DE60131262T2

DE60131262T2 - Ubiquitin-ligase-assay

Info

Publication number: DE60131262T2
Application number: DE60131262T
Authority: DE
Inventors: Sarkiz D. San Jose ISSAKANI; Jianing Foster City HUANG; Julie San Francisco SHEUNG; Todd R. San Francisco PRAY
Original assignee: Rigel Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Rigel Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-04-03
Filing date: 2001-04-03
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2021-04-04
Also published as: AU2001251291A1; DE60131262D1; US20060105409A1; JP2003529372A; US7781182B2; US20020042083A1; DK1268847T3; US6740495B1; EP1268847B1; US7022493B2; WO2001075145A3; EP1268847A2; US20050032139A1; US6737244B2; ATE377654T1; US20090263831A1; JP4095805B2; ES2296744T3; WO2001075145A2

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Tests zur Messung der Aktivität von Ubiquitinierungsenzymen. Die Erfindung ist auch auf Tests zur Identifikation von Modulatoren von Ubiquitinierung ausgerichtet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Ubiquitin ist ein höchst konserviertes 76-Aminosäure-Protein, das in allen eukaryotischen Zellen exprimiert wird. Die Ausmaße vieler intrazellulärer Proteine werden durch ein ubiquitinabhängiges proteolytisches Verfahren reguliert. Dieses Verfahren umfasst die kovalente Ligation von Ubiquitin an ein Target-Protein, was in einem poly-ubiquitiniertem Target-Protein resuliert, das rasch detektiert wird und durch das 26S-Proteasom abgebaut wird.
Die Ubiquitinierung dieser Proteine wird durch eine Kaskade von enzymatischer Aktivität vermittelt. Ubiquitin wird zuerst in einer ATP-abhängigen Art durch ein ubiquitinaktivierendes Enzym (E1) aktiviert. Der C-Terminus von Ubiquitin bildet eine hochenergetische Thiolesterbindung mit E1. Das Ubiquitin wird dann auf ein ubiquitinkonjugierendes Enzym (E1; auch Ubiquitinträgerprotein genannt) überführt, das auch über eine Thiolesterbindung an dieses zweite Enzym gebunden ist. Das Ubiquitin wird letztlich an sein Targetprotein gebunden, um eine terminale Isopeptidbindung unter der Leitung einer Ubiquitin-Ligase (E3) zu bilden. In diesem Verfahren werden Ketten an Ubiquitin auf dem Targetprotein gebildet, wobei diese durch Aktivität von E3 kovalent an die nächste gebunden ist.
Die Komponenten der Ubiquitinligations-Kaskade haben beträchtliche Aufmerksamkeit erhalten (für einen Überblick siehe Weissuran, Nature Reviews 2, 169–178 (2001)). E1 und E2 sind strukturell verwandte und gut charakterisierte Enzyme. Es gibt verschiedene Spezies von E2 (zumindest 25 bei Säugetieren), wovon einige in bevorzugten Paaren mit spezifischen E3-Enzymen wirken, um Spezifität für verschiedene Targetproteine zu verleihen. Während die Nomenklatur für E2 unter den Spezies nicht standardisiert ist, haben sich Forscher auf diesem Gebiet mit diesem Thema befasst, und der Fachmann kann einfach verschiedene E2-Proteine identifizieren, sowie Spezieshomologe (siehe Haas und Siepmann, FASER J. 11, 1257–1268 (1997)).
E3-Enzyme enthalten zwei verschiedene Aktivitäten: eine Ubiquitin-Ligaseaktivität, um Ubiquitin an Substrate zu konjugieren und Polyubiquitinketten über Isopeptidbindungen zu bilden, und eine Targeting-Aktivität, um die Ligase und das Substrat physikalisch zusammenzubringen. Substratspezifität verschiedener E3-Enzyme ist die Hauptdeterminante in der Selektivität des ubiquitinabhängigen Proteinabbauverfahrens.
Von einigen E3-Ubiquitin-Ligasen ist bekannt, dass sie eine einzige Untereinheit haben, die für die Ligase-Aktivität verantwortlich ist. Solche E3-Ligasen, die charakterisiert worden sind, umfassen die HECT- (homolog zu E6-AP-Carboxyterminus) Domänenproteine, repräsentiert durch den Säugetier-E6AP-E6-Komplex, der als Ubiquitin-Ligase für den Tumorsuppressor p53 wirkt und durch Papillomavirus in Cervixkrebs aktiviert wird (Huang et al., Science 286, 1321–26 (1999)). Einzeluntereinheit-Ubiquitin-Ligasen mit einer RING-Domäne umfassen Mdm2, das sich auch als Ubiquitin-Ligase für p53 erwiesen hat, sowie Mdm2 selbst. Eine andere RING-Domäne-, Einzeluntereinheit-E3-Ligasen umfassen: TRAF6, involviert in IKK-Aktivierung, CbI, die auf Insulin und EGF abzielt, Sina/Sich, die auf DCC abzielt, Itchy, die in Hämatopoese involviert ist (B-, T- und Mastzellen), und IAP, involviert mit Inhibitoren von Apoptose.
Die am besten charakterisierte E3-Ligase ist der APC(anaphasefördernder Komplex), der ein Multi-Untereinheiten-Komplex ist, der sowohl für den Eintritt in die Anaphase als auch den Austritt aus Mitose erforderlich ist (siehe King et al., Science 274, 1652–59 (1996), für einen Bericht). Der APC spielt eine wesentliche Rolle in der Regulation der Passage von Zellen durch Anaphase durch Förderung ubiquitinabhängiger Proteolyse vieler Proteine. Zusätzlich zum Abbau des mitotischen Cyclins vom B-Typ für die Inaktivierung von CDC2-Kinase-Aktivität ist der APC auch für den Abbau von anderen Proteinen für Schwester-Chromatid-Trennung und Spindel-Abbau erforderlich. Die meisten Proteine, von denen bekannt ist, dass sie durch den APC abgebaut werden, enthalten ein konserviertes 9-Aminosäuremotiv, das als „Destruktionsbox" bekannt ist, die auf diese für Ubiquitinierung und nachfolgenden Abbau abzielt. Jedoch enthalten Proteine, die während G1 abgebaut werden, einschließlich G1-Cycline, CDK-Inihibitoren, Transkriptionsfaktoren und Signalgebungsintermediate, dieses konservierte Aminosäuremotiv nicht. Stattdessen scheint Substratphosphorylierung eine wichtige Rolle im Abzielen auf ihre Wechselwirkung mit einer E3-Ligase für Ubiquitinierung zu sein [siehe Hershko et al., Ann. Rev. Biochem. 67, 429–75 (1998)].
In Eukaryoten spielt eine Familie von Komplexen mit E3-Ligaseaktivität eine wichtige Rolle in der Regulation der G1-Progression. Diese Komplexe, die SCFs genannt werden, bestehen alle aus zumindest drei Untereinheiten SKP1, Culline (mit zumindest sieben Familienmitgliedern) und einem F-Box-Protein (wovon Hunderte Spezies bekannt sind), die sich direkt an das Substrat binden und das Substrat auf den E3-Komplex richten. Die kombinatorischen Wechselwirkungen zwischen den SCFs und einer kürzlich entdeckten Familie von RING-Finger-Proteinen, den Regulator von Cullin (ROC)/APC11-Proteinen, haben sich als Schlüsselelemente erwiesen, die den E3-Proteinkomplexen Ligaseaktivität verleihen. Besondere ROC/Cullin-Kombinationen können spezifische zelluläre Wege regulieren, wie durch die Funktion von APC11-APC2, die in die proteolytische Kontrolle von Schwester-Chromatid-Trennung und Austritt aus Telophase in G1 in Mitose involviert sind [siehe King et al., siehe oben, Koepp et al., Cell 97, 431–34 (1999)], und ROC1-Cullin-1, involviert in den proteolytischen Abbau von I_κB_α in NF-_κB/I_κB-vermittelter Transkriptionsregulation [Tan et al., Mol. Cell. 3 (4), 527–533 (1999); Laney et al., Cell 97, 427–30 (1999)], veranschaulicht wird.
Da der E3-Komplex die Hauptdeterminante der Selektion von Proteinabbau durch das ubiquitinabhängige proteolytische Verfahren ist, können Modulatoren von E3-Ligaseaktivität zur Hinaufregulierung oder Herabregulierung spezifischer Moleküle, die in zelluläre Signaltransduktion involviert sind, verwendet werden. Krankheitspro zesse können durch eine solche Hinauf- und Herabregulierung von Signaltransduktoren behandelt werden, um spezifische Zeltreaktionen zu verstärken oder zu dämpfen. Dieses Prinzip ist im Entwurf einer Reihe von Therapeutika verwendet worden, einschließlich Phosphodiesterase-Inhibitoren für Atemwegserkrankung und vaskulärer Insuffizienz, Kinase-Inhibitoren für maligne Transformation und Proteasom-Inhibitoren für entzündliche Erkrankungen wie z. B. Arthritis.
Aufgrund der Bedeutung von Ubiquitinierung in Zellregulation und der weiten Anordnung von verschiedenen möglichen Komponenten in ubiquitin-abhängiger Proteolyse besteht ein Bedarf an schnellen und einfachen Mitteln zur Beurteilung von E3-Ligase-Aktivität. Weiters kann ein solcher Test für die Identifikation von Modulatoren von E3-Ligase nützlich sein. Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Testen von Ubiquitin-Ligaseaktivität bereitzustellen, wobei die Verfahren weiters zur Identifikation von Modulatoren von Ubiquitin-Ligase-Aktivität verwendet werden können.
BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN FACHGEBIETS
Tan et al., siehe oben, offenbaren, dass ROC1/Cul1 Ubiquitin-Polymerisierung in Abwesenheit von Targetproteinsubstrat katalysiert. Ohta et al., Mol. Cell 3 (4), 535–541 (1999), offenbaren, dass APC11/APC2 auch Ubiquitin-Polymerisierung in Abwesenheit von Targetproteinsubstrat katalysiert und dass diese Aktivität von der Aufnahme der geeigneten E2-Spezies abhängt. Rolfe et al., US-Patent Nr. 5.968.761 , offenbaren einen Test zur Identifikation von Inhibitoren von Ubquitinierung eines Target-Regulationsproteins.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Beurteilung von Ubiquitin-Ligase-Aktivität und zum Screening auf Mittel bereit, die Ubiquitin-Ligase-Aktivität modulieren. In einem Aspekt ist ein Verfahren zum Testen von Ubiquitin-Ligase-Aktivität bereitgestellt, dass die Schritte der Kombination von Ubiquitin, E1, E2 und E3 und Mes sung der Menge von Ubiquitin, gebunden an E3, umfasst. Dieses Verfahren kann weiters die Kombination eines möglichen Ubiquitin-Ligase-Modulators im Kombinationsschritt umfassen. Dieses Verfahren erfordert kein spezifisches Targetprotein, das ubiquitiniert werden soll. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Substratprotein für Ubiquitinierung, das nicht Ubiquitin ist, speziell ausgeschlossen.
In einer Ausführungsform des oben beschriebenen Tests liegt Ubiquitin in Form von tag1-Ubiquitin vor. In einer anderen Ausführungsform liegt E3 in Form von tag2-E3 vor. In diesen Ausführungsformen kann tag1 eine Markierung oder ein Partner eines Bindungspaares sein. In einer Ausführungsform ist tag1 eine Fluoreszenzmarkierung, in diesem Fall kann die Messung der Menge von Ubiquitin, gebunden an E3, durch Messung von Lumineszenz erfolgen.
In einer anderen Ausführungsform ist tag1 ein Element eines Bindungspaars, ausgewählt aus der Gruppe Antigen, Biotin und CBP. In letzterer Ausführungsform kann der Partner eines Bindungspaars durch indirekte Markierung markiert werden, die eine Fluoreszenzmarkierung oder ein Markierungsenzym sein kann. Das Markierungsenzym kann Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase oder Glucose-Oxidase sein. Wenn die indirekte Markierung durch Fluoreszenzmarkierung erfolgt, kann die Messung der Menge an Ubiquitin, gebunden an E3, durch Messung der Lumineszenz erfolgen. Im Fall, dass die indirekte Markierung durch ein Markierungsenzym erfolgt, kann das Enzym mit einem Substrat umgesetzt werden, das ein Fluoreszenz-Produkt produziert. In diesem Fall kann die Messung der Menge an Ubiquitin, gebunden an E3, durch Messung von Lumineszenz erfolgen. In einer Ausführungsform des obigen Verfahren ist tag1 ein FLAG-Antigen. In dieser Ausführungsform kann die indirekte Markierung durch Anti-FLAG erfolgen.
In einem Aspekt des obigen Verfahrens ist tag2 ein Oberflächen-Bindungsmolekül, das eine His-Markierung sein kann. In letzterem Fall kann der Test in einer Multi-Well-Platte durchgeführt werden, die ein Oberflächensubstrat umfasst, das Nickel umfasst.
In einer anderen Ausführungsform des obigen Verfahrens, wenn tag1 eine Fluoreszenzmarkierung ist, umfasst der Kombinationsschritt weiters die Kombination von tag3-Ubiquitin. Tag3 kann das zweite Element eines FRET-Paars mit tag1 sein, oder es kann ein Quencher von tag1 sein. In dieser Ausführungsform kann die Messung der Menge an Ubiquitin, gebunden an E3, durch Messung von Fluoreszenzemission erfolgen, welche die Messung von Fluoreszenzemissionsspektrum umfassen kann. In dieser letzten Ausführungsform kann das Verfahren weiters den Vergleich des gemessenen Fluoreszenzemissionsspektrums mit dem Fluoreszenzemissionsspektrum von ungebundenem tag1- und tag3-Ubiquitin umfassen. Wenn die Messung der Menge an Ubiquitin, gebunden an E3, durch Messung des Fluoreszenzemissionsspektrums erfolgt, kann die Messung kontinuierlich sein oder zu bestimmten Zeitpunkten nach der ursprünglichen Kombination von Materialien erfolgen.
In einem anderen Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifikation von Modulatoren von Ubiquitinierungsenzymen bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst die Kombination von tag1-Ubiquitin, eines Modulator-Kandidaten, E1, E2 und tag2-E3 und Messung der Menge von tag1-Ubiquitin, gebunden an tag2-E3. In einer anderen Ausführungsform umfasst dieses Verfahren weiters die Kombination von tag1-Ubiquitin, einem Modulator-Kandidaten, E1 und tag2-E2 und die Messung der Menge an tag1-Ubiquitin, gebunden an tag2-E2. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Targetprotein (d. h. ein anderes Substratprotein als Ubiquitin selbst) insbesondere in diesem Verfahren ausgeschlossen.
In den Ausführungsformen des Verfahrens zur Identifikation von Modulatoren von Ubiquitinierungsenzymen kann tag1 eine Markierung oder ein Partner eines Bindungspaars sein. Wenn tag1 eine Markierung ist, kann es eine Fluoreszenzmarkierung sein, in diesem Fall kann die Messung der Menge an gebundenem tag1-Ubiquitin durch Lumineszenz gemessen werden. Wenn tag1 ein Partner eines Bindungspaars ist, sind potenzielle Bindungspartner, Markierungsoptionen und nachfolgende Messoptionen im Wesentlichen wie für tag1 oben für das Verfahren zum Testen von Ubiquitin-Ligase-Aktivität beschrieben.
Im obigen Verfahren zur Identifikation von Modulatoren von Ubiquitinierungsenzymen können tag2 und tag3 Oberflächensubstratbindungsmoleküle sein. Optionen für solche Moleküle und Bedingungen zur Durchführung des Verfahrens sind wie für das Verfahren zum Testen von Ubiquitin-Ligase-Aktivität beschrieben.
In einem anderen Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Testen von Ubiquitinierungsenzymaktivität bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst die Kombination von tag1-Ubiquitin und tag2-Ubiquitin, E1, E2 und E3 unter Bedingungen, unter welchen Ubiquitinierung stattfinden kann, und Messung der Menge oder Geschwindigkeit von Ubiquitinierung. In dieser Ausführungsform konstituieren tag1 und tag2 ein FRET-Paar, oder tag1 ist eine Fluoreszenzmarkierung und tag2 ist ein Quencher von tag1. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Kombination eines Ubiquitinierungsmodulator-Kandidaten mit den anderen Komponenten. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens erfolgt die Messung durch Messung des Fluoreszenzemissionsspektrums aus der Kombination, vorzugsweise kontinuierlich oder zu bestimmten Zeitpunkten nach Kombination der Komponenten. Diese Messungen können mit Fluoreszenzemissionsspektrum von ungebundenem tag1- und tag2-Ubiquitin verglichen werden.
Hierin ist auch ein Verfahren zur Identifikation eines Ubiquitinierungsmodulators bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst die Kombination eines Ubiquitinierungsmodulator-Kandidaten, taq-1-Ubiquitin und tag-2-Ubiquitin, E1, E2 und E3 unter Bedingungen, unter welchen Ubiquitinierung stattfinden kann, und Messung des Ausmaßes oder der Geschwindigkeit von Ubiquitinierung. In dieser Ausführungsform konstituieren tag1 und tag2 ein FRET-Paar oder tag1 ist eine Fluoreszenzmarkierung und tag2 ist ein Quencher von tag1. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Kombination eines Ubiquitinierungsmodulator-Kandidaten mit den anderen Komponenten. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens erfolgt die Messung durch Messung des Fluoreszenzemissionsspektrums aus der Kombination, vorzugsweise kontinuierlich oder zu bestimmten Zeitpunkten nach Kombination der Komponenten. Diese Messungen können mit dem Fluoreszenzemissionsspektrum von ungebundenem tag1- und tag2-Ubiquitin verglichen werden.
In den beiden letzteren beschriebenen Tests kann das Ubiquitin in Form von tag1,3-Ubiquitin und tag2,3-Ubiquitin vorliegen, worin tag3 ein Element eines Bindungspaars ist, vorzugsweise FLAG. In einer anderen Ausführungsform dieser Tests kann E3 in Form von tag4-E3 vorliegen, worin tag4 ein Oberflächensubstratbindungsmolekül ist.
In wieder einem anderen Aspekt der Erfindung sind Zusammensetzungen zur Verwendung im Testen von Ubiquitinierung bereitgestellt. Die Zusammensetzung umfasst tag1-Ubiquitin und tag2-Ubiquitin, worin tag1 und tag2 ein FRET-Paar konstituieren oder tag1 eine Fluoreszenzmarkierung ist und tag2 ein Quencher von tag1 ist. In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung weiters E1, E2 und E3.
In bevorzugten Ausführungsformen der zuvor beschriebenen Tests und Zusammensetzungen wird E2 aus der Gruppe bestehend aus Ubc5, Ubc3, Ubc4 und UbcX ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst E3 ein RING-Fingerprotein, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ROC1, ROC2 und APC11. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst E2 ein Cullin, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CUL1, CUL2, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5 und APC2. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst E3 eine RING-Fingerprotein/Cullin-Kombination, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus APC11/APC2, ROC1/CUL1, ROC1/CUL2 und ROC2/CUL5.
Andere Aspekte der Erfindung sind Fachleuten aus der folgenden Beschreibung der Erfindung offensichtlich.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die relativen Mengen an fluoreszenzmarkiertem Ubiquitin in einem Ubiquitin-Aktivierungs- und -Konjugationstest. In diesen Versuchen ist E2 His-Ubch5c.
2 zeigt die relativen Mengen an Ubiquitin-Ligase-Aktivität, die aus verschiedenen Kombinationen von Ubiquitinierungsenzymen resultieren. In diesen Versuchen umfasst E3 das RING-Fingerprotein ROC1 und das Cullin Cul1.
3 zeigt die relative Ubiquitin-Ligase-Aktivität in einem Test, der Ubiquitin, E1, E2 und E3 kombiniert. 3A zeigt relative Ubiquitin-Ligase-Aktivität unter Verwendung verschiedener Mengen an E1 in Gegenwart und Abwesenheit von DMSO. 3B zeigt relative Ubiquitin-Ligase-Aktivität unter Verwendung verschiedener Mengen an Ubiquitin und E3.
4 zeigt das Signal-Rausch-Verhältnis von Fluoreszenzmarkierung in einem Ubiquitin-Ligase-Aktivitätstest unter Verwendung von Flag-Ubiquitin und eines Anti-Flag/Anti-Maus-Antikörpers, konjugiert an HRP, und Luminol-Fluoreszenz-HRP-Substrat. Das Signal wurde aus einer Reaktionszusammensetzung gemessen, die E1, E2, und E3 umfasst, wobei E3 das Reaktionsgefäßoberflächensubstrat spezifisch band. Der Hintergrund wurde als Ausmaß an Fluoreszenz gemessen, die nach Durchführung des Tests in Abwesenheit von E3 gegenwärtig war.
5 zeigt die konzentrationsabhängige Wirkung zweier Ubiquitin-Ligaseaktivitätsmodulatoren in Tests, die Ubiquitin-Ligase-Aktivität mit zwei verschiedenen E3-Enzymen messen. 5A zeigt eine konzentrationsabhängige Reduktion der Ubiquitin-Ligaseaktivität in Tests, die entweder ROC1/Cul1 oder ROC2/Cul5 als Komponenten der E3-Ubiquitin-Ligase umfassen. 5B zeigt ein leicht unterschiedliches Muster an konzentrationsabhängiger Reduktion von Ubiquitin-Ligase-Aktivität für einen anderen Modulator.
6 zeigt die Proportionen von Ubiquitin-Ligase-Aktivität und Ubiquitin-Konjugations-Aktivität in Gegenwart und Abwesenheit zweier Ubiquitin-Ligaseenzymmodulator-Kandidaten für Kombinationen von E1, E2, und E3 und Kombinationen von Enzymen E1 und E2. 6A zeigt einen Ubiquitinierungsenzymmodulator-Kandidaten, der nur E3 beeinflusst. 6B zeigt einen Ubiquitinierungsenzymmodulator-Kandidaten, der Enzyme beeinflusst, die nicht E3 sind.
