CN113173978A - 一种对hpv16e6蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用 - Google Patents
一种对hpv16e6蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明以葡萄球菌A蛋白的Z结构域作为支架，将其表面氨基酸残基模拟抗体结合位点进行随机突变，通过噬菌体展示技术构建突变文库，以HPV16E6作为靶抗原对该文库进行亲和筛选，经过大量的筛选工作，最终获得了对于HPV16E6具有高度亲和力的多肽，经过深入的研究，本发明首次揭示了一种对HPV16的E6蛋白具有结合亲和力的多肽，此外本发明还提供了该多肽作为药物或分子靶向试剂的诊断或治疗用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体地，本发明涉及一种对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用。
背景技术
宫颈癌是全球妇女癌症相关死亡的第二大常见原因。据报道每年新增病例达到445,000 例，其中约有270,000人死亡。来自临床，流行病学和分子生物学数据的研究已经证实超过 95％的宫颈癌患者与高危型人乳头瘤病毒(HPVs)的感染，研究表明，持续性感染高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59型，是宫颈癌发生发展的主要致病原因。其中，HPV16和HPV18是最普遍的基因型，分别约占宫颈肿瘤的62.6％和15.7％。
HPV是一种无包膜，双链，环状的DNA病毒。它的基因组由约8000个碱基对组成，其基因组分为3个区：E区、L区和非编码区(UCR)，E区含8个早期开放阅读框ORF(F1～E8)，分别编码 F1～E8早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和转化等功能；L区含2个晚期开放阅读框ORF(L1、L2)，编码主要结构蛋白L1和次要结构蛋白L2。大量研究表明HPV基因组整合到宿主染色体中，导致病毒E2基因破坏和E6/E7致癌基因的持续表达，这是宫颈癌发生的关键事件。E6蛋白是一种多功能蛋白，其中最重要的功能是介导p53蛋白的降解，导致p53抑制细胞生长增殖作用减弱甚至消失，引起肿瘤恶性进展。E7蛋白通过靶向pRb诱导细胞转化，从而促进宫颈癌的发生。E6/E7癌蛋白还可以通过靶向多个信号分子，进而调节对恶性转化同样重要的不同信号传导途径。因此，仅在HPV感染组织中特异性表达的E6/E7癌蛋白是HPV相关肿瘤早期诊断和治疗的理想分子靶点。
宫颈癌疫苗成功上市后对控制宫颈癌起到了积极的预防作用，但是，已经感染了HPV及其所致的癌前病变、复发与转移等，至今仍没有特异的靶向治疗方法。宫颈癌主要采用手术治疗，同时辅以放疗和化疗，而很大部分癌症患者因自身免疫系统及身体耐受情况较差，产生严重的毒副作用，从而更危及患者生命，成为癌症死亡率高的一个重要因素。靶向治疗具有选择性高效性杀伤肿瘤细胞，避免损伤正常组织，是目前肿瘤治疗中最具希望的方法和策略。目前，西妥昔单抗和舒尼替尼等单克隆抗体在肿瘤患者的治疗中已经产生了令人印象深刻的癌症控制效果。但基于抗体分子的靶向治疗仍然存在其应用的局限性，如渗透性差、成本昂贵、具有较强的免疫原性和毒副反应严重等有待进一步研究改善。尤其毒副作用产生的毒性效应已经成为发展针对肿瘤治疗性抗体的主要障碍，产生肝、肾及神经系统毒性而使其功能降低。
基于上述说明，本领域仍然亟待研究靶向性治疗HPV感染及其相关肿瘤的新药物或新方法，以改善目前临床现状。。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对HPV16E6具有结合亲和力的多肽及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽，该多肽是以葡萄球菌A蛋白(SPA)Z段(Z结构域)的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽，所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2-4任一所示。
在另一优选例中，所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽与HPV16E6蛋白相互作用的KD值为1×10-5M至1×10-7M。
在本发明的另一方面，提供一种靶向HPV16E6的靶向性分子，所述的靶向性分子包括前面任一所述的多肽，以及与该多肽相连接(或偶联)的偶联物，所述的偶联物包括(但不限于)：半胱氨酸残基，或多肽标签，或抑制HPV16E6的药物，或可检测标记物，该可检测标记物包括但不限于：荧光标记、酶、生物素或放射性同位素。
在一个优选例中，所述的偶联物是肽，所述的偶联物与所述的对人乳头瘤病毒16型的 E6蛋白具有结合亲和力的多肽构成融合多肽。
在另一优选例中，所述的抑制HPV16E6的药物包括(但不限于)：毒素；较佳地，所述毒素是具有抑制HPV16E6病毒感染或抑制肿瘤作用的毒素，如白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素或所述毒素的功能性片段；且，所述的肿瘤是HPV16E6型阳性的肿瘤。
在另一优选例中，所述的毒素是绿脓杆菌外毒素A，或所述毒素的功能性片段是绿脓杆菌外毒素A的活性片段PE38KDEL。较佳地，该绿脓杆菌外毒素A或其功能性片段连接于所述的对HPV16 E6蛋白具有结合亲和力的多肽的羧基末端(C末端)。
在另一优选例中，所述酶包括但不限于：碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
在另一优选例中，所述的偶联物与所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽以柔性肽连接，所述柔性肽包括(但不限于)：(Gly4Ser)3。
在另一优选例中，所述的多肽标签包括但不限于：His标签(如6×His)，Myc标签，6ST 标签，Flag标签。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码前面任一所述的对HPV16E6 蛋白具有结合亲和力的多肽。
在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的靶向HPV16E6的靶向性分子，且其中所述的偶联物是肽。
在本发明的另一方面，提供一种重组载体，该载体包含所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含所述的重组载体，或其包含有或基因组中整合有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽的方法，所述方法包括：(1)培养所述的细胞，从而表达所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽；(2)分离纯化(1)获得的多肽。
在本发明的另一方面，提供所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向HPV16E6的靶向性分子的用途，用于制备治疗HPV16E6病毒感染疾病或HPV16E6表达阳性肿瘤的药物；或用于制备检测HPV16E6病毒感染的检测试剂；或用于制备诊断HPV16E6病毒感染疾病或HPV16E6表达阳性肿瘤的诊断试剂。
在一个优选例中，所述的靶向HPV16E6的靶向性分子中，所述的偶联物是抑制HPV16E6 病毒的药物或抗肿瘤药物(如毒素)，所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向HPV16E6的靶向性分子用于治疗HPV16E6病毒感染疾病或HPV16E6表达阳性肿瘤。
在另一优选例中，所述的靶向HPV16E6的靶向性分子中，所述的偶联物是可检测标记物(如荧光标记或酶)，所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向HPV16E6 的靶向性分子用于诊断HPV16E6病毒感染疾病或HPV16E6表达阳性肿瘤。
