JPS6156131A - 腫瘍壊死因子様物質 - Google Patents
腫瘍壊死因子様物質Info
- Publication number
- JPS6156131A JPS6156131A JP59148740A JP14874084A JPS6156131A JP S6156131 A JPS6156131 A JP S6156131A JP 59148740 A JP59148740 A JP 59148740A JP 14874084 A JP14874084 A JP 14874084A JP S6156131 A JPS6156131 A JP S6156131A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- tnfx
- substance
- necrosis factor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、制ガン作用を有する腫瘍壊死因子様物質（
生体及び試験管内を問わず腫瘍細胞に対しては傷害効果
を示し、正常細胞に対してはそのような効果を示さない
物質；以下ＴＮＦＸと略称する）に関するものである。
生体及び試験管内を問わず腫瘍細胞に対しては傷害効果
を示し、正常細胞に対してはそのような効果を示さない
物質；以下ＴＮＦＸと略称する）に関するものである。
従来技術
従来、各種ダラム陽性菌やエンドトキシンにより誘発さ
れ、殺腫瘍細胞能力などの生理活性を有する物質の存在
は多数報告されている。例えば、Ｃａｒｒｌｅ氏らは、
正常ラットの腹腔浸出液からの細胞にエンドトキシンを
投与することにより、各種腫瘍細胞増殖を抑制する因子
が誘発されることを見出しくＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４
２巻１６００〜１６０５頁（１９７５年）〕、その後該
因子を単離精製することによって、その因子の本体が既
知のアルギナーゼであることをつきとめ報告した［Ｎａ
ｔｕｒｅ（Ｌｏｎ−ｄｏｎ）２７３巻７５８〜７５９頁
（１９７８年）］。またＲｅｅｄ氏らは、エンドトキシ
ン処理をすることによって正常ラットと人間の培養細胞
又は培養単核細胞上清から、Ｌｃｅｌｌ等の培養腫瘍細
胞を殺す能力を持つ分子量４５，０００の蛋白質を見出
している（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１５巻３９５〜４０
４頁（１９７５年）〕。さらにＣａ ｒ ｓｗｅ１１氏
らは、あらかしめｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔ
ｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）を投与したＣＤ−ｌ５ｗ１
ｓｓマウスに再び２週間後にエンドトキシンを静脈内注
射して得られる該マウスの血清が、培養Ｌｃｅ１１に対
して殺細胞能を有すること及びＭｅｔｈ Ａ ｓａ
ｒｃｏｍａで担癌させた（Ｂａｌｂ／ｃＸＣ５７ＢＬ／
６）Ｆ、マウスの腫瘍を出血性壊死に至らしめる現象を
見出し、ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｊａ
Ｆａｃｔｏｒ）と名ずけた（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ 、Ａｃ
ａｄ、ＳｅＩ 、ＵＳＡ７２巻（Ｎｏ、９）３６６６〜
３６７０頁（１９７５年）〕。
れ、殺腫瘍細胞能力などの生理活性を有する物質の存在
は多数報告されている。例えば、Ｃａｒｒｌｅ氏らは、
正常ラットの腹腔浸出液からの細胞にエンドトキシンを
投与することにより、各種腫瘍細胞増殖を抑制する因子
が誘発されることを見出しくＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４
２巻１６００〜１６０５頁（１９７５年）〕、その後該
因子を単離精製することによって、その因子の本体が既
知のアルギナーゼであることをつきとめ報告した［Ｎａ
ｔｕｒｅ（Ｌｏｎ−ｄｏｎ）２７３巻７５８〜７５９頁
（１９７８年）］。またＲｅｅｄ氏らは、エンドトキシ
ン処理をすることによって正常ラットと人間の培養細胞
又は培養単核細胞上清から、Ｌｃｅｌｌ等の培養腫瘍細
胞を殺す能力を持つ分子量４５，０００の蛋白質を見出
している（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１５巻３９５〜４０
４頁（１９７５年）〕。さらにＣａ ｒ ｓｗｅ１１氏
らは、あらかしめｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔ
ｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）を投与したＣＤ−ｌ５ｗ１
