TWI577694B

TWI577694B - 重組細胞毒素蛋白及其應用

Info

Publication number: TWI577694B
Application number: TW104139300A
Authority: TW
Inventors: 林茂榮; 羅文良; 陳道田
Original assignee: 國立陽明大學
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2017-04-11
Also published as: TW201718625A; US20170152293A1

Description

重組細胞毒素蛋白及其應用

本發明係有關於一種重組細胞毒素蛋白，特別為一種具自我摧毀程式的毒素蛋白。

毒素為一有機或無機分子，其即使在低濃度下也會對生物體產生有害影響。毒素可分成兩種。第1種為天然毒素，主要來自於致病細菌、有毒真菌、植物及有毒動物。第2種為人為毒素。許多細菌及植物會產生細胞毒素蛋白，統稱核醣體毒素，其在進入目標細胞後會去活化細胞的核醣體功能。核醣體毒素可分為2大類：(1)NAD+依賴型核醣體毒素，其藉由共價連接ADP-核醣與延伸因子-2蛋白以去活化核醣體；(2)NAD+非依賴型核醣體毒素，其去活化60S核醣體。核醣體毒素僅影響真核細胞的核醣體，在很低濃度下會造成死亡。

核醣體毒素可為一種異源2聚體或單一聚胜肽，其中為異源2聚體者係藉由雙硫鍵共價連接酶一活性A鏈聚胜肽與一非酶活性B鏈聚胜肽，非酶活性B鏈聚胜肽可結合至目標細胞表面以促進細胞的攝取。前述異二聚體核醣體毒素包括蓖麻毒蛋白(ricin)、相思豆毒蛋白(abrin)及蒴蓮根(modeccin)。而為單一聚胜肽者其自具有細胞毒性，因此又稱為“為鏈毒素”或“溶血毒素”，其中如前列腺酸性磷酸酶(Prostatic Acid Phosphatase protein，PAP)等。

許多核醣體毒素，如ricin、abrin與PAP為天然形式或超過一種以上形式。因此，這些核醣體毒素具有許多同簇毒素，即結構上類似但具不同功能。

目前，已有許多利用核醣體毒素的細胞毒殺特性，使用未修飾的聚胜肽作為治療藥劑)。然而，大部份的核醣體毒素係藉由共價連結於混合毒素(hybrid toxin)之結合部，，而能專一性結合至某些細胞、病毒或其它大分子。最常見的混合毒素係如具細胞毒性胜肽共價結合於一特定抗體而形成一免疫毒素。前述的混合毒素，雖具專一性之特性，然於針對特定目標作用完成後，前述之這些毒素蛋白仍很容易影響其它周圍的正常細胞。

有鑑於上述先前技術所存在之問題，本發明提供一種重組細胞毒素蛋白。本發明重組細胞毒素蛋白具有自我摧毀程式，可有效地毒殺目標細胞，但不影響周圍細胞。

本發明提供一種重組細胞毒素蛋白，包括一細胞毒素蛋白、一細胞穿透胜肽以及一DEVD序列，其中該DEVD序列鑲嵌於該細胞毒素蛋白。

在本發明一實施例中，其中此細胞穿透胜肽透過一連結子與該細胞毒素蛋白聯結。

在本發明一實施例中，其中此重組細胞毒素蛋白包括核醣體毒素蛋白、蛇毒蛋白、蜂毒蛋白、水母毒蛋白或蟾蜍毒蛋白。

在本發明一實施例中，其中核醣體毒素蛋白擇自下所組成之族群：真菌之核醣體毒素蛋白、蓖麻子毒蛋白(ricin)、雞母珠毒蛋白(abrin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、辛納毒蛋白(cinnamomin)及克木毒蛋白(camphorin)、α-sarcin、mitogillin、restrictocin、clavin及tricholin。

