CN110862459A - Hpv16e7亲和体负载颗粒酶b的亲和毒素靶向分子及其用途 - Google Patents

Hpv16e7亲和体负载颗粒酶b的亲和毒素靶向分子及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子及其用途，该亲和毒素靶向分子负载的颗粒酶B属于内源性蛋白，避免了异源性蛋白带来的免疫原性问题，具有更广阔的的应用前景；此外，本发明还提供了该亲和毒素靶向分子作为药物等的用途。

Description

HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子及其用途
技术领域
本发明涉及生物科技技术领域，尤其是一种HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子及其用途。
背景技术
目前人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）16等高危型别感染与子宫颈癌的发生发展密切相关，占全球宫颈癌发病的65%以上。尽管HPV疫苗成功上市大大降低了一些发达国家宫颈癌的发病率和死亡率，包括中国在内的发展中国家对已经感染HPV及其所致的癌前病变和转移复发，至今仍没有特效办法。肿瘤微环境中存在免疫抑制、免疫不应答、免疫豁免等，机体不容易依靠主动免疫清除病变细胞，故对宫颈癌前病变或转移复发的靶向干预和控制，具有重要的现实意义。
以单克隆抗体为代表的分子靶向治疗已获得了突破性的研究进展，例如，已经上市的靶向HER2的转移性乳腺癌单克隆抗体、EGFR的转移性结直肠癌与头颈癌单抗、VEGF的转移性结直肠癌单抗等。同时单克隆抗体作为载体与抗癌药物或毒素结合起来制备成的抗体-毒素生物分子药物，在患者体内追踪癌细胞，可进行靶向识别和靶向杀伤。但抗体药物最大的局限性是耐药性问题，以及组织渗透性不够、制备成本昂贵、抗体Fc段介导的免疫效应（即表达Fc受体的细胞，如中性粒细胞、NK细胞、巨噬细胞等）所致毒副反应等，即使单链抗体（ScFv）也存在稳定性差、亲和力低和体内清除过快等缺点而影响了在临床上的应用。
本申请人曾研究设计了一种与靶蛋白具有高亲和力的亲和体分子（affibody），参考中国专利ZL201510028505.3，《对HPV16E
7具有结合亲和力的多肽及其用途》，该亲合体分子具有抗体的靶向识别特性。它源于葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal protein A, SPA）的结构域Z区（SPA-Z），通过基因工程技术对SPA-Z结域进行改造，通过噬菌体展示技术构建突变体文库，以不同的靶蛋白对该文库进行亲和筛选，可筛选到与这些靶蛋白具有高度亲和力的特异性结合分子。这些基于SPA-Z获得的结合分子，被称为亲和体（affibody），亲和体分子和靶分子的结合相似于抗体和抗原的结合，其独特优势为：获得方法简便，体外筛选得到；制备容易，通过化学合成或原核体系表达；分子质量小，生物体内组织穿透力强；血浆清除率高；理化性质稳定，与标记分子（如荧光素、毒素、药物等）交联或融合表达不影响其与靶分子的结合能力，可实现体内示踪或靶向治疗。而抗体负载的毒素主要来源于细菌、植物等外源性毒素，比如白喉外毒素、绿脓杆菌毒素等，但免疫原性等带来的副作用限制了其临床应用。
E7是HPV早期表达的一种肿瘤原性蛋白，持续并稳定地在宫颈癌及其癌前病变组织中高表达，是HPV诊断和治疗研究中特异的靶抗原。本发明在已经亲和筛选到与HPV16E7具有高亲和力特异性亲和体（即：HPV16E7亲和体）的基础上，利用亲合体靶向亲合特性和颗粒酶GrB细胞毒作用的双重优势，设计并制备靶向HPV16E7发挥细胞毒作用的一种亲合毒素（即：HPV16E7亲和体-GrB）。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子，其中，颗粒酶B是内源性蛋白，避免了异源性蛋白带来的免疫原性问题，从而可以有具有更广阔的的应用前景，也能为早期宫颈癌前病变、复发转移等的靶向及时干预和治疗研究提供新思路和新方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子，其特征在于：包括HPV16E7亲和体和颗粒酶B，HPV16E7亲和体与颗粒酶B之间以柔性肽G4S连接，且该颗粒酶B是进行第201个氨基酸突变，同时将碱性氨基酸替换为非极性氨基酸后获得的颗粒酶B，该颗粒酶B的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示序列。
上述颗粒酶B的氨基酸序列中的第201个氨基酸（精氨酸 R）突变为赖氨酸（K），同时将碱性氨基酸替换为非极性氨基酸，以分别消除蛋白酶抑制剂的抑制和静电的非特异性吸附；SEQ ID NO 1 是GrB的核苷酸序列，SEQ ID NO 2为GrB的氨基酸序列。
本发明的另一方面，提供了一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子，该多核苷酸带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点。序列表中SEQID NO 3是HPV16E7亲和体负载颗粒酶B（HPV16E7-GrB）的核苷酸序列，SEQ ID NO 4为HPV16E7亲和体负载颗粒酶B（HPV16E7-GrB）的氨基酸序列。
本发明的另一方面，提供了一种重组载体，其特征在于：包含权利要求2所述的多核苷酸。