7 zeigt die konzentrationsabhängigen Wirkungen zweier Ubiquitin-Ligasemodulator-Kandidaten auf Ubiquitin-Ligase-Aktivität und Ubiquitin-Konjugations-Aktivität. 7A zeigt die Ergebnisse für einen Modulator-Kandidaten, der über eine konzentrationsabhängige Wirkung auf Ubiquitin-Ligaseaktivität verfügt (E1 + E2 + E3), aber nicht auf Ubiquitin-Konjugationsaktivität (E1 + E2), was daher nur die E3-Ligase beeinflusst. 7B zeigt die Ergebnisse für einen Modulator-Kandidaten, der über eine konzentrationsabhängige Wirkung sowohl auf Ubiquitin-Konjugationsaktivität als auch Ubiquitin-Ligase-Aktivität verfügt, wodurch eine Komponente beeinflusst wird, die nicht E3-Ligase ist.
8A und 8B zeigen die Nucleinsäuresequenz, die für Kaninchen-E1 kodiert, bzw. die Aminosäuresequenz von Kaninchen-E1.
9A und 9B zeigt die Nucleinsäuresequenz, die für das E2-Ubc5c kodiert, bzw. die Aminosäuresequenz von E2-Ubc5c.
10 zeigt die Aminosäuresequenz des RING-Fingerproteins APC11.
11 zeigt die Aminosäuresequenz des RING-Fingerproteins ROC1.
12A und 12B zeigen die Nucleinsäuresequenz, die für das RING-Fingerprotein ROC2 kodiert, bzw. die Aminosäuresequenz von ROC2.
13A und 13B zeigten die Nucleinsäuresequenz, die für das Cullin CUL5 kodiert, bzw. die Aminosäuresequenz von CUL5.
14A und 14B zeigen die Nucleinsäuresequenz, die für das Cullin APC2 kodiert, bzw. die Aminosäuresequenz von APC2.
15A, 15B und 15C zeigen die Aminosäuresequenzen von menschlichem Ubiquitin, Flag-Ubiquitin bzw. Flag-Cys-Ubiquitin. Die Flag- und Flag-Cys-Abschnitte der Sequenz sind fett gedruckt.
16A und 16B zeigen die E3-ligaseabhängige Einführung von Flag-Ala-Cys-Ubiquitin, markiert mit FRET-Fluorophoren, in E3-Ubquitin-Komplex. Isolation durch HPLC zeigt Emissionen aus freiem Ubiquitin und Ubiquitin, gebunden an E3-Ligase. Die Spuren zeigen Fluoreszenzemission in der nachstehend beschriebenen Wellenlänge unter Anregung mit 336 nm, der optimalen Anregungswellenlänge für IAEDANS. 16A zeigt die Fluoreszenzsignale von IAEDANS-(490 nm, größerer Peak) und fluorescein- (515 nm, kleinerer Peak) markiertem Ubiquitin nach Kombination mit E1 und E2 alleine. Das freie Ubiquitin wurde unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) isoliert. 16B zeigt die Fluoreszenzsignale von IAEDANS-(490 nm, größerer Peak bei jedem Elutionsvolumen) und fluorescein-(515 nm, kleinerer Peak bei jedem Elutionsvolumen) markiertem Ubiquitin nach Kombination mit E1 und E2 und E3 (Roc1/Cul1). Die strichlierte Linie zeigt optische Dichte von Proteinlösung (Maßstab rechts), was die hohe Empfindlichkeit der Fluorophore trotz einer sehr geringen Proteinkonzentration zeigt.
17 zeigt die Fluoreszenzemissionsspektren von freiem Ubiquitin, markiert mit FRET-Spender/Akzeptorpaar EDANS und Fluorescein unter Anregung mit 336 nm. Die strichlierte Linie zeigt die Emissionsspektren des freien markierten Ubiquitins (Recktanten), während die durchgezogene Linie die Emissionsspektren von markiertem Ubiquitin, gebunden an E3, zeigt (Produkte). Das stark erhöhte 515:490-nm-Emissionsverhältnis von E3-gebundenem Ubiquitin im Vergleich zu freiem Ubiquitin zeigt den Energietransfer vom EDANS-Spender zum Fluorescein-Akzeptor dieses FRET-Spender/Akzeptor-Paars.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Testen der Ubiquitin-Ligase-Aktivität. In einer umfassenden Ausführungsform stellt das Verfahren die Messung von Ubiquitin-Ligase-Aktivität direkt dort, wo die Reaktion aufgetreten ist, bereit, daher wird der Bedarf an Target-Proteinen und nachfolgende Analyse, wie z. B. Trennung von ligiertem von unligiertem Material in einem SDS-PAGE-Verfahren, vermieden. Dies ermöglicht Multi-Well-Anordnungsanalyse und Hochdurchsatz-Screening verfahren für Modulatoren von Ubiquitinierungsaktivität. Zusätzlich ermöglichen die vorliegenden Verfahren die Analyse vieler verschiedener Kombinationen von E3-Komponenten und E2/E3-Kombinationen, ohne eine vorherige Identifikation spezifischer Targetsubstrate zu erfordern.
Im Allgemeinen umfasst das Verfahren die Kombination von Ubiquitin und Ubiquitin-Ligations-Enzymen und Messung der Menge an Ubiquitin, das an Ubiquitinierungssubstratprotein ligiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ubiquitinierungssubstratprotein Ubiquitin selbst, und was gemessen wird, sind Poly-Ubiquitin-Ketten, die in der Ligase-Reaktion produziert werden. Deshalb steht „Ubiquitinierungssubstratprotein" wie hierin verwendet für ein Portein, an welches Ubquitin durch die Aktivität von Ubiquitinierungsenzymen gebunden ist, und „Ubiquitinierung" und grammatikalische Äquivalente davon stehen für die Bindung von Ubiquitin an ein Substratprotein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird kein spezifisches Targetprotein verwendet, um Ubiquitin-Ligase-Aktivität zu messen. Unter „Targetprotein" hierin versteht man ein Protein, das kein Ubiquitin ist, an welches Ubiquitin durch Ubiquitinierungsenzyme gebunden wird. In dieser Ausführungsform sind die Poly-Ubiquitin-Ketten, die gemessen werden, vorzugsweise an E3 gebunden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können die gemessenen Poly-Ubiquitin-Ketten an E3 gebunden sein oder nicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird E3 an die Oberfläche eines Reaktionsgefäßes angeheftet, wie z. B. den Well einer Multi-Well-Platte. Diese Ausführungsform erleichtert die Trennung von ligiertem Ubiquitin von unligiertem Ubiquitin. Mittel zum Anheften von E3 an die Oberfläche eines Reaktionsgefäßes sind nachstehend beschrieben. Diese Ausführungsform ermöglicht die Ubiquitin-Ligase-Reaktion und die Detektion und Messung von ligiertem Ubiquitin im selben Gefäß, was den Test für Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen nützlich macht.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist E3 frei in Lösung. In dieser Ausführungsform wird Ubiquitinierungsaktivität unter Verwendung eines Systems überwacht, das ein Signal produziert, das mit dem Ausmaß der Ubiquitinierung variiert, wie z. B. das Fluoreszenzresonanzenergietransfer-(FRET-)System, das nachstehend detailliert beschrieben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist Ubiquitin markiert, entweder direkt oder indirekt, wie nachstehend weiters beschrieben, und die Menge an Markierung wird gemessen. Dies ermöglichte eine einfache und rasche Detektion und Messung von ligiertem Ubiquitin, was den Test für Hochdurchsatz-Screeninganwendungen nützlich macht. In einer bevorzugten Ausführungsform variiert das Signal der Markierung mit dem Ausmaß an Ubiquitinierung, wie z. B. im FRET-System, das nachstehend beschrieben ist. Ein Fachmann erkennt die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung auf das Screening auf Mittel, die Ubiquitinierung modulieren.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen zum Testen von Ubiquitin-Ligaseaktivität bereit. Unter „Ubiquitin" hierin versteht man ein Polypeptid, das an ein anderes Polypeptid durch Ubiquitin-Ligase-Enzyme ligiert wird. Das Ubiquitin kann aus einer beliebigen Spezies eines Organismus stammen, vorzugsweise einer eukaryotischen Spezies. Vorzugsweise stammt Ubiquitin von einem Säugetier. Noch bevorzugter ist das Ubiquitin menschliches Ubiquitin. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform weist das Ubiquitin die Aminosäuresequenz auf, die in 15A dargestellt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn Ubiquitin an ein Targetprotein ligiert ist, wird auf dieses Protein zum Abbau durch das 26S-Proteasom abgezielt.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung verwenden ein 76-Aminosäure-Ubiquitin menschlichen Ursprungs. Andere Ausführungsformen verwenden wie nachstehend weiters beschrieben Varianten von Ubiquitin.
Von „Ubiquitin" sind auch natürlich auftretende Allele und künstlich hergestellte Varianten eines solchen 76-Aminosäurepolypeptids umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Ubiquitin die Aminosäuresequenz auf, die in ATCC Zugriffsnummer P02248 dargestellt ist, die hierin durch Verweis aufgenommen ist. ATCC-Zugriffsnummern sind in Genbank zu finden. Sequenzen von GenBank-Zugriffsnummern sind hierin durch Verweis aufgenommen. GenBank ist fachbekannt, siehe z. B. D. A. Benson et al., Nucleic Acids Research 26, 1–7 (1998), und http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Vorzugsweise weist das Ubiquitin die Aminosäuresequenz auf, die in 15A dargestellt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform haben die Varianten von Ubiquitin ein gesamte Aminosäuresequenzidentität von vorzugsweise mehr als etwa 75%, noch bevorzugter mehr als etwa 80%, noch bevorzugter mehr als 85% und am bevorzugtesten mehr als 90%, der Aminosäuresequenz, die in 15A dargestellt ist. In einigen Ausführungsformen beträgt die Sequenzidentität etwa 93 bis 95 oder 98%.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform hat ein Ubiquitinprotein eine gesamte Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz, die in 15A dargestellt ist, von mehr als etwa 80%, noch bevorzugter mehr als etwa 85%, noch bevorzugter mehr als etwa 90% und am bevorzugtesten mehr als 93%. In einigen Ausführungsformen beträgt die Sequenzidentität etwa 95 bis 98 oder 99%.
Wie fachbekannt ist, kann eine Reihe an verschiedenen Programmen verwendet werden, um zu identifizieren, ob ein Protein (oder Nucleinsäure wie nachstehend diskutiert) Sequenzidentität oder -ähnlichkeit zu einer bekannten Sequenz aufweist. Sequenzidentität und/oder -ähnlichkeit wird unter Verwendung fachbekannter Standardverfahren, einschließlich aber nicht ausschließlich eines lokalen Sequenzidentitätsalgorithmus von Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981), durch den Sequenzidentitätsanordnungsalgorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443 (1970), durch das Verfahren der Suche nach Ähnlichkeiten von Pearson & Lipman, PNAS USA 85, 2444 (1988), durch computerisierte Implementationen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), das „Best Fit Sequence Program", beschrieben von Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12, 387–395 (1984), vorzugsweise unter Verwendung von Voreinstellungen, oder durch Untersuchung bestimmt. Vorzugsweise wurde die prozentuelle Identität durch FastDB basierend auf den folgenden Parametern berechnet: mismatch penalty von 1, gap penalty von 1, gap size penalty von 0,33 und joining penalty von 30, „Current Methods in Sequence Comparison and Analysis", Macromolecular Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, 127–149, Alan R. Liss, Inc (1988).
Ein Beispiel für einen nützlichen Algorithmus ist PILEUP. PILEUP schafft eine multiple Sequenzanordnung aus einer Gruppe verwandter Sequenzen unter Verwendung progressiver, paarweiser Anordnungen. Er kann auch einen Baum abbilden, der Clustering-Beziehungen zeigt, die verwendet werden, um die Anordnung zu schaffen. PILEUP verwendet eine Vereinfachung der progressiven Anordnung von Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35, 351–360 (1987). Das Verfahren ähnelt dem von Higgins & Sharp, CABIOS 5, 151–153 (1989), beschriebenen Verfahren. Nützliche PILEUP-Parameter umfassen ein default gap weight von 3,00, ein default gap length weight von 0,10 und weighted end gaps.
Ein anderes Beispiel für einen nützlichen Algorithmus ist der BLAST-Algorithmus, der in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990), und Karlin et al., PNAS, USA 90, 5873–5787 (1993), beschrieben ist. Ein besonders nützliches BLAST-Programm ist das WU-BAST-2-Programm, das von Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460m480 (1996), http://blast.wustl/edu/blast/README.html, erhalten wurde. WU-BLAST-2 verwendet mehrere Suchparameter, wovon die meisten auf Standardwerte eingestellt wurden. Die anpassbaren Parameter weisen die folgenden Werte auf: overlap span = 1, overlap span = 0,125, Word threshold (T) = 11. Die HSP-S- und HSP-S2-Parameter sind dynamische Werte und werden vom Programm selbst geschaffen, abhängig von der Zusammensetzung der speziellen Sequenz und Zusammensetzung der speziellen Datenbank, gegen welche die Sequenz von Interesse gesucht wird, jedoch können die Werte angepasst werden, um Empfindlichkeit zu erhöhen.
Ein weiterer nützlicher Algorithmus ist gapped BLAST, wie von Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402, beschrieben. Gapped BLAST verwendet BLOSUM-62-Substitutionswerte, einen Threshold-T-Parameter, der auf 9 eingestellt ist, das 2-Treffer-Verfahren zum Auslösen von Extensionen ohne Lücken, kostet den Lückenlängen k 10+k₁ X_u ist auf 16 eingestellt, und X_g ist für das Datenbanksuchstadium auf 40 eingestellt und für das Output-Stadium der Algorithmen auf 67. Anordnungen mit Lücken werden durch einen Wert ausgelöst, der ~22 Bit entspricht.
Ein prozentueller Aminosäuresequenzidentitätswert wird durch die Zahl an übereinstimmenden identischen Resten bestimmt, die durch die Gesamtzahl von Resten der „längeren" Sequenz in der angeordneten Region geteilt wird. Die „längere" Sequenz ist jene, die über die meisten tatsächlichen Reste in der angeordneten Region verfügen (Lücken, die durch WU-Blast-2 eingeführt werden, um den Anordnungswert zu maximieren, werden ignoriert).
Die Anordnung kann die Einführung von Lücken in die anzuordnenden Sequenzen umfassen. Zusätzlich dazu versteht sich für Sequenzen, die entweder mehr oder weniger Aminosäuren als die Aminosäuresequenz umfassen, die in 15A dargestellt ist, dass in einer Ausführungsform der Prozentsatz von Sequenzidentität basierend auf der Zahl an identischen Aminosäuren im Verhältnis zur Gesamtzahl an Aminosäuren bestimmt wird. Daher wird zum Beispiel in einer Ausführungsform Sequenzidentität von Sequenzen, die kürzer ist als die Sequenz, die in 15A dargestellt ist, wie nachstehend diskutiert, unter Verwendung der Zahl an Aminosäuren in der kürzeren Sequenz bestimmt. In prozentueller Identitätsberechnung wird relatives Gewicht nicht verschiedenen Manifestationen von Sequenzvariationen, wie z. B. Insertionen, Deletionen, Substitutionen etc., zugeschrieben.
In einer Ausführungsform werden nur Identitäten positiv beurteilt (+1), und allen Formen von Sequenzvariationen, einschließlich Lücken, wird ein Wert von „0" zugeschrieben, der den Bedarf an einem gewichteten Wert oder Parameter wie nachstehend für Sequenzähnlichkeitsberechnungen beschrieben erübrigt. Prozentuelle Sequenzidentität kann z. B. durch die Dividieren der Zahl an übereinstimmenden identi schen Resten durch die Gesamtzahl an Resten der „kürzeren" Sequenz in der angeordneten Region und die Multiplikation mit 100 berechnet werden. Die „längere" Sequenz ist eine, die über die meisten tatsächlichen Reste in der angeordneten Region verfügt.
Ubiquitin-Proteine der vorliegenden Erfindung können kürzer oder länger als die in 15A dargestellte Aminosäuresequenz sein. Daher sind in einer bevorzugten Ausführungsform, die in die Definition von Ubiquitin aufgenommen ist, Abschnitte oder Teile der Aminosäuresequenz enthalten, die in 15A dargestellt ist. In einer hierin angeführten Ausführungsform werden Fragmente von Ubiquitin als Ubiquitin-Proteine angesehen, wenn sie durch Ubiquitin-Ligase-Enzyme an ein anderes Polypeptid gebunden werden.
Wie nachstehend deutlicher ausgeführt wird, kann zusätzlich dazu Ubiquitin länger hergestellt werden als die in 15A dargestellte Aminosäuresequenz, z. B. durch Hinzufügung von Markierungen, Hinzufügung anderer Fusionssequenzen oder Aufklärung zusätzlicher kodierender und nicht-kodierender Sequenzen. Wie nachstehend beschrieben ist die Fusion eines Ubiquitin-Peptids an ein Fluoreszenzpeptid, wie z. B. grünfluoreszierendes Peptid (GFP), besonders bevorzugt.
Das Ubiquitin-Protein sowie andere Proteine der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise rekombinant. Ein „rekombinantes Protein" ist ein Protein, das unter Verwendung von Rekombinationsverfahren, d. h. durch die Expression einer rekombinanten Nucleinsäure wie nachstehend beschrieben, hergestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Ubiquitin der Erfindung durch die Expression einer Nucleinsäure wie in ATCC Zugriffsnummer M26880 oder AB003730 angeführt, oder eines Fragments davon hergestellt. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform kodiert die Nucleinsäure für die Aminosäuresequenz, die in 15A dargestellt ist. Ein rekombinantes Protein unterscheidet sich von natürlich auftretendem Protein durch zumindest eine oder mehrere Eigenschaften. Zum Beispiel kann das Protein isoliert oder aus einigen oder allen Proteinen und Verbindungen isoliert oder gereinigt werden, mit welchen es normalerweise in seinem Wildtypwirt assoziiert ist, und kann daher im Wesentlichen rein sein. Zum kann daher im Wesentlichen rein sein. Zum Beispiel wird ein isoliertes Protein nicht von zumindest ein wenig Material begleitet, mit welchem es normalerweise in seinem natürlichen Zustand assoziiert ist, was vorzugsweise zumindest etwa 0,5 Gew.-%, noch bevorzugter zumindest etwa 5 Gew.-%, des gesamten Proteins in einer bestimmten Probe ausmacht. Ein im Wesentlichen reines Protein umfasst zumindest etwa 75 Gew.-% des gesamten Proteins, wobei zumindest etwa 80% bevorzugt sind und zumindest etwa 80% besonders bevorzugt sind. Die Definition umfasst die Produktion eines Proteins aus einem Organismus in einem anderen Organismus oder einer Wirtszelle. Alternativ dazu kann das Protein durch die Verwendung eines induzierbaren Promoters oder Hochexpressionspromotors in einer signifikant höheren Konzentration hergestellt werden als normalerweise zu beobachten ist, sodass das Protein in erhöhten Konzentrationsausmaßen hergestellt wird. Alternativ dazu kann das Protein in einer Form vorliegen, die normalerweise nicht in Natur zu finden ist, wie bei der Hinzufügung einer Epitopmarkierung oder Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und -deletionen wie nachstehend beschrieben.
Wie hierin verwendet und nachstehend weiter definiert kann sich „Nucleinsäure" entweder auf DNA oder RNA beziehen oder Moleküle, die sowohl Desoxy- als auch Ribonucleotide enthalten. Die Nucleinsäuren umfassen genomische DNA, cDNA und Oligonucleotide, einschließlich Sense- und Anti-Sense-Nucleinsäuren. Solche Nucleinsäuren können auch Modifikationen im Ribose-Phosphat-Gerüst enthalten, um Stabilität und Halbwertszeit solcher Moleküle in physiologischen Umgebungen zu erhöhen.
Die Nucleinsäure kann doppelsträngig, einzelsträngig sein oder Abschnitte von sowohl doppelsträngigen als auch einzelsträngigen Sequenzen enthalten. Wie Fachleuten klar ist, definiert die Darstellung eines einzelnen Strangs („Watson") auch die Sequenz des anderen Strangs („Crick"), daher umfassen die Sequenzen, die in den 1 und 3 dargestellt sind, auch das Komplement der Sequenz. Unter dem hierin angeführten Begriff „rekombinante Nucleinsäure" versteht man Nucleinsäure, die ursprünglich in vitro gebildet wird, im Allgemeinen durch die Manipulation von Nucleinsäure durch Endonucleasen, in einer Form, die normalerweise in der Natur nicht zu finden ist. Daher werden eine isolierte Nucleinsäure in einer linearen Form oder ein Expressionsvektor, der in vitro durch Ligation von DNA-Molekülen gebildet wird, die normalerweise nicht verbunden werden, beide für die Zwecke dieser Erfindung als rekombinant angesehen. Es versteht sich, dass, sobald eine rekombinante Nucleinsäure hergestellt und in eine Wirtszelle oder einen Organismus eingeführt wird, sie sich nicht-rekombinant repliziert, d. h. unter Verwendung der In-vivo-Zeltmaschinerie der Wirtszelle statt bei In-vitro-Manipulationen, jedoch werden solche Nucleinsäuren, sobald sie rekombinant produziert wurden, obwohl sie in der Folge nicht-rekombinant repliziert wurden, dennoch für die Zwecke der Erfindung als rekombinant erachtet.
