KR20070108128A - 쿠프레독신 유래된 수송제 및 이들의 이용 방법 - Google Patents

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KR20070108128A
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아난다 차크라바르티
타파스 다스 구프타
토루 야마다
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아난다 차크라바르티
아르세니오 피알로
토루 야마다
타파스 다스 구프타
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Abstract

본 발명에서는 적하 화합물(cargo compound)을 암세포로 전달하기 위한 방법과 재료를 기술한다. 적하 화합물의 전달은 쿠프레독신(cupredoxin)으로부터 유래된 단백질 형질도입 도메인(transduction domain)의 이용으로 달성된다. 더 나아가, 본 발명에서는 암을 치료하고 진단하는 방법을 기술한다.
쿠프레독신

Description

쿠프레독신 유래된 수송제 및 이들의 이용 방법{CUPREDOXIN DERIVED TRANSPORT AGENTS AND METHODS OF USE THEREOF}
본 출원은 2004년 10월 7일자로 제출된 U.S. 가출원 No. 60/616,782; 2005년 5월 13일자로 제출된 U.S. 가출원 No. 60/680,500; 2005년 7월 19일자로 제출된 U.S. 가출원 No. 60/700,297에 우선권을 주장한다. 이들 출원의 전체 내용은 본 출원에 참조로 한다.
정부 권리의 진술
본 출원의 요부는 the National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland, U.S.A.로부터 연구 기금(Grant Number ES 04050-18)을 지원받았다. 정부는 본 발명에 일부 권리를 주장할 수 있다.
본 발명의 기술 분야
본 발명에서는 적하 화합물(cargo compound)을 암세포로 전달하기 위한 방법과 재료를 기술한다. 적하 화합물의 전달은 쿠프레독신(cupredoxin)으로부터 유래된 단백질 형질도입 도메인(transduction domain)의 이용으로 달성된다. 더 나아가, 본 발명에서는 암을 치료하고 진단하는 방법을 기술한다.
단백질의 포유동물 세포 내로 침입은 빈번하게, 단백질의 작은 분절에 의해 지배되는데, 이는 통상적으로, “단백질 형질도입 도메인(protein transduction domain)”또는 PTD로 언급된다. 상기 분절은 외래 단백질에 부착되어 이런 단백질의 포유동물 세포 내로의 수송을 조장하는 신호로서 이용될 수 있다. 가령, 인간 섬유아세포 HS68 또는 뮤린 림프성 백혈병(murine lymphocytic leukemia) L1210 세포에서 잠재적인 항종양제로서 DNA-절단 금속포르피린(metalloporphyrin)의 흡수를 조장하기 위하여 양쪽 친화성 펩티드가 이용된다(Chaloin, L. et al. Bioconjugate Chem. 12:691-700, (2001)). 세포-침투 펩티드(cell-penetrating peptide)라고 하는 펩티드, 예를 들면, 페너트라틴(penetratin), 트란스포르탄(transportan), Tat(아미노산 47-57 또는 48-60), 모형 양쪽 친화성 펩티드 MAP가 약리학적으로 중요한 물질, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩티드를 수송하기 위한 전달 운반제(delivery vehicle)로서 이용되고 있다(Hallbrink, M. et al. Biochim. Biophys. Acta 1515:101-109 (2001); Lindgren, M., et al. Trends Pharmacol. Sci. 21:99-103 (2000)).
이들 펩티드, 특히 안테나페디아(Antennapedia)의 DNA-결합 호메오도메인(homeodomain), 초파리(Drosophila) 전사 인자(transcription factor), 또는 21개 잔기의 펩티드 담체 Pep-1은 37℃ 또는 4℃에서, 여러 유형의 배양 세포, 예를 들면, 인간 HS68 또는 뮤린 NIH-3T3 섬유아세포에 의해 내재화된다. 온도 이전(temperature shift)의 효과 없음은 키랄 수용체 단백질(chiral receptor protein)을 요구하는 고전적인 식균 작용(endocytosis)의 기전과 상이한 침투 기전을 암시한다(Morris, M.C. et al. Nature Biotechnol. 19:1173-1176 (2001)). 포유 동물 세포 내에서 약리학적 활성 화합물을 수송하기 위하여 가장 폭넓게 이용되는 펩티드 중의 하나는 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) 전사인자 단백질 Tat의 11개 아미노산 아르기긴-풍부한 단백질 형질도입 도메인(PTD)이다(Schwarze, S.R. et al. Science 285:1569-1572 (1999), Schwarze, S.R. et al. Trends Cell Biol. 10:290-295 (2000)). 120 kDa 베타-갈락토시다아제/Tat 융합 단백질의 복강내 주입은 혈관-뇌 장벽(blood-brain barrier)의 통과를 비롯하여, 융합 단백질의 생쥐내 거의 모든 조직으로의 경세포 형질도입(transcellular transduction)을 유도한다. HIV-1 Tat의 이런 짧은 펩티드 도메인은 자성 나노입자, 파지 벡터, 리포좀, 플라스미드 DNA를 비롯한 대형 분자 또는 입자의 세포 내재화(cell internalization)를 매개하는 것으로 밝혀졌다. 앞서 기술된 다른 세포-침투 펩티드와 달리, 전장 Tat 또는 11개 아미노산 형질도입 도메인에 의한 적하 단백질(cargo protein)의 내재화는 40℃에서 상당히 손상되고(Liu, Y. et al. Nat. Med. 6:1380-1387 (2000), Suzuki, T. et al. J. Biol. Chem. 277:2437-2443 (2002)), 세포막 헤파란 황산염 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)의 헤파란 황산염 사슬과 같은 수용체와의 상호작용을 필요로 한다.
현재까지 확인된 대부분의 PTD는 바이러스와 포유동물 공급원으로부터 유래되었다. PTD의 다른 공급원은 다양한 실험적 서열의 설계 및 동물과 인간 치료와 예방 절차에 바람직할 것이다. PTD의 한가지 대안적 공급원은 세균 세포이다. 콜레라 독소(cholera toxin)와 같은 세균 단백질이 포유동물 세포 세포질에 침투하는 것으로 알려져 있긴 하지만(Sofer, A. and Futerman, A.H. J. Biol. Chem. 270:12117-12122 (1995)), 이들 단백질의 세포독성은 포유동물 세포 내에서 약리학적으로 중요한 적하를 수송하기 위한 세균 단백질 또는 이들로부터 유래된 PTD의 이용을 제한하였다.
본 발명의 요약
본 발명의 한 측면은 전장보다 작은 야생형 쿠프레독신(cupredoxin) 또는 H.8 외부 막 단백질에 적어도 90% 아미노산 서열 동일성(sequence identity)을 갖고, 연계된 적하 분자(cargo molecule)의 포유동물 암세포로의 침입을 조장하는 펩티드에 관계한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 전장보다 작은 아주린(azurin), 플라스토시아닌(plastocyanin), 루스티시아닌(rusticyanin), 슈도아주린(pseudoazurin), 아우라시아닌(auracyanin) 또는 아주린-유사 단백질, 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 43에 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum), 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans), 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes), 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae), 수막염균(Neisseria meningitidis), 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 백일해균(Bordetella pertussis), 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus) 또는 임균(Neisseria gonorrhoeae)으로부터 유래된 다. 다른 구체예에서, 펩티드는 적어도 10개의 잔기 내지 50개 이하의 잔기를 보유한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48에서 선택되는 서열에 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48에서 선택되는 서열을 포함하거나 이런 서열로 구성된다. 일부 구체예에서, 펩티드는 아래의 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
DGXXXXXDXXYXKXXD와 DGXXXXDXXYXKXXD;
여기서 D는 아스파라긴산이고, G는 글리신이고, Y는 티로신이고, K는 리신이고, X는 임의의 아미노산이다. 최종적으로, 일부 구체예에서, 펩티드는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 50-77 아미노산 영역에 현저한 구조적 상동성을 갖는다.
본 발명의 다른 측면은 적하 화합물(cargo compound)과 아미노산 서열을 포함하는 복합체에 관계하는데, 상기 아미노산 서열은 쿠프레독신 또는 이의 단편과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 상기 아미노산 서열 또는 이의 단편은 적하 화합물에 연결되고, 상기 아미노산 서열은 적하 화합물의 포유동물 암세포로의 침입을 조장한다. 일부 구체예에서, 상기 복합체의 아미노산 서열은 전장보다 작은 야생형 쿠프레독신(cupredoxin) 또는 H.8 외부 막 단백질에 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 다른 구체예에서, 적하 화합물은 단백질, 지단백, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류, 핵산, 염료, 미립자, 나노입자, 독소, 약제이다. 특정 구체예에서, 적하 화합물은 단백질 또는 폴리펩티드이고, 이는 융합 단백질을 형성하는 연결된 아미노산 서열이다. 다른 특정 구체예에서, 적하 화합물은 독소, 더욱 구체적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A이다. 다른 구체예에서, 적하 화합물은 검출가능 물질, 더욱 구체적으로, 형광분석법, 검경, X-레이 CT, MRI, 초음파에서 선택되는 방법으로 검출되는 물질이다. 최종적으로, 본 발명은 상기 복합체 및 제약학적으로 적합한 담체를 함유하는 제약학적 조성물 역시 포괄한다.
본 발명의 또 다른 측면은 적하 화합물을 세포 내로 전달하는 방법에 관계한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 복합체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 세포는 암 환자로부터 유래되고, 상기 환자 내로 재도입된다. 다른 구체예에서, 세포는 암세포, 더욱 구체적으로, 골육종 세포, 폐암종 세포, 결장암종 세포, 림프종 세포, 백혈병 세포, 연조직 육종 세포, 유방암종 세포, 간암종 세포, 방광암종 세포, 흑색종 세포, 뇌종양 세포 또는 전립선암종 세포이다. 다른 구체예에서, 복합체는 치료 효과량으로 환자에 투여된다. 다른 구체예에서, 복합체는 정맥내, 국소, 피하, 근육내, 종양내(intratumor)에서 선택되는 방식으로 투여된다. 다른 구체예에서, 복합체는 다른 암 치료제와 공동-투여된다.
본 발명의 또 다른 측면은 암을 진단하는 방법에 관계한다. 일부 구체예에 서, 검출가능 물질인 적하 화합물과의 복합체가 암 환자에 투여되고, 적하 화합물의 위치가 검출된다. 특정 구체예에서, 적하 화합물은 X-레이 조영제(contrast agent)이고, 적하 화합물의 위치는 X-레이 CT에 의해 검출된다; 또는, 적하 화합물은 자기 공명 영상 조영제이고, 적하 화합물의 위치는 MRI에 의해 검출된다; 또는 적하 화합물은 초음파 조영제이고, 적하 화합물의 위치는 초음파 영상에 의해 검출된다. 다른 구체예에서, 세포가 검출가능 물질과의 복합체와 접촉되고, 적하 분자(cargo molecule)의 위치가 검출된다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 복합체를 포함하는 키트에 관계한다. 일부 구체예에서, 키트는 제약학적으로 허용되는 어쥬번트 또는 부형제를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 반응물의 투여를 위한 운반제(vehicle)를 추가로 포함한다.
서열목록의 간단한 설명
SEQ ID NO: 1은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 wt-아주린의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 2는 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 3은 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 루스티시아닌의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 4는 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 슈도아주린의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 5는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 wt-아주린의 36-128 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 6은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 wt-아주린의 36-89 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 7은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 wt-아주린의 36-77 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 8은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 wt-아주린의 36-50 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 9는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 wt-아주린의 50-77 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 10은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 wt-아주린의 50-66 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 11은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 wt-아주린의 azu 67-77 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 12는 pGST-azu 36-128에 대한 정방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 13은 pGST-azu 36-128에 대한 역방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 14는 pGST-azu 36-50에 대한 정방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 15는 pGST-azu 36-50에 대한 역방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 16은 pGST-azu 36-77에 대한 정방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 17은 pGST-azu 36-77에 대한 역방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 18은 pGST-azu 36-89에 대한 정방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 19는 pGST-azu 36-89에 대한 역방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 20은 pGST-azu 50-77에 대한 정방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 21은 pGST-azu 67-77에 대한 정방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 22는 pGST-azu 50-77과 pGST-azu 67-77에 대한 역방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 23은 pGST-azu 50-66에 대한 정방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 24는 pGST-azu 50-66에 대한 역방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 25는 녹색 형광 단백질 유전자에 대한 정방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 26은 녹색 형광 단백질 유전자에 대한 역방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 27은 gst-gfp-azu 50-77에 대한 정방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 28은 gst-gfp-azu 50-77에 대한 역방향 프라이머의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 29는 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae)로부터 아주린의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 30은 수막염균(Neisseria meningitidis)으로부터 아주린/H.8 외부 막 단백질의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 31은 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)로부터 아주린의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 32는 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)로부터 아주린의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 33은 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 A의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 34는 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 B의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 35는 쿠프레독신 침입 도메인 내에서 보조된 잔기를 나타내는 인공 아미노산 서열인데, 여기서 D는 아스파라긴산이고, G는 글리신이고, Y는 티로신이고, K는 리신이고, X는 임의의 아미노산이다.
SEQ ID NO: 36은 임균(Neisseria gonorrhoeae) Laz 단백질의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 37은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 wt-아주린의 50-67 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 38은 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)의 아우라시아닌 B의 57-89 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 39는 백일해균(Bordetella pertussis)으로부터 아주린의 50-77 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 40은 수막염균(Neisseria meningitidis)으로부터 Laz 단백질의 106-132 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 41은 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 아주린의 53-70 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 42는 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 아주린의 53-64 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 43은 백일해균(Bordetella pertussis)으로부터 아주린의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 44는 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 아주린의 51-77 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 45는 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae)로부터 아주린의 51-77 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 46은 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)로부터 아주린의 52-78 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 47은 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)로부터 아주린의 51-77 아미노산 단편의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 48은 쿠프레독신 침입 도메인 내에서 보조된 잔기를 나타내는 인공 아미노산 서열인데, 여기서 D는 아스파라긴산이고, G는 글리신이고, Y는 티로신이고, K는 리신이고, X는 임의의 아미노산이다.
도 1(a)와 (b). 아주린의 침입이 세포독성과 상관한다는 것을 입증하는 그래프. (a) J774, UISOMel-2, 섬유아세포 세포에 대한 wt-아주린-유도된 세포독성의 결정을 위하여 MTT 검사를 수행하였다. (b) M44KM64E 변이체 아주린으로 처리된 인간 정상 섬유아세포 세포에서 세포 주기 진행의 분석. 섬유아세포 세포는 24시간동안 0(대조), 0.5 또는 1.0 ㎎/㎖의 변이체 아주린과 함께 배양하였다. 처리의 종결 시점에서, 이들 세포에서 DNA 함량을 유세포분석법(flow cytometry)으로 측정하였다.
도 2(a)와 (b). (a) 다양한 절두된 아주린 구조체의 개요 및 이들의 정제 프로필. azu 유전자의 다양한 단편이 gst 유전자의 3'-말단에서 골격내 융합되었다. (b) GST-azu 융합 단백질은 세포 성장과 용해이후 정제되고, SDS-PAGE에 적하(loading)되고, 쿠마시에 블루 염색(Coomassie Blue staining)으로 가시화되었다.
도 3(a), (b), (c). (a) GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질의 구성을 보여주는 다이어그램. gfp 유전자가 gst 유전자의 3'-말단에 도입되고(GST-GFP), 이후 azu 50-77 단편이 gfp 유전자의 3'-말단에서 골격내 결찰되어 GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질을 형성하였다. GST-GFP-azu 50-77은 세포 용해질로부터 단일 융합 단백질로서 정제되었다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE에서 이동시키고 쿠마시에 블루 염색(Coomassie Blue staining)(9(b)) 및 항-아주린 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅(Western blotting)(9(c))으로 검출하였다.
도 4 (a), (b), (c). GST-녹색 형광 단백질(GFP)과 GST-GFP-아주린 융합 단백질의 내재화(internalization)를 위한 동역학 연구 결과를 보여주는 다이어그램. 녹색 형광(green fluorescence)은 다양한 농도의 GST-GFP(10(a)) 또는 GST-GFP-azu 50-77(10(b))로 처리된 J774 세포 내에서 37℃에서 1시간동안 평가하였다. 유세포분석법으로 만개의 세포를 분석하였다. (c) GST-GFP-azu 50-77의 내재화의 시간-의존성. J774 세포는 37℃에서 지정된 시간동안 200 ㎍/㎖ GST-GFP-azu 50-77과 함께 배양하고 유세포분석법으로 분석하였다.
도 5 (a), (b), (c). (a) GST-GFP 융합에서 앞서 기술된 바와 같이 GST(GST-PEDIII)에 융합된 외독소 A 도메인 III(아미노산 405-613)과 도메인 lb의 일부(아미노산 381-404)를 보여주는 다이어그램. 그 다음, azu 50-77 단편이 PCR을 이용하 여 GST-PEDIII(GST-PEDIII-azu 50-77)의 카르복시 말단에 결찰된다. (b) 이들 융합 단백질은 글루타티온 세파로스(glutathione sepharose) 4B 칼럼 겔 여과 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되고 크기 결정을 위하여 SDS-PAGE에서 이동된다. (c) PEDIII-매개된 세포독성에 의해 결정되는, UISO-Mel-2 암세포와 정상 섬유아세포(FBT) 세포 내에서 GST-PEDIII-azu 50-77 융합 단백질의 작용을 보여주는 다이어그램. 지정된 다양한 농도의 GST-PEDIII과 GST-PEDIII-azu 50-77은 24시간동안 UISO-Mel-2와 FBT 세포와 함께 배양하고, 이후 MTT 검사법으로 세포 생존능(cell viability)을 측정하였다.
도 6. wt-아주린에서 및 wt-아주린 50-77 단백질 형질도입 도메인에서 α-나선의 국지화를 보여주는 다이어그램. 아주린 50-77 도메인 내에서 프롤린 잔기에 의한 3개의 아미노산의 치환이 표시된다.
