KR20200136849A - 글루타치온-ｓ-전이효소 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 글루타치온 전구체 약물의 전달체 및 이의 용도 - Google Patents

글루타치온-ｓ-전이효소 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 글루타치온 전구체 약물의 전달체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

글루타치온-Ｓ-전이효소 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 글루타치온 전구체 약물의 전달체 및 약학적 조성물로서의 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 글루타치온 전구체 약물의 전달체에 의하면, 생체 내 잔존 시간을 지속시킬 수 있을 뿐 아니라, 표적 세포로의 표적능이 향상되어 타겟으로 하는 세포로 효과적으로 전달될 수 있으므로, 표적 치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

글루타치온-Ｓ-전이효소 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 글루타치온 전구체 약물의 전달체 및 이의 용도{Transporters of glutathione precursor drugs including glutathione-S-transferase and proteins having the ability to bind target cells or target proteins and uses thereof}
글루타치온-Ｓ-전이효소 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 글루타치온 전구체 약물의 전달체 및 약학적 조성물로서의 용도에 관한 것이다.
현재 알려져 있는 항암제의 종류는 화학항암제, 표적항암제, 면역항암제 등이 있다.
화학항암제는 세포독성항암제, 화학약물항암제로도 불린다. 다른 항암제가 부작용이 없는 것은 아니지만, 세간에 흔히 알려진 항암치료 부작용인 백혈구 감소, 탈모, 구토중세, 설사 등은 대개 1세대 항암제인 화학항암제가 그 주범이다. 화학항암제를 쓴다고 모든 정상세포를 파괴되는 건 아니다. 주로 증식 속도가 빠른 골수의 조혈모세포, 모근세포, 음식물이 통과하는 구강 및 장내 점막, 생식기관 등에 영향을 준다. 화악항암제는 단기간에 증식하는 암세포의 특성을 찾아 공격하도록 설계되어있기 때문이다.
대부분 정상세포는 화학항암제를 사용한 치료가 끝난 뒤 시간이 지나면 회복된다. 2~4주 간격을 두고 항암치료를 시행하는 것은 정상세포가 회복할 시간을 주는 것이다. 하지만 손발저림과 같은 말초신경독성은 완전히 회복되기까지 몇 년까지 걸릴 수도 있다고 의료계는 경고한다. 또 화학항암제로 인해 심장, 폐, 콩팥, 생식기관에 손상이 발생하면 영구적으로 지속될 수도 있다.
최근에는 표적 치료제가 활발히 개발되고 있는데 암세포가 가진 특정 마커만을 판별하여 공격하기 때문에 정상 세포를 건드리지 않고, 암세포 살상력도 몇 배나 뛰어나다. 만성 골수성 백혈병 환자들의 희망이나 다름없는 글리벡이 그 대표적인 예이다. 현실적으로 정상세포, 암세포 가리지 않고 죽여버리는 전통적인 고식적 항암제의 경우에는 이미 그 효과를 더욱 끌어올리거나 부작용을 줄일 수 있는 여지가 거의 한도에 다다랐기 때문에 이러한 표적치료제의 개발이 의학의 발전에 큰 화두가 되고 있다. 다만 표적치료제도 효과가 좋은 환자군은 한정되어 있고, 내성에 취약하며, 높은 가격대에 비해 실효능이 떨어진다는 치명적인 단점이 있어 한계점이 뚜렷하다.
화학항암제와 표적치료제의 단점을 개선한 면역항암제의 경우, CAR-T세포 치료요법이 두각을 드러내고 있다. CAR-T세포 치료요법이란 환자에게서 추출한 T 세포에 인위적으로 설계한 유전자를 삽입해, 재프로그래밍된 T세포가 암세포를 공격하게끔 유도하는 방식을 말한다. CAR-T 치료요법의 경우 항암제가 잘 듣지 않는 난치암 환자에게서 높은 치료 효과를 보이나, 독성이 매우 강력하고 부작용으로 사이토카인 방출 증후군(Cytokine Release Syndrome)이 나타날 경우 환자가 사망하는 사례가 많아 불안정한 점이 많다. 또한 1회 투여비용이 미국 기준으로 1억 5천만에 달하며, 고형암에는 치료효과가 크지 않다.
따라서, 현재 항암제의 단점을 보안할 수 있는 약물의 개발이 계속되고 있다.
일 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 글루타치온 전구체 약물을 함유하는 약물 전달체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 글루타치온 전구체 약물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 글루타치온 전구체 약물을 함유하는 약물 전달체를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질", "표적세포 인식능을 갖는 단백질", 또는 "표적 세포 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질"은 세포의 수용체 또는 표적 단백질을 특이적으로 인식하는 또는 세포의 수용체 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포의 수용체 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질은 항체, 항원 결합 단편, 애피바디(affibody), 다이아바디(diabody) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "애피바디 분자(affibody molecule)"는 특정 타겟 단백질(수용체)에 결합할 수 있는, 항체 모사체를 의미할 수 있다. 일반적으로 애피바디 분자는 20 내지 150의 아미노산 잔기로 구성되며, 2 내지 10개의 알파 헬릭스로 구성된 것일 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 애피바디 분자는 항-ErbB 애피바디 분자(ab31889), HER2-특이적 애피바디 분자(ZHER2:342), 항-EGFR 애피바디 분자(ZEGFR:2377) 등을 포함할 수 있다. 또한, 이에 한정되지 않고, 세포의 특정 수용체 또는 표적 단백질을 인식할 수 있는 애피바디 분자를 모두 포함한다. 상기 애피바디 분자가 인식할 수 있는 표적 수용체 또는 표적 단백질의 예는, 아밀로이드 베타 펩티드, 시누클레인(예를 들면, 알파-시누클레인), 아포리포프로테인(예를 들면, 아포리포프로테인 A1), 보체 인자(Complement factor)(예를 들면, C5), 탄산무수화효소(Carbonic anhydrase)(예를 들면, CAIX), 인터루킨-2 수용체 알파 사슬(IL2RA; CD25), 세포 표면의 CD 항원(예를 들면, CD28), 또는 c-Jun, Factor VIII, 프비르노겐, GP120, H-Ras, Her2, Her3, HPV16 E7, IAPP(Human islet amyloid polypeptide), 이뮤노글로불린 A(IgA), IgE, IgM, 인터루킨(예를 들면, IL-1, IL-6, IL-8, IL-17), 인슐린, 스타필로코커스 단백질 A 도메인(Staphylococcal protein A domain), Raf-1, LOV 도메인(Light-oxygen-voltage-sensing domain), 또는 RSV G 단백질일 수 있다. 상기 애피바디에 대한 정보는 Stefan Stahl et al., Affibody Molecules in Biotechnological and Medical Applications, Trends in Biotechnology, August 2017, Vol 35, No 8에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본 명세서에서 포함된다.
상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor tyrosine kinases: RTKs)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 수용체 타이로신 카이네이즈는 표피 성장인자 수용체, 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장인자 수용체, 혈관내피 성장인자 수용체, 섬유아세포 성장인자 수용체, 콜레시스토키닌(Cholecystokinin: CCK) 수용체, 신경영양인자(Neurotrophic factor: NGF) 수용체, 간세포 성장인자 (Hepatocyte growth factor: HGF) 수용체, 에프린(Ephrin: Eph) 수용체, 안지오포이에틴 수용체, 및 RYK(related to receptor tyrosine kinase) 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 GST 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 링커를 통해 연결되어 있을 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는, 1 내지 400개, 1 내지 200개, 또는 2 내지 200개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 또한 기능적 일부분 사이의 적절한 분리를 달성하기 위하여 또는 필수적인 내부-일부분(inter-moiety)의 상호작용을 유지하기 위한　링커의 최적화를 고려하여 카피 수 "n"을 조절할 수 있다. 해당 기술분야에서 다른 가요성　링커들이 알려져 있는데, 예를 들어 수용성을 향상시키기 위하여 극성 아미노산 잔기를 추가하는 것뿐만 아니라 유연성을 유지하기 위하여 T 및 A와 같은 아미노산 잔기를 추가한 G 및 S　링커가 있을 수 있다. 따라서 일 구체예에 있어서, 상기　링커는 G, S, 및/또는 T 잔기를 포함하는 유연성　링커일 수 있다. 상기　링커는 (GpSs)n 및 (SpGs)n으로부터 선택되는 일반식을 가질 수 있고, 이 경우, 독립적으로, p는 1 내지 10의 정수이고, s = 0 내지 10의 0 또는 정수이고, p + s는 20 이하의 정수이고, 및 n은 1 내지 20의 정수이다. 더욱 구체적으로 링커의 예는 (GGGGS)n (서열번호 2), (SGGGG)n　(서열번호 3), (SRSSG)n (서열번호 4), (SGSSC)n (서열번호 5), (GKSSGSGSESKS)n (서열번호 6), (RPPPPC)n (서열번호 7), (SSPPPPC)n (서열번호 8),　 (GSTSGSGKSSEGKG)n (서열번호 9), (GSTSGSGKSSEGSGSTKG)n (서열번호 10),　(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)n　(서열번호 11), 또는 (EGKSSGSGSESKEF)n (서열번호 12)이고, 상기 n은 1 내지 20, 또는 1 내지 10의 정수이다.