Die Begriffe „Polypeptide" und „Proteine" können austauschbar in der gesamten Anmeldung verwendet werden und stehen für zumindest zwei kovalent gebundene Aminosäuren, die Proteine, Polypeptide, Oligopeptide und Peptide umfassen. Das Protein kann aus natürlich auftretenden Aminosäuren und Peptidbindungen oder synthetischen Peptidmimetikastrukturen bestehen. Daher stehen "Aminosäure" oder „Peptidrest" wie hierin verwendet sowohl für natürlich auftretende als auch synthetische Aminosäuren. Zum Beispiel werden Homo-Phenylalanin, Citrullin und Norleucin als Aminosäuren für die Zwecke der Erfindung angesehen. „Aminosäure" umfasst auch Iminosäurereste, wie z. B. Prolin und Hydroxyprolin. Die Seitenketten können entweder die (R)- oder (S)-Konfiguration sein. In der bevorzugten Ausführungsform liegen die Aminosäuren in der (S)- oder L-Konfiguration vor. Wenn nicht-natürlich auftretende Seitenketten verwendet werden, können Nicht-Aminosäuresubstitutionen verwendet werden, zum Beispiel zum Vermeiden oder Verzögern von In-vivo-Abbau.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die Proteinvarianten enthalten, z. B. Ubiquitin-, E1-, E2- und/oder E3-Varianten. Diese Varianten fallen in eine oder mehr von drei Klassen: Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten. Diese Varianten werden üblicherweise unter Verwendung von Kassetten- oder PCR-Mutagenese oder anderer fachbekannter Verfahren durch ortsspezifische Mutagenese von Nucleotiden in der DNA, die für ein Protein der vorliegenden Zusammensetzungen kodiert, um DNA zu produzieren, die für die Variante kodiert, und anschließendes Exprimieren der DNA in rekombinanter Zellkultur wie oben angeführt hergestellt. Jedoch können Proteinfragmentvarianten, die über bis zu etwa 100–150 Reste verfügen, durch In-vitro-Synthese unter Verwendung etablierter Verfahren hergestellt werden. Aminosäuresequenzvarianten sind durch das vorgegebene Wesen der Variation, einer Eigenschaft, die diese von natürlich auftretenden Allelen oder Interspezies-Variation der Proteinaminosäuresequenz trennt, gekennzeichnet. Die Varianten weisen typischerweise dieselbe qualitative biologische Aktivität wie das natürlich auftretende Analogon auf, obwohl auch Varianten ausgewählt werden können, die modifizierte Eigenschaften aufweisen, wie nachstehend genauer angeführt wird.
Während die Stelle oder Region zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation vorgegeben wird, muss die Mutation per se nicht vorgegeben sein. Zum Beispiel kann zur Optimierung der Leistung einer Mutation an einer vorgegebenen Stelle Zufallsmutagenese am Targetcodon oder der Targetregion durchgeführt werden und die exprimierten Varianten auf die optimale gewünschte Aktivität gescreent werden. Verfahren zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorgegebenen Stellen in DNA, die über eine bekannte Sequenz verfügt, sind fachbekannt, z. B. M13-Primer-Mutagenese und PCR-Mutagenese. Rasche Produktion vieler Varianten kann unter Verwendung von Verfahren, wie z. B. dem Verfahren des Gen-Shufflings, durchgeführt werden, wodurch sich Fragmente ähnlicher Varianten einer Nucleotidsequenz rekombinieren dürfen, um neue Variantenkombinationen zu produzieren. Beispiele für solche Verfahren sind in US-Patent Nr. 5.605.703 , 5.811.238 , 5.873.458 , 5.830,696 , 5.939.250 , 5.763.239 , 5.965.408 und 5.945.325 zu finden, wovon jedes in seiner Gesamtheit hierin durch Verweis aufgenommen ist. Screening der Mutanten wird durch die Verwendung von Ubiquitin-Ligaseaktivitätstests der vorliegenden Erfindung durchgeführt.
Aminosäuresubstitutionen sind typisch für einzelne Reste, Insertionen liegen üblicherweise in der Größenordnung von etwa 1 bis 20 Aminosäuren vor, obwohl beträchtlich größere Insertionen toleriert werden können. Deletionen reichen von etwa 1 bis etwa 20 Resten, obwohl in einigen Fällen Deletionen viel größer sein können.

Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder eine beliebige Kombination davon können verwendet werden, um zu einem Endderivat zu gelangen. Im Allgemeinen werden diese Veränderungen auf einigen Aminosäuren durchgeführt, um die Änderung des Moleküls zu minimieren. Jedoch können größere Veränderungen unter bestimmten Umständen toleriert werden. Wenn kleine Änderungen in den Eigenschaften des Proteins wünschenswert sind, werden Substitutionen im Allgemeinen gemäß der folgenden Tabelle hergestellt. Tabelle I

Ursprünglicher Rest	Exemplarische Substitutionen
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser, Ala
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gin, Glu
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Wesentliche Änderungen der Funktion oder immunologischen Identität werden durch Selektion von Substitutionen durchgeführt, die weniger konservativ sind als jene, die in Tabelle I angeführt sind. Zum Beispiel können Substitutionen durchgeführt werden, die viel signifikanter Folgendes beeinflussen: die Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Änderung, zum Beispiel die Alpha-Helix- oder Beta-Faltblatt-Struktur; die Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Targetstelle; oder die Sperrigkeit der Seitenkette. Die Substitutionen, von denen im Allgemeinen erwartet wird, dass sie die größten Veränderungen in den Polypeptid-Eigenschaften produzieren, sind jene, in welchen (a) ein hydrophiler Rest, z. B. Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest, z. B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl, substituiert wird; (b) ein Cystein oder Prolin für (oder durch) einen beliebigen anderen Rest substituiert wird; (c) ein Rest, der über eine elektropositive Seitenkette verfügt, z. B. Lysyl, Arginyl, oder Histidyl, für (oder durch) einen elektronegativen Rest, z. B. Glutamyl oder Aspartyl, substituiert wird; oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z. B. Phenylalanin, für (oder durch) einen, der über keine Seitenkette verfügt, z. B. Glycin, substituiert wird.
Die Varianten zeigen typischerweise dieselbe qualitative biologische Aktivität und lösen dieselben Immunreaktion aus wie das natürlich auftretende Analogon, obwohl auch Varianten ausgewählt werden, um die Eigenschaften der Proteine wie nötig zu modifizieren. Alternativ dazu kann die Variante so entworfen sein, dass die biologische Aktivität des Proteins geändert wird. Zum Beispiel können Glykosylierungsstellen geändert oder entfernt werden.
Kovalente Modifikationen von Polypeptiden sind im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten. Eine Form von kovalenter Modifikation umfasst die Umsetzung von Aminosäureresten eines Polypeptids, auf die abgezielt wird, mit einem organischen derivatisierenden Mittel, das in der Lage ist, sich mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten eines Polypeptids umzusetzen. Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist z. B. zur Vernetzung eines Proteins mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren für Screeningtests nützlich, wie nachstehend detaillierter beschrieben ist. Häufig verwendete Vernet zungsmittel umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, Hydro xysuccinimidester, z. B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie z. B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide, wie z. B. Bis-N-maleinimid-1,8-octan, und Mittel, wie z. B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
Andere Modifikationen umfassen Desamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der "-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung einer beliebigen C-terminalen Carboxylgruppe.
Eine andere Form von kovalenter Modifikation eines Polypeptids, die im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten ist, umfasst die Änderung des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. „Änderung des nativen Glykosylierungsmusters" steht hierin für die Deletion einer oder mehrer Kohlenhydratgruppierungen, die im Nativsequenzpolypeptid zu finden sind, und/oder Hinzufügung einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenzpolypeptid nicht gegenwärtig sind.
Hinzufügung von Glykosylierungsstellen zu Polypeptiden kann durch Änderung der Aminosäuresequenz davon erreicht werden. Die Änderung kann z. B. durch Hinzufügung von oder Substitution durch einem/einen oder mehrere(n) Serin- oder Threoninreste(n) zum Nativsequenzpolypeptid (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) hergestellt werden. Die Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Veränderung auf DNA-Ebene geändert werden, insbesondere durch Mutation der DNA, die für das Polypeptid kodiert, an vorausgewählten Basen, sodass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatieren.
Ein anderes Mittel zur Steigerung der Zahl an Kohlenhydratgruppierungen auf einem Polypeptid erfolgt durch chemische oder enzymatische Kopplung von Glykosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren sind im Fachgebiet beschrieben, z. B. in WO 87/05330 , veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. 259–306 (1981).
Entfernung von Kohlenhydratgruppierungen, die auf dem Polypeptid gegenwärtig sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitution von Codons erreicht werden, die für Aminosäurereste kodieren, die als Targets für Glykosylierung dienen. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind fachbekannt und z. B. von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen auf Polypeptiden können durch die Verwendung einer Vielzahl an Endo- und Exoglykosidasen wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben erreicht werden.
Eine andere Form von kovalenter Modifikation eines Proteins umfasst die Verbindung des Polypeptids mit einem einer Vielzahl von nicht-proteinartigen Polymeren, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, in der Art und Weise, wie in den US-Patenten Nr. 4.640.835 , 4.496.689 , 4.301.144 , 4.670.417 , 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben ist.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ebenfalls auf eine Art und Wiese modifiziert werden, um chimäre Moleküle zu bilden, die ein erstes Polypeptid umfassen, das an ein(e) andere(s), heterologe(s) Polypeptid oder Aminosäuresequenz fusioniert ist. In einer Ausführungsform umfasst ein solches chimäres Molekül eine Fusion eines Ubiquitin-Polypeptids (oder wie nachstehend beschrieben ein E2 oder E3) mit einem Markierungspolypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an welches sich ein Anti-tag-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitopmarkierung ist im Allgemeinen an den Amino- oder Carboxyl-Terminus des Polypeptids gebunden. Die Gegenwart solcher epitopmarkierter Formen eines Polypeptids kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Tag-Polypeptid detektiert werden. Auch ermöglicht die Bereitstellung einer Epitopmarkierung dem Polypeptid, einfach durch Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Tag-Antikörpers oder einer anderen Form von Affinitätsmat rix, die sich an die Epitopmarkierung bindet, gereinigt zu werden. In einer alternativen Ausführungsform kann das chimäre Molekül eine Fusion eines hierin offenbarten Polypeptids mit einem Immunglobulin oder einer besonderen Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine bivalente Form des chimären Moleküls könnte eine solche Fusion an die Fc-Region eines IgG-Moleküls erfolgen. Markierungen für Komponenten der Erfindung sind nachstehend definiert und im Detail beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Testen von Ubiquitinligase-Aktivität bereit. Unter „Ubiquitinligase" versteht man ein Ubiquitinierungsenzym, das in der Lage ist, die kovalente Bindung eines Ubiquitins an ein anderes Protein zu katalysieren. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen die Kombination von Ubiquitin und Ubiquitinenzymen, einschließlich Ubiquitinligase, unter Bedingungen, unter welchen Ubiquitinierungen stattfinden können, und Messung der Menge an Ubiquitin (Poly-Ubiquitin), gebunden an die Ubiquitinligase. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Ubiquitinligase eine E3-Ubiquitinligase, die nachstehend beschrieben ist.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die Bindung von Ubiquitin an ein Ubiquitinierungssubstratprotein. Unter „Ubiquitinierungssubstratprotein" versteht man ein Protein, an welches die Ubiquitin-Ligase die kovalente Bindung von Ubiquitin katalysieren kann, und umfasst Targetprotein und Ubiquitin. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ubiquitinierungssubstratprotein Ubiquitin, und die Ubiquitinligase katalysiert die Bildung von Polyubiquitinketten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Polyubiquitin-Ketten durch die Ubiquitin-Ligase in Abwesenheit eines beliebigen Targetproteins gebildet.
In einem Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Testen von Ubiquitinierung bereit. In diesen Tests können die Wechselwirkungen verschiedener Ubiquitinierungsenzyme, die Wechselwirkungen verschiedener Untereinheiten von individuellen Ubiquitinierungsenzymen und der Einfluss von Ubiquitinierungsmodulator-Kandidaten beobachtet und gemessen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung auf ein Verfahren zum Testen von Ubiquitinligase-Aktivität ausgerichtet. Unter „Ubiquitinligase-Aktivität", „Ubiquitinligation" und grammatikalischen Äquivalenten davon versteht man die Katalyse der kovalenten Bindung von Ubiquitin an ein Substratprotein. Vorzugsweise ist jedes Ubiquitin gebunden, sodass ein nachfolgendes Ubiquitinpolypeptid daran gebunden werden kann, um Ketten zu bilden, die eine Vielzahl an Ubiquitinmolekülen umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform tritt Ubiquitinligase-Aktivität in Abwesenheit von Targetproteinen auf, daher ist das Substratprotein Ubiquitin.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung zusätzlich dazu auf ein Verfahren zum Testen von Ubiquitin-Aktivierungsaktivität ausgerichtet. Unter „Ubiquitin-Aktivierungsaktivität", „Ubiquitin-Aktivierung" und grammatikalischen Äquivalenten davon versteht man die Verbindung von Ubiquitin und E1. Vorzugsweise bildet E1 eine energiereiche Thiolesterbindung mit dem Ubiquitin.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung auch auf ein Verfahren zum Testen der Ubiquitin-Konjugationsaktivität ausgerichtet. Unter „Ubiquitin-Konjugationsaktiviät", „Ubiquitinkonjugation" und grammatikalischen Äquivalenten davon versteht man die Verbindung von aktiviertem Ubiquitin mit einem E2. Wie Fachleuten klar ist, kann aufgrund der Gegenwart von energiereicher Thiolesterbindung im E2-Ubiquitinkonjugat konjugiertes Ubiquitin an ein anderes Ubiquitin in einer geringen Geschwindigkeit in Abwesenheit der katalytischen Aktivität von E3 gebunden werden. Deshalb liegt ein Teil des in einem Ubiquitinkonjugationsaktivitätstest gemessenen Ubiquitins in Form von Poly-Ubiquitin vor.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die die Kombination von Ubiquitin mit anderen Komponenten umfassen. Unter „Kombination" versteht man die Hinzufügung der verschiedenen Komponenten in ein Gefäß unter Bedingungen, unter welchen Ubquitinaseaktivität oder Ubiquitinierung stattfinden können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gefäß ein Well einer 96-Well-Platte oder eine andere im Handel erhältliche Multiwellplatte. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Gefäß das Reaktionsgefäß einer FACS-Maschine.
Andere in der vorliegenden Erfindung nützliche Gefäße umfassen unter anderem 384-Well-Platten und 1536-Well-Platten. Wieder andere in der vorliegenden Erfindung nützliche Gefäße sind Fachleuten bekannt.
Die Hinzufügung von Komponenten kann nacheinander oder in einer vorgegebenen Reihenfolge oder Gruppierung erfolgen, solange die Bedingungen erhalten werden, die Ubiquitin-Ligase-Aktivität zugänglich sind. Solche Bedingungen sind fachbekannt, und weitere Hinweise sind nachstehend bereitgestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen eine oder mehrere Komponenten der vorliegenden Erfindung eine Markierung. Unter „Markierung" versteht man ein angeheftetes Molekül oder angeheftete Moleküle, die zur Identifikation oder Isolation der angehefteten Komponente nützlich sind. Komponenten, die über eine Markierung verfügen, werden als „Tag-X" bezeichnet, worin X die Komponente ist. Zum Beispiel wird ein Ubiquitin, das eine Markierung umfasst, hierin als „Markierungs-Ubiquitin" bezeichnet. Vorzugsweise ist die Markierung kovalent an die angeheftete Komponente gebunden. Wenn mehr als eine Komponente einer Kombination eine Markierung aufweist, werden die Markierungen zum Zwecke der Identifikation nummeriert, zum Beispiel „tag1-Ubiquitin". Komponenten können mehr als eine Markierung umfassen, in diesem Fall wird jede Markierung nummeriert, zum Beispiel „tag1,2-Ubiquitin". Bevorzugte Markierungen umfassen unter anderem eine Markierung, einen Partner eines Bindungspaars und ein Oberflächensubstratbindungsmolekül. Wie Fachleuten bekannt ist, finden viel Moleküle Anwendung als mehr als eine Form von Markierung, abhängig davon, wie die Markierung verwendet wird.
Unter „Markierung" versteht man ein Molekül, das direkt (d. h. eine primäre Markierung) oder indirekt (d. h. eine sekundäre Markierung) detektiert werden kann. Zum Beispiel kann eine Markierung sichtbar gemacht und/oder gemessen oder auf andere Weise identifiziert werden, sodass ihre Gegenwart oder Abwesenheit bekannt sein kann. Wie Fachleuten klar ist, hängt die Art, in welcher dies durchgeführt wird, von der Markierung ab. Bevorzugte Markierungen umfassen unter anderem Fluoreszenzmarkierungen, Markierungsenzyme und Radioisotope.
Unter „Fluoreszenzmarkierung" versteht man ein beliebiges Molekül, das über seine inhärenten Fluoreszenzeigenschaften detektiert werden kann. Geeignete Fluoreszenzmarkierungen umfassen unter anderem Fluorescein, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Eosin, Erythrosin, Cumarin, Methylcumarine, Pyren, Malachitgrün, Stilben, Luzifer-Gelb, Cascade-Blau^TM, Texas-Rot, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, IC-Rot 640, Cy 5, Cy 5.5, LC-Rot-705 und Oregongrün. Geeignete optische Farbstoffe sind im „Molecular Probes Handbook" von Richard P. Haugland (1996) beschrieben, hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen. Geeignete Fluoreszenzmarkierungen umfassen auch unter anderem grünfluoreszierendes Protein (GFP; Chalfie et al., Science 263 (5148), 802–805 (11. Februar, 1994), und EGFP (Clontech Genbank Zugriffsnummer U55762), blaufluoreszierendes Protein (BFP; 1. Quantum Biotechnologies, Inc., 1801 de Maisonneuve Blvd. West, B. Stock, Montreal (Quebec) Kanada H3H 1J9, 2. R. H. Stauber, Biotechniques 24(3), 462–471 (1998), 3. R. Heim und R. Y. Tsien, Curr. Biol. 6, 178–182 (1996)), verstärktes gelbfluoreszierendes Protein (EYFP; 1. Clontech Laborstories, Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303), Luciferase (Ichicki et al., J. Immunol. 150 (12), 5408–5417 (1993)), β-Galactosidase (Nolan et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85(8), 2603–2607 (April 1988), und Renilla, WO 92/15673 ; WO 95/07463 ; WO 98/14605 ; WO 98/26277 ; WO 99/49019 , US-Patent Nr. 5.292.658 , US-Patent Nr. 5.418.155 ; US-Patent Nr. 5.683.888 , US-Patent Nr. 5.741.668 , US-Patent Nr. 5.777.079 , US-Patent Nr. 5.804.387 , US-Patent Nr. 5.874.304 , US-Patent Nr. 5.876.995 und US-Patent Nr. 5.925.558 ). Alle der oben erwähnten Verweise sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.
In einigen Fällen werden mehrere Fluoreszenzmarkierungen verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zumindest zwei Fluoreszenzmarkierungen verwendet, die Elemente eines Fluoreszenzresonanzenergietransfer- (FRET-) Paars sind. FRET ist ein fachbekanntes Phänomen, worin Anregung eines Fluoreszenzfarbstoffs auf einen anderen ohne Emission eines Photons transferiert wird. Ein FRET-Paar besteht aus einem Donor-Fluorophor und einem Akzeptor-Fluorophor. Das Fluoreszenzemissionsspektrum des Donors und das Fluoreszenzabsorptionsspektrum des Akzeptors müssen einander überlappen, und die zwei Moleküle müs sen sich in enger Nähe zueinander befinden. Die Entfernung zwischen Donor und Akzeptor, bei welcher 50% der Donoren deaktiviert werden (Energietransfer auf den Akzeptor), wurde durch den Förster-Radius (R₀) definiert, der typischerweise 10–100 Å beträgt. Veränderungen des Fluoreszenzemissionsspektrums, das FRET-Paare umfasst, können detektiert werden, was Veränderungen der Zahl jener Paare mit sich bringt, die sich in enger Nähe befinden (d. h. innerhalb von 100 Å voneinander). Dies resultiert typischerweise aus der Bindung oder Trennung zweier Moleküle, wovon eines mit einem FRET-Donor markiert ist und das andere mit einem FRET-Akzeptor markiert ist, worin eine solche Bindung das FRET-Paar in enge Nähe bringt. Bindung solcher Moleküle resultiert in einer erhöhten Fluoreszenzemission des Akzeptors und/oder Quenching der Fluoreszenzemission des Donors.
FRET-Paare (Donor/Akzeptor), die in der Erfindung nützlich sind, umfassen unter anderem EDANS/Fluorescein, IAEDANS/Fluorescein, Fluorescein/Tetramethylrhodamin, Fluorescein/LC-Rot-640, Fluorescein/Cy 5, Fluorescein/Cy 5.5 und Fluorescein/LC-Rot 705.
in einem anderen Aspekt von FRET können ein Fluoreszenzdonormolekül und ein nicht-fluoreszierendes Akzeptormolekül („Quencher") verwendet werden. In dieser Anmeldung steigt die Fluoreszenzemission des Donors, wenn der Quencher aus der engen Nähe zum Donor verdrängt wird, und Fluoreszenzemission wird verringert, wenn der Quencher in enge Nähe zum Donor gebracht wird. Nützliche Quencher umfassen unter anderem DABCYL, QSY7 und QSY 33. Nützliche Fluoreszenz-Donor/Quencher-Paare umfassen unter anderem EDANS/DABCYL, Texas-Rot/DABCYL, BODIPY/DABCYL, Luzifergelb/DABCYL, Cumarin/DABCYL und Fluorescein/QSY-7-Farbstoff.
Der Fachmann versteht, dass FRET und Fluoreszenz-Quenching die Überwachung der Bindung von markierten Molekülen über einen gewissen Zeitraum ermöglichen, was kontinuierliche Information hinsichtlich des Zeitverlaufs von Bindungsreaktionen ermöglicht.
