CN108484781B

CN108484781B - 一种纳米抗体与铜绿假单胞菌外毒素的融合蛋白及应用

Info

Publication number: CN108484781B
Application number: CN201810368770.XA
Authority: CN
Inventors: 宋海鹏; 于建立; 刘原源; 黄琪; 李飞; 古一; 周宇杭
Original assignee: Shenzhen Innova Nanobodi Co ltd
Current assignee: Shenzhen Innova Nanobodi Co ltd
Priority date: 2018-04-23
Filing date: 2018-04-23
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2038-04-23
Also published as: CN108484781A

Abstract

本发明公开了一种纳米抗体与铜绿假单胞菌外毒素的融合蛋白，所述融合蛋白由具有靶向作用的纳米抗体或其可变区片段与铜绿假单胞菌外毒素串联而成。本发明还提供了所述融合蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用。所述融合蛋白针对肿瘤抗原良好的特异性和杀伤效果，并对正常组织细胞具有保护作用，具有良好的临床应用前景。

Description

一种纳米抗体与铜绿假单胞菌外毒素的融合蛋白及应用

技术领域

本发明公开了一种融合蛋白及其免疫学应用，属于多肽技术领域，更具体地，属于免疫球蛋白技术领域。

背景技术

肿瘤是严重危害人类健康的重要因素。传统的化疗药物和放疗都具有靶向性差的特点，因此靶向药物的研发已经成为恶性肿瘤治疗的研究热点。最初针对肿瘤细胞的靶向治疗应用的是无标记的单克隆抗体，目的是诱导细胞死亡或者是利用补体介导的细胞毒的作用来杀伤靶细胞，但是癌细胞通常会表现出抗凋亡的功能，而且它也可以将抗原频繁调变来避免上述两种杀伤机制对其造成的损伤。随后又出现了放免治疗技术，它不但可以增加细胞毒性作用，而且还很小程度上依赖抗原抗体特异性结合和诱导细胞死亡的机理；然而该技术仍有很大的毒副作用尤其是表现在骨髓抑制作用上面，由此阻碍了该技术在疾病诊疗中的应用。第三种是抗体药物分子偶联技术(ADC)，通过将毒性小分子偶联到抗体分子上，通过抗体分子的特异性将毒性分子带到肿瘤细胞表面并且内化，释放出毒性分子杀伤肿瘤细胞。这种技术需要寻找具有肿瘤靶向性和内吞作用的抗体及其受体，毒性分子在血液中会脱落而对正常细胞产生毒性，因此其应用有一定的局限性。第四种导向治疗就是目前研究的比较热的重组免疫毒素(Immunotoxins，ITs)技术，该技术的机理是靶细胞将毒素内化后进而发挥毒素的细胞毒作用，而对非靶细胞则没有相应的细胞毒作用。由于毒素分子与抗体是通过连接肽共价结合，在血液中不会脱落，而且毒素分子本身带有跨膜转运的序列，不需要具有内吞作用的抗体及其受体的介导，任何针对细胞膜表面抗原的抗体都可以使用，应用范围广泛。

免疫毒素是一种有效的肿瘤导向治疗药物，又称为生物导弹，是一种具有特异性靶细胞杀伤效应的杂合分子，主要由毒素部分与靶向部分组成。它由生物来源的毒素分子与肿瘤特异性抗体或肿瘤细胞表面受体相应的配体偶联而成，通过肿瘤特异性抗体或配体在体内的导向作用，将毒素效应分子定向地带至病灶部位，针对性杀死肿瘤细胞或病变细胞，减少对正常组织的伤害。免疫毒素抑制肿瘤细胞增殖主要通过以下两种方式：一是通过与细胞表面受体结合，经内化使免疫毒素进入细胞，通过抑制癌细胞的蛋白质合成导致细胞死亡或激活重要的凋亡蛋白而导致细胞凋亡；二是毒素蛋白直接作用于细胞膜，使细胞膜通透性增加，导致细胞死亡。ITs的制备中最常用到的毒素有铜绿假单胞杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A，PE)以及白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)等由细菌产生的毒素，还有植物细胞产生的蓖麻毒素(Ricin)、相思子毒素(Abrin)和肥皂草毒素(Saporin)，还有其它细胞产生的毒素如蜜蜂体内产生的蜂毒肽。

随着抗体技术和基因工程技术的快速发展，第一代的化学偶联的ITs逐步被第二代的重组ITs所替换，原因是第二代的ITs与第一代的相比具有融合蛋白更稳定，分子量更低以及组织渗透性更好的优势。用PE类毒素研制的ITs具有更高的杀伤效率以及更高的特异性，而且与DT类毒素相比机体内没有预存在抗体等好处，使得重组ITs称为目前应用最广研究最热的肿瘤治疗的技术。