在本發明一實施例中，其中真菌之醣體毒素蛋白為α-sarcin、mitogillin、restrictocin、clavin及tricholin。

在本發明一實施例中，其中細胞穿透胜肽包括Tat、antennapedia或聚精胺酸(polyarginine)。

在本發明一實施例中，其中DEVD序列位於核醣體毒素蛋白的環圈區域(loop region)。

在本發明一實施例中，其中DEVD序列位於核醣體毒素蛋白的第2環圈區域(loop 2)。

在本發明一實施例中，其中Tat鑲嵌於該細胞毒素蛋白的胺基端(N-端)。

本發明另提供一種醫藥組成物，包括申請專利範圍第1項之重組細胞毒素蛋白以及一藥學上可接受之載體。

本發明更提供一種使用之重組細胞毒素蛋白，來製備用以治療細胞增生性疾病之藥學組成物之用途。

在本發明一實施例中，其中重組細胞毒素蛋白為局部投予。

在本發明一實施例中，其中細胞增生性疾病為癌症。

在本發明一實施例中，其中癌症包括口腔癌、乳癌、前列腺癌、血癌、大腸癌、子宮癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、睪丸癌、淋巴癌、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、胰臟癌、肺癌、腦瘤、皮膚癌、胃癌、肝癌、腎臟癌或鼻咽癌。

A‧‧‧重組細胞毒素蛋白

C‧‧‧細胞毒素蛋白

P‧‧‧細胞穿透胜

DEVD‧‧‧DEVD序列

第1圖顯示本發明之重組細胞毒素蛋白之設計。

第2a-2e圖顯示本發明重組細胞毒素蛋白毒殺細胞的過程。

第3圖為一SDS-PAGE電泳圖。第3圖顯示KZ-sarcin重組蛋白被caspase-3水解成12kb及8.5kb兩個片段。

第4圖為一RNA電泳圖顯示。第4圖顯示28S rRNA被KZ-sarcin水解成α片段。證明KZ-sarcin的體外水解RNA的活性。

第5圖顯示KZ-sarcin蛋白可有效地抑制蛋白質的合成。 KZ-sarcin，KZ-sarcin濃度愈高，蛋白質的轉譯效率愈低。

第6圖為螢光顯微鏡及位相差顯微鏡影像。第6圖顯示可在KZ-sarcin處理的細胞發現螢光訊號，表示KZ-sarcin蛋白可進入細胞中。

第7圖顯示KZ-sarcin可抑制蛋白質的合成。KZ-sarcin處理的時間愈久，抑制蛋白質合成的作用愈明顯。

第8圖為螢光顯微鏡影像。細胞經KZ-sarcin處理後會產生空泡(vacuoles)，而且細胞核分解成片段。KZ-sarcin會促使細胞走向細胞自我凋亡。

第9圖顯示細胞在經KZ-sarcin處理後2小時產生8.5kD的胜肽片段(C端-胜肽)。

第10圖顯示細胞經KZ-sarcin處理1、2、3、4、5小時後，細胞中caspase 3的活性。

第11a-11b圖顯示在動物實驗中，KZ-sarcin可有效地抑制腫瘤生長，以減緩甚至是終止腫瘤生長。

第12圖為細胞H&E染色顯微鏡影像。第12圖顯示經KZ-sarcin處理後，細胞呈現核染質凝集(chromatin condensation)、多重核碎裂(multiple nuclear fragmentation)及凋亡小體(apoptotic body)。至於未接觸到KZ-sarcin的細胞，則保持原有的細胞形態。

13圖為KZ-sarcin三度結構電腦模擬圖。

本發明係提供一種重組細胞毒素蛋白，包括一細胞毒素蛋白、一細胞穿透胜肽以及一DEVD序列，其中該DEVD序列鑲嵌於該細胞毒素蛋白。

參照第1圖，本發明之重組細胞毒素蛋白(A)包括細胞毒素蛋白(C)與細胞穿透胜肽(P)。細胞穿透胜肽(P)可位於細胞毒素蛋白的胺基端(N端)或羧基端(C端)。細胞穿透胜肽(P)可藉由一或多個連結子(linker)聯結細胞毒素蛋白。DEVD序列為一Asp-Glu-Val-Asp短胜肽，可被硫胱氨酸蛋白酶三型(caspase-3)所辨識。DEVD序列被插入/鑲嵌於細胞毒素蛋白中。應注意的是，DEVD序列不影響細胞毒素蛋白的活性。因此，本發明之重組細胞毒素蛋白仍具有毒殺細胞的能力。