또 다른 양상은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 자연의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 당 또는 염기 부위가 변형된 그의 유사체(analogue)도 포함한다. 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 단쇄 폴리뉴클레오티드이다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 지칭한다. 일 실시예에 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 상기 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 벡터를 함유 하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우, 복제 기원을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 도입될 수 있으며, 상기 벡터는 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 배시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 벡터는 동물세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터를 포함한다. 일 실시예에 따라 적합한 프로모터는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, U6 프로모터 및 H1 프로모터, MLV(Murine Leukemia Virus) LTR(Long terminal repeat) 프로모터, 아데노바이러스 초기 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 마우스 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터 및 설바이빈 (Survivin) 프로모터를 포함할 수 있다.
또한, 상기 벡터에서, 전술한 융합 단백질은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
또 다른 양상은 상기 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터를 포함하는, 숙주 세포를 제공한다.
상기 세포, 예를 들면, 진핵 세포는 효모, 곰팡이, 원생동물 (protozoa), 식물, 고등 식물 및 곤충, 또는 양서류의 세포, 또는 CHO, HeLa, HEK293, 및 COS-1과 같은 포유 동물의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는, 배양된 세포 (인 비트로), 이식된 세포 (graft cell) 및 일차 세포 배양 (인 비트로 및 엑스 비보(ex vivo)), 및 인 비보 (in vivo) 세포, 및 또한 인간을 포함하는 포유동물의 세포 (mammalian cell)일 수 있다. 또한, 상기 유기체는 효모, 곰팡이, 원생동물, 식물, 고등 식물 및 곤충, 양서류, 또는 포유 동물일 수 있다. 또한, 상기 세포는 동물 세포 또는 식물세포일 수 있다.
또한, 상기 글루타치온-S-전이효소와 글루타치온 전구체 약물의 결합은 GSH(Glutathione)에 의한 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 글루타치온 전구체 약물은 하기 화학식 1 내지 화학식 7 중 어느 하나 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 글루타치온 전구체 약물은 글루타치온을 포함하고 있어서, 상기와 같이 글루타치온-S-전이효소와 결합되는 것일 수 있다.
Figure pat00001
[화학식 1]
Figure pat00002
[화학식 2]
Figure pat00003
[화학식 3]
Figure pat00004
[화학식 4]
Figure pat00005
[화학식 5]
Figure pat00006
[화학식 6]
Figure pat00007
[화학식 7]
다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 글루타치온 전구체 약물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 글루타치온 전구체 약물은 화학식1 내지 화학식 7 중 어느 하나 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST), 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질, 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 글루타치온 전구체 약물에 대해서는 상기한 바와 같다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 포유동물은 쥣과, 원숭이, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완동물을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 생체내에서 수득되거나 시험관내에서 배양된 생물학적 엔티티(entity)의 조직, 세포 및 그들의 자손도 또한 포함된다.
용어 "치료제" 또는 "약학적 조성물"는, 대상체로의 투여 시에 몇몇 유리한 효과를 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭한다. 유리한 효과는 진단적 결정을 가능하게 하는 것; 질병, 증상, 장애 또는 병태의 개선; 질병, 증상, 장애 또는 질환의 발병의 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질병, 증상, 장애 또는 병태의 대응을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화하는" 또는 "개선하는"은 상호교환가능하게 사용된다. 이들 용어는 치료 이익 및/또는 예방 이익을 포함하나 이들에 한정되지 않는 유리한 또는 요망되는 결과를 수득하는 방법을 지칭한다. 치료 이익은 치료 하의 하나 이상의 질병, 질환 또는 증상의 임의의 치료적으로 유의미한 개선 또는 그에 대한 효과를 의미한다. 예방 이익에 있어서, 조성물은 특정 질병, 질환 또는 증상이 발생할 위험이 있는 대상체에게 또는 질병, 질환 또는 증상이 아직 나타나지 않을지라도, 질병의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 유리한 또는 요망되는 결과를 야기하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 치료되는 대상체 및 병태, 대상체의 체중 및 연령, 병태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 용어는 본원에 기술된 영상화 방법 중 임의의 것에 의한 검출을 위한 이미지를 제공할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 작용제, 뒤따르는 투여 요법, 그것이 다른 화합물과 병용하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 영상화되는 조직 및 그것을 운반하는 신체 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
상기 암은 폐암(예를 들면, 비소세포성 폐암), 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 또는 자궁암일 수 있다. 또한, 상기 암은 항암제에 대한 내성(예를 들면, 다제 내성)을 갖는 위암, 유방암, 폐암, 간암, 식도암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(Nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(Carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(Ascorbic acid) 또는 글루타치온(Glutathione)과 같은 항산화제(Antioxidants), 킬레이트화제(Chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(Stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 유효용량은 0.01 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.
또 다른 양상은 하기 i) 내지 iii) 단계를 포함하는, 약물 전달체의 제조 방법을 제공한다:
i) 약물에 링커(예를 들면, GSH)를 결합시키는 단계; ii) 상기 단계 i)에서 링커와 결합된 약물 표면에 GST 융합 단백질을 결합시키는 단계.
일 양상에 따른 글루타치온 전구체 약물의 전달체에 의하면, 생체 내 잔존 시간을 지속시킬 수 있을 뿐 아니라, 표적 세포로의 표적능이 향상되어 타겟으로 하는 세포로 효과적으로 전달될 수 있으므로, 표적 치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 GST-Afb 융합 단백질의 세포 독성 및 세포 표적능을 확인한 결과이다:
도 1a는 GST-Afb 융합 단백질이 Afb 표적 세포에 대하여 세포 생존율을 저하시키지 않음을 확인한 결과이고; 및 도 1b는 GST-Afb 융합 단백질이 Afb 표적 세포에 대하여 나타내는 세포 표적능을 확인한 결과이다.
도 2는 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 2의 합성을 도식화 한 것이다.
도 3은 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 3의 합성을 도식화 한 것이다.
도 4는 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 5의 합성을 도식화 한 것이다.
도 5는 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 7의 합성을 도식화 한 것이다.
도 6은 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 9의 합성을 도식화 한 것이다.
도 7은 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 11의 합성을 도식화 한 것이다.
도 8은 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 12의 합성을 도식화 한 것이다.
도 9는 엔트리 2가 융합단백질에 결합하는 경우 결합 친화도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 엔트리 3이 융합단백질에 결합하는 경우 결합 친화도를 나타낸 그래프이다.
도 11은 엔트리 5가 융합단백질에 결합하는 경우 결합 친화도를 나타낸 그래프이다.
도 12는 엔트리 2,3,5,7,9,11 및 12가 융합단백질에 결합하는 경우 결합 친화도 값을 나타낸 표이다.
도 13은 융합단백질과 엔트리 2가 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 14는 융합단백질과 엔트리 3이 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 15는 융합단백질과 엔트리 5가 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 16은 융합단백질과 엔트리 7이 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 17은 융합단백질과 엔트리 9가 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 18은 융합단백질과 엔트리 11이 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 19는 융합단백질과 엔트리 12가 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 20은 융합단백질과 엔트리 2,3,5,7,9,11 및 12가 결합된 복합체의 세포 독성을 나타내는 IC50 값을 나타낸 표이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 글루타치온-S-전이효소 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 융합 단백질의 발현
<1-1> 애피바디(affibody) 및 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 융합 단백질의 제조
본 발명에서는 약물 전달체로 사용하기 위한 생체 내 환경에서도 안정성 및 표적능이 향상된 약물 전달체를 제조하고자 하였다. 이를 위해, 먼저 표적능을 갖는 융합 단백질(fusion protein)을 제조하였다. 융합 단백질은 암세포 표면의 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 애피바디(affibody, Afb)와 GST가 결합된 형태가 되도록 발현하였다.
구체적으로, 본 발명에서는 Afb로서 HER2에 특이적으로 결합하는 HER2 Afb 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 EGFR Afb를 사용하였다. 각각의 HER2 Afb 또는 EGFR Afb를 암호화하는 유전자의 말단에 추가 링커 도메인(서열번호 1: GGGLVPRGSGGGCGGGGTGGGSGGG)을 암호화하는 유전자를 결합시킨 다음, pETduet 플라스미드에 삽입하였다. 또한, GST 과발현을 위해서 GST의 N-말단에 6ХHis 태그가 연결되도록 디자인한 GST 암호화 유전자를 상기 pETduet 플라스미드에 삽입하여, Afb와 GST가 링커로 연결된 융합 단백질(GST-Afb)의 과발현을 위한 플라스미드를 구축하였다. 구축된 플라스미드에서 PCR 및 DNA 서열분석을 통해 GST-Afb 암호화 서열이 정상적으로 삽입되었는지 확인하였다. 그런 다음, 구축된 플라스미드를 E. coli BL21(DE3) 균주에 삽입하여 배양한 다음, IPTG를 처리하고 30 ℃에서 16 시간 동안 배양하여 GST-Afb의 과발현을 유도하였다. 과발현 유도된 E. coli 세포는 5000Хg로 4 ℃에서 10 분간 원심분리하여 침전된 세포를 수득하고, 인산염 완충용액(50 mM 인산 나트륨 및 100 mM 염화 나트륨, pH 6.5)에 세포를 현탁하였다. 세포 현탁액에 리소자임(lysozyme)을 처리하고 20 분간 실온에서 배양한 다음, 30 초 파쇄 및 1 분 간격으로 총 10 분간 초음파 파쇄하였다. 파쇄 후, 12000Хg로 4 ℃에서 1 시간 동안 원심분리하여 상층액을 GST-Afb 포함 분획으로서 수득하였다. 상층액은 FPLC를 이용한 금속이온 친화 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography; 1mL HisTrap FF 컬럼, GE HealthCare)로 정제하여 GST-Afb을 분리 하였다. 분리한 GST-Afb(GST-HER2 Afb 및 GST-EGFR Afb는 PBS(pH 7.4)에서 밤새도록 투석하여 농축하였다. 농축한 GST-HER2 Afb 및 GST-EGFR Afb는, SDS-PAGE 분석 및 ESI-TOF MS(electrospray ionization time-of-light mass spectrometry) 분석을 통해 분리한 단백질의 순도 및 분자량을 분석하였다.
<1-2> GST-Afb 융합 단백질의 세포 독성 및 세포 표적능 확인
본 발명에서 발현한 GST-Afb 융합 단백질을 약물 전달체로서 적용할 수 있는지 확인하기 위해 세포 독성 및 세포내 흡수능을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 먼저 GST-HER2 Afb를 대상으로 세포 독성 여부를 확인하기 위해 인간 유방암 세포주인 SK-BR-3 세포를 준비하였다. 준비한 SK-BR-3 세포는 DMEM 배지(11995065, Invitrogen, S.Korea)에서 배양하였다. 배지에는 10% 우태아혈청(FBS), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 페니실린을 첨가하였고, 배양 기간 중에는 배지를 매일 한번씩 교체하였다. 배양 환경은 37 ℃의 5% CO2 배양기로 유지하였다. 세포 접종 후 세포가 85% 포화도로 증식되면, 부착 배양된 세포를 분리하여 실험에 사용하였다. SK-BR-3 세포를 분리하여, 96 웰 플레이트(Thermo Scientific Inc. Korea)에 5Х103 세포/웰의 농도로 각각의 세포를 접종하고 37 ℃의 5% CO2 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 GST-HER2 Afb를 0.3 μM 내지 10 μM의 농도로 SK-BR-3 세포에 처리하고 24 시간 동안 추가 배양하였다. 배양 종료 후, 알라마르 블루 염색약(alamar blue dye; DAL 2015, Invitrogen, Korea)을 사용하여 세포 생존률을 확인하였다. 세포 생존률을 확인하기 위해 형광 염료에 대한 여기 파장(excitation wavelength)을 565 ㎚로 설정하였으며 이에 따른 방출 파장(monitoring emission)을 590 ㎚로 설정하여 형광 플레이트 리더기(Tecan Infinite Series, Germany)로 형광 분석하였다. 또한, GST-HER2 Afb 중 GST를 형광-5-말레이미드(fluorescein-5-maleimide, F5M)로 표지하여 세포 내로 흡수(cell uptake)된 GST-HER2 Afb의 위치를 확인하였다. 음성 대조군으로서는 정상 상피 세포주인 MCF-10A 세포를 사용하여 동일한 방법을 수행하여 세포 생존률 및 세포 내 흡수 정도를 확인하였다.
이와 함께, GST-Afb에서 GSH와 표적 수용체 간의 상호작용을 실시간으로 확인하기 위해 수정진동자저울(Quartz Crystal Microbalance, QCM) 및 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 GST-HER2 Afb가 세포에 대하여는 독성을 나타내지 않으나, 암 세포 특이적으로 흡수될 수 있음을 확인하였다. GST-HER2 Afb를 SK-BR-3 세포 및 MCF-10A 세포에 처리하여 배양하였을 때 처리 농도와는 관계없이 세포 사멸 정도를 나타내지 않아 GST-Afb에 의해 세포 독성을 나타내지 않음을 확인한 반면(도 1a), GST-HER2 Afb는 유방암 세포주인 SK-BR-3 세포에만 결합하는 결합능을 나타내어 GST-Afb가 암세포 특이적인 표적능을 나타내는 것으로 확인하였다(도 1b). 이를 통해, 본 발명에서 단백질 코로나 외층으로 사용하기 위해 발현한 GST-Afb 융합 단백질은 정상 세포에 대하여 독성을 나타내지 않고 암 세포에 대한 표적능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 글루타치온 전구체 약물의 합성
본 발명의 글루타치온 전구체 약물의 합성은 도 2 내지 도 8과 같은 scheme으로 제작하였다. 하기 기재된 엔트리는 글푸타치온 전구체 약물을 의미한다.
