ES2296744T3

ES2296744T3 - Ensayo de ubiquitina ligasa.

Info

Publication number: ES2296744T3
Application number: ES01924655T
Authority: ES
Inventors: Sarkiz D. Issakani; Jianing Huang; Julie Sheung; Todd R. Pray
Original assignee: Rigel Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Rigel Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-04-03
Filing date: 2001-04-03
Publication date: 2008-05-01
Anticipated expiration: 2021-04-03
Also published as: DE60131262D1; ATE377654T1; EP1268847B1; WO2001075145A3; DE60131262T2; DK1268847T3; US20090263831A1; AU2001251291A1; JP2003529372A; US20020042083A1; US20050032139A1; US6737244B2; US6740495B1; EP1268847A2; US7022493B2; WO2001075145A2; US7781182B2; JP4095805B2; US20060105409A1

Abstract

Procedimiento de ensayo de la actividad de ubiquitina ligasa que comprende: a) combinar: i) etiqueta 1-ubiquitina; ii) enzima de activación de ubiquitina (E1); iii) enzima de conjugación a ubiquitina (E2); y iv) ubiquitina ligasa (E3); b) medir la cantidad de etiqueta 1-ubiquitina unida a dicha E3.

Description

Ensayo de ubiquitina ligasa.

Campo técnico

La presente invención se refiere a ensayos para la medición de la actividad de enzimas de ubiquitinación. La presente invención también se refiere a ensayos para identificar moduladores de la ubiquitinación.

Antecedentes de la invención

La ubiquitina es una proteína de 76 aminoácidos altamente conservada expresada en todas las células eucariotas. Los niveles de muchas proteínas intracelulares están reguladas por un proceso proteolítico dependiente de ubiquitina. Este proceso implica la unión covalente de ubiquitina a una proteína diana, dando lugar a una proteína diana poli-ubiquitinada que se detecta rápidamente y es degradada por el proteosoma 26S.

La ubiquitinación de estas proteínas está mediada por una cascada de actividad enzimática. La ubiquitina es activada en primer lugar en una forma dependiente de ATP por una enzima de activación de ubiquitina (E1). El extremo C-terminal de una ubiquitina forma un enlace tioléster de alta energía con E1. A continuación, la ubiquitina se pasa a una enzima de conjugación a ubiquitina (E2; también denominada proteína portadora de ubiquitina), unida también a esta segunda enzima a través de un enlace tioléster. La ubiquitina se une finalmente a su proteína diana para formar un enlace a isopéptido terminal bajo la guía de una ubiquitina ligasa (E3). En este proceso, las cadenas de ubiquitina se forman en la proteína diana, cada una unida covalentemente a la siguiente mediante la actividad de E3.

Los componentes de la cascada de unión a ubiquitina han recibido una considerable atención (para una revisión, véase Weissman, Nature Reviews 2:169-178 (2001). E1 y E2 son enzimas estructuralmente relacionadas y bien caracterizadas. Éstas son varias especies de E2 (al menos 25 en mamíferos), algunas de las cuales actúan en parejas preferidas con enzimas E3 específicas para conferir especificidad para proteínas diana diferentes. Aunque la nomenclatura para E2 no está estandarizada entre las especies, los investigadores del sector han tratado este tema y el técnico en la materia puede identificar fácilmente varias proteínas E2, así como las especies homólogas (Véase Haas y Siepmann, FASEB J. 11: 1257-1268 (1997)).

Las enzimas E3 contienen dos actividades separadas: una actividad ubiquitina ligasa para conjugar ubiquitina a sustratos y formar cadenas de poliubiquitinas a través de enlaces de isopéptidos y una actividad de dirección para unir físicamente la ligasa y el sustrato. La especificidad de sustrato de enzimas E3 diferentes es el principal determinante en la selectividad del proceso de degradación de proteína dependiente de ubiquitina.

Se sabe que algunas ubiquitina ligasas E3 tienen una única subunidad responsable de la actividad ligasa. Entre dichas ligasas E3 que han sido caracterizadas se incluyen las proteínas de dominio HECT (homólogo a carboxi terminal de E6-AP), representado por el complejo de mamífero E6AP-E6 que funciona como una ubiquitina ligasa para el desactivador de tumores p53 y que es activado por el virus del papiloma en el cáncer cervical (Huang et al., Science 286: 1321-26 (1999)). Entre las ubiquitina ligasas de subunidad única que tienen un dominio RING se incluyen Mdm2, que también se ha observado que actúa como ubiquitina ligasa para p53, así como la propia Mdm2. Entre otras ligasas E3 de subunidad única con dominio RING se incluyen: TRAF6, implicada en la activación de IKK; Cbl, que dirige a insulina y EGF; Sina/Siah, que dirige DCC; Itchy, que está implicada en la hematopoyesis (células B, T y mast); e IAP, implicada con inhibidores de apoptosis.

La ligasa E3 mejor caracterizada es el APC (complejo promotor de la anafase), que es un complejo con múltiples subunidades que es requerida tanto para la entrada en la anafase como para la salida de la mitosis (véase King et al., Science 274: 1652-59 (1996) para la revisión). El APC juega un papel crucial en la regulación del paso de células a través de la anafase mediante la estimulación de la proteólisis dependiente de ubiquitina de muchas proteínas. Además de la degradación de ciclinas de tipo B mitóticas para la inactivación de actividad CDC2 quinasa, el APC también es necesario para la degradación de otras proteínas para la separación de cromátida hermana y la desunión del fuso. La mayoría de proteínas que se sabe que son degradadas por el APC contiene un motivo de nueve aminoácidos conservados conocido como la "caja de destrucción" que las dirige para la ubiquitinación y la posterior degradación. Sin embargo, las proteínas que se degradan durante G1, incluyendo ciclinas G1, inhibidores de CDK, factores de transcripción y intermedios de señalización, no contienen este motivo de aminoácidos conservados. En cambio, la fosforilación del sustrato parece jugar un papel importante en la dirección de su interacción con una ligasa E3 para la ubiquitinación (véase Hershko et al., Ann. Rev. Biochem. 67:429-75 (1998)).

En las eucariotas, una familia de complejos con actividad de ligasa E3 juega un papel importante en la regulación de la progresión de G1. Estos complejos, llamados SCF's, consisten en al menos tres subunidades, SKP1, Culinas (que tiene al menos siete miembros de la familia) y una proteína F-box (de la que se conocen cientos de especies) que se unen directamente a y reclutan el sustrato al complejo de E3. Se ha observado que las interacciones combinatorias entre los SCF's y una familia de proteínas de tipo dedo RING descubiertas recientemente, el Regulador de las proteínas Culina (ROC)/APC11, son los elementos clave que confieren actividad ligasa a los complejos de proteínas E3. Las combinaciones ROC/Culina particulares pueden regular mecanismos celulares específicos, tal y como se ejemplifica por la función de APC11-APC2, implicados en el control proteolítico de la separación de cromátida hermana y la salida de la telofase a G1 en la mitosis (véase, King et al., supra; Koepp et al., Cell 97: 431-34 (1999)) y ROC1-Culina1, implicado en la degradación proteolítica de I_{\kappa}B_{\alpha} en la regulación de la transcripción mediada por NF-_{\kappa}B/l_{\kappa}B (Tan et al., Mol. Cell 3(4): 527-533 (1999); Laney et al., Cell 97: 427-30 (1999)).

Debido a que el complejo de E3 es el determinante principal de la selección de la degradación de proteínas por el proceso proteolítico dependiente de ubiquitina, los moduladores de actividad E3 ligasa se pueden utilizar para la sobrerregulación o subregulación de moléculas específicas implicadas en la transducción de señales celulares. Los procesos patológicos se pueden tratar mediante dicha sobre- o subregulación de los transductores de señal para aumentar o reducir las respuestas celulares específicas. Este principio se ha utilizado en el diseño de una serie de productos terapéuticos, incluyendo inhibidores de fosfodiesterasa para enfermedades de las vías respiratorias e insuficiencia cardiovascular, inhibidores de quinasa para transformaciones malignas e inhibidores de proteosoma para condiciones inflamatorias tales como la artritis.

Debido a la importancia de la ubiquitinación en la regulación celular y el amplio conjunto de posibles componentes diferentes en la proteólisis dependiente de ubiquitina, existe la necesidad de un medio rápido y simple para ensayar la actividad de E3 ligasa. Además, dicho ensayo sería muy útil para la identificación de moduladores de E3 ligasa. Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar procedimientos de ensayo de la actividad de ubiquitina ligasa, los cuales se pueden utilizar también para identificar moduladores de actividad de ubiquitina ligasa.

Descripción de la técnica relacionada

Tan et al., supra, describen que ROCl/Cul 1 cataliza la polimerización de ubiquitina en ausencia de proteína sustrato diana. Ohta et al., Mol. Cell 3(4): 535-541 (1999) describen que APC11/APC2 también catalizan la polimerización de ubiquitina en ausencia de proteína sustrato diana, y que esta actividad es dependiente de la inclusión de las especies de E2 adecuadas. Rolfe et al., Patente de Estados Unidos No. 5,968,761 describen un ensayo para identificar inhibidores de la ubiquitinación de una proteína reguladora diana.

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona procedimientos para ensayar la actividad de ubiquitina ligasa y cribar ("screening") agentes que modulan la actividad de ubiquitina ligasa. En un aspecto, se proporciona un procedimiento de ensayo de actividad de ubiquitina ligasa que implica las etapas de combinación de ubiquitina, E1, E2 y E3 y la medición de la cantidad de ubiquitina unida a E3. Este procedimiento puede implicar adicionalmente la combinación de un modulador de ubiquitina ligasa candidato en la etapa de combinación. Este procedimiento no requiere una proteína diana específica para ser ubiquitinada. En una realización preferida, se excluye específicamente una proteína sustrato para la ubiquitinación diferente de la propia ubiquitina.

En una realización del ensayo descrito anteriormente, la ubiquitina está en forma de etiqueta 1-ubiquitina. En otra realización, E3 está en forma de etiqueta 2-E3. En estas realizaciones, etiqueta 1 puede ser una etiqueta o un componente en la pareja de unión. En una realización, etiqueta 1 es una etiqueta fluorescente, en cuyo caso la medición de la cantidad de ubiquitina unida a E3 se puede realizar midiendo la luminiscencia.

En otras realización, etiqueta 1 es un miembro de una pareja de unión elegida del grupo de antígeno, biotina y CBP. En esta última realización, el componente de la pareja de unión se puede marcar mediante marcaje indirecto, el cual puede ser un marcador fluorescente o una enzima marcadora. La enzima marcadora puede ser peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o glucosa oxidasa. Cuando el marcaje indirecto es mediante un marcador fluorescente, la medición de la cantidad de ubiquitina unida a E3 se puede realizar midiendo la luminiscencia. En el caso que el marcaje indirecto sea mediante una enzima marcadora, dicha enzima puede reaccionar con un sustrato que produce un producto fluorescente, en cuyo caso, la medición de la cantidad de ubiquitina unida a E3 se puede realizar midiendo la luminiscencia. En una realización del procedimiento anterior, etiqueta 1 es un antígeno de FLAG. En esta realización, el marcaje indirecto puede ser mediante anti-FLAG.

En un aspecto del procedimiento anterior, etiqueta 2 es una molécula de unión a la superficie, que puede ser una etiqueta de histidina. En este último caso, el ensayo se puede realizar en una placa con múltiples pocillos que comprende una sustrato de superficie que comprende níquel.

En una realización diferente del procedimiento anterior, cuando etiqueta 1 es un marcador fluorescente, la etapa de combinación incluye además la combinación de etiqueta 3-ubiquitina. Etiqueta 3 puede ser el segundo miembro de una pareja de FRET con etiqueta 1 o puede ser un desactivador de etiqueta 1. En esta realización, la medición de la cantidad de ubiquitina unida a E3 se puede realizar midiendo la emisión fluorescente, lo cual puede implicar la medición del espectro de emisión por fluorescencia. En esta última realización, el procedimiento puede comprender además la comparación del espectro de emisión por fluorescencia medido con el espectro de emisión por fluorescencia de etiqueta 1- y etiqueta 3-ubiquitina no unida. Cuando se mide la cantidad de ubiquitina unida a E3 se realiza midiendo el espectro de emisión por fluorescencia, esta medición puede ser continua o en puntos de tiempo específicos tras la combinación original de materiales.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para identificar moduladores de enzimas ubiquitinación. Este procedimiento comprende la combinación de etiqueta 1-ubiquitina, un modulador candidato, E1, E2 y etiqueta 2-E3 y la medición de la cantidad de etiqueta 1-ubiquitina unida a etiqueta 2-E3. En otra realización, este procedimiento comprende además la combinación de etiqueta 1-ubiquitina, un modulador candidato, E1 y etiqueta 2-E2 y la medición de la cantidad de etiqueta 1-ubiquitina unida a etiqueta 2-E2. En una realización preferida, la proteína diana (es decir, una proteína sustrato diferente de la propia ubiquitina) se excluye específicamente en el procedimiento.

En las realizaciones del procedimiento de identificación de moduladores de enzimas de ubiquitinación, etiqueta 1 puede ser un marcador o un componente de una pareja de unión. Si etiqueta 1 es un marcador, puede ser un marcador fluorescente, en cuyo caso, la medición de la cantidad de etiqueta 1-ubiquitina unida se puede realizar midiendo la luminiscencia. Si etiqueta 1 es un componente en una pareja de unión, los potenciales componentes de la pareja de unión, las opciones de marcaje y las posteriores opciones de medición son sustancialmente tal como se han descrito anteriormente para etiqueta 1 para el procedimiento de ensayo de la actividad de ubiquitina ligasa.

En el procedimiento anterior de identificación de moduladores de enzimas de ubiquitinación, etiqueta 2 y etiqueta 3 pueden ser moléculas de unión al sustrato de superficie. Las opciones para dichas moléculas y condiciones para realizar
el procedimiento son tal y como se han descrito para el procedimiento de ensayo de la actividad de ubiquitina ligasa.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de ensayo de la actividad de enzimas ubiquitinación. Este procedimiento comprende la combinación de etiqueta 1-ubiquitina y etiqueta 2-ubiquitina, E1, E2 y E3 en condiciones en las que puede tener lugar la ubiquitinación y la medición de la cantidad o tasa de ubiquitinación. En esta realización, etiqueta 1 y etiqueta 2 constituyen una pareja de FRET o etiqueta 1 es un marcador fluorescente y etiqueta 2 es un desactivador de etiqueta 1. En una realización, el procedimiento incluye la combinación de un modulador de la ubiquitinación candidato con los otros componentes. En una realización preferida de este procedimiento, la medición se realiza midiendo el espectro de emisión por fluorescencia de la combinación, preferiblemente de forma continua o en puntos de tiempo específicos tras la combinación de los componentes. Estas mediciones se pueden comparar con el espectro de emisión por fluorescencia de etiqueta 1 y etiqueta 2 no unidas a ubiquitina.

En la presente invención también se proporciona un procedimiento de identificación de un modulador de ubiquitina. Este procedimiento implicaba la combinación de de un modulador de la ubiquitinación candidato, etiqueta 1-ubiquitina y etiqueta 2-ubiquitina, E1, B2 y E3 en condiciones en las que puede tener lugar la ubiquitinación y la medición de la cantidad o tasa de ubiquitinación. En esta realización, etiqueta 1 y etiqueta 2 constituyen una pareja de FRET o etiqueta 1 es un marcador fluorescente y etiqueta 2 es un desactivador de etiqueta 1. En una realización, el procedimiento incluye la combinación de un modulador de la ubiquitinación candidato con los otros componentes. En una realización preferida de este procedimiento, la medición se realiza midiendo el espectro de emisión por fluorescencia de la combinación, preferiblemente de forma continua o en puntos de tiempo específicos tras la combinación de los componentes. Estas mediciones se pueden comparar con el espectro de emisión por fluorescencia de etiqueta 1 y etiqueta 2 no unidas a ubiquitina.

En los últimos dos ensayos descritos, la ubiquitina puede estar en forma de etiqueta 1,3-ubiquitina y etiqueta 2,3-ubiquitina, donde etiqueta 3 es un miembro de la pareja de unión, preferiblemente FLAG. En otra realización de estos ensayos, E3 puede estar en forma de etiqueta 4-E3, donde etiqueta 4 es una molécula de unión a sustrato de superficie.

En otro aspecto de la presente invención, las composiciones se proporcionan para el uso en el ensayo de la ubiquitinación. La composición comprende etiqueta 1-ubiquitina y etiqueta 2-ubiquitina, donde etiqueta 1 y etiqueta 2 constituyen una pareja de FRET o etiqueta 1 es un marcador fluorescente y etiqueta 2 es un desactivador de etiqueta 1. En una realización, la composición comprende además E1, E2 y E3.

En una realización preferida de los ensayos y las composiciones descritas anteriormente, E2 se selecciona del grupo que consiste en Ubc5, Ubc3, Ubc4 y UbcX. En una realización preferida, E3 comprende una proteína de dedo RING, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en ROC1, ROC2 y APC11. En una realización preferida, E3 comprende Culina, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en CUL1, CUL2, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5 y APC2. En una realización preferida, E3 comprende una combinación de proteína de dedo RING/Culina, seleccionada preferiblemente del grupo que consiste en APC11/APC2, ROC1/CUL1, ROC1/CUL2 y ROC2/CUL5.

Otros aspectos de la presente invención serán evidentes para el experto en la materia a partir de la siguiente descripción de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra las cantidades relativas de ubiquitina marcada fluorescentemente en un ensayo de activación y conjugación de ubiquitina. En estos experimentos, B2 es His-Ubch5c.

La figura 2 muestra las cantidades relativas de actividad de ubiquitina ligasa resultante de varias combinaciones de enzimas de ubiquitinación. En estos experimentos, E3 comprende la proteína de dedo RING ROC1 y Culina Cull.

La figura 3 muestra la actividad de ubiquitina ligasa relativa en un ensayo que combina ubiquitina, E1, E2 y E3. La figura 3A muestra la actividad de ubiquitina ligasa relativa utilizando cantidades variantes de E1 en presencia y ausencia de DMSO. La figura 3B muestra la actividad de ubiquitina ligasa relativa utilizando cantidades variantes de ubiquitina y E3.

La figura 4 muestra la señal de proporción de ruido del marcador fluorescente en un ensayo de actividad de ubiquitina ligasa utilizando Flag-ubiquitina y un anticuerpo anti-Flag/anti-ratón conjugado a HRP y sustrato de HRP fluorescente con luminol. La señal se midió a partir de una composición de la reacción que comprendía E1, E2 y E3, con E3 unido específicamente al sustrato de superficie del recipiente de reacción. La base se midió como la cantidad de fluorescencia presente después de realizar el ensayo en ausencia de E3.

La figura 5 muestra el efecto dependiente de la concentración de dos moduladores de actividad de ubiquitina ligasa en ensayos que miden la actividad de ubiquitina ligasa con dos enzimas E3 diferentes. La figura 5A muestra una reducción dependiente de la concentración en la actividad de ubiquitina ligasa en ensayos que comprenden ROC1/CUL1 o ROC2/Cu15 como componentes de la ubiquitina ligasa E3. La figura 5B muestra un patrón ligeramente diferente de reducción dependiente de la concentración en la actividad de ubiquitina ligasa para otro modulador.