本发明的另一方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于：宿主细胞包含权利要求3所述的重组载体，或其包含有货基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
本发明的另一方面，提供了一种制备权利要求1所述的HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子的方法，其特征在于，所述方法包括：（1）培养权利要求4所述的细胞，从而表达权利要求1所述的HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子；（2）分离纯化（1）获得的产物。
本发明的另一方面，提供了权利要求1所述的HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子的用途，其特征在于，用于制备治疗人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤的药物；或用于制备检测人乳头瘤病毒16型病毒感染的检测试剂；或用于制备诊断人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤的诊断试剂。
本发明的另一方面，提供了一种药物组合，其特征在于：包含权利要求1所述的HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子，和该靶向分子的载体。该载体参考中国专利ZL201510028505.3，《对HPV16E7具有结合亲和力的多肽及其用途》中涉及的内容。
本发明的另一方面，提供了一种用于诊断或治疗人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求1所述的HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子，或权利要求7所述的药物组合物。
上述方案中，本发明的HPV16E7亲和体可以特异性靶向HPV16阳性宫颈癌细胞，靶向结合致癌因子E7，封闭致癌通路，同时GrB是一种内源性细胞毒分子，是免疫细胞活化后释放的细胞毒酶分子，应用过程中不存在免疫原性等副作用，其可以发挥细胞毒作用，最终HPV16E7亲和体-GrB （即affibody- GrB）发挥靶向双功能抗宫颈癌效应，即亲合体靶向亲合特性和颗粒酶GrB细胞毒作用的双重优势。
下面结合附图对本发明作进一步描述。
附图说明
附图1A为本发明实施例中重组质粒 pET21a(+)/HPV16E7-GrB亲和毒素鉴定图；其中，M: 标准DNA分子量; 1: pET21a(+)/HPV16E7亲和体质粒; 2: pET21a(+)/HPV16E7-GrB亲和毒素质粒；3: pET21a(+)/Zwt-GrB亲和毒素质粒（对照组）; 4： pET21a(+)/HPV16E7-GrB亲和毒素质粒进行EcoR I和Xho I双酶切; 5: pET21a(+)/Zwt-GrB对照质粒做EcoR I和Xho I双酶切; 6：GrB DNA片段；
附图1B为大肠埃希菌BL21菌株表达产物的SDS-PAGE图；M: 标准蛋白分子量; 1: 大肠埃希菌BL21菌株；2：空载体pET21a(+)质粒转化大肠埃希菌BL21菌株；3-4：重组质粒pET21a(+)/HPV16E7-GrB亲和毒素质粒转化大肠埃希菌BL21菌株；5-6：重组质粒pET21a(+)/Zwt-GrB亲和毒素质粒（对照组）转化大肠埃希菌BL21菌株；
附图1C为Ni-NTA镍离子金属螯合亲和层析柱纯化产物的SDS-PAGE图：3-4：HPV16E7-GrB亲和毒素纯化物；5-6：Zwt-GrB亲和毒素对照纯化物；
附图1D为HPV16E7-GrB亲和毒素体外免疫结合特性鉴定；M: 标准蛋白分子量; 1：HPV16E7-GrB亲和毒素；2：Zwt-GrB亲和毒素。三张膜分别免疫印迹His-单克隆抗体（识别标签蛋白）、Zwt免疫血清（识别亲和体）、GrB免疫血清（识别GrB）；
附图2A 为本发明实施例中 HPV16E7免疫血清检测实验细胞中靶抗原E7；SiHa和TC-1细胞为HPV16阳性细胞、HeLa和A375细胞为HPV16阴性细胞；
附图2B 为本发明实施例中His单克隆抗体识别实验细胞分别与HPV16E7-GrB亲和毒素、Zwt-GrB（亲和毒素对照）共孵育体系中融合蛋白的标签分子；
附图2C为本发明实施例中GrB免疫血清识别实验细胞分别与HPV16E7-GrB亲和毒素、Zwt-GrB（亲和毒素对照）共孵育体系中的GrB分子。
附图3A 为本发明实施例中不同浓度HPV16E7-GrB亲和毒素分别与HPV16阳性细胞SiHa和TC-1共孵育后，CCK-8实验检测细胞生长活力，测得的数据以平均值±标准差表示（n=3），测定到HPV16E7-GrB亲和毒素的 IC50分别为TC-1细胞3.06μM ± 0.34，SiHa细胞2.52μM ± 0.21；
附图3B 为本发明实施例中2.5μM剂量的HPV16E7-GrB亲和毒素、HPV16E7亲和体（不耦联GrB）、ZWT-GrB（野生型亲和毒素）、或ZWT（野生型亲和体，未经过亲和筛选）、等体积的PBS与实验细胞共孵育72 h后，细胞生长活力结果；比较对照组，*p < 0.05；