Es ist wichtig, daran zu erinnern, dass Ubiquitin an Substratprotein durch seine terminale Carboxylgruppe an einen Lysinrest, einschließlich Lysinreste auf einem anderen Ubiquitin, gebunden ist. Deshalb soll die Anheftung von Markierungen oder anderen Tags keine dieser aktiven Gruppen auf dem Ubiquitin beeinflussen. Aminosäuren können durch fachbekannte und hierin beschriebene Mittel zur Proteinsequenz hinzugefügt werden, und zwar für den ausdrücklichen Zweck, einen Anheftungspunkt für eine Markierung bereitzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden eine oder mehrere Aminosäuren zur Sequenz einer Komponente hinzugefügt, um ein Tag daran anzuheften, vorzugsweise eine Fluoreszenzmarkierung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäure, an welche eine Fluoreszenzmarkierung angeheftet wird, Cystein.
Unter „Markierungsenzym" versteht man ein Enzym, das in Gegenwart eines Markierungsenzymsubstrats umgesetzt werden kann, das ein detektierbares Produkt produziert. Geeignete Markierungsenzyme zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen unter anderem Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase und Glucoseoxidase. Verfahren zur Verwendung solcher Substrate sind fachbekannt. Die Gegenwart des Markierungsenzyms wird im Allgemeinen durch die Katalyse des Enzyms einer Reaktion mit einem Markierungsenzymsubstrat gezeigt, die ein identifizierbares Produkt produziert. Solche Produkte können opak sein, wie z. B. die Reaktion von Meerrettich-Peroxidase mit Tetramethylbenzedin, und können eine Reihe verschiedener Farben aufweisen. Andere Markierungsenzymsubstrate, wie z. B. Luminol (erhältlich von Pierce Chemical Co.), sind entwickelt worden, die Fluoreszenzreaktionsprodukte produzieren. Verfahren zur Identifikation von Markierungsenzymen mit Markierungsenzymsubstraten sind fachbekannt, und viele Sets sind im Handel erhältlich. Beispiele und Verfahren zur Verwendung verschiedener Markierungsenzyme sind in Savage et al., Previews 247, 6–9 (1998), Young, J. Virol. Methods 24, 227–236 (1989), beschrieben, die hierin in ihrer Gesamtheit durch Verweis aufgenommen sind.
Unter „Radioisotop" versteht man ein radioaktives Molekül. Geeignete Radioisotope für die Verwendung in der Erfindung umfassen unter anderem ¹⁴C, ³H, ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I und ¹³¹I. Die Verwendung von Radioisotopen als Markierungen ist fachbekannt.
Zusätzlich dazu können Markierungen indirekt detektiert werden, d. h. das Tag ist ein Partner eines Bindungspaars. Unter „Partner eines Bindungspaars" versteht man eine erste und zweite Gruppierung, worin die erste und zweite Gruppierung eine spezifische Bindungsaffinität füreinander haben. Geeignete Bindungspaare für die Verwendung in der Erfindung umfassen unter anderem Antigene/Antikörper (z. B. Digoxigenin/Anti-Digoxigenin, Dinitrophenyl (DNP)/Anti-DNP, Dansyl-X-Anti-Dansyl, Fluorescein/Anti-Fluorescein, Luzifer-Gelb/Anti-Luzifer-Gelb und Rhodamin-Anti-Rhodamin), Biotin/Avidin (oder Biotin/Streptavidin) und Calmodulinbindungsprotein (CBP)/Calmodulin. Andere geeignete Bindungspaare umfassen Polypeptide, wie z. B. das FLAG-Peptid [Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)], das KT3-Epitoppeptid [Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)], Tubulinepitoppeptid [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)] und das T7-Gen-10-Protein-Peptid-Tag [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)] und die Antikörper jedes dazu. Im Allgemeinen kann in einer bevorzugten Ausführungsform der kleinere Bindungspaarpartner als Tag dienen, da räumliche Überlegungen in Ubiquitinligation wichtig sein können. Wie Fachleuten klar ist, können Bindungspaarpartner in Anwendungen verwendet werden, die nicht der Markierung dienen, wie nachstehend weiters beschrieben ist.
Wie Fachleuten klar ist, kann ein Partner eines Bindungspaars auch ein Partner eines anderen Bindungspaars sein. Zum Beispiel kann ein Antigen (erste Gruppierung) sich an einen ersten Antikörper (zweite Gruppierung) binden, der hingegen ein Antigen für einen zweiten Antikörper (dritte Gruppierung) sein kann. Es versteht sich weiters, dass ein solcher Umstand indirekte Bindung einer ersten Gruppierung und einer dritten Gruppierung über eine zweite Gruppierung als Zwischenprodukt, d. h. ein Bindungspaarpartner zu jedem, ermöglicht.
Wie Fachleuten klar ist, kann ein Partner eines Bindungspaars wie oben beschrieben eine Markierung umfassen. Es versteht sich weiters, dass dies ermöglicht, dass ein Tag indirekt durch Bindung eines Bindungspartners, der eine Markierung umfasst, markiert wird. Anheftung einer Markierung an ein Tag, das ein Partner eines Bindungspaars ist, wie zuvor beschrieben, wird hierin als „indirekte Markierung" bezeichnet.
Unter „Oberflächensubstratbindungsmolekül" und grammatikalischen Äquivalenten davon versteht man ein Molekül, das über Bindungsaffinität für ein spezifisches Substrat verfügt, wobei das Substrat im Allgemeinen ein Element eines Bindungspaars ist, das aufgetragen, inkorporiert oder auf andere Weise an eine Oberfläche angeheftet ist. Geeignete Oberflächensubstratbindungsmoleküle und ihre Oberflächen-Substrate umfassen unter anderem Poly-Histidin-(poly-his-) oder Poly-Histidin-Glycin-(poly-his-gly-)Tags und Nickelsubstrat; das Glutathion-S-transferase-tag und sein Antikörpersubstrat (erhältlich von Pierce Chemical), das flu-HA-tag-Polypeptid und sein Antikörper-12CA5-Substrat [Field et al., Mol. Cell Biol. 8, 2159–2165 (1988)], das c-myc-tag und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörpersubstrate dazu [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)] und das Herpes-simplex-Virus-Glykoprotein-D- (gD-) Tag und sein Antikörpersubstrat [Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6), 547–553 (1990)]. Im Allgemeinen umfassen Oberflächenbindungssubstratmoleküle, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, unter anderem Polyhistidinstrukturen (His-tags), die Nickelsubstrate binden, Antigene, die sich an Oberflächen-Substrate binden, die Antikörper umfassen, Haptene, die sich an Avidinsubstrat (z. B. Biotin) binden, und CBP, die sich an Oberflächensubstrat binden, das Calmodulin umfasst.
Produktion von antikörper-eingebetteten Substraten ist fachbekannt, siehe Slinkin et al., Bioconj. Chem. 2, 342–348 (1991), Torchilin et al., siehe oben, Trubetskoy et al., Bioconj. Chem. 3, 323–327 (1992), King et al., Cancer Res. 54, 6176–6185 (1994), und Wilbur et al., Bioconjugate Chem. 5 220–235 (1994) (wovon alle hierdurch durch Verweis ausdrücklich aufgenommen sind), und Anheftung von oder Produktion von Proteinen mit Antigenen ist oben beschrieben.
Calmodulin-eingebettete Substrate sind im Handel erhältlich, und Produktion von Proteinen mit CBP ist in Simcox et al., Strategies 8, 40–43 (1995), beschrieben, das hierdurch durch Verweis in seiner Gesamtheit aufgenommen ist.
Wie Fachleuten klar ist, können tag-Komponenten der Erfindung auf verschiedenste Art hergestellt werden, stark abhängig von der Form des Tags. Komponenten der Erfindung und Tags sind vorzugsweise durch eine kovalente Bindung angeheftet.
Die Produktion von tag-Polypeptiden durch rekombinante Mittel, wenn das Tag auch ein Polypeptid ist, ist nachstehend beschrieben. Produktion von FLAG-markierten Proteinen ist fachbekannt, und Sets für eine solche Produktion sind im Handel erhältlich (zum Beispiel von Kodak und Sigma). Verfahren zur Produktion und Verwendung von FLAG-markierten Proteinen sind z. B. in Winston et al., Genes and Devel. 13, 270–283 (1999), hierin in ihrer Gesamtheit aufgenommen, sowie in Produkthandbüchern zu finden, die mit den oben genannten Sets bereitgestellt werden.
Biotinylierung von Targetmolekülen und Substraten ist fachbekannt, zum Beispiel ist ein große Zahl and Biotinylierungsmitteln, einschließlich aminreaktiver und thiolreaktiver Mittel, für die Biotinylierung von Proteinen, Nucleinsäuren, Kohlenhydraten, Carbonsäuren bekannt; siehe Kapitel 4, Molecular Probes Catalog, Haugland, 6. Auflage (1996), hierin durch Verweis aufgenommen. Ein biotinyliertes Substrat kann an eine biotinylierte Komponente über Avidin oder Streptavidin angeheftet werden. Demähnlich ist auch eine große Zahl an Haptenisierungsreagenzien bekannt (Id.) Verfahren zur Markierung von Proteinen mit Radioisotopen sind fachbekannt. Zum Beispiel sind solche Verfahren in Ohta et al., Molec. Cell 3, 535–541 (1999), zu finden, das hierin in ihrer Gesamtheit durch Verweis aufgenommen ist.
Produktion von Proteinen, die über His-Tags verfügen, durch rekombinante Mittel ist fachbekannt, und Sets zur Produktion solcher Proteine sind im Handel erhältlich. Ein solches Set und seine Verwendung ist in QIAexpress Handbook von Quiagen von Joanne Crowe et al., hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen, beschrieben.
Die Funktionalisierung von Markierungen mit chemisch reaktiven Gruppen, wie Thiolen, Aminen, Carboxylen etc., ist im Allgemeinen fachbekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Tag funktionalisiert, um kovalente Anheftung zu erleichtern.
Die kovalente Anheftung des Tags kann entweder direkt oder über einen Linker erfolgen. In einer Ausführungsform ist der Linker eine relativ kurze Kupplungsgruppierung, die verwendet wird, um die Moleküle anzuheften. Eine Kupplungsgruppierung kann direkt auf einer Komponente der Erfindung, Ubiquitin zum Beispiel, synthetisiert werden und enthält zumindest eine funktionelle Gruppe, um Anheftung des Tags zu erleichtern. Alternativ dazu kann die Kupplungsgruppierung zumindest zwei funktionelle Gruppen aufweisen, die verwendet werden, um eine funktionalisierte Komponente z. B. an ein funktionalisiertes Tag anzuheften. In einer zusätzlichen Ausführungsform ist der Linker ein Polymer. In dieser Ausführungsform wird kovalente Anheftung entweder direkt oder durch die Verwendung von Kupplungsgruppierungen aus der Komponente oder dem Tag an das Polymer erreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die kovalente Anheftung direkt, d. h. es wird kein Linker verwendet. In dieser Ausführungsform enthält die Komponente vorzugsweise eine funktionelle Gruppe, wie z. B. Carbonsäure, die für direkte Anheftung an das funktionalisierte Tag verwendet wird. Es versteht sich, dass die Komponente und das Tag auf eine Reihe von Arten angeheftet wird, einschließlich der oben angeführten. Was wichtig ist, ist, dass die Art der Anheftung die Funktionalität der Komponente nicht signifikant ändert. Zum Beispiel soll in Taq-Ubiquitin das Tag auf eine solche Art angeheftet werden, um dem Ubiquitin zu ermöglichen, kovalent an ein anderes Ubiquitin gebunden zu werden, um Polyubiquitin-Ketten zu bilden. Wie Fachleuten klar ist, wird die obige Beschreibung der kovalenten Anheftung einer Markierung und eines Ubiquitins ebenso auf die Anheftung von im Wesentlichen beliebigen zwei Molekülen der vorliegenden Offenbarung angewendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Tag so funktionalisiert, dass kovalente Anheftung erleichtert wird, wie allgemein oben beschrieben ist. Daher ist eine große Zahl an Tags im Handel verfügbar, die funktionelle Gruppen enthalten, einschließlich unter anderem Isothiocyanatgruppen, Aminogruppen, Halogenacetylgruppen, Malei nimide, Succinimidylester und Sulfonylhalide, wovon alle verwendet werden können, um die Markierung kovalent an ein zweites Molekül anzuheften, wie hierin beschrieben ist. Die Zahl der funktionellen Gruppe des Tags hängt von der Stelle der Anheftung an entweder einen Linker, wie oben angeführt, oder eine Komponente der Erfindung ab. Daher werden zur direkten Bindung an eine Carbonsäuregruppe eines Ubiquitins aminomodifizierte oder hydrazinmodifizierte Tags zur Kupplung über Carbodiimid-Chemie verwendet, zum Beispiel unter Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) auf fachbekannte Weise (siehe Set 9 und Set 11 des Molecular Probes Catalog, siehe oben, siehe auch Pierce Catalog and Handbook, T-155 bis T-200 (1994), wovon beide hierin durch Verweis aufgenommen sind). In einer Ausführungsform wird das Carbodiimid zuerst an das Tag angeheftet, wie es z. B. für viele der hierin beschriebenen Tags im Handel erhältlich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt Ubiquitin in Form von Tag-Ubiquitin vor.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt Ubiquitin in Form von Tag-Ubiquitin vor, worin das Tag ein Partner eines Bindungspaars ist. Vorzugsweise ist das Tag in dieser Ausführungsform FLAG und der Bindungspartner Anti-FLAG. In dieser Ausführungsform ist eine Markierung vorzugsweise durch indirekte Markierung an das FLAG angeheftet. Vorzugsweise ist die Markierung ein Markierungsenzym. Am bevorzugtesten ist das Markierungsenzym Meerrettichperoxidase, die mit einem Fluoreszenzmarkierungsenzymsubstrat umgesetzt wird. Vorzugsweise ist das Markierungsenzymsubstrat Luminol. Alternativ dazu ist die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform liegt Ubiquitin in Form von Tag-Ubiquitin vor, worin das Tag eine Fluoreszenzmarkierung ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegt Ubiquitin in Form von tag1-Ubiquitin und tag2-Ubiquitin vor, worin tag1 und tag2 Elemente eines FRET-Paars sind. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform liegt Ubiquitin in Form von tag1-Ubiquitin und tag2-Ubiquitin vor, worin tag1 eine Fluoreszenzmarkierung und tag2 ein Quencher der Fluoreszenzmarkierung ist. In einer dieser bevorzugten Ausführungsformen, wenn tag1-Ubiquitin und tag2-Ubiquitin durch die Aktivität einer Ubiquitinligase gebunden sind, liegen tag1 und tag2 vorzugsweise innerhalb von 100 Å voneinander, noch bevorzugter innerhalb von 70 Å, noch bevorzugter innerhalb von 50 Å, noch bevorzugter innerhalb von 40 Å und in manchen Fällen vorzugsweise innerhalb von 30 Å oder weniger.
In wieder einer anderen bevorzugten Ausführungsform liegt Ubiquitin in der Form von tag1,2-Ubiquitin und tag1,3-Ubiquitin vor, worin tag1 ein Element eines Bindungspaars ist, vorzugsweise FLAG, tag2 eine Fluoreszenzmarkierung und tag3 entweder eine Fluoreszenzmarkierung ist, sodass tag2 und tag3 Elemente eines FRET-Paars sind oder tag3 ein Quencher von tag2 ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden eine oder mehrere Aminosäuren zu der Ubiquitinsequenz unter Verwendung von hierin beschriebenen Rekombinationsverfahren hinzugefügt, um einen Anheftungspunkt für ein Tag, vorzugsweise eine Fluoreszenzmarkierung oder einen Quencher, bereitzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind eine oder mehrere Aminosäuren Cys oder Ala-Cys. Vorzugsweise werden die eine oder mehrere Aminosäuren an den N-Terminus von Ubiquitin angeheftet. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die eine oder mehrere Aminosäuren zwischen der Sequenz eines Flag-Tags und des Ubiquitins. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Tag, vorzugsweise eine Fluoreszenzmarkierung oder ein Quencher, an das hinzugefügte Cystein angeheftet.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen bereit, welche die Kombination von Ubiquitin und E1 umfassen. Unter „E1" versteht man ein ubiquitinaktivierendes Enzym. In einer bevorzugten Ausführungsform ist E1 in der Lage, Ubiquitin an ein E2 zu transferieren, das nachstehend definiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform bindet E1 Ubiquitin. In einer bevorzugten Ausführungsform bildet E1 eine Hochenergie-Thiolester-Bindung mit Ubiquitin, wodurch das Ubiquitin „aktiviert" wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen E1-Proteine, die in der Erfindung nützlich sind, jene, die eine Aminosäuresequenz des Poylpeptids aufweisen, das die ATCC-Zugriffsnummern A38564, S23770, AAA61246, P22314, CAA40296 und BAA33144, hierin durch Verweis aufgenommen, aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform weist E1 die Aminosäuresequenz auf, die in 8B dargestellt ist, oder eine Nucleinsäure, welche die in 8A dargestellte Sequenz umfasst, kodiert dafür. Vorzugsweise ist E1 menschliches E1. E1 ist im Handel von Affiniti Research Proucts (Exeter, UK) erhältlich.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen Nucleinsäuren, die zur Produktion von E1-Proteinen für die Erfindung verwendet werden können, unter anderem jene, die durch ATCC-Zugriffsnummern M58028, X56976 und AB012190 offenbart sind, hierin durch Verweis aufgenommen. In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert eine Nucleinsäure, die eine Sequenz aufweist, die im Wesentlichen aus der in 8A dargestellten Sequenz besteht, für E1. Varianten der erwähnten E1-Proteine, die auch vom Begriff „E1" umfasst sind, können wie hierin beschrieben hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung E2. Unter „E2" versteht man ein Ubiquitin-Trägerenzym (auch als Ubiquitin-Konjugationsenzym bekannt). In einer bevorzugten Ausführungsform wird Ubiquitin von E1 auf E2 transferiert. In einer bevorzugten Ausführungsform resultiert der Transfer in einer Thiolester-Bindung, die zwischen E2 und Ubiquitin gebildet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist E2 in der Lage, Ubiquitin auf ein E3, das nachstehend beschrieben ist, zu transferieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ubiquitinierungssubstratprotein Ubiquitin.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen Proteine, die in der vorliegenden Erfindung als E2 verwendet werden können, unter anderem jene, die die Aminosäuresequenzen aufweisen, die in ATCC-Zugriffsnummern AAC37534, P49427, CAA82525, AAA58466, AAC41750, P51669, AAA91460, AAA91461, CAA63538, AAC50633, P27924, AAB36017, Q16763, AAB86433, AAC26141, CAA04156, BAA11675, Q16781, NP_003333, BAB18652, AAH00468, CAC16955, CAB76865, CAB76864, NP_05536, O00762, XP_009804, XP_009488, XP_006823, XP_006343, XP_005934, XP_002869, XP_003400, XP_009365, XP_010361, XP_004699, XP_004019, O14933, P27924, P50550, P52485, P51668, P51669, P49459, P37286, P23567, P56554 und CAB45853 offenbart sind, wovon jede hierin durch Verweis aufgenommen ist. Besonders bevorzugt sind Sequenzen, die in den ATCC-Zugriffsnummern NP003331, NP003330, NP003329, P49427, AAB53362, NP008950, XP009488 und AAC41750, die ebenfalls hierin durch Verweis aufgenommen sind, offenbart sind. Dem Fachmann ist klar, dass viele verschiedene E2-Proteine und Isozyme fachbekannt sind und in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, vorausgesetzt, das E2 weist Ubiquitin-Konjugationsaktivität auf. Vom Begriff „E2" sind ebenfalls insbesondere Varianten von E2 umfasst, die wie hierin beschrieben hergestellt werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist E2 eines von Ubc5 (Ubch5, vorzugsweise Ubch5c), Ubc3 (Ubch3), Ubc4 (Ubch4) und UbcX (Ubc10, Ubch10). In einer bevorzugten Ausführungsform ist E2 Ubc5c. In einer bevorzugten Ausführungsform hat E2 die Aminosäuresequenz, die in 9B dargestellt ist, oder eine Nucleinsäure, die im Wesentlichen aus der in 9A dargestellten Sequenz besteht, kodiert dafür.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen Nucleinsäuren, die verwendet werden können, um E2 herzustellen, unter anderem jene Nucleinsäuren, die Sequenzen aufweisen, die in den ATCC-Zugriffsnummern L2205, 229328, M92670, L40146, U39317, U39318, X92962, U58522, S81003, AF031141, AF075599, AJ000519, XM009488, BM007019, U73379, L40146 und D83004 offenbart sind, wovon jede hierin durch Verweis aufgenommen ist. Wie oben beschrieben können Varianten dieser und andere für E2 kodierende Nucleinsäuren auch verwendet werden, um E2-Protein-Varianten herzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nucleinsäure, die zur Herstellung von E2 verwendet wird, die in 9A gezeigte Sequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist E2 ein Tag auf, wie oben definiert, wobei der Komplex hierin als „Tag-E2" bezeichnet wird. Bevorzugte E2-Tags umfassen unter anderem Markierungen, Partner von Bindungspaaren und Substratbindungselemente. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist das Tag ein His-Tag oder GST-Tag.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die E3 umfassen. Unter „E3" versteht man eine oben definierte Ubiquitin-Ligase, die eine oder mehrere Komponenten umfasst, die mit Ligation von Ubiquitin an ein Ubiquitinierungssubstratprotein für ubiquitinabhängige Proteolyse assoziiert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst E3 ein RING-Fingerprotein und ein Culin. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen RING-Fingerproteine unter anderem ROC1, ROC2 und APC11. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen Culline unter anderem CUL1, CUL2, CUL3, CUL4A, CUL5 und APC2.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen RING-Fingerproteine unter anderem Proteine, die die Aminosäuresequenz aufweisen, die in ATCC-Zugriffsnummern AAD30147 und AAD30146 und 6320196 offenbart sind, die hierin durch Verweis aufgenommen sind. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform weist das RING-Fingerprotein eine Sequenz auf, die aus der Gruppe bestehend aus den in 10, 11 und 12B dargestellten ausgewählt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen Culline unter anderem Proteine mit Aminosäuresequenzen, die in den ATCC-Zugriffsnummern 4503161, AAC50544, AAC36681, 4503163, AAC51190, AAD23581, 4503165, AAC36304, AAC36682, AAD45191, AAC50548, Q13620, 4503167 und AAF05751 offenbart sind, wovon jede hierin durch Verweis aufgenommen ist. Zusätzlich dazu umfasst im Kontext der Erfindung jedes der RING-Fingerproteine und Culline Varianten der bekannten oder angeführten Sequenzen, die hierin beschrieben sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Cullin eine Sequenz wie die in 13B oder 14B dargestellte auf.