La figura 6 muestra las proporciones de actividad de ubiquitina ligasa y actividad de conjugación a ubiquitina en presencia y ausencia de dos moduladores candidatos de enzima ubiquitina ligasa para combinaciones de E1, E2 y E3 y combinaciones de enzimas E1, E2 y E3 y combinaciones de enzimas E1 y E2. La figura 6A muestra un modulador de enzima de ubiquitinación candidato que afecta sólo a E3. La figura 6B muestra un modulador de enzima de ubiquitinación candidato que afecta a enzimas diferentes de E3.

La figura 7 muestra los efectos dependientes de la concentración de dos moduladores de ubiquitina ligasa candidatos en la actividad de ubiquitina ligasa y la actividad de conjugación a ubiquitina. La figura 7A muestra los resultados para un modulador candidato que tiene un efecto dependiente de la concentración en la actividad de ubiquitina ligasa (E1+E2+E3), pero no en la actividad de conjugación a ubiquitina (E1 + B2), por tanto afectando sólo a E3 ligasa. La figura 7B muestra los resultados para un modulador candidato que tiene u efecto dependiente de la concentración en tanto la actividad de conjugación a ubiquitina como la actividad de ubiquitina ligasa, por tanto afectando a un componente diferente de E3 ligasa.

Las figuras 8A y 8B muestran la secuencia de ácidos nucleicos que codifica E1 de conejo y la secuencia de aminoácidos de E1 de conejo, respectivamente.

Las figuras 9A y 9B muestran la secuencia de ácidos nucleicos que codifica E2 Ubc5c y la secuencia de aminoácidos de E2 Ubc5c, respectivamente.

La figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de dedo RING APC11.

La figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de dedo RING ROC1.

Las figuras 12A y 12B muestran la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína de dedo RING ROC2 y la secuencia de aminoácidos de ROC2, respectivamente.

Las figuras 13A y 13B muestran la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la Culina CUL5 y la secuencia de aminoácidos de CUL5, respectivamente.

Las figuras 14A y 14B muestran la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la Culina APC2 y la secuencia de aminoácidos de APC2, respectivamente.

Las figuras 15A, 15B y 15C muestran la secuencia de aminoácidos de ubiquitina humana, Flag-ubiquitina y Flag-Cys-ubiquitina, respectivamente. Las partes de Flag y Flag-Cys de la secuencia se muestran en negrita.

Las figuras 16A y 16B muestran la incorporación dependiente de E3 ligasa de Flag-Ala-Cys-ubiquitina marcada con fluoróforos de FRET en el complejo de E3-ubiquitina. El aislamiento por HPLC muestra emisiones de la ubiquitina libre y la ubiquitina unida a E3 ligasa. La representación muestra la emisión fluorescente a la longitud de onda descrita a continuación, a una excitación de 336 nm, la longitud de onda de excitación óptima para IAEDANS. La figura 16A muestra las señales de fluorescencia de ubiquitina marcada con IAEDANS (490 nm; pico más amplio) y con fluoresceína (515 nm; pico más pequeño) tras la combinación con E1 y E2 solas. La ubiquitina libre se aisló utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). La figura 16B muestra las señales de fluorescencia de ubiquitina marcada con IAEDANS (490 nm; pico más amplio a cada volumen de elución) y con fluoresceína (515 nm; pico más pequeño a cada volumen de elución) tras la combinación con E1 y E2 y E3 (Roc1/Cul1). La línea de trazos muestra la densidad óptica de la solución de proteína (escala a la derecha), revelando la alta sensibilidad de los fluoróforos a pesar de la concentración muy baja de proteína.

La figura 17 muestra el espectro de emisión por fluorescencia de la ubiquitina libre marcada con la pareja aceptor/dador de FRET, EDANS y fluoresceína, a una excitación de 336 nm. La línea de trazos muestra el espectro de emisión de la ubiquitina libre marcada (reactivos), mientras que la línea continua muestra el espectro de emisión de la ubiquitina marcada unida a E3 (productos). El gran aumento en la proporción de emisión 515:490 nm de la ubiquitina unida a E3 en comparación con la ubiquitina libre muestra la transferencia de energía del dador EDANS al aceptor fluoresceína de esta pareja de aceptor/dador de FRET.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para ensayar la actividad de ubiquitina ligasa. En una realización amplia, el procedimiento proporciona la medición de la actividad de ubiquitina ligasa directamente cuando tiene lugar la reacción, evitando de este modo la necesidad de proteína diana y el posterior análisis, tal como la separación de material unido y no unido en un procedimiento SDS-PAGE. Esto permite un análisis de un grupo con múltiples pocillos y técnicas de cribado de alto rendimiento de moduladores de actividad de ubiquitinación. Además, los procedimientos de la invención permiten el análisis de muchas combinaciones diferentes de componentes de E3 y combinaciones E2/E3, sin necesidad de una identificación previa de sustratos diana específicos.

En general, el procedimiento implica la combinación de ubiquitina y enzimas de unión a ubiquitina y la medición de la cantidad de ubiquitina unida a la proteína sustrato de ubiquitinación. En una realización preferida, la proteína sustrato de ubiquitinación es la propia ubiquitina y lo que se mide son las cadenas de poliubiquitina producidas en la reacción de ligasa. Por lo tanto, tal y como se utiliza en la presente invención, la "proteína sustrato de ubiquitinación" significa una proteína a la que la ubiquitina está unida a través de la actividad de enzimas de ubiquitinación y "ubiquitinación" y equivalentes gramaticales del mismo significa la unión de ubiquitina a una proteína sustrato.

En una realización preferida, se utiliza una proteína diana no específica para medir la actividad de ubiquitina ligasa. Por "proteína diana" se entiende en la presente invención una proteína diferente de ubiquitina a la que la ubiquitina se une mediante enzimas de ubiquitinación. En esta realización, preferiblemente, las cadenas de poliubiquitina detectadas están unidas a E3. En otra realización preferida, las cadenas de poliubiquitina detectadas pueden estar unidas o no a E3.

En una realización preferida, E3 está unida a la superficie de un recipiente de reacción, tal como el pocillo de una placa con múltiples pocillos. Esta realización facilita la separación de ubiquitina unida de ubiquitina no unida. Los medios de unión de E3 a la superficie del recipiente de reacción se describen a continuación. Esta realización permite la reacción ligasa de la ubiquitina y la detección y medición de la ubiquitina unida que tiene lugar en el mismo recipiente, haciendo que el ensayo sea útil para aplicaciones de cribado con alto rendimiento.

En otra realización preferida, E3 está libre en solución. En esta realización, la actividad de ubiquitinación está monitorizada utilizando un sistema que produce una señal que varía con la extensión de la ubiquitinación, tal como el sistema de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) descrito en detalle a continuación.

En una realización preferida, la ubiquitina se marca, directa o indirectamente, tal como se describe en detalle a continuación, y se mide la cantidad de marcaje. Esto permite una detección fácil y rápida y la medición de ubiquitina unida, haciendo que el ensayo sea útil para aplicaciones de cribado con alto rendimiento. En una realización preferida, la señal del marcador varía con la extensión de la ubiquitinación, tal como el sistema de FRET descrito en detalle a continuación. Un técnico en la materia entenderá la aplicabilidad de la presente invención para el cribado de agentes que modulan la ubiquitinación.

Por consiguiente, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para ensayar la actividad de ubiquitina ligasa. Por "ubiquitina" en la presente invención se entiende un polipéptido que se une a otro polipéptido mediante enzimas ubiquitina ligasa. La ubiquitina puede ser de cualquier especie de organismo, preferiblemente una especie eucariota. Preferiblemente, la ubiquitina es de mamífero. Más preferiblemente, la ubiquitina es ubiquitina humana. En una realización aún más preferida, la ubiquitina tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 15A.

En una realización preferida, cuando la ubiquitina se une a una proteína diana, esa proteína está dirigida a la degradación por la proteosoma 26S.

Las realizaciones preferidas de la presente invención utilizan una ubiquitina humana de 76 aminoácidos. Otras realizaciones utilizan variantes de ubiquitina, tal y como se describirá detalle a continuación.

"Ubiquitina" también comprende alelos naturales y variantes realizadas por el hombre de dicho polipéptido de 76 aminoácidos. En una realización preferida, la ubiquitina tiene la secuencia de aminoácidos de la descrita en ATCC de número de acceso P02248, incorporada en la presente invención por referencia. Los números de acceso ATCC se encuentran en el Banco de Genes ("Genbank"). Las secuencias de los números de acceso del Banco de Genes se incorporan en la presente invención por referencia. El Banco de Genes es conocido en la técnica, véase Benson, DA, et al., Nucleic Acids Research 26: 1-7 (1998) y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Preferiblemente, la ubiquitina tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 15A. En una realización preferida, las variantes de ubiquitina tienen una identidad en la secuencia de aminoácidos completa de preferiblemente más de aproximadamente un 75%, más preferiblemente más de aproximadamente un 80%, incluso más preferiblemente más de aproximadamente un 85%, y aún incluso más preferiblemente más de un 90% con la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 15A. En algunas realizaciones, la identidad en la secuencia será tan elevada como aproximadamente de un 93 a un 95 ó 98%.

En otra realización preferida, una proteína de ubiquitina tiene una similitud en la secuencia completa con la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 15A de más de aproximadamente un 80%, más preferiblemente más de aproximadamente un 85%, incluso más preferiblemente más de un 90% e incluso más preferiblemente más de un 93%. En algunas realizaciones, la identidad en la secuencia será tan elevada como aproximadamente de un 95 a un 98 ó 99%.

Tal y como se conoce en la técnica, se pueden utiliza una serie de diferentes programas para identificar si una proteína (o ácido nucleico tal y como se describe a continuación) tiene una identidad o similitud en la secuencia con una secuencia conocida. La identidad y/o similitud en la secuencia se determina utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, el algoritmo de identidad de secuencias locales de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de identidad en la secuencia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda de un método de similitud de Pearson & Lipman, PNAS USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computacionales de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), el programa de secuencias Best Fit descrito por Deveraux et al., Nucl. Acid Res. 12: 387-395 (1984), preferiblemente utilizando los valores por defecto o mediante inspección. Preferiblemente, el porcentaje de identidad se calcula mediante FastDB en base a los siguientes parámetros: penalización por desacoplamiento de 1; penalización por espacio de 1; penalización por tamaño de espacio de 0,33; y penalización por unión de 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Análisis", ``Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, páginas 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencias múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones progresivas por parejas. También puede trazar un árbol que muestra las relaciones en grupo utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de FENA & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987); el método es similar al descrito por Higgins & Sharp CABIOS 5: 151-153 (1989). Entre los parámetros de PILEUP útiles se incluyen un peso por espacio por defecto de 3,00, un peso por longitud de espacio por defecto de 0,10 y espacios finales ponderados.

Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990) y Karlin et al., PNAS USA 90: 5873-5787 (1993). Un programa de BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST2 que se obtuvo de Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/
blast/README. WU-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales están fijados a los valores por defecto. Los parámetros ajustables se fijan con los siguientes valores: tramo de solapamiento ("overlap span" = 1, fracción de solapamiento = 0,125, umbral de palabra (T) = 11. Los parámetros HSP S y HSPS2 son valores dinámicos y son establecidos por el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia concreta y la composición de la base de datos concreta contra la que se busca la secuencia de interés; sin embargo, los valores se puede ajustar para aumentar la sensibilidad.

Un algoritmo útil adicionales es gapped BLAST tal como se describe por Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Gapped BLAST utiliza marcadores de sustitución BLOSUM-62; parámetro de umbral T ajustada a 9; el método de doble impacto ("two-hit") para impulsar las extensiones sin espacios; las cargas de ruptura de longitudes de k a un coste de 10 + k; X_{u} ajustado a 16; X_{g} ajustado a 40 para la etapa de búsqueda en la base de datos y 67 para la etapa de salida de los algoritmnos. Las alineaciones "gapped" son impulsadas por un marcador correspondiente a
\sim 22 bits.

El valor del porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos se determina mediante el número de emparejamientos de residuos idénticos dividido por el número total de residuos de la secuencia "más larga" en la región alineada. La secuencia "más larga" es la que tiene los residuos más efectivos en la región de alineación (los espacios introducidos por Wu-Blast-2 para maximizar el marcador de alineación se ignoran).

La alineación puede incluir la introducción de espacios en las secuencias a alinear. Además, para secuencias que contienen más, o bien menos aminoácidos que la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 15A, se entiende que en una realización, el porcentaje de identidad en las secuencias se determinará en base al número de aminoácidos idénticos en relación con el número total de aminoácidos. De este modo, por ejemplo, la identidad en la secuencia de secuencias más cortas que la de la secuencia descrita en la figura 15A, tal y como se describe a continuación, se determinará utilizando el número de aminoácidos en la secuencia más corta, en una realización. En los cálculos del porcentaje de identidad, el peso relativo no se asigna a varias manifestaciones de variación en la secuencia, tales como inserciones, deleciones, sustituciones, etc.

En una realización, sólo las identidades se marcan positivamente (+1) y a todas las formas de variación de secuencia que incluyen espacios se asigna un valor de "0" que obvia la necesidad de una escala o parámetros ponderados tal y como se describe a continuación para los cálculos de similitud en la secuencia. El porcentaje de identidad en la secuencia se puede calcular, por ejemplo, dividiendo el número de residuos idénticos que se emparejan por el número total de residuos de la secuencia "más corta" en la región alineada y multiplicada por 100. La secuencia "más larga" es la que tiene los residuos más eficaces en la región alineada.

Las proteínas de ubiquitina de la presente invención pueden ser más cortas o más largas que la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 15A. De este modo, en una realización preferida, incluida en la definición de ubiquitina están las partes o fracciones de la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 15A. En una realización de la presente invención, los fragmentos de ubiquitina se consideran proteínas de ubiquitina si están unidas a otro polipéptido por enzimas ubiquitina ligasa.

Además, tal y como se describe con detalle a continuación, la ubiquitina se puede hacer más larga que la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 15A; por ejemplo, mediante la adición de etiquetas ("etiquetas"), la adición de otras secuencias de fusión, o la elucidación de secuencias adicionales de codificación y no codificación. Tal y como se describe a continuación, particularmente se prefiere la fusión de un péptido de ubiquitina a un péptido fluorescente, tal como el Péptido Fluorescente Verde (GFP).

La proteína de ubiquitina, así como otras proteínas de la presente invención, son preferiblemente recombinantes. Una "proteína recombinante" es una proteína fabricada utilizando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante, tal y como se ha descrito posteriormente. En una realización preferida, la ubiquitina de la presente invención se fabrica mediante la expresión de una ácido nucleico tal y como se describe en el número de acceso de ATCC M26880 o AB003730, o un fragmento del mismo. En una realización más preferida, el ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 15A. Una proteína recombinante se distingue de la proteína natural en al menos una o más características. Por ejemplo, la proteína se puede aislar o purificar de algunas o todas las proteínas y compuestos con las que normalmente está asociada en su huésped de tipo salvaje y, de este modo, puede estar sustancialmente pura. Por ejemplo, una proteína aislada no está acompañada por al menos parte del material con el que está asociado normalmente en su estado natural, preferiblemente constituyendo al menos aproximadamente un 0,5%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 5% en peso de la proteína total en una muestra determinada. Una proteína sustancialmente pura comprende al menos aproximadamente un 75% en peso de la proteína total, siendo preferido al menos aproximadamente un 80%, y siendo particularmente preferido al menos aproximadamente un 90%. La definición incluye la producción de una proteína desde un organismo en un organismo o célula huésped diferente. Alternativamente, la proteína puede fabricarse a una concentración significativamente más elevada que la observada normalmente, mediante la utilización de un promotor inducible de promotor de expresión elevada, de manera que la proteína se fabrica a mayores niveles de concentración. Alternativamente, la proteína puede estar en una forma no hallada normalmente en la naturaleza, como en la adición de un epítopo etiqueta o sustituciones, inserciones y deleciones de aminoácidos, tal y como se describe a continuación.

Tal y como se utiliza en la presente invención y se define adicionalmente a continuación, "ácido nucleico" puede referirse a ADN o ARN o moléculas que contienen tanto desoxi- como ribonucleótidos. Los ácidos nucleicos incluyen ADN genómico, ADNc y oligonucleótidos que incluyen ácido nucleicos sentido y antisentido. Dichos ácidos nucleicos también pueden contener modificaciones en la estructura de ribosa-fosfato para aumentar la estabilidad y la vida media de dichas moléculas en medios fisiológicos.

El ácido nucleico puede ser de doble cadena, cadena única o contiene partes de secuencia de doble cadena o de cadena única. Como entenderán los técnicos en la materia, la representación de una cadena única ("Watson") también define la secuencia de la otra cadena ("Crick"); de este modo, las secuencias representadas en las figuras 1 y 3 también incluyen el complemento de la secuencia. Por el término "ácido nucleico recombinante" en la presente invención se entiende ácido nucleico, formado originalmente in vitro, en general, mediante la manipulación de ácido nucleico por endonucleasa, en una forma no hallada normalmente en la naturaleza. De este modo, un ácido nucleico aislado, en una forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro mediante la unión de moléculas de ADN que no se unen normalmente, son ambos considerados como recombinantes para los objetivos de la presente invención. Se entiende que una vez se fabrica un ácido nucleico recombinante y se reintroduce en una célula u organismo huésped, se replicará de forma no recombinante, es decir, utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped en lugar de manipulaciones in vitro; sin embargo, dichos ácidos nucleicos, una vez producidos recombinantemente, aunque posteriormente se repliquen de forma no recombinante, aún se consideran recombinantes para los objetivos de la presente invención.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se pueden utilizar indistintamente a lo largo de la solicitud, y significan al menos dos aminoácidos unidos covalentemente, que incluyen proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. La proteína puede estar fabricada de aminoácidos naturales y enlaces peptídicos o estructuras sintéticas péptidomiméticas. De este modo, "aminoácido" o "residuo de péptido", tal y como se utilizan en la presente invención, ambos significan aminoácidos tanto naturales como sintéticos. Por ejemplo, homofenilalanina, citrulina y norleucina son considerados aminoácidos para los objetivos de la presente invención. "Aminoácido" también incluye residuos aminoácidos tales como prolina e hidroxiprolina. Las cadenas laterales pueden estar en configuración (R) o (S). En la realización preferida, los aminoácidos están en configuración (R) o L. Si se utilizan cadenas laterales no naturales, se pueden utilizar sustituyentes no aminoácidos, por ejemplo, para prevenir o retrasar la degradación in vivo.