ｓｓマウスに再び２週間後にエンドトキシンを静脈内注
射して得られる該マウスの血清が、培養Ｌｃｅ１１に対
して殺細胞能を有すること及びＭｅｔｈ Ａ ｓａ
ｒｃｏｍａで担癌させた（Ｂａｌｂ／ｃＸＣ５７ＢＬ／
６）Ｆ、マウスの腫瘍を出血性壊死に至らしめる現象を
見出し、ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｊａ
Ｆａｃｔｏｒ）と名ずけた（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ 、Ａｃ
ａｄ、ＳｅＩ 、ＵＳＡ７２巻（Ｎｏ、９）３６６６〜
３６７０頁（１９７５年）〕。
発明が解決しようとする問題点
このように従来、Ｃａｒ８ｗｅ１１氏らは、生体（例え
ば実験動物、マウス、ウサギ等）にＢＣＧ（ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）を接取し１
４日後に菌体内毒素であるＨ ＬＰＳ（Ｉ
ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＷ ｆ’ｒｏｍ
Ｅａｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を静脈注射
して２時間後に全採血し、得られた血清中に含まれたか
たしでＴＮＦを採取している。又従来の他の殺腫瘍細胞
能力をもつ因子も各種ダラム陽性菌やエンドトキシンに
より誘発されたものであった。そのため従来のＴＮＦ等
の殺腫瘍細胞能力をもつ因子は、大量に得るには何匹も
の動物が必要で、そのため−匹一匹から得られるＴＮＦ
等の含有率が不均一であった。しかも血清中に存在する
ため他の蛋白（例えばアルブミン、グロブリン等）が多
く、精製するには非常に複雑な過程と時間を要し、さら
に最終的に得られるＴＮＦは決して多くはなかった。ま
た、有害な物質を用いるため安全性の点で問題があった
。
ば実験動物、マウス、ウサギ等）にＢＣＧ（ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）を接取し１
４日後に菌体内毒素であるＨ ＬＰＳ（Ｉ
ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＷ ｆ’ｒｏｍ
Ｅａｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を静脈注射
して２時間後に全採血し、得られた血清中に含まれたか
たしでＴＮＦを採取している。又従来の他の殺腫瘍細胞
能力をもつ因子も各種ダラム陽性菌やエンドトキシンに
より誘発されたものであった。そのため従来のＴＮＦ等
の殺腫瘍細胞能力をもつ因子は、大量に得るには何匹も
の動物が必要で、そのため−匹一匹から得られるＴＮＦ
等の含有率が不均一であった。しかも血清中に存在する
ため他の蛋白（例えばアルブミン、グロブリン等）が多
く、精製するには非常に複雑な過程と時間を要し、さら
に最終的に得られるＴＮＦは決して多くはなかった。ま
た、有害な物質を用いるため安全性の点で問題があった
。
問題を解決するだめの手段
この発明は、従来のような、生体を使用してエンドトキ
シンにより誘発され得られたＴＮＦではなく、エンドト
キシンを使用することなく、安全で容易に大量に得るこ
とのできる腫瘍壊死因子を提供せんとするものであり、
その要旨は、線雑芽様細Ｊｌｑ（Ｆｆｂｒｏｂｌａｓｔ
−ｌｉｋｅ ｃｅ＝３− １１ ｓ ） 、 Ｊｚ皮様細胞（Ｅｐｊｔｈｅｌｉａ
ｌ −１４ｋ ｅ ｃ ｅ Ｉ Ｉ ８ ） ＋リン
パ芽球様細胞（Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ−１ｉｋｅ
ｃｅｌｌｇ）のうち少なくとも１つ以上の細胞を培養増
殖させ、これを自然にあるいは人為的に死滅又は破壊す
ることによって前記細胞より抽出きれる以下特性を有す
るＩｌ！瘍壊死因子様物質。
シンにより誘発され得られたＴＮＦではなく、エンドト
キシンを使用することなく、安全で容易に大量に得るこ
とのできる腫瘍壊死因子を提供せんとするものであり、
その要旨は、線雑芽様細Ｊｌｑ（Ｆｆｂｒｏｂｌａｓｔ
−ｌｉｋｅ ｃｅ＝３− １１ ｓ ） 、 Ｊｚ皮様細胞（Ｅｐｊｔｈｅｌｉａ
ｌ −１４ｋ ｅ ｃ ｅ Ｉ Ｉ ８ ） ＋リン
パ芽球様細胞（Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ−１ｉｋｅ
ｃｅｌｌｇ）のうち少なくとも１つ以上の細胞を培養増
殖させ、これを自然にあるいは人為的に死滅又は破壊す
ることによって前記細胞より抽出きれる以下特性を有す
るＩｌ！瘍壊死因子様物質。
ａ）５６°Ｃ３０分の熱処理に耐え、７０°Ｃ６０分で
不活性化。
不活性化。
ｂ）分子匿 １０００００以上
である。
作用効果
ずなわら、発明者は、培養系線維芽様細胞等（例えばＬ
９２９）にＭφ（マクロファージ；従来ＴＮＦ産生物質