在另一优选例中，所述的HPV16E6表达阳性肿瘤包括：宫颈癌、头颈部肿瘤或外生殖器肿瘤等。
在另一优选例中，所述的HPV16E6病毒感染疾病包括：宫颈上皮内瘤样病变或外生殖器疣等。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含：前面所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向HPV16E6的靶向性分子；和药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供一种用于诊断HPV16E6病毒感染疾病或HPV16E6表达阳性肿瘤的药盒，所述的药盒中包括：所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽，或所述的靶向HPV16E6的靶向性分子，或所述的药物组合物。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗HPV16E6病毒感染疾病或HPV16E6表达阳性肿瘤的药盒，所述的药盒中包括：所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽，或所述的靶向HPV16E6的靶向性分子，或所述的药物组合物。
在一个优选例中，还包括有对HPV16E7蛋白具有结合亲和力的多肽。
在一个优选例中，所述对HPV16E7蛋白具有结合亲和力的多肽为如SEQ ID NO：12所示的序列。
在一个优选例中，所述HPV16E6表达阳性肿瘤包括：宫颈癌、头颈部肿瘤或外生殖器肿瘤。
在一个优选例中，所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向HPV16E6 的靶向性分子是有效量的。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1、各ZHPV16E6以及ZWT序列的对比。
图2、实施例1中产生的一个融合多肽的重组质粒构建图(A)和氨基酸序列示意图(B)。ZHPV16E6代表具有选自SEQ ID NO：1-4任一序列的HPV16E6结合结构域，6xHis代表六个组氨酸标记，HM代表NdeI(CATATG)翻译的氨基酸，LE代表XhoI(CTCGAG)翻译的氨基酸。
图3、pET21a(+)/ZHPV16E6重组质粒测序峰图。A：pET21a(+)/ZHPV16E61115的测序峰图B： pET21a(+)/ZHPV16E61171的测序峰图C：pET21a(+)/ZHPV16E61235的测序峰图。
图4、ZHPV16E6Affibody重组蛋白原核表达和纯化的SDS-PAGE电泳分析及其WesternBlot鉴定。A：M：蛋白Marker；1，E.coli.BL21(DE3)菌株；2，pET21a(+)/E.coli.BL21(DE3)菌株；3-6，pET21a(+)/ZHPV16E61115，pET21a(+)/ZHPV16E61171，pET21a(+)/ZHPV16E61235， pET21a(+)/ZWT分别诱导6h后SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色分析。SDS-PAGE(B)分析纯化的ZHPV16E6重组蛋白，并通过Western bloting(C)对其进行鉴定；M，蛋白marker；1，ZHPV16E61115； 2，ZHPV16E61171；3，ZHPV16E61235；4，ZWT。
图5、HPV16E6重组蛋白原核表达纯化的SDS-PAGE电泳分析及Western Blot鉴定。
M：预染蛋白marker；1.E.coli.BL21(DE3)菌株；2.pET21a(+)/E.coli.BL21(DE3)菌株；3～7：用1mM IPTG分别诱导pET21a(+)/HPV16E6/E.coli.BL21(DE3)菌株0，2， 4，6和8h；8：PBS超声溶解后上清；9：PBS超声溶解后沉淀；10-14：10mM，50mM， 100mM，200mM，500mM咪唑洗脱液；15：His单抗1∶1000。
图6、ZHPV16E6与HPV16E6结合亲合力的SPR分析。A、B、C、D分别为ZHPV16E61115、ZHPV16E61171、ZHPV16E61235 及Zwt蛋白与靶蛋白HPV16E6的亲和力分析。
图7、ZHPV16E6与天然靶蛋白HPV16E6特异性结合的细胞免疫荧光分析。
A：ZHPV16E61115蛋白的间接免疫荧光检测；B：ZHPV16E61171蛋白的间接免疫荧光检测；C：ZHPV16E61235 蛋白的间接免疫荧光；D：ZWT蛋白的间接免疫荧光检测。
图8、ZHPV16E6与人宫颈癌组织中的HPV16E6蛋白特异性结合的免疫组化分析。A：HPV16阳性宫颈癌组织；B：HPV16阴性正常宫颈组织。
图9、Dylight755标记ZHPV16E6的SDS-PAGE电泳及荧光分析。A：为ZHPV16E6的SDS-PAGE电泳分析； B：为标记Dylight755的ZHPV16E6的SDS-PAGE电泳的荧光分析。M：预染蛋白marker；1. Dylight755-ZHPV16E61115；2.Dylight755-ZHPV16E61171；3.Dylight755-ZHPV16E61235；4. Dylight755-ZWT
图10、Dylight755标记的affibody分子在健康裸鼠体内的生物分布成像分析。A：Dylight755标记的affibody分子在健康裸鼠体内各时间点的荧光成像图；B：肾脏/皮肤荧光信号强度的量化分析。
图11、Dylight755-ZHPV16E6affibody在荷瘤裸鼠肿瘤模型成像分析
Dylight755标记的affibody分子在TC-1(A，B)和HeLa229(C，D)荷瘤裸鼠肿瘤模型中的荧光成像图及肿瘤/皮肤荧光信号强度的量化分析。
图12、Affibody ZHPV16E61235抑制HPV16阳性细胞增殖作用
CCK8法分析联合使用ZHPV16E61235和ZHPV16E7384对TC-1(A)，CaSki(B)，HeLa229(C)，C666-1(D) 细胞的生长抑制作用。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示了一种对人乳头瘤病毒16型(HPV16)的E6蛋白具有结合亲和力的多肽；本发明还提供了该多肽作为药物或分子靶向试剂的诊断或治疗用途。
如本文所用，所述的“对HPV16E6具有结合亲和力的多肽”是指以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行10-20个氨基酸变异后获得的多肽，且该多肽能够特异性结合HPV16E6、具有极少或没有非特异性结合。
如本文所用，所述的“本发明的多肽”、“对HPV16E6具有结合亲和力的多肽”、“HPV16E6 结合多肽”、“ZHPV16E6affibody多肽”、“ZHPV16E6affibody”、“ZHPV16E6”、“affibody蛋白”、“affibody重组蛋白”、“ZHPV16E6重组蛋白”可以互换使用。
本发明的多肽是以葡萄球菌A蛋白Z结构域的氨基酸序列作为骨架，进行10-20个(较佳地为14个)氨基酸变异后获得的多肽。本发明的多肽具有SEQ ID NO：2-4任一所示的氨基酸序列。
本发明还涵盖了在所述HPV16E6结合多肽的氨基酸序列任一末端或两端加入额外的氨基酸残基而形成的多肽。这些额外的氨基酸残基可以在多肽结合HPV16E6时起作用，但是也可同样用于其它目的，如涉及该多肽的生产、纯化、稳定、偶联或检测的一种或几种。这些额外的氨基酸残基可以包括一或多种为了化学偶联目的而添加的氨基酸残基。如在多肽链的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一个半胱氨酸残基等。这种额外的氨基酸残基也可以包括用于多肽纯化或检测的一个“标记”，如与标记抗体相互作用的六组氨酸肽(His6)标记，或“myc”标记或“flag”标记。此外，其它本领域技术人员熟知的替代方式也包含在本发明中。
