CN101684472A - 包含p53基因的重组融合蛋白和重组体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种融合基因，其包含GnRH基因序列和p53基因序列，以及任选的介于GnRH基因序列与p53基因序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的基因序列。本发明还涉及一种重组融合蛋白，和所述融合基因的表达型重组体、由其获得的工程菌，以及所述表达型重组体和融合蛋白的制药用途。根据本发明可以有效地提高p53的抗肿瘤作用。

Description

包含p53基因的重组融合蛋白和重组体及其用途

技术领域

本发明涉及GnRH-p53系列融合蛋白及其抗肿瘤用途，具体涉及包含p53基因的重组融合蛋白和重组体及其用途，更具体地说，本发明涉及利用基因工程技术表达人类肿瘤抑制基因p53与促性腺激素释放激素和氧依赖性蛋白降解结构域的融合蛋白以及所述融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

目前癌症仍然是严重威胁人类健康的疾病，其发病率和死亡率都很高，特别是腺癌更是临床上最难治疗的恶性肿瘤之一。尽管恶性肿瘤的早期诊断、手术与放化疗等方面的技术和手段近年来都有了长足的进步和发展，但是手术疗法仅限于早期治疗，而化疗和放疗严重的毒副作用往往使得肿瘤患者不能耐受从而限制了其使用剂量和长期应用，进而大大影响了治疗的效果。因此，研究高效低毒治疗肿瘤的方法，制备真正有效的抗肿瘤药物一直以来都是肿瘤治疗研究的目标。靶向性药物的研究是近年来研究的重点。这类靶向性药物可以消除放疗和化疗在杀伤肿瘤细胞的同时也大量杀伤正常细胞的缺点，特异性地针对肿瘤细胞进行杀伤。这类药物主要应用靶向分子(包括肿瘤细胞表面过量表达的受体的配体或单克隆抗体等)可以进入体内特异性地到达肿瘤部位，而与该靶向分子连接的效应蛋白或与其偶联的化疗药物可以在肿瘤部位杀伤肿瘤细胞，从而达到特异性治疗肿瘤的目的。

促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone，GnRH)，也称促黄体激素生成激素(LHRH)，是下丘脑分泌的十肽激素，其生理功能是调节垂体前叶促性腺激素的分泌。GnRH必须与高亲和力的跨膜受体结合才能发挥作用。这些跨膜受体属于七次跨膜受体G蛋白偶联受体家族。研究发现，除垂体外，在脑、卵巢、子宫内膜、乳腺、睾丸、前列腺、肾上腺、胰腺和肝脏、肺等肿瘤细胞上均有GnRH受体分布，特别是GnRHIII受体特异性分布于肿瘤细胞。试验证实，当GnRH及其类似物与肿瘤细胞上的GnRH受体结合后可以对肿瘤细胞的增殖发挥一定抑制作用。因此，应用GnRH为配体的靶向融合蛋白特异性杀伤肿瘤细胞，是抗癌靶向治疗的一大创新。

p53是细胞内重要的肿瘤抑制因子，它可以通过诱导肿瘤细胞凋亡和诱发肿瘤细胞发生细胞周期阻滞而产生抗肿瘤作用。p53基因激活时产生的蛋白质分子量为53000。研究表明人类50％以上的肿瘤的发生都与细胞内p53基因突变、缺失有关，因此p53一直是近年来抗肿瘤研究的热点。p53参与凋亡、细胞周期抑制、DNA损伤与修复及衰老等过程。p53蛋白通过诱导编码三个跨膜蛋白Fas、DR5和PERP，形成死亡诱导信号复合物激活caspases，导致凋亡发生，形成外部凋亡信号途径。p53基因突变的研究为p53基因治疗提供了基础，以p53功能为基础的肿瘤药物研究成为多年来的研究热点。例如：应用腺病毒载体进行p53基因治疗，在动物实验和临床研究中都取得了肯定性的抗肿瘤药效。但是使用载体的安全性、基因表达水平的调控及其对病人毒性作用等问题还没有完全解决。p53蛋白可进行原核表达制备，外源性补充野生型p53蛋白或其活性调节分子，可直接发挥它们的肿瘤抑制作用。此法避免了基因治疗的载体安全性问题，剂量可调，也同样能达到体内表达p53基因的抗肿瘤，增加放、化疗效果的目的。然而，p53发挥作用的部位在细胞内，如何将p53转导进入肿瘤细胞，以及如何避免其对正常细胞的毒性，相对延长它们在肿瘤细胞内的半衰期成为p53靶向性发挥其抗肿瘤作用的关键。

已有许多临床证据表明，在缺氧环境下肿瘤细胞发生一系列适应性变化，使肿瘤细胞对放疗、化疗耐受，而且使肿瘤细胞更具有侵袭性，容易发生远处转移。缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是细胞适应缺氧的重要转录因子，参与缺氧时相应靶基因的调控。HIF-1属于bHLH PAS蛋白族，由HIF-1α和HIF-1β各两个亚单位组成的杂四聚体蛋白。HIF-1α对氧的依赖性较强，当周围环境的氧浓度下降时，HIF-1α表达增加。常氧时HIF-1α蛋白容易降解，其半衰期小于5分钟，而缺氧可以增加HIF-1α蛋白的稳定性，HIF-1α蛋白的降解阻止。在研究HIF-1的降解调控时发现，HIF-1α的氧依赖性蛋白降解结构域(oxygen-dependent degradation domain，ODD)是HIF-1α稳定的重要元件，非缺氧状态时，HIF-1多聚羟化酶(HIF-1prolyhydroxylase，HIF PH)羟化ODD核心脯氨酸(Pro 564)，使得pVHL(von Hippel-Lindau tumor suppressor gene product)与HIF-1α亚基结合，进而多聚蛋白化HIF-1α，最终使其被蛋白酶降解，而在缺氧条件下，由于缺少氧原子(必需来自氧分子)使HIF PH失活，以上的反应过程被阻断。HIF-1α的ODD含有203个氨基酸残基，Harada等发现ODD的aa548-603可以发挥对其融合蛋白的降解调控作用。

如何有效地使p53靶向转导进入肿瘤细胞内，提高融合蛋白在肿瘤细胞内的稳定性以及相对延长融合蛋白在中瘤细胞内的作用时间，减小p53对正常细胞的杀伤作用，仍是本领域技术人员急待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一组包含p53基因的融合基因。本发明的另一目的是提供一组由所述融合基因表达的融合蛋白。本发明的其它目的包括提供包含所述融合基因的重组体和由本发明方法得到的融合蛋白以及所述重组体或融合蛋白在制药中的用途。