En una realización, la presente invención proporciona composiciones que contienen variantes de proteínas, por ejemplo, variantes de ubiquitina, E1, E2 y/o E3. Estas variantes se encuentran en una o más de estas tres clases: variantes por sustitución, inserción o deleción. Estas variantes se preparan normalmente mediante mutagénesis específica de sitio de nucleótidos en el ADN que codifica una proteína de las presentes composiciones utilizando mutagénesis de cassette o PCR u otras técnicas bien conocidas en la técnica, para producir ADN que codifica la variante y, a continuación, expresar el ADN en cultivos de células recombinantes tal y como se indica anteriormente. Sin embargo, los fragmentos de proteínas variantes que tienen hasta aproximadamente 100-150 residuos se pueden preparar mediante síntesis in vitro utilizando técnicas establecidas. Las variantes de secuencias de aminoácidos se caracterizan por la naturaleza predeterminada de la variación, una característica que las coloca aparte de la variación natural alélica o entre especies en la secuencia de aminoácidos de la proteína. Las variantes muestran habitualmente la misma actividad biológica cualitativa que el análogo natural, aunque también se pueden seleccionar variantes que han modificado características tal y como se describirá con detalle a continuación.

Aunque el sitio o región para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos es predeterminada, la propia mutación no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, con el fin de optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio determinado, la mutagénesis al azar se puede realizar en el codón o región diana y las variantes expresadas se pueden cribar para obtener la actividad óptima deseada. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en ADN que tienen una secuencia conocida son conocidas, por ejemplo, la mutagénesis de cebador M13 y mutagénesis de PCR. La rápida producción de muchas variantes se puede realizar utilizando técnicas, tales como el método de barajado de genes ("gene shuffling"), mediante el cual los fragmentos de variantes similares de una secuencia de nucleótidos se dejan recombinar para producir nuevas combinaciones de variantes. Ejemplos de dichas técnicas se encuentran en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,605,703; 5,811,238; 5,873,458; 5,830,696; 5,939,250; 5,763,239; 5,965,408 y 5,945,325, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente invención en su totalidad. El cribado de los mutantes se realiza utilizando ensayos de actividad de ubiquitina ligasa de la presente invención.

Las sustituciones de aminoácidos son normalmente de residuos individuales; las inserciones serán habitualmente del orden de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos, aunque se pueden tolerar inserciones considerablemente más amplias. Las deleciones varían de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 residuos, aunque en algunos casos las deleciones pueden ser mucho más amplias.

Se pueden utilizar sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de los mismos para llegar a un derivado final. En general, estos cambios se realizan en unos pocos aminoácidos para minimizar la alteración de la molécula. Sin embargo, en ciertas circunstancias se pueden tolerar cambios más amplios. Cuando se desean pequeñas alteraciones en las características de las proteínas, generalmente se realizan sustituciones según la siguiente tabla:

TABLA I

1

Los cambios sustanciales en la función o identidad inmunológica se realizan mediante la selección de sustituciones que son menos conservativas que las mostradas en la Tabla I. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones que afectan de forma más significativa: la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la alteración, por ejemplo, la estructura de hélice alfa o lámina beta; la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana; o el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se esperan que produzcan los mayores cambios en las propiedades del polipéptido son aquellas en las que (a) un residuo hidrofílico, por ejemplo, seril o treonil, se sustituye por un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucil, isoleucil, fenilalanil, valil o alanil, (b) una cisteína o prolina se sustituye por cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisil, arginil o histidil se sustituye por un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamil o aspartil; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por uno que no tiene cadena lateral, por ejemplo, glicina.

Las variantes muestran habitualmente la misma actividad biológica cualitativa y obtendrán la misma respuesta inmune que el análogo natural, aunque las variantes también se seleccionan para modificar las características de las proteínas según sea necesario. Alternativamente, se puede designar la variante, de manera que se altera la actividad biológica de la proteína. Por ejemplo, los sitios de glicosilación de pueden alterar o eliminar.

Las modificaciones covalentes de polipéptidos se incluyen en el alcance de la presente invención. Un tipo de modificación covalente incluye la reacción de los residuos de aminoácidos dirigidos de un polipéptido con un agente derivatizador orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminal de un polipéptido. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para la reticulación de una proteína a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua a usar en el procedimiento de ensayos de cribado, tal y como se describe con detalle a continuación. Entre los agentes reticulantes utilizados habitualmente se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres bifuncionales, incluyendo succinimidil ésteres, tales como 3,3'-ditiobis(succinimidil-propionato), maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, la mutilación de los grupos amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 (1983)], acetilación del amino N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente de un polipéptido incluido en el alcance de la presente invención comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del polipéptido. Con "Alteración del patrón de glicosilación nativo" para los objetivos de la presente invención se pretende indicar la eliminación de uno o más restos de hidrocarburo hallados en el polipéptido de secuencia nativa y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido de la secuencia nativa.

La adición de sitios de glicosilación a polipéptidos se puede realizar mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de los mismos. La alteración se pueden realizar, por ejemplo, mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina al polipéptido de secuencia nativa (para los sitios de glicosilación unidos a O). La secuencia de aminoácidos se puede alterar opcionalmente a través de los cambios a nivel de ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el polipéptido en las bases preseleccionadas, de manera que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio para aumentar el número de restos de hidrocarburo en un polipéptido es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos medios se describen en la técnica, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas 259-306 (1981).

La eliminación de restos de hidrocarburos presentes en el polipéptido se puede realizar química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican para residuos de aminoácidos que actúan como dianas para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química se conocen en la técnica y se han descrito, por ejemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) y por Edge et al., anal. Biochem., 118:131 (1981). La división enzimática de los restos de hidrocarburo en los polipéptidos se puede conseguir mediante la utilización de una serie de endo- y exoglicosidasas, tal y como se ha descrito por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente de una proteína comprende la unión del polipéptido a uno de una serie de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera establecida en las Patentes de estados Unidos Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337.

Los polipéptidos de la presente invención también se pueden modificar de manera que forman moléculas quiméricas que comprenden un primer polipéptido fusionado a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogos. En una realización, dicha molécula quimérica comprende la fusión de un polipéptido de ubiquitina (o una E2 o una E3, tal y como se define a continuación) con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. El epítopo etiqueta se sitúa generalmente en el extremo amino o carboxi terminal del polipéptido. La presencia de dichas formas etiquetadas con epítopo de un polipéptido se puede detectar utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la disposición de un epítopo etiqueta permite que el polipéptido se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una al epítopo etiqueta. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender la fusión de un polipéptido descrito en la presente invención con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica, dicha fusión podría ser a la región Fc de una molécula IgG. Las etiquetas para los componentes de la presente invención se definen y se describen en detalle a continuación.

La presente invención proporciona procedimientos de ensayo de actividad de ubiquitina ligasa. Por "ubiquitina ligasa" se entiende una enzima de ubiquitinación capaz de catalizar la unión covalente de una ubiquitina a otra proteína. Las realizaciones preferidas de la presente invención implican la combinación de ubiquitina y enzimas de ubiquitinación, incluyendo ubiquitina ligasa, en condiciones en las que la ubiquitinación puede tener lugar y la medición de la cantidad de ubiquitina (poliubiquitina) unida a ubiquitina ligasa. En una realización preferida, la ubiquitina ligasa es una ubiquitina ligasa E3, definida a continuación.

Las realizaciones de la presente invención implican la unión de ubiquitina a una proteína sustrato de ubiquitinación. Por "proteína sustrato de ubiquitinación" se entiende una proteína a la que la ubiquitina ligasa puede catalizar la unión covalente de ubiquitina e incluye proteínas diana y ubiquitina. En una realización preferida, la proteína sustrato de ubiquitinación es ubiquitina y la ubiquitina ligasa cataliza la formación de cadenas de poliubiquitina. En una realización preferida, las cadenas de poliubiquitina se forman mediante la ubiquitina ligasa en ausencia de alguna proteína diana.

En un aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para el ensayo de la ubiquitinación. En estos ensayos, se puede observar y medir la interacción de las diferentes enzimas de ubiquitinación, la interacción de diferentes subunidades de enzimas de ubiquitinación individuales y la influencia de moduladores de ubiquitinación
candidatos.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento de ensayo de la actividad de ubiquitina ligasa. Por "actividad de ubiquitina ligasa", "unión a ubiquitina" y equivalentes gramaticales de los mismos se entiende la catálisis de la unión covalente de ubiquitina a una proteína sustrato. Preferiblemente, cada ubiquitina se une, de manera que un polipéptido de ubiquitina posterior se puede unir a la misma para formar cadenas que comprenden un conjunto de moléculas de ubiquitina. En una realización preferida, la actividad de ubiquitina ligasa tiene lugar en ausencia de proteínas diana, por tanto la proteína sustrato es ubiquitina.

En una realización preferida, la presente invención se refiere adicionalmente a un procedimiento de ensayo de la actividad de ubiquitina ligasa. Por "actividad de activación de ubiquitina", "activación de ubiquitina" y equivalentes gramaticales de los mismos se entiende la unión de ubiquitina y E1. Preferiblemente, E1 forma un enlace tioléster de alta energía con la ubiquitina.

En una realización preferida, la presente invención también se refiere a un procedimiento de ensayo de la actividad de conjugación a ubiquitina. Por "actividad de conjugación a ubiquitina", "conjugación a ubiquitina" y los equivalentes gramaticales de los mismos se entiende la unión de ubiquitina activada con una E2. Como se entenderá por los expertos en la materia, debido a la presencia del enlace tioléster de alta energía en el conjugado de E2-ubiquitina, la ubiquitina conjugada se puede unir a otra ubiquitina a una velocidad baja en ausencia de la actividad catalítica de E3. Por lo tanto, parte de la ubiquitina detectada en un ensayo de actividad de conjugación a ubiquitina estará en forma de poliubiquitina.

La presente invención proporciona procedimientos y composiciones que comprenden la combinación de ubiquitina con otros componentes. Por "combinación" se entiende la adición de los diversos componentes en un recipiente en condiciones en las que la actividad de ubiquitina ligasa o ubiquitinación puede tener lugar. En una realización preferida, el recipiente es un pocillo de una placa de 96 pocillos u otras placas con múltiples pocillos disponibles comercialmente. En una realización preferida alternativa, el recipiente es el recipiente de reacción de una máquina FACS. Entre otros recipientes útiles en la presente invención se incluyen, pero no se limitan a, placas de 384 pocillos y placas de 1536 pocillos. Incluso otros recipientes útiles en la presente invención serán evidentes para el experto en la materia.

La adición de los componentes puede ser secuencial o en un orden o agrupación predeterminada, siempre y cuando se obtengan condiciones susceptibles para la actividad de ubiquitina ligasa. Dichas condiciones son bien conocidas en la técnica y a continuación se proporciona una orientación al respecto.

En una realización preferida, uno o más componentes de la presente invención comprenden una etiqueta. Por "etiqueta" se entiende una molécula o moléculas unidas útiles para la identificación o aislamiento del componente unido. Los componentes que tienen una etiqueta se refieren como "etiqueta-X", donde X es el componente. Por ejemplo, una ubiquitina que comprende una etiqueta se refiere como "etiqueta-ubiquitina". Preferiblemente, la etiqueta está unida covalentemente al componente unido. Cuando más de un componente de una combinación tiene una etiqueta, las etiquetas se enumerarán para su identificación, por ejemplo "etiqueta 1-ubiquitina". Los componentes pueden comprender más de una etiqueta, en cuyo caso cada etiqueta se enumerará, por ejemplo "etiqueta 1,2-ubiquitina". Entre las etiquetas preferidas se incluyen, pero no se limitan a, un marcador, un componente de la pareja de unión y una molécula de unión a sustrato de superficie. Tal y como será evidente para el técnico en la materia, muchas moléculas pueden ser útiles como más de un tipo de etiqueta, dependiendo de cómo se utiliza la etiqueta.

Por "etiqueta" se entiende una molécula que se puede detectar directa (es decir, un marcador primario) o indirectamente (es decir, un marcador secundario); por ejemplo, un marcador se puede visualizar y/o medir o, en cualquier caso, identificarse, de manera que se puede conocer su presencia o ausencia. Tal y como se entenderá por los técnicos en la materia, la manera en la que esto se realiza dependerá del marcador. Entre los marcadores preferidos se incluyen, pero no se limitan a, marcadores fluorescentes, enzimas marcadoras y radioisótopos.

Por "marcador fluorescente" se entiende cualquier molécula que se puede detectar mediante sus propiedades fluorescentes inherentes. Entre los marcadores fluorescentes adecuados se incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, coumarin, metil-coumarins, pireno, verde Malaquita, amarillo Lucifer, Azul Cascada^{TM}, Rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705 y Verde Oregon. Los colorantes ópticos adecuados se describen en el 1996 Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland, expresamente incorporada en la presente invención por referencia. Los marcadores fluorescentes adecuados también incluyen, pero no se limitan a, proteína verde fluorescente (GFP; Chalfie et al., Science 263 (5148); 802-805 (Feb 11, 1994); y EFGP; Clontech - Número de Acceso del Banco de Genes U55762), proteína azul fluorescente (BFP; 1. Quantum biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8ª planta, Montreal (Quebec) Canada H3H 1J9; 2. Stauber, R. H. Biotechniques 24(3): 462-471 (1998); 3. Heim, R. y Tsien, R Y. Curr. Biol. 6: 178-182 (1996)), proteína amarilla fluorescente mejorada (EYFP; 1. Clontech Laboratories, Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303), luciferasa (Ichiki, et al., J. Immunol. 150 (12): 5408-5417 (1993)), \beta-galactosidasa (Nolan, et al., Proc Natl Acad Sci USA 85 (8): 2603-2607 (Abril 1988)) y Renilla WO 92/15673; WO 95/07463; WO 98/14605; WO 98/26277; WO 99/49019; Patente de Estados Unidos 5,292,658; Patente de Estados Unidos 5,418,155; Patente de Estados Unidos 5,683,888; Patente de Estados Unidos 5,741,668; Patente de Estados Unidos 5,777,079; Patente de Estados Unidos 5,804,387; Patente de Estados Unidos 5,874,304; Patente de Estados Unidos 5,876,995; y Patente de Estados Unidos 5,925,558). Todas las referencias citadas anteriormente se incorporan expresamente en la presente invención por referencia.

En algunos ejemplos, se utilizan múltiples marcadores fluorescentes. En una realización preferida, se utilizan al menos dos marcadores fluorescentes que son miembros de una pareja de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). La FRET es un fenómeno conocido en la técnica, en el que la excitación de un colorante fluorescente se transfiere a otro sin emisión de un fotón. Una pareja de FRET consiste en un fluoróforo dador y un fluoróforo aceptor. El espectro de emisión por fluorescencia del dador y el espectro de absorción por fluorescencia del aceptor deben solaparse y las dos moléculas deben estar próximas. La distancia entre dador y aceptor a la que el 50% de los dadores se desactivan (energía de transferencia al aceptor) se define por el radio de Förster (R_{o}) que es habitualmente de 10-100 \ring{A}. Se pueden detectar cambios en el espectro de emisión por fluorescencia que comprenden parejas de FRET, indicando los cambios en número de parejas que están próximas (es decir, menos de 100 \ring{A} entre sí). Esto normalmente resultará de la unión o disociación de dos moléculas, una está marcada con un dador de FRET y la otra está marcad con un aceptor de FRET, donde dicha unión hace que la pareja de FRET estén próximas. La unión de dichas moléculas dará lugar a un aumento de la emisión por fluorescencia del aceptor y/o la supresión de la emisión por fluorescencia del dador.

Entre las parejas de FRET (dador/aceptor) útiles en la presente invención se incluyen, pero no se limitan a, EDANS/fluoresceína, IAEDANS/fluoresceína, fluoresceína/tetrametilrodamina, fluoresceína/LC Red 640, fluoresceína/Cy 5, fluoresceína/Cy 5.5 y fluoresceína/LC Red 705.

En otro aspecto de FRET, se pueden utilizar una molécula dadora fluorescente y una molécula aceptora no fluorescente ("desactivador"). En esta solicitud, la emisión fluorescente del dador aumentará cuando el desactivador se desplace de la proximidad del dador. Entre los desactivadores útiles se incluyen, pero no se limitan a, DABCYL, QSY 7 y QSY 33. Entre las parejas dador/desactivador fluorescentes útiles se incluyen, pero no se limitan a, colorante EDANS/DABCYL, Rojo Texas/DABCYL, BODIPY/DABCYL, amarillo Lucifer/DABCYL, coumarin/DABCYL y fluoresceína/QSY 7.

El técnico en la materia entenderá que FRET y la supresión de fluorescencia permiten la monitorización de la unión de moléculas marcadas con el tiempo, proporcionando una información continua con respecto al tiempo de las reacciones de unión.

Es importante recordar que la ubiquitina se une a la proteína sustrato mediante su grupo carboxilo terminal a un residuo de lisina, incluyendo los residuos de lisina en otra ubiquitina. Por lo tanto, la unión de marcadores u otras etiquetas no debería interferir con ninguno de estos grupos activos en la ubiquitina. Se pueden añadir aminoácidos a la secuencia de la proteína mediante medios bien conocidos en la técnica y descritos en la presente invención, con el objetivo expreso de proporcionar un punto de unión para el marcador. En una realización preferida, se añaden uno o más aminoácidos a la secuencia de un componente para la unión de una etiqueta al mismo, preferiblemente un marcador fluorescente. En una realización preferida, el aminoácido al que se une un marcador fluorescente es cisteína.

Por "enzima marcadora" se entiende una enzima que puede reaccionar en presencia de un sustrato para enzima marcadora que produce un producto detectable. Entre las enzimas marcadoras adecuadas para usar en la presente invención se incluyen, pero no se limitan a, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y glucosa oxidasa. Los procedimientos para el uso de dichos sustratos son bien conocidos en la técnica. La presencia de la enzima marcadora se observa generalmente a través de la catálisis de la enzima con un sustrato para enzima marcadora, produciendo un producto identificable. Dichos productos pueden ser opacos, tales como la reacción de peroxidasa de rábano picante con tetrametil bencedina, y pueden tener una variedad de colores. Se han desarrollado otros sustratos para enzimas marcadoras, tales como Luminol (disponible en Pierce Chemical Co.) que producen productos de reacción fluorescentes. Los procedimientos para identificar enzimas marcadoras con sustratos para enzimas marcadoras son bien conocidos en la técnica y hay disponibles muchos kits comerciales. En Savage et al., Previews 247: 6-9 (1998), Young, J. Virol. Methods 24: 227-236 (1989), que se incorporan en la presente invención por referencia en su totalidad, describen ejemplos y procedimientos para el uso de varias enzimas marcadoras.

Por "radioisótopo" se entiende cualquier molécula radioactiva. Entre los radioisótopos útiles para el uso en la presente invención se incluyen, pero no se limitan a, ^{14}C, ^{3}H, ^{32}P, ^{33}P, ^{35}S, ^{125}I e ^{131}I. El uso de radioisótopos como marcadores es bien conocido en la técnica.