当前ITs设计的载体的选择依据无非是受体-配体和抗原-抗体的利用，癌细胞表面会过量表达各种生长因子受体、DC分子和肿瘤标志抗原等。单抗因为能特异性识别与结合肿瘤细胞表面的抗原，所以成为了目前研究领域里最受欢迎的载体分子。然而因其多数是来源于与小鼠体内，而且分子量比较大，不但具有很强的免疫原性还具有很低的穿透性，所以在实际科研和应用中都大大限制了该抗体的发展。为了克服上述缺点，当下制备重组ITs多数采用的分子量比较小的抗体，如单链抗体(scFv)等。相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。

本发明的目的就是提供一种免疫毒素与纳米抗体的融合蛋白，既能充分发挥其靶向药物的作用，并且具有良好的靶向性和通透性，能在发挥对肿瘤细胞的充分毒性杀伤作用的同时避免对正常细胞的损伤，为其在肿瘤临床治疗中的应用奠定基础。

发明内容

基于上述发明目的，发明人意欲采用基因重组表达的方式，表达纳米抗体和铜绿假单胞杆菌外毒素PE40重组融合蛋白，用于临床靶向治疗。

因此，本发明首先提供了一种纳米抗体与铜绿假单胞菌外毒素的融合蛋白，所述融合蛋白由具有靶向作用的纳米抗体或其可变区片段与铜绿假单胞菌外毒素串联而成。本发明中，将该纳米抗体命名为靶向纳米抗体。在所述靶向纳米抗体和铜绿假单胞杆菌外毒素之间可以添加连接肽以使抗体片段和铜绿假单胞杆菌外毒素基因能够各自表达和形成自身的空间构型，不造成抗体片段和铜绿假单胞杆菌外毒素基因蛋白的空间位阻，都具有相应的生物学活性，连接肽可以是(GGGGS)_n柔性多肽，其中，n为1-6的整数，优选地n＝3。

在一个优选的技术方案中，所述融合蛋白还通过连接肽与铜绿假单胞菌外毒素的配体串联，所述连接肽含有基质金属蛋白酶的作用位点序列。这里所述的铜绿假单胞菌外毒素的配体是指能够与铜绿假单胞菌外毒素特异性结合，从而阻止铜绿假单胞菌外毒素发挥其生物学效应的分子。

在一个更为优选的技术方案中，所述铜绿假单胞菌外毒素的配体为抗铜绿假单胞菌外毒素的纳米抗体。本发明中，将该纳米抗体命名为保护性纳米抗体。

所述靶向纳米抗体或者抗体片段和免疫毒素及其保护性纳米抗体或者抗体片段的融合方式，可以是在靶向抗体片段羧基端融合一个或者几个PE40毒素，在每个PE40毒素的羧基端融合一个或者多个保护性抗体片段。所述保护性抗体片段可以是不同的抗体片段，分别针对同一免疫毒素的不同抗原决定簇。所述靶向抗体片段也可以是一个或者多个不同的抗体片段，分别针对同一抗原的不同抗原决定簇或者不同的抗原分子。

在一个优选的技术方案中，所述铜绿假单胞菌外毒素氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在一个优选的技术方案中，所述融合蛋白与铜绿假单胞菌外毒素的配体串联的连接肽中基质金属蛋白酶的作用位点序列如SEQ ID NO:2中第1位-第10位氨基酸残基所示。

在铜绿假单胞杆菌外毒素基因和保护性抗体片段之间的连接肽中可以添加间隔序列以使保护性抗体抗体片段和铜绿假单胞杆菌外毒素基因能够各自表达和形成自身的空间构型，不造成抗体片段和铜绿假单胞杆菌外毒素基因蛋白的空间位阻，都具有相应的生物学活性，间隔序列可以是(GGGGS)_n柔性多肽，其中，n为1-6的整数，优选地n＝3。

在一个更为优选的技术方案中，所述融合蛋白与铜绿假单胞菌外毒素的配体串联的连接肽序列如SEQ ID NO:2所示。

在一个优选的技术方案中，所述具有靶向作用的纳米抗体为抗肿瘤抗原的纳米抗体。

在一个更为优选的技术方案中，所述肿瘤抗原为CEACAM-5。

在一个尤为优选的技术方案中，所述抗肿瘤抗原的纳米抗体的可变区序列氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

其次，本发明还提供了上述的融合蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明所述融合蛋白是在DNA水平上将编码靶向抗体或者抗体可变区片段的基因和编码铜绿假单胞菌外毒素的报告基因及其纳米抗体基因融合后，通过重组表达的方法，在如大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或者哺乳动物细胞中表达的重组融合免疫毒素。