Diese E3-Proteine und -Varianten können wie hierin beschrieben hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen Nucleinsäuren, die verwendet werden, um die RING-Fingerproteine herzustellen, unter anderem jene, die Nucleinsäuresequenzen aufweisen, die in den ATCC-Zugriffsnummern AF142059, AF142060 und Nucleinsäuren 433493 bis 433990 von NC001136 offenbart sind. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Culline aus Nucleinsäuren hergestellt, die unter anderem jene umfassen, die Nucleinsäuresequenzen aufweisen, die in ATCC-Zugriffsnummern NM003592, U58087, AF062536, AF126404, NM003591, U83410, NM003590, AB014517, AF062537, AF064087, AF077188, U58091, NM003478, X81882 und AF191337 offenbart sind, wovon jede hierin durch Verweis aufgenommen ist. Wie oben beschrieben sind Varianten dieser Sequenzen auch von der Erfindung umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst Nucleinsäure, die verwendet wird, um ROC2 zu produzieren, die Sequenz, die in 12A dargestellt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst Nucleinsäure, die verwendet wird, um CUL5 zu produzieren, die in 13A dargestellte Sequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst Nucleinsäure, die verwendet wird, um APC2 zu produzieren, die in 14A dargestellte Sequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst E3 die RING-Fingerprotein/Cullin-Kombination APC11/APC2. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst E3 die RING-Fingerprotein/Cullin-Kombination ROC1/CUL1. In wieder einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst E3 die RING-Fingerprotein/Cullin-Kombination ROC1/CUL2. In wieder einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst E23 die RING-Fingerprotein/Cullin-Kombination ROC2/CUL5. Jedoch versteht der Fachmann, dass eine beliebige Kombination von E3-Komponenten produziert werden kann und in der hierin beschriebenen Erfindung verwendet werden kann.
In einer anderen Ausführungsform umfasst E3 die Ligase E3-alpha, E3A (E6-AP), HERC2, SMURF1, TRAF6, MDM2, Cbl, Sina/Siah, Itchy, IAP oder NEDD-4. In dieser Ausführungsform weist die Ligase die Aminosäuresequenz von jener in den ATCC- Zugriffsnummern AAC39845 Q05086, CAA66655, CAA66654, CAA66656, AAD08657, NP_002383, XP_006284, AAC51970, XP_013050, BAB39389, Q00987, AAF08298 oder P46934 offenbarten auf, wovon jede hierin durch Verweis aufgenommen ist. Wie oben umfasst die Erfindung auch Varianten. Nucleinsäuren zur Herstellung von E3 für diese Ausführungsform umfassen unter anderem jene mit Sequenzen, die in den ATCC-Zugriffsnummern AF061556, XM006284, U76247, XM013050, X898032, X98031, X98033, AF071172, 212020, AB056663, AF199364 und D42055 offenbart sind, und Varianten davon.
E3 kann auch andere Komponenten umfassen, wie z. B. SKP1- und F-Box-Proteine. Die Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen für SKP1 sind in den ATCC-Zugriffsnummern AAC50241 bzw. U33760 zu finden. Viele F-Box-Proteine sind fachbekannt, und ihre Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen sind einfach vom Fachmann aus verschiedenen veröffentlichten Quellen zu erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die E3-Komponenten wie hierin beschrieben rekombinant produziert.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die E3-Komponenten in derselben Wirtszelle co-exprimiert. Co-Expression kann durch Transformation der Zelle mit einem Vektor erreicht werden, der Nucleinsäuren umfasst, die für zwei oder mehrere der E3-Komponenten kodieren, oder durch Transformation der Wirtszelle mit getrennten Vektoren, wobei jeder eine einzelne Komponente des gewünschten. E3-Proteinkomplexes umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform werden das RING-Fingerprotein und Cullin in einem einzelnen Wirt exprimiert, der mit zwei Vektoren transfiziert ist, wovon jeder Nucleinsäure umfasst, die für das eine oder andere Polypeptid kodiert, wie in den Beispielen detaillierter beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist E3 ein Tag auf, wobei der Komplex hierin als „tag-E3" bezeichnet wird. Vorzugsweise ist das Tag an nur eine Komponente von E3 angeheftet. Bevorzugte E3-Tags umfassen unter anderem Markierungen, Partner von Bindungspaaren und Substratbindungselemente. Noch bevorzugter ist das. Tag ein Oberflächenbindungssubstratbindungsmolekül. Am bevorzugtesten ist das Tag ein His-Tag oder GST-Tag.
In einer hierin angeführten Ausführungsform werden Ubiquitin und Ubiquitinierungsenzyme und deren Komponenten wie nachstehend beschrieben kloniert und exprimiert. Daher werden Sonden- oder degenerierte Polymerasekettenreaktion-(PCR-)Primersequenzen verwendet, um andere verwandte Ubiquitinierungsproteine aus Menschen oder anderen Organismen zu finden. Wie Fachleuten klar ist, umfassen insbesondere nützliche Sonden- und/oder PCR-Primersequenzen die einzigartigen Bereiche einer Nucleinsäuresequenz. Wie fachbekannt ist, reichen bevorzugte PCR-Primer von etwa 15 bis 35 Nucleotiden Länge, wobei etwa 20 bis etwa 30 bevorzugt sind, und können, wenn nötig, Inosin enthalten. Die Bedingungen für die PCR-Reaktion sind fachbekannt. Es versteht sich daher, dass gemeinsam mit den Sequenzen in den hierin zitierten Sequenzen Abschnitte jener Sequenzen bereitgestellt sind, worin einzigartige Abschnitte von 15 Nucleotiden oder mehr besonders bevorzugt sind. Der Fachmann kann eine Nucleotidsequenz routinemäßig auf die gewünschte Länge synthetisieren oder zuschneiden.
Sobald die rekombinante Nucleinsäure aus ihrer natürlichen Quelle isoliert ist, z. B. in einem Plasmid oder einem anderen Vektor enthalten oder als lineares Nucleinsäuresequment daraus herausgeschnitten, kann sie weiters als Sonde zur Identifikation und Isolation anderer Nucleinsäuren verwendet werden. Sie kann auch als „Vorläufer"-Nucleinsäure verwendet werden, um modifizierte Nucleinsäuren und Proteine oder Varianten davon herzustellen.
Unter Verwendung der Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung, die für ein Protein kodieren, wird eine Vielzahl an Expressionsvektoren hergestellt. Die Expressionsvektoren können entweder selbst-replizierende extrachromosomale Vektoren sein oder Vektoren, die sich in ein Wirtsgenom integrieren. Im Allgemeinen umfassen diese Expressionsvektoren transkriptions- und translationsregulierende Nucleinsäure, operabel an die Nucleinsäure gebunden, die für das Protein kodiert. Der Begriff „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer ope rabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem besonderen Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, umfassen z. B. einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosomenbindungsstelle. Von eukaryotischen Zellen ist bekannt, das sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz platziert wird. Zum Beispiel ist DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn es als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an die kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert wird, dass Translation erleichtert wird. Als anderes Beispiel bezieht sich „operabel gebunden" auf DNA-Sequenzen, die zusammenhängend sind und im Fall eines sekretorischen Leaders zusammenhängend sind und in Leseraster vorliegen. Jedoch müssen Enhancer nicht zusammenhängend sein. Bindung wird durch Ligation an herkömmlichen Restriktionsstellen erreicht. Wenn solche Stellen nicht existieren, werden synthetische Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet. Die transkriptions- und translationsregulierende Nucleinsäure ist im Allgemeinen für die Wirtszelle geeignet, die verwendet wird, um das Protein zu exprimieren; zum Beispiel werden transkriptions- und translationsregulierende Nucleinsäuresequenzen aus Bacillus vorzugsweise verwendet, um das Protein in Bacillus zu exprimieren. Zahlreiche Arten von geeigneten Expressionsvektoren und geeignete regulierende Sequenzen sind für eine Reihe von Wirtszellen fachbekannt.
Im Allgemeinen können die transkriptions- und translationsregulierenden Sequenzen unter anderem Promotorsequenzen, Ribosomenbindungsstellen, Transkriptionsstartund -stoppsequenzen, Translationsstart- und -stoppsequenzen und Enhancer- oder Aktivatorsequenzen umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die regulierenden Sequenzen einen Promotor und Transkriptionsstart- und -stoppsequenzen.
Promotorensequenzen kodieren entweder für konstitutive oder induzierbare Promotoren. Die Promotoren können entweder natürlich auftretende Promotoren oder Hybrid-Promotoren sein. Hybridpromotoren, die Elemente von mehr als einem Promotor kombinieren, sind ebenfalls fachbekannt und in der vorliegenden Erfindung nützlich.
Zusätzlich dazu kann der Expressionsvektor weitere Elemente umfassen. Zum Beispiel kann der Expressionsvektor zwei Replikationssysteme aufweisen, wodurch es ermöglicht wird, dass dieser in zwei Organismen erhalten bleibt, zum Beispiel in Säugetier- oder Insektenzellen zur Expression und in einem prokaryotischen Wirt zur Klonierung und Amplifikation. Weiters enthält der Expressionsvektor zur Integration von Expressionsvektoren zumindest eine Sequenz, die zum Wirtszellgenom homolog ist, und vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren. Der Integrationsvektor kann auf einen spezifischen Lokus in der Wirtszelle ausgerichtet sein, indem die geeignete homologe Sequenz zum Einschluss in den Vektor ausgewählt wird. Konstrukte für Integrationsvektoren sind fachbekannt.
Zusätzlich dazu enthält der Expressionsvektor in einer bevorzugten Ausführungsform ein selektierbares Markergen, um die Selektion der transformierten Wirtszellen zu ermöglichen. Selektionsgene sind fachbekannt und variieren mit der verwendeten Wirtszelle.
Ein bevorzugtes Expressionsvektorsystem ist ein Retrovirus-Vektorsystem, wie es allgemein in PCT/US97/01019 und PCT/US97/01048 beschrieben ist, wovon beide hierin durch Verweis aufgenommen sind.
Proteine der vorliegenden Erfindung werden produziert, indem eine Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der Nucleinsäure enthält, die für das Protein kodiert, unter den geeigneten Bedingungen kultiviert wird, um Expression des Proteins zu induzieren oder zu verursachen. Die geeigneten Bedingungen für Prote inexpression variieren mit der Auswahl des Expressionsvektros und der Wirtszelle und werden einfach von einem Fachmann durch routinemäßige Versuche festgestellt. Zum Beispiel erfordert die Verwendung von konstitutiven Promotoren im Expressionsvektor die Optimierung des Wachstums und der Proliferation der Wirtszelle, während die Verwendung eines induzierbaren Promotors die geeigneten Wachstumsbedingungen zur Induktion erfordert. Zusätzlich dazu ist in einigen Ausführungsformen das Timing der Ernte wichtig. Zum Beispiel sind die Baculovirusysteme, die in Insektenzellexpression verwendet werden, lytische Viren, und daher kann die Erntezeitauswahl für die Produktausbeute wesentlich sein.
Geeignete Wirtszellen umfassen Hefe, Bakterien, Archaebakterien, Pilze und Insekten- und Tierzellen, einschließlich Säugetierzellen. Von besonderem Interesse sind Drosophila-melanogaster-Zellen, Pichia pastoris und P. methanolica, Saccharomyces cerevisiae und andere Hefen, E. coli, Bacillus subtilis, SF9-Zellen, SF21-Zellen, C129-Zellen, Saos-2-Zellen, Hi-5-Zellen, 293-Zellen, Neurosporen, BHK-, CHO-, COS- und HeLa-Zellen. Von größtem Interesse sind Pichia pastoris und P. methanolica, E. coli, SF9-Zellen, SF21-Zellen und Hi-5-Zellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proteine in Säugetierzellen exprimiert. Säugetierexpressionssysteme sind ebenfalls fachbekannt und umfassen retrovirale Systeme. Ein Säugetierpromotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die in der Lage ist, Säugeteir-RNA-Polymerase zu binden und die Stromab-(3'-)Transkription einer für ein Protein kodierenden Sequenz in mRNA zu initiieren. Ein Promotor hat eine Transkriptionsinitiationsregion, die üblicherweise proximal zum 5'-Ende der kodierenden Sequenz platziert ist, und eine TATA-Box, unter Verwendung von 25–30 Rasenpaaren stromauf der Transkriptionsinitationsstelle. Die TATA-Box soll RNA-Polymerase-II steuern, um RNA-Synthese an der korrekten Stelle zu beginnen. Ein Säugetierprotein enthält auch ein Stromauf-Promotorelement (Enhancer-Element), das sich typischerweise innerhalb von 100 bis 200 Rasenpaaren stromauf der TATA-Box befindet. Ein Stromauf-Promotorelement bestimmt die Geschwindigkeit, mit welcher Transkription begonnen wird, und kann in jeder Ausrichtung wirken. Von besonderem Nutzen als Säugetierpromotoren sind die Promotoren aus den viralen Säuge tiergenen, da die Virusgene oft höchst exprimiert sind und einen breiten Wirtsbereich aufweisen. Beispiele umfassen den frühen SV40-Promotor, Maus-Mammatumorvirus-LTR-Promotor, späten Adenovirus-Hauptpromotor, Herpes-simplex-Viruspromotor und den CMV-Promotor.
Typischerweise sind die Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen, die von Säugetierzellen erkannt werden, regulierende Regionen, die sich 3' zum Translationsstoppcodon befinden und daher gemeinsam mit den Promotorelementen die kodierende Sequenz flankieren. Der 3'-Terminus der reifen mRNA wird durch ortsspezifische Posttranslationsspaltung und Polyadenylierung gebildet. Beispiele für Transkriptionsterminator und Polyadenylierungssignale umfassen jene, die von SV40 stammen.
Die Verfahren zur Einführung von exogener Nucleinsäure in Säugetierwirte sowie andere Wirte sind fachbekannt und variieren mit der verwendeten Wirtszelle. Verfahren umfassen dextranvermittelte Transfektion, Kalziumphosphatpräzipitation, polybrenvermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Virusinfektion, Einkapselung des/der Polynucleotide in Liposomen und direkte Mikroinjektion der DNA in Kerne.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Proteine in bakteriellen Systemen exprimiert. Bakterielle Expressionssysteme sind fachbekannt.
Ein geeigneter bakterieller Promotor ist eine beliebige Nucleinsäuresequenz, die in der Lage ist, bakterielle RNA-Polymerase zu binden die Stromab-(3'-)Transkription der für ein Protein kodierenden Sequenz in mRNA zu beginnen. Ein bakterieller Promotor weist eine Transkriptionsinitiationsregion auf, die üblicherweise proximal zum 5'-Ende der kodierenden Sequenz platziert ist. Diese Transkriptionsinitiationsregion umfasst typischerweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptionsinitiationsstelle. Sequenzen, die für Stoffwechselweg-Enzyme kodieren, stellen insbesondere nützliche Promotorsequenzen bereit. Beispiele umfassen Promotorsequenzen, die von zuckermetabolisierenden Enzymen, wie z. B. Galactose, Lac tose und Maltose, abstammen und Sequenzen, die von biosynthetischen Enzymen abstammen, wie z. B. Tryptophan.
Promotoren aus Bakteriophage können ebenfalls verwendet werden und sind fachbekannt. Zusätzlich dazu sind synthetische Promotoren und Hybridpromotoren auch nützlich, zum Beispiel ist der tac-Promotor ein Hybrid der trp- und lac-Promotorsequenzen. Weiters kann ein bakterieller Promotor natürlich auftretende Promotoren von nicht-bakteriellem Ursprung umfassen, welche die Fähigkeit haben, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und Transkription zu initiieren.
Zusätzlich zu einer funktionierenden Promotorsequenz ist eine effiziente Ribosomenbindungsstelle wünschenswert. In E. coli wird die Ribosomenbindungsstelle Shine-Delgarno-(SD-)Sequenz genannt und umfasst ein Initiationscodon und eine Sequenz, die 3–9 Nucleotide lang ist, die sich 3–11 Nucleotide stromauf des Initiationscodons befindet.
Der Expressionsvektor kann auch eine Signalpeptidsequenz umfassen, welche die Sekretion des Proteins in Bakterien bereitstellt. Die Signalsequenz kodiert typischerweise für ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle auf fachbekannte Weise steuern. Das Protein wird entweder in das Wachstumsmedium (grampositive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum sekretiert, der sich zwischen der Innen- und Außenmembran der Zelle befindet (gramnegative Bakterien).
Der bakterielle Expressionsvektor kann auch ein selektierbares Markergen umfassen, um die Selektion von Bakterienstämmen zu ermöglichen, die transformiert worden sind. Geeignete Selektionsgene umfassen Gene, die die Bakterien gegen Arzneimittel, wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracyclin, resistent machen. Selektierbare Marker umfassen auch biosynthetische Gene, wie z. B. jene in den biosynthetischen Histidin-, Tryptophan- und Leucin-Wegen.
Diese Komponenten werden in Expressionsvektoren eingebaut. Expressionsvektoren für Bakterien sind fachbekannt und umfassen u. a. Vektoren für Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris und Streptococcus lividans.
Die bakteriellen Expressionsvektoren werden unter Verwendung fachbekannter Verfahren, wie z. B. Kalziumchloridbehandlung, Elektroporation und anderer, in bakterielle Wirtszellen transformiert.
In einer Ausführungsform werden Proteine in Insektenzellen produziert. Expressionsvektoren für die Transformation von Insektenzellen und insbesondere baculovirusbasierte Expressionsvektoren sind fachbekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Proteine in Hefezellen produziert. Hefeexpressionssysteme sind fachbekannt und umfassen Expressionsvektoren für Saccharomyces cervisiae, Candida albicans und C. maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis und K. lactis, Pichia guillerimondii, P. methanolica und P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica. Bevorzugte Promotorsequenzen zur Expression in Hefe umfassen den induzierbaren GAL1,10-Promotor, die Promotoren aus Alkoholdehydrogenase, Enolase, Glucokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, und das Saure-Phosphatase-Gen. Selektierbare Hefemarker umfassen ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, und ALG7, die Resistenz gegen Tunicamycin verleihen, das Neomycin-Phosphotransferasegen, das Resistenz gegen G418 verleiht, und das CUP1-Gen, das Hefe ermöglicht, in Gegenwart von Kupferionen zu wachsen.
Das Protein kann auch unter Verwendung fachbekannter Verfahren als Fusionsprotein hergestellt werden. Daher kann zum Beispiel das Protein als Fusionsprotein hergestellt werden, um Expression zu erhöhen, oder aus anderen Gründen. Zum Beispiel kann, wenn das Protein ein Peptid ist, die Nucleinsäure, die für das Peptid kodiert, für Expressionszwecke an eine andere Nucleinsäure gebunden werden. Ähnlich können Proteine der Erfindung an Proteinmarkierungen gebunden werden, wie z. B. grünfluoreszierendes Protein (GFP), rotfluoreszierendes z. B. grünfluoreszierendes Protein (GFP), rotfluoreszierendes Protein (RFP), blaufluoreszierendes Protein (BFP), gelbfluoreszierendes Protein (YFP) etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Protein nach Expression gereinigt oder isoliert. Proteine können auf eine Reihe von fachbekannten Wegen isoliert oder gereinigt werden, abhängig davon, welche anderen Komponenten in der Probe gegenwärtig sind. Standardreinigungsverfahren umfassen elektrophoretische, molekulare, immunologische und chromatographische Verfahren, einschließlich Ionenaustausch-, Hydrophob-, Affinitäts- und Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie, und Chromatofokussierung. Zum Beispiel kann das Ubiquitinprotein unter Verwendung einer Standard-Anti-Ubiquitin-Antikörpersäule gereinigt werden. Ultrafiltrations- und Diafiltrationsverfahren sind in Verbindung mit Proteinkonzentration ebenfalls nützlich. Für allgemeine Hinweise in geeigneten Reinigungsverfahren siehe R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982). Der notwendige Reinigungsgrad variiert abhängig von der Verwendung des Proteins. In einigen Fällen ist keine Reinigung notwendig.
Sobald Zusammensetzungen hergestellt sind, werden sie in einer Reihe von Anwendungen verwendet, einschließlich unter anderem von Screens auf Modulatoren von Ubiquitinierung. Der Fachmann versteht, dass Modulatoren von Ubiquitinierung Enzymaktivität, Enzymwechselwirkung mit dem Substrat, Wechselwirkung zwischen Ubiquitin und dem Substrat oder eine Kombination dieser beeinflussen. Ein Modulator, der insbesondere Ubiquitin-Ligase-Aktivität beeinflusst, ist ein Ubiquitin-Ligasemodulator.
Unter „Kandidat", „Kandidatenmittel", „Modulatorkandidat", „Ubiquitinierungsmodulatorkandidat" oder grammatikalischen Äquivalenten hierin versteht man ein beliebiges Molekül, z. B. Proteine (die hierin Proteine, Polypeptide und Peptide umfassen), kleine organische oder anorganische Moleküle, Polysaccharide, Polynucleotide etc., die auf Ubiquitinierungsmodulatoraktivität getestet werden. Kandidatenmittel umfassen zahlreiche chemische Klassen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Kandidatenmittel organische Moleküle, insbesondere kleine organische Moleküle, die funktionelle Gruppen umfassen, die für strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen notwendig sind, insbesondere Wasserstoffbrückenbindung, und typischerweise zumindest eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe umfassen, vorzugsweise zumindest zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Die Kandidatenmittel umfassen oft zyklische Kohlenstoff- oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren chemischen funktionellen Gruppen substituiert sind.