구체적으로, 먼저 엔트리(entry) 1인 2-브로모에틸 비스(2-클로로에틸)카바메이트 (2-bromoethyl bis(2-chloroethyl)carbamate)의 합성은 비트(2-클로로에틸)아민 (Bis(2-chloroethyl)amine) (20 mg, 0.1408 mmol)과 수산화 나트륨 (Sodium hydroxide) (8.448 mg, 0.2112 mmol)을 먼저 메틸 클로라이드 (methyl chloride) 5mL에 섞은 후, 2-브로모에틸 카보노클로라이데이트 (2-bromoethyl carbonochloridate) (26.39 mg, 0.1408 mmol) 을 첨가하였다.
엔트리 2인 15-아미노-10-((카복시메틸)카바모일)-1-클로로-3-(2-클로로에틸)-4,12-디옥소-5-옥사-8-티아-3,11-디아자헥사데칸-16-온 산 (15-amino-10-((carboxymethyl)carbamoyl)-1-chloro-3-(2-chloroethyl)-4,12-dioxo-5-oxa-8-thia-3,11-diazahexadecan-16-oic acid)의 합성은 2-브로모에틸 비스(2-클로로에틸)카바메이트 (2-bromoethyl bis(2-chloroethyl)carbamate) (10 mg, 0.034 mmol)을 pH 7.4 PBS 용액에 넣은 후, PBS에 녹은 GSH ((glutathione), 7.683 mg, 0.025mmol)을 한방울씩 첨가하며 실온에서 24시간 교반하였다. 그 후 HPLC 과정을 통하여 분리하였다.
엔트리 3은 시스플라틴 (Cisplatin) (10mg, 0.0333 mmol) 을 GSH ((glutathione), 15mg, 0.05mmol) pH 7.4 PBS 용액에 섞고 실온에서 24시간 반응후, HPLC 과정을 통하여 분리하였다.
엔트리 4인 2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸 ((2S,3R,4S,6R)-6-(((1S,3S)-3-아세틸-3,5,12-트리히드록시-10-메톡시-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사히드로테트라센-1-일)옥시)-3-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-4-일)카바메이트 (2-(pyridin-2-yldisulfaneyl)ethyl ((2S,3R,4S,6R)-6-(((1S,3S)-3-acetyl-3,5,12-trihydroxy-10-methoxy-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahydrotetracen-1-yl)oxy)-3-hydroxy-2-methyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)carbamate)는 4-니트로페닐 (2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸)카보네이트 (4-nitrophenyl (2-(pyridine-2-yldisulfaneyl)ethyl)carbonate) (20 mg, 0.0568 mmol)과 DMAP (18.52 mg, 0.1516 mmol)을 건조 메틸 클로라이드 (Dry methyl chloride) 7mL에 녹인 후 다우노루비신 (Daunorubicin) (20 mg, 0.079 mmol) 을 첨가 후 24시간 동안 환류시켰다. 메탄올로 DMAP을 세척한 후 컬럼크로마토그래피를 통하여 분리하였다.
엔트리 5인 N5-(3-((2-((((2S,3R,4S,6R)-6-(((1S,3S)-3-아세틸-3,5,12-트리히드록시-10-메톡시-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사히드로테트라센-1-일)옥시)-3-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-4-일)카바모일)옥시)에틸)디술파닐)-1-((카복시메틸)아미노)-1-옥소프로판-2-일)글루타민 (N5-(3-((2-((((2S,3R,4S,6R)-6-(((1S,3S)-3-acetyl-3,5,12-trihydroxy-10-methoxy-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahydrotetracen-1-yl)oxy)-3-hydroxy-2-methyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)carbamoyl)oxy)ethyl)disulfaneyl)-1-((carboxymethyl)amino)-1-oxopropan-2-yl)glutamine)은 2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸 ((2S,3R,4S,6R)-6-(((1S,3S)-3-아세틸-3,5,12-트리히드록시-10-메톡시-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사히드로테트라센-1-일)옥시)-3-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-4-일)카바메이트 (2-(pyridin-2-yldisulfaneyl)ethyl ((2S,3R,4S,6R)-6-(((1S,3S)-3-acetyl-3,5,12-trihydroxy-10-methoxy-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahydrotetracen-1-yl)oxy)-3-hydroxy-2-methyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)carbamate) (15 mg, 0.02 mmol)을 Di water : MeOH 1:1 5mL에 녹인 후 글루타치온 (glutathione) (5.194 mg, 0.0169 mmol)을 한 방울씩 첨가하며 0 ℃에서 24시간 교반하였다. 그 후 HPLC 과정을 통하여 분리하였다.
엔트리 6인 (5-플루오로-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)메틸 (2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸) 카보네이트 ((5-fluoro-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)methyl (2-(pyridin-2-yldisulfaneyl)ethyl) carbonate)는 4-니트로페닐 (2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸)카보네이트 (4-nitrophenyl (2-(pyridine-2-yldisulfaneyl)ethyl)carbonate) (50 mg, 0.142 mmol)과 DMAP (46.23 mg, 0.3784 mmol)을 건조 DCM 15mL에 녹인 후 5-플루오로-1-(히드록시메틸)피리미딘-2,4-디온 (5-fluoro-1-(hydroxymethyl)pyrimidine-2,4-dione) (15.15 mg, 0.0946 mmol) 을 첨가 후 16시간 동안 실온에서 반응을 진행하였다. 메탄올로 DMAP을 세척한 후 DCM, 증류수로 추출한 후 MgSO4로 건조시킨 후 컬럼크로마토그래피를 통하여 분리하였다.
엔트리 7인 15-아미노-10-((카복시메틸)카바모일)-1-(5-플루오로-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-3,12-디옥소-2,4-디옥사-7,8-디티아-11-아자헥사데칸-16-온산 (15-amino-10-((carboxymethyl)carbamoyl)-1-(5-fluoro-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-3,12-dioxo-2,4-dioxa-7,8-dithia-11-azahexadecan-16-oic acid)은 5-fluoro-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidinyl methyl (2-(pyridine-2-yldisulfaneyl)ethyl) 카보네이트 (carbonate) (20 mg, 0.0536 mmol)를 용매 (Di water : MeOH = 1:1) 10mL에 녹인 후 글루타치온 (13.74 mg, 0.0447 mmol)을 한방울씩 첨가하며 0 ℃에서 12시간 반응 후 HPLC 과정을 통하여 분리하였다.
엔트리 8인 (5-(4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4,4-디플루오로-3-히드록시테트라히드로푸란-2-일)메틸 (2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸) 카보네이트 ((5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl)-4,4-difluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl (2-(pyridin-2-yldisulfaneyl)ethyl) carbonate)는 4-니트로페닐 (2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸)카보네이트 ((4-nitrophenyl (2-(pyridine-2-yldisulfaneyl)ethyl)carbonate) (30 mg, 0.0851 mmol)과 DMAP (15.64 mg, 0.128 mmol)을 건조 DCM 15mL에 녹인 후 젬시타빈 (11.21 mg, 0.0426 mmol) 을 첨가 후 12시간 동안 실온에서 반응을 진행하였다. 테트라클로로메탄 (Tetrachloromethane)을 이용하여 재결정화시킨 후 감압필터를 이용하여 분리한 후 NMR로 확인하였다.