と考えられている。）よりはるかに高いＩｋ１１１Ｍ壊
死因子が含まれていることを見出した。そしてこれらの
細胞を培養し人為的に死滅又は破壊することによって、
前記線維芽様細胞等に含マれているＴＮＦＸが上清液中
に抽出きれることを見出したものである。
９２９）にＭφ（マクロファージ；従来ＴＮＦ産生物質
と考えられている。）よりはるかに高いＩｋ１１１Ｍ壊
死因子が含まれていることを見出した。そしてこれらの
細胞を培養し人為的に死滅又は破壊することによって、
前記線維芽様細胞等に含マれているＴＮＦＸが上清液中
に抽出きれることを見出したものである。
＝４−
例えば実例をあげると、Ｍφ株（例λ−ばＣＡＭＵ−３
）と線維類細胞株（Ｌ９２９）を同条件で破壊して得た
培養液を腫瘍細胞株（例えばＭｅａｔ ｈＡ）に加え４
８時間培養後、その傷害効果（殺生効果と増殖抑制効果
を含む効果）［（（培養液だけの生細胞数）−（ＴＮＦ
を含む培養液での生細胞数））／（培養液だけの生細胞
数）］Ｘ１００ を比較すると、前者はわずか８．８％しかなく後者はそ
の１０倍近い８３．７％と高い傷害効果を示した。さら
に」二皮様細泊株（例えばＣＡＭＵ−３−ＡＴ）では９
６．９％と同様に高い効果であった。しかもこのような
傷害効果を示す培養液を正常細胞に加えても傷害作用は
見られなかった。このことより細胞破壊液中にＴＮＦＸ
（従来のＴＮＦと同等の効果を示す。）の存在が確認さ
れた。即ち、Ｍ≠株より生産されるＴＮＦＸに対して１
０倍以上の量が得られる。また、Ｍφ株を得ることは困
難とされているのに対し、線維芽様細胞、上皮様細胞、
リンパ芽球様細胞は生体から容易に培養可能な細胞であ
り、一般にも多くの細胞株が市販されていることから入
手も容易である。さらにこれら細胞は増殖能力もＭφに
比べ非常に強く短時間で大量の細胞を得ることも可能で
ある。さらにこのＴＮＦＸは生体を使用しないため均一
な質のものが得られやすく、有害な物質を用いないため
安全性の高いものである。従来のＴＮＦは腫瘍を特異的
に破壊することより理想的な癌治療剤として開発が進め
られているが、この発明によるＴＮＦＸは従来のＴＮＦ
と同等の効果を示し、しかも入手が容易で大量培養も可
能な線維芽様細胞、上皮様細胞、リンパ芽球様細胞を使
用し、細胞破壊という単純な生産技術により得られるた
め速やかに量産が可能である。
）と線維類細胞株（Ｌ９２９）を同条件で破壊して得た
培養液を腫瘍細胞株（例えばＭｅａｔ ｈＡ）に加え４
８時間培養後、その傷害効果（殺生効果と増殖抑制効果
を含む効果）［（（培養液だけの生細胞数）−（ＴＮＦ
を含む培養液での生細胞数））／（培養液だけの生細胞
数）］Ｘ１００ を比較すると、前者はわずか８．８％しかなく後者はそ
の１０倍近い８３．７％と高い傷害効果を示した。さら
に」二皮様細泊株（例えばＣＡＭＵ−３−ＡＴ）では９
６．９％と同様に高い効果であった。しかもこのような
傷害効果を示す培養液を正常細胞に加えても傷害作用は
見られなかった。このことより細胞破壊液中にＴＮＦＸ
（従来のＴＮＦと同等の効果を示す。）の存在が確認さ
れた。即ち、Ｍ≠株より生産されるＴＮＦＸに対して１
０倍以上の量が得られる。また、Ｍφ株を得ることは困
難とされているのに対し、線維芽様細胞、上皮様細胞、
リンパ芽球様細胞は生体から容易に培養可能な細胞であ
り、一般にも多くの細胞株が市販されていることから入
手も容易である。さらにこれら細胞は増殖能力もＭφに
比べ非常に強く短時間で大量の細胞を得ることも可能で
ある。さらにこのＴＮＦＸは生体を使用しないため均一
な質のものが得られやすく、有害な物質を用いないため
安全性の高いものである。従来のＴＮＦは腫瘍を特異的
に破壊することより理想的な癌治療剤として開発が進め
られているが、この発明によるＴＮＦＸは従来のＴＮＦ
と同等の効果を示し、しかも入手が容易で大量培養も可
能な線維芽様細胞、上皮様細胞、リンパ芽球様細胞を使
用し、細胞破壊という単純な生産技術により得られるた
め速やかに量産が可能である。
実施例
以下、本発明を具体化した実施例を実験データーととも
に詳細に説明する。
に詳細に説明する。
まず第１のＴＮＦＸ生産例として、上皮様細胞（本例で
はＣＡＭＵ−３−Ａ、）を使用し、このＣＡＭＵ−３−
Ａ、を培養シャーレよりトリプシンやＥＤＴＡにてガラ
ス壁に付着している細胞を剥離分散し採取する。次に、
採取したＣＡＭＵ−３−Ａｔに５％の新生児血清液を加
えた培養液（ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０ 、ＫＮｔ等
）にて３×１０’／ｍｌに調整して細胞浮遊液とする。
はＣＡＭＵ−３−Ａ、）を使用し、このＣＡＭＵ−３−
Ａ、を培養シャーレよりトリプシンやＥＤＴＡにてガラ
ス壁に付着している細胞を剥離分散し採取する。次に、
採取したＣＡＭＵ−３−Ａｔに５％の新生児血清液を加
えた培養液（ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０ 、ＫＮｔ等