도 7. UISO-Mel-2 암세포와 FBT 세포에 대한 GST-PEDIII-루스티시아닌 융합 단백질의 PEDIII-매개된 세포독성을 보여주는 다이어그램. 지정된 다양한 농도의 GST-PEDIII과 GST-PEDIII-azu 50-77은 24시간동안 UISO-Mel-2와 FBT 세포와 함께 배양하고, 이후 MTT 검사법으로 세포 생존능(cell viability)을 측정하였다.
도 8 (a)와 (b). (a) VAST 알고리즘으로 계산된, 아주린과 다른 쿠프레독신의 구조적 정렬을 보여주는 다이어그램. 아주린 내에 부재하는 아우라시아닌 B와 루스티시아닌의 N-말단 연장된 부분은 도면에서 생략되었다. 회색 막대는 각 이웃으로부터 잔기에 겹쳐질 수 있는 아주린 영역을 표시한다. 빈 공간은 정렬되지 않은 영역이다. 루스티시아닌과의 정렬이 존재하지 않는 아주린 단백질 형질도입 도 메인(PTD), 아주린 아미노산 50-77은 수직의 쇄선(dashed line)으로 표시된다. 쿠프레독신 명칭 다음의 괄호안 숫자는 단백질 데이터베이스 목록 번호이다. (b) 일부 공지된 세균 아주린 내에서 중간 부분을 포함하는 잔기의 복수 아미노산 서열 정렬. 세균 속(genus)과 종은 아래와 같은 약어로 표시된다: Psae, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)(SEQ ID NO:44); Pssy, 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae)(SEQ ID NO: 45); Neme, 수막염균(Neisseria meningitidis)(SEQ ID NO:40); Vipa, 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)(SEQ ID NO:46); Bobr, 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)(SEQ ID NO:47). 다수의 개재성 (intervening) 아미노산이 괄호안에 제공된다. 이러한 복수 서열 정렬을 산출하기 위하여 CLUSTAL X 소프트웨어(Higgins and Sharp, Gene 101:6427-6432 (1988))가 이용되었다.
도 9에서는 수막염균(Neisseria meningitidis)으로부터 Laz 단백질 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 아주린 단백질의 다이어그램을 도시한다. 막대 좌측의 용어는 단백질의 명칭을 나타낸다. 막대 위쪽의 용어는 상기 막대에서 바로 아래에 도시된 단백질 영역의 명칭을 나타낸다. 막대 아래쪽의 번호는 상기 단백질 영역의 접점의 아미노산 번호를 나타낸다.
도 10에서는 여러 아주린 융합 단백질의 구조체를 도시한다. 막대 좌측의 용어는 구조체의 명칭을 나타내는데, 플라스미드와 단백질 산물이 표시된다. 막대 위쪽의 용어는 상기 막대에서 바로 아래에 도시된 단백질 영역을 나타낸다. “N.Sp”는 임균(Neisseria gonorrhoeae) 신호 펩티드를 나타낸다; “H.8”은 임 균(Neisseria gonorrhoeae)의 H.8 영역을 나타낸다; “N.Azu”는 임균(Neisseria gonorrhoeae) 아주린을 나타낸다; “P.Sp”는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 신호 펩티드를 나타낸다; “P.Azu”는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린을 나타낸다.
본 발명은 세포 내로 적하 화합물을 전달하기 위한 방법과 물질에 관계한다. 본 발명에 따른 적하 화합물(cargo compound)의 전달은 적절한 수송 폴리펩티드의 이용으로 달성된다. 본 발명의 한 구체예에서, 적하 화합물은 수송 폴리펩티드에 연결된다. 적절한 수송 펩티드에는 쿠프레독신, 또는 “쿠프레독신 침입 도메인”을 보유하는 쿠프레독신 단편이 포함된다. “쿠프레독신 침입 도메인”은 쿠프레독신이 포유동물 암세포 내로 침입하기 위하여 요구되는 아미노산 서열을 보유하는 쿠프레독신 단편을 의미한다. 본 발명에 의해 전달되는 적하 화합물에는 단백질, 지단백, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류, 안티-센스 핵산을 비롯한 핵산, 염료, 형광과 방사능 태그, 미립자 또는 나노입자, 독소, 무기와 유기 분자, 소형 분자, 약제 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 약제와 독소는 종양 세포를 죽인다.
본 발명의 한 구체예에서, 쿠프레독신은 아주린, 예를 들면, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 wt-아주린이다. “Wt-아주린”은 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 야생형 아주린을 의미한다. 이와 유사하게, “wt-아주린 침입 도메인”은 wt-아주린이 세포 내로 침입하기 위하여 요구되는 아미노산 서열을 보유하는 wt-아주린 단편을 의미한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신은 특히, 플라스토시아닌, 루스티시아닌, 또는 슈도아주린이다. 특정 구체예에서, 아주린은 특히, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus) 또는 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)로부터 유래된다.
한 구체예에서, 적하 화합물은 세포, 예를 들면, 암세포에서 세포 주기 진행을 억제하거나 지연시키기 위하여 전달된다. 이런 암세포는 예로써, 골육종 세포, 폐암종 세포, 결장암종 세포, 림프종 세포, 백혈병 세포, 연조직 육종 세포, 또는 유방, 간, 방광 또는 전립선 암종 세포일 수 있다. 가령, 적하 화합물은 특히, 세포 주기 통제 단백질, 예를 들면, p53; 사이클린(cyclin)-의존성 키나아제 저해물질, 예를 들면, p16, p21 또는 p27; 자살 단백질, 예를 들면, 티미딘 키나아제(thymidine kinase) 또는 니트로환원효소(nitroreductase); 사이토킨 또는 다른 면역조절 단백질, 예를 들면, 인터루킨 1, 인터루킨 2 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF); 또는 독소, 예를 들면, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기한 종류의 화합물 중에서 하나의 생물학적 활성 단편이 전달된다. 다른 구체예에서, 적하 화합물은 표적 조직의 영상을 산출하기 위하여 전달된다. 가령, 표적 조직은 암일 수 있고, 적하 화합물은 X-레이 전산화 단층촬영(computed tomography, CT), 자기 공명 영상(MRI), 초음파에 의한 검출을 위한 영상을 산출하는데 통상적으로 이용되는 화합물일 수 있다. 이들 구체예에서, 적하 화합물은 감마선(gamma ray) 또는 양전자 방출 방사성동위원소(positron emitting radioisotope), 자기 공명 영상 조영제, X-레이 조영제, 또는 초음파 조영제이다.
쿠프레독신
“쿠프레독신”은 예로써, 세균 산화환원 연쇄(redox chain) 또는 광합성(photosynthesis)에 참여하고 전자 전달 특성(10-20 kDa)을 갖는 작은 황산동-보유 단백질이다. 구리 이온은 단백질 매트릭스(protein matrix)에 의해서만 결합된다. 구리 주변에 2개의 히스티딘과 1개의 시스테인에 독특한 뒤틀린 삼각형 2차원 정렬은 금속 부위의 매우 고유한 전자 특성 및 강렬한 푸른색을 발생시킨다. 다수의 쿠프레독신이 중간 내지 높은 해상도(resolution)에서 결정학적으로 특성화되었다. 쿠프레독신에는 아주린, 플라스토시아닌, 루스티시아닌, 슈도아주린, 아우라시아닌, 아주린-유사 단백질이 포함된다. 본 명세서에서, “쿠프레독신”에는 구리 원자가 존재하지 않는 단백질 형태 및 구리-보유 단백질이 포함된다.
아주린
아주린은 식물과 특정 세균에서 전자 전달에 관여하는 쿠프레독신 집단에 속하는 128개의 아미노산 잔기로 구성되는 구리-보유 단백질이다. 아주린에는 녹농균(P. aeruginosa)(SEQ ID NO: 1)(“wt-아주린”), 알칼리지너스 자일로족시단스(Alcaligenes xylosoxidans), 알칼리지너스 데니트리피칸(Alcaligenes denitrifican)으로부터 유래된 것들이 포함된다(Murphy, L. M. et al., J. Mol. Biol. 315:859-71 (2002)). 아주린 사이에 서열 상동성이 60-90% 사이에서 변하지만, 이들 분자 사이에 구조적 상동성이 높다. 모든 아주린은 Greek key 모티프를 포함하는 특징적인 β-샌드위치를 보유하고, 단일 구리 원자는 단백질의 동일 영역에 항상 위치한다. 이에 더하여, 아주린은 구리 부위를 둘러싸는 본질적으로 중성의 소수성 패치를 보유한다(Murphy et al.).
플라스토시아닌
플라스토시아닌은 진핵 식물과 청록색 세균(cyanobacteria)에서 발견되는 쿠프레독신이다. 이들은 한 분자당 하나의 구리 분자를 보유하고, 산화된 형태에서 푸른빛을 띤다. 이들은 엽록소(chloroplast)에서 생성되는데, 여기서 이들은 전자 운반체(electron carrier)로서 기능한다. 1978년에 포플러 플라스토시아닌의 구조 결정이후, 조류(떼목말(Scenedesmus), 파래속(Enteromorpha), 클라미도모나스(Chlamydomonas))와 식물(강낭콩(French bean)) 플라스토시아닌의 구조가 결정학적 방법 또는 NMR 방법으로 결정되고, 포플러 구조가 1.33 Å 해상도로 상세하게 구별되었다. SEQ ID NO: 2에서는 청록색 세균 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌의 아미노산 서열을 도시한다..
조류와 관속 식물(vascular plants)의 플라스토시아닌 사이에 서열 불일치(가령, 클라미도모나스(Chlamydomonas)와 포플러 단백질 사이에 62% 서열 동일성)에도 불구하고, 3차원 구조가 보존되었다(가령, 클라미도모나스(Chlamydomonas)와 포플러 단백질 사이에 C 알파 위치에서 0.76 Å rms 편차). 구조적 특징에는 8개 가닥의 역평행 베타-배럴(beta-barrel)의 한 단부에서 뒤틀린 4배위자리(tetrahedral) 구리 결합 부위, 현저한 네거티브 패치(negative patch), 평평한 소수성 표면(flat hydrophobic surface)이 포함된다. 구리 부위는 전자 전달 기능을 위하여 최적화되고, 네거티브와 소수성 패치(patch)는 생리학적 반응 파트너의 인식에 관여하는 것으로 제안된다. 화학적 변형, 교차-결합, 특정부위 돌연변이 유발 실험은 시토크롬 f와의 결합 상호작용에서 네거티브와 소수성 패치의 중요성을 확증하고, 플라스토시아닌에서 2가지 기능적으로 중요한 전자 전달 통로의 모형을 확인하였다. 첫 번째 추정 전자 전달 통로는 상대적으로 짧고(대략 4 Å) 소수성 패치 내에 용매-노출된 구리 리간드 His-87을 수반하는 반면, 다른 통로는 더욱 길고(대략 12-15 Å) 네거티브 패치 내에 거의 보존된 잔기 Tyr-83을 수반한다(Redinbo et al., J. Bioenerg. Biomembr. 26(1):49-66 (1994)).
루스티시아닌
루스티시아닌은 유황 세균(thiobacillus)으로부터 획득된 푸른색의 구리-보유 단일-사슬 폴리펩티드이다. 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 극히 안정한 고도 산성화 쿠프레독신 루스티시아닌의 산화된 형태(SEQ ID NO: 3)의 X-레이 결정 구조는 다파장 비정상 산란(multiwavelength anomalous diffraction)으로 결정하고 1.9 Å 해상도로 상세하게 구별되었다. 루스티시아닌은 6-개와 7-개 가닥 β-시트로 구성되는 코어 베타-샌드위치 접힘(core beta-sandwich fold)으로 구성된다. 다른 쿠프레독신과 유사하게, 구리 이온은 뒤틀린 4배위자리 내에 정렬된 4개의 보존된 잔기의 클러스터(His85, Cys138, His143, Met148)에 의해 동위(coordination)된다(Walter, R.L. et al., J. Mol. Biol. 263:730-51 (1996)).
아우라시아닌
아우라시아닌 A, 아우라시아닌 B-1, 아우라시아닌 B-2로 명명된 3개의 작은 푸른색 구리 단백질이 내열성 녹색 활주 광합성 세균(thermophilic green gliding photosynthetic bacterium) 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 분리되었다. 2가지 B 형태는 서로 거의 동일한 특성을 갖지만 A 형태와는 상이하다. 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서 겉보기 단량체 분자질량(apparent monomer molecular mass)이 14(A), 18(B-2), 22(B-1)kDa로서 확인되었다.
아우라시아닌 A의 아미노산 서열은 139개 잔기의 폴리펩티드인 것으로 밝혀졌다(Van Dreissche et al, Protein Science 8:947-957 (1999)). His58, Cys123, His128, Met132는 이들이 공지된 소형 구리 단백질 플라스토시아닌과 아주린에서처럼 진화적으로 보존된 금속 리간드인 경우에 예상되는 방식으로 일정한 거리를 두고 위치한다. 2차 구조 예측 역시 아우라시아닌이 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 아주린 및 포플러 잎으로부터 플라스토시아닌의 베타-배럴 구조와 전반적으로 유사한 구조를 갖는다는 것을 암시한다. 하지만, 아우라시아닌은 이들 두 종류의 소형 구리 단백질 서열의 서열 특징을 갖는 것으로 보인다. 아주린의 공통 서열과 전반적인 유사성은 플라스토시아닌의 공통 서열과의 유사성과 거의 동일하다(다시 말하면, 30.5%). 아우라시아닌의 N-말단 서열 영역 1-18은 글리신과 하이드록시 아미노산이 눈에 띄게 풍부하다. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌의 사슬 A에 대한 전형적인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 33(NCBI Protein Data Bank Accession No. AAM12874)을 참조한다.
아우라시아닌 B 분자는 표준 쿠프레독신 집단이다. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 B의 결정 구조가 조사되었다(Bond et al., J. Mol. Biol. 306:47-67 (2001)). 부가적인 N-말단 가닥을 제외하고, 상기 분자는 세균 쿠프레독신, 아주린과 매우 유사하다. 다른 쿠프레독신에서처럼, Cu 리간드 중에서 하나는 상기 폴리펩티드의 가닥 4에 위치하고, 다른 3개는 가닥 7과 8 사이에 대형 루프를 따라서 위치한다. Cu 부위 기하학은 3개의 후자 리간드 사이에 아미노산 간격(amino acid spacing)을 참조하여 논의된다. 아우라시아닌 B의 결정학적으로 특성화된 Cu-결합 도메인은 아마도, 막-결합된 여러 다른 전자-전달 단백질 내에서 공지된 사슬(tether)과 현저한 서열 동일성을 보이는 N-말단 꼬리에 의해 세포질 막의 주변질 부분(periplasmic side)에 속박된다. B 형태의 아미노산 서열은 McManus et al. (J Biol Chem. 267:6531-6540 (1992))에서 제시된다.
클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 B의 사슬 A에 대한 전형적인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 34(NCBI Protein Data Bank Accession No. 1QHQA)를 참조한다.
슈도아주린
슈도아주린은 푸른색의 구리-보유 단일-사슬 폴리펩티드 집단이다. 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 획득된 슈도아주린의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4에 도시된다. 슈도아주린의 X-레이 구조 분석 결과는 슈도아주린이 아주린과의 서열 상동성(sequence homology)이 낮긴 하지만 이들 아주린에 유사한 구조를 갖는다는 것을 보여준다. 2가지 주요한 차이는 슈도아주린과 아주린의 전체 구조 사이에 존재한다. 아주린에 비하여 슈도아주린에는 2개의 알파-나선으로 구성되는 카르복시 말단 신장이 존재한다. 중간-펩티드 영역에서, 아주린은 슈도아주린에 비하여 신장된 루프를 보유하는데, 이는 짧은 α-나선을 보유하는 플랩(flap)을 형성한다. 구리 원자 부위에서 유일한 주요 차이점은 MET 측쇄의 형태(conformation)와 Met-S 구리 결합 길이인데, 상기 길이는 아주린에서보다 슈도아주린에서 훨씬 짧다.
쿠프레독신의 세포독성
쿠프레독신은 그들의 전자 전달(산화 환원) 특성이 광범위하게 연구되긴 했지만 최근까지 세포독성 효과를 나타내는 지는 알려지지 않았다. 본 발명은 쿠프레독신 및 철(haem) 보유 산화 환원 단백질 시토크롬 c551이 J774 생쥐 대식세포 종양 세포와 인간 암세포에서 아폽토시스(apoptosis)를 유도하거나 세포 주기 진행을 저해한다는 놀라운 발견에 의해 예측된다. 쿠프레독신의 산화 활성 활성은 그들의 세포독성 활성에 중요하지 않다. 가령, 구리 원자 없는 쿠프레독신은 구리 원자를 보유하는 쿠프레독신에 비하여 훨씬 낮은 산화 환원 활성을 나타내지만, 그럼에도 불구하고 현저한 세포독성 활성을 나타낸다. 암 세포 내에서 활성과 비교하여, 쿠프레독신은 종양-보유 쿠프레독신-처리된 생쥐의 정상 조직 내에서 낮은 수준의 생체내 아폽토시스를 유도한다.
쿠프레독신의 세포독성 활성은 2002년 1월 15일자로 제출된 동시-계류중인 U.S. 특허 출원 10/047,710 및 2003년 11월 24일자로 제출된 동시-계류중인 U.S. 특허 출원 10/720,603에서 기술된다. 이들 선행 출원은 참조로 한다.
본 발명자들은 암세포에 대한 쿠프레독신의 선택적 효과가 이들 세포에 침입하는 쿠프레독신의 능력과 관련된다는 것을 입증한다. 실시예 5에서, 본 발명자들은 쿠프레독신이 J774 세포에 침입한다는 것을 입증한다. 이들 세포는 대식세포-유사 특성을 갖는 뮤린 망상조직 세포 육종의 복수(ascites) 형태이다. 실시예 18과 19에서, 본 발명자들은 Laz로 알려져 있는 아주린-유사 단백질, 나이세리균(Neisseria)으로부터 H.8 외부 막 단백질은 뇌종양 세포에 특이적으로 침입할 수 있다. 대조적으로, 쿠프레독신은 정상 세포 내로 극히 감소된 비율의 침입을 보인다.