엔트리 9인 15-아미노-1-(5-(4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4,4-디플루오로-3-히드록시테트라히드로푸란-2-일)-10-((카복시메틸)카바모일)-3,12-디옥소-2,4-디옥사-7,8-디티아-11-아자헥사데칸-16-온산 (15-amino-1-(5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl)-4,4-difluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)-10-((carboxymethyl)carbamoyl)-3,12-dioxo-2,4-dioxa-7,8-dithia-11-azahexadecan-16-oic acid)은 (5-(4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4,4-디플루오로-3-히드록시테트라히드로푸란-2-일)메틸 (2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸) 카보네이트 ((5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl)-4,4-difluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl (2-(pyridin-2-yldisulfaneyl)ethyl) carbonate) (15 mg, 0.0315 mmol)을 용매 (PBS 완충액) 6mL에 녹인 후 글루타치온 (6.45 mg, 0.021 mmol)을 한방울씩 첨가하며 실온에서 12시간 반응 후 원심 분리기를 이용하여 분리한 후 NMR로 반응을 확인하였다.
엔트리 10인 ((2R,3S,5R)-5-(5-플루오로-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-3-히드록시테트라히드로푸란-2-일)메틸 (2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸) 카보네이트 (((2R,3S,5R)-5-(5-fluoro-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl (2-(pyridin-2-yldisulfaneyl)ethyl) carbonate)는 4-니트로페닐 (2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸)카보네이트 (4-nitrophenyl (2-(pyridine-2-yldisulfaneyl)ethyl)carbonate) (20 mg, 0.057 mmol)와 DMAP (10.4 mg, 0.0851 mmol)을 건조 DMF 10mL에 녹인 후 플록스유리딘 (floxuridine) (6.99 mg, 0.0284 mmol) 을 첨가 후 16시간 동안 실온에서 반응을 진행하였다. 에탄올로 DMAP을 세척한 후 컬럼크로마토그래피를 통하여 분리하였다.
엔트리 11인 15-아미노-10-((카복시메틸)카바모일)-1-((2R,3S,5R)-5-(5-플루오로-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-3-히드록시테트라히드로푸란-2-일)-3,12-디옥소-2,4-디옥사-7,8-디티아-11-아자헥사데칸-16-온산 (15-amino-10-((carboxymethyl)carbamoyl)-1-((2R,3S,5R)-5-(5-fluoro-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)-3,12-dioxo-2,4-dioxa-7,8-dithia-11-azahexadecan-16-oic acid)은 ((2R,3S,5R)-5-(5-플루오로-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-3-히드록시테트라히드로푸란-2-일)메틸 (2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸) 카보네이트 (((2R,3S,5R)-5-(5-fluoro-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl (2-(pyridin-2-yldisulfaneyl)ethyl) carbonate) (33.77 mg, 0.0735 mmol)을 용매 (Di water : pH 7.4 PBS = 1:1) 10mL에 녹인 후 글루타치온 (15 mg, 0.049 mmol)을 한방울씩 첨가하며 22 ℃에서 16시간 반응 후 추출한 후 메탄올을 이용하여 원심 분리기로 분리한 후 NMR로 확인하였다.
엔트리 12인 N5-(1-((카복시메틸)아미노)-3-((3-(((2S)-1-(((14S,16S,33S,2R,4R,10E,12Z,14R)-86-클로로-14-히드록시-85,14-디메톡시-33,2,7,10-테트라메틸-12,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤젠아시클로테트라데카판-10,12-디엔-4-일)옥시)-1-옥소프로판-2-일)(메틸)아미노)-3-옥소프로필)디술파닐)-1-옥소프로판-2-일)글루타민 (N5-(1-((carboxymethyl)amino)-3-((3-(((2S)-1-(((14S,16S,33S,2R,4R,10E,12Z,14R)-86-chloro-14-hydroxy-85,14-dimethoxy-33,2,7,10-tetramethyl-12,6-dioxo-7-aza-1(6,4)-oxazinana-3(2,3)-oxirana-8(1,3)-benzenacyclotetradecaphane-10,12-dien-4-yl)oxy)-1-oxopropan-2-yl)(methyl)amino)-3-oxopropyl)disulfaneyl)-1-oxopropan-2-yl)glutamine)은 메르탄신 (Mertansine) (10 mg, 0.0135 mmol)을 용매 (DMF : pH 7.2 PBS 완충액=1:30)에 녹인 후 PBS 완충액에 녹인 글루타치온 (2.76 mg, 0.01 mmol)을 한방울씩 첨가하여 실온에서 10시간 반응시켰다. 뜨거운 DMF 소량에 녹인 후 4 ℃에서 24시간 동안 재결정화 시키고 감압필터로 생성물을 수득하였다.
각 엔트리의 NMR 결과는 엔트리 1은 1H NMR: δ 3.47 (2H, t,　J　= 6.3 Hz), 3.56 (4H, t,　J　= 5.3 Hz), 3.83 (4H, t,　J　= 5.3 Hz), 4.34 (2H, t,　J　= 6.3 Hz), 엔트리 2는 1H NMR: δ 1.86-1.98 (2H, 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz), 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz)), 2.26-2.34 (2H, 2.30 (t,　J　= 7.4 Hz), 2.30 (t,　J　= 7.4 Hz)), 2.96-3.08 (4H, 3.04 (t,　J　= 6.0 Hz), 2.98 (d,　J　= 7.3 Hz), 2.98 (d,　J　= 7.3 Hz), 3.04 (t,　J　= 6.0 Hz)), 3.46 (1H, t,　J　= 7.6 Hz), 3.53-3.59 (4H, 3.56 (t,　J　= 5.3 Hz), 3.56 (t,　J　= 5.3 Hz)), 3.75-3.76 (2H, 3.75 (s), 3.75 (s)), 3.80-3.86 (4H, 3.83 (t,　J　= 5.3 Hz), 3.83 (t,　J　= 5.3 Hz)), 4.25-4.33 (2H, 4.29 (t,　J　= 6.0 Hz), 4.29 (t,　J　= 6.0 Hz)), 4.40 (1H, t,　J　= 7.3 Hz), 엔트리 3은 1H NMR: δ 1.86-1.98 (2H, 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz), 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz)), 2.24-2.32 (2H, 2.28 (t,　J　= 7.4 Hz), 2.28 (t,　J　= 7.4 Hz)), 3.30-3.35 (2H, 3.33 (d,　J　= 7.0 Hz), 3.33 (d,　J　= 7.0 Hz)), 3.46 (1H, t,　J　= 7.6 Hz), 3.75-3.76 (2H, 3.75 (s), 3.75 (s)), 4.56 (1H, t,　J　= 7.0 Hz), 엔트리 4는 1H NMR: δ 1.28 (3H, d,　J　= 6.7 Hz), 1.60 (1H, ddd,　J　= 14.6, 3.5, 2.9 Hz), 2.13 (3H, s), 2.30-2.49 (3H, 2.38 (ddd,　J　= 14.6, 10.2, 2.6 Hz), 2.44 (dd,　J　= 14.5, 3.8 Hz), 2.40 (dd,　J　= 14.5, 10.1 Hz)), 3.04 (1H, d,　J　= 15.8 Hz), 3.18-3.30 (2H, 3.23 (d,　J　= 15.8 Hz), 3.24 (dd,　J　= 10.3, 10.2 Hz)), 3.47-3.53 (2H, 3.50 (t,　J　= 5.2 Hz), 3.50 (t,　J　= 5.2 Hz)), 3.70 (3H, s), 3.83 (1H, td,　J　= 10.2, 3.5 Hz), 4.09 (1H, dq,　J　= 10.3, 6.7 Hz), 4.33-4.39 (2H, 4.36 (t,　J　= 5.2 Hz), 4.36 (t,　J　= 5.2 Hz)), 4.89-4.99 (2H, 4.97 (dd,　J　= 2.9, 2.6 Hz), 4.93 (dd,　J　= 10.1, 3.8 Hz)), 7.02 (1H, dd,　J　= 8.2, 1.3 Hz), 7.21 (1H, ddd,　J　= 7.4, 5.4, 1.7 Hz), 7.36 (1H, ddd,　J　= 7.8, 1.7, 0.5 Hz), 7.51 (1H, dd,　J　= 8.2, 7.8 Hz), 7.66 (1H, ddd,　J　= 7.8, 7.4, 1.9 Hz), 7.75 (1H, dd,　J　= 7.8, 1.3 Hz), 8.43 (1H, ddd,　J　= 5.4, 1.9, 0.5 Hz), 엔트리 5는 1H NMR: δ 1.28 (3H, d,　J　= 6.7 Hz), 1.60 (1H, ddd,　J　= 14.6, 3.5, 2.9 Hz), 1.86-1.98 (2H, 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz), 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz)), 2.13 (3H, s), 2.26-2.49 (5H, 2.38 (ddd,　J　= 14.6, 10.2, 2.6 Hz), 2.44 (dd,　J　= 14.5, 3.8 Hz), 2.40 (dd,　J　= 14.5, 10.1 Hz), 2.30 (t,　J　= 7.4 Hz), 2.30 (t,　J　= 7.4 Hz)), 3.04 (1H, d,　J　= 15.8 Hz), 3.18-3.33 (4H, 3.23 (d,　J　= 15.8 Hz), 3.24 (dd,　J　= 10.3, 10.2 Hz), 3.31 (d,　J　= 7.2 Hz), 3.31 (d,　J　= 7.2 Hz)), 3.40-3.50 (3H, 3.46 (t,　J　= 7.6 Hz), 3.43 (t,　J　= 5.1 Hz), 3.43 (t,　J　= 5.1 Hz)), 3.70 (3H, s), 3.75-3.76 (2H, 3.75 (s), 3.75 (s)), 3.83 (1H, td,　J　= 10.2, 3.5 Hz), 4.09 (1H, dq,　J　= 10.3, 6.7 Hz), 4.38-4.44 (2H, 4.41 (t,　J　= 5.1 Hz), 4.41 (t,　J　= 5.1 Hz)), 4.53 (1H, t,　J　= 7.2 Hz), 4.89-4.99 (2H, 4.97 (dd,　J　= 2.9, 2.6 Hz), 4.93 (dd,　J　= 10.1, 3.8 Hz)), 7.02 (1H, dd,　J　= 8.2, 1.3 Hz), 7.51 (1H, dd,　J　= 8.2, 7.8 Hz), 7.75 (1H, dd,　J　= 7.8, 1.3 Hz), 엔트리 6은 1H NMR: δ 3.45 (2H, t,　J　= 5.1 Hz), 4.40 (2H, t,　J　= 5.1 Hz), 5.67 (2H, s), 7.21 (1H, ddd,　J　= 7.4, 5.4, 1.7 Hz), 7.36 (1H, ddd,　J　= 7.8, 1.7, 0.5 Hz), 7.66 (1H, ddd,　J　= 7.8, 7.4, 1.9 Hz), 8.43 (1H, ddd,　J　= 5.4, 1.9, 0.5 Hz), 8.63 (1H, s), 엔트리 7은 1H NMR: δ 1.86-1.98 (2H, 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz), 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz)), 2.26-2.34 (2H, 2.30 (t,　J　= 7.4 Hz), 2.30 (t,　J　= 7.4 Hz)), 3.29-3.33 (2H, 3.31 (d,　J　= 7.2 Hz), 3.31 (d,　J　= 7.2 Hz)), 3.42-3.50 (3H, 3.46 (t,　J　= 7.6 Hz), 3.47 (t,　J　= 5.1 Hz), 3.47 (t,　J　= 5.1 Hz)), 3.75-3.76 (2H, 3.75 (s), 3.75 (s)), 4.42-4.49 (2H, 4.46 (t,　J　= 5.1 Hz), 4.46 (t,　J　= 5.1 Hz)), 4.53 (1H, t,　J　= 7.2 Hz), 5.66-5.67 (2H, 5.67 (s), 5.67 (s)), 8.63 (1H, s), 엔트리 8은 1H NMR: δ 3.42-3.48 (2H, 3.45 (t,　J　= 5.1 Hz), 3.45 (t,　J　= 5.1 Hz)), 3.92 (1H, d,　J　= 7.3 Hz), 4.02 (1H, dt,　J　= 7.3, 3.9 Hz), 4.42-4.48 (4H, 4.45 (t,　J　= 5.1 Hz), 4.44 (d,　J　= 3.9 Hz), 4.44 (d,　J　= 3.9 Hz), 4.45 (t,　J　= 5.1 Hz)), 5.66 (1H, s), 6.24 (1H, d,　J　= 10.2 Hz), 7.21 (1H, ddd,　J　= 7.4, 5.4, 1.7 Hz), 7.36 (1H, ddd,　J　= 7.8, 1.7, 0.5 Hz), 7.61-7.71 (2H, 7.66 (d,　J　= 10.2 Hz), 7.66 (ddd,　J　= 7.8, 7.4, 1.9 Hz)), 8.43 (1H, ddd,　J　= 5.4, 1.9, 0.5 Hz), 엔트리 9는 1H NMR: δ 1.86-1.98 (2H, 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz), 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz)), 2.26-2.34 (2H, 2.30 (t,　J　= 7.4 Hz), 2.30 (t,　J　= 7.4 Hz)), 3.29-3.33 (2H, 3.31 (d,　J　= 7.2 Hz), 3.31 (d,　J　= 7.2 Hz)), 3.42-3.50 (3H, 3.46 (t,　J　= 7.6 Hz), 3.47 (t,　J　= 5.1 Hz), 3.47 (t,　J　= 5.1 Hz)), 3.75-3.76 (2H, 3.75 (s), 3.75 (s)), 3.92 (1H, d,　J　= 7.3 Hz), 4.02 (1H, dt,　J　= 7.3, 3.9 Hz), 4.42-4.48 (3H, 4.44 (d,　J　= 3.9 Hz), 4.45 (t,　J　= 5.1 Hz), 4.44 (d,　J　= 3.9 Hz)), 4.45 (1H, t,　J　= 5.1 Hz), 4.53 (1H, t,　J　= 7.2 Hz), 5.66 (1H, s), 6.24 (1H, d,　J　= 10.2 Hz), 7.66 (1H, d,　J　= 10.2 Hz), 엔트리 10은 1H NMR: δ 2.06 (1H, ddd,　J　= 14.5, 7.1, 4.4 Hz), 2.27 (1H, ddd,　J　= 14.5, 8.1, 7.4 Hz), 3.31 (1H, ddd,　J　= 9.3, 7.4, 7.1 Hz), 3.42-3.48 (2H, 3.45 (t,　J　= 5.1 Hz), 3.45 (t,　J　= 5.1 Hz)), 4.12 (1H, dt,　J　= 9.3, 4.5 Hz), 4.41-4.48 (4H, 4.45 (t,　J　= 5.1 Hz), 4.43 (d,　J　= 4.5 Hz), 4.43 (d,　J　= 4.5 Hz), 4.45 (t,　J　= 5.1 Hz)), 6.13 (1H, dd,　J　= 8.1, 4.4 Hz), 7.21 (1H, ddd,　J　= 7.4, 5.4, 1.7 Hz), 7.36 (1H, ddd,　J　= 7.8, 1.7, 0.5 Hz), 7.66 (1H, ddd,　J　= 7.8, 7.4, 1.9 Hz), 8.43 (1H, ddd,　J　= 5.4, 1.9, 0.5 Hz), 8.59 (1H, s), 엔트리 11은 1H NMR: δ 1.86-1.98 (2H, 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz), 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz)), 2.06 (1H, ddd,　J　= 14.5, 7.1, 4.4 Hz), 2.19-2.35 (3H, 2.30 (t,　J　= 7.4 Hz), 2.27 (ddd,　J　= 14.5, 8.1, 7.4 Hz), 2.30 (t,　J　= 7.4 Hz)), 3.25-3.38 (3H, 3.31 (ddd,　J　= 9.3, 7.4, 7.1 Hz), 3.31 (d,　J　= 7.2 Hz), 3.31 (d,　J　= 7.2 Hz)), 3.42-3.50 (3H, 3.46 (t,　J　= 7.6 Hz), 3.47 (t,　J　= 5.1 Hz), 3.47 (t,　J　= 5.1 Hz)), 3.75-3.76 (2H, 3.75 (s), 3.75 (s)), 4.12 (1H, dt,　J　= 9.3, 4.5 Hz), 4.41-4.48 (3H, 4.43 (d,　J　= 4.5 Hz), 4.45 (t,　J　= 5.1 Hz), 4.43 (d,　J　= 4.5 Hz)), 4.45 (1H, t,　J　= 5.1 Hz), 4.53 (1H, t,　J　= 7.2 Hz), 6.13 (1H, dd,　J　= 8.1, 4.4 Hz), 8.59 (1H, s), 엔트리 12는 1H NMR: δ 1.08 (3H, d,　J　= 7.1 Hz), 1.32 (3H, d,　J　= 7.2 Hz), 1.45 (3H, s), 1.63 (3H, s), 1.86-1.99 (3H, 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz), 1.94 (dd,　J　= 14.8, 2.6 Hz), 1.92 (dt,　J　= 7.6, 7.4 Hz)), 2.10 (1H, ddq,　J　= 9.2, 8.1, 7.1 Hz), 2.18-2.34 (3H, 2.30 (t,　J　= 7.4 Hz), 2.25 (dd,　J　= 14.8, 10.2 Hz), 2.30 (t,　J　= 7.4 Hz)), 2.37-2.41 (2H, 2.39 (t,　J　= 2.7 Hz), 2.39 (t,　J　= 2.7 Hz)), 2.59 (3H, s), 2.68-2.83 (3H, 2.72 (d,　J　= 14.0 Hz), 2.77 (dd,　J　= 15.0, 6.2 Hz), 2.73 (d,　J　= 14.0 Hz)), 2.88-3.00 (2H, 2.90 (d,　J　= 9.2 Hz), 2.95 (dd,　J　= 15.0, 2.1 Hz)), 3.14-3.17 (2H, 3.15 (t,　J　= 2.7 Hz), 3.15 (t,　J　= 2.7 Hz)), 3.29-3.33 (2H, 3.31 (d,　J　= 6.4 Hz), 3.31 (d,　J　= 6.4 Hz)), 3.41-3.50 (7H, 3.45 (s), 3.46 (t,　J　= 7.6 Hz), 3.43 (s)), 3.71 (3H, s), 3.75-3.76 (2H, 3.75 (s), 3.75 (s)), 4.23 (1H, q,　J　= 7.2 Hz), 4.30 (1H, d,　J　= 1.7 Hz), 4.54 (1H, t,　J　= 6.4 Hz), 5.17 (1H, ddd,　J　= 10.2, 8.1, 2.6 Hz), 5.68 (1H, dd,　J　= 6.2, 2.1 Hz), 5.85 (1H, dd,　J　= 9.9, 1.7 Hz), 5.97 (1H, d,　J　= 10.3 Hz), 6.66 (1H, d,　J　= 2.6 Hz), 6.77 (1H, dd,　J　= 10.3, 9.9 Hz), 7.43 (1H, d,　J　= 2.6 Hz)이다.
도 2는 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 2의 합성을 도식화 한 것이다.
도 3은 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 3의 합성을 도식화 한 것이다.