所述“额外的氨基酸残基”也可构成具有预期功能的一个或多个多肽结构域，如与第一个、HPV16E6结合结构域相同的结合功能，或者其它结合功能，或是一种酶促功能，或是一种荧光功能，或是其组合。
本发明也包含在所述的HPV16E6结合多肽基础上，经修饰进而增加其在碱性条件下的稳定性的多肽。这种稳定性包括用对于碱性条件较不敏感的氨基酸残基定点取代在没有修饰的序列中出现的任何天冬酞胺残基。由于在不同的反应之间亲和层析柱要经受频繁的强碱处理以进行洗脱，这种对碱降低敏感性的特性，有利于使用本发明的多肽作为亲和层析中的亲和配体，能够延长亲和层析基质的使用寿命。
本发明也包含在本发明的HPV16E6结合多肽基础上，进行其它修饰后获得的多肽。这些修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明的HPV16E6结合多肽可以与偶联物连接，从而构成功能性的靶向性分子，这种连接可通过化学键(包括肽键)相连或吸附；所述的化学键是共价键或非共价键。作为一种优选方式，通过肽键连接，从而形成融合多肽。
所述的HPV16E6结合多肽与偶联物之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽) 连接。所述的连接子例如包括1-30个氨基酸；较佳地为1-20个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响融合蛋白中各多肽的活性。较佳地，可以利用柔性肽(Gly4Ser)3进行连接。其它本领域技术人员熟知的连接肽也可应用于本发明。
在“异源”融合多肽中，所述HPV16E6结合多肽构成了第一个结构域或第一个部分，第二和其它部分具有除了结合HPV16E6外的其它功能，这些可预期的结果也在本发明的范围内。该融合多肽的第二和其它部分可能包含对除了HPV16E6外的其它靶分子具有亲和力的结合结构域。这种结合结构域也可能与SPA结构域相关，但在1到大约20个位置具有取代突变。结果是融合多肽有至少一个HPV16E6结合结构域和至少一个与所述其它靶分子具有亲和力的结构域。这扩展了本发明的多肽的应用，如作为治疗制剂或作为捕获、检测或分离试剂。
本发明融合多肽第二和其它部分的其它选择包括用于治疗性应用的一或多种部分。在治疗性应用中，其它分子也可以通过其它方法共价或非共价偶联到本发明的多肽上。非限制性例子包括用本发明多肽引导效应酶(例如羧肽酶)而进行“ADEPT″(抗体介导的酶前药治疗，antibody-directed enzyme prodrug therapy)的酶；包括用以募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白质；包括细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFα、IP10；包括促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白A、calcheamicin、美登木素生物碱；包括毒性小分子，如auristatin类似物、阿霉素等。同时，为了更方便掺入放射性核素(如68Ga、76Br、111In、99Tc、124I、125I)用于诊断或放射性核素(如 90Y、131I、211At)用于治疗，可以考虑上述列举的额外的氨基酸(特别是六组胺酸标记和半胱氨酸)，其目的是将放射性同位素的鳌合剂偶联到多肽序列。
本发明还涵盖了在所述的HPV16E6结合多肽上连接一个可检测标记物(如荧光标记，生物素或放射性同位素)，从而可基于本发明的多肽的特异性，实现检测HPV16感染或HPV16 感染相关疾病的目的。
“HPV16E6结合亲和力”是指可以例如通过利用表面等离子共振(surface plasmonresonance)技术如
装置进行检测的一种多肽特性。HPV16E6结合亲和力可以通过一个实验进行检测，其中将HPV16E6固定在该装置的感应芯片上，然后将含有待测多肽的样品通过该芯片。或者，也可以将待检测的多肽固定在该装置的感应芯片上，然后将含有HPV16E6的样品通过该芯片。本领域技术人员可以利用所获得的感应图像建立多肽的HPV16E6结合亲和力的至少一种定性测量方法。如果需要定量测量方法，例如为了建立相互作用间的某个KD值，也可以使用表面等离子共振方法。例如，结合值可以利用
2000装置(Biocore AB)进行测定。HPV16E6固定于该装置的感应芯片上，而亲和力待检测的多肽样品通过连续稀释制备并以随机顺序进行注射。然后可从结果中计算KD 值。在本发明的实施例中，所述的多肽的KD值达到1×10-5M至1×10-7M。
本发明还提供了编码本发明的HPV16E6结合多肽或融合多肽的分离的核酸，也可以是其互补链。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得。
本发明还提供了包含编码所述核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体：实验室手册中所描述的。此外，含有所述核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。生产本发明的HPV16E6结合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有相应多肽的编码核酸的重组细胞，获得产物多肽。可将上述制备获得的多肽纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。基于要表达多肽的信息和目前重组表达蛋白质的技术水平，结合本发明揭示的内容，本领域技术人员易于制备本发明的多肽。例如，表达未被修饰的Z结构域的质粒可以用作起始材料。使用已知技术，所需的取代突变可以被引入这个质粒中以获得本发明的表达载体。当使用化学多肽合成方法制备本发明的多肽或靶向性分子或融合蛋白时，上述多肽中的任何天然产生的氨基酸残基都可以被任何相应的、非天然产生的氨基酸残基或其衍生物所取代，只要产物多肽的功能基本不被损害。
本发明还涉及所述的HPV16E6结合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的应用，包括应用于治疗、诊断和/或检测。
本发明的HPV16E6结合多肽可作为HPV16E6抗体在不同应用中的一种替代物。作为非限制性的实例，其可用于治疗特征以HPV16E6表达或HPV16感染为特征的疾病，例如肿瘤(如宫颈癌，头颈部肿瘤)等。通过结合胞内HPV16E6以抑制细胞信号传导，用于相关疾病的体内和体外诊断。本发明的多肽可作为一种检测试剂、一种捕获试剂或者分离试剂，而且还可直接用作为一种治疗制剂或者将其它治疗制剂靶向HPV16E6蛋白的手段。体外使用本发明的多肽的方法可以不同方式进行，如微量滴定板、蛋白阵列、生物传感器表面和组织切片等等。为了使本发明多肽适用于特异的用途，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对本发明的多肽进行修饰和/或添加。在下面详细描述了这些修饰和添加，其可能包括在同一多肽链中包含的额外的氨基酸，或者标记和/或治疗制剂，其化学修饰或以其它方式结合本发明的多肽。另外，本发明还涵盖了保留了结合HPV16E6能力的该多肽的片段。
本发明的HPV16E6结合多肽可以作为治疗制剂，其治疗作用基于至少一种以下机制： (i)加强化疗作用，施用本发明的多肽与目前和将来的化疗治疗协同作用。阻断胞内的HPV16E6蛋白对抑癌基因p53的降解作用；(ii)促进肿瘤细胞的凋亡。
本发明多肽的HPV16E6结合特性以及用该多肽生产靶向性分子(包括融合蛋白)和/或标记的结合分子的稳定性意味着该多肽也可以用于将其它活性物质靶向肿瘤部位，这些肿瘤包括表达HPV16E6的细胞。因此，本发明的另一方面是提供了本文所述的HPV16E6结合多肽与一种具有抗癌活性的物质偶联的应用，以将所述物质运送到表达HPV16E6的细胞，产生靶细胞的损伤或凋亡。