本發明中所述之“毒素”係特別指特徵上為毒性物質，通常為具有生物活性的蛋白質。毒素可來自於微生物、植物或動物。

毒素包括各種生物(包括細菌、植物)的複雜的有毒產物。毒素包括，但不限於核醣體毒素蛋白、蛇毒蛋白、蜂毒蛋白、水母毒蛋白或蟾蜍毒蛋白等，較佳為核醣體毒素蛋白。毒素蛋白可利用重組DNA技術形成本發明之重組蛋白。毒素蛋白可共價連接另一功能性蛋白。

本發明所述“核醣體毒素蛋白”係指任何天然或合成的胜肽或聚胜肽，其可專一性酵素作用核醣體中特定序列的某個特定鹼基。核醣體毒素蛋白包括，但不限於，真菌之核醣體毒素蛋白、蓖麻子毒蛋白(ricin)、雞母珠毒蛋白(abrin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、辛納毒蛋白(cinnamomin)及克木毒蛋白(camphorin)。

再者，本發明真菌之核醣體毒素蛋白包括，但不限於，α-sarcin、mitogillin、restrictocin、clavin及tricholin，較佳為α-sarcin。

本發明所述之“細胞穿透胜肽(cell penetrating peptide，CPP)”為一載體胜肽，其可穿透生物性膜或生理屏障。細胞穿透胜肽具有易位(translocate)體外及/或體內的哺乳動物細胞膜並進入細胞的能力，並攜帶感興趣的共價化合物，例如藥物或標記，進入以期望的目的地，例如細胞質(細胞溶膠，內質網，高爾基體等)或細胞核。因此，細胞穿透胜肽可直接，或促進化合物穿透磷脂、線粒體、核內體或核膜。細胞穿透胜肽也可直接攜帶化合物通過細胞膜從細胞外進入細胞質或在細胞內，例如，細胞核、核糖體、線粒體、內質網、溶酶體或過氧化物酶體。此外，細胞穿透胜肽可攜帶化合物穿透過血腦、皮膚、胃腸道及/或肺等生物性屏障。

許多蛋白質及其衍生物具有細胞穿透活性，包括，但不限於，人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)蛋白Tat(Ruben et al.J.Virol.63,1-8(1989))、皰疹病毒衣殼蛋白VP22(Elliott and O'Hare,Cell 88,223-233(1997))、antennapedia(Derossi et al.,J.Biol.Chem.271,18188-18193(1996))、protegrin 1(PG-1)、抗微生物肽SynB(Kokryakov et al.,FEBS Lett.327,231-236(1993))及鹼性成纖維細胞生長因子(Jans,Faseb J.8,841-847(1994))。衍生於上述蛋白之穿透蛋白序列的同源性不高，主要是具有豐富的陽離子和精氨酸或賴氨酸。實際上，合成的多聚精氨酸胜肽(polyarginine)已被證明具高度穿透性(Futaki et al.,J.Mol.Recognit.16,260-264(2003)；Suzuki et al.,J.Biol.Chem.(2001))。

本發明所述之連結子為一共價鍵，較佳為胜肽鍵。重組細胞毒素蛋白可選擇性地包括至少一連結子。連結子介於細胞毒素蛋白與細胞穿透胜肽之間。在一實施例中，連結子包括1-5個胺基酸。

在本發明一特定實施例中，細胞毒素蛋白為α-sarcin，細胞穿透胜肽為Tat，而DEVD序列位於α-sarcin的環圈區域(loop region)上，較佳為第2環圈區域(loop 2)，其中所述DEVD序列更佳為係位於α-sarcin之第2環圈區域的第84胺基酸(甘胺酸)之前。

本發明另提供一種醫藥組成物，包括本發明所述之重組細胞毒素蛋白以及一藥學上可接受之載體。

本發明之組成物可被製作成適當的形式，例如粉末、錠劑、藥片、顆粒、膠囊、塗劑、懸浮液、微脂體、鼻劑、貼片、栓劑、腸劑、輸注液或注射液。本發明之組成物可藉由一必須的程序投予至一個體。本發明組成物的給予方式包括口服、非腸胃式、靜脈注射、經直腸、經皮下、經皮內、經肌肉或局部給予至一個體。