도 4는 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 5의 합성을 도식화 한 것이다.
도 5는 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 7의 합성을 도식화 한 것이다.
도 6은 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 9의 합성을 도식화 한 것이다.
도 7은 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 11의 합성을 도식화 한 것이다.
도 8은 글루타치온 전구체 약물의 한 종류인 엔트리 12의 합성을 도식화 한 것이다.
실시예 3. 글루타치온 전구체 약물과 융합 단백질간의 결합 확인
글루타치온 전구체 약물과 융합 단백질간의 결합을 ITC (isothermal titration calorimetry) 방법을 사용하여 확인하였다.
먼저 증류수로 대조 샘플을 채운 후, 튜브를 이용하여 플라스틱 주사기를 주입 주사기의 주입구에 연결하였다. 주입 주사기를 증류수로 헹군 뒤, 완충액으로 헹구었다. 시스템을 통해 공기를 흡입하여 주입 주사기를 완전히 비웠다. 주사 주사기의 바늘을 HER2 표적 애피바디가 부착된 글루타치온-S-전이효소 용액에 넣고 주사기 전체가 가득 찰 때까지 융합단백질을 주사기에 끌어들였다. 주입구 및 연결된 튜브에 100 uL까지 계속 끌어들인 후 주사기의 주입구를 즉시 닫고 튜브와 플라스틱 주사기를 분리하였다. 주사기에서 기포를 제거하기 위해 주입 주사기를 두 번 더 배출하고 다시 300uL까지 채웠다. 융합단백질 용액에서 주사기를 제거하고 주사기에서 용량이 제거될 수 있으므로 주사기 팁을 킴와이프에 닿지 않도록 주의하면서 킴와이프로 측면을 닦아 방울을 제거하였다. 또한 주사기 팁에서 용량이 손실될 수 있으므로 주사기를 두드리거나 병에 넣지 않도록 주의하였다. 그 다음, 주입 주사기를 엔트리 2,3,5,7,9,11 및 12를 각각 녹인 PBS 버퍼용액에 넣었다. 융합단백질을 주입 후, 시스템에 평형화 할 시간이 주어지고 다음 주입이 발생하기 전에 열 신호가 기준선으로 복귀하도록 5분 기다린다. 그 후 후속 주입을 300 uL으로 유지한 후, 실험 온도를 25 ℃로 선택한다. 위와 같이 파라미터를 설정 한 후 실험을 시작하였다. 실험은 오차발생을 줄이기 위해 3번 반복으로 진행하였다.
그 다음, 데이터를 분석하였다. 구체적으로, 모든 데이터 피팅 프로그램 (일반적으로 제조업체에서 계측기와 함께 제공)에서 매크로를 사용하여 데이터 피팅을 쉽게 수행할 수 있다. 데이터를 피팅하는 데 사용할 데이터 피팅 모델 (한개의 결합 부위, 두개/여러개의 결합 부위, 협동 결합 등)을 선택한다. 데이터는 피팅 파라미터, 화학량론 (n), 엔탈피 (△H) 및 결합 친화도 (Ka)의 초기 추측에 적합할 수 있고 ITC 엔탈피 값을 van't Hoff 플롯의 엔탈피와 비교할 수 있다. 거대 분자 농도가 증가함에 따라 열 신호의 절대 값이 증가해야 하기 때문에 상이한 농도의 리간드 또는 거대 분자를 사용하는 것이 도움이 될 수 있다. 세포와 주사기의 완충액이 일치하지 않으면 잡음이 발생할 가능성이 높다. 잡음에 대한 또 다른 가능성은 불순물이 있는 샘플에서 발생한다.
그 결과, 도 9 내지 도 12에 나타낸 바와 같이 융합단백질과 각 엔트리의 결합은 0.92 내지 1.1 μM 수준으로 결합함을 나타냈다.
도 9는 엔트리 2가 융합단백질에 결합하는 경우 결합 친화도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 엔트리 3이 융합단백질에 결합하는 경우 결합 친화도를 나타낸 그래프이다.
도 11은 엔트리 5가 융합단백질에 결합하는 경우 결합 친화도를 나타낸 그래프이다.
도 12는 엔트리 2,3,5,7,9,11 및 12가 융합단백질에 결합하는 경우 결합 친화도 값을 나타낸 표이다.
실시예 4. 글루타치온 전구체 약물과 융합단백질이 결합된 복합체의 세포 독성 확인
글루타치온 전구체 약물 (엔트리)와 융합단백질이 결합된 복합체의 항암 효과를 관찰하기 위해 세포 독성을 분석하였다.
구체적으로, 인간 유방암 세포(human breast cancer cell)인 SKBR3 세포에 대한 Her2 지향 융합단백질(Fusion protein)과 엔트리 2, 3, 5, 7, 9, 11, 및 12가 각각 결합된 복합체의 세포 생존력은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (MTT)의 불용성 포르마잔(formazan)으로의 환원을 관찰하여 평가하였다. 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 5X103 세포의 밀도로 파종하고 밤새 배양한 후, 100 nM ~ 1 μM 농도 범위의 엔트리 2, 3, 5, 7, 9, 11, 및 12 를 각각 세포에 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 대조군 실험은 융합단백질과 각 엔트리 2, 3, 5, 7, 9, 11, 및 12 로 수행하였다. 그 다음, 세포를 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (MTT)와 배양한 뒤, 결정화된 포르마잔을 ELISA 플레이트 판독기로 595 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 결과는 생존력 백분율 = [(A550 (처리 된 세포)-배경값) / (A550 (처리되지 않은 세포)-배경값)] x 100으로 표현되었다.
그 결과, Her2 지향 융합단백질(Fusion protein) 또는 엔트리 2, 3, 5, 7, 9, 11, 및 12 자체의 세포독성은 50ug/ml 까지 미비한 주순이나, 융합단백질(Fusion protein)과 엔트리 2, 3, 5, 7, 9, 11, 및 12이 각각 결합된 복합체의 세포독성은 IC50 수치가 1 내지 60 ug/ml 임을 나타냈다 (도 13 내지 도 20). 이러한 결과는, 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 글루타치온―S―전이효소 (glutathione-S-transferase, GST)에 글루타치온 전구체 약물이 결합하는 복합체를 조성하고 있다는 것과, 표적세포로 글루타치온 전구체 약물을 전달하여 치료용 목적으로 적용 가능함을 나타낸다.
도 13은 융합단백질과 엔트리 2가 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 14는 융합단백질과 엔트리 3이 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 15는 융합단백질과 엔트리 5가 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 16은 융합단백질과 엔트리 7이 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 17은 융합단백질과 엔트리 9가 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 18은 융합단백질과 엔트리 11이 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 19는 융합단백질과 엔트리 12가 결합된 복합체의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 20은 융합단백질과 엔트리 2,3,5,7,9,11 및 12가 결합된 복합체의 세포 독성을 나타내는 IC50 값을 나타낸 표이다.
<110> ULSAN NATIONAL INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Fusion Biotechnology <120> Transporters of glutathione precursor drugs including glutathione-S-transferase and proteins having the ability to bind target cells or target proteins and uses thereof <130> PN133090 <150> KR 19/62595 <151> 2019-05-28 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker domain <400> 1 Gly Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 25 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 1 <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 2 <400> 3 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 3 <400> 4 Ser Arg Ser Ser Gly 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 4 <400> 5 Ser Gly Ser Ser Cys 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 5 <400> 6 Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 6 <400> 7 Arg Pro Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 7 <400> 8 Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 8 <400> 9 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 9 <400> 10 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 10 <400> 11 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 11 <400> 12 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe 1 5 10