本发明人在研究中令人意外地发现，将GnRH与p53的基因融合以及由此表达所获得的融合蛋白，可以有效地提高p53的抗肿瘤作用；本发明人还发现，在上述融合基因中引入缺氧诱导因子基因序列以及由此表达所获得的融合蛋白，可以有效地抑制癌细胞的生长，为肿瘤的临床治疗提供了一种全新的有益方案。基于该发现，本发明人完成了本发明。

因此，本发明提供的各个方面和特征概述如下：

本发明第一方面提供一种融合基因，其包含促性腺激素释放激素(GnRH)基因序列和p53基因序列，以及任选的介于GnRH基因序列与p53基因序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的基因序列。

根据本发明第一方面的融合基因，其具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、和SEQ ID NO：7中所示的DNA序列。具体地说，本发明第一方面提供的是编码重组融合蛋白GnRH-p53、GnRH-ODD-p53、GnRHIII-p53、或GnRHIII-ODD-p53的融合基因，并且所述各融合基因分别具有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、和SEQ ID NO：7中所示的DNA序列。

本发明第二方面提供一种重组融合蛋白，其包含促性腺激素释放激素(GnRH)氨基酸序列和p53氨基酸序列，以及任选的介于GnRH氨基酸序列与p53氨基酸序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的氨基酸序列。

根据本发明第二方面的重组融合蛋白，其选自重组融合蛋白GnRH-p53、GnRH-ODD-p53、GnRHIII-p53和GnRHIII-ODD-p53，并且所述重组融合蛋白分别具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、和SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列。

基于本发明第一方面，本发明第三方面提供一种包含如本发明第一方面所述融合基因的表达型重组体，其表达载体选自原核表达载体、真核表达载体和病毒表达载体。

根据本发明第三方面所述的重组体，其选自pET28a-GnRH-p53、pET28a-GnRH-ODD-p53、pET28a-GnRHIII-p53和pET28a-GnRHIII-ODD-p53原核表达载体。

根据本发明第三方面所述的重组体，其为IPTG诱导表达型重组体。具体地说，本发明第一方面所述各融合基因的表达是基于IPTG诱导来实现的。

根据本发明第三方面所述的重组体，其中基因表达盒的上游选自真核细胞启动子、原核细胞启动子和病毒启动子。

本发明第四方面提供一种根据本发明第三方面任一项所述表达型重组体转化、转染或转导所获得的工程菌。

根据本发明第四方面所述的工程菌，其为工程菌GnRH-p53/DH5α、GnRH-ODD-p53/DH5α、GnRHIII-p53/DH5α、或GnRHIII-ODD-p53/DH5α。具体地说，它们分别是本发明第三方面所述的表达型重组体pET28a-GnRH-p53、pET28a-GnRH-ODD-p53、pET28a-GnRHIII-p53和pET28a-GnRHIII-ODD-p53转化入大肠杆菌DH5α所得。

根据本发明第四方面所述的工程菌，其为工程菌GnRH-p53/BL21/DE3、GnRH-ODD-p53/BL21/DE3、GnRHIII-p53/BL21/DE3、或GnRHIII-ODD-p53/BL21/DE3。具体地说，它们分别是本发明第三方面所述的表达型重组体pET28a-GnRH-p53、pET28a-GnRH-ODD-p53、pET28a-GnRHIII-p53和pET28a-GnRHIII-ODD-p53转化入大肠杆菌/BL21/DE3所得。

本发明第五方面提供一种生产重组靶向融合蛋白GnRH-p53、GnRH-ODD-p53、GnRHIII-p53和GnRHIII-ODD-p53的方法，其包括培养本发明第四方面任一项的工程菌，并且分离和纯化所述的融合蛋白。所述的“培养”可以本领域已知的任何在合适表达的条件下进行。

本发明第六方面提供本发明第三方面所述重组体在制备用于治疗哺乳动物实体肿瘤和/或预防哺乳动物肿瘤转移及手术切除后肿瘤再生的药物中的用途。所述的重组体可以作为所述药物的组成部分之一或者作为所述药物的唯一成分。

根据本发明第六方面所述的用途，其中所述的药物用于静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射、腹腔内注射。

本发明第七方面提供本发明第二方面所述融合蛋白在制备用于治疗哺乳动物实体肿瘤和/或预防哺乳动物肿瘤转移及手术切除后肿瘤再生的药物中的用途。所述的融合蛋白可以作为所述药物的组成部分之一或者作为所述药物的唯一组分。

根据本发明第七方面所述的用途，其中所述的药物用于静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射、腹腔内注射。

本发明第八方面提供了一种药物组合物，其含有本发明上述的融合蛋白或重组体，以及任选的药学可接受的载体。

下面进一步详细地描述本发明。

本发明提供的编码重组融合蛋白GnRH-p53、GnRH-ODD-p53、GnRHIII-p53、或GnRHIII-ODD-p53的融合基因分别具有SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、和SEQ ID NO：7中所示的DNA序列；以及本发明提供的选自GnRH-p53、GnRH-ODD-p53、GnRHIII-p53和GnRHIII-ODD-p53的重组融合蛋白分别具有SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、和SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列。其中各序列详情参见序列表，它们分别简述如下：

SEQ ID NO：1是GnRH-p53基因序列，其中：1)序列1-33为GnRH基因序列，2)序列34-1212为p53基因序列，3)序列1213-1215为终止密码子序列。

SEQ ID NO：2是GnRH-p53基因编码的氨基酸序列，其中：1)序列1-11为GnRH序列，2)序列12-404为p53蛋白序列。

SEQ ID NO：3是GnRH-ODD-p53基因序列，其中：1)序列1-33为GnRH基因序列，2)序列34-204为缺氧诱导因子序列，3)序列205-1383为p53基因序列，4)序列1384-1386为终止密码子序列。

SEQ ID NO：4是GnRH-ODD-p53基因编码的氨基酸序列，其中：1)序列1-11为GnRH序列，2)序列12-68为缺氧诱导因子依赖性蛋白降解结构域序列，3)序列69-461为p53蛋白序列。