한 구체예에서, 본 발명은 세포 내로 전달되는 “적하 화합물”에 연결된 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 단편을 보유하는 “복합체”에 관계한다. 적하 화합물은 복합체를 형성하기 위하여 공유 또는 비-공유 연결된다. 이런 복합체를 제조하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 가령, 적하 화합물이 단백질 또는 폴리펩티드이면, 복합체는 융합 단백질로서 형성될 수 있다. 대안으로, 적하 화합물은 예로써 이황화 또는 에스테르 결합에 의하여, 직접적으로 또는 링커 분자를 통하여 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신 단편에 공유 연결된다.
쿠프레독신 침입 도메인
본 발명은 연결된 적하가 포유동물 암세포 내로만 수송되고 비-암세포로는 수송되지 않도록 하는 단백질 형질도입 도메인을 제시한다. 쿠프레독신 단백질은 연결된 적하의 포유동물 암세포로의 침입을 조장하는 단백질 형질도입 도메인인 쿠프레독신 침입 도메인을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 일부 구체예에서, 전체 쿠프레독신 단백질은 연결된 적하의 암 세포 내로 선택적인 수송을 촉진하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 연결된 적하를 암 세포 내로 수송하는데 쿠프레독신의 일부가 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 전장 이하의 야생형 단백질인 쿠프레독신의 한 영역으로 구성된다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 쿠프레독신의 대략 10개 이상의 잔기, 대략 15개 이상의 잔기 또는 대략 20개 이상의 잔기로 구성된다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 쿠프레독신의 대략 50개 이하의 잔기, 대략 40개 이하의 잔기 또는 대략 30개 이하의 잔기로 구성된다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 쿠프레독신에 적어도 90% 아미노산 서열 동일성, 적어도 95% 아미노산 서열 동일성 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
본 명세서에서, “폴리펩티드”, “펩티드”, “단백질”은 동의어이며, 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. “폴리펩티드”, “펩티드” 또는 “단백질”은 세포 내에서 합성되고 다른 단백질과 세포 성분으로부터 분리될 수 있다. 대안으로, “폴리펩티드”, “펩티드” 또는 “단백질”은 당업자에게 공지된 방법에 따라 인공적으로 합성되고, 따라서 다른 단백질이 존재하지 않을 수 있다. 상기 용어는 하나이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적 화학 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. 대안으로, “폴리펩티드”, “펩티드”, “단백질”은 당화(glycosylation), 지질 부착(lipid attachment), 황산염화(sulfation), 글루타민산 잔기의 감마-카르복실화(gamma-carboxylation), 수산화(hydroxylation), ADP-리보실화(ribosylation)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 변형을 또한, 포함한다. 폴리펩티드가 항상 선형인 것은 아니다. 가령, 폴리펩티드는 유비퀴틴화(ubiquitination)의 결과로써 분지되고, 일반적으로, 자연 처리 현상 및 자연적으로 발생하지 않는 인간 조작에 의해 유발되는 현상을 비롯한 번역후 현상의 결과로써 원형(분지화(branching)와 함께 또는 분지화 없이)이 된다. 원형 폴리펩티드, 분지된 폴리펩티드, 분지된 원형 폴리펩티드는 비-번역 자연 과정 및 완전한 합성 방법으로 합성될 수 있다.
본 실시예에서는 본 발명에 사용하기 적합한 녹농균(P. aeruginosa) wt-아주린의 단편을 확인하는 방법을 기술한다. 이런 방법은 다른 쿠프레독신의 단편을 확인하는 데에도 이용될 수 있다. 실시예 1과 2에서는 N-과 C-말단 모두에서 절두된 일련의 글루타티온 S-이전효소(“GST”) 융합체의 작제를 기술한다. 이들 실시예에서는 이들 융합 단백질 산물의 정제 역시 기술한다.
실시예 9에서는 37℃에서 J774 세포 내에서 이들 융합체의 내재화(internalization)를 기술한다. wt-아주린은 내재화되는 반면, GST는 이들 세포의 주변에 존속하고 내재화되지 않았다. azu 36-128(SEQ ID NO: 5)과 azu 36-89(SEQ ID NO: 6)는 내재화되고 azu 36-77(SEQ ID NO: 7) 역시 내재화되었다. 추가적인 절두에서, azu 50-77(SEQ ID NO: 9)은 내재화되는 반면, azu 36-50(SEQ ID NO: 8)의 내재화는 매우 비효율적인 것으로 확인되었다. azu 50-77(SEQ ID NO: 9)의 azu 50-66(SEQ ID NO: 10)과 azu 67-77(SEQ ID NO: 11)로의 추가적인 절두는 극히 적은 내재화를 나타내는데, 이는 효율적인 내재화가 위치 66-67 근처에서 상기 서열의 간섭을 요하지 않는다는 것을 암시한다. 실용적인 관점으로부터, 이러한 데이터는 효율적인 수송을 위한 아미노산 50 내지 77의 유용성을 뒷받침한다.
일부 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 wt-아주린 침입 도메인이다. 본 발명의 한 구체예에서, wt-아주린 침입 도메인은 wt-아주린의 아미노산 50 내지 77(SEQ ID NO: 9)을 적어도 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, wt-아주린 침입 도메인은 wt-아주린의 아미노산 36 내지 77(SEQ ID NO: 7)을 적어도 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, wt-아주린 침입 도메인은 wt-아주린의 아미노산 36 내지 89(SEQ ID NO: 6)를 적어도 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, wt-아주린 침입 도메인은 wt-아주린의 아미노산 36 내지 128(SEQ ID NO: 5)을 적어도 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, wt-아주린 침입 도메인은 wt-아주린의 아미노산 50 내지 67(SEQ ID NO: 37)을 적어도 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, wt-아주린 침입 도메인은 wt-아주린의 아미노산 53 내지 70(SEQ ID NO: 41)을 적어도 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, wt-아주린 침입 도메인은 wt-아주린의 아미노산 53 내지 64(SEQ ID NO: 42)를 적어도 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 이외의 쿠프레독신으로부터 침입 도메인이다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 청록색 세균 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌(SEQ ID NO: 2), 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 루스티시아닌(SEQ ID NO: 3), 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 슈도아주린(SEQ ID NO: 4), 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae)로부터 아주린(SEQ ID NO: 29), 수막염균(Neisseria meningitidis)으로부터 아주린(SEQ ID NO: 30), 임균(Neisseria gonorrhoeae)으로부터 아주린(SEQ ID NO: 36), 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)로부터 아주린(SEQ ID NO: 31), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)로부터 아주린(SEQ ID NO: 32), 백일해균(Bordetella pertussis)으로부터 아주린(SEQ ID NO: 43) 또는 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌(SEQ ID NO: 33과 34)의 단편이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)의 아우라시아닌 B의 아미노산 57 내지 89(SEQ ID NO: 38)를 적어도 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 백일해균(Bordetella pertussis)의 아미노산 50 내지 77(SEQ ID NO: 39)를 적어도 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 수막염균(N. meningitidis)의 아미노산 106 내지 132(SEQ ID NO: 40)를 적어도 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae) 아주린의 아미노산 51-77(SEQ ID NO: 45)을 적어도 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 수막염균(Neisseria meningitidis) Laz의 아미노산 89-115(SEQ ID NO: 40)을 적어도 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus) 아주린의 아미노산 52-78(SEQ ID NO: 46)을 적어도 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 아주린의 아미노산 51-77(SEQ ID NO: 47)을 적어도 포함한다.
쿠프레독신 침입 도메인의 변형
본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 적하 화합물을 세포 내로 수송하는 능력을 유지하는 변이체를 생산하기 위하여 화학적으로 변형되거나 유전학적으로 조작된다. 가령, 실시예 14에서는 위치 54, 61, 70에 도입된 프롤린 잔기를 보유하는 wt-아주린은 UISO-Mel-2 세포에 침입하는 능력을 유지한다.
다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 보존된 아미노산 서열 DGXXXXXDXXYXKXXD(SEQ ID NO: 35) 또는 DGXXXXDXXYXKXXD(SEQ ID NO: 48)를 포함하는데, 여기서 D는 아스파라긴산이고, G는 글리신이고, Y는 티로신이고, K는 리신이고, X는 임의의 아미노산이다(실시예 17 참조).
쿠프레독신 침입 도메인의 변이체는 표준 기술로 합성될 수 있다. 유도체는 직접적으로, 또는 변형이나 부분적인 치환으로 고유 화합물로부터 형성된 아미노산 서열이다. 유사체는 고유 화합물과 동일하지는 않지만 유사한 구조를 보유하고 특정 구성요소 또는 측쇄의 측면에서 고유 화합물과 구별되는 아미노산 서열이다. 유사체는 합성되거나, 또는 상이한 진화적 기원으로부터 유래될 수 있다.
변이체는 전장이거나, 또는 유도체 또는 유사체가 변형된 아미노산을 보유하는 경우에 전장이 아니다. 쿠프레독신 침입 도메인의 변이체에는 예로써, 동일한 크기의 아미노산 서열에서, 또는 상동성 알고리즘(homology algorithm)에 의해 정렬된 서열과 비교하여, 쿠프레독신 침입 도메인과 적어도 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성으로 실질적으로 상동한 영역을 포함하는 분자가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 명세서에서 “아미노산 서열 동일성 비율(%)”은 두 서열을 정렬하는 경우에 후보 서열에서 아미노산 잔기와 일치하는 쿠프레독신 침입 도메인에서 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 동일성 비율(%)을 결정하기 위하여, 서열은 정렬하고, 필요한 경우, 최대 서열 동일성(％)을 달성하기 위하여 갭(gap)을 도입한다; 보존성 치환은 서열 동일성의 일부로서 간주되지 않는다. 동일성(％)을 측정하기 위한 아미노산 서열 정렬 절차는 당업자에게 공지되어 있다. 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어가 펩티드 서열을 정렬하는데 이용된다.
아미노산 서열을 정렬하는 경우에, 일정한 아미노산 서열 B에 대한 일정한 아미노산 서열 A(또는, 일정한 아미노산 서열 B에 대한 특정한 아미노산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 일정한 아미노산 서열 A)의 아미노산 서열 동일성 비율(%)은 아래와 같이 산정될 수 있다:
아미노산 서열 동일성 비율(%) = X/Y x 100
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 또는 알고리즘 정렬에 의해 A와 B의 동일한 정합(match)으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고,
Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다.
아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성(％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성(％)과 일치하지 않는다.
쿠프레독신 침입 도메인에 변화를 도입하여, 적하 화합물을 세포 내로 수송하는 쿠프레독신 침입 도메인의 능력을 무력화시키는, 쿠프레독신 침입 도메인의 아미노산 서열 내에 변형을 유도할 수 있다. “비-필수”아미노산 잔기는 적하 화합물을 세포 내로 수송하는 능력의 변화없이 쿠프레독신 침입 도메인의 야생형 서열로부터 변화될 수 있는 잔기인 반면, “필수” 아미노산은 이런 활성에 반드시 필요하다.
“보존성” 치환이 달성될 수 있는 아미노산은 당분야에 널리 공지되어 있다. 유용한 보존성 치환은 표 1, “바람직한 치환”에 도시된다. 한 종류의 아미노산이 동일 종류의 다른 아미노산으로 치환되는 보존성 치환은 이런 치환이 쿠프레독신 침입 도메인의 활성을 무력화시키지 않는다면, 본 발명의 범위에 속한다. 변화된 쿠프레독신 침입 도메인 활성을 유도하는 이들 교환은 이런 활성이 상당하다면 본 발명의 일부로서 고려된다.
바람직한 치환
최초 잔기 전형적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val, Leu, Ile Val
Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys
Asn (N) Gln, His, Lys, Arg Gln
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gln (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro, Ala Ala
His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucine Leu
Leu (L) Norleucine, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile
Lys (K) Arg, Gln, Asn Arg
Met (M) Leu, Phe, Ile Leu
Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr, Phe Tyr
Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Norleucine Leu
(1) 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면, β-시트 또는 α-나선 구조, (2) 전하, (3) 소수성, 또는 (4) 표적 부위 측쇄의 크기에 영향을 주는 “비-보존성” 치환은 쿠프레독신 침입 도메인 기능을 변화시킬 수 있다. 잔기는 표 2에 제시된 바와 같이, 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 여러 군으로 세분된다. 비-보존성 치환은 한 종류의 구성원을 다른 종류의 구성원으로 교체한다.
한 종류의 아미노산이 상이한 종류의 다른 아미노산으로 치환되는 비-보존성 치환은 이런 치환이 쿠프레독신 침입 도메인의 활성을 무력화시키지 않는다면, 본 발명의 범위에 속한다. 변화된 쿠프레독신 침입 도메인 활성을 유도하는 이들 교환은 이런 활성이 상당하다면 본 발명의 일부로서 고려된다.
표 2 아미노산 종류
종류 아미노산
소수성 Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile
중성 친수성 Cys, Ser, Thr
산성 Asp, Glu
염기성 Asn, Gln, His, Lys, Arg
교란된 사슬 구조 Gly, Pro
방향족 Trp, Tyr, Phe
다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인의 변이체는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린개의 잔기 50-77과 현저한 구조적 유사성을 갖는다. 쿠프레독신과 다른 단백질 사이의 현저한 구조적 상동성을 결정하는 연구의 실례에는 Toth et al., Developmental Cell 1:82-92 (2001)가 포함된다. 구체적으로, 쿠프레독신 침입 도메인의 변이체와 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77 사이에 현저한 구조적 상동성은 VAST 알고리즘(Gibrat et al., Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej et al., Proteins 23:356-3690 (1995))을 이용하여 결정된다. 특정 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인의 변이체와 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77의 구조 비교로부터 VAST p 값은 대략 10-3 이하, 대략 10-5 이하, 또는 대략 10-7 이하이다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인의 변이체와 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77 사이의 현저한 구조적 상동성은 DALI 알고리즘(Holm & Sander, J. Mol. Biol.233:123-138 (1993))을 이용하여 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 쌍별 구조 비교(pairwise structural comparison)에 대한 DALI Z 스코어는 적어도 3.5, 적어도 7.0, 또는 적어도 10.0이다.
쿠프레독신 침입 도메인에 변형은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드-매개된(특정부위) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝(alanine scanning), PCR 돌연변이유발을 이용하여 달성될 수 있다. 특정부위 돌연변이유발(Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); Zoller and Smith, Methods Enzymol. 154:329-50 (1987)), 카세트 돌연변이유발(cassette mutagenesis), 제한 선별 돌연변이유발(restriction selection mutagenesis)(Wells et al., Gene 34:315-23 (1985)) 또는 다른 공지된 기술을 클론된 DNA에서 수행하여 쿠프레독신 침입 도메인 변이 핵산을 산출할 수 있다. 이에 더하여, 쿠프레독신 침입 도메인과 구조적 유사성을 갖는 침입 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드는 당분야에 널리 공지된 방법으로 합성될 수 있다. 더 나아가, 야생형이나 변이 쿠프레독신 침입 도메인인 단백질 분자 역시 당분야에 널리 공지된 방법으로 합성될 수 있다.
쿠프레독신 침입 도메인 및 적하 화합물에 연결된 쿠프레독신 침입 도메인의 복합체를 코딩하는 핵산
다른 측면에서, 본 발명은 적하 화합물에 연결된 쿠프레독신 침입 도메인을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 제시한다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 당분야에 공지된 기술의 조합으로 제조될 수 있다. 가령, 쿠프레독신 침입 도메인과 적하 화합물에 대한 핵산 서열은 화학적 합성 또는 클로닝에 의해 개별적으로 제조될 수 있다. 이후, 이들 핵산 서열은 리가아제로 순차적으로 결찰시켜 목적하는 핵산 분자를 제공한다.
쿠프레독신 침입 도메인을 이용하여 적하 화합물을 전달하는 방법
다수의 아르기닌-풍부한 펩티드는 포유동물 세포막을 통하여 전좌(translocation)되고 단백질 적하 화합물을 이들 세포 내로 수송하는 것으로 알려져 있다(Suzuki, T., et al. J. Biol. Chem. 277:2437-43 (2002)). 가령, HIV Tat 단백질의 짧은 아르기닌-풍부한 11개 아미노산(아미노산 47-57) 분절은 적하 단백질을 포유동물 세포 내로 수송할 수 있다(Schwarze, SR., et al. Trends Cell Biol. 10:290-95 (2000)). 알파-나선 함량(alpha-helical content)을 강화시키고 아르기닌 잔기의 배치를 최적화시키는 합성 침입 도메인은 단백질 형질도입 도메인으로서 강화된 잠재력을 갖는 것으로 밝혀졌다(Ho, A., et al. Cancer Res. 61:474-77 (2001)). 대조적으로, wt-아주린은 단일 아르기닌 잔기를 보유한다. 이런 이유로, 비록 절대적인 것은 아니지만 본 발명에서 침입 양식은 Tat 단백질의 침입 양식과 상이한 것으로 생각된다.
본 발명은 적하 화합물의 세포로의 침입을 조장하는 이들 쿠프레독신 단편의 이용을 포괄한다. 이들 단편은 세포 내로의 침입에 요구되는 이들 단편을 확인하는 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 이와 같은 한가지 방법에서, 쿠프레독신 단편은 마커 물질에 연결되고, 상기 쿠프레독신 단편이 세포로 침입하는 지를 결정하기 위한 검사가 수행된다. 이들 방법은 상기한 쿠프레독신의 적절한 단편을 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예에서, 적하 화합물은 쿠프레독신, 예를 들면, 다른 아주린과 아주린-유사 단백질 중에서, 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 아주린(SEQ ID NO: 1)(“wt-아주린”); 청록색 세균 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌(SEQ ID NO: 2); 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 루스티시아닌(SEQ ID NO: 3) 또는 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 슈도아주린(SEQ ID NO: 4), 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae)로부터 아주린(SEQ ID NO: 29), 수막염균(Neisseria meningitidis)으로부터 아주린(SEQ ID NO: 30), 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)로부터 아주린(SEQ ID NO: 31), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)로부터 아주린(SEQ ID NO: 32), 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 A와 B(SEQ ID NO. 33, 34) 또는 임균(Neisseria gonorrhoeae) laZ 단백질(SEQ ID NO. 36)에 부착된다. 다른 구체예에서, 적하는 쿠프레독신 침입 도메인에 연결된다.