Además, los marcadores se pueden detectar indirectamente, es decir, la etiqueta es un componente de la pareja de unión. Por "componente de una pareja de unión" uno de un primer y un segundo resto, donde dicho primer y dicho segundo resto tienen una afinidad de unión específica entre sí. Las parejas de unión adecuadas para usar en la presente invención se incluyen, pero no se limitan a, antígenos/anticuerpos (por ejemplo, digoxigenina/anti-digoxigenina, dinitrofenil (DNP)/anti-DNP, dansil-X-antidansil, fluoresceína/anti-fluoresceína, amarillo lucifer/anti-amarillo lucifer, y rodamina anti-rodamina), biotina/avidita (o biotina/streptavidina) y proteína de unión a calmodulina (CBP)/calmodulina. Entre otras parejas de unión adecuadas se incluyen polipéptidos, tales como el péptido FLAG [Hopp et al., Bio Technology, 6: 1204-1210 (1988)]; el péptido epítopo de KT3 [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; péptido epítopo de tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; la etiqueta del péptido de proteína del gen 10 de T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 6393-6397 (1990)] y los anticuerpos para los mismos. En general, en una realización preferida, el más pequeño de los componentes de la pareja de unión sirve como etiqueta, ya que las consideraciones estéricas en la unión a ubiquitina pueden ser importantes. Tal y como se entenderá por los técnicos de la materia, los componentes de la pareja de unión se pueden utilizar en aplicaciones diferentes del marcaje, tal y como se describirá a continuación.

Tal y como se entenderá por los técnicos de la materia, un componente de una pareja de unión también puede ser un componente de otra pareja de unión. Por ejemplo, un antígeno (primer resto) puede unirse a un primer anticuerpo (segundo resto) que puede, a su vez, se un antígeno para un segundo anticuerpo (tercer resto). Se entenderá adicionalmente que dicha circunstancia permite la unión indirecta de un primer resto y un tercer resto a través de un segundo resto intermedio que es un componente de una pareja de unión para cada uno.

Tal y como se entenderá por los técnicos de la materia, un componente de una pareja de unión puede comprender un marcador tal y como se ha descrito anteriormente. Se entenderá adicionalmente que esto permite que una etiqueta se marque indirectamente tras la unión de un componente de la unión que comprende un marcador. La unión de un marcador a una etiqueta que es un componente de una pareja de unión, tal y como se acaba de describir, se hace referencia en la presente invención como "marcaje indirecto".

Por "molécula de unión a sustrato de superficie" y los equivalentes gramaticales del mismo se entiende una molécula que tiene una afinidad de unión para un sustrato de superficie específico, el cual es generalmente un miembro de una pareja de unión aplicada, incorporada o, en cualquier caso, unida a una superficie. Entre las moléculas de unión a sustrato de superficie y sus sustratos de superficie se incluyen, pero no se limitan a, etiquetas de poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly) y sustrato de níquel; la etiqueta de glutatión-S transferasa y su sustrato de anticuerpo (disponible en Pierce Chemical; el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su sustrato de anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-21655 (1988)]; la etiqueta c-myc y los sustratos de anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 para la misma [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de la glicoproteína D (gD) del virus del Herpes Simplex y su sustrato de anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. En general, las moléculas sustrato de unión a la superficie útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, estructuras de polihistidina (etiquetas de His) que se unen a sustratos de níquel, antígenos que se unen a sustratos de superficie que comprenden anticuerpos, haptenos que se unen sustratos de avidita (por ejemplo, biotina) y CBP que se unen a sustratos de superficie que comprenden calmodulina.

La producción de sustratos incrustados en anticuerpos es bien conocida; véase Slinkin et al., Bioconj. Chem. 2:342-348 (1991); Torchillin et al., supra; Trubetskoy et al., Bioconj. Chem. 3: 323-327 (1992); King et al., Cancer Res. 54: 6176-6185 (1994); y Wilbur et al., Bioncojugate Chem. 5:220-235 (1994) (todos ellos se incorporan expresamente por referencia en la presente invención), y la unión o la producción de proteínas con antígenos se describe anteriormente.

Los sustratos incrustados en calmodulinas están disponibles comercialmente y la producción de proteínas con CBP se describe en Simcox et al., Strategies 8:40-43 (1995), que se incorpora a la presente invención por referencia en su totalidad.

Tal y como se entenderá por los expertos en la materia, los componentes etiquetas de la presente invención se pueden fabricar de varias maneras dependiendo ampliamente de la forma de la etiqueta. Los componentes de la invención y las etiquetas se unen preferiblemente mediante un enlace covalente.

A continuación se describe la producción de polipéptidos etiqueta mediante medios recombinantes cuando la etiqueta es también un polipéptido. La producción de proteínas marcadas con FLAG es bien conocida en la técnica y los kits para dicha producción están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Kodak y Sigma). Los métodos para la producción y la utilización de proteínas marcadas con FLAG se encuentran, por ejemplo, en Winston et al., Genes y Devel, 13: 270-283 (1999), incorporado en la presente invención en su totalidad, así como los manuales de productos proporcionados con los kits mencionados anteriormente.

La biotinilación de moléculas y sustratos diana es bien conocida, por ejemplo, se conocen un gran número de agentes de biotinilación, incluyendo agentes reactivos a amina y agentes reactivos a tiol para la biotinilación de proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, ácidos carboxílicos; véase capítulo 4, Molecular Probes Catalog, Haugland, 6ª Ed., 1996, incorporada en la presente invención por referencia. Un sustrato biotinilado se puede unir a un componente biotinilado a través de avidita o estreptavidina. De forma similar, también se conocen un gran número de reactivos de haptenilación (Id.).

Los procedimientos para el marcaje de proteínas con radioisótopos es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, dichos procedimientos se encuentran en Ohta et al., Molec. Cell 3:535-541 (1999), que se incorpora en la presente invención por referencia en su totalidad.

La producción de proteínas que tienen etiquetas His mediante medios recombinantes es bien conocida y los kits para producir dichas proteínas están disponibles comercialmente. Dicho kit y utilización se describen en el Manual QIAexpress de Quiagen por Joanne Crowe et al., incorporado expresamente por referencia en la presente invención.

La funcionalización de las etiquetas con grupos químicamente reactivos tales como tioles, aminas, carboxilos, etc. es conocida generalmente en la técnica. En una realización preferida, la etiqueta se funcionaliza para facilitar la unión covalente.

La unión covalente de la etiqueta puede ser directa o mediante un enlazador. En una realización, en enlazador es un grupo de acoplamiento relativamente corto que se utiliza para unir las moléculas. Un grupo de acoplamiento se puede sintetizar directamente sobre un componente de la presente invención, ubiquitina, por ejemplo, y contiene al menos un grupo funcional para facilitar la unión de la etiqueta. Alternativamente, el grupo de acoplamiento puede tener al menos dos grupos funcionales que se utilizan para unir un componente funcionalizado a una etiqueta funcionalizada, por ejemplo. En una realización adicional, el enlazador es un polímero. En esta realización, la unión covalente se realiza directamente o a través de la utilización de grupos de acoplamiento del componente o la etiqueta al polímero. En una realización preferida, la unión covalente es directa, es decir, no se necesita enlazador. En esta realización, el componente contiene preferiblemente un grupo funcional tal como un grupo carboxílico que se utiliza para la unión directa a la etiqueta funcionalizada. Debería entenderse que el componente y la etiqueta se pueden unir de varias maneras, incluyendo las indicadas anteriormente. Lo que es importante es que la manera de unirse no altere significativamente la funcionalidad del componente. Por ejemplo, en etiqueta-ubiquitina, la etiqueta debería unirse de manera que permita que la ubiquitina se una covalentemente a otra ubiquitina para formar cadenas de poliubiquitina. Tal y como se entenderá por los expertos en la materia, la descripción anterior de la unión covalente de un marcador y la ubiquitina se aplica igualmente a la unión de prácticamente cualquiera de dos moléculas de la presente
invención.

En una realización preferida, la etiqueta se funcionaliza para facilitar la unión covalente, tal y como se indica de forma general anteriormente. De este modo, existe una gran variedad de etiquetas disponibles comercialmente que contienen grupos funcionales, incluyendo, pero sin limitarse a, grupos isotiocianato, grupos amino, grupos haloacetilo, maleimidas, succinimidil ésteres, y haluros de sulfonilo, todos ellos se pueden utilizar para unir covalentemente la etiqueta a una segunda molécula, tal y como se describe en la presente invención. La elección del grupo funcional de la etiqueta dependerá del punto de unión a un enlazador, tal y como se ha indicado anteriormente, o a un componente de la presente invención. De este modo, por ejemplo, para la unión directa a un grupo ácido carboxílico de una ubiquitina, se utilizarán etiquetas modificadas con amino o hidracina para un acoplamiento a través de la química de las carbodiimidas, por ejemplo, utilizando 1-etil-3-(3-3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC), tal y como se conoce en la técnica (véase, Se 9 y Set 11 de Molecular Probes Catalog, supra; véase, también, Pierce 1994 Catalog and Handbook, páginas T-155 a T-200, ambos incorporados en la presente invención por referencia. En una realización, la carbodiimida se une en primer lugar a la etiqueta, tal como la disponible comercialmente para muchas de las etiquetas descritas en la presente invención.

En una realización preferida, la ubiquitina está en forma de etiqueta-ubiquitina.

En una realización preferida, la ubiquitina está en forma de etiqueta-ubiquitina, en la que la etiqueta es un componente de una pareja de unión. Preferiblemente, en esta realización, la etiqueta es FLAG y el componente de unión es anti-FLAG. Preferiblemente, en esta realización, se une un marcador al FLAG mediante marcaje indirecto. Preferiblemente, el marcador es una enzima marcadora. Más preferiblemente, la enzima marcadora es peroxidasa de rábano picante que reacciona con un sustrato fluorescente para enzima marcadora. Preferiblemente, el sustrato para enzima marcadora es Luminol. Alternativamente, el marcador es un marcador fluorescente.

En otra realización preferida, la ubiquitina está en forma de etiqueta-ubiquitina, en la que la etiqueta es un marcador fluorescente. En una realización particularmente preferida, la ubiquitina está en forma de etiqueta 1-ubiquitina y etiqueta 2-ubiquitina, donde etiqueta 1 y etiqueta 2 son los miembros de una pareja de FRET. En una realización preferida alternativa, la ubiquitina está en forma de etiqueta 1-ubiquitina y etiqueta 2-ubiquitina, donde etiqueta 1 es un marcador fluorescente y la etiqueta 2 es un desactivador del marcador fluorescente. En cualquiera de estas realizaciones preferidas, cuando etiqueta 1-ubiquitina y etiqueta 2-ubiquitina se unen a través de la actividad de una ubiquitina ligasa, preferiblemente etiqueta 1 y etiqueta 2 están separadas por 100 \ring{A}, más preferiblemente por 70 \ring{A}, aún más preferiblemente por 60 \ring{A}, incluso más preferiblemente, por 40 \ring{A} y, en algunos casos, preferiblemente por 30 \ring{A} o menos.

En aún otra realización preferida, la ubiquitina está en forma de etiqueta 1,2-ubiquitina y etiqueta 1,3-ubiquitina, donde la etiqueta 1 es un miembro de una pareja de unión, preferiblemente FLAG, la etiqueta 2 es un marcador fluorescente y la etiqueta 3 es un marcador fluorescente, de manera que la etiqueta 2 y la etiqueta 3 son miembros de una pareja de FRET o la etiqueta 3 es un desactivador de la etiqueta 2.

En una realización preferida, se añaden uno o más aminoácidos a la secuencia de ubiquitina utilizando técnicas recombinantes tal y como se describe en la presente invención, para proporcionar un punto de unión para una etiqueta, preferiblemente un marcador fluorescente o un desactivador. En una realización preferida, el aminoácido o aminoácidos son Cys o Ala-Cys. Preferiblemente, el aminoácido o aminoácidos se unen al extremo N-terminal de la ubiquitina. En una realización preferida, el aminoácido o aminoácidos se interponen en la secuencia de una etiqueta FLAG y la ubiquitina. En una realización preferida, la etiqueta, preferiblemente un marcador fluorescente o un desactivador, se une a la cisterna añadida.

La presente invención proporciona procedimientos y composiciones que comprenden la combinación de ubiquitina y E1. Por "E1" se entiende una enzima de activación de ubiquitina. En una realización preferida, E1 es capaz de transferir ubiquitina a una E2, definida a continuación. En una realización preferida, E1 se une a ubiquitina. En una realiza-
ción preferida, E1 forma un enlace tioléster de alta energía con ubiquitina, "activando" de este modo la ubiquitina.

En una realización preferida, Entre las proteínas E1 útiles en la presente invención se incluyen aquellas que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido que tiene el número de acceso ATCC A38564, S23770, AAA61246, P22314, CAA40296 y BAA33144, incorporados en la presente invención por referencia. En una realización preferida, E1 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 8B o está codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia mostrada en la figura 8A. Preferiblemente, E1 es E1 humana. E1 está disponible comercialmente por Affiniti Reasearch Products (Exeter, Reino Unido).

En una realización preferida, entre los ácidos nucleicos que se pueden utilizar para producir proteínas E1 para la presente invención se incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos por los números de acceso ATCC M58028, X56976 y AB012190, incorporados en la presente invención por referencia. En una realización preferida, E1 está codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia que consiste esencialmente en la secuencia mostrada en la figura 8A. Tal y como se describe en la presente invención, también se pueden fabricar variantes de las citadas proteínas E1, también incluidas en el término "E1".

En una realización preferida, las composiciones de la presente invención comprenden E2. Por "E2" se entiende una enzima portadora de ubiquitina (también conocida como una enzima de conjugación a ubiquitina). En una realización preferida, la transferencia da lugar a un enlace tioléster formado entre E2 y ubiquitina. En una realización preferida, E2 es capaz de transferir ubiquitina a una E3, definida a continuación. En una realización preferida, la proteína sustrato de ubiquitinación es ubiquitina.

En una realización preferida, entre las proteínas que se pueden utilizar en la presente invención como E2 se incluyen, pero no se limitan a, aquellas que tienen las secuencias de aminoácidos descritas en los números de acceso ATCC AAC37534, P49427, CAA82525, AAA58466, AAC41750, P51669, AAA91460, AAA91461, CAA63538, AAC50633, P27924, AAB36017, Q16763, AAB86433, AAC26141, CAA04156, BAA11675, Q16781, NP__003333, BAB18652, AAH00468, CAC16955, CAB76865, CAB76864, NP__05536, O00762, XP__009804, XP_009488,
XP__006823, XP__006343, XP__005934, XP_002869, XP__003400XP__009365, XP__010361, XP_004699,
XP__004019, 014933, P27924, P50550, P52485, P51668, P51669, P49459, P37286, P23567, P56554, y CAB45853, cada uno de los cuales se incorpora en la presente invención por referencia. Particularmente preferidas son las secuencias descritas en los números de acceso ATCC NP003331, NP003330, NP003329, P49427, AAB53362, NP008950, XP009488 y AAC41750, también incorporados por referencia. El técnico en la materia entenderá que en el sector se conocen muchas proteínas E2 e isozimas diferentes y se pueden utilizar en la presente invención, con la condición de que la E2 tenga actividad de conjugación a ubiquitina. También se incluye específicamente en el término "E2" están las variantes de "E2" que se pueden producir tal y como se describe en la presente invención.

En una realización preferida, E2 es una de Ubc5 ((Ubch5, preferiblemente Ubch5c), Ubc3 (Ubch3), Ubc4 (Ubch4) y UbcX (Ubc10, Ubch10). En una realización preferida, E2 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 9B o está codificada por un ácido nucleico que consiste esencialmente en la secuencia mostrada en la figura 9A.

En una realización preferida, entre los ácidos nucleicos que se pueden utilizar para producir E2 se incluyen, pero no se limitan a aquellos ácidos nucleicos que tienen las secuencias descritas en los números de acceso ATCC L2205, Z29328, M92670, L40146, U39317, U39318, X92962, U58522, S81003, AF031141, AF075599, AJ000519, XM009488, NM007019, U73379, L40146 y D83004, cada uno de ellos incorporados en la presente invención por referencia. Tal y como se ha descrito anteriormente, las variantes de estos y otros ácidos nucleicos que codifican E2 también se pueden utilizar para producir variantes de proteína E2.

En una realización preferida, el ácido nucleico utilizado para producir E2 comprende la secuencia mostrada en la figura 9A.

En una realización preferida, E2 tiene una etiqueta, tal y como se ha definido anteriormente, haciéndose referencia al complejo en la presente invención como "etiqueta-E2". Entre las etiquetas de E2 preferidas se incluyen, pero no se limitan a, marcadores, componentes de las parejas de unión y elementos de unión a sustrato. En una realización más preferida, la etiqueta es una etiqueta de His o etiqueta de GST.

La presente invención proporciona procedimientos y composiciones que comprenden E3. Por "E3" se entiende una ubiquitina ligasa, tal y como se ha definido anteriormente, que comprende uno o más componentes asociados con la unión de ubiquitina a una proteína sustrato de ubiquitinación para la proteólisis dependiente de ubiquitina. En una realización preferida, E3 comprende una proteína de tipo dedo RING y una Culina. En una realización preferida, entre las proteínas de tipo dedo RING se incluyen, pero no se limitan a, ROC1, ROC2 y APC11. En una realización preferida, entre las Culinas se incluyen, pero no se limitan a, CUL1, CUL2, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5 y APC2.

En una realización preferida, entre las proteínas de tipo dedo RING se incluyen, pero no se limitan a, proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos descrita en los números de acceso de ATCC AAD30147 y AAD30146 y 6320196, incorporada en la presente invención por referencia. En una realización más preferida, la proteína de tipo dedo RING tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la mostrada en la figura 10, figura 11 y figura 12B.

En una realización preferida, entre las Culinas se incluyen, pero no se limitan a, proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos descritas en los números de acceso ATCC 4503161, AAC50544, AAC36681, 4503163, AAC51190, AAD23581, 4503165, AAC36304, AAC36682, AAD45191, AAC50548, Q13620, 4503167 y AAF05751, cada uno incorporado en la presente invención por referencia. Además, en el contexto de la presente invención, cada una de las proteínas de tipo dedo RING y Culinas comprenden variantes de las secuencias conocidas o indicadas, tal y como se describe en la presente invención.

En una realización preferida, la Culina tiene una secuencia tal y como se muestra en la figura 13B o 14B.

Estas proteínas E3 y variantes se pueden producir tal y como se describe en la presente invención. En una realización preferida, entre los ácidos nucleicos utilizados para producir las proteínas de tipo dedo RING se incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen las secuencias de ácidos nucleicos descritas en los números de acceso ATCC AF142059, AF142060 y los ácidos nucleicos 433493 a 433990 de NC001136. En una realización preferida, las Culinas se producen de ácidos nucleicos que incluyen, pero no se limitan a, aquellas que tienen las secuencias de ácidos nucleicos descritas en los números de acceso ATCC NM 003592, U58087, AF062536, AF126404, NM 003591, U83410, NM 003590, AB014517, AF062537, AF064087, AF077188, U58091, NM 003478, X81882 y AF191337, cada uno incorporado en la presente invención por referencia. Tal y como se ha descrito anteriormente, la presente invención también comprende las variantes de estas secuencias.