本發明中所述之“個體”係指人類或非人類之動物，如，狗、小鼠、大鼠、牛、綿羊、豬、山羊、或靈長類動物，特別為實驗動物、家畜、及馴養的動物。在一實施例中，動物可為人類。在另一實施例中，動物可為一齧齒目動物，例如，小鼠或大鼠。在另一實施例，個體可為一動物模式(例如，基因轉殖鼠)。

用於非腸胃道、皮內或皮下投予之溶液可包括一經消毒的稀釋液，例如，水、食鹽水、甘油、固定油、聚乙二醇、丙烯乙二醇、或其他合成溶劑；一抗菌劑，例如，苯甲醇或甲基安息香酸酚酯；一抗氧化劑，例如，維他命C或亞硫酸氫鈉；一螯合劑；或一緩衝劑，例如，醋酸鹽或磷酸鹽。溶液可儲存於細頸瓶(ampoules)、丟棄式注射器、塑膠或玻璃瓶。

若為注射或靜脈注射的投予形式，組成物可包括一溶劑或分散劑之載體。適當的載體包括水、生理食鹽水、抑菌水、Cremophor EL.TM.(BASF,Parsippany,N.J.)、磷酸緩衝液(PBS)、乙醇、多元醇(例如，甘油、乙二醇、丙烯乙二醇及其類似物)、及其混合物。上述組成物必須經消毒及液化以適合注射。在本發明中，可藉由如卵磷脂或界面活性劑等，來維持組成物的流動性。在本發明中，可藉由抗細菌或抗真菌劑，如苯甲酸脂類(parabens)、氯丁醇、酚、維生素C及硫柳汞，來防止微生物的污染。此外，可使用醣類或高分子醇類，如甘露醣醇、山梨醣醇、氯化鈉，來維持本發明組成物之滲透壓。

本發明另提供一種使用本發明重組細胞毒素蛋白，來製備用以治療細胞增生性疾病之藥學組成物之用途。

本發明之重組細胞毒素蛋白可穿透膜屏障至細胞內，以達成毒殺細胞的目的。在細胞凋亡時所產生的酵素，如caspase-3，可辨識重組細胞毒素蛋白上的DEVD序列，而破壞細胞毒素蛋白結構。

本發明所述之“細胞增生性疾病”係指在一多細胞組織中發生一或複數個細胞群不正常增生所導致的多細胞組織傷害。細胞增生性疾病可發生於不同的動物及人類。細胞增生性疾病包括，但不限於，癌症、血管增生性疾病及纖維化疾病，較佳為癌症。癌症包括，但不限於，口腔癌、乳癌、前列腺癌、血癌、大腸癌、子宮癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、睪九癌、淋巴癌、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、胰臟癌、肺癌、腦瘤、皮膚癌、胃癌、肝癌、腎臟癌或鼻咽癌，較佳為口腔癌。

第2a-2d圖顯示本發明重組細胞毒素蛋白毒殺細胞的過程。參照第2a-2b圖，提供一載體，並表現重組細胞毒素蛋白。參照第2c圖，使重組細胞毒素蛋白接觸一細胞。重組細胞毒素蛋白藉由細胞穿透胜肽，進入此細胞。重組細胞毒素蛋白誘發此細胞造成凋亡程序(第2d圖)，而產生caspase-3酵素。caspase-3酵素辨識重組細胞毒素蛋白上的DEVD序列，而將重組細胞毒素蛋白分解(第2e圖)。

本發明之重組細胞毒素蛋白在進入目標細胞後，可誘導目標細胞自我凋亡，並且被凋亡過程中產生的酵素分解。因此，本發明重組細胞毒素蛋白僅作用於目標細胞，而不影響目標細胞周圍的細胞。

所有說明書中所揭示之發明技術特點可以任意方式組合。說明書中揭示之每一技術特點可以提供相同、等同或相似目的之其他方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般系列之實例。

無需進一步詳盡說明，本技術領域的入員可根據以上描述，使用本發明至其最大限度。下面的具體實施方式，其應解釋為僅是說明性的，且不可用於限制本發明。本文所引用的文獻均併入本發明。