본 발명의 다양한 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 시험관내에서, 탈체에서 또는 생체내에서, 적하 화합물을 세포 내로 전달한다. 가령, 전달은 쿠프레독신 침입 도메인과 적하 화합물의 복합체를 세포 배양물, 예를 들면, 자궁경부 세포검사체(pap smear)에 추가함으로써 시험관내에서 달성된다. 대안으로, 전달은 환자로부터 떼어낸 샘플, 예를 들면, 혈액, 조직 또는 골수에 복합체를 추가하고, 처리된 샘플을 환자로 재도입함으로써 탈체에서 달성된다. 전달은 또한, 환자에 직접적으로 복합체를 투여함으로써 달성된다. 본 발명의 방법은 치료, 예방, 진단 또는 연구 목적으로 이용된다. 본 발명에 의해 전달되는 적하 화합물에는 단백질, 지단백, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류, 안티-센스 핵산을 비롯한 핵산, 염료, 미립자 또는 나노입자, 독소, 유기와 무기 분자, 소형 분자, 약제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
한 구체예에서, 검출가능 물질, 예를 들면, 녹색 형광 단백질과 같은 형광 물질; 발광 물질; β-갈락토시다아제와 같은 효소; 또는 방사성표지된 또는 비오틴화된 단백질은 검출가능 표현형을 세포로 공여하기 위하여 전달된다. 이와 유사하게, 검출가능 물질, 예를 들면, 형광 물질로 표지된 미립자 또는 나노입자가 전달될 수 있다. 적합한 나노입자의 한가지 실례는 2002년 5월 7일자로 허여된 U.S. Pat. No. 6,383,500에서 확인된다. 이들 검출가능 물질은 당업자에게 공지되어 있다.
일부 구체예에서, 적하 화합물은 X-레이 전산화 단층촬영(CT), 자기 공명 영상(MRI), 초음파 영상 또는 방사성핵종 섬광계수법(radionuclide scintigraphy)에 적합한 검출가능 물질이다. 이들 구체예에서, 적하 화합물은 진단 목적으로 환자에 투여된다. 조영제는 X-레이 CT, MRI, 초음파에 의해 획득되는 영상을 강화시키기 위한 적하 화합물로서 투여된다. 쿠프레독신 침입 도메인을 통하여 종양 조직을 표적하는 방사성핵종 적하 화합물의 투여가 방사성핵종 섬광계수법에 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인은 적하 화합물과 함께 또는 적하 화합물 없이 방사성핵종을 포함한다. 다른 구체예에서, 적하 화합물은 감마선이나 양전자 방출 방사성동위원소, 자기 공명 영상 조영제, X-레이 조영제, 또는 초음파 조영제이다.
적하 화합물로서 적합한 초음파 조영제에는 생체적합성 가스의 미세거품(microbubble), 액체 담체, 계면활성 마이크로스피어 마이크로스피어가 포함되지만 이들에 국한되지 않는데, 상기 조영제는 표적 부분과 미세거품 사이에 선택적 연결 부분, Ln을 추가로 포함한다. 이런 배경에서, 액체 담체는 수용액을 의미하고, 계면활성제는 용액에서 경계면 장력(interfacial tension)에서 감소를 유도하는 임의의 양쪽친화성 물질을 의미한다. 계면활성 마이크로스피어를 형성하는데 적합한 계면활성제의 목록은 EP0727225A2에서 기술된다. 계면활성 마이크로스피어에는 나노스피어(nanosphere), 리포좀, 소포 등이 포함된다. 생체적합성 가스는 공기, 또는 불화탄소(fluorocarbon), 예를 들면, C3-C5 과플루오르알칸(perfluoroalkane)인데, 이는 에코발생도(echogenicity)에서 차이 및 초음파 영상에서 조영을 제공한다. 상기 가스는 선택적으로, 연결기를 통하여 쿠프레독신 침입 도메인에 부착된 마이크로스피어에 피포 또는 내포된다. 이러한 부착은 공유 결합, 이온 결합 또는 반 데르 발스 결합일 수 있다. 이런 조영제의 구체적인 실례는 복수의 종양 신생혈관 수용체 결합 펩티드, 폴리펩티드 또는 펩티드모방체(peptidomimetic)를 갖는 지질 피포된 과불화탄소(perfluorocarbon)가 포함된다.
적하 화합물로서 적합한 X-레이 조영제에는 한가지이상의 X-레이 흡수 원자 또는 원자 번호 20 이상의 “중” 원자(heavy atom)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는데, 상기 조영제는 쿠프레독신 침입 도메인과 X-레이 흡수 원자 사이에 선택적 연결 부분, Ln을 추가로 포함한다. X-레이 조영제에서 빈번하게 사용되는 중원자는 요오드(iodine)이다. 최근에, 금속 킬레이트로 구성되는 X-레이 조영제(참조: U.S. Pat. No. 5,417,959) 및 복수의 금속 이온으로 구성되는 폴리킬레이트(polychelate)(참조: U.S. Pat. No. 5,679,810)가 보고되었다. 더욱 최근에, 다핵 클러스터 복합체(multinuclear cluster complex)가 X-레이 조영제로서 보고되었다(참조: U.S. Pat. No. 5,804,161, PCT WO91/14460, PCT WO 92/17215).
적하 화합물로서 적합한 MRI 조영제에는 한가지이상의 상자성 금속 이온(paramagnetic metal ion)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는데, 상기 조영제는 쿠프레독신 침입 도메인과 상자성 금속 이온 사이에 선택적 연결 부분, Ln을 추가로 포함한다. 상자성 금속 이온은 금속 착화물 또는 금속 산화물 입자의 형태로 존재한다. U.S. Pat. No. 5,412,148과 5,760,191에서는 MRI 조영제에 사용하기 적합한 상자성 금속 이온에 대한 킬레이터(chelator)의 실례를 기술한다. U.S. Pat. No. 5,801,228, U.S. Pat. No. 5,567,411, U.S. Pat. No. 5,281,704에서는 MRI 조영제에 사용하기 적합한 한가지이상의 상자성 금속 이온을 복합하는데 유용한 폴리킬란트(polychelant)의 실례를 기술한다. U.S. Pat. No. 5,520,904에서는 MRI 조영제로서 사용하기 적합한 상자성 금속 이온으로 구성되는 미립자 조성물을 기술한다.
다른 구체예에서, 적하 화합물은 세포, 예를 들면, 암세포에서 세포 주기 진행을 억제하거나 지연시키기 위하여 전달된다. 이런 암세포는 예로써, 골육종 세포, 폐암종 세포, 결장암종 세포, 림프종 세포, 백혈병 세포, 연조직 육종 세포, 또는 유방, 간, 방광 또는 전립선 암종 세포일 수 있다. 가령, 적하 화합물은 특히, 세포 주기 통제 단백질, 예를 들면, p53; 사이클린-의존성 키나아제 저해물질, 예를 들면, p16, p21 또는 p27; 자살 단백질, 예를 들면, 티미딘 키나아제 또는 니트로환원효소; 사이토킨 또는 다른 면역조절 단백질, 예를 들면, 인터루킨 1, 인터루킨 2 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF); 또는 독소, 예를 들면, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기한 종류의 화합물 중에서 하나의 생물학적 활성 단편이 전달된다.
다른 구체예에서, 적하 화합물은 상기한 종류의 화합물 중에서 하나를 코딩하는 핵산이다. 또 다른 구체예에서, 적하 화합물은 암을 치료하는데 사용되는 약제이다. 이런 약제에는 예로써, 5-플루오르우라실(fluorouracil); 인터페론 α; 메토트렉세이트(Methotrexate); 타목시펜(Tamoxifen); 빈크리스틴(Vincrinstine)이 포함된다. 이들 실례는 설명을 목적으로 제공되며, 많은 다른 화합물이 당업자에게 공지되어 있다.
암을 치료하는데 적합한 적하 화합물에는 알킬화제(alkylating agent), 예를 들면, 질소 겨자(nitrogen mustard), 알킬 술포네이트(alkyl sulfonate), 니트로소우레아(nitrosourea), 에틸렌이민(ethylenimine), 트리아젠(triazene); 대사길항물질(antimetabolite), 예를 들면, 엽산염 길항제(folate antagonist), 퓨린 유사체(purine analogue), 피리미딘 유사체(pyrimidine analogue); 항생제, 예를 들면, 안트라사이클린(anthracycline), 블레오마이신(bleomycin), 미토마이신(mitomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin); 효소, 예를 들면, L-아스파라기나아제; 파르네실(farnesyl)-단백질 이전효소 저해물질; 5.알파.-환원효소 저해물질; 17.베타.-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제(hydroxysteroid dehydrogenase) 타입 3의 저해물질; 호르몬제, 예를 들면, 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 에스트로겐(estrogen)/항에스트로겐(antiestrogen), 안드로겐(androgen)/항안드로겐(antiandrogen), 프로제스틴(progestin), 황체 형성 호르몬-방출 호르몬 길항제(luteinizing hormone-releasing hormone) 길항제, 옥트레오티드 아세테이트(octreotide acetate); 미세소관-교란제(microtubule-disruptor agent), 예를 들면, 엑틴아시딘(ecteinascidin) 또는 이들의 유사체와 유도체; 미세소관-안정화제(microtubule-stabilizing agent), 예를 들면, 파클리탁셀(paclitaxel)(Taxol™), 도세탁셀(docetaxel)(Taxotere™), 이들의 유사체와 같은 탁산(taxane) 및 에포틸론(epothilone) A-F와 이들의 유사체와 같은 에포틸론; 식물-유래된 산물, 예를 들면, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin), 탁산; 토포아이소머라제(topoisomerase) 저해물질; 프레닐(prenyl)-단백질 이전효소 저해물질; 혼합제(miscellaneous agent), 예를 들면, 하이드록시우레아(hydroxyurea), 프로카르바진(procarbazine), 미토탄(mitotane), 헥사메틸멜라민(hexamethylmelamine), 백금 배위 착화물(platinum coordination complex), 예를 들면, 시스플라틴(cisplatin)과 카보플라틴(carboplatin); 항암제와 세포독성제로서 사용되는 다른 약제, 예를 들면, 생물 반응 조절제(biological response modifier), 성장 인자(growth factor); 면역조절제(immune modulator)와 면역 항체(monoclonal antibody)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이들 종류의 항암제와 세포독성제의 대표적인 실례에는 메클로레타민 하이드로클로라이드(mechlorethamine hydrochloride), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 클로람부실(chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 이포스파마이드(ifosfamide), 부설판(busulfan), 카르무스틴(carmustin), 로무스틴(lomustine), 세무스틴(semustine), 스트렙토조신(streptozocin), 티오테파(thiotepa), 다카르바진(dacarbazine), 메토트렉세이트(methotrexate), 티오구아닌(thioguanine), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 플루다라빈(fludarabine), 펜타스타틴(pentastatin), 클라드리빈(cladribin), 시타라빈(cytarabine), 플루오르우라실(fluorouracil), 독소루비신 하이드로클로라이드(doxorubicin hydrochloride), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 블레오마이신 설페이트(bleomycin sulfate), 미토마이신(mitomycin) C, 악티노마이신(actinomycin) D, 사프라신(safracin), 사프라마이신(saframycin), 퀴노카르신(quinocarcin), 디스코데르몰리드(discodermolide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈 주석산염(vinorelbine tartrate), 에토포시드(etoposide), 에토포시드 인산염(etoposide phosphate), 테니포시드(teniposide), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(tamoxifen), 에스트라무스틴(estramustine), 에스트라무스틴 인산염 나트륨(estramustine phosphate sodium), 플루타마이드(flutamide), 부세렐린(buserelin), 레우프롤리드(leuprolide), 프테리딘(pteridine), 디에네세스(diyneses), 레바미솔(levamisole), 아플라콘(aflacon), 인터페론(interferon), 인터루킨(interleukin), 알데스루킨(aldesleukin), 필그라스팀(filgrastim), 사르그라모스팀(sargramostim), 리툭시맙(rituximab), BCG, 트레티노인(tretinoin), 이리노테칸 하이드로클로라이드(irinotecan hydrochloride), 베타메타손(betamethosone), 젬시타빈 하이드로클로라이드(gemcitabine hydrochloride), 알트레타민(altretamine), 토포테카(topoteca), 이들의 유사체 또는 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이들 종류의 선호되는 구성원에서는 파클리탁셀(paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 독소루비신(doxorubicin), 카르미노마이신(carminomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 아미노프테린(aminopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 메토프테린(methopterin), 미토마이신(mitomycin) C, 엑틴아시딘(ecteinascidin) 743, 또는 포피로마이신(pofiromycin), 5-플루오르우라실(fluorouracil), 6-메르캅토퓨린(mercaptopurine), 젬시타빈(gemcitabine), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 포도필로톡신(podophyllotoxin) 또는 포도필로톡신 유도체, 예를 들면, 에포토시드(etoposide), 에토포시드 인산염(etoposide phosphate) 또는 테니포시드(teniposide), 멜팔란(melphalan), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 레우로시딘(leurosidine), 빈데신(vindesine), 레우로신(leurosine)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
적하 화합물로서 유용한 항암제와 다른 세포독성제의 실례는 German Patent No. 4138042.8; WO 97/19086, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02224, WO 99/02514, WO99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890, WO 99/28324, WO 99/43653, WO 99/54330, WO 99/54318, WO 99/54319, WO 99/65913, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/00485에 기술된 에포틸론(epothilone) 유도체; WO 99/24416(참조: U.S. Pat. No. 6,040,321)에 기술된 사이클린 의존성 키나아제(cyclin dependent kinase) 저해물질; WO 97/30992와 WO 98/54966에 기술된 프레닐-단백질 이전효소 저해물질; U.S. Pat. No. 6,011,029(상기 U.S. 특허의 화합물은 특히, 암의 치료에서 임의의 NHR 조절제, 예를 들면, AR 조절제, ER 조절제 또는 LHRH 조절제와 함께, 또는 외과적 거세(surgical castration)와 함께 이용될 수 있다)에 전반적으로/구체적으로 기술된 것들과 같은 약제 등이다.
본 발명의 화합물과 함께 적하 화합물로서 이용되는 상기한 다른 치료제는 예로써, the Physicians' Desk Reference(PDR)에서 지정되거나 당업자에 의해 결정된 양으로 사용된다.
쿠프레독신 침입 도메인을 함유하는 제약학적 조성물
적하 화합물에 연결된 쿠프레독신 침입 도메인의 복합체를 함유하는 제약학적 조성물은 임의의 통상적인 방식, 예를 들면, 통상적인 혼합, 분해, 과립화, 당의정-만들기, 에멀젼화, 캡슐화, 포획, 또는 냉동 건조 과정으로 제조될 수 있다. 이러한 복합체는 당분야에 공지된 제약학적으로 허용되는 담체와 쉽게 혼합될 수 있다. 이들 담체는 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등의 형태로 제조를 가능하게 한다. 적절한 부형제에는 예로써, 충전제와 셀룰로오스 제형이 모두 포함될 수 있다. 다른 부형제에는 예로써, 향료, 착색제, 농후제(thickness), 디태크피어(detackifier), 다른 허용되는 첨가제, 어쥬번트 또는 결합제가 포함될 수 있다.
이들 조성물은 예로써, 세포형의 검출이나 영상, 또는 세포 사멸(cell death)과 관련된 질환의 치료 또는 이의 예방에 사용될 수 있다. 이들 조성물은 세포 사멸에 대한 내성과 관련된 질환을 예방하거나 치료할 수 있을 만큼 충분한 함량으로 투여될 수 있다. 본 명세서에서, “세포 사멸에 대한 내성과 관련된 질환”은 숙련된 의사 또는 임상의에 의해 결정되는, 건강한 세포와 비교하여 연장된 세포 수명의 성향으로 적어도 특성화되는 질병, 상태 또는 병을 의미한다. 전형적으로, 숙주 생물은 포유동물, 예를 들면, 인간 또는 동물이다.
쿠프레독신 침입 도메인을 함유하는 조성물의 투여
쿠프레독신 침입 도메인을 함유하는 조성물은 임의의 적절한 루트, 예를 들면, 경구, 협측, 흡입, 설하, 직장, 질, 경요도, 비강, 국소, 경피, 다시 말하면, 경피 또는 비경구(정맥내, 근육내, 피하, 관상동맥내 포함) 투여될 수 있다. 조성물과 이의 제약학적 제제는 의도한 목적을 달성하는 효과량으로 투여될 수 있다. 세포 사멸에 대한 내성과 관련된 질환을 치료하기 위하여 투여되는 경우에, 조성물은 치료 효과량으로 투여된다. “치료 효과량”은 치료되는 개체의 증상 발생을 예방하거나, 또는 기존 증상을 완화시키는 효과량이다. 치료 효과량의 결정은 당업자의 능력 범위에 속한다.
다양한 구체예에서, 조성물은 담체와 부형제(완충제, 탄수화물, 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산(가령, 글리신), 항산화제, 세균발육 저해제, 킬레이트제, 현탁제, 농후제 및/또는 보존제 포함), 물, 오일, 염수 용액, 수성 덱스트로스와 글리세롤 용액, 생리 조건을 근사하는데 요구되는 다른 제약학적으로 허용되는 보제물질(가령, 완충제, 긴장도 조절제(tonicity adjusting agent), 적심제(wetting agent) 등)을 함유한다. 당업자에게 공지된 임의의 담체가 본 발명의 조성물을 투여하는데 이용될 수 있긴 하지만, 담체의 유형은 투여 방식에 따라 달라진다. 화합물은 널리 공지된 기술을 이용하여 리포좀 내에 피포될 수도 있다. 생물분해성 마이크로스피어 역시 본 발명의 제약학적 조성물에 대한 담체로서 이용될 수 있다. 적절한 생물분해성 마이크로스피어는 예로써, U.S. Patent No. 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344; 5,942,252에서 기술된다. 본 명세서에서, “화합물”에는 펩티드, 아미노산 서열, 적하 화합물, 본 발명의 복합체가 포함된다.