这种抗癌活性的物质可能是通过融合或通过化学键偶联到HPV16E6结合多肽上的蛋白质，如选自用于“ADEPT”(antibody-directed enzyme prodrug therapy)应用的效应酶；用于募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白；细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFαa、IP 10等；促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子等；毒素，如蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物碱等。或者，所述活性物质也可能是细胞毒性药物，如auristatin类似物或阿霉素或放射性同位素(如90Y、131I、211At 等)，这种同位素可与HPV16E6结合多肽直接结合，或通过一种鳌合剂，如熟知的鳌合剂 DOTA或DTPA而与HPV16E6结合多肽结合。
在相关方面，本发明还提供了一种在体内将具有抗癌活性的物质导向表达HPV16E6细胞的方法，包括施用给患者本文所述的所述活性物质与与HPV16E6结合多肽的偶联物。这种偶联物在前文已被适当描述。
本发明还包括使用所述的与HPV16E6结合的多肽检测样品中的HPV16E6蛋白。例如，这种检测可以用来诊断特征为表达HPV16E6的疾病情况。检测HPV16E6的存在可以在体内也可以在体外进行。体内诊断的优选选择是使用正电子放射X线断层摄影术，PET。被检测的样品可以例如是生物学液体样品或组织样品。现在的普遍方法是用针对与HPV16E6的抗体，这种方法可以适用于本发明的与HPV16E6结合多肽，这种方法是组织化学方法检测与HPV16E6的存在，用来鉴定新鲜、冷冻或福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品中与HPV16E6蛋白的表达。为了检测HPV16E6，本发明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其中其它结构域是报告酶或荧光酶。或者，其也可以是被一个或多个荧光制剂和/或放射性同位素标记的，任选通过鳌合剂标记。合适的放射性同位素包括68Ga、76Br、111In、99Tc、124I和 125 I等。
本发明还包括将所述的HPV16E6结合多肽应用于检测生物学液体样品中HPV16E6。这个方法包括以下步骤：(1)提供被检测患者的生物学液体样品，(2)将本文所述的HPV16E6结合多肽在能使所述多肽与样品中存在的任何HPV16E6结合的条件下加入样品中，(3)除去非结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。被检测到的结合的多肽的量与样品中存在的HPV16E6量相关。在步骤(2)中，HPV16E6结合多肽可以以任何适宜的形式加入到样品中，包括例如这样的情况，当HPV16E6结合多肽被固定在一种固体支持物上，通过其使样品接触，或HPV16E6结合多肽存在于溶液中。所述的HPV16E6结合多肽的其它应用还包括：检测样品中HPV16E6的方法，包括如下步骤：(1)提供一种怀疑含有HPV16E6的组织样品，例如冷冻切片或用福尔马林包埋的组织切片，(2)在适宜条件下加入本发明的HPV16E6结合多肽到所述样品中，所述条件为益于所述多肽与样品中存在的任何HPV16E6结合，(3) 除去未结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。检测到的结合的多肽的量与样品中存在的 HPV16E6的量相关。
本发明还提供了一个诊断组织样品中HPV16E6表达的试剂盒，包括与报告酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)融合的、本发明的HPV16E6结合多肽、检测酶活性的试剂、和阳性和阴性对照组织切片。
本发明还提供了一个诊断组织样品中HPV16E6表达的试剂盒，包括通过抗体检测的与标记(如flag标记或myc标记)融合的本发明的HPV16E6结合多肽、一个特异于标记的一抗、特异于一抗并与报告酶偶联的二抗、检测酶活性的试剂，和阳性和阴性对照组织切片。诊断应用的一个领域就是在体内检测癌细胞或其聚集物。本发明提供了一个进行这种诊断的试剂盒，该试剂盒包括标记有一个鳌合物的、本发明的HPV16E6结合多肽、一种诊断用放射性同位素(非限制性的例子是68Ga、76Br、111In、99Tc、124I和125I等)，以及用于分析掺入效率的试剂。
如上所述，本发明涵盖了本发明的HPV16E6结合多肽将活性物质靶向表达HPV16E6的细胞如某些类型的癌症细胞的应用。本发明还提供了一个用于此目的的试剂盒，该试剂盒包括用一个鳌合物标记的本发明的HPV16E6结合多肽、一个治疗性放射性同位素(非限制性的例子是90Y、131I、211At)，以及用于分析掺入效率的试剂。
本发明还提供一种药物组合物，其包含：有效量的本发明所述的对人乳头瘤病毒16型的E6蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向人乳头瘤病毒16型的靶向性分子，和药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。
可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。
在使用时，是将安全有效量的本发明所述的对人乳头瘤病毒16型的E6蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向性分子施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约1微克/ 千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例一、HPV16E6结合多肽的文库构建及筛选研究
构建噬菌体展示HPV16E6结合多肽的随机组合文库，即许多不同的SPA结构域相关多肽的文库，从该文库中筛选HPV16E6结合多肽，并对其亲和性进行了鉴定。
1、HPV16E6结合多肽的随机组合噬菌体展示文库的构建和鉴定
根据野生型SPA-Z的氨基酸序列及结构(Nilsson B等，Protein Eng.1987； 1(2)：107-113)，针对其三个螺旋结构区对应的编码序列设计随机引物，利用PCR方法扩增获得可导致随机氨基酸突变的SPA编码序列，命名为SPA-N。
2、pCANTAB5E/SPA-N重组质粒的构建
选择以M13噬菌体系统(购自北京宝科维食安生物公司)进行亲和体的表达，以pCANTAB5E(购自北京宝科维食安生物公司)为载体，通过SfiI和NotI酶切位点构建pCANTAB5E/SPA-N重组质粒，转化至感受态E.coli TG1细胞，涂布2YT-A平板，培养过夜，标记为affibody初级库备用。结果：根据测序结果，送测序的48个克隆中有测序结果的为46个克隆，其中连接成功41个克隆，随机性完全不同，故重组率为41/48＝85％；多样性为21/21＝100％。同时，取上述转化后培养的菌液，用2×YT培养液倍比稀释(1∶10， 1∶102……)，涂布SOB-AG平板，克隆数达到2.4×106个Z蛋白变体(affibody分子)，其在第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35和43位具有随机的氨基酸残基。
3、HPV16E6结合多肽的筛选和滴度测定
将纯化的HPV16E6蛋白包被96孔酶标板，经封闭、加噬菌体文库(初级库)孵育、再加入E.coliTG1 37℃，轻摇温育；加1010辅助噬菌体M13K07(购自北京宝科维食安生物公司)和卡那霉素培养过夜，离心后取上清经0.22μm滤膜过滤，获得HPV16E6分子亲和筛选后的噬菌体一级affibody库。重复上述1轮富集筛选，获得HPV16E6分子亲和筛选后的噬菌体文库，为二级，滴度测定为1×105；在二级库的基础上再重复上述1轮富集筛选，为三级文库，滴度测定在1×106以上。同时设置不加噬菌体的空白对照作同步筛选。
4、HPV16E6结合多肽单克隆噬菌体的制备及ELISA鉴定