SEQ ID NO：5是GnRHIII-p53基因序列，其中：1)序列1-33为GnRHIII基因序列，2)序列34-1212为p53基因序列，3)序列1213-1215为终止密码子序列。

SEQ ID NO：6是GnRHIII-p53基因编码的氨基酸序列，其中：1)序列1-11为GnRHIII序列，2)序列12-404为p53蛋白序列。

SEQ ID NO：7是GnRHIII-ODD-p53基因序列，其中：1)序列1-33为GnRHIII基因序列，2)序列34-204为缺氧诱导因子序列，3)序列205-1383为p53基因序列，4)序列1384-1386为终止密码子序列。

SEQ ID NO：8是GnRHIII-ODD-p53基因编码的氨基酸序列，其中：1)序列1-11为GnRHIII序列，2)序列12-68为缺氧诱导因子依赖性蛋白降解结构域序列，3)序列69-461为p53蛋白序列。

本发明的内容主要涉及编码新型的重组靶向融合蛋白GnRH-ODD-p53和GnRHIII-ODD-p53的基因、包含所述基因的表达型重组体、所述表达型重组体的工程菌、此类工程菌表达和分离的靶向融合蛋白以及该类融合蛋白对恶性肿瘤细胞的特异性杀伤作用等方面。因此，本发明主要在于将具有潜在治疗作用的基因与可以转导蛋白进入细胞的配体、加速融合蛋白在正常组织中代谢的氧依赖性蛋白降解结构域进行有机的融合，通过原核表达载体表达融合蛋白，经过蛋白的纯化和复性，提供一种可以进入肿瘤细胞，在正常组织中快速代谢，而在缺氧的肿瘤组织中诱导细胞凋亡的融合蛋白，达到治疗肿瘤的目的。本发明的还在于提供该融合蛋白的制备方法及其用于制备治疗肿瘤药物的应用。

为此，本发明提供一种GnRH/GnRHIII、氧依赖性蛋白降解结构域和人肿瘤抑制基因的表达载体。该表达载体是将由DNA克隆技术构建的原核表达载体与上述融合蛋白基因表达相结合，构建成一个能在原核细胞中扩增、繁殖，表达的肿瘤抑制蛋白的融合序列。本文所述的术语“表达载体”，其含义是本领域技术人员公知的，并且通常是指含有一个启动子顺序，能有效地促使插入的目的基因进行转录，进而翻译出该插入基因编码的蛋白产物的载体。在本发明中，术语“表达载体”可以是本领域技术人员已知的任何一种原核表达载体，并且优选的原核表达载体是pET28a。本文所述术语“人肿瘤抑制基因”所述可以是本领域技术人员已知的具有肿瘤抑制作用的基因中的任一种，并且最优选的基因为p53基因，虽然本文主要以p53基因作为主要实施方案，但本领域技术人员根据本发明的精神可以延及其它种类的人肿瘤抑制基因。所述表达载体由载体与GnRH-ODD-p53和GnRHIII-ODD-p53基因构建而成，定义为GnRH-ODD-p53和GnRHIII-ODD-p53表达载体，其优选序列为SEQ ID NO：2、4、6、8中所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了编码所述融合蛋白的SEQ ID NO：1、3、5、7中所示的核酸序列、含有上述核酸序列的表达载体以及包含所述载体的工程菌GnRH-p53/DH5α、GnRH-ODD-p53/DH5α、GnRHIII-p53/DH5α、GnRHIII-ODD-p53/DH5α，GnRH-p53/BL21/DE3、GnRH-ODD-p53/BL21/DE3、GnRHIII-p53/BL21/DE3、GnRHIII-ODD-p53/BL21/DE3。它们分别是通过表达型重组体pET28a-GnRH-p53、pET28a-GnRH-ODD-p53、pET28a-GnRHIII-p53和pET28a-GnRHIII-ODD-p53转化入大肠杆菌DH5α所得，以及分别是通过表达型重组体pET28a-GnRH-p53、pET28a-GnRH-ODD-p53、pET28a-GnRHIII-p53和pET28a-GnRHIII-ODD-p53转化入大肠杆菌/BL21/DE3所得。所述的转化是本领域技术人员公知的，并且可以参照公知的教科书或工具书的描述的方法进行操作。

本发明还提供了靶向融合蛋白对恶性肿瘤细胞具有特异性杀伤作用的试验证据。

用于本文的术语“哺乳动物”是指罹患本发明所述肿瘤和/或癌症的受试者，其包括但不限于猪、狗、猫、牛、羊等家畜和人类。优选地，所述的哺乳动物是人类。

用于本文的术语“肿瘤”和“癌”，其含义和两者关系是本领域技术人员公知的，并且二者在许多情况下可以互换使用。所述的肿瘤和/或癌可以是医学上已知的任何肿瘤，包括恶性肿瘤和/或癌症。优选地，所述的肿瘤(包括恶性肿瘤和/或癌症)包括，但不限于：

恶性肿瘤，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、头和颈癌、食管癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；

淋巴系统的造血肿瘤，包括但不限于白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴癌、T-细胞淋巴癌、霍奇金淋巴癌、非-霍奇金淋巴癌、毛细胞淋巴癌、外套细胞淋巴瘤、骨髓瘤和Burkett′s氏淋巴癌；

骨髓系统的造血肿瘤，包括但不限于急性和慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和前髓细胞性白血病；

间质成因的肿瘤，包括但不限于纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；

中枢和周围神经系统的肿瘤，包括但不限于星形细胞瘤和神经胶质瘤；以及

其他肿瘤，包括但不限于黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、、甲状腺滤囊癌和卡波氏肉瘤。

更优选地，所述的肿瘤(包括恶性肿瘤和/或癌症)选自乳腺癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、胃癌、膀胱癌、结肠癌、肾癌、头和颈癌、食管癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和皮肤癌。

更进一步优选地，所述的肿瘤(包括恶性肿瘤和/或癌症)选自乳腺癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、胃癌。