En una realización preferida, el ácido nucleico utilizado para producir ROC2 comprende la secuencia representada en la figura 12A. En una realización preferida, el ácido nucleico utilizado para producir CUL5 comprende la secuencia representada en la figura 13A. En una realización preferida, el ácido nucleico utilizado para producir APC2 comprende la secuencia representada en la figura 14A.

En una realización preferida, E3 comprende la combinación de proteína con dedo RING/Culina APC11/APC2. En otra realización preferida, E3 comprende la combinación de proteína con dedo RING/Culina ROC1/CUL1. En otra realización preferida, E3 comprende la combinación de proteína con dedo RING/Culina ROC1/CUL2. En otra realización preferida, E3 comprende la combinación de proteína con dedo RING/Culina ROC2/CUL5. Sin embargo, el técnico en la materia entenderá que se puede producir cualquier combinación de los componentes de E3 y utilizarse en la presente invención.

En una realización alternativa, E3 comprende la ligasa E3-alfa, E3A (E6-AP), HERC2, SMURF1, TRAF6, MDM2, Cb1, Sina/Siah, Itchy, IAP o NEDD-4. En esta realización, la ligasa tiene la secuencia de aminoácidos de la descrita en el número de acceso ATCC AAC39845, Q05086, CAA66655, CAA66654, CAA66656, AAD08657, NP__002383, XP__006284, AAC51970, XP__013050, BAB39389, Q00987, AAF08298 o P46934, cada uno incorporado en la presente invención por referencia. Al igual que antes, la presente invención también comprende variantes. Entre los ácidos nucleicos para producir E3 para esta realización se incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen las secuencias descritas en los números de acceso ATCC AF061556, XM006284, U76247, XM013050, X898032, X98031, X98033, AF071172, Z12020, AB056663, AF199364 y D42055 variantes de las mismas.

E3 puede comprender también otros componentes, tales como proteínas SKP1 y F-box. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos para SKP1 se encuentran en los números de acceso ATCC AAC50241 y U33760, respectivamente. Muchas proteínas F-box son conocidas en la técnica y el técnico en la materia obtiene fácilmente sus secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos a partir de varias fuentes publicadas.

En una realización preferida, los componentes de E3 se producen recombinantemente, tal y como se ha descrito en la presente invención.

En una realización preferida, los componentes de E3 se coexpresan en la misma célula huésped. La co-expresión se puede conseguir mediante la transformación de la célula con un vector que comprende ácidos nucleicos que codifican dos o más de los componentes de E3, o mediante la transformación de la célula huésped con vectores separados, comprendiendo cada uno un único componente del complejo de proteínas E3 deseado. En una realización preferida, la proteína de tipo dedo RING y Culina se expresan en un único huésped transfectado con dos vectores, comprendiendo cada uno ácido nucleico que codifica uno u el otro polipéptido, tal y como se describe con mayor detalle en los Ejemplos.

En una realización preferida, E3 tiene una etiqueta, a cuyo complejo se hace referencia en la presente invención como "etiqueta-E3". Preferiblemente, la etiqueta está unida a sólo un componente de la E3. Entre las etiquetas de E3 preferidas se incluyen, pero no se limitan a, marcadores, componentes de las parejas de unión y elementos de unión a sustrato. Más preferiblemente, la etiqueta es una molécula de unión a sustrato de superficie. Más preferiblemente, la etiqueta es una etiqueta de His o una etiqueta de GST.

En una realización de la presente invención, la ubiquitina y las enzimas de ubiquitinación y sus componentes se clonan y se expresan tal y como se indica a continuación. De este modo, se pueden utilizar secuencias de sondas o secuencias de cebador de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) degenerada para encontrar otras proteínas de ubiquitinación relacionadas de humanos u otros organismos. Tal y como se entenderá por los expertos en la materia, entre las secuencias se sondas y/o cebador de PCR particularmente útiles se incluyen las áreas únicas se una secuencia de ácidos nucleicos. Tal y como se conoce generalmente en la técnica, los cebadores de PCR preferidos tienen de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 nucléotidos de longitud, preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 30, y puede contener inopina si es necesario. Las condiciones para la reacción de PCR son bien conocidas. Por lo tanto, también se entiende que junto con las secuencias en las secuencias citadas en la presente invención se proporcionan fragmentos de estas secuencias, donde se prefieren los fragmentos únicos de 15 nucleótidos o más. El
técnico en la materia puede sintetizar o cortar de forma rutinaria una secuencia de nucleótidos con la longitud deseada.

Una vez aislado de su fuente natural, por ejemplo, contenido en un plásmido u otro vector o separado de los mismos como un segmento de ácido nucleico lineal, el ácido nucleico recombinante se puede utilizar adicionalmente como sonda para identificar y aislar otros ácidos nucleicos. También se puede utilizar como ácido nucleico "precursor" para producir ácidos nucleicos y proteínas modificadas o variantes.

Utilizando los ácidos nucleicos de la presente invención que codifican una proteína, se fabrican una serie de vectores de expresión. Los vectores de expresión pueden ser vectores extracromosómicos autoreplicantes o vectores que se integran en un genoma huésped. En general, estos vectores de expresión incluyen ácido nucleico regulador transcripcional y traduccional unido operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína. El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped concreto. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadotes.

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para un presecuencia o secuencia líder secretora está unida operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una prepropteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador están unidos operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está situado de manera que facilita la traducción. Como otro ejemplo, unido operativamente se refiere a secuencias de ADN unidas se manera que son contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contigua y en el marco de lectura. Sin embargo, los potenciadotes no tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante el enlace en sitios de restricción adecuados. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan según la práctica convencional. El ácido nucleico regulador transcripcional y traduccional será de forma general apropiado para la célula huésped utilizada para expresar la proteína; por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico regulador transcripcional y traduccional de Bacillus se utilizan preferiblemente para expresar la proteína en Bacillus. En la técnica se conocen numerosos tipos de vectores de expresión adecuados y secuencias reguladoras adecuadas para una serie de células huésped.

En general, entre las secuencias de ácido nucleico regulador transcripcional y traduccional se pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias de promotor, sitios de unión a ribosoma, secuencias de inicio y parada transcripcional, secuencias de inicio y parada traduccional, y secuencias de potenciador o activador. En una realización preferida, las secuencias reguladoras incluyen un promotor y secuencias de inicio y parada transcripcional.

Las secuencias de promotor codifican promotores constitutivos o inducibles. Los promotores pueden ser promotores naturales o promotores híbridos. Los promotores híbridos, que combinan elementos de más de un promotor, también son conocidos en la técnica y son útiles en la presente invención.

Además, el vector de expresión puede comprender elementos adicionales. Por ejemplo, el vector de expresión puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo así que se mantenga en dos organismos, por ejemplo, en células de mamífero o insectos para la expresión y en un huésped procariota para la clonación y amplificación. Además, para vectores de expresión integrantes, el vector de expresión contiene al menos una secuencia homóloga con el genoma de la célula huésped, y preferiblemente dos secuencias homólogas que flanquean la construcción de expresión. El vector integrante puede estar dirigido a un locus específico en la célula huésped mediante la selección de la secuencia homóloga apropiada para la inclusión en el vector. Las construcciones para vectores integrantes son conocidas en la técnica.

Además, en una realización preferida, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células huésped transformadas. Los genes de selección son conocidos en la técnica y variarán con la célula huésped utilizada.

Un sistema de vector de expresión preferido es un sistema de vector retroviral, tal como el que se describe en general en la PCT/US97/01019 y la PCT/LTS97/01048, ambas incorporadas expresamente en la presente invención por referencia.

Las proteínas de la presente invención se producen mediante el cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión que contiene el ácido nucleico que codifica la proteína bajo las condiciones apropiadas para inducir o provocar la expresión de la proteína. Las condiciones apropiadas para la expresión de la proteína variarán con la elección del vector de expresión y la célula huésped, y se establecerán fácilmente por un experto en la materia mediante experimentación de rutina. Por ejemplo, el uso de promotores constitutivos en el vector de expresión requerirá la optimización del crecimiento y la proliferación de la célula huésped, mientras que el uso de un promotor inducible requiere las condiciones de crecimiento adecuadas para la inducción. Además, en algunas realizaciones, el momento de la recogida es importante. Por ejemplo, los sistemas baculovirales utilizados en la expresión en células de insectos son virus líticos y, de este modo, la selección del momento de la recogida puede ser crucial para el rendimiento del producto.

Entre las células huésped apropiadas se incluyen levadura, bacterias, arqueobacterias, hongos, y células de insectos y animales. De particular interés son células de Drosophila melanogaster, Pichia pastoris y P. methanolica, Saccharomyces cerevisiae y otras levaduras, E. coli, Bacillus subtilis, células SF9, células SF21, células C129, células Saos-2, células Hi-5, células 293, Neurospora, BHK, CHO, COS, y células HeLa. De mayor interés son Pichia pastoris y P. methanolica, E. coli, células SF9, células SF21 y células Hi-5.

En una realización preferida, las proteínas se expresan en células de mamíferos. Los sistemas de expresión de mamíferos también son conocidos en la técnica e incluyen sistemas retrovirales. Un promotor de mamífero es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a ARN polimerasa de mamífero e iniciar la transcripción en dirección 3' de una secuencia codificante para una proteína en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que se sitúa normalmente proximal al extremo 5' de la secuencia codificante y una caja TATA que utiliza una pareja de 25-30 bases localizada en dirección 5' del sitio de inicio de la transcripción. Un elemento promotor en dirección 5' determina la velocidad a la que se inicia la transcripción y puede actuar en cualquier orientación. De particular interés como promotores de mamíferos son los promotores de genes virales mamíferos, dado que los genes virales son frecuentemente altamente expresados y tienen un amplio rango de huéspedes. Entre los ejemplos se incluyen el promotor temprano de SV40, el promotor LTR del virus de tumor mamario de ratón, promotor tardío principal de adenovirus, promotor del virus del herpes simplex, y el promotor CMV.

Habitualmente, las secuencias de terminación de la transcripción y poliadenilación reconocidas por las células de mamífero son regiones reguladoras localizadas 3' con el codón de parada de la traducción y, de este modo, junto con los elementos promotores, flanquean la secuencia codificante. El extremo 3' del ARNm maduro está formado por la división post-traduccional específica de sitio y la poliadenilación. Entre los ejemplos de terminadores de la transcripción y señales de poliadenilación se incluyen aquellos derivados de SV40.

Los procedimientos de introducción de ácido nucleico exógeno en huéspedes mamíferos, así como otros huéspedes, son conocidos en la técnica, y variarán con la célula huésped utilizada. Entre las técnicas se incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato cálcico, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, infección viral, encapsulación del polinucleótido o polinucleótidos en liposomas y la microinyección directa del ADN en los núcleos.

En una realización preferida, las proteínas se expresan en sistemas bacterianos. Los sistemas de expresión bacterianos son bien conocidos en la técnica.

Un promotor bacteriano adecuado es cualquier secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción en dirección 3' de una secuencia codificante para una proteína en ARNm. Un promotor bacteriano tiene una región de inicio de la transcripción que se sitúa normalmente proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de inicio de la transcripción incluye habitualmente un sitio de unión de ARN polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción. Las secuencias que codifican enzimas del mecanismo metabólico proporcionan secuencias de promotor particularmente útiles. Entre los ejemplos se incluyen secuencias de promotor derivadas de enzimas que metabolizan azúcares, tales como galactosa, lactosa y maltosa y secuencias derivadas de enzimas biosintéticas, tales como triptófano.

Los promotores de bacteriofágos también se pueden utilizar y son conocidos en la técnica. Además, también son útiles los promotores sintéticos y los promotores híbridos; por ejemplo, el promotor tac es un híbrido de las secuencias de promotores trp y lac. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores naturales de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unirse a ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción.

Además de una secuencia de promotor funcional, se desea un sitio de unión a ribosoma eficaz. En E. coli, el sitio de unión a ribosoma de llama secuencia de Shine-Delgarno (SD) e incluye un codón de iniciación y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizada 3-11 nucleótidos en dirección 5' del codón de iniciación.

El vector de expresión puede incluir también una secuencia de péptido señal que proporciona la secreción de la proteína en bacterias. La secuencia señal codifica habitualmente un péptido señal comprendido de aminoácidos hidrofóbicos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula, tal y como se conoce en la técnica. La proteína se secreta en el medio de crecimiento (bacterias gram-positivas) o en el espacio periplásmico, localizado entre la membrana interna y externa de la célula (bacterias gram-negativas).

El vector de expresión bacteriano también puede incluir un gene marcador seleccionable para permitir la selección de cepas bacterianas que se han transformado. Los genes de selección adecuados incluyen genes que hacen que las bacterias sean resistentes a fármacos tales como ampicilina, cloramfenicol, eritromicina, canamicina, neomicina y tetraciclina. Los marcadores seleccionables también incluyen genes biosintéticos, tales como aquellos que están en los mecanismos biosintéticos de histidina, triptófano y leucina.

Estos componentes se ensamblan en vectores de expresión. Los vectores de expresión para bacterias son bien conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, vectores para Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris, y Streptococcus lividans.

Los vectores de expresión bacterianos se transforman en células huésped bacterianas utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como tratamiento con cloruro de calcio, electroporación y otras.

En una realización, las proteínas se producen en células de insectos. Los vectores de expresión para la transformación de células de insectos y, en particular, vectores de expresión basados en baculovirus son bien conocidos en la técnica.

En una realización preferida, las proteínas se producen en células de levadura. Los sistemas de expresión en levaduras son bien conocidas en la técnica e incluyen vectores de expresión para Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans y C. maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis y K lactis, Pichia guillerimondii P. methanolica y P.pastoris, Schizosaccharomyces pombe, y Yarrowia lipolytica. Entre las secuencias de promotores para la expresión en levaduras se incluyen el promotor GAL 1,10 inducible, los promotores de alcohol deshidrogenasa, enolasa, glucoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, fosfofructoquinasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa y el gen de la fosfatasa ácida. Entre los marcadores seleccionables preferidos se incluyen ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, y ALG7, que confiere resistencia a tunicamicina; el gen de neomicina fosfotransferasa, que confiere resistencia a G418; y el gen de CUP1 que permite a la levadura que crezca en presencia de iones de cobre.

La proteína también se puede producir como una proteína de fusión utilizando técnicas bien conocidas en el sector. De este modo, por ejemplo, la proteína se puede producir como una proteína de fusión para aumentar la expresión o para otras razones. Por ejemplo, cuando la proteína es un péptido, el ácido nucleico que codifica el péptido se puede unir a otro ácido nucleico con fines de expresión. De forma similar, las proteínas de la presente invención se pueden unir a marcadores de proteínas, tales como proteína verde fluorescente (GFP), proteína roja fluorescente (RFP), proteína azul fluorescente (BFP), proteína amarilla fluorescente (YFP), etc.

En una realización preferida, la proteína se purifica o aísla después de la expresión. Las proteínas se pueden aislar o purificar de varias maneras conocidos por los expertos en la materia dependiendo de qué otros componentes están presentes en la muestra. Entre los procedimientos de purificación estándar se incluyen técnicas electroforéticas, moleculares, inmunológicas y cromatográficas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, hidrofóbica, afinidad y HPLC de fase inversa, cromatoisoenfoque ("chromatofocusing"). Por ejemplo, la proteína ubiquitina se puede purificar utilizando una columna con anticuerpo anti-ubiquitina. También son útiles técnicas de ultrafiltración y diafiltración, conjuntamente con la concentración de proteínas. Para una guía general sobre técnicas de purificación adecuadas, véase Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982). El grado de purificación necesario variará dependiendo del uso de la proteína. En algunos casos no será necesaria la purificación.

Una vez fabricadas, las composiciones tienen utilidad en una serie de aplicaciones, incluyendo, pero sin limitarse a, cribados ("screens") para moduladores de ubiquitinación. Por "modulador" se entiende un compuesto que puede aumentar o disminuir la ubiquitinación. El técnico en la materia entenderá que los moduladores de la ubiquitinación pueden afectar a la actividad de la enzima, la interacción de la enzima con el sustrato, la interacción entre ubiquitina y el sustrato, o una combinación de los mismos. Un modulador que afecta específicamente la actividad de ubiquitina ligasa es un modulador de ubiquitina ligasa.

Por "candidato", "agente candidato", "modulador candidato", "modulador de ubiquitinación candidato" o equivalentes gramaticales en la presente invención, se entiende cualquier molécula, por ejemplo, proteínas (que en la presente invención incluye proteínas, polipéptidos y péptidos), moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas, polisacáridos, polinucleótidos, etc. que se ensayan para la actividad de modulación de la ubiquitinación. Los agentes candidatos comprenden numerosas clases químicas. En una realización preferida, los agentes candidatos son moléculas orgánicas, particularmente moléculas orgánicas pequeñas, que comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente enlaces de hidrógeno, y normalmente incluyen, al menos, un grupo amino, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos comprenden a menudo carbonos cíclicos o estructuras heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más grupos químicos funcionales.

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Los moduladores candidatos se obtienen de una gran variedad de fuentes, tal y como se entenderá por los expertos en la materia, incluyendo bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Tal y como se entenderá por los expertos en la materia, la presente invención proporciona un procedimiento rápido y sencillo para cribar cualquier biblioteca de moduladores candidatos, incluyendo la gran variedad de bibliotecas conocidas de tipo química combinatoria.

En una realización preferida, los moduladores candidatos son compuestos sintéticos. Muchas técnicas están disponibles para la síntesis aleatoria y dirigida de una gran variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos aleatorios. Véase, por ejemplo, WO 94/24314, que se incorpora expresamente por referencia en la presente invención, que describe procedimientos para la generación de nuevos compuestos, incluyendo procedimientos químicos, así como procedimientos enzimáticos, aleatorios. Tal y como se describe en WO 94/24314, una de las ventajas del presente procedimiento es que no es necesario caracterizar el modulador candidato antes del ensayo; sólo deben identificarse moduladores candidatos que aumentan o disminuyen la actividad de ubiquitina ligasa. Además, tal y como se conoce en la técnica, se pueden producir etiquetas codificantes que utilizan reacciones de síntesis por separación para identificar esencialmente los grupos químicos ensayados.

Alternativamente, una realización preferida utiliza bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, de plantas y animales que están disponibles o se producen fácilmente.

Adicionalmente, las bibliotecas o compuestos naturales o producidos sintéticamente se modifican fácilmente mediante medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Los agentes farmacológicos conocidos se pueden someter a modificaciones químicas, incluyendo modificaciones enzimáticas, dirigidas o aleatorias, para producir análogos estructurales.

En una realización preferida, los moduladores candidatos incluyen proteínas, ácidos nucleicos y grupos químicos.