附图4为本发明实施例C57BL/6小鼠建立TC-1细胞宫颈癌移植瘤模型及鉴定；其中，图A为TC-1细胞移植瘤在小鼠体内随时间的瘤体大小变化；图B为小鼠左下肢后处42天肿瘤体积（小鼠俯卧位），红色圈示肿瘤范围；图C为PCR扩增肿瘤组织中E7致癌基因；M：标准DNA分子量；1：无模板（阴性对照）；2：TC-1细胞中扩增的HPV16E7基因片段（阳性对照）；3：SiHa细胞中扩增的HPV16E7基因片段（阳性对照）；4：肿瘤组织中扩增的HPV16E7基因片段；
附图5为本发明实施例近红外成像验证HPV16E7-GrB亲和毒素体内靶向亲和效应；其中，图A 为亲和毒素标记近红外荧光染料Dylight755的SDS-PAGE图. M：标准蛋白分子量;1：HPV16E7-GrB亲和毒素；2：ZWT-GrB亲和毒素（对照）；3：标记Dylight755的HPV16E7-GrB亲和毒素；4：标记Dylight755的ZWT-GrB亲和毒素；
其中，图B 为肿瘤组织和主要器官中的荧光分布图. TC-1移植瘤小鼠注射Dylight755标记的HPV16E7-GrB亲和毒素、Dylight755标记的ZWT-GrB亲和毒素12h后剥离的肿瘤组织、肾脏、脑、肺、肝、心、脾和胃肠；
其中，图C 注射Dylight755标记的HPV16E7-GrB亲和毒素、Dylight755标记的ZWT-GrB亲和毒素12h后的荧光/背景密度比例，以平均值±标准差（n=5）表示。肿瘤组织中HPV16E7-GrB亲和毒素组的荧光密度比较ZWT-GrB亲和毒素组，p < 0.05，差异具有统计学意义；
附图6A 为肿瘤体积长至200 mm3, HPV16E7-GrB亲和毒素分别以每只小鼠1μg/g、4μg/g、8μg/g的剂量尾静脉给药，不同时间测定肿瘤大小，箭头指示给药时间点；
附图6B为给药33天后，不同剂量组剥离的肿瘤组织；
附图6C为不同剂量组之间肿瘤组织重量比较，PBS组做对照，测定值以平均值±标准差（n=5）表示，*表示与其他各组比较，p < 0.05 ；
附图7 A为肿瘤体积长至200 mm3，每只小鼠以8μg/g的HPV16E7-GrB亲和毒素、ZWT-GrB亲和毒素对照、HPV16E7亲和体、Zwt亲和体对照、等剂量的PBS尾静脉给药，不同时间测定肿瘤大小，箭头指示给药时间点；
附图7B为给药33天，不同组别剥离的肿瘤组织；
附图7C为各组分离的肿瘤组织称重比较，测定值以平均值±标准差（n=5）表示，*表示与其他各组比较，p < 0.05 ；
附图8A本发明实施例 HPV16阳性宫颈癌组织切片中出现深棕色着色，宫颈内瘤变Ш级（CIN-Ш）组织切片比较宫颈癌肿瘤组织出现较少的深棕色染色，宫颈糜烂组织切片无致癌分子E7表达；
附图8B显示了宫颈癌组与CIN-Ⅲ组和宫颈糜烂组比较差异有显著性。
具体实施方式
本发明公开的是HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子及其用途，是在已经亲和筛选到与HPV16E7具有高亲和力特异性亲和体（即：HPV16E7亲和体）的基础上，利用亲合体靶向亲合特性和颗粒酶GrB细胞毒作用的双重优势，设计并制备靶向HPV16E7发挥细胞毒作用的一种亲合毒素。有关于对HPV16E7具有高亲和力特异性亲和体的内容，参考中国专利ZL ZL201510028505.3，授权公告号为： CN105859846B的 《对HPV16E7具有结合亲和力的多肽及其用途》。
本发明的HPV16E7亲和体负载颗粒酶B亲和毒素靶向分子是HPV16E7亲和体；和第201个氨基酸突变后且同时将碱性氨基酸替换为非极性氨基酸后获得的颗粒酶B相连或吸附。
另，统计分析时，采用 SPSS 17.0 软件进行分析，单因素方差分析比较组间差异，两两比较采用独立样本t检验， P<0.05为差异有统计学意义 。
、HPV16E7亲和体的筛选与构建：
基于前期制备好的HPV16E7重组蛋白为靶抗原，从噬菌体展示的亲和体affibody初级库（前期构建）中亲和筛选HPV16E7的亲和体，与标准的野生型亲和体（即SPA-Z，未经亲和筛选的野生型）比对，氨基酸可变区出现氨基酸序列改变后，即获得正确的高亲和力HPV16E7亲和体。亲和体核苷酸序列经原核密码子优化后，生物技术公司全基因合成，构建HPV16亲和体、及未经亲和筛选的野生型SPA-Z（wild type of Z domainant from SPA, Zwt）亲和体的原核表达重组质粒（即，pET21a(+)/HPV16E7亲和体、pET21a(+)/Zwt亲和体对照）。参照affibody基因序列（GenBank：GY324633.1）设计PCR引物，PCR、酶切、测序进行鉴定。
2、HPV16E7亲和体-GrB亲和毒素的构建和制备
从GenBank中获得的GrB氨基酸序列（SEQ ID NO 2），在不改变酶活性的前提下，将第201个氨基酸（精氨酸 R）突变为赖氨酸（K），同时将碱性氨基酸替换为非极性氨基酸，以分别消除蛋白酶抑制剂的抑制和静电的非特异性吸附。改造的GrB核苷酸序列设计带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点进行全基因合成，克隆至本室保存的pET21a(+)/HPV16E7亲和体中，构建融合的HPV16E7亲和体-GrB（即：亲和毒素）重组质粒，同时构建pET21a(+)/Zwt野生型亲和体-GrB（即：亲和毒素对照），PCR、酶切、序列测定。鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)大肠杆菌菌株，IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷）诱导表达，表达产物经SDS-PAGE（Sodium dodecyi sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析确定后，通过Ni-NTA镍离子金属螯合亲和层析柱纯化。纯化产物进行SDS-PAGE后，凝胶上的蛋白转到PVDF膜（polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜）进行Western blot（蛋白质免疫印迹）分析，以融合蛋白的标签His-单克隆抗体、或免疫血清分别识别鉴定。