【實施例】

1.重組蛋白基因的構築

由Aspergillus giganteus基因體以聚合酶連鎖反應(PCR)增幅，取得α幅，取得合酶連基因片段，並將α因片段，並將連基因片段插入pET22b載體，形成pET22b/KZ-sarcin。藉PCR技術，並利用2條N端引子(N Primer)和1條C端引子(C Primer)而將Tat胜肽融合於以pET28a/α-sarcin為模板的α-sarcin之N端，前述N1引子(N1 Primer)係為5'-NNNCCATGGGTAGAAAAAAACGAAGACAACGACGAAGAGGTGGTGGTAGC-3'(SEQ ID NO：1)；N2引子(N2 Primer)係為5'-GACGAAGAGGTGGTGGTAGCgtgacctggacctgcttgaacg-3'(SEQ ID NO：2)；C端引子(C Primer)係為5'-TAAAGCGGCCGCAtgagagcagagcttaagttc-3'(SEQ ID NO：3)。其中N1引子係攜帶Tat胜肽中的基礎結構域(basic domain)序列MGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：4)、一連結子(linker)GGGS(SEQ ID NO：5)、及Nco I限制酶切位(N1引子序列中劃底線者)，而N2引子係攜帶N1引子重覆序列(N2引子序列中大寫者)、α-sarcin序列(N2引子序列小寫者)，C端引子係攜帶α-sarcin序列(C端引子序列小寫者)、及Not I限制酶切位(C端引子序列中劃底線者)。聚合酶連鎖反應後，藉Nco I與Not I限制酶水解，繼而連接pET22b並形成pET22b/Tat-sarcin。進一步，利用一前置引子5'-GACGAAGTGGATggcaagagtgatcactacctgctggag-3'(SEQ ID NO：6)及一後置引子5'-cttgctgtgcttgggaggacg-3'(SEQ ID NO：7)，以pET22b/Tat-sarcin為模板，將DEVD(SEQ ID NO：8)插入至α入至Q ID的第2環圈區域(loop-2)。前述前置引子係攜帶DEVD序列(前置引子序列中大寫者)和相關α-sarcin序列(前置引子序列中小寫者)。PCR反應後，將產物純化，自我黏合轉殖至ECOS101勝任細胞(Competent cells)，得到pET22b/KZ-sarcin。

2.重組蛋白的表現及純化

將含有pET22b/KZ-sarcin質體的E.coli BL21 DE3培養於LB培養基中，加入IPTG後，於37於G震盪培養2小時。將菌液離心，收集菌塊。將菌塊置於50mL的溶解緩衝液(lysis buffer)，用超音波破碎機(sonicator)將細菌打破，經高速離心(39000g)1小時後，去除上清液，收集包涵體(inclusion body)。將包涵體置於變性結合緩衝液(denature binding buffer)中，利用超音波震盪器將包涵體溶解。經高速離心後，將上清液與Ni+-His膠體於4體於下反應2小時，經變性清洗緩衝液(denature wash buffer)清洗，及變性洗提緩衝液(denature elute buffer)洗提後，獲得KZ-sarcin重組蛋白(SEQ ID NO：9)，KZ-sarcin重組蛋白的序列如下所示：

以SDS-PAGE電泳分析KZ-sarcin重組蛋白。分別將2組蛋的KZ-sarcin蛋白與0.1sa的caspase-3(Sigma Chem.Co,U.S.A.)於磷酸鹽緩衝液(PBS)中，於室溫下反應15分鐘後，以SDS-PAGE電泳分析。使用α泳分析。使用E變異蛋白(Sarcin*)作為對照組。參照第3圖，KZ-sarcin重組蛋白被caspase-3水解成12kb及8.5kb兩個片段。

3.核糖體去活化分析

在本實施例中，使用兔子網狀紅血球細胞萃取液(rabbit reticulum lysate，RRL)進行核糖體去活化分析。將兔子網狀紅血球細胞萃取液分別以α行核糖體去活化或KZ-sarcin處理後，以1%的瓊脂膠體進行分析。參照第4圖，28S rRNA被KZ-sarcin水解成α片段。證明KZ-sarcin與α Z-sarcin野生型，wild type)相同皆具體外水解RNA的活性。進一步言，經插入Tat與DEVD胜肽之KZ-sarcin重組蛋白並不會影響其破壞核醣體的能力。