）にて３×１０’／ｍｌに調整して細胞浮遊液とする。
これをそのまま５％ＣＯ３下３７°Ｃ通気培養にて９６
時間培養する。以上の手順により、ＣＡＭＵ−３−Ａ７
は培養液中にて細胞過多となり自然死滅する。
時間培養する。以上の手順により、ＣＡＭＵ−３−Ａ７
は培養液中にて細胞過多となり自然死滅する。
これを遠心管に移し、２００ Ｏｒ、ｐ、ｍ、にて１０
分間遠心すると遠心管の底部には細胞片が、上層部には
上清液が得られる。この上清液にはＣＡＭＵ−３−Ａ、
より抽出されたＴＮＦＸが存在するはずであるため、そ
の存在を確認すべく以下の実験を行なった。
分間遠心すると遠心管の底部には細胞片が、上層部には
上清液が得られる。この上清液にはＣＡＭＵ−３−Ａ、
より抽出されたＴＮＦＸが存在するはずであるため、そ
の存在を確認すべく以下の実験を行なった。
まず実験１として、腫瘍細胞（ＭｅａｔｈＡ。
マウス肉腫細胞）を４Ｘ１０’／ｍｊ！に５％牛新生児
血清加培養液にて調整する。その中へ上記方法にて得た
上清液を等量（５０％）加え（最終濃度２ｘｔｏ’／Ｊ
）、５％ＣＯ，下３７℃下気７養にて４８時間培養する
。培養後、腫瘍細胞を採取しトリパンブルー染色法（生
細胞は染色されない）にて生細胞数を算出する。傷害効
果（以下ＣＴＡと略す）は下記の＃１算式にて求めた。
血清加培養液にて調整する。その中へ上記方法にて得た
上清液を等量（５０％）加え（最終濃度２ｘｔｏ’／Ｊ
）、５％ＣＯ，下３７℃下気７養にて４８時間培養する
。培養後、腫瘍細胞を採取しトリパンブルー染色法（生
細胞は染色されない）にて生細胞数を算出する。傷害効
果（以下ＣＴＡと略す）は下記の＃１算式にて求めた。
傷害効果（ＣＩＡ）（Ｘ）−［（（培養液だけの生細胞
数）−（上清液を加えた生細胞数））／ （培養液たけの生細胞数）］Ｘ１００ その結果は ＣＴＡ ９１．８％に達した。
数）−（上清液を加えた生細胞数））／ （培養液たけの生細胞数）］Ｘ１００ その結果は ＣＴＡ ９１．８％に達した。
なお、加える上清液の量を０％〜５０％の範囲において
変化させた実験結果を第１表に示す。
変化させた実験結果を第１表に示す。
第１表
第１表によれば、加えた上清液の濃度の濃いものはどＣ
ＴＡも高く、上清液の濃度が濃いほどＴＮＦＸも多いこ
とがわかる。
ＴＡも高く、上清液の濃度が濃いほどＴＮＦＸも多いこ
とがわかる。
次に、実験２として、上記」−清液に含まれ、上記のよ
うなＣＴＡを示ずＴＮＦＸの性質を知る目的で、上清液
を熱処理（５６°Ｃ３０分、７０°Ｃ６０分、８５°Ｃ
１５分）してみた。その結果得られたＣＴＡを第２表に
示４−０ 第２表によれば、５６℃３０分ではＣＴＡ７６．３％に
対し７０℃６０分、８５℃１５分では１７．５％、２８
．３％とＣＴＡの減少（不活化）がみられた。
うなＣＴＡを示ずＴＮＦＸの性質を知る目的で、上清液
を熱処理（５６°Ｃ３０分、７０°Ｃ６０分、８５°Ｃ
１５分）してみた。その結果得られたＣＴＡを第２表に
示４−０ 第２表によれば、５６℃３０分ではＣＴＡ７６．３％に
対し７０℃６０分、８５℃１５分では１７．５％、２８
．３％とＣＴＡの減少（不活化）がみられた。
このことより、抽出されたＴＮＦＸは熱により効力を失
う糖タンパクの１種と考えられる。
う糖タンパクの１種と考えられる。
次に、実験３として、Ｅｌ、１に使用したＣＡＭＵ−３
−Ａ、の１×１０″／ｍ１〜４ Ｘ １０ ”／ｍｌ！
の各細巾濃度浮遊液を作り９６時間培養（自然死）後の
上清液を腫瘍細胞傷害実験に用いた。その結果得られた
ＣＴＡを第３表に示す。
−Ａ、の１×１０″／ｍ１〜４ Ｘ １０ ”／ｍｌ！
の各細巾濃度浮遊液を作り９６時間培養（自然死）後の
上清液を腫瘍細胞傷害実験に用いた。その結果得られた
ＣＴＡを第３表に示す。
第３表
１ｌ−
Ｅｌ、３細胞数■
第３表によれば、使用する細胞浮遊液の濃度が濃いはど
ＴＮＦＸも多いことがわかる。
ＴＮＦＸも多いことがわかる。
次に第２のＴＮＦＸ生産例として、上皮様細胞（ＣＡＭ
Ｕ ３ Ａｔ）を使用し、このＣＡＭＵ３ Ａｔ
を培養シャーレよりトリプシンやＥＤＴＡにてガラス壁
に付着している細胞を剥離分散し採取する。次に、採取
したＣＡＭＵ−３−Ａｔに５％の新生児血清液を加えた
培養液（ＭＥＭ、ＲＰＭ１１６４０．ＫＮ、等）にて３
Ｘ１０’／ｍｐに調節して細胞浮遊液とする。
Ｕ ３ Ａｔ）を使用し、このＣＡＭＵ３ Ａｔ
を培養シャーレよりトリプシンやＥＤＴＡにてガラス壁
に付着している細胞を剥離分散し採取する。次に、採取
したＣＡＭＵ−３−Ａｔに５％の新生児血清液を加えた
培養液（ＭＥＭ、ＲＰＭ１１６４０．ＫＮ、等）にて３
Ｘ１０’／ｍｐに調節して細胞浮遊液とする。
これを硬質アンプル（セラムチューブ、−１９６°Ｃに
たλ、るもの）に入れ、液体チッソ（−１９６℃）中へ
投入する（急速凍結、約５分間）、次に温水（３７°Ｃ
）へ移す（急速融解、約１０分間）、同操作を３回くり