实验结果：构建的重组质粒pET21a(+)/HPV16E7-GrB亲和毒素、pET21a(+)/Zwt-GrB亲和毒素对照，通过EcoR I和Xho I双酶切均可得到约750 bp大小的目的条带（GrB）（图1A游道4、5）。亲和毒素在大肠埃希菌表达体系中可表达出一个约34 kDa的融合蛋白（亲和体+GrB）（图1B泳道3-4（HPV16E7-GrB亲和毒素）、泳道5-6（野生型亲和毒素对照）），通过镍离子亲和层析柱纯化后可得条带单一的目的蛋白（图1C泳道3-4（HPV16E7-GrB亲和毒素）、5-6（野生型亲和毒素对照））。纯化的HPV16E7-GrB亲和毒素）和野生型亲和毒素Zwt-GrB经过蛋白免疫印迹，分别可以与His单克隆抗体（识别标签分子）、Zwt免疫血清（识别亲和体）、GrB免疫血清（识别GrB）发生特异性结合，显色后均能检测到34kDa单一的信号（图1D）,说明制备的亲和毒素体外具有相应的免疫结合特性。
3、HPV16E7-GrB亲和毒素对宫颈癌细胞的间接免疫荧光检测
选择鼠源性宫颈癌细胞TC-1细胞（HPV16E7+）、宫颈癌Siha细胞（HPV16E7+/HPV18E7-）、宫颈癌Hela 细胞（HPV18E7+/HPV16E7-）、黑色素瘤A-375细胞（HPV阴性对照细胞）为实验细胞株，以2×104 细胞数做细胞爬片后，分别加入终浓度为50μg/ml的HPV16E7-GrB亲和毒素，Zwt-GrB亲和毒素对照，同时设同体积的PBS空白对照，5%CO2培养箱内37℃培养5h，4%多聚甲醛固定细胞10min，洗涤后加入0.3%的Triton x-100 打孔处理10min，洗涤后加入分别加入针对HPV16E7亲和体的免疫兔血清、针对GrB的免疫兔血清、针对融合蛋白标签抗体His-单克隆抗体（所有抗体均做1：2000稀释）孵育1.5 h，洗涤后分别加入FITC荧光标记的相应二抗（1：1000稀释），同时每孔加入10μl荧光染料Hoechst33342，避光条件下37℃孵育1h。洗涤后，加入抗荧光猝灭剂，封片后于荧光显微镜下成像拍照。
实验结果：TC-1细胞（鼠源性的HPV16E7+）、Siha细胞（HPV16E7+/HPV18E7-）、Hela229细胞（HPV18E7+/HPV16E7-，作型别对照细胞）、A-375细胞（人黑色素瘤细胞，作阴性细胞对照），分别以HPV16E7免疫血清为检测抗体验证实验所用细胞中的靶分子E7，间接免疫荧光实验结果显示：TC-1细胞、Siha细胞的胞浆、核周、及核内均有显著的绿色荧光，Hela229、及A-375对照细胞均无HPV16E7表达（图2A），证实本实验所选细胞的可行性。上述细胞分别与HPV16E7-GrB亲和毒素、Zwt-GrB亲和毒素（没有进行靶向亲和筛选的野生型亲和体-GrB）共孵育后，无论以GrB免疫血清、还是His-融合蛋白标签抗体为检测抗体，间接免疫荧光均显示：TC-1细胞、Siha细胞的胞浆、核周、及核内均有显著的绿色荧光，Hela229、A-375对照细胞无相应的绿色荧光（分别见图2B、2C），这部分实验结果证实了HPV16E7亲和体融合GrB后的亲和毒素，其靶向结合特性仍保持不变。
4、HPV16E7-GrB亲和毒素对宫颈癌细胞生长抑制作用
CCK8法检测细胞生长抑制效应。
4.1 半数抑制量
同上选择的实验细胞5×103/孔细胞数铺板后，加入亲和毒素，分别使孔内药物浓度为（12.5μmol/L、6.25μmol/L,3.125μmol/L, 1.56μmol/L，0.78μmol/L, 0.39μmol/L, 0.20μmol/L），培养4h后，每孔加入10μl的CCK8溶液继续再培养4h后，酶标仪波长450nm处测定光吸收度。细胞活力计算按照以下公式计算：
细胞活力*（％）=（给药组-空白组）/（未给药组-空白组）×100 %，计算亲和毒素对靶细胞的半数抑制浓度（IC50）。
实验结果：CCK-8试剂盒检测HPV16E7-GrB亲和毒素对TC-1细胞和Siha细胞生长半数抑制浓度（IC50）分别为3.06μM ± 0.34、2.52μM ± 0.21（图3A），IC50均为5微摩尔以下，显示了作为肿瘤抑制药物应用的可行性。
4.2 亲和毒素对宫颈癌细胞的靶向杀伤
细胞及细胞数同上述4.1，细胞铺板后，分别加入200ug剂量的HPV16E7-GrB亲和毒素，SPA-Z-GrB亲和毒素对照，同时设同体积的PBS空白对照，培养72h后，弃掉培养液，每孔加入10μl的CCK8溶液继续培养4h，酶标仪波长450nm处测定光吸收度，根据上述4.1公式，计算细胞活力，分析各组之间细胞生长抑制作用。