4.無細胞系統蛋白合成分析

在本實施例中，使用RRL轉譯系統進行分析。先以以不同濃度的KZ-sarcin處理RRL後，置於含有20mM HEPES、5mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol)、5mM醋酸鎂、100mM醋酸鉀、2mM ATP、0.4mM GTP、8mM磷酸肌酸、50酸mM G磷酸肌酸酶、20肌酸無甲硫氨酸之胺基酸、1200Ci/mmol的1mCi/mL[³⁵S]甲硫氨酸的溶液中。加入40液中。加入冷光mRNA，於37NA下反應90分鐘，以進行蛋白質轉譯。使用10%trichloroacetic acid(TCA)沉澱含放射線[³⁵S]的蛋白質，並以GF/A玻璃過濾器(Whatman Co.)收集。利用液體閃爍計數器(Tri-Carb 2900TR)分析[³⁵S]放射活性。參照第5圖，KZ-sarcin濃度愈高，蛋白質的轉譯效率愈低。由此結果可知，KZ-sarcin蛋白可有效地抑制蛋白質的合成。

5. KZ-sarcin進入細胞的能力

於500胞的的磷酸鹽緩衝液(PBS)中，將500胞的的KZ-sarcin蛋白或α白或sarci與50或sarcin轉譯效率愈低。由此結果於室溫下混合1小時，將KZ-sarcin蛋白連接上螢光物質Alexa-fluor 555。將HeLa細胞以含有2胞以之KZ-sarcin蛋白或α白或sarci的DMEM溶液於37於s下處理1小時。利用PBS清洗後，以螢光顯微鏡及位相差顯微鏡觀察。參照第6圖，經KZ-sarcin蛋白處理的細胞產生螢光訊號。相反地，以α反地，以細胞產處理的細胞則無螢光訊號。由此結果可確認，KZ-sarcin蛋白可進入細胞中。

6.細胞內蛋白質合成抑制的能力

將239 T細胞(0.3OD₆₅₀)培養於含有[³⁵S]甲硫氨酸中，當細胞溶液到達0.5 OD₆₅₀時，以1，0的KZ-sarcin處理細胞液。在不同的時間點收集細胞並快速地溶於1ml的冷TCA，以GF/A glass filter(Whatman Co.)收集含[³⁵S]甲硫氨酸的胜肽。利用液體閃爍計數器(Tri-Carb 2900TR)分析[³⁵S]放射活性。參照第7圖，細胞係分別以KZ-sarcin(29、α Z-sarcin(2、及對照組(△)處理。在經KZ-sarcin蛋白處理的細胞中，蛋白質的合成能力明顯降低。KZ-sarcin處理的時間愈久，抑制蛋白質合成的作用愈明顯。

7. Hoechst 33342染色分析

將HeLa細胞以含有2胞以之KZ-sarcin或α Z-sarci的DMEM(不含血清)於37血清下處理1小時。經PBS清洗2次後，以DMEM(不含血清)在37血清下處理1小時。經PBS清洗2次後，以含有5後，以含有cin33342成的作之DMEM(不含血清)於37血清下處理1小時。去除多餘染劑，以4%paraformaldehyde固定細胞，進行Hoechst 33342染色，利用螢光顯微鏡觀察(Olympus FV1000)。參照第8圖，經KZ-sarcin處理的細胞產生空泡(vacuoles)，而且細胞核分解成片段。此結果可證實KZ-sarcin會促使細胞走向細胞自我凋亡。

8.細胞內KZ-sarcin對硫胱氨酸蛋白酶三型(caspase-3)的反應

將口腔SAS細胞以KZ-sarcin處理，分別在處理後1、2、3、4、5個小時後以5小時後以在的trypsin於25yp下處理30分鐘。回收細胞並去除細胞外之KZ-sarcin後，使用抗his-tag抗體進行西方墨點法分析。參照第9圖，第(1)欄為KZ-sarcin，第(2)欄為經trypsin處理的KZ-sarcin，第(3)至(7)欄為不同時間點經KZ-sarcin處理之細胞(1x10⁶)。細胞在經KZ-sarcin處理後2小時產生8.5kD的胜肽片段(C端-胜肽)，一直到處理後5小時。