En una realización preferida, el modulador candidato son proteínas, tal y como se ha definido anteriormente. En una realización preferida, los moduladores candidatos son proteínas naturales o fragmentos de proteínas naturales. De este modo, por ejemplo, se pueden ensayar extractos celulares que contienen proteínas o digestos aleatorios o dirigidos de extractos celulares proteináceos, tal u como se describe con detalle a continuación. De esta manera, se pueden producir bibliotecas de proteínas procariotas y eucariotas para el cribado contra cualquier tipo de composición de ubiquitina ligasa. En esta realización, son particularmente preferidas las bibliotecas de proteínas bacterianas, fúngicas, virales y mamíferas, siendo éstas últimas preferidas, y siendo especialmente preferidas las proteínas humanas. En una realización preferida, los moduladores candidatos son péptidos de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 aminoácidos, y particularmente preferible de aproximadamente 8 a aproximadamente 20. Los péptidos pueden ser digestos de proteínas naturales tal y como se ha indicado anteriormente, péptidos aleatorios o péptidos aleatorios "predispuestos". Por "aleatorio" o los equivalentes gramaticales en la presente invención se entiende que cada ácido nucleico y péptido consisten en esencialmente nucleótidos y aminoácidos esencialmente aleatorios, respectivamente. Dado que generalmente estos péptidos aleatorios (o ácidos nucleicos, descritos a continuación) se sintetizan químicamente, se pueden incorporar cualquier nucleótidos o aminoácidos a cualquier posición. El proceso sintético se puede diseñar para generar proteínas o ácidos nucleicos aleatorios para permitir la formación de todas o la mayoría de las posibles de combinaciones sobre la longitud de la secuencia, formando de este modo una biblioteca de agentes proteináceos bioactivos candidatos aleatorios.

La biblioteca debería proporcionar una población suficiente y estructuralmente diversa de agentes aleatorios para realizar un rango probabilísticamente suficiente para permitir la interacción con una enzima ubiquitina ligasa particular. Por consiguiente, una biblioteca de interacción debe ser suficientemente amplia, de manera que al menos uno de sus miembros tendrá una estructura que interacciona con una enzima ubiquitina ligasa. Aunque es difícil estimar el tamaño absoluto requerido de una biblioteca de interacción, la naturaleza proporciona una pista con la respuesta inmunitaria: una diversidad de 10^{7}-10^{8} anticuerpos diferentes proporciona al menos una combinación con suficiente afinidad para interaccionar con la mayoría de antígenos potenciales afrontados por un organismo. Las técnicas publicadas de selección in vitro también han mostrado que un tamaño de biblioteca de 10^{7} a 10^{8} es suficiente para encontrar estructuras con afinidad para una diana. Una biblioteca con todas las combinaciones de un péptido de 7 a 20 aminoácidos de longitud, tal y como se propone de forma general en la presente invención, tiene el potencial de codificar para 20^{7} (10^{9}) a 20^{20}. De este modo, con bibliotecas de 10^{7} a 10^{8} moléculas diferentes, los procedimientos presentes permiten un subgrupo "de trabajo" de una biblioteca de interacción teóricamente completa para 7 aminoácidos, y un subgrupo de formas para la biblioteca de 20^{20}. De este modo, en una realización preferida, al menos 10^{6}, preferiblemente al menos 10^{7}, más preferiblemente al menos 10^{8} y aún más preferiblemente al menos 10^{9} secuencias diferentes se analizan simultáneamente en los procedimientos presentes. Los procedimientos preferidos maximizan el tamaño y la diversidad de las bibliotecas.

En una realización, la biblioteca es totalmente aleatoria sin preferencias de secuencias no constantes en ninguna posición. En una realización preferida, la biblioteca está predispuesta. Es decir, algunas posiciones de la secuencias se mantienen constante o se seleccionan de un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, en una realización preferida, los nucleótidos o residuos de aminoácidos son aleatorios en una clase definida, por ejemplo, de aminoácidos hidrofóbicos, residuos hidrofílicos, residuos (pequeños o grandes) estéricamente predispuestos, hacia la creación de cisteínas, para la reticulación, prolinas para dominios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para sitios de fosforilación, etc. o para purinas, etc.

En una realización preferida, la tendencia es hacia péptidos o ácidos nucleicos que interaccionan con clases conocidas de moléculas. Por ejemplo, cuando el modulador candidato es un péptido, se sabe que mucha de la señalización intracelular se lleva a cabo mediante regiones cortas de polipéptidos que interaccionan con otros polipéptidos a través de dominios pequeños de péptidos. Por ejemplo, previamente se ha observado que una región corta del dominio citoplásmico de la cubierta de VIH-1 bloquea la acción de la calmodulina celular. Las regiones del dominio citoplásmico Fas, que muestra homología a la toxina mastoparán de las avispas, se puede limitar a una región de péptido corto con funciones apoptóticas inductoras de la muerte o inductoras de la proteína G. Magainin, un péptido natural derivado de Xenopus, puede tener una actividad antitumoral y antimicrobiana potente. Se ha observado que los fragmentos de péptido corto de una isozima de la proteína quinasa C (BPKC) bloquean la translocación nuclear de BPKC en oocitos de Xenopus tras estimulación. Y, se han utilizado péptidos diana cortos con SH-3 como pseudosustratos para la unión específica a proteínas SH-3. Naturalmente, ésta es una lista corta de péptidos disponibles con actividad biológica, ya que la literatura es densa en esta área. De este modo, existen muchos precedentes del potencial de péptidos pequeños para tener actividad en las cascadas de señalización intracelular. Además, los agonistas y antagonistas de cualquier tipo de molécula se pueden utilizar también como la base del azar predispuesto de moduladores
candidato.

De este modo, un conjunto de moléculas o dominios de proteínas son adecuados como puntos de partida para la generación de moduladores candidatos aleatorios predispuestos. Se conocen un gran número de dominios de moléculas pequeñas que confieren una función, estructura o afinidad común. Además, tal y como se entiende en la técnica, las áreas de homología débil de aminoácidos pueden tener una fuerte homología estructural. Se conocen un conjunto de estas moléculas, dominios y/o secuencias de consenso correspondientes incluyendo, pero sin limitarse a, dominios SH-2, dominios SH-3, Pleckstrin, dominios de muerte, sitios de división/reconocimiento por proteasa, inhibidores de enzimas, sustratos de enzimas, Traf, etc.

En una realización preferida, los moduladores candidatos son ácidos nucleicos. En referencia a los moduladores candidatos, por "ácido nucleico" o "oligonucleótido" o equivalentes gramaticales en la presente invención se entiende al menos dos nucleótidos unidos covalentemente. Un ácido nucleico de la presente invención contendrá en general uniones fosfodiéster, aunque en algunos casos, tal y como se indica a continuación, se incluyen análogos de ácido nucleico que pueden tener alternar estructuras, que comprenden, por ejemplo, fosforamida (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925 (1993) y las referencias incluidas; Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); y Pauwels et al., Chemica Scripta 26:141 91986)), fosforotioato (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991); y Patente De Estados Unidos Nº 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989)), enlaces O-metilfosforoamidito (véase Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), y estructuras y enlaces de ácido nucleico peptídico (véase Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson et al., Nature 380:207 (1996), todos incorporados en la presente invención por referencia). Otros ácidos nucleicos análogos incluyen a aquellos con estructuras positivas (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995); estructuras no-iónicas (Patentes de Estados Unidos Nº 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 y 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994); Capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) y estructuras sin ribosas, incluyendo aquellas descritas en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.235.033 y 5.034.506, y Capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui y P. Dan Cook. También se incluyen dentro de la definición de ácidos nucleicos los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos (véase Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) págs. 169-176). Se describen diversos análogos de ácido nucleico en Rawls, C & E News del 2 de junio de 1997 pág. 35. Todas estas referencias se incorporan expresamente en la presente invención por referencia. Estas modificaciones de la estructura de ribosa-fosfato se pueden realizar para facilitar la adición de fracciones adicionales tales como marcadores, o para incrementar la estabilidad y la vida media de dichas moléculas en ambientes fisiológicos.

Tal y como se entenderá por los expertos en la materia, todos estos análogos de ácido nucleico pueden ser útiles en la presente invención. Además, pueden fabricarse mezclas de ácidos nucleicos naturales y análogos. Alternativamente, pueden fabricarse mezclas de diferentes análogos de ácidos nucleicos, y mezclas de ácidos nucleicos naturales y análogos.

Son particularmente preferidos los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) que incluyen análogos de ácidos nucleicos peptídicos. Estas estructuras son sustancialmente no-iónicas en condiciones neutras, en contraste con la estructura de fosfodiéster altamente cargada de ácidos nucleicos naturales.

Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena simple o de cadena doble, tal y como se especifica, o contener partes de ambas, secuencias de cadena doble o de cadena simple. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN o un híbrido, donde el ácido nucleico contiene cualquier combinación de deoxiribonucleótidos y ribonucleótidos, y cualquier combinación de bases, incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xatanina hipoxatanina, isocitosina, isoguanina, etc. Tal y como se utiliza en la presente invención, el término "nucleósido" incluye nucleótidos y nucleósidos y análogos de nucleótido, y nucleósidos modificados, tales como nucleósidos modificados con amino. Además, "nucleósido" incluye a estructuras análogas no naturales. De este modo por ejemplo las unidades individuales de un ácido nucleico peptídico, cada una conteniendo una base, se refieren en la presente invención como nucleósido.

Tal y como se describe anteriormente en general para las proteínas, los moduladores candidatos de ácido nucleico pueden ser ácidos nucleicos naturales, ácidos nucleicos aleatorios, o ácidos nucleicos aleatorios "predispuestos". Por ejemplo, los digestos de los genomas procariotas o eucariotas puede utilizarse tal y como se indica anteriormente para las proteínas. Cuando el producto de expresión final es un ácido nucleico, al menos 10 posiciones de nucleótidos, preferiblemente al menos 12, más preferiblemente al menos 15, aún más preferible al menos 21, necesitan distribuirse aleatoriamente, más preferiblemente si la distribución aleatoria es menos que perfecta. De modo similar, se necesitan distribuir aleatoriamente al menos 5 posiciones de aminoácido, preferiblemente al menos 6, más preferiblemente al menos 7; de nuevo, es más preferible si la distribución aleatoria es menos que perfecta.

En una realización preferida, los moduladores candidatos son grupos orgánicos. En esta realización, tal y como se describe de forma general en WO 94/243314, se sintetizan agentes candidatos a partir de una serie de sustratos que pueden modificarse químicamente. "Modificado químicamente" en la presente invención incluye reacciones químicas tradicionales además de reacciones enzimáticas. Estos sustratos incluyen generalmente, pero no se limitan a, grupos alquilo (incluyendo alcanos, alquenos, alquinos y heteroalquilo), grupos arilo (incluyendo arenos y heteroarilo), alcoholes, éteres, aminas, aldehídos, cetonas, ácidos, ésteres, amidas, compuestos cíclicos, compuestos heterocíclicos (incluyendo purinas, pirimidinas, benzodiacepinas, beta-lactamas, tetraciclinas, cefalosporinas, y carbohidratos), esteroides (incluyendo estrógenos, andrógenos, cortisona, ecodisona, etc.), alcaloides (incluyendo ergots, vinca, curare, pirolizidina, y mitomicinas), compuestos organometálicos, compuestos que llevan heteroátomos, aminoácidos, y nucleósidos.

Las reacciones químicas (incluyendo las enzimáticas) se pueden realizar sobre los grupos para formar nuevos sustratos o agentes candidatos que pueden ser evaluados utilizando la presente invención.

Tal y como se entenderá por los expertos en la materia, es posible cribar simultáneamente más de un tipo de modulador candidato. De este modo, la biblioteca de moduladores candidatos utilizada puede incluir sólo un tipo de agente (es decir, péptidos), o múltiples tipos (péptidos y agentes orgánicos). El ensayo de diversos candidatos al mismo tiempo se explica a continuación.

La presente invención proporciona procedimientos y composiciones que comprenden la combinación de diversos componentes. En una realización preferida, una combinación preferida es la etiqueta-ubiquitina, E1, E2, y E3. Preferiblemente la etiqueta es un marcador, un componente de una pareja de unión o una molécula de unión a sustrato. Más preferiblemente, la etiqueta es un marcador fluorescente o un componente de una pareja de unión. En una realización preferida, la etiqueta es un componente de una pareja de unión y la ubiquitina está marcada mediante marcaje indirecto. En la realización de marcaje indirecto, preferiblemente el marcador es un marcador fluorescente o una enzima marcadora. En una realización que comprende una enzima marcadora, preferiblemente el sustrato para esta enzima produce un producto fluorescente. En una realización preferida, el sustrato de la enzima marcadora es luminol. En una realización preferida, la combinación excluye específicamente la combinación de los componentes con una proteína diana.

En otra realización preferida, una combinación preferida es etiqueta 1-ubiquitina, etiqueta 2-ubiquitina, E1, E2 y E3. Preferiblemente, etiqueta 1 y etiqueta 2 son marcadores preferiblemente marcadores fluorescentes, más preferiblemente la etiqueta 1 y la etiqueta 2 constituyen una pareja de FRET.

En una realización preferida, una combinación preferida es la etiqueta 1-ubiquitina E1, E2 y etiqueta 2-E3. Preferiblemente, la etiqueta 1 es un marcador, un componente de una pareja de unión, o una molécula de unión a sustrato y la etiqueta 2 es un marcador diferente, un componente de una pareja de unión, o una molécula de unión a sustrato. Más preferiblemente, la etiqueta 1 es un marcador fluorescente o un miembro de una pareja de unión. Cuando la etiqueta 1 es un miembro de una pareja de unión, preferiblemente la etiqueta 1 se marca indirectamente. Aún más preferiblemente, la etiqueta 1 se marca indirectamente con una enzima marcadora. Preferiblemente el sustrato de la enzima marcadora solía revelar que la presencia de la enzima produce un producto fluorescente, y más preferiblemente, es luminol. En la combinación descrita en la presente, preferiblemente la etiqueta 2 es un elemento de unión al sustrato de la superficie, más preferiblemente una etiqueta de His.

En una realización preferida, una combinación preferida es la etiqueta 1-ubiquitina, E1 y etiqueta 2-E2. En esta realización, preferiblemente la etiqueta 1 es un marcador, un componente de un pareja de unión, o una molécula de unión a sustrato y la etiqueta 2 es un marcador diferente, componente de una pareja de unión, o una molécula de unión a sustrato. Más preferiblemente, la etiqueta 1 es un marcador o un miembro de una pareja de unión. Cuando la etiqueta 1 es un miembro de una pareja de unión, preferiblemente la etiqueta 1 se marca indirectamente. En una realización preferida, el marcador de la etiqueta 1 (directa o indirecta) es un marcador fluorescente o una enzima marcadora. Cuando el marcador de la etiqueta 1 (directa o indirecta) es una enzima marcadora, preferiblemente el sustrato de la reacción solía revelar que la presencia de la enzima produce un producto fluorescente, y más preferiblemente luminol. En la combinación descrita en la presente invención, preferiblemente la etiqueta 2 es un elemento de unión a sustrato, más preferiblemente una etiqueta de His.

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En una realización preferida, las composiciones de la presente invención no comprenden una proteína diana. En esta realización, la ubiquitina es el único sustrato de ubiquitinación, tal y como se ha explicado anteriormente. Esta realización se encuentra en contraste con los ensayos previos con enzimas de ubiquitinación, los cuales requieren la adición de una proteína diana como parte de la composición. Debido a que las diferentes combinaciones de E3 y E2 y las combinaciones de subunidades de E3 son específicas para proteínas diana concretas, los presentes ensayos son mucho más versátiles, permitiendo cualquier variación de dichas combinaciones sin previa identificación de la proteína diana específica a la cual va dirigida la combinación.

Los componentes de las presentes composiciones pueden combinarse en cantidades variables. En una realización preferida, la ubiquitina se combina a una concentración final de desde 20 hasta 200 ng por cada 100 \mul de solución de reacción, más preferible aproximadamente 100 ng por cada 100 \mul de solución de reacción.

En una realización preferida, E1 se combina a una concentración final de desde 1 hasta 50 ng por cada 100 \mul de solución de reacción, más preferiblemente desde 1 ng hasta 20 ng por cada 100 \mul de solución de reacción, aún más preferible desde 5 ng hasta 10 ng por cada 100 \mul de solución de reacción.

En una realización preferida, E2 se combina a una concentración final de 10 a 100 ng por cada 100 \mul de solución de reacción, más preferiblemente 10-50 ng por cada 100 \mul de solución reacción.

En una realización preferida, E3 se combina a una concentración final de desde 1 ng hasta 500 ng por cada 100 \mul de solución de reacción, más preferiblemente desde 50 ng hasta 400 ng por cada 100 \mul de solución de reacción, aún más preferiblemente de 100 a 300 ng por cada 100 \mul de solución de reacción, siendo lo más preferible aproximadamente de 100 ng por cada 100 \mul de reacción solución.

Los componentes de la presente invención se combinan en condiciones de reacción que favorecen la actividad de la ubiquitina ligasa y/o la actividad de ubiquitinación. En general, éstas serán condiciones fisiológicas. Las incubaciones pueden realizarse a cualquier temperatura que facilite la actividad óptima, típicamente entre 4 y 40ºC. Los períodos de incubación se seleccionan para una actividad óptima, pero también pueden optimizarse para facilitar la un cribado rápido y con alto rendimiento. Habitualmente entre 0,5 y 1,5 horas serán suficientes.

Puede incluirse una variedad de otros reactivos en las composiciones. Éstos incluyen reactivos tales como sales, disolventes, tampones, proteínas neutras, por ejemplo, albúmina, detergentes, etc. los cuales pueden utilizarse para facilitar la actividad óptima de las enzimas de ubiquitinación y/o disminuir las interacciones no específicas o de fondo. Además pueden utilizarse reactivos que de cualquier otro modo incrementan la eficacia del ensayo, tales como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etc. Las composiciones también incluirán preferiblemente adenosin trifosfato (ATP).

La mezcla de componentes puede añadirse en cualquier orden que promueve la actividad de la ubiquitina ligasa u optimiza la identificación de efectos del modulador candidato. En una realización preferida, se proporciona ubiquitina en una solución de tampón de reacción, seguido de la adición de las enzimas de ubiquitinación. En una realización preferida alternativa, se proporciona ubiquitina en una solución de tampón de reacción, a continuación se añade un modulador candidato, seguido de la adición de las enzimas de ubiquitinación.

Una vez combinados, los procedimientos preferidos de la presente invención comprenden la medición de la cantidad de ubiquitina unida a E3. En una realización preferida alternativa en la cual la combinación carece de E3, los procedimientos preferidos de la presente invención comprenden la medición de la cantidad de ubiquitina unida a E2. Tal y como entenderá por un técnico en la materia, el modo de medición dependerá de la etiqueta específica unida a la ubiquitina. Tal y como será también obvio para un experto en la materia, la cantidad de ubiquitina unida comprenderá no sólo la proteína de ubiquitina concreta unida directamente a la enzima de ubiquitinación, sino también las proteínas de ubiquitina unidas a la ubiquitina concreta en una cadena de poliubiquitina.

En una realización preferida, se mide la ubiquitinación.

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En una realización preferida, la etiqueta unida a la ubiquitina es un marcador fluorescente. En una realización preferida, la etiqueta unida a la ubiquitina es una enzima marcadora o un miembro de una pareja de unión que se marca indirectamente con una enzima marcadora. En esta segunda realización preferida, el sustrato de la enzima marcadora produce un producto de reacción fluorescente. En estas realizaciones preferidas, la cantidad de ubiquitina unida se mide mediante luminiscencia.