根据本发明所述重组体在制备用于治疗哺乳动物实体肿瘤和/或预防哺乳动物肿瘤转移及手术切除后肿瘤再生的药物中的用途，以及所述融合蛋白在制备用于治疗哺乳动物实体肿瘤和/或预防哺乳动物肿瘤转移及手术切除后肿瘤再生的药物中的用途，其中所述的药物其可以通过本领域已知的任何途径给予有治疗需求的受试者，例如哺乳动物特别是人类。所述的给药途径包括但不限于：全身给药、皮肤局部给药、病灶区局部给药等。特别地，所述的给药途径包括但不限于：静脉内、动脉内、肌内、经口、经皮、腹膜内、肿瘤病灶区、经肺吸入或吹入、胃肠外、经粘膜、经鼻、经直肠。更特别地，所述的给药途径包括但不限于：静脉内和肿瘤病灶区。例如，非限制性地，根据本发明的含有所述重组体或融合蛋白的药物其可通过肿瘤病灶区局部注射或者通过静脉注射给药。具体而言，例如，可以参考有关重组质粒和腺病毒的本领域公知的给药方式给予有治疗需求的受试者；进一步地，例如参考Clayman GL et al.J Clin Oncol，1998，16：2221-2232和Martin B et al.Cancer Res，1999，59：1391-1399中的方法通过肿瘤部位局部注射给药，或者参考Reid T et al.Cancer Gene Ther，2002，9：979-986中的方法通过静脉注射给药。以上文献以其全部内容通过引用并入本文。

根据本发明，所述的药物可以是本领域公知的任何可用于给药的药物形式，包括药物组合物、药物制剂等。虽然本发明所述用途中涉及的药物可以经口、经皮的途径给药，并且这些给药方式也是本发明的一部分。但是，本领域技术人员清楚适合于本发明所述用途的最优选给药途径是胃肠外途径。对于本发明的实施而言，所述用途中涉及的药物优选是用于胃肠外给药的制剂，包括但不限于局部注射用制剂和全身注射用制剂，具体剂型包括但不限于注射用溶液剂和注射用粉针剂。更优选的，所述的药物是无菌的注射用含水溶液剂，或者是无菌的用于临床使用前用注射用水复溶配制的粉针剂，特别是冷冻干燥粉针剂。

另外，根据下文中提供的研究结果，本领域技术人员可以容易地确定在哺乳动物中使用时有效剂量。可以将一天的剂量在一天中一次性全部给与受试者，也可以在一天内将需要的剂量分成两个、三个、四个或更多个小剂量以合适的间隔给药。所述小剂量可以配制成单元剂量形式，例如每个单元剂量形式含有日总剂量细分适宜次数的相应量。当然，也可以以一定的时间周期给药，例如一天给药一次、两天给药一次、一周给药一次、一月给药一次等。

本发明所述用途中涉及的药物在具体的临床案例中，它们的具体使用量可因多种因素而可能需要作相应的变化，这些因素包括但不限于：受试者病况的严重程度，受试者的年龄、性别、体重，给药途径，药物剂型等等。

本发明还涉及所述融合蛋白的表达、纯化和复性的方法，所述的表达、纯化和复性的方法是本领域技术人员公知的，并且可以参照公知的教科书或工具书的描述的方法进行操作。优选的方法包括：将编码所述融合蛋白和His标签质粒(包括，但不限于，例如pET质粒)转化宿主菌BL21(DE3)，培养在25℃～42℃，取出活化菌液，以5％～20％的比例在新鲜培养基中培养至OD₆₀₀值为0.5～2.0，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.4～1mM，诱导时间为3～24h，收集诱导表达的菌体，PBS洗涤，用pH8.5～11.5的10mmol/L Tris缓冲液重悬菌体，振荡混匀，置冰浴超声10～25min破菌，回收包涵体。用6-10M尿素溶解，用镍柱或层析柱纯化包涵体。采用连续梯度法复性目的蛋白。

另一方面，本发明提供了所述融合蛋白或重组体用于治疗实体瘤的药物用途。本发明特别涉及含有所述融合蛋白或重组体的药物组合物，为选自适于静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射和胸腔、腹腔内注射的剂型。所述的药物组合物含有本发明所述的融合蛋白或重组体，还可以任选地含有一种或多种药学可接受的载体，例如所述药物组合物为注射用粉针剂时可以含有赋形剂例如甘露醇。

本发明从肿瘤细胞的特点入手，在GnRH和p53融合蛋白中引入ODD，通过肿瘤细胞膜上的GnRH受体介导融合蛋白进入细胞内，利用ODD加速融合蛋白在正常细胞内的降解，相对延长其在肿瘤细胞内的半衰期达到p53蛋白靶向抗肿瘤的目的。本发明提供的重组靶向融合蛋白GnRH-p53、GnRH-ODD-p53、GnRHIII-p53、GnRHIII-ODD-p53，以p53为肿瘤治疗的效应分子，通过促性腺激素释放激素(GnRH)与其受体特异结合介导蛋白进入相应的肿瘤细胞，应用氧依赖性降解区域(ODD)减轻p53对正常组织的损伤，增强蛋白对实体肿瘤的靶向作用。经研究在细胞和动物整体水平上，融合蛋白具有抑制肿瘤生长作用，并且其肝、肾等毒副作用较轻微。使用本发明，可以制备抗肿瘤蛋白制品，在肿瘤治疗方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1显示了pET-GnRH/GnRHIII-ODD-p53构建示意图。

图2显示了pET-GnRH/GnRHIII-ODD-p53经Nhe I和Xho I双酶切鉴定。图中各标签分别表示：1为pET-GnRH-p53；2为pET-GnRH-ODD-p53；3为pET-GnRHIII-p53；4为pET-GnRHIII-ODD-p53；M为DNA Marker，从下到上分别为500、1000、2000、3500、5500、7000bp。

图3显示了pET-GnRH/GnRHIII-ODD-p53表达(12％SDS-PAGE)。图中从左到右共9条电泳带，依次分别是：pET28a-GP(0h)、pET28a-GP(4h)、pET28a-GOP(0h)、pET28a-GOP(4h)、Marker、pET28a-G3P(0h)、pET28a-G3P(4h)、pET28a-G3OP(0h)、pET28a-G3OP(4h)。M为标准蛋白；GP为GnRH-p53；GOP为GnRH-ODD-p53；G3P为GnRHIII-p53；G3OP为GnRHIII-ODD-p53。图中所示Marker的分子量从上到下分别为：97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4kD。

图4显示了GnRH/GnRHIII-ODD-p53的Western免疫印迹(Western免疫印迹)。图中从左到右共6条色带分别为p53、GP、GOP、p53、G3P、G3OP