かえす。以上の手順により、ＣＡＭＵ−３−Ａ、は培養
液中にて物理的に破壊される。これを遠心管に移し、２
０００ｒ、ｐ、ｍ、にて１０分間遠心すると、遠心管の
底部には細胞片が、上層部には上清液が得られる。この
上清液には第１のＴＮＦＸの生産例と同様なＴＮＦＸが
存在するはずである。その存在を確認する意味と、第１
のＴＮＦＸの生産例との比較を行う意味において、実験
４として、実験１に使用したＣＡＭＵ−３−Ａｙの上清
液と凍結融解にて得た上清液を用いてＣＴＡを比較し第
４表を得た。
たλ、るもの）に入れ、液体チッソ（−１９６℃）中へ
投入する（急速凍結、約５分間）、次に温水（３７°Ｃ
）へ移す（急速融解、約１０分間）、同操作を３回くり
かえす。以上の手順により、ＣＡＭＵ−３−Ａ、は培養
液中にて物理的に破壊される。これを遠心管に移し、２
０００ｒ、ｐ、ｍ、にて１０分間遠心すると、遠心管の
底部には細胞片が、上層部には上清液が得られる。この
上清液には第１のＴＮＦＸの生産例と同様なＴＮＦＸが
存在するはずである。その存在を確認する意味と、第１
のＴＮＦＸの生産例との比較を行う意味において、実験
４として、実験１に使用したＣＡＭＵ−３−Ａｙの上清
液と凍結融解にて得た上清液を用いてＣＴＡを比較し第
４表を得た。
第４表
腫瘍細胞（ＭｅａｔｈＡ）
４８時間培養後
Ｅｘｐ、４細胞破壊方法 生細胞数 傷害効果側比較
（ＸＩＯ’） Ｘ培養液のみ ７
８０ ＣＡＭＵ−３−９６時間培養 ２．４ ９６．９
Ａ、 ３Ｘ１０’ ／ｍｊ２ 凍結融解 １．３ ９８．３第４表に
よれば、第１のＴＮＦＸの生産例の方法及び第２のＴＮ
ＦＸの生産例の方法とも同程度のＴＮＦＸが得られたこ
とが確認し得る。なお、上記ＣＡＭＵ−３−Ａ７に換λ
、て、線維芽様細胞（例えばＬ９２９）を使用して第１
のＴＮＦＸの生産例の方法により抽出したものとの比較
も表中に付記した。このように、ＣＡＭＵ−３−Ａ、に
換えてＬ９２９を使用しても、さらに、Ｌ９２９に換え
てリンパ芽球様細胞（例えばＲＬ♂−１）を使用しても
同様にＴＮＦＸが得られる。ここで、ＴＮＦＸの生産に
使用した各細胞の一般的性状を説明すると、線維芽様細
胞とは、生体より取り出した組織をトリプシンやＥ Ｄ
Ｔ Ａ （Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒ
ａａｃｅｔａｔｅ ：細胞付着を防ぐ働きを持つ）で分
散させガラスジＡ・−レ等に培養した場合に、ガラス壁
に付着して紡錘形の細胞形態を取るものを言う。（アメ
リカ組織培養学会用語委員会にて承認されたもの）次に
、上皮様細胞とは、同条件下においてガラス壁に付着し
、多角形の細胞形態を取るものを言う。次に、リンパ芽
球様細胞とは、同条件下において、ガラス壁に付着せず
（一部付着しうる）培養液中に浮遊し球形の細胞形態を
取るものを言う。上記各細胞はいずれもマクロファージ
（大食細胞）が有する通常の性状（Ｆｃレセプター、Ｃ
３レセプター等）や機能（＊食能、腫瘍細胞傷害作用等
）を十分に備えていないものをいう。
（ＸＩＯ’） Ｘ培養液のみ ７
８０ ＣＡＭＵ−３−９６時間培養 ２．４ ９６．９
Ａ、 ３Ｘ１０’ ／ｍｊ２ 凍結融解 １．３ ９８．３第４表に
よれば、第１のＴＮＦＸの生産例の方法及び第２のＴＮ
ＦＸの生産例の方法とも同程度のＴＮＦＸが得られたこ
とが確認し得る。なお、上記ＣＡＭＵ−３−Ａ７に換λ
、て、線維芽様細胞（例えばＬ９２９）を使用して第１
のＴＮＦＸの生産例の方法により抽出したものとの比較
も表中に付記した。このように、ＣＡＭＵ−３−Ａ、に
換えてＬ９２９を使用しても、さらに、Ｌ９２９に換え
てリンパ芽球様細胞（例えばＲＬ♂−１）を使用しても
同様にＴＮＦＸが得られる。ここで、ＴＮＦＸの生産に
使用した各細胞の一般的性状を説明すると、線維芽様細
胞とは、生体より取り出した組織をトリプシンやＥ Ｄ
Ｔ Ａ （Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒ
ａａｃｅｔａｔｅ ：細胞付着を防ぐ働きを持つ）で分
散させガラスジＡ・−レ等に培養した場合に、ガラス壁
に付着して紡錘形の細胞形態を取るものを言う。（アメ
リカ組織培養学会用語委員会にて承認されたもの）次に
、上皮様細胞とは、同条件下においてガラス壁に付着し
、多角形の細胞形態を取るものを言う。次に、リンパ芽
球様細胞とは、同条件下において、ガラス壁に付着せず
（一部付着しうる）培養液中に浮遊し球形の細胞形態を
取るものを言う。上記各細胞はいずれもマクロファージ
（大食細胞）が有する通常の性状（Ｆｃレセプター、Ｃ
３レセプター等）や機能（＊食能、腫瘍細胞傷害作用等
）を十分に備えていないものをいう。
また腫瘍ウィルスや発癌物質等によって腫瘍原性をもっ
た細胞も含めるものである。
た細胞も含めるものである。
次に実験５として、ＴＮＦＸの分子量の目安を知る目的
で、各分子量（ＩＸＩＯ’、３Ｘ１０’、 ｌＸｌ０”