9.硫胱氨酸蛋白酶三型(caspase-3)活性之分析

將實施例8中收集的口腔SAS細胞以細胞溶劑緩衝液(50mM HEPES,pH 7.4，25mM CHAPS，25mM CHAPS，25mM DTT)打破細胞。將所得到的細胞溶解物與caspase-3的受質(Ac-DEVD-pNA)於37c-下反應隔夜。使用Ultrospec 3300 pro(Amershan Biosciences)測量405nm的吸光值。第10圖顯示不同時間點時細胞中caspase 3的活性。參照第9及10圖，細胞中caspase-3的活性反應相對應於8.5kD的胜肽片段(C端-胜肽)的產生。

10.動物試驗

在本實施例，使用8週齡之公裸鼠(BALB/c AnN-Foxnl；NLAC,Taipei,Taiwan)進行試驗。分別在老鼠的左、右側背部注射2 x 10⁶的口腔SAS細胞，形成異種移植腫瘤。待腫瘤體積為27mm³(腫瘤體積=短徑x短徑x長徑/2)時，分別連續注射10μl PBS(如第11a圖中之「-■-」)或KZ-sarcin(如第11a圖中之「─」)溶液13天。每天測量腫瘤大小，並以SAS/STAT MIXED 9.1軟體分析腫瘤生長速率。另外，在第13天，將老鼠安樂死，取出腫瘤。將腫瘤以10%福馬林固定，以Hematoxylin & Eosin染色後，在顯微鏡下觀察。參照第11a及11b圖，KZ-sarcin可有效地抑制腫瘤生長，以減緩甚至是終止腫瘤生長。參照第12圖，經KZ-sarcin處理後，細胞呈現核染質凝集(chromatin condensation)、多重核碎裂(multiple nuclear fragmentation)及凋亡小體(apoptotic body)。至於未接觸到KZ-sarcin的細胞，則保持原有的細胞形態。亦即，自前述結果可得知本發明之重組細胞毒素蛋白其中一實施例KZ-sarcin可誘發腫瘤細胞自我凋亡，且KZ-sarcin的毒性是受到控制。

另請參閱第十三圖，係為本發明KZ-sarcin三度結構電腦模擬圖。其中第13a圖中藍色的部分為KZ-sarcin之第2環，與第13b圖中野生型α-sarcin之藍色部分的第2環比較，可觀察到本發明KZ-sarcin之第2環之結構並未因具有DEVD序列而造成結構上的改變。

綜上所述，衍生自真菌之核醣體毒素蛋白(例如α-sarcin)具抑制核醣體合成胜肽的功效，但是卻無法輕易穿過細胞膜而進入細胞內，本發明藉基因重組技術將一細胞穿透胜肽(引導胜肽序列)，例如衍生自HIV之Tat序列，接於上述衍生自真菌之核醣體毒素蛋白的其中一端，進而幫助上述衍生自真菌之核醣體毒素蛋白容易穿入(penetrate)欲毒殺之目標細胞(例如癌細胞)，進而殺死細胞。

然上述接有細胞穿透胜肽之核醣體毒素蛋白除了殺死原有的目標細胞外，仍會自已進行細胞凋亡程序的細胞中釋放出來，繼續擴散至周邊細胞，而造成持續殺死周邊細胞的狀況。本發明為進一步改善前述情形，又在上述衍生自真菌之核醣體毒素蛋白序列中，特別藉基因重組技術(蛋白質工程技術)將一可被caspase 3辨認的序列(例如Asp-Glu-Val-Asp；DEVD)鑲嵌於上述衍生自真菌之核醣體毒素蛋白之環圈區域，特別是第2環。且上述經基因重組技術之衍生自真菌之核醣體毒素蛋白仍保有野生型(wild-type)衍生自真菌之核醣體毒素蛋白的活性。如此本發明細胞毒素蛋白藥物僅會進入欲毒殺之目標細胞內，且當目標細胞進行細胞凋亡時，則被目標細胞內所產生的caspase 3所分解，故本發明僅會作用於目標細胞中，而不會擴散至周邊其它細胞。亦即本發明於實際應用時，僅侷限於細胞毒素蛋白藥物注射或釋放之局部部位，不至於擴散而大規模破壞周邊正常健康的細胞