图5显示了复性后蛋白的SDS-PAGE(12％)图。图中从左到右共5条电泳带，依次分别是：GP，表示GnRH-p53；GOP GnRH-ODD-p53，表示；G3P，表示GnRHIII-p53；G3OP，表示GnRHIII-ODD-p53；Marker，表示标准蛋白。

图6显示了免疫细胞化学方法检测H1299细胞中融合蛋白的显微图(200×)，其中图a～e依次为无血清培养基、p53、GP、GOP、G3P、G3OP。

图7显示了常氧及缺乏氧条件下GnRH-p53系列融合蛋白对细胞的影响。A、B、C、D四个图的横坐标均为蛋白剂量(μg/mL)。其中，A图是融合蛋白对H1299细胞生存抑制实验结果(MTT法，缺氧)；B图是融合蛋白对H1299细胞生长抑制作用研究结果(MTT法，缺氧48h)；C图是融合蛋白对H1299细胞生长抑制作用研究结果(MTT法，常氧)；D图是融合蛋白对H1299细胞生长抑制作用研究结果(MTT法，常氧48h)。

图8显示了GnRH-p53系列融合蛋白对荷瘤动物的影响。图中：##表示与TC组比较P＜O.01，#表示与TC组比较P＜0.05；SPSS统计分析软件，ANOVA；V＝(LW2)/2

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

例1、制备p53基因

取人胎总RNA 1g，按cDNA synthesis system操作指南依次加入反应成分。反应总体积20μl，42℃反应15min后，95℃灭活5min，作为PCR模板。以P7：GAGAATTCATGGAGGAGCCGCAGTC；P4：CCGTCGACTTAGTCTGAGTCAGGC为引物，PCR人全长p53基因。

分别取载体pET28a和p53PCR片段，用EcoR I和SalI进行双酶切，在37℃下处理3h，再用凝胶回收试剂盒回收。pET载体片段与p53片段以1∶3的比例混合，加3U的T4连接酶，16℃反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5α中，挑取转化成功的菌落，提质粒PCR鉴定。阳性克隆经过测序正确后命名为pET-p53。将pET-p53质粒转化于感受态大肠杆菌BL21中。

例2、制备GnRH-ODD-p53基因和GnRHIII-ODD-p53基因

采用重叠延伸法构建GnRH和GnRHIII基因。将GP1：CTAGCATGGAGCACTGGTCCTATGGACTGCGCCCTGGAA和GP2：AGCTTTCCAGGGCGCAGTCCATAGGACCAGTGCTCCATG等量混合加入PCR反应体系，反应30次，得到片段(GnRH)。

同法将G3P1：

CTAGCATGGAGCACTGGTCCCACGACTGGAAGCCTGGAA和G3P2：

AGCTTTCCAGGCTTCCAGTCGTGGGACCAGTGCTCCATG等量混合加入PCR反应体系，反应30次，得到片段(GnRHIII)。

将Nhe I和HindIII双酶切的pET-p53载体与GnRH或GnRHIII片段以1∶3的比例混合，加T4连接酶，16℃反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒PCR鉴定。阳性克隆经过测序正确命名为pET-GnRH-p53(GP)和pET-GnRHIII-p53(G3P)。将pET-GnRH-p53和pET-GnRHIII-p53质粒转化于感受态大肠杆菌BL21中。

用HindIII和BamH I双酶切(全基因合成ODD，pET-GnRH-p53和pET-GnRHIII-p53)，37℃处理2h后用凝胶回收试剂盒回收ODD片段及pET-GnRH-p53和pET-GnRHIII-p53载体，将载体与片段以1∶3的比例混合，加T4连接酶，16℃反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒Nhe I和Xho I双酶切鉴定(参见图1、图2)。阳性克隆命名为pET-GnRH-ODD-p53(GOP)和pET-GnRHIII-ODD-p53(G3OP)。将其质粒转化于感受态大肠杆菌BL21中。

例3、制备GnRH-ODD-p53和GnRHIII-ODD-p53融合蛋白

1)、GnRH-ODD-p53和GnRHIII-ODD-p53的表达

分别挑取转化pET-GnRH-p53和pET-GnRHIII-p53的阳性菌落置LB培养液中(含卡那霉素60g/ml)活化，再按5-20％接种于2YT培养液中，培养至OD₆₀₀值为0.5～2.0时，加入IPTG至0.4～1mM诱导表达。收集诱导表达3～24h的菌体，PBS洗涤。

2)、GnRH-ODD-p53和GnRHIII-ODD-p53的Western免疫印迹鉴定

经诱导表达获得的融合蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(12％SDS-PAGE，见图3)分析表明：沉淀中有目的蛋白，其分子量与理论值相符。经Western免疫印迹，用p53单克隆抗体鉴定分析为GnRH-p53系列融合蛋白(见图4)。图4中，p53、GP、GOP、G3P、G3OP依次分别表示的是p53蛋白、重组融合蛋白GnRH-p53、重组融合蛋白GnRH-ODD-p53、重组融合蛋白GnRHIII-p53、和重组融合蛋白GnRHIII-ODD-p53。

3)、包涵体洗涤

以上所得菌体用10mM磷酸缓冲液(pH 7.6)重悬，超声破菌，在4℃下以10000rpm离心，沉淀部分用0.5-4M尿素、100mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)在4℃下洗涤过夜。

4)、包涵体溶解及复性

以10000rpm离心15分钟，收集沉淀，用6-10mol/L尿素(溶于20mmol/L三羟甲基胺基甲烷缓冲液，pH 8.0-12.0)溶解，缓慢加入等体积复性液(含20mmol/L Tris、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L GSH；0.01mol/L GSSG)，以12000rpm离心15分钟，取上清装入Mr 50000透析袋，置4-12℃中采用连续梯度透析法透析至复性液，用生理盐水透析3次。复性后蛋白进行SDS-PAGE(12％)，见图5。透析后蛋白溶液至冰箱过夜冷冻后进行真空冷冻干燥，-80℃存放备用。

例4、GnRH-ODD-p53和GnRHIII-ODD-p53活性测定

1)、GnRH-ODD-p53和GnRHIII-ODD-p53跨膜进入细胞实验

将例3获得的GnRH-p53系列融合蛋白以40μg/mL的终浓度加入H1299细胞(p53缺陷型人肺腺瘤细胞)中，同时以等量无血清培养基及p53蛋白作为对照，2h后以抗p53单克隆抗体为一抗做免疫组织化学检测，对照组分别用无血清培养基、p53蛋白加入H1299细胞中，结果表明，GP、GOP、G3P、G3OP均能进入细胞内，并以细胞核中分布为主(见图6)。