Modulatorkandidaten werden aus einer großen Zahl an Quellen, wie Fachleuten klar ist, einschließlich Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen, erhalten. Wie Fachleuten klar ist, stellt die vorliegende Erfindung ein rasches und einfaches Screening-Verfahren einer beliebigen Bibliothek von Modulatorkandidaten bereit, einschließlich der großen Vielzahl an bekannten Bibliotheken vom Typ der kombinatorische Chemie.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind Modulatorkandidaten synthetische Verbindungen. Eine beliebige Zahl an Verfahren ist für die willkürliche und gerichtete Synthese einer großen Vielzahl an organischen Verbindungen und Biomolekülen erhältlich, einschließlich Expression von randomisierten Oligonucleotiden. Siehe z. B. WO 94/24314 , hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen, die Verfahren zur Herstellung von neuen Verbindungen, einschließlich willkürlicher Chemieverfahren sowie enzymatischer Verfahren, diskutiert. Wie in WO94/24314 beschrieben, ist einer der Vorteile des vorliegenden Verfahrens, dass es nicht notwendig ist, den Modulatorkandidaten vor dem Test zu charakterisieren. Nur Modulatorkandidaten, die Ubiquitinligaseaktivität verstärken oder verringern, müssen identifiziert werden. Zusätzlich dazu können, wie fachbekannt ist, kodierende Tags unter Verwendung von Split-Synthesereaktionen durchgeführt werden, um die getesteten chemischen Gruppierungen im Wesentlichen zu identifizieren.
Alternativ dazu verwendet eine bevorzugte Ausführungsform Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in Form von bakteriellen, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten, die erhältlich sind oder einfach produziert werden.
Zusätzlich dazu werden natürliche oder synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen einfach durch herkömmliche chemische, physische und biochemische Mittel modifiziert. Bekannte pharmakologische Mittel können gerichteter oder willkürlicher chemischer Modifikation unterworfen sein, einschließlich enzymatischer Modifikationen, um strukturelle Analoga zu produzieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen Modulatorkandidaten Proteine, Nucleinsäuren und chemische Gruppierungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Modulatorkandidat Proteine, wie oben definiert. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Modulatorkandidaten natürlich auftretende Proteine oder Fragmente von natürlich auftretenden Proteinen. Daher können z. B. zelluläre Extrakte, die Proteine enthalten, oder willkürliche oder gerichtete Verdaue von proteinhältigen zellulären Extrakten getestet werden, wie nachstehend umfassend beschrieben ist. Auf diese Weise können Bibliotheken von prokaryotischen und eukaryotischen Proteinen für Screening gegen eine Zahl an Ubiquitin-Ligasezusammensetzungen hergestellt werde. In dieser Ausführungsform sind Bibliotheken von bakteriellen, Pilz-, Virus- und Säugetierproteinen besonders bevorzugt, wobei Letztere bevorzugt sind und menschliche Proteine insbesondere bevorzugt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Modulatorkandidaten Peptide von etwa 2 bis etwa 50 Aminosäuren, wobei etwa 5 bis etwa 30 Aminosäuren bevorzugt sind und etwa 8 bis etwa 20 besonders bevorzugt sind. Die Peptide können Verdaue von natürlich auftretenden Proteinen sein, wie oben angeführt, willkürliche Peptide oder „beeinflusste" willkürliche Peptide sein. Unter „randomisiert" oder grammatikalischen Äquivalenten hierin versteht man, dass jede Nucleinsäure und jedes Peptid aus im Wesentlichen willkürlichen Nucleotiden bzw. Aminosäuren besteht. Da im Allgemeinen diese willkürlichen Peptide (oder Nucleinsäuren, nachstehend diskutiert) chemisch synthetisiert werden, können sie beliebige Nucleotide oder Aminosäuren an einer beliebigen Position inkorporieren. Das synthetische Verfahren kann so entworfen sein, dass randomisierte Proteine oder Nucleinsäuren erzeugt werden, um die Bildung von allen oder den meisten der möglichen Kombinationen über die Länge der Sequenz zu ermöglichen, wodurch eine Bibliothek von randomisierten bioaktiven proteinhaltigen Kandidatenmitteln gebildet wird.
Die Bibliothek soll eine ausreichend strukturell vielfältige Population von randomisierten Mitteln bereitstellen, um einen probabilistisch ausreichenden Vielfältigkeitsbereich zu erreichen, um Wechselwirkung mit einem besonderen Ubiquitin-Ligase-Enzym zu ermöglichen. Dementsprechend muss eine Wechselwirkungsbibliothek ausreichend groß sein, sodass zumindest eines seiner Elemente eine Struktur aufweist, die mit einem Ubiquitin-Ligaseenzym wechselwirkt. Obwohl es schwierig ist, die erforderliche absolute Größe einer Wechselwirkungsbibliothek zu kalibrieren, stellt die Natur mit der Immunreaktion einen Hinweis bereit: eine Vielfalt an 107–108 verschiedenen Antikörpern stellt zumindest eine Kombination mit ausreichender Affinität bereit, um mit den meisten potenziellen Antigenen wechselzuwirken, mit denen ein Organismus konfrontiert ist. Veröffentlichte In-vitro-Selektionsverfahren haben auch gezeigt, dass eine Bibliotheksgröße von 10 bis 10⁸ ausreichend ist, um Strukturen mit Affinität für ein Target zu finden. Eine Bibliothek von allen Kombinationen eines Peptids mit einer Länge von 7 bis 20 Aminosäuren, wie z. B. im Altgemeinen hierin vorgeschlagen, hat das Potenzial, für 20⁷ (10⁹) bis 20²⁰ zu kodieren. Daher ermöglichen die vorliegenden Verfahren mit Bibliotheken von 10⁷ bis 10⁸ verschiedenen Molekülen, eine „Arbeits"-Untermenge einer theoretisch vollständigen Wechselwirkungsbibliothek für 7 Aminosäuren und eine Untermenge von Formen für die 20²⁰-Bibliothek darzustellen. Daher werden in einer bevorzugten Ausführungsform zumindest 10⁶, vorzugsweise zumindest 10⁷, noch bevorzugter zumindest 10⁸ und am bevorzugtesten zumindest 10⁹, verschiedene Sequenzen gleichzeitig in den vorliegenden Verfahren analysiert. Bevorzugte Verfahren maximieren Bibliotheksgröße und Vielfalt.
In einer Ausführungsform ist die Bibliothek vollständig randomisiert, wobei an einer beliebigen Position keine Sequenzpräferenzen oder Konstanten existieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bibliothek beeinflusst. Das heißt einige Positionen innerhalb der Sequenz werden entweder konstant gehalten oder sind aus einer begrenzten Anzahl an Möglichkeiten ausgewählt. Zum Beispiel werden in einer bevorzugten Ausführungsform die Nucleotide oder Aminosäurereste innerhalb einer definierten Klasse randomisiert, z. B. hydrophobe Aminosäuren, hydrophile Reste, sterisch beeinflusste Reste (entweder kleine oder große Reste), zur Schaffung von Cysteinen, zur Vernetzung, Proline für SH3-Domänen, Serine, Threonine, Tyrosine oder Histidine für Phosphorylierungsstellen oder Purine etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Beeinflussung auf Peptide oder Nucleinsäuren, die mit bekannten Klassen von Molekülen Wechselwirken, gerichtet. Zum Beispiel ist bekannt, dass, wenn der Modulatorkandidat ein Peptid ist, viel von intrazellulärer Signalgebung über kurze Regionen von Polypeptiden durchgeführt werden, die mit anderen Polypeptiden durch kleine Peptiddomänen Wechselwirken. Zum Beispiel ist zuvor gezeigt worden, dass eine kurze Region aus der zytoplasmatischen HIV-1-Hülldomäne die Wirkung von zellulärem Calmodulin blockiert. Regionen der zytoplasmatischen Fas-Domäne, die Homologie zum Mastoparan-Toxin aus Wespen zeigt, können auf eine kurze Peptidregion mit todinduzierenden apoptotischen oder G-Proteininduzierenden Funktionen beschränkt werden. Magainin, ein natürliches Peptid, das von Xenopus stammt, kann potenzielle Antitumor- und antimikrobielle Aktivität aufweisen. Es hat sich gezeigt, dass kurze Peptidfragmente eines Protein-Kinase-C-Isozyms(βPKC) Kerntranslokation von βPKC in Xenopus-Oozyten nach Stimulation blockieren. Und es sind kurze SH-3-Targetpeptdie als Pseudosubstrate für spezifische Bindung an SH-3-Proteine verwendet worden. Die Liste an verfügbaren Peptiden mit biologischer Aktivität ist natürlich nicht vollständig, da die Literatur in diesem Bereich umfassend ist. Daher gibt es viele Präzedenzfälle für das Potenzial kleiner Peptide, Aktivität auf intrazellulären Signalgebungskaskaden aufzuweisen. Zusätzlich dazu können Agonisten und Antagonisten einer beliebigen Zahl an Molekülen ebenfalls als Grundlage von beeinflusster Randomisierung von Modulatorkandidaten verwendet werden.
Daher sind eine Reihe an Molekülen oder Proteindomänen als Ausgangspunkte für die Erzeugung von beeinflussten randomisierten Modulatorkandidaten geeignet. Eine große Zahl an kleinen Moleküldomänen ist bekannt, die eine gemeinsame Funktion, Struktur oder Affinität verleihen. Zusätzlich dazu können, wie fachbekannt ist, Bereiche von schwacher Aminosäurehomologie starke strukturelle Homologie aufweisen. Eine Reihe dieser Moleküle, Domänen und/oder entsprechenden Consensus-Sequenzen sind bekannt, einschließlich unter anderem SH-2-Domänen, SH-3-Domänen, Pleckstrin, Todesdomänen, Proteasespaltung/Erkennungsstellen, Enzyminhibitoren, Enzymsubstrate, Traf etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Modulatorkandidaten Nucleinsäuren. Unter Verweis auf Modulatorkandidaten versteht man unter „Nucleinsäure" oder „Oligonucleotid" oder grammatikalischen Äquivalenten hierin zumindest zwei Nucleotide, die kovalent aneinander gebunden sind. Eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung enthält im Allgemeinen Phosphodiesterbindungen, obwohl in einigen Fällen, wie nachstehend beschrieben ist, Nucleinsäureanaloga enthalten sind, die abwechselnde Rückgrate haben, die zum Beispiel Phosphoramid (Beaucage et al., Tetrahedron 49 (10), 1925 (1993), und Verweise hierin, Letsinger, J. Org. Chem. 35, 3800 (1970), Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81, 579 (1977), Letsinger et al., Nuci. Acids Res. 14, 3487 (1986), Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988), und Pauwels et al., Chemica Scripta 26, 141 (1986)), Thiophosphoat (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19, 1437 (1991), und US-Patent Nr. 5.644.048 ), Dithiophosphat (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 2321 (1989)), O-Methylphosphoramitidbindungen (siehe Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) und Peptidnucleinsäurehauptketten und -bindungen umfassen (siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114, 1895 (1992), Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31, 1008 (1992), Nielsen, Nature 365, 566 (1993), Carlsson et al., Nature 380, 207 (1996), wovon alle hierin durch Verweis aufgenommen sind). Andere analoge Nucleinsäuren umfassen jene mit positiven Hauptketten (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6097 (1995)), nicht-ionischen Hauptketten ( US-Patent Nr. 5.386.023 , 5.637.684 , 5.602.240 , 5.216.141 und 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30, 423 (1991), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988), Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13, 1597 (1994); Kapitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Hrsg. Y.S. Sanghui und P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorga nic & Medicinal Chem. Lett. 4, 395 (1994), Jeffs et al., J. Biomocleular NMR 34, 17 (1994), Tetrahedron Lett. 37, 743 (1996)) und Nicht-Ribosehauptketten, einschließlich jene, die in US-Patent Nr. 5.235.033 und 5.034.506 und den Kapiteln 6 und 7, ASC Symposium Series 580 „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Hrsg. Sanghui und P. Dan Cook, beschrieben sind. Nucleinsäuren, die einen oder mehrere carbocyclische Zucker enthalten, sind in der Definition von Nucleinsäuren ebenfalls enthalten (siehe Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., 169–176 (1995)). Mehrere Nucleinsäureanaloga sind in Ravels, C & E Neves, 2. Juni 1997, Seite 35, beschrieben. Alle dieser Verweise sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen. Diese Modifikationen von Ribose-Phosphathauptkette können durchgeführt werden, um die Hinzufügung von zusätzlichen Gruppierungen sowie Markierungen zu erleichtern oder um die Stabilität und Halbwertszeit solcher Moleküle in physiologischen Umgebungen zu erhöhen.
Wie Fachleuten klar ist, finden alle diese Nucleinsäureanaloga in der vorliegenden Erfindung Anwendung. Zusätzlich dazu können Gemische aus natürlich auftretenden Nucleinsäuren und Analoga hergestellt werden. Alternativ dazu können Gemische aus verschiedenen Nucleinsäureanaloga und Gemische aus natürlich auftretenden Nucleinsäuren und Analoga hergestellt werden.
Besonders bevorzugt sind Peptidnucleinsäuren (PNA), die Peptidnucleinsäureanaloga umfassen. Diese Hauptketten sind unter neutralen Bedingungen im Wesentlichen nicht-ionisch, im Gegensatz zu der höchst geladenen Phosphodiesterhauptkette von natürlich auftretenden Nucleinsäuren.
Die Nucleinsäuren können wie beschrieben einzelsträngig oder doppelsträngig sein oder Abschnitte sowohl von doppelsträngigen als auch einzelsträngigen Sequenzen enthalten. Die Nucleinsäure kann DNA, sowohl genomische als auch cDNA, RNA oder ein Hybrid, sein, wo die Nucliensäure eine beliebige Kombination von Desoxyribo- und Ribonucleotiden und eine beliebige Kombination von Basen, einschließlich Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Inosin, Xathanin, Hypoxathanin, Isocytosin, Isoguanin etc., enthält. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff „Nucleosod" Nucleo tide und Nucleoside und Nucleotidanaloga und modifizierte Nucleoside, wie z. B. aminomodifizierte Nucleoside. Zusätzlich dazu umfasst „Nucleosid" nicht-natürlich auftretende Analogstrukturen. Daher werden hierin zum Beispiel die individuellen Einheiten einer Peptidnucleinsäure, wobei jede eine Base enthält, als Nucleosid bezeichnet.
Wie oben im Allgemeinen für Proteine beschrieben, kann ein Nucleinsäuremodulatorkandidat aus natürlich auftretenden Nucleinsäuren, willkürlichen Nucleinsäuren oder „beeinflussten" willkürlichen Nucleinsäuren bestehen. Zum Beispiel können die Verdaue von prokaryotischen oder eukaryotischen Genomen verwendet werden, wie es für Proteine oben ausgeführt ist. Wo das Expressionsendprodukt eine Nucleinsäure ist, müssen zumindest 10, vorzugsweise zumindest 12, noch bevorzugter zumindest 15, am bevorzugtesten zumindest 21, Nucleotidpositionen randomisiert werden, noch bevorzugter, wenn die Randomisierung weniger als perfekt ist. Auf ähnliche Weise müssen zumindest 5, vorzugsweise zumindest 6, noch bevorzugter zumindest 7, Aminosäurepositionen randomisiert werden, wieder noch bevorzugter, wenn die Randomisierung weniger als perfekt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Modulatorkandidaten organische Gruppierungen. In dieser Ausführungsform, wie allgemein in WO 94/24314 beschrieben ist, werden Kandidatenmittel aus einer Reihe von Substraten synthetisiert, die chemisch modifiziert werden können. „Chemisch modifiziert" umfasst hierin traditionelle chemische Reaktionen sowie enzymatische Reaktionen. Diese Substrate umfassen im Allgemeinen unter anderem Alkylgruppen (einschließlich Alkane, Alkene, Alkine und Heteroalkyl), Arylgruppen (einschließlich Arene und Heteroaryl), Alkohole, Ether, Amine, Aldehyde, Ketone, Säuren, Ester, Amide, zyklische Verbindungen, heterozyklische Verbindungen (einschließlich Purine, Pyrimidine, Benzodiazepine, Betalactame, Tetracycline, Cephalosporen und Kohlenhydrate), Steroide (einschließlich Östrogene, Androgene, Cortison, Ecodyson etc.), Alkaloide (einschließlich Mutterkorn, Vinca, Curare, Pyrollizidin und Mitomycine), organometallische Verbindungen, heteroatomtragende Verbindungen, Aminosäuren und Nucleoside. Chemische (einschließlich enzymatische) Reaktionen können auf Gruppierungen durchgeführt wer den, um neue Substrate oder Kandidatenmittel zu bilden, die dann unter Verwendung der vorliegenden Erfindung getestet werden können.
Wie Fachleuten klar ist, ist es möglich, mehr als eine Form von Modulatorkandidat zu einem Zeitpunkt zu screenen. Daher kann die Bibliothek an verwendeten Modulatorkandidaten nur eine Form von Mittel umfassen (d. h. Peptide) oder mehrere Formen (Peptide und organische Mittel). Der Test mehrerer Kandidaten zu einem Zeitpunkt ist nachstehend weiter diskutiert.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen bereit, welche die Kombination mehrerer Komponenten umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine bevorzugte Kombination Tag-Ubiquitin, El, E2 und E3. Vorzugsweise ist das Tag eine Markierung, ein Partner eines Bindungspaars oder ein Substratbindungsmolekül. Noch bevorzugter ist das Tag eine Fluoreszenzmarkierung oder ein Bindungspaarpartner. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Tag ein Bindungspaarpartner, und das Ubiquitin ist durch indirekte Markierung markiert. In der Ausführungsform der indirekten Markierung ist die Markierung vorzugsweise eine Fluoreszenzmarkierung oder ein Markierungsenzym. In einer Ausführungsform, die ein Markierungsenzym umfasst, produziert das Substrat für das Enzym vorzugsweise ein Fluoreszenzprodukt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Markierungsenzymsubstrat Luminol. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die Kombination insbesondere die Kombination von Komponenten mit einem Targetprotein aus.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist eine bevorzugte Kombination tag1-Ubiquitin, tag2-Ubiquitin, E1, E2, und E3. Vorzugsweise sind tag1 und tag2 Markierungen, vorzugsweise Fluoreszenzmarkierungen, am bevorzugtesten konstituieren tag1 und tag2 ein FRET-Paar.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine bevorzugte Kombination tag1-Ubqiuitin, E1, E2 und tag1-E3. Vorzugsweise ist tag1 eine Markierung, ein Partner eines Bindungpaars oder ein Substratbindungsmolekül und tag1 ist eine andere Markierung, ein anderer Partner eines Bindungspaars oder ein anderes Substratbin dungsmolekül. Noch bevorzugter ist tag1 eine Fluoreszenzmarkierung oder ein Element eines Bindungspaars. Wenn tag1 ein Element eines Bindungspaars ist, ist tag1 vorzugsweise indirekt markiert. Noch bevorzugter ist, wenn tag1 indirekt mit einem Markierungsenzym markiert ist. Vorzugsweise produziert das Markierungsenzymsubstrat, das verwendet wird, um die Gegenwart des Enzyms zu enthüllen, ein Fluoreszenzprodukt und ist noch bevorzugter Luminol. In der derzeit beschriebenen Kombination ist tag2 vorzugsweise ein Oberflächensubstratbindungselement, noch bevorzugter ein His-tag.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine bevorzugte Kombination tag1-Ubiquitin, E1 und tag2-E2. In dieser Ausführungsform ist tag1 vorzugsweise eine Markierung, ein Partner eines Bindungspaars oder ein Substratbindungsmolekül und tag2 eine unterschiedliche Markierung, ein unterschiedlicher Partner eines Bindungspaars oder ein unterschiedliches Substratbindungsmolekül. Noch bevorzugter ist tag-1 eine Markierung oder ein Element eines Bindungspaars. Wenn tag1 ein Element eines Bindungspaars ist, ist tag1 vorzugsweise indirekt markiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die tag1-Markierung (direkt oder indirekt) eine Fluoreszenzmarkierung oder ein Markierungsenzym. Wenn die tag1-Markierung (direkt oder indirekt) ein Markierungsenzym ist, produziert das Reaktionssubstrat, das verwendet wird, um die Gegenwart des Enzamy anzuzeigen, vorzugsweise ein Fluoreszenzprodukt und ist vorzugsweise Luminol. In der vorliegenden beschriebenen Kombination ist tag2 vorzugsweise ein Substratbindungselement, nochbevorzugter ein His-tag.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung kein Targetprotein. In dieser Ausführungsform ist Ubiquitin wie oben beschrieben das einzige Ubiquitinierungssubstrat. Diese Ausführungsform steht im Gegensatz zu vorherigen Ubiquitinierungsenzymtests, die die Hinzufügung eines Targetproteins als Teil der Zusammensetzungen erforderten. Da die verschiedenen Kombinationen von E3 und E2 und Kombinationen von E3-Untereinheiten für spezielle Targetproteine spezifisch sind, sind die vorliegenden Tests viel vielseitiger, was eine Va riation solcher Kombinationen ermöglicht, ohne zuerst das spezifische Targetprotein zu identifizieren, auf welches die Kombination gerichtet ist.
Die Komponenten der vorliegenden Zusammensetzungen können in variierenden Mengen kombiniert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Ubiquitin in einer Endkonzentration von 20 bis 200 ng pro 100 μl Reaktionslösung kombiniert, am bevorzugtesten bei etwa 100 ng pro 100 μl Reaktionslösung.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird E1 in einer Endkonzentration von 1 bis 50 ng pro 100 μl Reaktionslösung, noch bevorzugter von 1 ng bis 20 ng pro 100 μl Reaktionslösung, am bevorzugtesten von 5 ng bis 10 ng pro 100 μl Reaktionslösung, kombiniert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird E2 in einer Endkonzentration von 10 bis 100 ng pro 100 μl Reaktionslösung, noch bevorzugter 10–50 ng pro 100 μl Reaktionslösung, kombiniert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird E3 in einer Endkonzentration von 1 ng bis 500 ng pro 100 μl Reaktionslösung, noch bevorzugter 50–400 ng pro 100 μl Reaktionslösung, noch bevorzugter von 100 bis 300 ng pro 100 μl Reaktionslösung, am bevorzugtesten etwa 100 ng pro 100 μl Reaktionslösung, kombiniert.