發明所揭露的所有特徵應可以任何結合方式實現。本發明所揭露的每一特徵應可以相同、均等或相似目的的取代物所取代。因此，除非有明確的指定，否則所揭露的每一個特徵僅僅只是均等物或相似特徵的一個種類的一實施例。

由上述內容可知，任何所屬本領域技術人員，將可輕易從本發明所揭露的內容中瞭解到本發明的特徵，在不偏離隨附權利要求書所界定的本發明的精神與範圍下，當可在此進行各種改變、取代以及修正。因此，其他實施例亦落于本發明權利要求書所要求保護的範圍之內。

<110> 國立陽明大學

<120> 重組細胞毒素蛋白及其應用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> prt

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> n is a,c,g,or t

<400> 1

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> prt

<400> 2

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> prt

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> prt

<400> 4

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> prt

<400> 5

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<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> prt

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> prt

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<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<223> prt

<400> 8

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<211> 198

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> prt

<400> 9

A‧‧‧重組細胞毒素蛋白

C‧‧‧細胞毒素蛋白

P‧‧‧細胞穿透胜肽

DEVD‧‧‧DEVD序列

Claims

一種重組細胞毒素蛋白，包括：一細胞毒素蛋白；一細胞穿透胜肽，該細胞穿透胜肽連接於該細胞毒素蛋白N端或C端；以及一DEVD序列；其中，該DEVD序列鑲嵌於該細胞毒素蛋白，且不破壞該細胞毒素蛋白之活性。
如申請專利範圍第1項所述之重組細胞毒素蛋白，其中該細胞穿透胜肽透過一連結子與該細胞毒素蛋白聯結。
如申請專利範圍第1項所述之重組細胞毒素蛋白，其中該重組細胞毒素蛋白包括核醣體毒素蛋白、蛇毒蛋白、蜂毒蛋白、水母毒蛋白或蟾蜍毒蛋白。
如申請專利範圍第3項所述之重組細胞毒素蛋白，其中該核醣體毒素蛋白係選擇自下述所組成之族群：真菌之核醣體毒素蛋白、蓖麻子毒蛋白(ricin)、雞母珠毒蛋白(abrin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、辛納毒蛋白(cinnamomin)及克木毒蛋白(camphorin)。
如申請專利範圍第4項所述之重組細胞毒素蛋白，其中該真菌之核醣體毒素蛋白為α-sarcin、mitogillin、restrictocin、clavin及tricholin。
如申請專利範圍第1項所述之重組細胞毒素蛋白，其中該細胞穿透胜肽包括Tat、antennapedia或聚精胺酸(polyarginine)。
如申請專利範圍第6項所述之重組細胞毒素蛋白，其中該Tat係鑲嵌於該細胞毒素蛋白的胺基端(N-端)。
如申請專利範圍第1項所述之重組細胞毒素蛋白，其中該DEVD序列鑲嵌於核醣體毒素蛋白的環圈區域(loop region)。
如申請專利範圍第8項所述之重組細胞毒素蛋白，其中該該DEVD序列鑲嵌於核醣體毒素蛋白的第2環圈區域(loop 2)。
一種醫藥組成物，包括申請專利範圍第1項之重組細胞毒素蛋白以及一藥學上可接受之載體。
一種如申請專利範圍第10項所述之重組細胞毒素蛋白的用途，其係用於製備用以治療細胞增生性疾病之藥學組成物。
如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該重組細胞毒素蛋白為局部投予。
如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該細胞增生性疾病為癌症。
如申請專利範圍第13項所述之用途，其中該癌症包括口腔癌、乳癌、前列腺癌、血癌、大腸癌、子宮癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、睪丸癌、淋巴癌、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、胰臟癌、肺癌、腦瘤、皮膚癌、胃癌、肝癌、腎臟癌或鼻咽癌。