본 발명의 조성물의 혈류에서 반감기는 원형화된 펩티드(circularized peptide)(Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)), D,L-펩티드(부분입체이성질체)(Futaki et al., J. Biol. Chem. Feb 23;276(8):5836-40 (2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987)), 특별한 아미노산을 보유하는 펩티드(Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)), N-과 C-말단 변형(Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990))을 비롯한 당업자에게 널리 공지된 여러 방법으로 연장되거나 최적화될 수 있다. 특히, d-이성질화(isomerization)(치환) 및 D-치환 또는 L-아미노산 치환에 의한 펩티드 안정성의 변형이 주목된다.
본 발명의 조성물은 널리 공지된 통상적인 멸균 기술로 멸균되거나, 또는 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 원상태로 포장되거나, 또는 냉동 건조되는데, 냉동 건조된 제조물은 투여에 앞서 무균 용액과 혼합된다.
본 발명의 조성물은 주사(가령, 피내, 피하, 근육내, 복강내 등), 흡입, 국소 투여, 좌약, 경피 패치의 이용 또는 구강을 비롯한 다양한 방식으로 투여될 수 있다.
주사로 투여되는 경우에, 조성물은 수용액, 바람직하게는, 생리 적합성 완충제, 예를 들면, Hanks 용액, 링거액, 또는 생리 식염수에서 조제된다. 용액은 제제 약물(flormulatory agent), 예를 들면, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유한다. 대안으로, 조성물은 사용에 앞서, 적절한 운반제, 예를 들면, 발열원없는 무균수로 구성을 위한 분말 형태로 조제된다.
흡입으로 투여되는 경우에, 조성물은 적절한 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오르메탄, 트리클로로플루오르메탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스를 이용한 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우에, 투약 단위(dosage unit)는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예로써, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴의 캡슐과 카트리지는 단백질 및 적절한 분말 기부(base), 예를 들면, 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 조제된다.
국소 투여의 경우에, 조성물은 당분야에 널리 공지된 바와 같이, 용액, 겔, 연고, 크림, 현탁액 등으로 조제된다. 일부 구체예에서, 투여는 경피 패치에 의해 달성된다. 좌약(가령, 직장 또는 질내)으로 투여되는 경우에, 조성물은 통상적인 좌약 기부를 함유하는 조성물 형태로 조제된다.
경구 투여되는 경우에, 조성물은 당분야에 널리 공지된 제약학적으로 허용되는 담체와의 조합으로 용이하게 조제될 수 있다. 고형 담체, 예를 들면, 만니톨, 락토오스, 스테아르산마그네슘 등이 사용된다; 이들 담체는 케모탁신(chemotaxin)이 치료되는 개체에 의한 경구 섭취를 위한 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 조제될 수 있도록 한다. 경구 고체 조성물, 예를 들면, 분말, 캡슐, 정제에 적합한 부형제에는 충전제(가령, 당), 셀룰로오스 제조물, 과립화제, 결합제 등이 포함된다.
당분야에 널리 공지된 다른 통상적인 담체에는 다가 담체, 예를 들면, 박테리아 캡슐 다당류, 덱스트란 또는 유전자 조작된 벡터 역시 포함된다. 이에 더하여, 이러한 조성물을 함유하는 서방 제제는 연장된 기간 동안 상기 조성물을 방출하는데, 이런 서방 제제가 없는 경우에 조성물은 치료 효과를 유도하거나 강화하기에 앞서, 예로써 프로테아제 및 단순한 가수분해에 의해 개체의 조직으로부터 제거되거나 분해된다.
정확한 제제, 투여 루트, 용량은 환자의 상태를 고려하여 임상의에 의해 결정된다. 용량과 휴지기는 치료 효과를 유지할 만큼 충분한 혈장 수준의 복합체를 제공하기 위하여 개별적으로 조정될 수 있다. 일반적으로, 원하는 조성물은 의도된 투여 루트와 표준 제약학적 관례에 따라 선택된 제약학적 담체와의 혼합물로 투여된다.
적절한 용량은 예로써, 사용된 쿠프레독신 침입 도메인을 포함하는 화합물, 호스트, 투여 방식, 치료되거나 진단되는 질병의 특성과 심각도에 따라 달라질 것이다. 하지만, 본 발명의 방법의 한 구체예에서, 인간에서 만족스런 치료 결과는 체중 ㎏당 대략 0.001 내지 20 ㎎/㎏의 쿠프레독신 침입 도메인 포함 화합물의 일일 용량(daily dosage)에서 달성되는 것으로 지시된다. 한 구체예에서, 인간에서 치료를 위한 지시된 일일 용량은 예로써, 1일 분량, 1주일 분량, 1개월 분량 및/또는 연속 투약으로 편의하게 투여되는 대략 0.7 ㎎ 내지 1400 ㎎ 범위의 쿠프레독신 침입 도메인 포함 화합물이다. 1일 분량은 1일 1 내지 12회 불연속적으로 투약될 수 있다. 대안으로, 분량은 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 1주일마다, 이와 유사하게 최대 31일까지 하루씩 증가하여 투약될 수 있다. 투약은 정제, 패치, i.v. 투여 등을 비롯한 임의의 적절한 투약 형태를 이용한 연속, 간헐적 또는 단일 투약일 수 있다. 더욱 구체적으로, 조성물은 치료 효과량으로 투여된다. 특정 구체예에서, 치료 효과량은 체중 ㎏당 대략 0.01-20 ㎎/㎏이다. 특정 구체예에서, 용량 수준은 대략 10 ㎎/㎏/day, 대략 15 ㎎/㎏/day, 대략 20 ㎎/㎏/day, 대략 25 ㎎/㎏/day, 대략 30 ㎎/㎏/day, 대략 35 ㎎/㎏/day, 대략 40 ㎎/㎏/day, 대략 45 ㎎/㎏/day 또는 대략 50 ㎎/㎏/day이다.
쿠프레독신 침입 도메인을 포함하는 화합물을 환자에 도입하는 방법은 일부 구체예에서, 암을 치료하는 것으로 공지된 다른 약제와의 공동-투여이다. 이들 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 쿠프레독신 침입 도메인을 포함하는 화합물은 암을 치료하기 위한 다른 약제를 포함하는 칵테일의 일부이거나, 또는 이들 약제와 공동-투약된다. 이들 약제에는 예로써, 본 명세서에 언급된 것들, 구체적으로, 5-플루오르우라실(fluorouracil); 인터페론 α; 메토트렉세이트(methotrexate); 타목시펜(tamoxifen); 빈크리스틴(vincrinstine)이 포함된다. 이들 실례는 설명을 목적으로 제공되며, 많은 다른 화합물이 당업자에게 공지되어 있다.
암을 치료하는데 적합한 다른 약제에는 알킬화제(alkylating agent), 예를 들면, 질소 겨자(nitrogen mustard), 알킬 술포네이트(alkyl sulfonate), 니트로소우레아(nitrosourea), 에틸렌이민(ethylenimine), 트리아젠(triazene); 대사길항물질(antimetabolite), 예를 들면, 엽산염 길항제(folate antagonist), 퓨린 유사체(purine analogue), 피리미딘 유사체(pyrimidine analogue); 항생제, 예를 들면, 안트라사이클린(anthracycline), 블레오마이신(bleomycin), 미토마이신(mitomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin); 효소, 예를 들면, L-아스파라기나아제; 파르네실(farnesyl)-단백질 이전효소 저해물질; 5.알파.-환원효소 저해물질; 17.베타.-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제(hydroxysteroid dehydrogenase) 타입 3의 저해물질; 호르몬제, 예를 들면, 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 에스트로겐(estrogen)/항에스트로겐(antiestrogen), 안드로겐(androgen)/항안드로겐(antiandrogen), 프로제스틴(progestin), 황체 형성 호르몬-방출 호르몬 길항제(luteinizing hormone-releasing hormone) 길항제, 옥트레오티드 아세테이트(octreotide acetate); 미세소관-교란제(microtubule-disruptor agent), 예를 들면, 엑틴아시딘(ecteinascidin) 또는 이들의 유사체와 유도체; 미세소관-안정화제(microtubule-stabilizing agent), 예를 들면, 파클리탁셀(paclitaxel)(Taxol™), 도세탁셀(docetaxel)(Taxotere™), 이들의 유사체와 같은 탁산(taxane) 및 에포틸론(epothilone) A-F와 이들의 유사체와 같은 에포틸론; 식물-유래된 산물, 예를 들면, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin), 탁산; 토포아이소머라제(topoisomerase) 저해물질; 프레닐(prenyl)-단백질 이전효소 저해물질; 혼합제(miscellaneous agent), 예를 들면, 하이드록시우레아(hydroxyurea), 프로카르바진(procarbazine), 미토탄(mitotane), 헥사메틸멜라민(hexamethylmelamine), 백금 배위 착화물(platinum coordination complex), 예를 들면, 시스플라틴(cisplatin)과 카보플라틴(carboplatin); 항암제와 세포독성제로서 사용되는 다른 약제, 예를 들면, 생물 반응 조절제(biological response modifier), 성장 인자(growth factor); 면역조절제(immune modulator)와 면역 항체(monoclonal antibody)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 화합물은 방사선 요법 및 수술과 병용될 수 있다.
이들 종류의 항암제와 세포독성제의 대표적인 실례에는 메클로레타민 하이드로클로라이드(mechlorethamine hydrochloride), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 클로람부실(chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 이포스파마이드(ifosfamide), 부설판(busulfan), 카르무스틴(carmustin), 로무스틴(lomustine), 세무스틴(semustine), 스트렙토조신(streptozocin), 티오테파(thiotepa), 다카르바진(dacarbazine), 메토트렉세이트(methotrexate), 티오구아닌(thioguanine), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 플루다라빈(fludarabine), 펜타스타틴(pentastatin), 클라드리빈(cladribin), 시타라빈(cytarabine), 플루오르우라실(fluorouracil), 독소루비신 하이드로클로라이드(doxorubicin hydrochloride), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 블레오마이신 설페이트(bleomycin sulfate), 미토마이신(mitomycin) C, 악티노마이신(actinomycin) D, 사프라신(safracin), 사프라마이신(saframycin), 퀴노카르신(quinocarcin), 디스코데르몰리드(discodermolide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈 주석산염(vinorelbine tartrate), 에토포시드(etoposide), 에토포시드 인산염(etoposide phosphate), 테니포시드(teniposide), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(tamoxifen), 에스트라무스틴(estramustine), 에스트라무스틴 인산염 나트륨(estramustine phosphate sodium), 플루타마이드(flutamide), 부세렐린(buserelin), 레우프롤리드(leuprolide), 프테리딘(pteridine), 디에네세스(diyneses), 레바미솔(levamisole), 아플라콘(aflacon), 인터페론(interferon), 인터루킨(interleukin), 알데스루킨(aldesleukin), 필그라스팀(filgrastim), 사르그라모스팀(sargramostim), 리툭시맙(rituximab), BCG, 트레티노인(tretinoin), 이리노테칸 하이드로클로라이드(irinotecan hydrochloride), 베타메타손(betamethosone), 젬시타빈 하이드로클로라이드(gemcitabine hydrochloride), 알트레타민(altretamine), 토포테카(topoteca), 이들의 유사체 또는 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이들 종류의 선호되는 구성원에서는 파클리탁셀(paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 독소루비신(doxorubicin), 카르미노마이신(carminomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 아미노프테린(aminopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 메토프테린(methopterin), 미토마이신(mitomycin) C, 엑틴아시딘(ecteinascidin) 743, 또는 포피로마이신(pofiromycin), 5-플루오르우라실(fluorouracil), 6-메르캅토퓨린(mercaptopurine), 젬시타빈(gemcitabine), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 포도필로톡신(podophyllotoxin) 또는 포도필로톡신 유도체, 예를 들면, 에포토시드(etoposide), 에토포시드 인산염(etoposide phosphate) 또는 테니포시드(teniposide), 멜팔란(melphalan), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 레우로시딘(leurosidine), 빈데신(vindesine), 레우로신(leurosine)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명의 조성물과의 동시-투여에 유용한 항암제와 다른 세포독성제의 실례는 German Patent No. 4138042.8; WO 97/19086, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02224, WO 99/02514, WO99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890, WO 99/28324, WO 99/43653, WO 99/54330, WO 99/54318, WO 99/54319, WO 99/65913, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/00485에 기술된 에포틸론(epothilone) 유도체; WO 99/24416(참조: U.S. Pat. No. 6,040,321)에 기술된 사이클린 의존성 키나아제(cyclin dependent kinase) 저해물질; WO 97/30992와 WO 98/54966에 기술된 프레닐-단백질 이전효소 저해물질; U.S. Pat. No. 6,011,029(상기 U.S. 특허의 화합물은 특히, 암의 치료에서 임의의 NHR 조절제, 예를 들면, AR 조절제, ER 조절제 또는 LHRH 조절제와 함께, 또는 외과적 기술과 함께 이용될 수 있다)에 전반적으로/구체적으로 기술된 것들과 같은 약제 등이다.
본 발명에 사용되는 제약학적 조성물은 조성물의 가공을 용이하게 하는 부형제와 보조성분, 조성물의 분비를 저해 또는 촉진하는 활성물질, 또는 이들의 혼합물을 함유하는 한가지이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 이용한 통상적인 방식으로, 치료에 사용될 수 있는 제제로 조제될 수 있다.
쿠프레독신 침입 도메인, 또는 침입 도메인과 적하 화합물을 통합하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 벡터 내로 삽입되고 유전자 요법 벡터로서 이용될 수 있다. 유전자 요법 벡터는 예로써, 정맥내 주사, 국소 투여(Nabel et al., US Patent No. 5,328,470, 1994. USA), 또는 뇌정위 주사(Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA, vol. 91, pp 3054-57 (1994))로 개체에 전달될 수 있다. 유전자 요법 벡터의 제약학적 제제는 허용가능 희석제를 함유하거나, 또는 유전자 전달 운반체가 삽입된 지연 방출 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안으로, 완전 유전자 전달 벡터가 재조합 세포, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터로부터 원형으로 제조될 수 있는 경우에, 제약학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나이상의 세포를 함유할 수 있다.
한 측면에서, 조성물은 DNA로서 전달되고, 복합체가 in situ에서 산출된다. 한 구체예에서, DNA는 예로써 Ulmer et al., Science, Vol.259, pp-1745-49(1993)에서 기술되고 Cohen, Science, vol.259, pp-1691-92(1993)에 검토된 바와 같이 “나신(naked)”이다. 나신 DNA의 흡수는 DNA를 담체, 예를 들면, 세포 내에 효과적으로 수송되는 생분해가능 비드에 피복하여 증가시킬 수 있다. 이런 방법에서, DNA는 핵산 발현 시스템, 박테리아 발현 시스템, 바이러스 발현 시스템을 비롯한 당업자에게 공지된 다양한 전달 시스템 내에 존재한다. DNA를 이런 발현 시스템 내로 통합하는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다(WO90/11092, WO93/24640, WO93/17706, U.S. Pat. No. 5,736,524).
생물체로부터 생물체로 유전 물질을 이동시키는데 사용되는 벡터는 크게 2가지 종류로 세분될 수 있다: 클로닝 벡터는 적합한 숙주 세포에서 증식에 필수적이지 않고 외래 DNA가 삽입될 수 있는 영역을 보유하는 복제 플라스미드 또는 파지이다; 외래 DNA는 벡터의 구성요소인 것처럼 복제되고 증식된다. 발현 벡터(가령, 플라스미드, 효모 또는 동물 바이러스 게놈)는 외래 DNA, 예를 들면, 상기 조성물의 DNA를 전사하고 번역하기 위하여 숙주 세포 또는 조직 내로 외래 유전물질을 도입하는데 사용된다. 발현 벡터에서, 도입된 DNA는 삽입된 DNA를 전사하도록 숙주 세포에 신호하는 프로모터와 같은 요소에 작동가능하게 연결된다. 특정 인자에 반응하여 유전자 전사를 조절하는 유도성 프로모터와 같은 일부 프로모터가 특히 유용하다. 조성물 폴리뉴클레오티드를 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결하면, wt-아주린 침입 도메인 조성물 폴리펩티드 또는 단편의 발현을 조절할 수 있다. 고전적인 유도성 프로모터의 실례는 α-인터페론, 열 충격, 중금속 이온 및 스테로이드, 예를 들면, 글루코코르티코이드(Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511 (1990))와 테트라사이클린에 반응하는 프로모터이다. 다른 바람직한 유도성 프로모터는 구조체가 삽입되는 세포에 내인성이 아니지만 유도 인자가 외부로부터 공급되면 이들 세포에서 반응하는 프로모터이다. 일반적으로, 유용한 발현 벡터는 주로 플라스미드이다. 하지만, 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터(가령, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스)가 고려된다.
벡터 선택은 사용되는 생물체 또는 세포 및 벡터의 원하는 목적에 좌우된다. 일반적으로, 벡터는 신호 서열, 복제 기점, 마커 유전자, 인헨서 요소, 프로모터, 전사 종결 서열을 포함한다.
쿠프레독신 침입 도메인-적하 화합물 복합체를 포함하는 키트
다른 측면에서, 본 발명은 포장 또는 용기에 (1) 적하 화합물에 연결된 쿠프레독신 침입 도메인의 복합체를 함유하는 반응물; (2) 제약학적으로 허용되는 어쥬번트 또는 부형제를 함유하는 반응물; (3) 투여용 운반기, 예를 들면, 주사기; (4) 투약법 중에서 한가지이상을 포함하는 키트를 제시한다. 구성요소 (1)-(4) 중에서 2가지 이상이 동일 용기에서 발견되는 구체예 역시 고려된다.
키트가 공급되는 경우에, 조성물의 서로 다른 구성요소는 별개의 용기에 포장되고 사용직전에 혼합된다. 이들 구성요소의 개별적인 포장은 활성 구성요소의 기능 상실 없이 장기 저장을 가능하게 한다.
