冬酰胺酶ii基因敲除的宿主菌、其制备方法及其应用 | |
CN116555351A (zh) | 一种核酸构建体 | |
Sutton et al. | The total synthesis of Pantocin B | |
CN101265297B (zh) | α-突触核蛋白与Sph1的相互作用位点及其在筛选帕金森症药物中的应用 | |
US20130281667A1 (en) | Uses of spatial configuration to modulate protein function | |
CN114540262B (zh) | 构建产l-缬氨酸的重组微生物的方法及其所用核酸分子和生物材料 | |
CN101684459B (zh) | CehA突变体蛋白、基因、重组载体及其用途和制备方法 | |
WO2019228501A1 (en) | Lentiviral vector used for treatment of gaucher, lentivirus, and preparation method and application thereof | |
CN102816747B (zh) | 一种耐高温铁超氧化物歧化酶及其结晶方法 | |
Cho et al. | Engineering TALE-linked deaminases to facilitate precision adenine base editing in mitochondrial DNA | |
KR101223664B1 (ko) | 나이트릴레이즈 rmn1을 이용한 카르복실산의 제조방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120926 |