2)、MTT法测定常氧及缺乏氧条件下GnRH-p53系列融合蛋白对细 胞的影响

用不含小牛血清的RPMI 1640培养基溶解融合蛋白GP、GOP、G3P、G3OP，用0.22μm滤器过滤除菌后4℃存放备用。

收集对数生长期的H1299细胞，用含10％小牛血清的RPMI 1640完全培养基将其稀释成1×10⁵个/mL的浓度，以100μl/孔接种于96孔细胞培养板中，在37℃和5％CO₂下培养过夜。

将融合蛋白GP、GOP、G3P、G3OP用RPMI 1640完全培养基稀释后分别分为6个剂量组，蛋白终浓度为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL，以100μl/孔的量加入已经接种H1299细胞中的96孔板中，同时以等量p53蛋白作为对照，将培养板分别常氧和缺氧(氧含量≤1.1％)条件下培养48h后，以20μl/孔的量加入MTT(5g/L)，在37℃和5％CO₂的条件下继续培养4h。分别吸弃孔中培养基，以150μl/孔的量加入DMSO，在室温下轻微振荡，直至沉淀溶解，用酶标仪测定A₄₉₂，结果见图7。

3)、GnRH-p53系列融合蛋白对荷瘤动物的影响

将H1299细胞按规定量(5×10⁶个细胞/只动物)在BALB/c裸鼠(雌性，18-22g，6-8周龄)右肩胛下侧注射，14天后建成模型。将荷瘤动物随机分成5组，分别为：TC组(肿瘤对照组)、GP组(GnRH-p53)、GOP组(GnRH-ODD-p53)、G3P组(GnRHIII-p53)、G3OP组(GnRHIII-ODD-p53)，6只/组。给药组动物剂量为5mg/kg，对照组给予等体积的生理盐水，腹腔注射(ip)，连续给药12天，实验结束之后处死动物，测定各组动物瘤体的直径，计算瘤体的体积，结果见图8。从图可见，本发明提供的四种融合蛋白可以在动物体内明显抑制肿瘤生长。

本发明利用基因工程、蛋白质纯化等手段，制备出具有穿膜活性、在缺氧环境中稳定及具有生物学活性的蛋白或多肽，并指导制备出具有药用价值的生物载体药物，GnRH-ODD-p53在体外缺氧环境可以抑制肿瘤细胞生长，在体内可以抑制移植瘤在小鼠体内的生长，延长小鼠的存活时间。用于人类多种恶性肿瘤的治疗，具有重要的医学研究及临床使用价值。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所

<120>包含p53基因的重组融合蛋白和重组体及其用途

<130>IDC080094

<160>8

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1215

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GnRH-p53基因序列

<400>1

atggagcact ggtcctatgg actgcgccct ggaatggagg agccgcagtc agatcctagc    60

gtcgagcccc ctctgagtca ggaaacattt tcagacctat ggaaactact tcctgaaaac    120

aacgttctgt cccccttgcc gtcccaagca atggatgatt tgatgctgtc cccggacgat    180

attgaacaat ggttcactga agacccaggt ccagatgaag ctcccagaat gccagaggct    240

gctccccgcg tggcccctgc accagcagct cctacaccgg cggcccctgc accagccccc    300

tcctggcccc tgtcatcttc tgtcccttcc cagaaaacct accagggcag ctacggtttc    360

cgtctgggct tcttgcattc tgggacagcc aagtctgtga cttgcacgta ctcccctgcc    420

ctcaacaaga tgttttgcca actggccaag acctgccctg tgcagctgtg ggttgattcc    480

acacccccgc ccggcacccg cgtccgcgcc atggccatct acaagcagtc acagcacatg    540

acggaggttg tgaggcgctg cccccaccat gagcgctgct cagatagcga tggtctggcc    600

cctcctcagc atcttatccg agtggaagga aatttgcgtg tggagtattt ggatgacaga    660

aacacttttc gacatagtgt ggtggtgccc tatgagccgc ctgaggttgg ctctgactgt    720

accaccatcc actacaacta catgtgtaac agttcctgca tgggcggcat gaaccggagg    780

cccatcctca ccatcatcac actggaagac tccagtggta atctactggg acggaacagc    840

tttgaggtgc gtgtttgtgc ctgtcctggg agagaccggc gcacagagga agagaatctc    900

cgcaagaaag gggagcctca ccacgagctg cccccaggga gcactaagcg agcactgccc    960

aacaacacca gctcctctcc ccagccaaag aagaaaccac tggatggaga atatttcacc    1020

cttcagatcc gtgggcgtga gcgcttcgag atgttccgag agctgaatga ggccttggaa    1080

ctcaaggatg cccaggctgg gaaggagcca ggggggagca gggctcactc cagccacctg    1140

aagtccaaaa agggtcagtc tacctcccgc cataaaaaac tcatgttcaa gacagaaggg    1200

cctgactcag actaa                                                     1215

<210>2

<211>404

<212>PRT

<213>E.coli

<220>

<223>GnRH-p53基因编码的氨基酸序列

<400>2

Met Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Met Glu Glu Pro Gln

1               5                   10                  15

Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp

            20                  25                  30

Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser

        35                  40                  45

Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln Trp

    50                  55                  60

Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu Ala

65                  70                  75                  80

Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro

                85                  90                  95

Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gln Lys

            100                 105                 110

Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly

        115                 120                 125

Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met

    130                 135                 140

Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser

145                 150                 155                 160

Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln

                165                 170                 175

Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg

            180                 185                 190

Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg Val

        195                 200                 205

Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg

    210                 215                 220

His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys

225                 230                 235                 240

Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly

                245                 250                 255

Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser

            260                 265                 270

Gly Asn Leu Leu Gly Arg Ash Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys

        275                 280                 285

Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly

    290                 295                 300

Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro

305                 310                 315                 320

Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly

                325                 330                 335

Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe

            340                 345                 350

Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys

        355                 360                 365

Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys

    370                 375                 380

Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly

385                 390                 395                 400

Pro Asp Ser Asp

<210>3

<211>1386

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GnRH-ODD-p53基因序列

<400>3

atggagcact ggtcctatgg actgcgccct ggaatgaacc cattttctac tcaggacaca    60

gatttagact tggagatgtt agctccctat atcccaatgg atgatgactt ccagttacgt    120

tccttcgatc agttgtcacc attagaaagc agttccgcaa gccctgaaag cgcaagtcct    180

caaagcacag ttacagtatt ccagatggag gagccgcagt cagatcctag cgtcgagccc    240

cctctgagtc aggaaacatt ttcagaccta tggaaactac ttcctgaaaa caacgttctg    300

tcccccttgc cgtcccaagc aatggatgat ttgatgctgt ccccggacga tattgaacaa    360

tggttcactg aagacccagg tccagatgaa gctcccagaa tgccagaggc tgctccccgc    420

gtggcccctg caccagcagc tcctacaccg gcggcccctg caccagcccc ctcctggccc    480

ctgtcatctt ctgtcccttc ccagaaaacc taccagggca gctacggttt ccgtctgggc    540

ttcttgcatt ctgggacagc caagtctgtg acttgcacgt actcccctgc cctcaacaag    600

atgttttgcc aactggccaa gacctgccct gtgcagctgt gggttgattc cacacccccg    660

cccggcaccc gcgtccgcgc catggccatc tacaagcagt cacagcacat gacggaggtt    720

gtgaggcgct gcccccacca tgagcgctgc tcagatagcg atggtctggc ccctcctcag    780

catcttatcc gagtggaagg aaatttgcgt gtggagtatt tggatgacag aaacactttt    840

cgacatagtg tggtggtgcc ctatgagccg cctgaggttg gctctgactg taccaccatc    900

cactacaact acatgtgtaa cagttcctgc atgggcggca tgaaccggag gcccatcctc    960

accatcatca cactggaaga ctccagtggt aatctactgg gacggaacag ctttgaggtg    1020

cgtgtttgtg cctgtcctgg gagagaccgg cgcacagagg aagagaatct ccgcaagaaa    1080

ggggagcctc accacgagct gcccccaggg agcactaagc gagcactgcc caacaacacc    1140

agctcctctc cccagccaaa gaagaaacca ctggatggag aatatttcac ccttcagatc    1200

cgtgggcgtg agcgcttcga gatgttccga gagctgaatg aggccttgga actcaaggat    1260

gcccaggctg ggaaggagcc aggggggagc agggctcact ccagccacct gaagtccaaa    1320

aagggtcagt ctacctcccg ccataaaaaa ctcatgttca agacagaagg gcctgactca    1380

gactaa                                                               1386

<210>4

<211>461

<212>PRT

<213>E.coli

<220>

<223>GnRH-ODD-p53基因编码的氨基酸序列

<400>4

Met Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Met Asn Pro Phe Ser

1               5                   10                  15

Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro

            20                  25                  30

Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu

        35                  40                  45

Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val

    50                  55                  60

Thr Val Phe Gln Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro

65                  70                  75                  80

Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu

                85                  90                  95

Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met

            100                 105                 110

Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro

        115                 120                 125

Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala

    130                 135                 140

Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro

145                 150                 155                 160

Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly

                165                 170                 175

Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys

            180                 185                 190

Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr

        195                 200                 205

Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg

    210                 215                 220

Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val

225                 230                 235                 240

Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu

                245                 250                 255

Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu

            260                 265                 270

Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr

        275                 280                 285

Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr

    290                 295                 300

Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu

305                 310                 315                 320

Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn

                325                 330                 335

Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr

            340                 345                 350

Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro

        355                 360                 365

Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro

    370                 375                 380

Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile

385                 390                 395                 400

Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu

                405                 410                 415

Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala

            420                 425                 430

His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His

        435                 440                 445

Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp

    450                 455                 460

<210>5

<211>1215

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GnRHIII-p53基因序列

<400>5

atggagcact ggtcccacga ctggaagcct ggaatggagg agccgcagtc agatcctagc    60

gtcgagcccc ctctgagtca ggaaacattt tcagacctat ggaaactact tcctgaaaac    120

aacgttctgt cccccttgcc gtcccaagca atggatgatt tgatgctgtc cccggacgat    180

attgaacaat ggttcactga agacccaggt ccagatgaag ctcccagaat gccagaggct    240

gctccccgcg tggcccctgc accagcagct cctacaccgg cggcccctgc accagccccc    300

tcctggcccc tgtcatcttc tgtcccttcc cagaaaacct accagggcag ctacggtttc    360

cgtctgggct tcttgcattc tgggacagcc aagtctgtga cttgcacgta ctcccctgcc    420

ctcaacaaga tgttttgcca actggccaag acctgccctg tgcagctgtg ggttgattcc    480

acacccccgc ccggcacccg cgtccgcgcc atggccatct acaagcagtc acagcacatg    540

acggaggttg tgaggcgctg cccccaccat gagcgctgct cagatagcga tggtctggcc    600

cctcctcagc atcttatccg agtggaagga aatttgcgtg tggagtattt ggatgacaga    660

aacacttttc gacatagtgt ggtggtgccc tatgagccgc ctgaggttgg ctctgactgt    720

accaccatcc actacaacta catgtgtaac agttcctgca tgggcggcat gaaccggagg    780

cccatcctca ccatcatcac actggaagac tccagtggta atctactggg acggaacagc  840

tttgaggtgc gtgtttgtgc ctgtcctggg agagaccggc gcacagagga agagaatctc  900

cgcaagaaag gggagcctca ccacgagctg cccccaggga gcactaagcg agcactgccc  960

aacaacacca gctcctctcc ccagccaaag aagaaaccac tggatggaga atatttcacc  1020

cttcagatcc gtgggcgtga gcgcttcgag atgttccgag agctgaatga ggccttggaa  1080

ctcaaggatg cccaggctgg gaaggagcca ggggggagca gggctcactc cagccacctg  1140

aagtccaaaa agggtcagtc tacctcccgc cataaaaaac tcatgttcaa gacagaaggg  1200

cctgactcag actaa                                                   1215

<210>6

<211>404

<212>PRT

<213>E.coli

<220>

<223>GnRHHI-p53基因编码的氨基酸序列

<400>6

Met Glu His Trp Ser His Asp Trp Lys Pro Gly Met Glu Glu Pro Gln

1               5                   10                  15

Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp

            20                  25                  30

Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser

        35                  40                  45

Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln Trp

    50                  55                  60

Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu Ala

65                  70                  75                  80

Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro

                85                  90                  95

Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gln Lys

            100                 105                 110

Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly

        115                 120                 125

Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met

    130                 135                 140

Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser

145                 150                 155                 160

Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln

                165                 170                 175

Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg

            180                 185                 190

Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg Val

        195                 200                 205

Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg

    210                 215                 220

His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys

225                 230                 235                 240

Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly

                245                 250                 255

Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser

            260                 265                 270

Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys

        275                 280                 285

Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly

    290                 295                 300

Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro

305                 310                 315                 320

Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly

                325                 330                 335

Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe

            340                 345                 350

Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys

        355                 360                 365

Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys

    370                 375                 380

Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly

385                 390                 395                 400

Pro Asp Ser Asp

<210>7

<211>1386

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GnRHIII-ODD-p53基因序列

<400>7

atggagcact ggtcccacga ctggaagcct ggaatgaacc cattttctac tcaggacaca  60

gatttagact tggagatgtt agctccctat atcccaatgg atgatgactt ccagttacgt  120

tccttcgatc agttgtcacc attagaaagc agttccgcaa gccctgaaag cgcaagtcct  180

caaagcacag ttacagtatt ccagatggag gagccgcagt cagatcctag cgtcgagccc  240

cctctgagtc aggaaacatt ttcagaccta tggaaactac ttcctgaaaa caacgttctg  300

tcccccttgc cgtcccaagc aatggatgat ttgatgctgt ccccggacga tattgaacaa  360

tggttcactg aagacccagg tccagatgaa gctcccagaa tgccagaggc tgctccccgc  420

gtggcccctg caccagcagc tcctacaccg gcggcccctg caccagcccc ctcctggccc  480

ctgtcatctt ctgtcccttc ccagaaaacc taccagggca gctacggttt ccgtctgggc  540

ttcttgcatt ctgggacagc caagtctgtg acttgcacgt actcccctgc cctcaacaag  600

atgttttgcc aactggccaa gacctgccct gtgcagctgt gggttgattc cacacccccg  660

cccggcaccc gcgtccgcgc catggccatc tacaagcagt cacagcacat gacggaggtt  720

gtgaggcgct gcccccacca tgagcgctgc tcagatagcg atggtctggc ccctcctcag  780

catcttatcc gagtggaagg aaatttgcgt gtggagtatt tggatgacag aaacactttt  840

cgacatagtg tggtggtgcc ctatgagccg cctgaggttg gctctgactg taccaccatc  900

cactacaact acatgtgtaa cagttcctgc atgggcggca tgaaccggag gcccatcctc  960

accatcatca cactggaaga ctccagtggt aatctactgg gacggaacag ctttgaggtg  1020

cgtgtttgtg cctgtcctgg gagagaccgg cgcacagagg aagagaatct ccgcaagaaa  1080

ggggagcctc accacgagct gcccccaggg agcactaagc gagcactgcc caacaacacc  1140

agctcctctc cccagccaaa gaagaaacca ctggatggag aatatttcac ccttcagatc  1200

cgtgggcgtg agcgcttcga gatgttccga gagctgaatg aggccttgga actcaaggat  1260

gcccaggctg ggaaggagcc aggggggagc agggctcact ccagccacct gaagtccaaa  1320

aagggtcagt ctacctcccg ccataaaaaa ctcatgttca agacagaagg gcctgactca  1380

gactaa                                                             1386

<210>8

<211>461

<212>PRT

<213>E.coli

<220>

<223>GnRHIII-ODD-p53基因编码的氨基酸序列

<400>8

Met Glu His Trp Ser His Asp Trp Lys Pro Gly Met Asn Pro Phe Ser

1               5                   10                  15

Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro

            20                  25                  30

Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu

        35                  40                  45

Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val

    50                  55                  60

Thr Val Phe Gln Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro

65                  70                  75                  80

Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu

                85                  90                  95

Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met

            100                 105                 110

Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro

        115                 120                 125

Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala

    130                 135                 140

Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro

145                 150                 155                 160

Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly

                165                 170                 175

Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys

            180                 185                 190

Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr

        195                 200                 205

Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg

    210                 215                 220

Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val

225                 230                 235                 240

Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu

                245                 250                 255

Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu

            260                 265                 270

Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr

        275                 280                 285

Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr

    290                 295                 300

Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu

305                 310                 315                 320

Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn

                325                 330                 335

Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr

            340                 345                 350

Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro

        355                 360                 365

Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro

    370                 375                 380

Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile

385                 390                 395                 400

Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu

                405                 410                 415

Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala

            420                 425                 430

His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His

        435                 440                 445

Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp

    450                 455                 460

Claims (10)

1、一种融合基因，其包含GnRH基因序列和p53基因序列，以及任选的介于GnRH基因序列与p53基因序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的基因序列。

2、根据权利要求1所述的融合基因，其具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、和SEQ ID NO：7中所示的DNA序列。

3、一种重组融合蛋白，其包含GnRH氨基酸序列和p53氨基酸序列，以及任选的介于GnRH氨基酸序列与p53氨基酸序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的氨基酸序列。

4、根据权利要求3所述的重组融合蛋白，其选自重组融合蛋白GnRH-p53、GnRH-ODD-p53、GnRHIII-p53和GnRHIII-ODD-p53，并且所述重组融合蛋白分别具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、和SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列。

5、一种包含如权利要求1或2所述融合基因的表达型重组体，其表达载体选自原核表达载体、真核表达载体和病毒表达载体。

6、根据权利要求5所述的表达型重组体，其选自pET28a-GnRH-p53、pET28a-GnRH-ODD-p53、pET28a-GnRHIII-p53和pET28a-GnRHIII-ODD-p53原核表达载体。

7、根据权利要求6所述的表达型重组体，其为IPTG诱导表达型重组体。

8、根据权利要求5所述的表达型重组体，其中基因表达盒的上游选自真核细胞启动子、原核细胞启动子和病毒启动子。

9、由权利要求5至7任一项所述的表达型重组体转化、转染或转导所获得的工程菌。

10、根据权利要求9所述的工程菌，其特征在于：

i)其为工程菌GnRH-p53/DH5α、

工程菌GnRH-ODD-p53/DH5α、

工程菌GnRHIII-p53/DH5α、或

工程菌GnRHIII-ODD-p53/DH5α；或者

ii)其为工程菌GnRH-p53/BL21/DE3、

工程菌GnRH-ODD-p53/BL21/DE3、

工程菌GnRHIII-p53/BL21/DE3、或

工程菌GnRHIII-ODD-p53/BL21/DE3。

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