키트에 포함되는 반응물은 일정한 용기에 담아 공급함으로써, 서로 다른 구성요소의 수명이 보존되고 용기 재료에 의해 흡수되거나 변형되지 않도록 한다. 가령, 밀봉된 유리 앰풀은 냉동 건조된 세포독성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 중성의 비-활성 가스, 예를 들면, 질소 하에 포장된 완충제를 포함한다. 앰풀은 임의의 적절한 재료, 예를 들면, 유리, 유기 중합체(가령, 폴리카보네이트, 폴리스트렌 등), 세라믹, 금속, 또는 유사한 반응물을 유지시키는데 전형적으로 사용되는 임의의 다른 물질로 구성된다. 적절한 용기의 다른 실례는 앰풀과 유사한 물질로부터 조제되는 간단한 병 및 알루미늄이나 합금과 같은 박을 입힌 내부를 보유하는 덮개이다. 다른 용기에는 검사 튜브, 바이알, 플라스크, 병, 주사기 등이 포함된다. 용기는 무균 접근 포트(access port), 예를 들면, 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개가 달린 병을 보유한다. 다른 용기는 쉽게 제거가능하고 제거이후에 구성요소가 혼합될 수 있도록 하는 막에 의해 분리되는 2개의 구획을 보유한다. 제거가능 막은 유리, 플라스틱, 고무 등이다.
키트에는 사용 안내서 역시 제공될 수 있다. 사용법은 종이 또는 다른 기질에 인쇄되거나 전자-판독가능 매체, 예를 들면, 플로피 디스크, CD-ROM, DVD-ROM, Zip 디스크, 비디오테이프, 오디오테이프, 플래시 메모리 장치 등으로 제공될 수 있다. 상세한 사용법은 키트에 물리적으로 부착되지 않을 수도 있다; 대신에, 사용자는 키트의 제조업체나 유통업체에 의해 구체적으로 명시되거나 전자 메일로 제공된 인터넷 웹 사이트를 직접 방문할 수도 있다.
본 발명의 더욱 완전한 이해는 아래의 구체적인 실시예를 참고하여 달성할 수 있다. 이들 실시예는 설명을 목적으로 하며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 형태에서 변화 및 등가물의 치환은 본 발명을 우회하기 위한 편법으로 간주된다. 본 명세서에 특정 용어가 이용되고 있긴 하지만, 이들 용어는 설명을 위한 것으로 본 발명을 제한하지 않는다. 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 본 발명의 개변이 가능하고, 따라서 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정된다.
실시예 1 - 플라스미드 작제
융합 글루타티온 S-이전효소(GST)-절두된 wt-아주린(azu) 유도체를 발현하는 플라스미드는 교정판독(proofreading) DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응으로 작제하였다. 도 6에서는 다양한 절두된 wt-아주린 구조체의 개요도를 도시한다. pGST-azu 36-128의 경우에, 증폭된 PCR 단편은 상업적 GST 발현 벡터 pGEXSX(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855)의 BamHl와 EcoRl 부위 내로 도입하였다. 상기 단편은 주형(template)으로서 pUC19-azu 및 프라이머, 5’-CGGGATCC CCG GCA ACC TGC CGA AGA ACG TCA TGG GC-3’(SEQ ID NO: 12)과 5’-CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3’(SEQ ID NO: 13)으로 증폭하였는데, 여기서 부가적으로 도입된 BamHl과 EcoRI 부위는 각각 밑줄로 표시된다. azu 유전자의 카르복시-말단 절두는 QuickChange 특정부위 돌연변이유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA 92037)를 이용하여 종결 코돈을 도입함으로써 누적적으로 수행하였다.
pGST-azu 36-50, pGST-azu 36-77, pGST-azu 36-89의 경우에, 종결 코돈은 각각, Ser51, Ser78, Gly90에 도입하였다. pGST-azu 36-128을 보유하는 플라스미드는 주형 DNA로서 이용하였다. 특정부위 돌연변이유발을 위한 3가지 세트의 올리고뉴클레오티드는 아래에 제시된다: pGST-azu 36-50의 경우: 5’-GGC CAC AAC TGG GTA CTG TGA ACC GCC GCC GAC ATG CAG-3’(SEQ ID NO: 14)와 5’-CTG CAT GTC GGC GGC GGT TCA CAG TAC CCA GTT GTG GCC-3’(SEQ ID NO: 15). pGST-azu 36-77의 경우: 5’-CCT GAA GCC CGA CGA CTG ACG TGT CAT CGC CCA CAC C-3’(SEQ ID NO: 16)과 5’-GGT GTG GGC GAT GAC ACG TCA GTC GTC GGG CTT CAG G-3’(SEQ ID NO: 17). pGST- azu 36-89의 경우: 5’-CCA AGC TGA TCG GCT CGT GAG AGA AGG ACT CGG TGA CC-3’(SEQ ID NO: 18)와 5’-GGT CAC CGA GTC CTT CTC TCA CGA GCC GAT CAG CTT GG-3 (SEQ ID NO: 19). 플라스미드 pGST-azu 50-77과 pGST-azu 67-77은 주형 DNA로서 pGST-azu 36-77을 이용한 PCR로 산출하였다.
증폭된 PCR 단편, azu 50-77과 azu 67-77은 정방향 프라이머 5’-CGGGATCC TGA GCA CCG CCG CCG ACA TGC AGG G-3’(SEQ ID NO: 20)과 5’-CGGGATCC CCG GCC TGG ACA AGG ATT ACC TGA AGC CCG-3’(SEQ ID NO: 21)을 이용하여 수득하였는데, 여기서 부가적으로 도입된 BamHI 부위는 밑줄로 표시된다. 양쪽 경우에 역방향 프라이머, 5’-CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3’(SEQ ID NO: 22)이 이용되었다.
gst-azu 50-77을 보유하는 플라스미드는 아래의 올리고뉴클레오티드를 이용한, Gly67에 종결 코돈의 도입으로 pGST-azu 50-66을 산출하는데 이용되었다: 5’-GAC GGC ATG GCT TCC TGA CTG GAC AAG GAT TAC C -3’(SEQ ID NO: 23)과 5’-GGT AAT CCT TGT CCA GTC AGG AAG CCA TGC CGTC- 3’(SEQ ID NO: 24). 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 녹색 형광 단백질 유전자(gfp) 역시 PCR로 증폭하였다. 이용된 정방향과 역방향 프라이머는 각 올리고뉴클레오티드의 5’말단에 BamHl과 EcoRI 부위를 보유하는 5’-CGGGATCC CCA TGG TGA GCA AGGGCG-3’(SEQ ID NO: 25)와 5’-CGGAATTC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC G-3’(SEQ ID NO: 26)이었다. 생성된 PCR 단편은 pGEXSX 벡터 내로 결찰시켜 pGST-GFP를 산출하였다. gst-gfp-azu 50-77를 보유하는 플라스미드 DNA를 제조하기 위하여, azu 50-77 유전자는 주형으로서 pGST-azu 50-77 및 프라이머 5’-CCGCTCGAG CCT GAG CAC CGC CGC CAT GCA GGG-3’(SEQ ID NO: 27)과 5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGC TCA GTC GTC GGG CTT CAG GTA ATC C-3’(SEQ ID NO: 28)를 이용한 PCR로 증폭하였는데, 여기서 도입된 XhoI과 NotI 부위는 각각, 밑줄로 표시된다. 정제된 azu 50-77 단편은 pGST-GFP 내에서 XhoI과 NotI 제한 효소 부위에 도입되었다.
실시예 2 - 단백질의 정제
Wt-아주린과 M44KM64E 변이체 아주린은 Yamada, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, pp. 4770-75 (2004) 및 동시-계류중인 U.S. 특허 출원 10/720,603에 기술된 바와 같이 제조하고 정제하였다. 간단히 말하면, wt-아주린 유전자는 Kukimoto et al., FEBS Lett, vol. 394, pp 87-90 (1996)에 기술된 방법에 따른 PCR로 증폭하였다. PCR은 주형 DNA로서 녹농균(P. aeruginosa) 균주 PAO1로부터 게놈 DNA를 이용하여 수행하였다.
Hindlll과 Pstl로 절단된 545 bp의 증폭된 DNA 단편은 pUC19의 상응하는 부위 내로 삽입하고, 따라서 아주린 유전자를 lac 프로모터 하류에 위치시켜 발현 플라스미드 pUC19-azuA를 산출하였다. E. col JM109는 상기 아주린 유전자의 발현을 위한 숙주 균주로서 이용하였다. 상기 재조합 대장균(E. coil) 균주는 50 ㎍ ㎖-1 암피실린, 0.1 mM IPTG, 0.5 mM CuSO4를 포함하는 2YT 배지 내에 37℃에서 16시간동안 배양하여 아주린을 생산하였다.
M44KM64E 변이체 아주린의 제조를 위하여, QuickChange 특정부위 돌연변이유 발 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 아주린 유전자의 특정부위 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이는 DNA 염기서열분석으로 확증하였다.
액시디티오바실루스 페로옥시단스(Acidithiobadilus ferrooxidans)로부터 쿠프레독신 루스티시아닌을 인코딩하는 rus 유전자를 보유하는 플라스미드 DNA, pET9a는 Dr. Kazuhiko Sasaki, Central Research Institute of Electric Power Industry, Chiba, Japan로부터 입수하였다.
루스티시아닌은 Sasaki, K., et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., vol. 67, pp. 1039-47 (2003)에 기술된 방법을 일부 변형하여 rus 유전자를 대장균(E. coli) BL21(DE3)로부터 분리하였다. 간단히 말하면, 베타-알라닌 완충액(pH 4.0)과 TSK-겔 CM-650 칼럼(Tosoh Bioscience, LLC, Montgomeryville, PA 18936) 대신에 아세트산 완충액(pH 4.0)과 CM-Sepharose(Sigma Chemicals, St. Louis, MO 63178)를 이용하였다. 2가지 다른 정제된 쿠프레독신; 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)로부터 플라스토시아닌 및 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 슈도아주린은 각각, Dr. Beatrix G. Schlarb-Ridley, University of Cambridge, UK와 Dr. Christopher Dennison, University of Newcastle Upon Tyne, UK로부터 입수하였다.
모든 재조합 GST-융합 유도체는 아래와 같이 정제하였다: 대장균(E. coli) BL21 세포는 숙주 균주로서 이용하였다. L 액체배지에서 성장의 초기 대수기(log phase)에서 0.4 mM IPTG로 도입이후, GST-융합 단백질은 Glutathione Sepharose 4B 친화성 크로마토그래피 및 PBS를 포함하는 Sephadex 75 겔-여과 칼럼(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855)을 이용하여 세포 추출물로부터 정제하였다. Alexa fluor(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR 97402)로 표지된 정제된 단백질, wt 아주린과 GST-유도체 또는 다른 쿠프레독신은 제조업체의 사용설명서에 따라 분리하였다. 결합하지 않는 자유 형광 화학물질은 겔-여과 칼럼으로 제거하였다.
실시예 3 - 세포 배양
J774와 UISO-Mel-2 세포(Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, Maryland U.S.A.)는 Yamada, T. et al. Infect. Immun. vol. 70, pp. 7054-62 (2002); Goto, M., et al. Mol. Microbiol. vol. 47, pp. 549-59 (2003); Yamada, T., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 99, pp. 14098-103 (2002)에 기술된 바와 같이 배양하였다. 인간 정상 섬유아세포 세포(the Department of Surgical Oncology, University of Illinois at Chicago (UIC), Chicago의 보존 배양(stock culture) 컬렉션)는 2 mM L-글루타민, 0.1 mM MEM 필수 아미노산을 함유하는 Eagle 염을 포함하고 10% 열 불활화된 태아 소 혈청, 100 Unit/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된 MEM에 배양하였다. MCF-7과 MOF-10F 세포는 Punj et al. Oncogene 23:2367-78 (2004)에서 기술된 바와 같이 배양하였다.
실시예 4 - J774, UISO-Mel-2, 섬유아세포 세포의 공동-배양 및 공초점 검경
J774, UISO-Mel-2, 섬유아세포 세포는 개별 커버 슬립 상에 배양하였다. 하룻밤 배양이후, 이들 세포는 새로운 배지로 세척하고, 3가지 세포주 모두 Alexa fluor 568로 공액된 200 ㎍/㎖의 wt-아주린을 포함하는 배양 접시에 위치시켰다. 이후, 이들 세포는 37℃에서 5% C02 하에 0.5 또는 3.5 시간동안 배양하였다.
현미경 샘플을 준비하기 위하여, 세포는 37℃에서 하룻밤동안 커브-슬립 상에서 배양하였다. 배양된 세포는 단백질 처리에 앞서 37℃ 또는 4℃에 위치시켰다. 미리-데워진 37℃ 새로운 배지 또는 차가운 4℃ 새로운 배지는 적-형광(Alexa fluor568로 표지된) 쿠프레독신 또는 GST-융합 유도체와 혼합하고, 이들 세포와 함께 배양하였다. 이들 세포는 PBS로 세척하고, -20℃에서 5분간 메탄올로 고정시켰다. PBS로 2회 세척 및 핵을 염색하기 위한 1.5 ㎍/㎖ 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 포함하는 봉입 배지(mounting media)(VECTASHILD, Vector, Burlingame, CA)의 첨가이후, 공초점 현미경(confocal microscope)으로 영상을 획득하였다.
실시예 5 쿠프레독신의 J774 세포 내로 침입
Wt-아주린, 이의 돌연변이체 M44KM64E, 플라스토시아닌, 슈도아주린, 루스티시아닌은 실시예 4에서처럼 J774 세포와 함께 배양하고, 이들 세포는 공초점 검경을 이용하여 실험하였다. 이들 실험에서, 쿠프레독신은 적색 형광을 발하는 Alexa fluor 568로 공액하고 200 ㎍/㎖의 농도에서 37℃에서 1시간동안 J774 세포와 함께 배양하며, 별개의 실험에서 야생형 아주린과 루스티시아닌은 야생형 아주린과 루스티시아닌은 대략 6 내지 7 μM의 농도에서 37℃에서 1시간동안 J774 세포와 함께 배양하였다. 핵은 DAPI로 푸른색으로 염색하였다. 이들 단백질이 없는 대조를 유지시켰다. 모든 경우에, 쿠프레독신은 J774 세포의 세포질 내로 침입하는 것으로 밝혀졌다. 유사한 실험에서, 아우라시아닌 A와 B는 MCF7 암세포에 선호적으로 침입하 고 비-암성 대조 세포에는 침입하지 않는다.
실시예 6 Wt-아주린과 루스티시아닌의 다양한 세포형 내로 침입
Wt-아주린은 MCF-7 세포에 비하여 MCF-10F 세포에 대하여 감소된 세포독성 활성을 나타낸다(Punj et al. Oncogene 23:2367-2378 (2004)). J774, 복막 대식세포, 비만 세포, 인간 유방암 MCF-7, 인간 정상 상피 MCF-10F 세포(the Department of Surgical Oncology, University of Illinois at Chicago (UIC), Chicago의 보존 배양 컬렉션)는 실시예 5에서처럼 처리하고 실험하여 wt-아주린이 이들 세포에 침입할 수 있는 지를 검사하였다.
Wt-아주린은 45분 배양 동안 J774 세포에 내재화되었다. 하지만, 이는 복막 대식세포 또는 비만 세포 내에 매우 비효율적으로 내재화되었다. 6시간 배양이후에도, 이들 세포는 매우 제한된 침입을 보였다. 이와 유사하게, wt-아주린은 유방암 MCF-7 세포에 효율적으로 침입하는 반면, 정상 유방 MCF-10F 세포에서 극히 감소된 침입 비율을 보였다.
Alexa fluor-공액된 아주린은 UISOMel-2와 MCF-7 암세포에 효율적으로 침입하지만 정상 유방 MCF 10A1 세포에는 침투하지 못하였다. 하지만, Alexa fluor-공액된 루스티시아닌은 UISO-Mel-2와 MCF-7 암세포의 세포질에서뿐만 아니라 정상 MCF 10A1 세포에도 침입하였다. 루스티시아닌이 세포질 내에 균등하게 분포하는 암세포에서와 달리, MCF10A1 세포에서는 대부분의 루스티시아닌이 핵 주변의 핵막 간극(perinuclear space)에 격리되었다.
실시예 7 Wt 아주린-매개된 세포독성과 성장 저해
다양한 세포에서 wt-아주린의 침입 특이성을 평가하기 더욱 평가하기 위하여, 37℃에서 30분과 3.5시간 배양 동안 J774, UISO-Mel-2, 정상 섬유아세포 세포에서 Alexa fluor-공액된 wt-아주린의 침입을 측정하였다. wt-아주린은 30분 내에 J774와 UISO-Mel-2 세포에 급속하게 침입하는 것으로 관찰되었다; 이 기간 동안 섬유아세포의 세포질 내에서 wt-아주린은 거의 관찰되지 않았다. 3.5 시간의 배양이후, 극히 소량의 wt-아주린이 이들 섬유아세포 내에서 관찰되었다.
Yamada, T., et al. Infect. Immun. 70:7054-62 (2002), Goto, M., et al. Mol. Microbiol 47:549-59 (2003) 및 2003년 11월 24일자로 제출된 동시-계류중인 U.S. 특허 출원 10/720,603에 기술된 바와 같이 wt-아주린의 세포독성의 측정을 위하여 3(4,5-디메틸티아졸-2-일-2,5-테트라졸리움 브롬화물)(MTT) 검사를 수행하였다. 도 1(b)에서는 현저한 wt-아주린-매개된 세포독성이 24시간 배양 동안 J774과 UISO-Mel-2 세포에서만 관찰된다는 것을 보여준다.
M44KM64E 변이체 아주린은 J774 세포에서 아폽토시스(apoptosis)-유도 활성을 거의 나타내지 않지만 1 ㎎/㎖ 농도에서 G1에서 S 단계로의 세포 주기 진행을 현저하게(대략 95%) 저해하였다. 세포 주기 진행은 Hiraoka, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101:6427-32 (2004)와 Yamada, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA101:4770-75 (2004)에 기술된 바와 같이 유세포분석법으로 분석하였다. 도 1(a)에서는 이들 섬유아세포를 500 ㎍/㎖ 또는 1 ㎎/㎖의 M44KM64E 변이체 아주린으로 처리하는 경우에, 세포 주기 진행의 저해 정도가 대략 20%임을 보여준다.