实验结果：以选定2.5μM剂量的HPV16E7-GrB亲和毒素、HPV16E7亲和体（不耦联GrB），Zwt-GrB（野生型亲和毒素），或Zwt（野生型亲和体，未经亲和筛选），或等体积的PBS与实验细胞共孵育72 h后， TC-1细胞（HPV16E7+）中，HPV16E7-GrB亲和毒素与其他实验相比，细胞活力显著下降，统计学分析（p＜0.05），差异具有统计学意义；HPV16E7亲和体比较其对照Zwt，细胞活力也显著下降，（p=0.008，p＜0.05），差异具有统计学意义；更为显著的是HPV16E7-GrB亲和毒素比较HPV16E7亲和体，细胞活力下降明显，（p=0.019，p＜0.05），差异具统计学意义（图3B）。Siha细胞显示了与上述同样的结果（图3B）。对HPV16阴性而18阳性的宫颈癌Hela229细胞株和HPV16/18均阴性的A375细胞，各组之间细胞生长活力均无显著差异，分别与对照组PBS相比，均为p＞0.05，差异无统计学意义（图3B）。
5 、TC-1细胞小鼠宫颈癌移植瘤模型的建立
5.1小鼠肿瘤模型的建立
鼠源性TC-1宫颈癌细胞接种C57BL/6实验小鼠建立肿瘤模型，即，在剔除左下肢毛发小鼠的左下肢大腿根部和腹部的间隙中，皮下注射300ul TC-1细胞悬液（相当于1×106/ml细胞数），接种后每隔2天，用电子游标卡尺测量肿瘤的长径 a、 最短经 b，以公式V=ab2/2计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。
5.2 肿瘤模型的鉴定
PCR 方法检测肿瘤基因，根据 HPV16E7全长的DNA 序列，设计 PCR 引物：
正向引物：5‘ -GGAATTCCATATGCATGGAGATACACCT-3 ’
反向引物：5‘ -CCGCTCGAGTGGTTTCTGAGAACAGA-3 ’。 按照DNA试剂盒说明书提取移植瘤的基因，扩增 HPV16E7全长 DNA 基因，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的基因大小。
实验结果：鼠源性TC-1细胞（3×105）皮下接种于C57BL/6小鼠左下肢后，每隔2天测得肿瘤体积大小绘制生长曲线见（图4A），接种后9天，接种部位出现可触的米粒大小的肿块，30天左右后肿块呈快速增长状态，40天左右肿瘤大小可增长至4897 mm³ ± 432（图4A）。图4B为42天的小鼠肿瘤模型，安乐死处死小鼠取肿瘤组织提取DNA，以HPV16E7特异性引物PCR扩增后，可见300bp大小的HPV16E7的全长基因（图4C泳道4），与TC-1细胞（图4C泳道2）、Siha（图4C泳道3）扩增的HPV16E7基因大小一致，说明TC-1细胞小鼠肿瘤模型构建成功。
6、近红外成像鉴定亲和毒素的靶向结合作用
近红外染料Dylight755与亲和毒素避光混合，4℃过夜，标记好的Dylight755-亲和毒素避光条件下进行SDS-PAGE电泳，切取目的凝胶带，在动物活体成像仪中鉴定荧光，判断标记是否成功。标记成功的Dylight755-亲和毒素，于肿瘤模型小鼠上通过尾静脉注射Dylight755-亲和毒素（每只小鼠140pmol的药量溶解于100ul的PBS），12h时间后，处死小鼠后收集肿瘤组织、及肾脏、大脑、肺、肝脏、心脏、脾脏、胃、小肠主要脏器，依次排序（因为C57BL/6小鼠皮和毛均为黑色，不能做活体小动物体内成像），于动物活体成像仪中鉴定荧光，观察靶向结合效应。
实验结果：HPV16E7-GrB亲和毒素和Zwt-GrB对照亲和毒素分别标记近红外荧光染料Dylight755后，经SDS-PAGE电泳后的凝胶于近红外成像仪器中，可见一条分子量为34kDa大小的红色高亮荧光条带（图5A 泳道3、4），与目的条带一致（图5A 泳道2为纯化的HPV16E7-GrB亲和毒素、泳道3为纯化的Zwt-GrB对照亲和毒素），结果说明亲和毒素成功标记了荧光染料。
荧光染料标记的HPV16E7-GrB亲和毒素和Zwt-GrB对照亲和毒素，分别尾静脉注射TC-1移植瘤小鼠体内12h后，各脏器近红外成像结果显示：虽然HPV16E7-GrB亲和毒素和Zwt-GrB对照亲和毒素组小鼠肾脏部位均有荧光信号，但HPV16E7-GrB亲和毒素组小鼠肿瘤部位可见明显高亮荧光信号，Zwt-GrB对照亲和毒素组肿瘤部位无荧光信号，显示了HPV16E7-GrB亲和毒素的靶向亲和特性显著（图5B）。荧光信号量化后，HPV16E7-GrB亲和毒素组比较Zwt-GrB对照亲和毒素组，肿瘤部位荧光强度差异具有显著统计学意义（p＜0.05），其他部位荧光均无显著性差异（p>0.05）（图5C）。
7、亲和毒素对宫颈癌移植瘤小鼠的治疗
小鼠肿瘤模型建立见方法5.1。
7.1 治疗剂量的确定：制备的亲和毒素通过0.22μm滤膜过滤，调整浓度为500μg/ml，按每只小鼠体重设置1ug/g、4ug/g、8ug/g三个剂量组和相应体积的PBS对照组。待小鼠肿瘤长至体积约为200mm3大小的小肿块时，每隔2天，连续5次尾静脉注射药物治疗。每隔2天电子游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，按上述5.1方法测量和计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线图。治疗后第33天小鼠过量麻醉安乐死后，取出肿瘤称重。统计分析，确定最佳治疗剂量。
7.2 亲和毒素的肿瘤治疗
以上述7.1确定的最佳治疗剂量，待至肿瘤长至200mm3大小时同样尾静脉给药，分别设置亲和毒素（亲和体+毒素）组、亲和体组、亲和毒素对照（野生型亲和体+毒素）组、毒素组、以及PBS对照组，同样每隔2天连续5次给药治疗，同上述方法比较各组对移植瘤小鼠的治疗作用。