）以下の物質しか通さない特殊な膜を用いて上清液を検
索した。その結果を第５表に示す。
で、各分子量（ＩＸＩＯ’、３Ｘ１０’、 ｌＸｌ０”
）以下の物質しか通さない特殊な膜を用いて上清液を検
索した。その結果を第５表に示す。
第５表
第５表の結果によれば、本実験により得たＴＮＦＸは分
子鼠ｌＸ１０’以上の因子と思料される次に、実験６と
して、各種細胞を使用して実験を行ない、各種細胞別に
ＴＮＦＸの生産能の比較を行なった。その結果を第６〜
第８表に示す。
子鼠ｌＸ１０’以上の因子と思料される次に、実験６と
して、各種細胞を使用して実験を行ない、各種細胞別に
ＴＮＦＸの生産能の比較を行なった。その結果を第６〜
第８表に示す。
第６表
第６〜第８表の結果によれば、ＣＡＭＵ−３−Ａ ｙ（
９６，９％）、Ｔ−９２９（８３，７％＞、ＲＬ ♂
１ （９１，９％）。
９６，９％）、Ｔ−９２９（８３，７％＞、ＲＬ ♂
１ （９１，９％）。
Ｂ ａ Ｉ ｂ／３ Ｔ ３ （９７，８％＞、正常マ
ウス胎児由来線維芽様細Ｊｆｉ（７５，２に）と高いＣ
ＴＡを示したのに対し、 Ｍｅ ａ ｔ ｈＡ（８，３
％＞、５Ｖ−Ｔｔ（１３，５％＞、ＹＡＣ−１（１，２
２）、 Ｘ Ｃ（３，０％＞ 、！：有効なＣＴＡはみ
られなかった。
ウス胎児由来線維芽様細Ｊｆｉ（７５，２に）と高いＣ
ＴＡを示したのに対し、 Ｍｅ ａ ｔ ｈＡ（８，３
％＞、５Ｖ−Ｔｔ（１３，５％＞、ＹＡＣ−１（１，２
２）、 Ｘ Ｃ（３，０％＞ 、！：有効なＣＴＡはみ
られなかった。
次に、実験７として、マクロファージ株ＣＡＭＵ−３−
Ｒ，ＣＡＭＵ−３１−Ｒ）にて各細胞濃度（４Ｘ１０’
／Ｊ 〜８Ｘ１０’／ｍＮ ）で４８時間培養（自然死
）後の上清液のＣＴＡを検索した。その結果を第９及び
第１０表に示す。
Ｒ，ＣＡＭＵ−３１−Ｒ）にて各細胞濃度（４Ｘ１０’
／Ｊ 〜８Ｘ１０’／ｍＮ ）で４８時間培養（自然死
）後の上清液のＣＴＡを検索した。その結果を第９及び
第１０表に示す。
第１０表
第９表及び第１０表の結果によれば、マクロファージ株
では各細胞濃度いずれも有効なＣＴＡを示さなかった。
では各細胞濃度いずれも有効なＣＴＡを示さなかった。
次に、実験８として、ＴＮＦＸの正常細胞に対する効果
を検討した。正常マウス（Ｂ ａ Ｉ ｂ／ｃ系）の肺
臓を細分して得たリンパ系細胞、同マウス妊娠中期の胎
児を細切して得たリンパ系細胞、線維芽様細胞を腫瘍開
胸の変わりに用いてＣＴＡを検索した。その結果を第１
１表に示す。
を検討した。正常マウス（Ｂ ａ Ｉ ｂ／ｃ系）の肺
臓を細分して得たリンパ系細胞、同マウス妊娠中期の胎
児を細切して得たリンパ系細胞、線維芽様細胞を腫瘍開
胸の変わりに用いてＣＴＡを検索した。その結果を第１
１表に示す。
第１１表
※Ｎ 、 Ｄ （ｎｏｔ ｄｏｎｅ） ：未実験第１１
表の結果によれば、ＣＡＭＵ−３−Ａ。
表の結果によれば、ＣＡＭＵ−３−Ａ。
の上清液及び、Ｌ９２９の上清液ともＣＴＡはのられな
かった。
かった。
以上の結果をまとめると、１）上皮様細胞、線維芽様細
胞、リンパ芽球様細胞の各細胞培養株の中に高いＣＴＡ
を示す因子が存在することが確認きれた。２）ＣＴＡを
示す因子は５６℃３０分に耐え７０°Ｃ６０分で不活化
きれ、分子量１０万以上（現時点で）と思料される。３
〉マクロファージ株には有効なＣＴＡはみられなかった
。４）上記のＣＴＡは正常細胞には傷害を示さなかった
。
胞、リンパ芽球様細胞の各細胞培養株の中に高いＣＴＡ
を示す因子が存在することが確認きれた。２）ＣＴＡを
示す因子は５６℃３０分に耐え７０°Ｃ６０分で不活化
きれ、分子量１０万以上（現時点で）と思料される。３
〉マクロファージ株には有効なＣＴＡはみられなかった
。４）上記のＣＴＡは正常細胞には傷害を示さなかった
。
このことより、この因子（ＴＮＦＸ）は従来のＴＮＦと
同等の効果を示すことが確認された。
同等の効果を示すことが確認された。
このように第１のＴＮＦＸの生産例の抽出法によっても
、又、第２のＴＮＦＸの生産例の抽出法によっても、有
効なＴＮＦＸが抽出されたことが確認でき、さらに、第
２のＴＮＦＸの生産例の凍結融解による細胞の破壊にか
え、超音波処理、その他何らかの物理的、科学的方法で
細胞を死滅、又は破壊しても同様に有効なＴＮＦＸが抽
出できるこのように、本例ＴＮＦＸは、入手が容易な線
維芽様細胞、上皮様細胞、リンパ芽球様細胞を使用して
、それらを細胞過多の条件にて自然死させるか、又は凍
結、融解の繰り返し作業あるいは超音波処理作業等によ
ってｍ胞を破壊することにより抽出することができ、容
易にしかも安全かつ大量に生産することができる。
、又、第２のＴＮＦＸの生産例の抽出法によっても、有
効なＴＮＦＸが抽出されたことが確認でき、さらに、第
２のＴＮＦＸの生産例の凍結融解による細胞の破壊にか
え、超音波処理、その他何らかの物理的、科学的方法で
細胞を死滅、又は破壊しても同様に有効なＴＮＦＸが抽
出できるこのように、本例ＴＮＦＸは、入手が容易な線