실시예 8 Wt-아주린의 섬유아세포와 MCF-10F 세포로의 미세 주입
Wt-아주린은 Punj, V., et al., Oncogene 23:2367-78 (2004)에 기술된 방법을 이용하여 섬유아세포와 MCF-10F 세포 내에 미세주입하였다. 세포는 핵 DNA 응축(condensation)과 단편화(fragmentation)를 유발하는 아폽토시스의 유도를 조사하였다. 현저한 핵 DNA(DAPI로 푸른색으로 표지됨) 응축과 단편화는 wt-아주린과 함께 5시간 배양이후 미세주입된 단일 세포에서 관찰되지만 아주린과 함께 30분 배양 동안에는 관찰되지 않았다.
실시예 9 37℃에서 Wt-아주린 융합 유도체의 내재화
N-과 C-말단 모두에서 절두된 wt-아주린의 일련의 GST 융합체는 실시예 1(도 2(a)와 2(b))에서처럼 제조하고 정제하였다. Alexa fluor 568 공액된 wt-아주린, GST와 GST-azu 융합 유도체를 이용하여, 실시예 5에 기술된 방법에 따라 1시간 배양 동안 37℃에서 J774 세포에 내재화를 조사하였다. 핵은 DAPI로 푸른색으로 염색하였다.
wt-아주린은 내재화되는 반면, GST는 세포의 주변에 잔존하고 내재화되지 않았다. GST-azu 36-128과 GST-azu 36-89는 내재화되고, GST-azu 36-77 역시 내재화되었다. 하지만, 추가적인 절두에서, GST-azu 50-77은 내재화되는 반면, GST-azu 36-50은 내재화는 매우 비효율적이고 표면상에 덩어리를 형성하는 것으로 확인되었다.
실시예 10 - 4℃에서 아주린 융합 유도체의 내재화
4℃에서 배양된 J774 세포에서 wt-아주린과 GST-azu 유합 유도체의 내재화를 조사하였다. 4℃에서, 1시간 배양 동안 J774 세포 내로 wt-아주린의 내재화는 심각하게 손상되었다. GST-azu 36-128과 GST-azu 36-89에서도 유사한 손상이 관찰되었다. 더욱 짧은 GST-azu 36-77, GST-azu 50-77, GST-azu 50-66, GST-azu 67-77은 4℃에서 내재화의 심각한 손상을 나타냈다.
실시예 11 - J774와 흑색종 UISO-MeI-2 세포에서 GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질의 에너지-의존성 내재화
GST는 GFP와 융합하여 GST-GFP 융합 유도체를 만들었다. 부가적으로, azu 50-77을 GST-GFP(Mr 53 kDa) 융합 단백질에 융합시켰다(도 3(a)). 정제된 GST, GST-GFP, GST-GFP-azu 50-77 융합 유도체의 이동성(mobility)을 SDS-PAGE 상에서 조사하였다(도 3(b)). 검출은 쿠마시에 블루 염색(Coomassie Blue staining) 및 항-아주린 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅으로 수행하였다(도 3(c)).
다양한 농도의 GST-GFP로 처리된 J774 세포의 유세포 분석 측정은 상기 단백질이 J774 세포에 결합한다는 것을 입증하였다. 증가하는 농도의 GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질로 처리된 J774 세포의 유세포 분석 분리는 GST-GFP 단독에서보다 현저하게 감소된 형광을 입증하였다(도 4). 포유동물 세포에서 GFP의 내재화는 형광의 상실을 유발하는 것으로 알려져 있다. 형광의 이러한 감소는 J774 세포가 200 ㎍/㎖의 GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질로 처리되고 37℃에서 증가하는 기간 동안 배양되는 경우에도 명확하게 관찰된다.
GST-GFP와 GST-GFP-azu 50-77의 결합과 내재화 프로필에서 임의의 차이가 존 재하는 지를 결정하기 위하여, J774와 UISO-Mel-2 세포 둘 모두 37℃와 4℃에서 GST-GFP 및 GST-GFP-azu 50-77과 함께 배양하였다. 녹색 형광은 공초점 검경을 이용하여 위치를 확인하였다. J774 세포 내에서, GST-GFP 융합 단백질은 표면에 결합하고 37℃와 4℃ 모두에서 내재화되지 않았다. 대조적으로, GST-GFP-azu 50-77은 37℃에서 내재화되지만 4℃에서는 내재화되지 않는 것으로 밝혀졌다. UISO-Mel-2 세포 내에서, GST-GFP 융합 단백질은 37℃와 4℃ 모두에서 표면상에 유지되었다. 대조적으로, J774 세포에서와 유사하게, GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질은 37℃에서 내재화되지만 4℃에서는 내재화되지 않는 것으로 밝혀졌다.
실시예 12 세포막 침투와 식작용 기전에 의한 포유동물 세포로의 Wt-아주린 침입
wt-아주린 침입이 수용체-매개된 식균 작용(endocytosis)에 순전히 의존한다면, 이는 에너지 발생의 미토콘드리아 짝풀림물질(uncoupler), 프로토노포어 카르보닐 시아나이드 m-클로로피르닐하이드라존(protonophore carbonyl cyanide m-chlorophrnylhydrazone)(CCCP)에 의해, 또는 이들 수용체를 차단하는 표지되지 않은 아주린 또는 다른 쿠프레독신과의 사전배양에 의해 차단될 수 있을 것이다. J774와 UISO-MeI-2 세포는 4℃에서 2시간 동안 10배 초과 농도에서 쿠프레독신과 함께 배양하고, 이들 세포는 완전하게 세척하여 쿠프레독신을 제거하고 37℃에서 1시간동안 Alexa fluor 568-공액된 아주린과 함께 배양하였다. 쿠프레독신으로 처리되지 않은 세포에서 만큼의 내재된 아주린이 존재하였다. 세포 미세섬유 네트워크를 파괴하는 수용체-매개된 식균 작용의 공지된 저해물질인 사이토칼라 신(cytochalasin) D(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo 63195) 및 골지체(Golgi apparatus)를 파괴하고 고전적인 소포-매개된 분비를 저해하는 것으로 알려져 있는 Brefeldin A(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo 63195)의 효과 역시 조사하였다. 20 pM 농도에서 CCCP는 0.25 to 0.5 pM 사이토칼라신 D에서처럼 UISO-MeI-2 세포 내에 아주린의 흡수를 현저하게 감소시켰다. 다른 한편, Brefeldin A는 별다른 효과를 나타내지 않았다.
실시예 13 - GST-PEDIII-azu 50-77 융합 유도체의 UISO-Mel-2 세포로의 침입
녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 도메인 III(PEDIII)의 GST-융합체는 Hwang, J. et al., Cell 48:129-36 (1987); Reiter, Y. and Pastan, I., Trends Biotechnol. 16:513-20 (1998)에 기술된 바와 같이 작제하였다. 상기 GST-PEDIII 융합 유도체는 외독소 A의 아미노산 381-613을 포함하였다. PEDIII은 ADP-리보실 이전효소 활성을 보유하고 진핵 신장 인자(elongation factor) 2를 저해함으로써 진핵 세포 내에서 세포 단백질 합성을 저해하는 것으로 알려져 있다.
GST-GFP-azu 50-77에서 기술된 바와 같이 PCR을 이용하여, azu 50-77 서열을 GST-PEDIII 융합 단백질의 카르복시 말단에 도입하였다(도 5(a)). 이들 2가지 융합 단백질(GSTPEDIII과 GST-PEDIII-azu 50-77)은 글루타티온-세파로스(glutathione-sepharose) 4B 칼럼 크로마토그래피에 의해 52와 54 kDa 단백질로서 정제되었다(도 5(b)). 이후, UISO-Mel-2와 정상 섬유아세포(FBT) 세포는 다양한 농도의 이들 단백질과 함께 37℃에서 24시간동안 배양하고, 세포 사멸의 정도는 실시예 7에 기술된 바와 같이 MTT 검사로 측정하였다.
GST-PEDIII은 낮은 세포독성을 나타내는 반면, GST-PEDIII-azu 50-77 융합 단백질은 UISO-Mel-2 세포 내로 효율적인 침입으로 인하여 높은 세포독성을 나타냈다(도 5(c)). 대조적으로, 이들 융합 단백질은 섬유아세포 세포에 대하여 낮은 수준의 세포독성을 나타냈다.
실시예 14 - wt-아주린 내에서 α-나선의 불안정화는 UISO-Mel-2 세포에서 이의 내재화에 별다른 영향을 주지 않는다.
α-나선이 아주린 침입에서 역할하는 지를 조사하기 위하여, 3개의 나선-불안정화 프롤린 잔기를 wt-아주린의 위치 54, 61, 70에 도입하고(도 6) 전장 A54PT61PK70P 변이체 아주린의 UISO-Mel-2 세포로의 침입을 조사하였다. 이들 위치에서 단일과 이중 돌연변이 역시 작제하고 침입을 조사하였다. A54PT61PK70P 변이체 아주린은 QuickChange 특정부위 돌연변이유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용한 아주린 유전자의 특정부위 돌연변이유발로 제조하였다.
이들 변이체는 37℃에서 1시간 동안 UISO-Mel-2 세포와 함께 200 ㎍/㎖로 배양하고, 이후 공초점 검경으로 형광 위치를 확인하였다. 모든 경우에, Alexa fluor 568-공액된 변이체 아주린은 UISO-Mel-2 세포를 침입하였다. 이와 유사하게, GST-GFP-azu 50-77융합 단백질 및 이의 삼중 A54PT61PK70P azu 돌연변이 변이체에서 UISO-Mel-2 세포로의 침입을 조사하는 경우에, 현저한 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 15 - GST-PEDIII-루스티시아닌 융합 유도체의 UISO-Mel-2 세포로의 침입
녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 도메인 III(PEDIII)의 GST-융합체 는 실시예 13에 기술된 바와 같이 작제하였다. GST-GFP-azu 50-77에서 기술된 바와 같이 PCR을 이용하여, 전장 루스티시아닌 서열을 GST-PEDIII 융합 단백질의 카르복시 말단에 도입하였다. 상기 융합 단백질은 글루타티온-세파로스 4B 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 이후, UISO-Mel-2와 FBT 세포는 다양한 농도의 상기 융합 단백질과 함께 37℃에서 24시간동안 배양하고, 세포 사멸의 정도는 실시예 7에 기술된 바와 같이 MTT 검사로 측정하였다.
GST-PEDIII-루스티시아닌 융합 단백질은 UISO-Mel-2 세포에 대하여 높은 세포독성을 나타냈다(도 7). 대조적으로, 상기 융합 단백질은 FBT 세포에 대하여 낮은 수준의 세포독성만을 나타냈다.
실시예 16 J774 세포로의 침입을 위한 아주린과 GST-Azu 55-77의 경쟁
7 Alexa fluor- conjugated GST-azu 50-77의 존재하에 37℃에서 표지되지 않은 아주린으로 경쟁 실험을 수행하였다. J774 세포는 GST-azu 50-77 침입을 결정하기에 앞서, Alexa fluor-공액된 아주린 없이; Alexa fluor-공액된 GST-azu 50-77(7 )과 함께; 7, 14, 56 의 표지되지 않은 아주린의 존재하에 Alexa fluor-공액된 GST-azu 50-77(7 )과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이의 결과는 표지된 7 GST-azu 50-77 단독에 비하여, 증가하는 양의 표지되지 않은 아주린(7, 14, 56 )의 존재가 표지된 7 GST-azu 50-77의 침입과 더욱 경쟁한다는 것을 명백하게 증명하였다. 대조적으로, 유사한 농도(6, 12, 48 )의 표지되지 않은 루스티시아닌이 표지된 GST-azu 50-77의 존재하에 이용되는 경우에, GST-azu 50-77의 침입에 대한 효과는 거의 관찰되지 않았다.
실시예 17 아주린 단백질 형질도입 도메인(PTD)과 다른 쿠프레독신의 서열과 구조 비교
azu 50-77 영역 내에서 아주린과 루스티시아닌 사이에 서열 동일성은 20% 이하인데, 이는 여러 다른 쿠프레독신에서도 동일하다(De Rienzo et al., Protein Science 9:1439-1454, 2000; Murphy et al., J. Mol. Biol. 315:859-871, 2002). 아주린과 쿠프레독신 집단의 여러 구성원 사이에 VAST 알고리즘(Gibrat et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 6:377-385, 1996)을 이용한 구조 분석 결과는 azu 50-77 영역 및 내열성 녹색 광합성 세균(thermophilic green photosynthetic bacterium) 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(C. aurantiacus)로부터 쿠프레독신, 쿠프레독신 아우라시아닌 B 사이에 현저한 동일성을 입증하였다(Bond et al., J. Mol. Biol. 306:47-67, 2001). 쿠프레독신 집단의 다른 구성원은 아주린의 다른 영역과 구조적 유사성을 나타내긴 하지만, 아주린 PTD, 아미노산 50-77과 현저한 동일성이 부재하였다(도 8(a)). 실제로, 단백질 데이터베이스에 구조가 기탁된 다른 단백질과 비교하여, azu PTD와 다른 단백질 사이에 구조적 유사성은 거의 존재하지 않았다. 녹농균(P. aeruginosa) PTD 영역 내에 잔기와 병원균으로부터 다른 박테리아 아주린의 공지된 서열의 복수 아미노산 서열 정렬은 CLUSTAL X 정렬 프로그램(Higgins and Sharp, id. 1988)을 이용하여 수행하였다. 식물병원성(phytopathogenic) 슈도모나스 시린가(P. syringae) 아주린이 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 PTD 영역과 높은 동일성을 나타내긴 하지만, 수막염균(Neisseria meningitidis)으로부터 아주린-유사 단백질(Gotschlich and Seiff, FEMS Microbiol. Lett. 43:253-255 (1987) Kawula et al., Mol. Microbiol. 1:179-185 (1987) Cannon, Clin. Microbiol. Rev. 2:S1-S4 (1989)) 역시 녹농균(P. aeruginosa) 아주린의 PTD 도메인과 현저한 동일성을 나타내고, 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)와 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)로부터 아주린 역시 그러하였다(도 8(b)). 이들 모든 아주린에서 보조된 모티프 서열 D-G-X-X-X-X-X-D-X-X-Y-X-K-X-X-D(SEQ ID NO: 35)이 발견되었다.
실시예 18 수막염균( N. meningitidis ) Laz(H8-아주린)은 뇌종양 세포주 LH229에서 세포 사멸을 유도한다
수막염균(Neisseria meningitidis)(Nm)은 혈류에 살포되고, 아마도 뇌 내피 세포를 통한 경세포 경로(transcellular route)로 혈관 뇌 장벽을 관통하며, 수막(meninges)에 침입함으로써 뇌척수막염(cerebrospinal meningitis)을 유발한다. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)과 수막염균(Neisseria meningitidis)으로부터 아주린은 유사한 구조와 높은 아미노산 서열 상동성(>50%)을 갖는다. 이에 더하여, 수막염균(N. meningitidis) 아주린은 더욱 긴 폴리펩티드, Laz(SEQ ID NO: 30)의 일부인데, 이는 수막염균(N. meningitidis)의 외부 막에 존재하는 H.8이라고 하는 표면 펩티드를 N-말단에 보유한다(Cannon, J.G., Clin. Microbiol. Rev. vol. 2, pp. 51-54 (1989)). 표면-노출된 H8 항원성 에피토프는 또한, 지질화(lipidation)를 위한 신호를 보유한다. 완전 수막염균(N. meningitidis) H8 외부 막 단백질은 수막염균(N. meningitidis) 세포의 외부 표면상에 존속한다.
임균(Neisseria gonorrhoeae) Laz 단백질은 수막염균(N. meningitidis) Laz 단백질과 매우 유사하다. 임균(N. gonorrhoeae) laz 유전자는 대장균(E. coli) 내로 클론하고, 이후 대장균(E. coli) 내에서 상기 laz 유전자를 과다-발현시켜 Laz 단백질을 생산하였다(도 13). 뇌종양 세포주 LH229에서 세포 사멸을 유도하는 정제된 녹농균(P. aeruginosa) 아주린과 정제된 임균(N. gonorrhoeae) Laz 단백질의 능력은 MTT 검사로 측정하였다(Yamada, T., et al., Cell Cycle vol. 3, pp. 1182-1187 (2004)).
대장균(E. coli) 내에서 발현된 녹농균(P. aeruginosa) 아주린은 주변세포질(periplasm)에 존재하는 반면, 대장균(E. coli) 내에서 발현된 Laz 단백질은 대장균(E. coli)의 외부 막에서 발견되었다. 부가적으로, 아주린은 24시간 이내에 뇌종양 세포에 대하여 매우 낮은 세포독성을 나타내는 반면, Laz는 높은 세포독성을 나타내고 24시간 이내에 뇌종양 세포의 90%를 사멸시켰다(도 3). 아주린은 48시간 이후에 증가하는 세포독성을 나타냈다(표 4). 이 실험은 녹농균(P. aeruginosa) 아주린과 임균(N. gonorrhoeae) H8-아주린(Laz, SEQ ID NO: 36)이 시험관내와 생체내에서 뇌종양을 진단 및/또는 치료하는데 유용하다는 것을 암시한다.
Laz가 생체내에서 뇌종양 성장을 감소시키면, 상기 단백질의 전부 또는 일부는 진단이나 치료 목적으로, 형광이나 방사성 표식(tag) 또는 종양-사멸 약제/독소를 비롯한 적하 분자를 뇌, 특히, 뇌종양 세포로 수송하는 본 발명의 “쿠프레독신 침입 도메인”으로서 이용될 수 있을 것이다.
24시간 배양이후 뇌종양 세포주 LH229에 대한 녹농균(P. aeruginosa) 아주린과 임균(N. gonorrhoeae) Laz의 세포독성.
단백질 Conc. 세포독성(%) STDEV
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 0 0.00 0.00
임균(N. gonorrhoeae) Laz 0 0.00 0.00
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 25 5.86 2.45
임균(N. gonorrhoeae) Laz 25 18.80 1.26
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 50 5.48 2.43
임균(N. gonorrhoeae) Laz 50 23.59 1.57
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 100 6.00 4.13
임균(N. gonorrhoeae) Laz 100 41.02 1.49
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 200 8.27 4.79
임균(N. gonorrhoeae) Laz 200 78.99 2.06
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 400 7.25 3.69
임균(N. gonorrhoeae) Laz 400 94.69 0.87
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 800 13.22 7.67
임균(N. gonorrhoeae) Laz 800 98.36 0.62
48시간 배양이후 뇌종양 세포주 LH229에 대한 녹농균(P. aeruginosa) 아주린과 임균(N. gonorrhoeae) Laz의 세포독성.