Phage-ELISA用于筛选表达HPV16E6结合多肽分子的噬菌体。将HPV16E6蛋白以 10μg/mL包被96孔酶标板，4℃过夜；PBS洗涤，用3％脱脂奶粉封闭2h；洗涤，取三轮筛选后获得的噬菌体与等体积的3％脱脂奶粉混匀，200μl/孔，37℃，2h。洗涤，加入1∶10000 稀释的HRP/anti-M13酶标二抗(兔抗M13，Abcam#ab6188)，200μl/孔，37℃，1h；洗涤，加入TMB显色液200μl/孔，37℃，15min；2M H2SO4 50μl/孔，终止反应；置酶标仪(ELx800TM，BIO-TEK，Winooski，USA)读取OD450值。结果，在三轮淘选循环中选择结合抗原的affibody分子，进一步用噬菌体ELISA检测以分析其HPV16E6结合活性，用高于 0D450＞0.5的ELISA值为选择标准，鉴定编码HPV16E6结合多肽的噬菌体，选择高于这个 ELISA信号值的66个克隆，进行DNA序列分析。
5、HPV16E6结合多肽的序列检测及筛选
66个单克隆经中国上海生工公司测序，结果获得60个完全正确克隆序列，有部分序列完全重复，兼并重复序列后获42个序列完全正确且不重复的克隆。根据DNA测序结果进行分析，在上述测序正确的42个克隆中，选择与HPV16E6蛋白结合活性最强的3个单克隆噬菌体的DNA序列(分别为ZHPV16E61115、ZHPV16E61171、ZHPV16E61235)作为靶目标进行下续研究，DNA序列分别为SEQ ID NO：6-8，如图1，编码的氨基酸序列如(SEQ ID NO： 2-4)。
实施例二、HPV16E6结合多肽重组质粒构建和原核蛋白表达及纯化
如前选择了具有较高phage-ELISA读数的3个克隆(图1中的ZHPV16E61115、ZHPV16E61171、 ZHPV16E61235)，为了对筛选的affibody分子进行功能检测，对其进行重组质粒构建、原核蛋白的表达及其鉴定，并制备纯化蛋白。
1、pET21a(+)/affibody的重组质粒构建和鉴定
参照affibody基因序列(GenBank：GY324633.1)设计PCR引物，上游引物 5’GGGAATTCCATATGGTTGACAACAAATTCAACAAAGAA 3’(SEQ ID NO：10，下划线表示Ned I酶切位点)，下游引物5’CCGCTCGAGTTTCGGAGCCTGAGCGTCG3’(SEQ ID NO：11，下划线表示Xho I酶切位点)；以筛选的测序正确三级库单克隆affibody ZHPV16E61115、ZHPV16E61171、ZHPV16E61235 为模板，通过PCR扩增affibody目的基因(SEQ ID NO：5-7)。通过常规克隆方法，将编码ZHPV16E61115、ZHPV16E61171、ZHPV16E61235三个affibody基因的DNA序列分别克隆至pET21a(+) 载体的Nde I和Xho I酶切位点，构建三个重组质粒：pET21a(+)/ZHPV16E61115、 pET21a(+)/ZHPV16E61171、pET21a(+)/ZHPV16E61235，并经测序鉴定(图2，图3)。同时将affibody Zwt(SEQ ID NO：1)经原核密码子优化后全序列(SEQ ID NO：8)合成作为阴性对照。
2、原核蛋白制备
将测序鉴定完全正确的重组质粒pET21a(+)/ZHPV16E6转化至E.coli BL21(DE3)大肠杆菌中以进行原核表达。经1mM异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(默克公司，德国)， 37℃诱导6小时后，表达带有His标签的ZHPV16E6及Zwt affibody蛋白。经诱导后表达的重组蛋白，用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)(QIAGEN公司，美国)亲和层析法纯化并经SDS-PAGE分析和Westernblotting鉴定。结果，pET21a(+)/ZHPV16E6重组质粒构建成功，并采用原核表达系统制备了纯化的ZHPV16E61115、ZHPV16E61171、ZHPV16E61235及ZWT affibody重组融合蛋白，经SDS-PAGE电泳分析(图4B)证实，出现考马斯亮蓝浓染的条带分子质量约6.5kDa，与预期ZHPV16E6 affibody多肽的分子质量大小一致。另外，Western bloting结果显示融合蛋白可以与抗His标签小鼠mAb特异性反应(图4C)。
实施例三、ZHPV16E6 affibody多肽与HPV16E6蛋白的结合
为鉴定ZHPV16E6affibody多肽与HPV16E6蛋白结合的特异性，利用表面等离子共振技术 (SPR)分析筛选的三个ZHPV16E61115、ZHPV16E61171、ZHPV16E61235分子及其对照Zwtaffibody与靶蛋白HPV16E6的特异性结合。
(1)HPV16E6重组蛋白的制备和鉴定
用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16E6基因，克隆至pET21a(+)载体，构建pET21a(+)/HPV16E6重组质粒，将测序鉴定完全正确的重组质粒pET21a(+)/HPV16E6转化至E.coli BL21(DE3)菌株中。经1mM IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳可见14kDa处出现较浓的诱导条带，与理论值大小一致(图5)。超声裂解后，SDS-PAGE电泳分析可知重组蛋白在沉淀中，以包涵体形式表达(图5)。通过6M盐酸胍溶解，Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白，在14kDa处出现明显单一的蛋白条带(图5)。以小鼠抗His-tag单抗为一抗 (1∶10000)进行Westernblotting分析，在14kDa处可见阳性单一反应条带(图5)。经鉴定的高纯度重组蛋白HPV16E6于透析复性后，-80度保存备用。
(2)ZHPV16E6 affibody多肽的传感器分析
在BIAcore T200生物传感器仪系统(Biacore公司)进行HPV16E6蛋白和ZHPV16E6affibody多肽之间相互作用的亲和力分析，即利用表面等离子共振技术(SPR)分析上述带有His标签的 ZHPV16E61115、ZHPV16E61171、ZHPV16E61235及Zwt affibody分子(作为对照)与HPV16E6之间的相互作用。根据操作手册，将HPV16E6重组蛋白偶联固定于CM5芯片上，以进行与筛选多肽之间的亲和力测定。第5个流动池表面被激活和失活以作为注射时的空白对照。用PH＝2.5 Runing Buffer梯度稀释ZHPV16E6affibody，和ZWT蛋白至6.4μM，3.2μM，1.6μM，0.8μM，流经芯片，检测其与靶蛋白的亲和力。所有的分析在25℃进行，注射标本的容量为200μl，并以流速30μl/min随机顺序注射，随后用HCl(BIO-RAD货号：#176-2250100mM HCl)洗涤 6min解离。利用BIA evaluation 3.0.2 software软件(Biacore)的1∶1朗缪尔结合模型分析结合曲线(感应图)。分析重复两次检测的结果，亲和力平衡解离常数KD均值，ZHPV16E61115、 ZHPV16E61171、ZHPV16E61235、和ZWT的解离平衡常数(KD)分别为1.67E-06mol/L，5.36E-06mol/L、 2.76E-06mol/L和1.404E-00mol/L，表明经筛选获得的ZHPV16E61115、ZHPV16E61171、ZHPV16E61235均能与HPV16E6重组蛋白结合，其结合的亲和力达到μmol/L级水平。与此同时野生型的Zwt affibody分子和HPV16E6重组蛋白几乎没有结合力，表明筛选出的3个affibody分子与 HPV16E6重组蛋白具有较高的特异亲和力，同时表明原核诱导表达的ZHPV16E6 affibody分子与 HPV16E6重组蛋白均具有生物活性(表1)。
因此，本发明获得的ZHPV16E6多肽分子与HPV16E6靶蛋白具有相互结合和识别能力。从蛋白水平验证了ZHPV16E61115、ZHPV16E61171、ZHPV16E61235分子与HPV16E6靶蛋白之间的亲和力。实施例四、ZHPV16E6 affibody多肽与表达HPV16E6蛋白的细胞结合