实验结果：TC-1移植瘤小鼠肿瘤生长至200mm3时，不同剂量的HPV16E7-GrB亲和毒素给药干预的结果显示：PBS对照组和HPV16E7-GrB亲和毒素给药任何剂量组小鼠肿瘤体积生长均呈时间依赖和剂量依赖关系（图6A），治疗后第33天，8ug/g剂量组肿瘤体积显著低于1ug/g、4ug/g剂量组、和PBS对照组，且差异均具有统计学意义（均为p＜0.01），而其他各组肿瘤体积大小差异无显著统计学意义（p＞0.05）（图6A）。治疗后第33天，取各组小鼠肿瘤组织称重后，肿瘤重量之间的差异同样出现上述结果（图6B，6C）。由此判断：8ug/g剂量对肿瘤具有明显的抑制作用，选做后续治疗剂量。
8、免疫组织化学验证
HPV16 DNA阳性（HPV16+）、HPV18 DNA阳性（HPV18+）、HPV16/18 DNA双阳性（HPV16+/18+）的宫颈癌临床肿瘤组织标本，组织切片、脱腊、水化、固定、抗原修复后，与亲和毒素及各对照组蛋白于37℃分别孵育2hr、洗涤后，分别与His-单克隆抗体（识别融合蛋白的标签分子）、SPA-Z免疫血清（识别亲和体）、GrB免疫血清（识别GrB）37℃孵育2hr后，再加入相应的酶标二抗显色，分析比较各组与肿瘤组织标本中天然E7的免疫结合能力。
实验结果：TC-1细胞移植瘤小鼠肿瘤长至200mm3大小时，以确定的8ug/g剂量开始给药，每隔2天连续5次给药HPV16E7-GrB亲和毒素、Zwt-GrB对照亲和毒素、HPV16E7亲和体、Zwt对照亲和体、以及PBS，每隔2天测的小鼠肿瘤大小结果显示：HPV16E7-GrB亲和毒素组和HPV16E7亲和体组，分别与其他各组比较 ，肿瘤生长显著缓慢，第33天统计结果显示，差异均具有显著统计学意义（p＜0.05），而其他各对照组之间肿瘤大小均无显著统计学差异（p ＞0.05），但HPV16E7-GrB亲和毒素组肿瘤大小明显小于HPV16E7亲和体组，差异具有统计学意义（p＜0.05），结果显示亲和体负载毒素后抑制肿瘤效果更为显著，证实了亲和毒素的重叠效应（即亲和体和颗粒酶B细胞毒的双重作用）（图7A）。
治疗结束后第33天，摘取的各组肿瘤组织重量称量， 各组之间肿瘤重量的差异同样印证了上述结果（图7B、7C）。
9、宫颈癌临床组织标本上验证亲和毒素在的靶向亲和性
由图8A-8B中可看出，ZHPV16E7-GRB染色阳性的E7癌蛋白在宫颈癌组织中的表达明显高于CIN-Ⅲ（宫颈上皮内瘤样病变Ⅲ级）组和宫颈糜烂组（图8A），与CIN-Ⅲ组和宫颈糜烂组比较差异有显著性（P<0.05，图8B）；结果表明，ZHPV16E7-GRB在宫颈癌临床标本中也能识别靶蛋白E7，提示其临床应用的可能性。
本发明不局限于上述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。
<110> 温州医科大学
<120> HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子及其用途
<130> 11
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 683
<212> DNA
<213> “人工序列”
<400> 1
atcatcggtg gtcacgaagc taaaccgcac tctcgtccgt acatggctta cctgatgatc 60
tgggaccaga aatctctgaa acgttgcggt ggtttcctga tccgtgacga cttcgttctg 120
accgctgctc actgctgggg ttcttctatc aacgttaccc tgggtgctca caacatcaaa 180
gaacaggaac cgacccagca gttcatcccg gttaaacgtc cgatcccgca cccggcttac 240
aacccgaaaa acttctctaa cgacatcatg ctgctgcagc tggaagctaa agctaaagct 300
accgctgctg ttcagccgct gcgtctgccg tctaacaaag ctcaggttaa accgggtcag 360
acctgctctg ttgctggttg gggtcagacc gctccgctgg gtaaacactc tcacaccctg 420
caggaagtta aaatgaccgt tcaggaagac cgtaaatgcg aatctgacct gcgtcactac 480
tacgactcta ccatcgaact gtgcgttggt gacccggaaa tcaaaaaaac ctctttcaaa 540
ggtgactctg gtggtccgct ggtttgcaac aaagttgctc agggtatcgt ttcttacggt 600
aaaaacaacg gtatgccgcc gcgtgcttgc accaaagttt cttctttcgt tcactggatc 660
gctgctacca tggctgctta cgg 683
<210> 2
<211> 227
<212> PRT
<213> “人工序列”
<400> 2
Ile Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala
1 5 10 15
Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln Lys Ser Leu Lys Arg Cys Gly Gly Phe
20 25 30
Leu Ile Arg Asp Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Gly Ser
35 40 45