단백질 Conc. (/㎖) 세포독성(%) STDEV
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 0 0.00 0.00
임균(N. gonorrhoeae) Laz 0 0.00 0.00
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 25 11.65 1.07
임균(N. gonorrhoeae) Laz 25 20.04 4.25
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 50 8.55 2.51
임균(N. gonorrhoeae) Laz 50 25.52 1.80
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 100 16.19 2.60
임균(N. gonorrhoeae) Laz 100 39.72 0.92
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 200 16.30 1.91
임균(N. gonorrhoeae) Laz 200 87.01 1.21
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 400 61.96 19.15
임균(N. gonorrhoeae) Laz 400 98.75 0.96
녹농균(P. aeruginosa) 아주린 800 82.71 5.91
임균(N. gonorrhoeae) Laz 800 99.93 0.12
실시예 19 뇌종양 세포에 대한 임균( N. gonorrhoeae ) Laz 단백질의 세포독성
녹농균(P. aeruginosa) 아주린, 임균(N. gonorrhoeae) Laz(SEQ ID NO:36), 융합 단백질을 비롯한 단백질 구조체를 인코딩하는 여러 플라스미드를 작제하고, 이들 단백질은 뇌종양 세포주와 함께 MTT 검사법으로 조사하였다. 조사되는 단백질 구조체는 임균(N. gonorrhoeae) Laz H.8 영역 단독, 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 단독, 임균(N. gonorrhoeae) 아주린 단독, 도 10에 도시된 구조체 등이다. 이들 단백질 구조체를 인코딩하는 플라스미드는 대장균(E. coli) 또는 다른 적절한 발현 시스템 내로 형질전환시키고, 이들 단백질 구조체는 발현시키고, 생성된 단백질은 정제한다. 뇌종양 세포주는 NL229와 CCF-STTG1이다.
이 실험의 결과는 이러한 단백질 구조체가 뇌종양 세포에 세포독성을 나타내려면 Laz 유전자의 H.8 영역 및/또는 아주린이 요구된다는 것을 암시한다. 이 실험의 결과는 H.8 영역이 부착된 아주린을 뇌 암세포로 수송함으로써, 뇌 암세포에 세포독성을 나타내도록 쿠프레독신을 적응시킬 수 있음을 암시한다. 따라서, H.8은 적하 분자를 뇌 암세포로 수송하는 수송 도메인(transport domain)으로서 이용될 수 있다. 유용한 적하에는 당분야에 공지되고 본 명세서에 언급된 암 치료제와 진단제가 포함된다.
실시예 20 - 암으로 고생하는 환자의 치료
암 환자에서 쿠프레독신 침입 도메인-외독소 A 도메인 III 융합체(연구 약제)의 임상 I/II기 시험이 수행된다. 구체적으로, 쿠프레독신 침입 도메인은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 50-67 아미노산 영역이고, 적하는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 외독소 A 도메인이고, 따라서 융합 단백질 “PEDIII-azu 50-67”이 산출된다. 상기 융합 단백질은 실시예 13에 예시된 바와 같이 작제된다.
현재 가용한 FDA-승인된 화학 치료제와 섭생에 의한 치료이후 임상적/방사선사진적 진행이나 재발을 보이고 유방암, 결장암, 흑색종이 조직학적으로 확인된 49명의 성인 환자가 연구 약제를 투여하는 개방 전향적 연구(open-label prospective study)에 참가한다. 본 연구에 참가하는 모든 환자는 화학치료 섭생의 승인된 과정의 완결이후, 측정가능 종양의 양이 증가한다. 지속적인 전이성 종양(metastatic deposit) 및/또는 크기 도는 양에서 지속적인 증가의 증거가 조직학적으로 확증되어야 한다. 이런 조직학적 증거는 미세 침 흡인(fine needle aspiration, FNA) 생검으로 획득될 수 있다.
치료 프로그램은 the Institutional Review Board of the University of Illinois, Chicago와 the FDA에 따라 모든 환자로부터 서면 동의를 받은 이후에 실시된다. 이들 환자는 다른 악성 종양, 이전 악성 종양의 병력, 혈액이온화증(blood dyscrasias), 인슐린 의존성 당뇨, 또는 제안된 치료의 효과의 적절한 평가를 간섭하는 다른 심각한 심혈관 질환과 같은 병발성 질환(intercurrent illness)이 없다. 치료의 시작에 앞서, 간 기능 연구(LFT)를 비롯한 기준 혈액 작업(baseline blood work)(일반 혈액 검사(Complete Blood Count)[CBC]와 혈액 화학 검사(Serum Chemistry))이 수행된다. 모든 유자격 환자는 임상 시험 동안 임의의 암 치료제를 동시에 복용하지 않아야 한다.
연구 약제는 12주 동안 연구 약제의 제약학적으로 허용되는 제제의 매일 정맥내 주사로 투여되고, 개체는 용량 제한 독성(dose limiting toxicity)이 관찰된다. 10 ㎎/㎏/day에서 시작하여 50 ㎎/㎏/day의 최대량까지 5 ㎎/㎏/day씩 증가하는 7가지 용량 수준이 존재한다. 각 용량 수준의 효능은 진전된 측정가능 암(유방, 결장, 흑색종)을 갖는 7명의 환자에서 기록된다.
반응은 2가지 치수(a와 b)에서 측정가능 종양을 측정함으로써 평가된다. 1) 표적 전이성 종양의 완전 소멸은 완전 반응(CR)로서 간주된다; 2) 75% 감소는 우수한 부분 반응(PR)으로 간주된다; 3) 우수한 반응(PR)은 크기에서 치료이후 50% 감소이다. 4) 크기에서 25% 감소는 불변(stable disease, SD)으로 간주되고, 5) < 25%는 무반응(no response, NR)으로 간주된다. 질병이 진행된 환자는 치료를 중단하고 추가로 12주 동안 추적한다.
완전 소멸 및 표적 전이성 종양의 크기 감소는 아주린 치료가 암 치료에 유효하다는 것을 암시한다. 아주린 치료가 유효하다는 다른 표시는 새로운 전이성 종양의 발생률 감소 및 종양과 연관된 혈관신생(angiogenesis)의 감소이다.
본 발명의 범위와 기술적 사상을 벗어나지 않는, 앞서 기술된 실시예와 시스템의 다양한 개변은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정 구체예와 관련하여 기술되긴 했지만, 본 발명은 이들 특정 구체예에 부당하게 한정되지 않는다. 실제로, 관련 분야의 당업자에게 명백한, 본 발명을 수행하기 위한 기술된 양식의 다양한 변형은 아래의 특허청구범위의 범위 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Chakrabarty, Ananda Das Gupta, Tapas Yamada, Tohru Fialho, Arsenio <120> Cupredoxin Derived Transport Agents and Methods of Use Thereof <130> 51282-00009 <140> 11/244,105 <141> 2005-10-06 <150> 60/616,782 <151> 2004-10-07 <150> 60/680,500 <151> 2005-05-13 <150> 60/700,297 <151> 2005-07-19 <160> 48 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1 Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn 1 5 10 15 Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn 20 25 30 Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met 50 55 60 Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys 100 105 110 Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys 115 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<212> PRT <213> Vibrio parahaemolyticus <400> 31 Met Ser Leu Arg Ile Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ser 1 5 10 15 Phe Gly Ala Gln Ala Ser Ala Glu Cys Glu Val Ser Ile Asp Ala Asn 20 25 30 Asp Met Met Gln Phe Ser Thr Lys Thr Leu Ser Val Pro Ala Thr Cys 35 40 45 Lys Glu Val Thr Leu Thr Leu Asn His Thr Gly Lys Met Pro Ala Gln 50 55 60 Ser Met Gly His Asn Val Val Ile Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala 65 70 75 80 Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys 85 90 95 Pro Asp Asp Glu Arg Val Tyr Ala His Thr Lys Val Val Gly Gly Gly 100 105 110 Glu Ser Thr Ser Ile Thr Phe Ser Thr Glu Lys Met Thr Ala Gly Gly 115 120 125 Asp Tyr Ser Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Ile Met Gln 130 135 140 Gly Lys Phe Glu Phe Lys 145 150 <210> 32 <211> 129 <212> PRT <213> Bordetella bronchiseptica <400> 32 Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp 1 5 10 15 Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn 20 25 30 Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile 50 55 60 Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val 65 70 75 80 Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys 100 105 110 Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val 115 120 125 Asp <210> 33 <211> 162 <212> PRT <213> Chloroflexus aurantiacus <400> 33 Met Lys Ile Thr Leu Arg Met Met Val Leu Ala Val Leu Thr Ala Met 1 5 10 15 Ala Met Val Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Val Thr Ile Glu Ile Gly Ser 35 40 45 Lys Gly Glu Glu Leu Ala Phe Asp Lys Thr Glu Leu Thr Val Ser Ala 50 55 60 Gly Gln Thr Val Thr Ile Arg Phe Lys Asn Asn Ser Ala Val Gln Gln 65 70 75 80 His Asn Trp Ile Leu Val Lys Gly Gly Glu Ala Glu Ala Ala Asn Ile 85 90 95 Ala Asn Ala Gly Leu Ser Ala Gly Pro Ala Ala Asn Tyr Leu Pro Ala 100 105 110 Asp Lys Ser Asn Ile Ile Ala Glu Ser Pro Leu Ala Asn Gly Asn Glu 115 120 125 Thr Val Glu Val Thr Phe Thr Ala Pro Ala Ala Gly Thr Tyr Leu Tyr 130 135 140 Ile Cys Thr Val Pro Gly His Tyr Pro Leu Met Gln Gly Lys Leu Val 145 150 155 160 Val Asn <210> 34 <211> 140 <212> PRT <213> Chloroflexus aurantiacus <400> 34 Ala Ala Asn Ala Pro Gly Gly Ser Asn Val Val Asn Glu Thr Pro Ala 1 5 10 15 Gln Thr Val Glu Val Arg Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Phe Ala Gln 20 25 30 Thr Ser Leu Ser Leu Pro Ala Asn Thr Val Val Arg Leu Asp Phe Val 35 40 45 Asn Gln Asn Asn Leu Gly Val Gln His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly 50 55 60 Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala 65 70 75 80 Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp Thr Pro Asn Ala Leu Ala Trp 85 90 95 Thr Ala Met Leu Asn Ala Gly Glu Ser Gly Ser Val Thr Phe Arg Thr 100 105 110 Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Phe Pro Gly His Tyr 115 120 125 Leu Ala Gly Met Lys Gly Thr Leu Thr Val Thr Pro 130 135 140 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> conserved sequence of cupredoxin entry domain <220> <221> misc_feature <222> (3)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 35 Asp Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Tyr Xaa Lys Xaa Xaa Asp 1 5 10 15 <210> 36 <211> 183 <212> PRT <213> Neisseris gonorrhoeae <400> 36 Met Lys Ala Tyr Leu Ala Leu Ile Ser Ala Ala Val Ile Gly Leu Ala 1 5 10 15 Ala Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala 20 25 30 Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala 35 40 45 Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu 50 55 60 Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys 65 70 75 80 Ala Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro 85 90 95 Lys Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val Ile Ala Lys Ala Glu Asp Met 100 105 110 Asp Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val 115 120 125 Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly 130 135 140 Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly 145 150 155 160 Asp Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn 165 170 175 Gly Lys Val Thr Leu Val Asp 180 <210> 37 <211> 18 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 37 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly <210> 38 <211> 33 <212> PRT <213> Chloroflexus aurantiacus <400> 38 His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val 1 5 10 15 Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro 20 25 30 Asp <210> 39 <211> 28 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 39 Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp 20 25 <210> 40 <211> 27 <212> PRT <213> Nesseria meningtitidis <400> 40 Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly 1 5 10 15 Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 41 <211> 21 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 41 Glu Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly 1 5 10 15 Leu Asp Lys Asp Tyr 20 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 42 Glu Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser 1 5 10 15 <210> 43 <211> 129 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 43 Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp 1 5 10 15 Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn 20 25 30 Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile 50 55 60 Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val 65 70 75 80 Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys 100 105 110 Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val 115 120 125 Asp <210> 44 <211> 27 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 44 Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser 1 5 10 15 Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 45 <211> 27 <212> PRT <213> Pseudomonas syringae <400> 45 Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala Ile Thr Thr Asp Gly Met Ser Val 1 5 10 15 Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 46 <211> 27 <212> PRT <213> Vibrio parahaemolyticus <400> 46 Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala 1 5 10 15 Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 47 <211> 27 <212> PRT <213> Bordetella bronchiseptica <400> 47 Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala 1 5 10 15 Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp 20 25 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> conserved sequence of cupredoxin entry domain <220> <221> misc_feature <222> (3)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 48 Asp Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Tyr Xaa Lys Xaa Xaa Asp 1 5 10 15

Claims (36)

  1. 전장보다 작은 야생형 쿠프레독신(cupredoxin) 또는 H.8 외부 막 단백질에 적어도 90% 아미노산 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 서열로 구성되고, 연계된 분자의 포유동물 암세포로의 침입을 조장하는 펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, 쿠프레독신은 아주린(azurin), 플라스토시아닌(plastocyanin), 루스티시아닌(rusticyanin), 슈도아주린(pseudoazurin), 아우라시아닌(auracyanin), 아주린-유사 단백질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  3. 제 1항에 있어서, 펩티드는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum), 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans), 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes), 슈도모나스 시린가(Pseudomonas syringae), 수막염균(Neisseria meningitidis), 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 백일해균(Bordetella pertussis), 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus), 임균(Neisseria gonorrhoeae)에서 선택되는 미생물로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  4. 제 1항에 있어서, 쿠프레독신은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 43에서 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  5. 제 1항에 있어서, 적어도 10개의 잔기 내지 50개 이하의 잔기를 보유하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  6. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48에서 선택되는 서열에 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  7. 제 6항에 있어서, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  8. 제 6항에 있어서, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48에서 선택되는 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  9. 제 1항에 있어서, 아래의 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드:
    DGXXXXXDXXYXKXXD와 DGXXXXDXXYXKXXD;
    여기서 D는 아스파라긴산이고, G는 글리신이고, Y는 티로신이고, K는 리신이고, X는 임의의 아미노산이다.
  10. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 50-77 아미노산 영역에 현저한 구조적 상동성을 갖고, 연계된 분자의 포유동물 암세포로의 침입을 조장하는 펩티드.
  11. 적하 화합물(cargo compound)과 펩티드를 포함하는 복합체에 있어서, 상기 펩티드는 쿠프레독신 또는 이의 단편과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 상기 펩티드 또는 이의 단편은 적하 화합물에 연결되고, 상기 펩티드는 적하 화합물의 포유동물 암세포로의 침입을 조장하는 것을 특징으로 하는 복합체.
  12. 제 11항에 있어서, 펩티드는 제 1항의 펩티드인 것을 특징으로 하는 복합체.
  13. 제 11항에 있어서, 적하 화합물은 단백질, 지단백, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류, 핵산, 염료, 미립자, 나노입자, 독소, 약제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
  14. 제 13항에 있어서, 적하 화합물은 단백질과 폴리펩티드에서 선택되고, 펩티드는 적하 화합물에 연결되어 융합 단백질을 형성하는 것을 특징으로 하는 복합체.
  15. 제 11항에 있어서, 적하 화합물은 독소인 것을 특징으로 하는 복합체.
  16. 제 15항에 있어서, 독소는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 복합체.
  17. 제 11항에 있어서, 적하 화합물은 검출가능 물질인 것을 특징으로 하는 복합체.
  18. 제 17항에 있어서, 검출가능 물질은 형광분석법, 검경, X-레이 CT, MRI, 초음파에서 선택되는 방법으로 검출되는 것을 특징으로 하는 복합체.
  19. 제 11항의 복합체 및 제약학적으로 적합한 담체를 함유하는 제약학적 조성물.
  20. 제 11항의 복합체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 세포는 암 환자로부터 유래되고, 이들 세포를 상기 환자 내로 재도입하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 세포는 골육종 세포, 폐암종 세포, 결장암종 세포, 림프종 세포, 백혈병 세포, 연조직 육종 세포, 유방암종 세포, 간암종 세포, 방광암종 세포, 흑색종 세포, 뇌종양 세포, 전립선암종 세포에서 선택되는 암세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 암 환자를 치료하는 방법에 있어서, 제 11항의 복합체를 치료 효과량으로 상기 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 복합체는 정맥내, 국소, 피하, 근육내, 종양내(intratumor)에서 선택되는 방식으로 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 복합체는 다른 암 치료제와 공동-투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  27. 환자에서 암을 화상 진찰(imaging)하는 방법에 있어서, 제 17항의 복합체를 상기 환자에 투여하고, 적하 화합물의 위치를 검출하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 적하 화합물은 X-레이 조영제(contrast agent)이고, 적하 화합물의 위치는 X-레이 CT에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 적하 화합물은 자기 공명 영상 조영제이고, 적하 화합물의 위치는 MRI에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  30. 제 27항에 있어서, 적하 화합물은 초음파 조영제이고, 적하 화합물의 위치는 초음파 영상(ultrasound imaging)에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  31. 암을 진단하는 방법에 있어서, 세포를 제 17항의 복합체와 접촉시키고, 적하 분자(cargo molecule)의 위치를 검출하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  32. 제 11항의 복합체를 함유하는 반응물을 포함하는 키트.
  33. 제 32항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 어쥬번트 또는 부형제를 함유하는 반응물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  34. 제 32항에 있어서, 반응물의 투여를 위한 운반제(vehicle)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  35. 제 1항에 있어서, 혈류 내에서 펩티드의 반감기를 연장하거나 최적화하기 위하여 펩티드 구조가 변형되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  36. 제 1항 또는 10항의 폴리펩티드, 또는 제 14항의 복합체를 인코딩하는 핵산 분자.
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