为进一步验证筛选的ZHPV16E6affibody多肽与HPV16E6靶蛋白的亲和力，利用表达HPV16E6 的宫颈癌细胞作为研究对象，即TC-1(c-Ha-ras和HPV16E6/E7癌基因共转化的C57BL/6 小鼠原代上皮细胞)，人宫颈癌细胞系Caski(ATCC：CRL-1550，表达HPV16阳性的宫颈癌细胞)，并利用HeLa229(ATCC：CCL-2HPV18阳性的宫颈癌细胞)和人鼻咽癌细胞系C666-1(ATCC：CVCL_7949，HPV阴性)作为对照，进一步验证ZHPV16E61115、ZHPV16E61171和ZHPV16E61235蛋白分子是否能与天然表达蛋白HPV16E6特异性结合。
细胞培养：TC-1，CaSki细胞培养于DMEM培养基(10％胎牛血清，2.05mM L-谷氨酞胺和100IU/ml青霉素及100μg/ml链霉素)，及HeLa229，C666-1培养于RPMI 1640培养基(10％胎牛血清，2.05mM L-谷氨酞胺和100IU/ml青霉素及100μg/ml链霉素)。细胞在 37℃含有5％CO2的培养箱中培养至24h，细胞状态良好时进行免疫荧光检测。
细胞免疫荧光检测：将灭菌的盖玻片放入六孔板中，按1×104细胞数量的TC-1、CaSki、 HeLa229，C666-1均匀铺板，5％CO2、37℃培养24h至单层细胞。加入终浓度为100μg/ml ZHPV16E6 affibody多肽于上述含10％FBS培养基中，5％CO2、37℃继续培养6h，吸出培养液，用预冷PBS洗涤；采用4％多聚甲醛固定单层细胞15min，PBST洗涤3次，加入 0.3％Triton X-100打孔15min，洗涤后加入含20％FBS的培养基37℃封闭1h，洗涤；随后加入鼠抗His单克隆抗体(ABR公司，美国，1∶2000)、置4℃12小时以上。洗涤后加FITC- 羊抗鼠IgG二抗(上海联科生物技术公司，中国)和PI(索莱宝公司，北京)2μl/孔1h，避光，洗涤后加盖玻片并用抗荧光猝灭剂封片，共聚焦荧光显微镜(Leica TCS SP2 microscope 德国)观察并拍片。
结果显示，ZHPV16E61115、ZHPV16E61171、ZHPV16E61235重组蛋白孵育的TC-1和CaSki细胞株在细胞浆和细胞核中出现明显的团块状绿色荧光，而HeLa229和C666-1细胞中无绿色荧光出现(图7A-7C)。同时Zwt对照肽孵育的TC-1、CaSki、HeLa229和C666-1细胞株的细胞浆均未见明显的荧光团块(图7D)。实验结果本发明制备的ZHPV16E61115、ZHPV16E61171、 ZHPV16E61235重组蛋白和活细胞表达的HPV16E6蛋白有很强的特异结合能力。
上述结果进一步从细胞水平验证了ZHPV16E61115、ZHPV16E61171和ZHPV16E61235重组蛋白与 HPV16E6蛋白具有很强的靶向结合特异性和亲和力。
实施例5、ZHPV16E6 affibody多肽与表达HPV16E6蛋白的组织结合
按3μm厚度进行组织切片，放置在载玻片上，并在60℃下烘烤60分钟。取出切片迅速置于二甲苯中脱蜡10min。然后依次放入100％，95％，85％，75％酒精中各水化3min，蒸馏水中轻晃漂洗2min。随后进行内源性过氧化物酶阻断剂阻断，室温浸泡10min，PBS洗3次/5min。然后，将切片放置于煮沸的柠檬酸盐抗原修复液中，高温高压修复3min，冷却至室温，PBS洗3 次/5min。在自来水中洗涤后，然后用10％正常山羊血清进行非特异性位点封闭。随后，用PBS 稀释重组蛋白ZHPV16E61115，ZHPV16E61171，ZHPV16E61235至终浓度为200μg/ml，滴加于玻片上，置于 4℃过夜；然后，用抗体稀释液稀释鼠源一抗His-tag(1∶200)，滴加于玻片上，同时设置阳性对照组抗HPV16E6兔血清多克隆抗体(1∶1000)和阴性对照组ZWT和PBS，置于湿盒37℃孵育1h，PBST洗3次/5min。按照说明书要求孵育相应的HRP标记的IgG(H+L)二抗，置于湿盒37℃孵育1h。取出片子，PBST洗3次/5min，然后滴加DAB显色液于组织上显色，反应1min后置于水中中止反应。随后进行苏木精复染5min，流动水冲洗10min。按顺序放入不同梯度酒精(75％， 85％，98％，100％)各脱水3min，二甲苯透化15min。最后用中性树脂封片，在显微镜下进行观察并拍照。
结果：取人宫颈癌(HPV16阳性)和正常宫颈(HPV16阴性)石蜡组织，制成切片。用重组蛋白ZHPV16E61115、ZHPV16E61171和ZHPV16E61235孵育肿瘤组织12h，同时以HPV16E6特异性兔多克隆抗体作为阳性对照，以孵育野生型ZWT蛋白和PBS作为阴性对照。结果如图8所示，与孵育HPV16E6特异性兔多克隆抗体结果相似，孵育重组蛋白ZHPV16E61115、ZHPV16E61171和ZHPV16E61235的人宫颈癌组织切片，显微镜下可见肿瘤细胞浆和细胞核中有明显的黄褐色沉淀，而孵育ZWT蛋白和PBS的肿瘤细胞中未见阳性颗粒沉淀。另外人正常宫颈组织切片中，孵育ZHPV16E61115、 ZHPV16E61171和ZHPV16E61235蛋白后均未见黄褐色沉淀。这些结果表明ZHPV16E6affibody重组蛋白对 HPV16阳性人宫颈癌组织中的HPV16E6具有较好的特异性靶向结合能力。
实施例6、ZHPV16E6 affibody多肽在宫颈癌细胞荷瘤裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向
在本实施例的实验中，选择上述ZHPV16E6 affibody多肽作为检测对象，用近红外荧光染料 DyLight755 NHS Ester(Thermo Fisher公司，美国，货号62278)标记ZHPV16E6affibody多肽，并将其注射到携带TC-1、HeLa229移植肿瘤的小鼠体内，进行ZHPV16E6affibody多肽生物分布研究，并对裸小鼠成像定位以研究标记多肽的靶向特性。
(1)动物肿瘤模型的制备：选择4-6周龄BALB/c-nu小鼠，雌性，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，动物合格证号：SYXK(苏)2018-0027；饲养于温州医科大学动物实验中心SPF环境。将培养至对数生长期，生长状态良好的TC-1和HeLa229用EDTA(胰酶)消化后，用含10％血清细胞培养液进行吹打、收集，常温1000转/min离心5min，将离心细胞用不含血清的培养液重悬并计数，配制成1×107/ml，取0.2ml选择裸鼠右侧腋下部位缓慢皮下注射细胞悬液。每隔 3天观察小鼠的精神状态、活动力、反应、饮食、体重及皮下接种区域外观及触感，并以电子游标卡尺测量瘤体大小直径。待肿瘤长至300-500mm3用于检测ZHPV16E6affibody多肽的生物分布和成像研究。
结果显示，所有荷瘤裸鼠接种肿瘤细胞后一般状况尚可，反应敏捷，活动量正常，进水及进食量无明显变化，体重随裸小鼠的周龄逐渐增长。TC-1和HeLa229荷瘤裸鼠的成瘤潜伏期分别为2.51±1.25天，8.00±2.87天。随着接种时间推移，肿瘤体积不断增长。实验组 24只荷瘤裸鼠全部存活，成瘤率均为100％。
(2)ZHPV16E6多肽近红外荧光染料Dylight755标记及鉴定：按照说明书步骤进行Dylight755 的标记并鉴定。将购买的Dylight755荧光染料粉末12000rpm，4℃离心10min，加入1mLDMF 溶液溶解染料。另外，纯化、透析重组蛋白ZHPV16E61115、ZHPV16E61171和ZHPV16E61235以及野生型ZWT蛋白，调整终浓度至500μg/mL。分别取1mL重组蛋白ZHPV16E61115、ZHPV16E61171和 ZHPV16E61235以及野生型ZWT蛋白于棕色EP管中，加入100μL Dylight755荧光染料，混匀充分后置于4℃冰箱偶联过夜。取10μL过夜偶联后的荧光蛋白进行15％SDS-PAGE电泳分析，电泳过程中注意避光；另外值得注意的是：无需进行考马斯亮蓝染色，直接将凝胶放于活体成像仪(CRi Maesro 2.10，in-vivo fluorescenceimaging system)中，激发光滤片为671-705nm，发射光滤片为750longpass，采用8bit和2×2模式，用730-950nm波长间隔10nm每次曝光5000ms收集图像信息，用Maesro软件进行图像处理及分析。经鉴定的Dylight755-ZHPV16E6分装于棕色离心管，-20℃保存备用。