Die Komponenten der Erfindung werden unter Reaktionsbedingungen kombiniert, die Ubiquitin-Ligaseaktivtiät und/oder Ubiquitinierungsaktivität begünstigen. Im Allgemeinen sind dies physiologischen Bedingungen. Inkubationen können bei einer beliebigen Temperatur durchgeführt werden, die optimale Aktivität erleichtert, typischerweise zwischen 4 und 40°C. Inkubationszeiten werden für optimale Aktivität ausgewählt, können aber auch optimiert werden, um rasches Hochdurchsatzscreening zu erleichtern. Typischerweise sind zwischen 0,5 und 1,5 Stunden ausreichend.
Eine Vielzahl an anderen Reagenzien kann in den Zusammensetzungen enthalten sein. Diese umfassen Reagenzien wie Salz, Lösungsmittel, Puffer, neutrale Proteine z. B. Albumin, Detergenzien etc., die verwendet werden können, um optimale Ubiquitinierungsenzymaktivität zu ermöglichen und/oder nicht-spezifische oder Hintergrundwechselwirkungen zu reduzieren. Auch Reagenzien, welche die Wirksamkeit des Tests auf andere Weise verbessern, wie z. B. Proteaseinhibitoren, Nucleaseinhibitoren, antimikrobielle Mittel etc., können verwendet werden. Die Zusammensetzungen umfassen vorzugsweise Adenosintriphosphat (ATP).
Das Gemisch von Komponenten kann in einer beliebigen Reihenfolge hinzugefügt werden, die die Ubquitin-Ligaseaktivität fördert oder die Identifikation von Modulatorkandidatenwirkungen optimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Ubiquitin in einer Reaktionspufferlösung bereitgestellt, gefolgt von Hinzufügung von Ubiquitinierungsenzymen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist Ubiquitin in einer Reaktionspufferlösung bereitgestellt, dann wird ein Modulatorkandidat hinzugefügt, gefolgt von Hinzufügung der Ubiquitinierungsenzyme.
Sobald sie kombiniert sind, umfassen bevorzugte Verfahren der Erfindung die Messung der Menge an an E3 gebundem Ubiquitin. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in welcher der Kombination E3 fehlt, umfassen bevorzugte Verfahren der Erfindung die Messung der Menge an Ubiquitin, das an E2 gebunden ist. Wie Fachleuten klar ist, hängt der Modus der Messung vom spezifischen Tag ab, das an das Ubiquitin angeheftet ist. Wie dem Fachmann auch offensichtlich ist, umfasst die Menge an Ubiquitin, das gebunden ist, nicht nur das spezielle Ubiquitinprotein, das direkt an das Ubiquitinierungsenzym gebunden ist, sondern auch die Ubiquitinierungsproteine, die an das bestimmte Ubiquitin in einer Polyubiquitinierungskette gebunden sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Ubiquitinierung gemessen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Tag, das an das Ubiquitin angeheftet ist, eine Fluoreszenzmarkierung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Tag, das an Ubiquitin angeheftet ist, eine Enzymmarkierung oder ein Bindungspaarelement, das indirekt mit einer Enzymmarkierung markiert ist. In letzterer bevorzugten Ausführungsform produziert das Enzymmarkierungssubstrat ein Fluoreszenzreaktionsprodukt. In diesen bevorzugten Ausführungsformen wird die Menge des gebundenen Ubiquitins durch Lumineszenz gemessen.
Wie hierin verwendet steht „Lumineszenz" oder „Fluoreszenzemission" für Photonenemission aus einer Fluoreszenzmarkierung. In einer Ausführungsform, in welcher FRET-Paare verwendet werden, können kontinuierlich oder zu Zeitpunkten während der Ligationsreaktion Fluoreszenzmessungen durchgeführt werden. Die Ausrüstung für solche Messungen ist im Handel erhältlich und wird einfach von einem Fachmann verwendet, um eine solche Messung durchzuführen.
Andere Modi zur Messung von gebundenem Ubiquitin sind fachbekannt und werden vom Fachmann für jede der hierin beschriebenen Markierungen einfach identifiziert. Zum Beispiel kann Radioisotopmarkierung durch Szintillationszählung oder durch Densitometrie nach Exposition gegenüber einer photographischen Emulsion oder durch Verwendung eines Geräts, wie z. B. eines Phosphorlmager, gemessen werden. Ähnlich kann Densitometrie verwendet werden, um gebundenes Ubiquitin nach einer Reaktion mit einem Enzymmarkierungssubstrat, das ein opakes Produkt produziert, wenn eine Enzymmarkierung verwendet wird, zu messen.
In bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung ist E3 an ein Oberflächensubstrat gebunden. Dies kann direkt erfolgen, wie oben für die Bindung einer Markierung an Ubiquitin beschrieben ist. Dies kann auch unter Verwendung von tag-E3 erreicht werden, worin das Tag ein Oberflächensubstratbindungsmolekül ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist E2 in Abwesenheit von E3 an ein Oberflächensubstrat gebunden. Dies kann direkt erfolgen, wie oben für die Bindung einer Markierung an Ubiquitin beschrieben. Dies kann auch unter Verwendung von tag-E2 erreicht werden, worin das Tag ein Oberflächensubstratbindungsmolekül ist.
In den zwei bevorzugten Ausführungsformen, die unmittelbar zuvor beschrieben sind, liegen E3 und E2 in Form von tag-E3 bzw. tag-E2 vor und sind über ein Oberflächensubstratbindungsmolekül-Tag an ein Oberflächensubstrat gebunden. Im Allgemeinen kann ein beliebiges Substratbindungsmolekül verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Tag ein His-Tag und das Oberflächensubstrat Nickel. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nickeloberflächensubstrat auf der Oberfläche der Wells einer Multiwellplatte, wie z. B. einer 96-Weltplatte, gegenwärtig. Solche Multiwellplatten sind im Handel erhältlich. Die Bindung des Enzyms an ein Oberflächensubstrat erleichtert die Trennung von gebundenem Ubiquitin von ungebundenem Ubiquitin. In der vorliegenden Ausführungsform wird das ungebundene Ubiquitin einfach nach der Ligationsreaktion aus dem Behälter gewaschen. Wie Fachleuten klar ist, ist die Verwendung eines beliebigen Oberflächensubstratbindungselements und Behälters mit dem Oberflächensubstrat, an welches es sich bindet, zur Erleichterung der Trennung von gebundenem und ungebundenem Ubiquitin wirkungsvoll.
In einer alternativen Ausführungsform ist E3 oder E2 direkt oder über ein Substratbindungselement an ein Kügelchen gebunden. Nach Ligation werden die Kügelchen vom ungebundenen Ubiquitin getrennt und das gebundene Ubiquitin gemessen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist E3 oder E2 an Kügelchen gebunden, und die verwendete Zusammensetzung umfasst Tag-Ubiquitin, worin das Tag eine Fluoreszenzmarkierung ist. In dieser Ausführungsform können die Kügelchen mit gebundenem Ubiquitin unter Verwendung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierungs-(FACS-)Maschine getrennt werden. Verfahren für solche Anwendungen sind in US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 09/047.119 beschrieben, die hierin durch Verweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist. Die Menge an gebundenem Ubiquitin kann dann gemessen werden.
In einer anderen Ausführungsform ist keines der Ubiquitinierungsenzyme an ein Substrat gebunden. In dieser Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung tag1-Ubiquitin, tag2-Ubiquitin, E1, E2 und E3. Vorzugsweise sind tag1 und tag2 Markierungen, vorzugsweise Fluoreszenzmarkierungen, am bevorzugtesten konstituieren tag1 und tag2 ein FREt-Paar. In dieser Ausführungsform wird Ubiquitinierung durch Messung des Fluoreszenzemissionsspektrums gemessen. Diese Messung kann kontinuierlich oder zu einem oder mehreren Zeitpunkten nach der Kombination der Komponenten erfolgen. Änderung im Fluoreszenzemissionsspektrum der Kombination verglichen mit nicht-ligiertem Ubiquitin gibt die Menge an Ubiquitinierung an. Der Fachmann versteht, dass in dieser Ausführungsform Änderung des Fluoreszenzemissionsspektrums aus Ubiquitin resultiert, das verschiedene Elemente des FRET-Paars trägt, die in enge Nähe zueinander gebracht werden, entweder durch Bildung von Poly-Ubiquitin und/oder durch Bindung naher Orte auf einem Protein, vorzugsweise einem Targetprotein.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zusammensetzungen der Erfindung verwendet, um Ubiquitinierungsmodulatoren zu identifizieren. In dieser Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung einen Modulatorkandidaten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die gemessene Menge und/oder Geschwindigkeit von Tag-Ubiquitin-Bindung an E3 mit jener verglichen, wenn der Modulatorkandidat in der Zusammensetzung fehlt, wodurch die Wirkung der Gegenwart oder Abwesenheit der Modulatoren auf Ubiquitinligaseaktivität bestimmt wird. In dieser Ausführungsform wird ebenfalls bestimmt, ob der Modulator Ubiquitinierung verstärkt oder hemmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform fehlt der Zusammensetzung der Erfindung, die einen Modulatorkandidaten enthält, E3, und die Menge und/oder Geschwindigkeit von Ubiquitinbindung an E2 wird gemessen. Diese Ausführungsform kann auch den Schritt des Vergleichens der Menge und/oder Geschwindigkeit von Ubiquitinbindung an E2 in einer Zusammensetzung umfassen, der sowohl E3 als auch der Modulatorkandidat fehlt, wodurch die Modulationsaktivität des Kandidaten auf Ubiquitinierungsenzyme, die keine E3 sind, bestimmt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der prozentuelle Unterschied der Menge an Ubiquitin, die an E2 gebunden ist, in Gegenwart und Abwesenheit des Modulatorkandidaten mit dem prozentuellen Unterschied der Menge, die in Gegenwart und Abwesenheit des Modulatorkandidaten an E3 gebunden ist, verglichen, wodurch der Wirkungspunkt des Modulatorkandidaten in der Enzym-Kaskade bestimmt wird. Das heißt, es wird bestimmt, ob der Modulstorkandidat E3-Ubiquitin-Ligaseaktivität beeinflusst oder E1 -Ubiquitinaktivierungsaktivität und/oder E2-Ubiquitinkonjugationsaktivität beeinflusst.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Zusammensetzungen der Erfindung dazu verwendet, die Ubiquitinierungsmodulatoren zu identifizieren. In dieser Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung einen Modulatorkandidaten. In einer bevorzugten Ausführungsform, wo tag1 und tag2 ein FREt-Paar bilden, wird die gemessene Menge und/oder Geschwindigkeit von tag1-Ubiquitin- und tag2-Ubiquitinbindung an ein Substratprotein (als Poly-Ubiquitin und/oder Ubiquitin gebunden an ein Targetprotein) mit der Menge oder Geschwindigkeit einer solchen Bindung in Abwesenheit des Modulatorkandidaten verglichen, wodurch die Gegenwart oder Abwesenheit der Wirkung des Modulators auf Ubiquitinligase-Aktivität bestimmt wird. In dieser Ausführungsform wird auch bestimmt, ob der Modulator Ubiquitinierung verstärkt oder hemmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden gleichzeitig mehrere Tests in einem Hochdurchsatzscreeningsystem durchgeführt. In dieser Ausführungsform können mehrere Tests in mehreren Behältern durchgeführt werden, wie z. B. den Wells einer 96-Well-Platte oder einer anderen Multi-Well-Platte. Wie Fachleuten klar ist, kann ein solches System auf den Test mehrerer Modulatorkandidaten und/oder mehrerer Kombinationen von E3-Komponenten und/oder E2-E3-Paarungen angewendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung in einem Hochdurchsatzscreeningsystem zur Bestimmung der Ubiquitinligaseaktivität verschiedener E2-E3-Paarungen und/oder verschiedener E3-Komponentenkombinationen verwendet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung in einem Hochdurchsatzscreeningsystem für gleichzeitiges Testen der Wirkung von individuellen Modulatorkandidaten verwendet.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Testen auf Ubiquitinierungsaktivität oder Ubiquitinierungsenzymaktivität in einem Gemisch bereit. Ubiquitin wird in eine Zelle oder ein Gemisch von Protein, vorzugsweise ein Zelllysat, un ter Bedingungen eingeführt, unter welchen Ubiquitinierung stattfinden kann. In dieser Ausführungsform liegt das Ubiquitin in Form von tag1-Ubiquitin und tag1-Ubiquitin vor, worin tag1 und tag2 ein FRET-Paar bilden oder tag1 eine Fluoreszenzmarkierung ist und tag2 ein Quencher von tag1 ist. Fluoreszenzemissionsspektrum wird als Hinweis darauf gemessen, ob Ubiquitinierungsaktivität in dem Gemisch oder der Zelle vorliegt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst Ubiquitin auch ein Element eines Bindungspaars, wie z. B. FLAG. In letzterer Ausführungsform können Komponenten, die in Ubiquitinierung involviert sind, aus dem Gemisch unter Verwendung einer Zahl an affinitätsbasierten Trennungsmitteln, wie z. B. Fluoreszenzkügelchen, die mit Anti-FLAG-Antikörper beschichtet sind, oder Immunpräzipitation unter Verwendung von Anti-FLAG-Antikörpern oder Verwendung von Anti-FLAG-Antikörpern, die an einen festen Träger angeheftet sind, isoliert werden. Andere Mittel zur Trennung von ubiquitingebundenen Komponenten der Zelle oder des Gemisches sind Fachleuten bekannt. Ubiquitingebundene Komponenten, die auf diese Weise getrennt werden, können E3 und Targetprotein umfassen. Der Fachmann versteht, dass eine Trennung dieser Komponenten für individuelle Identifikation oder nachfolgende Untersuchung durch mehrere fachbekannte Mittel, wie z. B. durch HPLC oder Elektrophorese, erhalten werden kann.
Es ist für einen Fachmann auch offensichtlich, das die Schritte der hierin bereitgestellten Tests in ihrer Reihenfolge variieren können. Es versteht sich daher jedoch, dass, während zahlreiche Optionen (von Verbindungen, ausgewählten Eigenschaften oder Reihenfolge von Schritten) hierin bereitgestellt sind, die Optionen jeweils individuell bereitgestellt sind und individuell von anderen hierin bereitgestellten Optionen getrennt werden können. Weiters sollen Schritte, die offensichtlich sind und von denen fachbekannt ist, dass sie die Empfindlichkeit des Tests erhöhen, innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung liegen. Zum Beispiel gibt es zusätzliche Waschschritte, Blockierungsschritte etc.
Die folgenden Beispiele dienen der vollständigen Beschreibung der Art der Verwendung der oben beschriebenen Erfindung sowie der Darstellung der besten Modi, die zur Durchführung verschiedener Aspekte der Erfindung ins Auge gefasst werden. Es versteht sich, dass die Beispiele in keiner Weise den Schutzumfang dieser Erfindung einschränken sollen, aber für illustrative Zwecke präsentiert sind. Alle hierin zitierten Verweise sind in ihrer Gesamtheit durch Verweis ausdrücklich aufgenommen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Produktion von E2, E3 und Ubiquitin
E2-Produktion
Der offene Leseraster von E2 (Ubc5C) wurde durch PCR amplifiziert und in den pGex-6P-1-E.-coli-Expressionsvektor (Amersham Pharmacia) als BgIII-EcoRI-Fragment kloniert, mit einem N-Terminus in Raster an das GST-Tag fusioniert.
Materialien und Verfahren
Plasmid wird in BL21-DE3-kompetentem E. coli (Stratagene Kat-Nr. 230132) transformiert. Zellen werden bei 37°C in TB + 100 μg/ml Ampicillin und 0,4% Glucose zu 0D600 von etwa 0,6 gezüchtet, induziert mit Zugabe von 320 μM IPTG und weitere 3h vor Ernte wachsen gelassen. Die Pellets werden einmal mit kalter PBS gewaschen, dann in etwa 6 Volumeneinheiten Lysepuffer resuspendiert (20 mM Tris, 10% Glycerin, 0,5 M NaCl, 2,5 mM EDTA, 1 mM TCEP plus Complete EDTA-freie Proteaseinhibitortabletten, 1 Tablette/25 ml von resuspendierten Zellen, pH 8,0). Die Suspension wird homogenisiert und 3 × 30 s lang beschallt. NP40 wird dann zu einer Endkonzentration von 0,5% hinzugefügt, und die Röhrchen wurden 30 min lang bei 4°C geschüttelt. Nach Zentrifugation bei 11000 U/min 25 bis 30 min lang wird der Überstand mit Glutathion-Sepharose-4B (Amersham, Kat-Nr. 17-0756-01) in einem Verhältnis von 1 ml Kügelchen pro 100 ml von ursprünglichem Kulturvolumen 1 bis 2 Stunden lang bei 4°C unter sanftem Schütteln inkubiert. Die Kügelchen werden pelletiert und einmal mit 10 Bettvolumeneinheiten des Lysepuffers, dann zweimal mit 10 Bettvolumeneinheiten von Prescission-Protease-Puffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 MM DTT, 0,1% NP-40, pH 7.0) gewaschen. Prescission-Protease (Amersham, Produkt-Nr. 27-0843) wird in einem Verhältnis von 80 μl (160 Einheiten) pro ml GST-Harz hinzugefügt und 4 h lang bei 4°C inkubieren gelassen. Der Überstand, der das gespaltene E2-Protein enthält, wird gewonnen, und das Harz wird zweimal mit einem Bettvolumen von Prescission-Puffer gewaschen. Alle drei Fraktionen werden durch SDS-PAGE analysiert und wenn geeignet gepoolt.
Ubiquitinproduktion
Ubiquitin wurde als Hindill-EcoRI-Fragment durch PCR in den pFlag-Mac-Expressionsvektor (Sigma) kloniert. Dies führt zur Expression von aminoterminalem Flag-Fusions-Ubiquitin in E. coli.
Materialien und Verfahren
Die Induktion von Proteinexpression und Zelllyse ähnelt der obigen GST-E2-Formulierung, mit der Ausnahme, dass der Überstand über ein FLAG-Affinitätsharz (VWR, Kat.-Nr. IB 13020) in einem Verhältnis von 15 ml Kügelchen pro 1 I der ursprünglichen Kultur geladen wird. Das Harz wird dann mit 10 Bettvolumeneinheiten von Lysepuffer gewaschen. Das Protein wird aus der Säule mit 100 mM Essigsäure, 10% Glycerin, 200 mM NaCl, 2,5 mM EDTA, 0,1% NP-40, pH 3,5, eluiert. Die Flutionen werden als 1 Bettvolumenfraktionen in Röhrchen gesammelt, die 1/10 Volumen von 2 M Tris, 80 mM B-ME, pH 9,0, enthalten, um den pH zu neutralisieren. Die Elutionsfraktionen werden durch SDS-PAGE analysiert und die geeigneten Fraktionen gepoolt und gegen 400 Volumeneinheiten von 20 mM Tris, 10% Glycerin, 200 mM NaCl, 2,5 mM EDTA, pH 8,0, dialysiert.
Produktion von E3
Kodierende Sequenzen für E3-Komplex wurden ebenfalls durch PCR amplifiziert, und Baculoviren wurden unter Verwendung des Bac-zu-Bac-Systems (GibcoBRL) erzeugt. E3 enthält zwei Untereinheiten, die durch Co-Infektion der zwei Baculoviren in denselben Hi-5-Insektenzellen exprimiert wurden. Eine der Untereinheiten ist His-markiert, wobei die andere korrelierende Untereinheit nicht markiert ist.
Das detaillierte Verfahren wurde nach dem Bac-zu-Bac-Baculovirusexpressionssystem von GibcoBRL durchgeführt. Zum Beispiel wurde ROC1 in pFastBacHtb-Vektor mit einer N-terminalen His6-Markierung kloniert, während CUL1 in den pFastBac1-Vektor ohne beliebige Fusionsmarkierung insertiert wurde. Nach Transposition und Bacmid-DNA-Transfektion in SF-9-Zellen wurden Baculoviren geerntet, amplifiziert und dazu verwendet, Hi-5-Zellen für Proteinexpression zu co-infizieren.
Materialien und Verfahren
Zellen werden geerntet, einmal mit kalter PBS gewaschen und in etwa 6 Volumeneinheiten von Lysepuffer resuspendiert (20 mM Tris, 20% Glycerin, 0,5 M NaCl, 15 mM Imidazol, 1 mM TCEP plus Complete EDTA-freien Protease-Inhibitor-Tabletten, 1 Tablette/25m1 von resuspendierten Zellen, pH 8,0). Die Suspension wurde dann 3 × 30 s lang beschallt, gefolgt von Hinzufügung von NP40 auf eine Endkonzentration von 0,5% und Inkubation 30 min lang bei 4 °C. Das Lysat wird dann zentrifugiert und der Überstand mit prä-äquilibrierten (Lysepuffer + NP40) Ni-NTA-Agarosekügelchen (Qiagen, Kat.-Nr. 1000632) 1 bis 2 h lang inkubiert. Die pelletierten Kügelchen wurden 2-mal mit Lysepuffer gewaschen, in 1 bis 2 Volumeneinheiten Lysepuffer resuspendiert und zur Elution auf eine Einwegsäule transferiert. Flution wurde unter Verwendung von 5 X 1-Bettvolumenaliquoten von Lysepuffer + 250 mM Imidazol ereicht. Elutionsfraktionen werden durch SDS-PAGE analysiert, und geeignete Fraktionen werden gepoolt. Der Elutionspool wurde dann unter Verwendung von entweder Entsalzungssäule oder einem Zentrifugationskonzentrationsgerät entsalzt (öfter für größere Volumeneinheiten verwendet). Wenn Zentrifugationswerte verwendet werden, wird der eluierte Pool 1:1 mit Lysepuffer verdünnt, der kein Imidazol aufweist, und in der geeigneten Geschwindigkeit zentrifugiert, bis das Volumen um die Hälfte reduziert ist. An diesem Punkt wird ein gleiches Volumen an frischem Puffer hinzuge fügt und das Gerät erneut zentrifugiert. Dies wird insgesamt viermal durchgeführt, was zu einem 32fachen Austausch führt.