Ser Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Lys Glu Gln Glu Pro
50 55 60
Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val Lys Arg Pro Ile Pro His Pro Ala Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Lys Asn Phe Ser Asn Asp Ile Met Leu Leu Gln Leu Glu Ala
85 90 95
Lys Ala Lys Ala Thr Ala Ala Val Gln Pro Leu Arg Leu Pro Ser Asn
100 105 110
Lys Ala Gln Val Lys Pro Gly Gln Thr Cys Ser Val Ala Gly Trp Gly
115 120 125
Gln Thr Ala Pro Leu Gly Lys His Ser His Thr Leu Gln Glu Val Lys
130 135 140
Met Thr Val Gln Glu Asp Arg Lys Cys Glu Ser Asp Leu Arg His Tyr
145 150 155 160
Tyr Asp Ser Thr Ile Glu Leu Cys Val Gly Asp Pro Glu Ile Lys Lys
165 170 175
Thr Ser Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Lys Val
180 185 190
Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Lys Asn Asn Gly Met Pro Pro Arg
195 200 205
Ala Cys Thr Lys Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile Ala Ala Thr Met
210 215 220
Ala Ala Tyr
225
<210> 3
<211> 914
<212> DNA
<213> “人工序列”
<400> 3
catatggttg acaacaaatt caacaaagaa tggctctggg cttcgatgga aatcctcacg 60
ctgccgaacc tgaacgacca ccaggccctc gctttcatcg aatctctgca agacgacccg 120
tctcagtctg ctgagctcct ggctgaagct aaaaaactga acgacgctca ggctccgaaa 180
ctcgagggtg gaggaggctc tggtggaggc ggtagcggag gcggagggtc gatcatcggt 240
ggtcacgaag ctaaaccgca ctctcgtccg tacatggctt acctgatgat ctgggaccag 300
aaatctctga aacgttgcgg tggtttcctg atccgtgacg acttcgttct gaccgctgct 360
cactgctggg gttcttctat caacgttacc ctgggtgctc acaacatcaa agaacaggaa 420
ccgacccagc agttcatccc ggttaaacgt ccgatcccgc acccggctta caacccgaaa 480
aacttctcta acgacatcat gctgctgcag ctggaagcta aagctaaagc taccgctgct 540
gttcagccgc tgcgtctgcc gtctaacaaa gctcaggtta aaccgggtca gacctgctct 600
gttgctggtt ggggtcagac cgctccgctg ggtaaacact ctcacaccct gcaggaagtt 660
aaaatgaccg ttcaggaaga ccgtaaatgc gaatctgacc tgcgtcacta ctacgactct 720
accatcgaac tgtgcgttgg tgacccggaa atcaaaaaaa cctctttcaa aggtgactct 780
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atggctgctt acgg 914
<210> 4
<211> 304
<212> PRT
<213> “人工序列”
<400> 4
His Met Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Leu Trp Ala Ser Met
1 5 10 15
Glu Ile Leu Thr Leu Pro Asn Leu Asn Asp His Gln Ala Leu Ala Phe
20 25 30
Ile Glu Ser Leu Gln Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala
35 40 45
Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Leu Glu Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Ile Gly