Tal y como se utiliza en la presente invención, "luminiscencia" o "emisión fluorescente" significan la emisión de fotones desde un marcador fluorescente. En una realización en la que se utilizan las parejas de FRET, las mediciones de fluorescencia pueden tomarse de manera continua o en puntos de tiempo durante la reacción de unión. El equipamiento para dichas mediciones se encuentra disponible comercialmente y es utilizado fácilmente por un técnico en la material para realizar dicha medición.

En la técnica se conocen otros modos de medición de la ubiquitina unida y son fácilmente identificables por un técnico en la materia para cada uno de los marcadores descritos en la presente invención. Por ejemplo, el marcaje con radioisótopos puede medirse mediante recuento por destellos, o mediante densitometría tras la exposición a una emulsión fotográfica, o mediante la utilización de un dispositivo tal como un Phosphorlmager. Asimismo, la densitometría puede emplearse para medir la ubiquitina unida tras una reacción con un sustrato de enzima marcadora que produce un producto opaco cuando se emplea una enzima marcadora.

En procedimientos preferidas de la presente invención, E3 está unido a un sustrato de superficie. Esto puede realizarse directamente, tal y como se ha descrito anteriormente para la unión de un marcador a una ubiquitina. Esto también puede realizarse utilizando etiqueta-E3, donde la etiqueta es una molécula de unión a sustrato de superficie.

En otra realización preferida de la presente invención, E2 se une a un sustrato de superficie en ausencia de E3. Esto puede realizarse directamente, tal y como se ha descrito anteriormente, para la unión de un marcador a ubiquitina. Esto también puede llevarse a cabo utilizando etiqueta-E2, donde la etiqueta es una molécula de unión al sustrato de superficie.

En las dos realizaciones preferidas descritas anteriormente, E3 y E2 están en forma de etiqueta-E3 y etiqueta E2, respectivamente, y se unen a un sustrato de superficie mediante una molécula etiqueta de unión al sustrato de superficie. En general, se puede utilizar cualquier molécula que se une a sustrato. En una realización preferida, la etiqueta es una etiqueta de His y el sustrato de superficie es níquel. En una realización preferida, el sustrato de superficie de níquel está presente en la superficie de los pocillos en una placa de múltiples pocillos, tal como una placa de 96 pocillos. Dichas placas de múltiples pocillos están disponibles comercialmente. La unión de la enzima al sustrato de la superficie facilita la separación de la ubiquitina unida de la ubiquitina no unida. En la presente realización, la ubiquitina no unida se lava fácilmente del recipiente tras la reacción de unión. Tal y como se entenderá por los expertos en la materia, el uso de cualquier elemento de unión al sustrato de la superficie y recipiente que tiene el sustrato de superficie al que se une será eficaz para facilitar la separación de ubiquitina unida y no unida.

En una realización alternativa, E3 o E2 se unen, directamente o mediante un elemento de unión a sustrato, a una perla ("bead"). Tras la unión, las perlas se pueden separar de la ubiquitina no unida y medir la ubiquitina unida. En una realización preferida, E3 o E2 se unen a perlas y la composición utilizada incluye una etiqueta-ubiquitina, donde la etiqueta es un marcador fluorescente. En esta realización, las perlas con ubiquitina unida se pueden separar utilizando una máquina de separación celular activada por fluorescencia (FACS). Los procedimientos para la misma se describen en la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 09/047,119, que se incorpora en la presente invención en su totalidad. A continuación, se puede medir la cantidad de ubiquitina.

En otra realización, ninguna de las enzimas de ubiquitinación está unida a un sustrato. Preferiblemente, en esta realización, la composición comprende etiqueta 1-ubiquitina, etiqueta 2-ubiquitina, E1, E2 y E3. Preferiblemente, la etiqueta 1 y la etiqueta 2 son marcadores, preferiblemente marcadores fluorescentes, más preferiblemente la etiqueta 1 y la etiqueta 2 constituyen una pareja de FRET. En esta realización, la ubiquitinación se calcula midiendo el espectro de emisión fluorescente. Esta medición puede ser continua en una o más veces tras la combinación de los componentes. La alteración en el espectro de emisión fluorescente de la combinación en comparación con la ubiquitina no unida indica la cantidad de ubiquitinación. El experto en la materia entenderá que en esta realización, la alteración en el espectro de emisión fluorescente resulta de la aproximación de la ubiquitina que lleva diferentes miembros de la pareja de FRET, o a la formación de poliubiquitina y/o por la unión en localizaciones próximas a la proteína, preferiblemente una proteína diana.

En una realización preferida, las composiciones de la presente invención se utilizan para identificar los moduladores de ubiquitinación. En esta realización, la composición incluye un modulador candidato. En una realización preferida, la cantidad y/o tasa medida de unión de etiqueta-ubiquitina a E3 se compara con la del modulador candidato cuando está ausente de la composición, mediante lo cual se determina la presencia o ausencia del efecto del modulador en la actividad de ubiquitina ligasa. En esta realización, también se determina si el modulador potencia o inhibe la ubiquitinación.

En una realización preferida, la composición de la presente invención que contiene un modulador candidato carece de E3 y se mide la cantidad y/o la tasa de unión de ubiquitina a E2. Esta realización puede comprender también la etapa de comparar la cantidad y/o la tasa de unión de ubiquitina a E2 en una composición carente tanto de E3 como del modulador candidato, a través de la cual se determina la actividad modular del candidato en las enzimas de ubiquitinación diferentes de E3. En una realización preferida, se compara la diferencia porcentual en la cantidad de ubiquitina unida a E2 en presencia y ausencia del modulador candidato con la diferencia porcentual en la cantidad unida a E3 en presencia y ausencia del candidato modulador, a través de lo cual se determina el punto de efecto del modulador candidato en la cascada de enzimas. Es decir, se determina si el modulador candidato afecta a la actividad de la ubiquitina ligasa de E3 o si esto afecta a la actividad de activación de la ubiquitina de E1 y/o la actividad de conjugación de la ubiquitina de E2.

En otra realización preferida, se utilizan las composiciones de la presente invención para identificar moduladores de ubiquitinación. En esta realización, la composición incluye un modulador candidato. En una realización preferente, cuando la etiqueta 1 y la etiqueta 2 constituyen una pareja de FRET, se compara la cantidad y/o la tasa medida de la etiqueta 1-ubiquitina y la etiqueta 2-ubiquitina que se unen a una proteína sustrato (como la poliubiquitina y/o la ubiquitina unida a una proteína diana) con la cantidad o la tasa de dicha unión en ausencia del modulador candidato, a través de lo cual se determina la presencia o la ausencia del efecto del modulador en la actividad de la ubiquitina ligasa. En esta realización, también se determina si el modulador potencia o inhibe la ubiquitinación.

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En una realización preferida, se realizan simultáneamente múltiples ensayos en un sistema de cribado de alto rendimiento. En esta realización, se pueden realizar múltiples ensayos en múltiples recipientes, tales como los pocillos de una placa de 96 pocillos u otra placa de múltiples pocillos. Tal y como se entenderá por un experto en la materia, dicho sistema puede aplicarse al ensayo de múltiples moduladores candidatos y/o a la combinación múltiple de componentes de E3 y/o emparejamientos E2-E3. En una realización preferida, la presente invención se utiliza en un sistema de cribado de alto rendimiento para determinar la actividad de la ubiquitina ligasa de los diferentes emparejamientos de E2-E3 y/o de las diferentes combinaciones de los componentes de E3. En una realización preferida alternativa, la presente invención se utiliza en un sistema de cribado de alto rendimiento para evaluar simultáneamente el efecto de moduladores candidatos individuales.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de ensayo para la actividad de ubiquitinación o la actividad de las enzimas de ubiquitinación en una mezcla. Se introduce la ubiquitina en una célula o una mezcla de proteínas, preferiblemente un lisato de células, en condiciones en las que la ubiquitinación puede llevarse a cabo. En esta realización, la ubiquitina se encuentra en la forma de etiqueta 1-ubiquitina y etiqueta 2-ubiquitina, donde etiqueta 1 y etiqueta 2 constituyen una pareja de FRET o la etiqueta 1 es un marcador fluorescente y la etiqueta 2 es un desactivador de la etiqueta 1. El espectro de emisión fluorescente se mide como una indicación de si la actividad de ubiquitinación se encuentra presente en la mezcla o la célula. En una realización preferente, la ubiquitina también comprende a un miembro de una pareja de unión, tal como FLAG. En esta última realización, pueden aislarse los componentes involucrados en la ubiquitinación a partir de la mezcla utilizando cualquiera de una serie de medios de separación basados en la afinidad como, por ejemplo, perlas fluorescentes recubiertas con anticuerpo anti-FLAG o inmuno-precipitación que utiliza anticuerpos anti-FLAG, o utilizando anticuerpo anti-FLAG unido a un soporte sólido. Otros medios de separación de los componentes de la célula o la mezcla unidos a ubiquitina serán fácilmente evidentes para un experto en la materia. Los componentes unidos a la ubiquitina separados con este procedimiento pueden incluir E3 y proteína diana. El técnico en la materia entenderá que la separación de estos componentes para su identificación individual o la posterior investigación puede obtenerse mediante diversos medios bien conocidos en la técnica, como por ejemplo mediante HPLC o electroforesis.

Es conocido por un técnico en la materia que las etapas de los ensayos proporcionados en la presente invención pueden variar en su orden. También es conocido, no obstante, que aunque en la presente invención se proporcionan varias opciones (de compuestos, propiedades seleccionadas u orden de las etapas), también se proporcionan cada una de las opciones de manera individual, y cada una puede separarse individualmente de las otras opciones proporcionadas en la presente invención. Además, las etapas que son obvias y conocidas en la técnica que incrementarán la sensibilidad del ensayo pretenden estar dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, pueden haber adicionalmente etapas de lavado, etapas de bloqueo, etc.

Los siguientes ejemplos sirven para describir con más detalle la manera de utilizar la invención descrita anteriormente, así como establecer los modos óptimos contemplados para llevar a cabo varios aspectos de la presente invención. Se entiende que estos ejemplos de ningún modo sirven para limitar el verdadero alcance de la presente invención, sino que se presentan con fines ilustrativos. Todas las referencias citadas en la presente invención se incorporan expresamente por referencia en su totalidad.

Ejemplos Ejemplo 1 Producción de E2, E3 y ubiquitina Producción de E2

El marco de lectura abierto de E2 (Ubc5c) se amplificó mediante PCR y se clonó en el vector de expresión de E. coli pGex-6p-1 (Amersham Pharmacia) como fragmentos BgIII-EcoRI, con el extremo N-terminal en el marco fusionado a la etiqueta de GST.

Materiales y procedimientos

El plásmido se transforma en E. coli competente de BL21 DE3 (Stratagene, cat # 230132). Las células se desarrollan a 37ºC en TB + 100 \mug/ml de ampicilina y glucosa al 0,4% a una DO600 de aproximadamente 0,6, se inducen con la adición de 320 \muM de IPTG y se dejan crecer durante otras 3 horas antes de la recogida. Los pélets se lavan una vez con PBS frío, a continuación se resuspende en aproximadamente 6 volúmenes de tampón de lisis (20 mM de Tris, glicerol al 10%, 0,5 M de Nacl, 2,5 mM de EDTA, 1 mM de TCEP más comprimidos inhibidores de proteasa libre de EDTA completo, 1 comprimido/25 ml de células resuspendidas, pH 8,0). La suspensión se homogeneiza y se sonica 3 x 30 s. A continuación, se añade NP40 hasta una concentración final del 0,5% y los tubos se agitan durante 30 minutos a 4ºC. Después de la centrifugación a 11000 rpm durante 25 a 30 minutos, el sobrenadante se incuba con Glutatión Sefarosa 4B (Amersham, cat # 17-0756-01) en una proporción de 1 ml de perlas por 100 ml de volumen de cultivo original durante 1 a 2 horas a 4ºC con agitación suave. Las perlas se ponen en forma de pélets y se lavan una vez con 10 volúmenes del lecho del tampón de lisis, a continuación dos veces con 10 volúmenes del lecho de tampón de Proteasa PreScission (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, NP-40 al 0,1%, pH 7,0). La Proteasa PreScission (Amersham, producto # 27-0843) se añade en una proporción de 80 \mul (160 Unidades) por ml de resina de GST y se deja incubar durante 4 horas a 4ºC. El sobrenadante que contiene la proteína E2 escindida se recoge y la resina se lava dos veces con un volumen del lecho de tampón de PreScission. Las tres facciones analizaron mediante SDS-PAGE y se agrupan las que sean apropiadas.

Producción de ubiquitina

La ubiquitina se clonó en el Vector de Expresión pFlag-Mac (Sigma) como un fragmento Hindi-EcoRI por PCR. Esto da lugar a la expresión de ubiquitina de fusión a Flag amino terminal en E. coli.

Materiales y procedimientos

La inducción de la expresión de proteínas y la lisis celular es similar a la preparación de GST-E2 anterior, a excepción de que el sobrenadante se carga sobre una resina de afinidad a FLAG (VWR, cat # IB 13020) en una proporción de 15 ml de perlas por 1 L de cultivo original. A continuación, la resina se lava con 10 volúmenes del lecho de tampón de lisis. La proteína se eluye de la columna con: 100 mM de ácido acético, glicerol al 10%, 100 mM de NaCl, 2,5 mM de EDTA, NP-40 al 0,1%, pH 3,5. Las eluciones se recogen como fracciones de 1 volumen del lecho en tubos que contienen 1/10ª parte del volumen de 2 M de Tris, 80 mM de B-ME, pH 9,0 para neutralizar el pH. Las fracciones de elución se analizan mediante SDS-PAGE y las fracciones apropiadas se agrupan y se dializan contra 400 volúmenes de 20 mM de Tris, glicerol al 10%, 200 mM de NaCl, 2,5 mM de EDTA, pH 8,0.

Producción de E3

Las secuencias codificantes para el complejo de E3 también se amplificaron mediante PCR y se generaron baculovirus que utilizaban el sistema Bac-to-Bac (GibcoBRL). E3 contiene dos subunidades, las cuales se expresan mediante co-infección de los dos baculovirus en las mismas células de insectos Hi-5. Una de las subunidades es la etiquetada con His, con la otra unidad asociada sin etiquetar.

El procedimiento detallado se realizó siguiente el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac por GibcoBRL. Por ejemplo, ROC1 se clonó en el vector pFastBacHtb con una etiqueta 6His Terminal, mientras que CUL1 era un inserto en el vector pFastBac1 sin ninguna etiqueta de fusión. Después de la transposición y la transfección de ADN Bácmido en células Sf-9, los Baculovirus se recogieron, se amplificaron y se utilizaron para co-infectar las células Hi-5 para la expresión de proteínas.

Materiales y procedimientos

Las células se recogen, se lavan una vez con PBS frío y se resuspenden en aproximadamente 6 volúmenes de tampón de lisis (20 mM de Tris, glicerol al 20%, 0,5 M de NaCl, 15 mM de imidazola, 1 mM de TCEP más comprimidos inhibidores de proteasa libre de EDTA completo, 1 comprimido/25 ml de células resuspendidas, pH 8,0). A continuación, la suspensión se sonica 3 x 30 s, seguido de la adición de NP40 hasta una concentración final del 0,5% y la incubación durante 30 minutos a 4ºC. A continuación, el lisato se centrifuga y el sobrenadante se incuba con perlas de Ni-NTa Azarosa preequilibradas (tampón de lisis + NP40) (Qiagen, cat # 1000632) durante 1 a 2 horas. Las perlas en pélets se lavan dos veces con tampón de lisis, se resuspenden en 1 a 2 volúmenes del tampón de lisis y se transfieren a una columna desechable para la elución. La elución se realiza utilizando 5 veces alícuotas de 1 volumen del lecho de tampón de lisis + 250 mM de imidazola. Las fracciones de elución se analizan mediante SDS-PAGE y se agrupan las fracciones apropiadas. El grupo de elución se desala a continuación utilizando una columna de desalación o un dispositivo de concentración centrífugo (más frecuentemente utilizado para volúmenes grandes). Cuando se utilizan dispositivos centrífugos, el grupo eluido se diluye 1:1 con tampón de lisis que no tiene imidazola y se gira a la velocidad adecuada hasta que el volumen se reduce a la mitad. En este punto se añade un volumen igual de tampón nuevo y se vuelve a girar el dispositivo. Esto se realiza un total de cuatro veces dando lugar a un intercambio de 32 veces.

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Ejemplo 2 Ensayo de conjugación a ubiquitina

La actividad de conjugación a ubiquitina se E1+E2 se midió utilizando el siguiente protocolo con Flag-ubiquitina, purificada de E. Coli y la E2 Ubch5c, purificada como His-Ubch5c de E. Coli.

Materiales y procedimientos

Los siguientes procedimientos se utilizaron para ensayos que medían la conjugación de ubiquitina. Los pocillos de placas de 96 pocillos con sustrato de níquel (Pierce Chemical) se bloquean con 100 \mul de solución salina tamponada de fosfato (PBS)/caseína al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavan a continuación con 200 \mul de PBST (Tween-20 en PBS al 0,1%) 3 veces. A cada pocillo se añade la siguiente solución de reacción Flag-ubiquitina (véase anteriormente):

Concentración final

62,5 mM Tris pH 7,5

6,25 m MgCl_{2}

0,75 mM DTT

2,5 mM ATP

2,5 mM NaF

12,5 nM ácido okadaico

100 ng Flag-ubiquitina (producido tal y como se ha descrito anteriormente).

La solución tampón se lleva a un volumen final de 80 \mul con agua filtrada milipore, seguido de la adición de 10 \mul de DMSO.

A la solución anterior, se añade a continuación 10 \mul de E1, His-E2 en 20 mM de tampón Tris, pH 7,5 y glicerol al 5%. His-E2 se produce tal y como se ha descrito anteriormente. E1 se obtiene comercialmente (Affiniti Research Products, Exter, Reino Unido). Las siguientes cantidades de cada enzima se utilizan para estos ensayos: 5 ng/pocillo de E1; 25 nl/pocillo de E2. A continuación, la reacción se deja proceder a temperatura ambiente durante 1 hora.

Tras la reacción de conjugación a ubiquitina, los pocillos se lavan con 200 \mul de PBST 3 veces. Para la medición de la enzima unida a ubiquitina, se añaden a cada pocillo 100 \mul de anti-Flag de ratón (1:10.000) e Ig-HRP anti-ratón (1:15.000) en PBST y se dejan incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, los pocillos se lavan con 200 \mul de PBST 3 veces, seguido de la adición de 100 \mul de sustrato luminol (dilución 1/5). A continuación, se mide la luminiscencia para cada pocillo utilizando un fluorímetro.