維芽様細胞、上皮様細胞、リンパ芽球様細胞を使用して
、それらを細胞過多の条件にて自然死させるか、又は凍
結、融解の繰り返し作業あるいは超音波処理作業等によ
ってｍ胞を破壊することにより抽出することができ、容
易にしかも安全かつ大量に生産することができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 線維芽様細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｃｅ
ｌｌｓ）、上皮様細胞（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｌｉｋ
ｅ ｃｅｌｌｓ）、リンパ芽球様細胞（Ｌｙｍｐｈｏｂ
ｌａｓｔ−ｌｉｋｅｃｅｌｌｓ）のうち少なくとも１つ
以上の細胞を培養増殖させ、これを自然にあるいは人為
的に死滅又は破壊することによって前記細胞より抽出さ
れる以下特性を有する腫瘍壊死因子様物質。 ａ）５６℃３０分の熱処理に耐え、７０℃６０分で不活
性化。 ｂ）分子量 １０００００以上
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59148740A JPS6156131A (ja) | 1984-07-17 | 1984-07-17 | 腫瘍壊死因子様物質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59148740A JPS6156131A (ja) | 1984-07-17 | 1984-07-17 | 腫瘍壊死因子様物質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6156131A true JPS6156131A (ja) | 1986-03-20 |
Family
ID=15459558
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59148740A Pending JPS6156131A (ja) | 1984-07-17 | 1984-07-17 | 腫瘍壊死因子様物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6156131A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03105119U (ja) * | 1990-02-14 | 1991-10-31 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4993523A (ja) * | 1972-10-20 | 1974-09-05 | ||
| JPS58107197A (ja) * | 1981-12-21 | 1983-06-25 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 |
| JPS58225024A (ja) * | 1982-06-23 | 1983-12-27 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 糖蛋白質およびその製造方法ならびに腫瘍治療剤 |
| JPS5984827A (ja) * | 1982-07-30 | 1984-05-16 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | ヒトリンホトキシン |
| JPS5988423A (ja) * | 1982-11-09 | 1984-05-22 | Nippon Chem Res Kk | ヒト腫瘍細胞変性因子の製造方法 |
-
1984
- 1984-07-17 JP JP59148740A patent/JPS6156131A/ja active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4993523A (ja) * | 1972-10-20 | 1974-09-05 | ||
| JPS58107197A (ja) * | 1981-12-21 | 1983-06-25 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 |
| JPS58225024A (ja) * | 1982-06-23 | 1983-12-27 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 糖蛋白質およびその製造方法ならびに腫瘍治療剤 |
| JPS5984827A (ja) * | 1982-07-30 | 1984-05-16 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | ヒトリンホトキシン |