结果显示，用Dylight755荧光染料对ZHPV16E61115、ZHPV16E61171、ZHPV16E61235和ZWT重组蛋白进行荧光标记，经15％SDS-PAGE凝胶避光电泳后，于小动物活体成像仪下观察，在相对分子质量为6.5kDa处出现单一的红色荧光条带，表明重组蛋白标记成功(图9)。用一次性胰岛注射器抽吸偶联成功后的荧光蛋白，通过尾静脉注射到裸鼠体内，观察 Dylight755-ZHPV16E6在裸鼠体内的分布和代谢情况。
(3)ZHPV16E6 affibody多肽在肿瘤细胞异种移植物的裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向作用：待裸鼠的肿瘤长至300-500mm3时将裸鼠带出SPF屏障系统，用10％水合氯醛腹腔注射诱导麻醉，待其进入深度麻醉状态后经尾静脉分别注射100μL Dylight755-ZHPV16E61115、Dylight755-ZHPV16E61171、Dylight755-ZHPV16E61235以及Dylight755-ZWT荧光重组蛋白，注射过程中注意蛋白的避光。随后，将其置于小动物活体成像仪(CRi Maesro 2.10，in-vivofluorescence imagingsystem)中成像，并用0.8-1.0μl/g水合氯醛维持麻醉状态，以保证小鼠在成像过程中处于深度麻醉，在5min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h， 72h拍照，获取荧光标记重组蛋白在裸鼠体内的代谢情况。成像的激发光滤片为671-705nm，发射光滤片为750long pass，采用8bit和2×2模式，730-950nm波长间隔10nm每次曝光 5000ms收集图像信息，并用Maesro软件进行图像处理及分析，分别显示背景自发荧光和目标荧光信号，然后测量其荧光值，将背景自发荧光设置为黑色，目标荧光信号设置为红色，最后将两种色彩相叠加。所得数据用GraphPAD软件进行处理。
结果，在TC-1异种移植荷瘤裸鼠肿瘤模型中，我们观察到在注射后30min，肿瘤部位即出现明显强于皮肤的荧光信号。随后于注射后1h可获得高对比度荧光信号，并与2小时达到峰值。 Dylight755-ZHPV16E61115，Dylight755-ZHPV16E61171能在肿瘤部位中维持超过8h而Dylight755-ZHPV16E61235能维持超过12h(图11A，B)。在HeLa229异种移植荷瘤裸鼠肿瘤模型中，我们观察到在注射后30min荧光蛋白非特异性聚集于肿瘤组织，随后于1-2h荧光信号强度逐渐减弱消失(图11C，D)。另外，我们将Dylight755标记的affibody分子经尾静脉注射入没有肿瘤异种移植物的正常无胸腺裸鼠体内，我们观察到荧光信号5分钟内遍布全身，随后荧光信号逐渐向双肾聚集并于8h内达到高峰，之后逐渐下降，于48h基本排出，至72h代谢完全(图10)，这表明Dylight755标记的亲和体分子呈现经肾脏代谢的特点。结果表明，标记Dylight755-ZHPV16E6多肽具有靶向结合HPV16E6表达阳性肿瘤的特性，且呈现经肾脏代谢的特点。
实施例7、ZHPV16E61235和ZHPV16E7384联合使用对HPV16阳性细胞生长的协同抑制作用。
本实施例选择HPV16阳性的TC-1和CaSki肿瘤细胞株作为实验对象。利用CCK-8试剂检测单独或组合使用ZHPV16E61235和ZHPV16E7384(靶向HPV16 E7)在细胞中的细胞生长抑制效果。按5×103细胞量接种到96孔板上，然后将不同浓度试剂(0.5、1、2.5、5、10和20μM) 加入到细胞中，共孵育2天。同时，用ZWT处理的HPV16阳性细胞和用不同浓度试剂处理的 HPV16阴性细胞(包括HPV18阳性HeLa229细胞和HPV阴性C666-1细胞)作为阴性对照。接下来，将10ul CCK-8溶液(Cell Counting Kit-8，GC-0030，CN)加入每个孔中，然后再孵育30分钟。使用酶标仪测量了在450nm处的吸光度，使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software，Inc.)计算半数最大抑制浓度(IC50)值。
CCK-8结果显示，与ZHPV16E7384多肽组处理结果相类似，在0.5至20μM的范围内ZHPV16E61235 affibody多肽能够以浓度依赖的方式抑制了HPV16阳性肿瘤细胞系的细胞增殖活力。值得注意的是，我们发现相较与任何一种单独用药策略，联合使用ZHPV16E61235和ZHPV16E7384能够明显增强其抗增殖效果(图12A，B)。另外，我们进一步通过克隆形成实验验证了上述实验结果。克隆形成实验被视为衡量细胞对药物治疗敏感性的“金标准”。如预期的那样，用 ZWT处理的HPV16阳性细胞，和单独或联合使用ZHPV16E61235和ZHPV16E7384处理的HPV18阳性细胞和HPV阴性C666-1细胞仍然完全存活(图12C，D)。经过统计分析，TC-1细胞中ZHPV16E61235，ZHPV16E7384以及其联合使用的IC50值分别为7.202μM，11.460μM和3.071μM。在Caski细胞中，对应的这些值为9.975μM，14.480μM和4.843μM。进一步使用了 Chou-Talalay分析方法。根据IC50值，ZHPV16E61235(1、5或10μM)和ZHPV16E7384(10μM) 的协同抑制肿瘤细胞增殖活性结果被证明是具有统计学意义的(表2)。
因此，这些发现表明ZHPV16E61235与ZHPV16E7384 affibody多肽具有协同抑制HPV16阳性细胞增殖的作用。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 一种对 HPV16E6 蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(58)
<400> 1
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1 5 10 15
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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(58)
<400> 2
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Pro Lys Ser Ala Leu Thr Glu
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Ile Val Gln Leu Pro Asn Leu Asn Pro Ala Gln Gly Gly Ala Phe Ile
20 25 30
Gly Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu
35 40 45
Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(58)
<400> 3
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Phe Thr Glu Ala Arg Gly Glu
5 10 15
Ile Arg His Leu Pro Asn Leu Asn Val Gly Gln Val Gly Ala Phe Ile
20 25 30
Arg Ser Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu
35 40 45
Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(58)