65 70 75 80
Gly His Glu Ala Lys Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Met
85 90 95
Ile Trp Asp Gln Lys Ser Leu Lys Arg Cys Gly Gly Phe Leu Ile Arg
100 105 110
Asp Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Gly Ser Ser Ile Asn
115 120 125
Val Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Lys Glu Gln Glu Pro Thr Gln Gln
130 135 140
Phe Ile Pro Val Lys Arg Pro Ile Pro His Pro Ala Tyr Asn Pro Lys
145 150 155 160
Asn Phe Ser Asn Asp Ile Met Leu Leu Gln Leu Glu Ala Lys Ala Lys
165 170 175
Ala Thr Ala Ala Val Gln Pro Leu Arg Leu Pro Ser Asn Lys Ala Gln
180 185 190
Val Lys Pro Gly Gln Thr Cys Ser Val Ala Gly Trp Gly Gln Thr Ala
195 200 205
Pro Leu Gly Lys His Ser His Thr Leu Gln Glu Val Lys Met Thr Val
210 215 220
Gln Glu Asp Arg Lys Cys Glu Ser Asp Leu Arg His Tyr Tyr Asp Ser
225 230 235 240
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245 250 255
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Lys Val Ala Gln Gly
260 265 270
Ile Val Ser Tyr Gly Lys Asn Asn Gly Met Pro Pro Arg Ala Cys Thr
275 280 285
Lys Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile Ala Ala Thr Met Ala Ala Tyr
290 295 300

Claims (8)

1.一种HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子，其特征在于：包括HPV16E7亲和体和颗粒酶B，HPV16E7亲和体与颗粒酶B之间以柔性肽G4S连接，且该颗粒酶B是进行第201个氨基酸突变，同时将碱性氨基酸替换为非极性氨基酸后获得的颗粒酶B，该颗粒酶B的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示序列。
2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子，该多核苷酸带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点。
3.一种重组载体，其特征在于：包含权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种宿主细胞，其特征在于：宿主细胞包含权利要求3所述的重组载体，或其包含有货基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
5.一种制备权利要求1所述的HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子的方法，其特征在于，所述方法包括：（1）培养权利要求4所述的细胞，从而表达权利要求1所述的HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子；（2）分离纯化（1）获得的产物。
6.权利要求1所述的HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子的用途，其特征在于，用于制备治疗人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤的药物；或用于制备检测人乳头瘤病毒16型病毒感染的检测试剂；或用于制备诊断人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤的诊断试剂。
7.一种药物组合，其特征在于：包含权利要求1所述的HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子，和该靶向分子的载体。
8.一种用于诊断或治疗人乳头瘤病毒16型感染疾病或人乳头瘤病毒16型表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求1所述的HPV16E7亲和体负载颗粒酶B的亲和毒素靶向分子，或权利要求7所述的药物组合物。
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