Claims (9)

  1. 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST);
    표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질;
    상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및
    상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 글루타치온 전구체 약물을 함유하는 약물 전달체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor tyrosine kinases: RTKs)에 특이적으로 결합하는 것인 약물 전달체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor tyrosine kinases: RTKs)는 표피 성장인자 수용체, 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장인자 수용체, 혈관내피 성장인자 수용체, 섬유아세포 성장인자 수용체, 콜레시스토키닌(Cholecystokinin: CCK) 수용체, 신경영양인자(Neurotrophic factor: NGF) 수용체, 간세포 성장인자 (Hepatocyte growth factor: HGF) 수용체, 에프린(Ephrin: Eph) 수용체, 안지오포이에틴 수용체, 및 RYK(related to receptor tyrosine kinase) 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 약물 전달체.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 글루타치온-S-전이효소와 글루타치온 전구체 약물의 결합은 GSH(Glutathione)에 의한 것인 약물 전달체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 글루타치온 전구체 약물은 하기 화학식 1 내지 화학식 7 중 어느 하나 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인 약물 전달체.
    Figure pat00008

    [화학식 1]
    Figure pat00009

    [화학식 2]
    Figure pat00010

    [화학식 3]
    Figure pat00011

    [화학식 4]
    Figure pat00012

    [화학식 5]
    Figure pat00013

    [화학식 6]
    Figure pat00014

    [화학식 7]
  6. 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST);
    표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질;
    상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및
    상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 글루타치온 전구체 약물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 표피 성장인자 수용체, 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장인자 수용체, 혈관내피 성장인자 수용체, 및 안지오포이에틴 수용체에 특이적으로 결합하는 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 글루타치온-S-전이효소와 글루타치온 전구체 약물의 결합은 GSH(Glutathione)에 의한 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 글루타치온 전구체 약물은 하기 화학식 1 내지 화학식 7 중 어느 하나 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    Figure pat00015

    [화학식 1]
    Figure pat00016

    [화학식 2]
    Figure pat00017

    [화학식 3]
    Figure pat00018

    [화학식 4]
    Figure pat00019

    [화학식 5]
    Figure pat00020

    [화학식 6]
    Figure pat00021

    [화학식 7]
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