<400> 4
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Ser Thr Tyr Ala Gln Arg Glu
5 10 15
Ile Pro Asn Leu Pro Asn Leu Asn Arg Gln Gln Pro Pro Ala Phe
20 25 30
Ile Glu Ser Leu Pro Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu
35 40 45
Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
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<212> DNA
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<212> DNA
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gcacctgccg aacctgaacg aagaacagcg taacgctttc atccagtctc 100
tgaaagacga cccgtctcag tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa 150
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tgctggacga cccgtctcag tctgctgaac tgctggctga agctaaaaaa 150
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tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174
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<211> 58
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<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(58)
<400>12
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Leu Trp Ala Ser Met Glu
5 10 15
Ile Leu Thr Leu Pro Asn Leu Asn Asp His Gln Ala Leu Ala Phe
20 25 30
Ile Glu Ser Leu Gln Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu
35 40 45
Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
Claims (15)
1.一种对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽，其特征在于：所述多肽是以葡萄球菌A蛋白Z结构域的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽，所述多肽的氨基酸序列选自：SEQ ID NO：2-4任一所示的序列。
2.根据权利要求1所述的一种对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽，其特征在于：该多肽与HPV16E6蛋白相互作用的KD值为1×10-5M至1×10-7M。
3.一种靶向HPV16E6蛋白的靶向性分子，其特征在于，所述的靶向性分子包括权利要求1或2任一所述的多肽，以及与该多肽相连接的偶联物，所述的偶联物包括：半胱氨酸残基，和/或多肽标签，和/或可检测标记物，和/或抑制HPV16E6病毒的药物，和/或抗肿瘤药物。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，多核苷酸为编码权利要求1或2所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽的多核苷酸。
5.一种多核苷酸，其编码所述的靶向HPV16E6的靶向性分子，且其中所述的偶联物是肽，肽为His标签(如6×His)，或Myc标签，或GST标签，或Flag标签。
6.一种重组载体，其特征在于，该载体包含权利要求4或5所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞包含权利要求6所述的重组载体，或其包含有基因组中整合有权利要求4或5所述的多核苷酸。
8.权利要求1任一所述的对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽或权利要求3任一所述的一种靶向HPV16E6蛋白的靶向性分子的用途，其特征在于，用于制备治疗HPV16E6感染疾病或HPV16E6表达阳性肿瘤的药物；或用于制备检测HPV16E6病毒感染的检测试剂；或用于制备诊断HPV16E6感染疾病或HPV16E6表达阳性肿瘤的诊断试剂。
9.权利要求3任一所述的一种靶向HPV16E6蛋白的靶向性分子的用途，其特征在于，所述的偶联物是抑制HPV16E6病毒的药物或抗肿瘤药物，用于制备治疗HPV16E6病毒感染疾病或HPV16E6表达阳性肿瘤的药物；
或所述偶联物是多肽标签或可检测标记物，用于制备检测HPV16E6病毒感染的检测试剂或用于制备诊断HPV16E6病毒感染疾病或HPV16E6表达阳性肿瘤的诊断试剂。
10.一种药物组合物，其特征在于，其包含：权利要求1或2任一所述的一种对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽或权利要求3所述的一种靶向HPV16E6蛋白的靶向性分子；和药学上可接受的载体。
11.一种用于诊断HPV16E6病毒感染疾病或HPV16E6表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求3任一所述的一种靶向HPV16E6蛋白的靶向性分子和检测靶向性分子的检测试剂，所述靶向性分子包括多肽标签或者可检测标记物。
12.一种用于治疗HPV16E6病毒感染疾病或HPV16E6表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求1或2任一所述的一种对HPV16E6蛋白具有结合亲和力的多肽，或权利要求3所述的靶向HPV16E6蛋白的靶向性分子，或权利要求8所述的药物组合物。
13.根据权利要求12所述的一种用于治疗HPV16E6表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，还包括有对HPV16E7蛋白具有结合亲和力的多肽。
14.根据权利要求13所述的一种用于HPV16E6表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，所述对HPV16E7蛋白具有结合亲和力的多肽为如SEQ ID NO：12所示的序列。
15.根据权利要求13或14所述的一种用于治疗HPV16E6表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，所述HPV16E6表达阳性肿瘤包括：宫颈癌、头颈部肿瘤或外生殖器肿瘤。
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| 彭方毅;姜海蓉;彭方亮;赵卫兵;林治华;陈远翔;陈胜珍;: "HPV16E6基因原核表达载体的构建及表达", 生物医学工程学杂志, no. 04, 25 August 2010 (2010-08-25) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113173978B (zh) | 2024-03-01 |
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