Resultados Actividad de activación y conjugación a ubiquitina

La figura 1 muestra la luminiscencia medida para E1 sola y para E1 + his-E2, tal y como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 3 Ensayo de ubiquitina ligasa

La actividad de ubiquitina ligasa de E1+E2+E3 se midió utilizando el siguiente protocolo con Flag-ubiquitina, purificada de E. Coli, la E2 Ubch5c, purificada de GST-Ubch5c de E. Coli con la etiqueta de GST extraída, y el complejo His-ROC/Cul de E3 purificado de células Hi-5 por coinfección de baculovirus. Este ensayo también se utilizó para mostrar los efectos de los moduladores candidatos en la actividad de ubiquitina ligasa.

Materiales y procedimientos

Los pocillos de placas de 96 pocillos con sustrato de níquel (Pierce Chemical) se bloquean con 100 \mul de solución salina tamponada de fosfato (PBS)/caseína al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavan a continuación con 200 \mul de PBST (Tween-20 en PBS al 0,1%) 3 veces. A cada pocillo se añade la siguiente solución de reacción Flag-ubiquitina (véase anteriormente):

Concentración final

62,5 mM Tris pH 7,5

6,25 m MgCl_{2}

0,75 mM DTT

2,5 mM ATP

2,5 mM NaF

12,5 nM ácido okadaico

La solución tampón se lleva a un volumen final de 80 \mul con agua filtrada milipore.

Para ensayos dirigidos a la identificación de moduladores de actividad de ubiquitina ligasa, se añaden a continuación a la solución 10 \mul de un compuesto modulador candidato en DMSO. Si no se añade modulador candidato, se añaden a la solución 10 \mul de DMSO.

A continuación, a la solución anterior se añaden 10 \mul de enzimas de ubiquitinación en 20 mM de tampón Tris, pH 7,5 y glicerol al 5%. E2-Ubch5c y E3-HisROC1/Cull se producen tal y como se ha descrito anteriormente. E1 se obtiene comercialmente (Affiniti Research Products, Exter, Reino Unido). Las siguientes cantidades de cada enzima se utilizan para estos ensayos: 5 ng/pocillo de E1; 25 nl/pocillo de E2; y 100 ng/pocillo de His-E3. A continuación, la reacción se deja proceder a temperatura ambiente durante 1 hora.

Tras la reacción de ubiquitinación, los pocillos se lavan con 200 \mul de PBST 3 veces. Para la medición de la enzima unida a ubiquitina, se añaden a cada pocillo 100 \mul de anti-Flag de ratón (1:10.000) e Ig-HRP anti-ratón (1:15.000) en PBST y se dejan incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, los pocillos se lavan con 200 \mul de PBST 3 veces, seguido de la adición de 100 \mul de sustrato luminol (dilución 1/5). A continuación, se mide la luminiscencia para cada pocillo utilizando un fluorímetro.

Resultados Actividad de ubiquitina ligasa

La figura 2 muestra la luminiscencia medida para varias combinaciones diferentes de enzimas de ubiquitinación. En estos experimentos, sólo E3 estaba en forma de His-E3. Las mediciones de luminiscencia muestran que el ensayo mide específicamente la actividad de la cascada completa de enzimas de ubiquitinación, lo cual requiere la presencia de las tres enzimas de ubiquitinación en la reacción.

Variaciones de los componentes de la composición

La figura 3A muestra el efecto relativo de la variación de la cantidad de E1 en la actividad de ubiquitina ligasa en el procedimiento anterior, en presencia y ausencia de DMSO. La adición de aproximadamente 10 \mul por 100 \mul de solución de reacción proporciona la actividad máxima de ubiquitina ligasa manteniendo los otros componentes de la composición tal y como se ha detallado anteriormente. La presencia de DMSO no afecta significativamente a la actividad de las enzimas de ubiquitinación.

El efecto relativo de la variación de las concentraciones de E3 y ubiquitina de la composición de reacción se muestra en la figura 3B. En general, la actividad máxima de ubiquitina ligasa se obtuvo con 200 a 300 ng por 100 \mul de E3 a cada concentración de ubiquitina, mientras que el aumento de la concentración de ubiquitina aumentó generalmente la actividad de ubiquitina ligasa a cada concentración de E3.

También se observó que el bloqueo de los pocillos con caseína al 1% mejoró la proporción de señal con respecto al ruido sobre el no bloqueo o el bloqueo con albúmina de suero bovino (BSA) al 5%. El blanco se determinó después de combinar todos los componentes al igual que antes a excepción de His-E3 y de medir la fluorescencia resultante después del tratamiento previo de los pocillos con BSA al 5%, caseína al 1% o nada. Los resultados se muestran en la figura 4.

Identificación de moduladores de actividad de ubiquitina ligasa

Para mostrar que el ensayo es útil para identificar moduladores de actividad de ubiquitina ligasa, se combinaron varios moduladores candidatos en concentraciones variantes con los componentes del ensayo tal y como se ha descrito anteriormente. Las figuras 5A y 5B muestran los resultados de dos moduladores de actividad de ubiquitina ligasa identificados. Los moduladores disminuyeron la actividad de ubiquitina ligasa en una forma dependiente de la dosis para
composiciones con enzimas de ubiquitinación que comprenden ROC1/Cull o ROC2/CULl como componente de E3.

La comparación del efecto de los moduladores de la actividad de ubiquitina ligasa en las composiciones de reacción, tal y como se ha descrito anteriormente, que contienen E1, E2 y His-E3 o que contienen E1, His-E2 y que carecen de E3, muestra si el modulador afecta a E3 o a una enzima diferente de E3. En la figura 6A, el modulador identificado disminuye la actividad de ubiquitina ligasa en presencia de E3, pero no altera la actividad en ausencia de E3, demostrando que el modulador tiene un efecto específico en la actividad ligasa de E3. En cambio, los resultados mostrados en la figura 6B para otro modulador revela que este compuesto reduce la actividad tanto si E3 está o no presente, demostrando que este modulador afecta a un miembro de la cascada de enzimas de ubiquitinación diferente de E3.

Ejemplo 4 Análisis FRET de ubiquitina ligasa

La ubiquitina se preparó, se marcó con EDANS o fluoresceína, y se midió la fluorescencia de cada uno de estos marcadores y su interacción como una pareja de FRET para mostrar la unión de la ubiquitina marcada a E3 y la actividad de FRET en la ubiquitina unida.

Materiales y procedimientos

La ubiquitina se produjo incorporando residuos de Cys en la secuencia de FLAG-ubiquitina mediante mutagénesis dirigida de sitio utilizando el cebador

5'-CCCCCCAAGCTTTGCATGCAGATTTTCGTGAAGACCCTGACC-3'

para producir FLAG-Cys-ubiquitina, o el cebador

5'-CCCCCCAAGCTTGCGTGCATGCAGATTTTCGTGAAGACCCTGACC-3'

para producir FLAG-Ala-Cys-ubiquitina. La proteína se expresó y se purificó tal y como se ha descrito anteriormente.

Se hizo reaccionar fluoresceína 5-maleimida (emisión máxima a 515 nm) o 1,5-yodoacetamida EDANS (IAEDANS; emisión máxima a 490 nm) con el grupo tiol de la ubiquitina producida como antes para formar un tioléter. El marcaje se llevó a cabo en PBS con 1 nM de TCEP. La proteína marcada se separó del marcador libre mediante filtración en gel.

El ensayo de ubiquitina ligasa se realizó sustancialmente tal y como se ha descrito anteriormente, con algunas modificaciones. No se utilizó sustrato de níquel en los pocillos de reacción, de manera que todos los componentes estaban libres en solución. Se utilizaron cantidades iguales de ubiquitina marcada con fluoresceína y ubiquitina marcada con IAEDANS. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 2 horas en un volumen de 100-150 \mul, a continuación se paró con 50 \mul de EDTA 0,5 M, pH 8.

Después de la reacción, los productos se separaron en PBS con 1 mM de TCEP mediante HPLC en una columna de exclusión por tamaño Superdex-75 HR 10/30 utilizando la detección por emisión de fluorescencia. Se podría utilizar una columna de filtración de gel con un poro para peso molecular más grande para resolver las especies de unión individuales.

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Resultados

La ubiquitina marcada con fluoresceína y la ubiquitina marcada con IAEDANS se unieron a E3 en aproximadamente las mismas cantidades. Una comparación del análisis espectral de la emisión fluorescente de la ubiquitina libre (no unida) marcada con ambos fluoróforos y la ubiquitina unida a E3 muestra un claro aumento en la proporción de la emisión a 515 nm con respecto a 490 nm (figura 17). Esto demuestra que en la ubiquitina unida, los fluoróforos en diferentes moléculas de ubiquitina están suficientemente próximos para FRET para ser medidos.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.

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Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5968761 A, Rolfe [0011]

\bullet US 8524441988 A [0038]

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\bullet WO 8705330 A [0062]

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\bullet US 4791192 A [0064]

\bullet US 4179337 A [0064]

\bullet WO 9215673 A [0076]

\bullet WO 9507463 A [0076]

\bullet WO 9814605 A [0076]

\bullet WO 9826277 A [0076]

\bullet WO 9949019 A [0076]

\bullet US 5292658 A [0076]

\bullet US 5418155 A [0076]

\bullet US 5683888 A [0076]

\bullet US 5741668 A [0076]

\bullet US 5777079 A [0076]

\bullet US 5804387 A [0076]

\bullet US 5874304 A [0076]

\bullet US 5876995 A [0076]

\bullet US 5925558 A [0076]

\bullet US 9701019 W [0132]

\bullet WO 9424314 A [0153] [0153] [0167]

\bullet US 5644048 A [0162]

\bullet US 5386023 A [0162]

\bullet US 5637684 A [0162]

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\bullet US 5216141 A [0162]

\bullet US 4469863 A [0162]

\bullet US 5235033 A [0162]

\bullet US 5034506 A [0162]

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\global\parskip0.930000\baselineskip

Documentos que no son patentes citados en la descripción

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Claims

```
\global\parskip0.900000\baselineskip
```
1. Procedimiento de ensayo de la actividad de ubiquitina ligasa que comprende:

a) combinar:

i)

etiqueta 1-ubiquitina;

ii)

enzima de activación de ubiquitina (E1);

iii)

enzima de conjugación a ubiquitina (E2); y

iv)

ubiquitina ligasa (E3);

b) medir la cantidad de etiqueta 1-ubiquitina unida a dicha E3.
2. Procedimiento de ensayo de la actividad de conjugación a ubiquitina que comprende:

a) combinar

i)

etiqueta 1-ubiquitina;

ii)

E1; y

iii)

E2

b) medir la cantidad de etiqueta 1-ubiquitina unida a dicha E2.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además en la etapa a) combinar un modulador de ubiquitina ligasa candidato.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que dicha E3 está en forma de etiqueta 2-E3.
5. Procedimiento según las reivindicaciones 2 ó 3, en el que dicha E2 está en forma de etiqueta 2-E2.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además en la etapa a) combinar una etiqueta 3-ubiquitina.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la etiqueta 1 es un primer miembro de una pareja de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y la etiqueta 3 es el segundo miembro de una pareja de FRET con la etiqueta 1 o es un desactivador de la etiqueta 1.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha medición se realiza midiendo la emisión fluorescente.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha medición se realiza midiendo el espectro de emisión fluorescente.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, que comprende además la comparación de dicho espectro de emisión fluorescente medido con el espectro de emisión fluorescente de la etiqueta 3-ubiquitina y la etiqueta 1-ubiquitina no unidos.
11. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha medición es continua con el tiempo o en puntos específicos de tiempo después de dicha combinación.
12. Procedimiento de identificación de un modulador de ubiquitinación que comprende:

a) combinar

i)

etiqueta 1-ubiquitina;

ii)

un modulador candidato;

iii)

E1;

iv)

E2; y

v)

etiqueta 2-E3;

b) medir la cantidad de etiqueta 1-ubiquitina unida a dicha etiqueta 2-E3.
```
\global\parskip1.000000\baselineskip
```
13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que E2 se selecciona del grupo que consiste en Ubc5, Ubc3, Ubc4 y UbcX.
14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que E3 comprende una proteína de tipo dedo RING.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicha proteína de tipo dedo RING se selecciona del grupo que consiste en regulador de Culina 1 (ROC1), regulador de Culina 2 (ROC2) y complejo promotor de la anafase 11 (APC11).
16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que E3 comprende una Culina.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha Culina se selecciona del grupo que consiste en CUL1, CUL2, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5 y complejo promotor de la anafase 2 (APC2).
18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que E3 comprende una combinación de proteína de tipo dedo RING/Culina.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que dicha combinación de proteína de tipo dedo RING/Culina se selecciona del grupo que consiste en APC2/APC11, ROC1/CUL1, ROC1/CUL2 y ROC2/CUL5.
20. Procedimiento según la reivindicación 12, que comprende además

a) combinar

i)

etiqueta 1-ubiquitina;

ii)

un modulador candidato;

iii)

E1; y

iv)

etiqueta 3-E2;

b) medir la cantidad de etiqueta 1-ubiquitina unida a dicha etiqueta 3-E2.
21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etiqueta 1 es un marcador o un componente de una pareja de unión.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicha etiqueta 1 marcadora es un marcador fluorescente.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicha medición se realiza midiendo la luminiscencia.
24. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicha etiqueta 1 componente de una pareja de unión se selecciona del grupo que consiste en un antígeno, biotina y proteína unión a calmodulina (CBP).
25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha etiqueta 1 componente de una unión se marca mediante marcaje indirecto.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicho marcaje indirecto es con un marcador fluorescente o una enzima marcadora.
27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que dicha medición se realiza midiendo la luminiscencia.
28. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que dicha enzima marcadora se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y glucosa oxidasa.
29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que dicha enzima marcadora reacciona con un sustrato de enzima marcadora que produce un producto fluorescente.
30. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que dicha medición se realiza midiendo la luminiscencia.
31. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho antígeno es un antígeno FLAG (FLAG).
32. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha etiqueta 1 componente de una pareja de unión es FLAG.
33. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que dicha etiqueta 1 componente de una pareja de unión es FLAG y dicho marcaje indirecto es mediante anti-FLAG.
34. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que dicha etiqueta 1 es FLAG.
35. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicha etiqueta 2 es una molécula de unión al sustrato de superficie.
36. Procedimiento según la reivindicación 35, en el que dicha molécula de unión al sustrato de superficie es poli-histidina (etiqueta de His).
37. Procedimiento según la reivindicación 36, en el que dicha combinación y medición se lleva a cabo en una placa con múltiples pocillos que comprende un sustrato de superficie que comprende níquel.
38. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicha etiqueta 3 es una molécula de unión al sustrato de superficie.
39. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que dicha molécula de unión al sustrato de superficie se selecciona del grupo que consiste en etiqueta de His y glutatión-s-transferasa (GST).
40. Procedimiento de ensayo de la actividad de enzimas de ubiquitinación que comprende:

a) combinar

i)

la etiqueta 1-ubiquitina y la etiqueta 2-ubiquitina, donde la etiqueta 1 y la etiqueta 2 constituyen una pareja de FRET o la etiqueta 1 es un marcador fluorescente y la etiqueta 2 es un desactivador de la etiqueta 1;

ii)

E1;

iii)

E2; y

iv)

E3;

b) medir la cantidad o la tasa de ubiquitinación.
41. Procedimiento según la reivindicación 40, que comprende además en la etapa a) combinar un modulador de la ubiquitinación candidato.
42. Procedimiento de identificación de un modulador de la ubiquitinación que comprende:

a) combinar

i)

la etiqueta 1-ubiquitina y la etiqueta 2-ubiquitina, donde la etiqueta 1 y la etiqueta 2 constituyen una pareja de FRET o la etiqueta 1 es un marcador fluorescente y la etiqueta 2 es un desactivador de la etiqueta 1;

ii)

E1;

iii)

E2;

iv)

E3; y

v)

un modulador de la ubiquitinación candidato;

b) medir la cantidad o la tasa de ubiquitinación.
43. Procedimiento según las reivindicaciones 40 a 42, en el que E2 se selecciona del grupo que consiste en Ubc5, Ubc3, Ubc4 y UbcX.
44. Procedimiento según las reivindicaciones 40 a 43, en el que E3 comprende una proteína de tipo dedo RING.
45. Procedimiento según la reivindicación 44, en el que dicha proteína de tipo dedo RING se selecciona del grupo que consiste en ROC1, ROC2 y APC11.
46. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 40 a 45, en el que E3 comprende una Culina.
47. Procedimiento según la reivindicación 46, en el que dicha Culina se selecciona del grupo que consiste en CUL1, CUL2, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5 y APC2.
48. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 40 a 47, en el que E3 comprende una combinación de proteína de tipo dedo RING/Culina.
49. Procedimiento según la reivindicación 48, en el que dicha combinación de proteína de tipo dedo RING/Culina se selecciona del grupo que consiste en APC2/APC11, ROC1/CUL1, ROC1/CUL2 y ROC2/CUL5.
50. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 40 a 49, en el que dicha medición se realiza midiendo el espectro de emisión fluorescente.
51. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 40 a 50, en el que dicha medición es continua con el tiempo o en puntos específicos de tiempo después de dicha combinación.
52. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 40 a 51, que comprende además la comparación de dicho espectro de emisión fluorescente medido con el espectro de emisión fluorescente de etiqueta 1-ubiquitina y etiqueta 2-ubiquitina no unidos.
53. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 40 a 52, en el que dicha ubiquitina está en forma de etiqueta 1,3-ubiquitina y etiqueta 2,3-ubiquitina, donde la etiqueta 3 es un miembro de una pareja de unión.
54. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que la etiqueta 3 es FLAG.
55. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 40 a 54, en el que dicha E3 está en forma de etiqueta 4-E3, donde la etiqueta 4 es una molécula de unión al sustrato de superficie.
56. Procedimiento según la reivindicación 50, que comprende además una proteína diana.
57. Procedimiento según la reivindicación 50, que comprende además:

a) combinar, en condiciones que favorecen la actividad de ubiquitinación:

vi)

una proteína diana.
58. Composición que comprende: etiqueta 1-ubiquitina y etiqueta 2-ubiquitina, donde la etiqueta 1 es un marcador fluorescente y la etiqueta 2 es el segundo miembro de una pareja de FRET con la etiqueta 1 o a etiqueta 2 es un desactivador de la etiqueta 1.
59. Composición según la reivindicación 58, que comprende además: E1, E2 y E3.
60. Composición según la reivindicación 59, en la que dicha E2 se selecciona del grupo que consiste en Ubc5, Ubc3, Ubc4 y UbcX.
61. Composición según la reivindicación 59, en la que E3 comprende una proteína de tipo dedo RING.
62. Composición según la reivindicación 61, en la que dicha proteína de tipo dedo RING se selecciona del grupo que consiste en ROC1, ROC2 y APC11.
63. Composición según la reivindicación 59, en la que E3 comprende una Culina.
64. Composición según la reivindicación 63, en la que dicha Culina se selecciona del grupo que consiste en CUL1, CUL2, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5 y APC2.
65. Composición según la reivindicación 59, en la que E3 comprende una combinación de proteína de tipo dedo RING/Culina.
66. Composición según la reivindicación 65, en la que dicha combinación de proteína de tipo dedo RING/Culina se selecciona del grupo que consiste en APC2/APC11, ROC1/CUL1, ROC1/CUL2 y ROC2/CUL5.