| JPS5988423A (ja) * | 1982-11-09 | 1984-05-22 | Nippon Chem Res Kk | ヒト腫瘍細胞変性因子の製造方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03105119U (ja) * | 1990-02-14 | 1991-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Matthews | Tumour-necrosis factor from the rabbit. V. Synthesis in vitro by mononuclear phagocytes from various tissues of normal and BCG-injected rabbits | |
| Menkin | Biology of inflammation: chemical mediators and cellular injury | |
| Lundgren et al. | Differential effects of human granulocytes and lymphocytes on human fibroblasts in vitro | |
| Fisch et al. | In vitro production of rabbit macrophage tumor cell cytotoxin | |
| CN106620681A (zh) | 一种细胞裂解液、试剂盒及在制备肿瘤全细胞抗原负载dc肿瘤疫苗中的应用 | |
| Meyrick et al. | Effects of recombinant tumor necrosis factor-alpha on cultured pulmonary artery and lung microvascular endothelial monolayers. | |
| JPH02109994A (ja) | モノクローナル抗体及びそれから誘導されたフラグメントによるＴＮＦ‐αの試験管内及び生体内毒性の中和 | |
| Freedman et al. | Cellular distribution of nuclear factor κB binding activity in rat liver | |
| US20080063631A1 (en) | Apoptotic entities for use in treatment of endothelium dysfunction disorders | |
| Pasieka et al. | Glutamine metabolism of normal and malignant cells cultivated in synthetic media | |
| JPS60112718A (ja) | 抗腫瘍作用を示す蛋白性物質及びその製造方法 | |
| JPS6156131A (ja) | 腫瘍壊死因子様物質 | |
| JPS58141785A (ja) | 抗腫瘍物質の製法 | |
| Alexander et al. | Stimulants of cellular proliferation in wounds | |
| CN114190367B (zh) | 冻存液及其制备方法与在免疫细胞的应用 | |
| Xie et al. | The role and mechanisms of macrophage polarization and hepatocyte pyroptosis in acute liver failure | |
| JPH05505093A (ja) | Ｌａｋ細胞の産生増殖方法 | |
| US6331403B1 (en) | Use of mCRP to slow cell growth and to promote maturation of cells | |
| JPS6124520A (ja) | 腫瘍壊死因子様物質を抽出する方法 | |
| JP3703828B2 (ja) | 医薬製剤におけるカルシウム活性化中性プロテアーゼ抑制因子の使用 | |
| JP2021512654A (ja) | 温熱条件の組織からの幹細胞の単離方法及びその使用 | |
| US2992165A (en) | Method of potentiating acth preparations | |
| JPS63164895A (ja) | 培養細胞由来のレクチン様蛋白質及びその製法並びに該物質を主成分とする抗腫瘍剤 | |
| JPS59141519A (ja) | 制ガン作用を有する蛋白質 | |
| US20220241340A1 (en) | Composition of pharmaceutical carrier solution for mesenchymal stem cells and use of the same |