Beispiel 2
Ubiquitin-Konjugationstest
Ubiquitinkonjugationsaktivität von E1 + E2 wurde unter Verwendung des folgenden Protokolls mit Flag-Ubiquitin, gereinigt aus E. coli, und E2-Ubch5, gereinigt aus E. coli als His-Ubch5c, gemessen.
Materialien und Verfahren
Die folgenden Verfahren wurden für Tests zur Messung von Ubiquitinkonjugation verwendet. Die Wells von Nickelsubstrat-96-Weltplatten (Pierce Chemical) werden mit 100 μl von 1% casein/phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert, dann mit 200 μl PBST (0,1% Tween-20 in PBS) 3-mal gewaschen. Zu jedem Well wird die folgende Flag-Ubiquitinreaktionslösung (siehe oben) hinzugefügt:
Endkonzentration
62,5 mM Tris pH 7,5
6,25 m MgCl₂
0,75 mM DTT
2,5 mM ATP
2,5 mM NaF
12,5 nM Okadasäure
100 ng Flag-Ubiquitin (wie oben beschrieben hergestellt).
Die Pufferlösung wird auf ein Endvolumen von 80 μl mit milipore-filtriertem Wasser gebracht, gefolgt von der Hinzufügung von 10 μl DMSO.
Zur obigen Lösung werden dann 10 μl E1, His-E2 in 20 mM Tris-Puffer, pH 7,5, und 5% Glycerin hinzugefügt. His-E2 wird dann wie oben beschrieben hergestellt. E1 ist im Handel erhältlich (Affiniti Research Products, Exeter, UK). Die folgenden Mengen jedes Enzyms werden für diese Tests verwendet: 5 ng/Well E1; 25 nl/Well E2. Die Reaktion wird dann bei Raumtemperatur 1 Stunden lang fortschreiten gelassen.
Nach der Ubiquitinkonjugationsreaktion werden die Wells mit 200 μl PBST 3-mal gewaschen. Für Messungen des enzymgebundenen Ubiquitins werden 100 μl Maus-Anti-Flag (1:10.000) und Anti-Maus-Ig-HRP (1:15.000) in PBST zu jedem Well hinzugefügt und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubieren gelassen. Die Wells werden dann mit 200 μl PBST 3-mal gewaschen, gefolgt von der Hinzufügung von 100 μl Luminolsubstrat (1/5-Verdünnung). Lumineszenz für jeden Well wurde dann unter Verwendung eines Fluorimeters gemessen.
Ergebnisse
Ubiquitinaktivierung und Konjugationsaktivität
1 zeigt die Lumineszenz, die für E1 alleine und für E1 + his-E2 wie oben beschrieben gemessen wurde.
Beispiel 3
Ubiquitin-Ligase-Test
Ubiquitin-Ligase-Aktivität von E1 + E2 + E3 wurde unter Verwendung des folgenden Protokolls mit Flag-Ubiquitin, gereinigt aus E. coli, dem E2-Ubch5c, gereinigt als GST-Ubch5c aus E. coli, wobei das GST-Tag entfernt wurde, und dem E3-His-ROC/Cul1-Komplex, gereinigt aus Hi-5-Zellen durch Baculoviruscoinfektion, gemessen. Dieser Test wurde ebenfalls verwendet, um die Wirkungen von Modulatorkandidaten auf Ubiquitin-Ligase-Aktivität zu zeigen.
Materialien und Verfahren
Die Wells von Nickelsubstrat-96-Wellplatten (Pierce Chemical) werden mit 100 μl von 1 Casein/phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert, dann mit 200 μl PBST (0,1% Tween-20 in PBS) 3-mal gewaschen. Zu jedem Well wird die folgende Flag-Ubiquitinreaktionslösung (siehe oben) hinzugegeben:
Endkonzentration
62,5 mM Tris pH 7,5
6,25 m MgCl₂
0,75 mM DTT
2,5 mM ATP
2,5 mM NaF
12,5 nM Okadasäure
100 ng Flag-Ubiquitin (wie oben beschrieben hergestellt)
Die Pufferlösung wird dann mit millipore-filtriertem Wasser auf ein Endvolumen von 80 μl gebracht.
Für Tests, die auf die Identifikation von Modulatoren von Ubiquitin-Ligaseaktivität ausgerichtet sind, werden dann 10 μl einer Modulatorkandidatenverbindung in DMSO zur Lösung hinzugegeben. Wenn kein Modulatorkandidat hinzugefügt wird, werden 10 μl DMSO zur Lösung hinzugefügt.
Zur obigen Lösung werden dann 10 μl Ubiquitinierungsenzyme in 20 mM Tris-Puffer, pH 7,5, und 5% Glycerin hinzugefügt. E2-Ubch5c und E3-HisROC1/Cul1 werden wie oben beschrieben hergestellt. E1 ist im Handel erhältlich (Affiniti Research Products, Exeter, UK). Die folgenden Mengen jedes Enzyms werden für diese Tests verwendet: 5 ng/Well E1, 25 nl/Well E2 und 100 ng/Well His-E3. Die Reaktion wird dann bei Raumtemperatur 1 Stunde lang fortschreiten gelassen.
Nach der Ubiquitinierungsreaktion werden die Wells mit 200 μl PBST 3-mal gewaschen. Zur Messung des enzymgebundenen Ubiquitins werden 100 μl Maus-Anti-Flag (1:10.000) und Anti-Maus-Ig-HRP (1:15.000) in PBST hinzugefügt und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubieren gelassen. Die Wells werden dann mit 20 μl PBST 3-mal gewaschen, gefolgt von Hinzufügung von 100 μl Luminolsubstrat (1/5-Verdünnung). Lumineszenz für jeden Well wird ebenfalls unter Verwendung eines Fluorimeters gemessen.
Ergebnisse
Ubiquitin-Ligase-Aktivität
2 zeigt die Lumineszenz, die für mehrere verschiedene Kombinationen von Ubiqutinierungsenzymen gemessen wurden. In diesen Versuchen war nur E3 in Form von His-E3. Die Lumineszenzmessungen zeigen, dass der Test insbesondere die Aktivität der gesamten Ubiquitinerungsenzym-Kaskade misst, welche die Gegenwart aller drei Ubiquitinierungsenzyme in der Reaktion erfordert.
Variationen von Zusammensetzungskomponenten
3A zeigt die relative Wirkung der Variation der Menge an E1 auf Ubiquitin-Ligase-Aktivität im obigen Verfahren, in Gegenwart und Abwesenheit von DMSO. Die Hinzufügung von etwa 10 ng pro 100 μl Reaktionslösung stellt maximale Ubiquitin-Ligase-Aktivität bereit, wobei die anderen Komponenten der Zusammensetzung wie oben beschrieben aufbewahrt wurden. Die Gegenwart von DMSO beeinflusst die Aktivität der Ubiquitinierungsenzyme nicht signifikant.
Die relative Wirkung von variierendem E2 und Ubiquitinkonzentration der Reaktionszusammensetzung ist in 3B dargestellt. Allgemein gesprochen wurde maximale Ubiquitin-Ligase-Aktivität mit 200 bis 300 ng pro 100 μl von E3 bei jeder Konzentrati on von Ubiquitin erhalten, während die Steigerung der Ubiquitinkonzentration im Allgemeinen Ubiquitinligaseaktivität bei jeder Konzentration von E3 steigerte.
Es wurde ebenfalls herausgefunden, dass Blockieren der Wells mit 1% Casein das Signal-zu-Rausch-Verhältnis gegenüber Nicht-Blockieren oder Blockieren mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) verbesserte. Hintergrund wurde nach Kombination aller wie oben beschriebenen Komponenten, mit der Ausnahme von His-E3, und Messung der resultierenden Fluoreszenz nach Vorbehandlung der Wells mit 5% BSA, 1% Casein oder nichts bestimmt. Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Identifikation von Modulatoren von Ubiquitin-Ligase-Aktivität
Um zu zeigen, dass der Test zur Identifikation von Modulatoren von Ubiquitin-Ligase-Aktivität nützlich ist, wurden mehrere Modulatorkandidaten in variierenden Konzentrationen mit Testkomponenten wie oben beschrieben kombiniert. 5A und 5B zeigen die Ergebnisse aus zwei identifizierten Modulatoren von Ubiquitin-Ligase-Aktivität. Die Modulatoren verringerten Ubiquitin-Ligase-Aktivität in einer dosisabhängigen Art für Ubiquitinierungsenzym-Zusammensetzungen, die entweder ROC1/Cul1 oder ROC2/Cul5 als E3-Komponente umfassen.
Vergleich der Wirkung von Ubiquitin-Ligase-Aktivität-Modulatoren auf Reaktionszusammensetzungen, wie oben beschrieben, die entweder E1, E2 und His-E3 enthalten oder E1, His-E2 enthalten und denen E3 fehlt, zeigt, ob der Modulator E3 oder ein Enzym, das kein E3 ist, beeinflusst. In 6A verringert der identifizierte Modulator Ubiquitin-Ligase-Aktivität in Gegenwart von E3, aber nicht die Aktivität in Abwesenheit von E3, was zeigte, dass der Modulator eine spezifische Wirkung auf E3-Ligase-Aktivität zeigt. Hingegen zeigen die Ergebnisse, die in 6B für einen anderen Modulator dargestellt sind, dass diese Verbindung Aktivität verringert, egal, ob E3 gegenwärtig ist oder nicht, was zeigt, dass dieser Modulator ein Element der Ubiquitinierungsenzymkaskade, die nicht E3 ist, beeinflusst.
Beispiel 4
FRET-Analyse von ligiertem Ubiquitin
Ubiquitin wurde hergestellt, entweder mit EDANS oder Fluorescein markiert, und die Fluoreszenz von jeder dieser Markierungen und ihre Wechselwirkung als FRET-Paar wurde gemessen, um die Bindung des markierten Ubiquitins an E3 und FRET-Aktivität im gebundenen Ubiquitin zu zeigen.
Materialien und Verfahren
Ubiquitin wurde produziert, indem Cys-Reste durch ortsspezifische Mutagenese in die FLAG-Ubiquitin-Sequenz aufgenommen wurden, unter Verwendung entweder von Primer
um FLAG-Cys-Ubiquitin zu produzieren, oder von Primer
um FLAG-Ala-Cys-Ubiquitin zu produzieren. Protein wurde wie oben beschrieben exprimiert und gereinigt.
Entweder Fluorescein-5-Maleinimid (höchste Emission bei 515 nm) oder 1,5-Iodacetamid-EDANS (IAEDANS, höchste Emission bei 490 nm) wurde mit der Thiolgruppe auf dem Cystein des Ubiquitins umgesetzt, das wie oben beschrieben produziert wurde, um einen Thioether zu bilden. Die Markierung wurde in PBS mit 1 mM TCEP durchgeführt. Markiertes Protein wurde durch Gelfiltrierung von freier Markierung getrennt.
Ubiquitin-Ligase-Test wurde im Wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt, mit einigen wenigen Modifikationen. Es wurde kein Nickelsubstrat in den Reaktionswells verwendet, also waren alle Komponenten in Lösung frei. Gleiche Mengen an fluoresceinmarkiertem Ubiquitin und IAEDANS-makiertem Ubiquitin wurden verwen det. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang in einem Volumen von 100–150 μl durchgeführt, dann mit 50 μl von 0,5 M EDTA, pH 8, gestoppt.
Nach der Reaktion wurden die Produkte in PBS mit 1 mM TCEP durch HPLC auf einem Superdez-75HR-10/30-Größenausschlußsäule unter Verwendung von Fluoreszenzemissionsdetektion durchgeführt. Eine Cut-off-Gelfiltrierungssäule bei höherem Molekulargewicht (z. B. Superdex 200-HR 10/30) konnte verwendet werden, um einzelne Ligationsspezies aufzulösen.
Ergebnisse
Fluoresceinmarkiertes Ubiquitin und IAEDANS-markiertes Ubiquitin wurde in etwa den gleichen Mengen an E3 gebunden. Ein Vergleich der Spektralanalyse von Fluoreszenzemission aus dem freien (nicht-ligierten) Ubiquitin, das sowohl mit Fluorophoren als auch dem E3-gebundenen Ubiquitin markiert war, zeigt einen anderen Anstieg des Verhältnisses der Emission bei 515 nm gegen 490 nm (17). Dies zeigt, dass in ligiertem Ubiquitin die Fluorophore auf verschiedenen Ubiquitinmolekülen ausreichend nahe sind, sodass FRET gemessen werden kann.

Claims

Verfahren zum Testen auf Ubiquitin-Ligase-Aktivität, Folgendes umfassend: a) das Kombinieren von i) tag1-Ubiquitin; ii) ubiquitinaktivierendem Enzym (E1); iii) ubiquitinkonjugierendem Enzym (E2); und iv) Ubiquitin-Ligase (E3); b) das Messen der Menge an tag1-Ubiquitin, die an E3 gebunden ist.
Verfahren zum Testen auf Ubiquitin-Konjugationsaktivität, Folgendes umfassend: a) das Kombinieren von: i) tag1-Ubiquitin; ii) E1; und iii) E2; b) das Messen der Menge an tag1-Ubiquitin, die an E2 gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das in Schritt a) weiters das Kombinieren eines Kandidaten-Ubiquitin-Ligase-Modulators umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, worin E3 in Form von tag2-E3 vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, worin E2 in Form von tag2-E2 vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das in Schritt a) weiters das Kombinieren von tag3-Ubiquitin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, worin tag1 ein erstes Element eines Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-(FRET-)Paars und tag3 das zweite Element eines FRET-Paars mit tag1 oder ein Quencher von tag1 ist.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das Messen durch Messung von Fluoreszenzemission erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Messen durch Messung des Fluoreszenzemissionsspektrums erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 9, das weiters das Vergleichen des gemessenen Fluoreszenzemissionsspektrums mit den Fluoreszenzemissionsspektren von ungebundenem tag3- und tag1-Ubiquitin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das Messen zeitlich kontinuierlich oder zu bestimmten Zeitpunkten nach dem Kombinieren erfolgt.
Verfahren zur Identifikation eines Ubiquitinierungsmodulators, Folgendes umfassend: a) das Kombinieren von: i) tag1-Ubiquitin; ii) einem Kandidatenmodulator; iii) E1; iv) E2; und v) tag2-E3; b) das Messen der Menge an tag1-Ubiquitin, die an tag1-E3 gebunden ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin E2 aus der aus Ubc5, Ubc3, Ubc4 und UbcX bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangen Ansprüche, worin E3 ein RING-Finger-Protein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das RING-Finger-Protein aus der aus dem Regulator von Cullin 1 (ROC1), Regulator von Cullin 2 (ROC2) und dem anaphasefördernden Komplex 11 (APC11) bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin E3 ein Cullin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das Cullin aus der aus CUL1, CUL2, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5 und dem anaphasefördernden Komplex 2 (APC2) bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangen Ansprüche, worin E3 eine RING-Finger-Protein/Cullin-Kombination umfasst. 19 Verfahren nach Anspruch 18, worin die RING-Finger-Protein/Cullin-Kombination aus der ausAPC2/APC11, ROC1/CUL1, ROC1/CUL2 und ROC2/CUL5 bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, weiters Folgendes umfassend: c) das Kombinieren von: i) tag1-Ubiquitin, ii) einem Kandidatenmodulator; iii) E1; und iv) tag3-E2; d) das Messen der Menge an tag1-Ubiquitin, die an tag3-E2 gebunden ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin tag1 eine Markierung oder ein Partner eines Bindungspaars ist.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die tag1-Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist.
Verfahren nach Anspruch 22, worin das Messen durch Messung von Lumineszenz erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 21, worin der tag1-Partner eines Bindungspaars aus der aus einem Antigen, Biotin und Calmodulinbindungsprotein (CBP) bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, worin der tag1-Partner eines Bindungspaars durch indirekte Markierung markiert wird.
Verfahren nach Anspruch 25, worin das indirekte Markieren mit einer Fluoreszenzmarkierung oder einem Markierungsenzym erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 26, worin das Messen durch Messung von Lumineszenz erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 26, worin das Markierungsenzym aus der aus Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase und Glucoseoxidase bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 28, worin das Markierungsenzym mit einem Markierungsenzym-Substrat umgesetzt wird, das ein fluoreszierendes Produkt ergibt.
Verfahren nach Anspruch 29, worin das Messen durch Messung von Lumineszenz erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 24, worin das Antigen FLAG-Antigen (FLAG) ist.
Verfahren nach Anspruch 25, worin der tag1-Partner eines Bindungspaars FLAG ist.
Verfahren nach Anspruch 26, worin der tag1-Partner eines Bindungspaars FLAG ist und das indirekte Markieren über Anti-FLAG erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 28, worin das tag1 FLAG ist.
Verfahren nach Anspruch 21, worin das tag2 ein Oberflächensubstratbindungsmolekül ist.
Verfahren nach Anspruch 35, worin das Oberflächensubstratbindungsmolekül Polyhistidin (His-tag) ist.
Verfahren nach Anspruch 36, worin das Kombinieren und Messen in einer Multiwellplatte durchgeführt wird, die ein Oberflächensubstrat umfasst, das Nickel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, worin das tag3 ein Oberflächensubstratbindungsmolekül ist.
Verfahren nach Anspruch 38, worin das Oberflächensubstratbindungsmolekül aus der aus His-tag und Glutathion-S-Transferase (GST) bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren zum Testen auf Ubiquitinierungsenzymaktivität, Folgendes umfassend: a) das Kombinieren von i) tag1-Ubiquitin und tag2-Ubiquitin, worin tag1 und tag2 ein FRET-Paar bilden oder tag1 eine Fluoreszenzmarkierung und tag2 ein Quencher von tag1 ist; ii) E1; iii) E2; und iv) E3; b) das Messen der Menge oder Geschwindigkeit der Ubiquitinierung.
Verfahren nach Anspruch 40, das in Schritt a) weiters das Kombinieren eines Kandidaten-Ubiquitinierungsmodulators umfasst.
Verfahren zur Identifikation eines Ubiquitinierungsmodulators, Folgendes umfassend: a) das Kombinieren von: i) tag1-Ubiquitin und tag1-Ubiquitin, worin tag1 und tag2 ein FRET-Paar bilden oder tag1 eine Fluoreszenzmarkierung und tag2 ein Quencher von tag1 ist; ii) E1; iii) E2; iv) E3; und v) einem Kandidaten-Ubiquitinierungsmodulator; b) das Messen der Menge oder Geschwindigkeit der Ubiquitinierung.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 42, worin E2 aus der aus Ubc5, Ubc3, Ubc4 und UbcX bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 43, worin E3 ein RING-Finger-Protein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 44, worin das RING-Finger-Protein aus der aus ROC1, ROC2 und APC11 bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 45, worin E3 ein Cullin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 46, worin das Cullin aus der aus CUL1, CUL2, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5 und APC2 bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 47, worin E3 eine Ring-Finger-Protein/Cullin-Kombination umfasst.
Verfahren nach Anspruch 48, worin die RING-Finger-Protein/Cullin-Kombination aus der aus APC2/APC11, ROC1/CUL1, ROC1/CUL2 und ROC2/CUL5 bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 49, worin das Messen durch Messung des Fluoreszenzemissionsspektrums erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 50, worin das Messen zeitlich kontinuierlich oder zu bestimmten Zeitpunkten nach dem Kombinieren erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 51, das weiters das Vergleichen des gemessenen Fluoreszenzemissionsspektrums mit den Fluoreszenzemissionsspektren von ungebundenem tag1-Ubiquitin und tag2-Ubiquitin umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 52, worin das Ubiquitin in Form von tag1,3-Ubiquitin und tag2,3-Ubiquitin vorliegt, worin tag2 ein Element eines Bindungspaars ist.
Verfahren nach Anspruch 53, worin tag3 FLAG ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 54, worin das E3 in Form von tag4-E3 vorliegt, worin tag4 ein Oberflächensubstratbindungsmolekül ist.
Verfahren nach Anspruch 50, das weiters ein Targetprotein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 50, weiters Folgendes umfassend; a) das Kombinieren unter Bedingungen, die Ubiquitinierungsaktivität begünstigen: vi) ein Targetprotein.
Zusammensetzung, umfassend: tag1-Ubiquitin und tag2-Ubuqitin, worin tag1 eine Fluoreszenzmarkierung ist und tag2 das zweite Element eines FRET-Paars mit tag1 oder tag2 ein Quencher von tag1 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 58, weiters umfassend: E1, E2 und E3.
Zusammensetzung nach Anspruch 59, worin E2 aus der aus Ubc5, Ubc3, Ubc4 und UbcX bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 59, worin E3 ein RING-Finger-Protein umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 61, worin das RING-Finger-Protein aus der aus ROC1, ROC2 und APC11 bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 59, worin E3 ein Cullin umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 63, worin das Cullin aus der aus CUL1, CUL2, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5 und APC2 bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Zusammensetung nach Anspruch 59, worin E3 eine RING-Finger-Protein/Cullin-Kombination umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 65, worin die RING-Finger-Protein/Cullin-Kombination aus der aus APC2/APC11, ROC1/CUL1, ROC1/CUL2 und ROC2/CUL5 bestehenden Gruppe ausgewählt wird.