在传统的融合免疫毒素技术中，常选择单克隆传统抗体作为靶向分子，但是传统抗体分子量大，穿透性低，大大限制了抗体充分发挥其靶向作用。PE毒素在去掉了与细胞结合的功能区后(PE40)，虽然能够大大降低非特异性毒副作用，但并不能完全避免对正常细胞的损伤，多种肿瘤相关抗原在正常细胞表面都有表达，免疫毒素也可能通过非特异结合的方式结合到正常细胞表面，造成不同程度的毒副作用。而本发明提供的融合免疫毒素恰恰克服了这两个技术缺陷，选择纳米抗体作为靶向分子不仅降低了融合免疫毒素的整体分子量，且纳米抗体的穿透性较强，特定的序列组合保证了纳米抗体和免疫毒素形成各自的空间结构，使其充分发挥各自的生物活性。并且我们又在已构建的融合免疫毒素的基础上又添加了针对免疫毒素的保护性纳米抗体，但其对肿瘤细胞同样起到了保护作用，从而也失去了靶向杀伤的目的。然而，肿瘤细胞在浸润和转移过程中，会分泌一些基质金属蛋白酶(MMP)，如MMP2和MMP9从而降解基底膜促进肿瘤组织的生长和转移，而正常细胞不会表达MMP。所以，我们在毒素与其保护性纳米抗体之间又增加了MMP的识别位点，这样毒素在没有到达靶细胞之前就不会对细胞有杀伤作用，而在到达靶细胞位置时，其中的保护性纳米抗体就会被肿瘤细胞分泌的MMP切割掉，失去对毒素的保护性作用，免疫毒素的活性位点因此而得到暴露，通过纳米抗体识别肿瘤细胞表面的抗原，进入靶细胞诱导肿瘤细胞的凋亡。本发明以CEACAM5抗原为例，将抗CEACAM5纳米抗体11C12融合铜绿假单胞菌外毒素，对比添加保护性抗体2F2前后融合免疫毒素的毒性变化。结果显示，保护性免疫毒素对人结直肠癌细胞系SW480和LoVo细胞均具有较好的杀伤效应，融合免疫毒素的浓度与肿瘤细胞存活率之间有较明显的相关性，呈较好的剂量-效应关系，而该融合毒素与正常人结肠上皮细胞不存在明显的剂量-效应关系。在保护性免疫毒素浓度约为10μg/mL时对SW480和LoVo细胞均具有明显的杀伤作用，在浓度大于10μg/mL时正常细胞存活率与癌细胞存活率之间的方差P值小于0.01，具有统计学意义，该保护性性免疫毒素对大肠癌细胞具有显著的杀伤效果。保护性免疫毒素的MMT实验中细胞的存活率均高于非保护性免疫毒素MTT实验中细胞的存活率，说明PE毒素的保护性纳米抗体对PE毒素起到了一定的保护作用。这一结果符合纳米抗体的技术效果预期，也充分证明了本发明融合免疫毒素在实际应用中的前景。

附图说明

图1.抗CEACAM-5纳米抗体细胞ELISA鉴定结果；

图2.pET28a-11C12/PE40载体构建示意图；

图3.PCR扩增纳米抗体及PE40凝胶鉴定结果；

图4.融合PCR反应凝胶鉴定结果；

图5.质粒pET28a-11C12/PE40双酶切鉴定结果；

图6.pET28a-11C12/PE40/2F2载体构建示意图；

图7.PCR扩增11C12/PE40及2F2凝胶鉴定结果；

图8.质粒pET28a-11C12/PE40/2F2的三酶切鉴定结果；

图9.pET28a-11C12/PE40诱导表达结果；

图10.pET28a-11C12/PE40/2F2诱导表达结果；

图11.融合免疫毒素的western blot鉴定结果；

图12.融合免疫毒素MMP酶切结果；

图13.融合免疫毒素的纯化结果；

图14.融合免疫毒素间接免疫荧光结果；

图15.11C12/PE40对SW480和LoVo细胞的作用曲线图；

图16.11C12/PE40/2F2对SW480和LoVo细胞的作用曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1融合免疫毒素制备实施例

1.1羊驼的免疫：选取健康成年羊驼一只羊，将铜绿假单胞菌外毒素与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，按6-7μg/kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。

1.2驼源淋巴细胞的分离：按照本技术领域常规程序从采集的驼源抗凝全血中分析淋巴细胞，每2.5×10⁷个活细胞加入1mL RNA分离试剂，取1mL进行RNA提取，其余-80℃保存。

1.3总RNA提取：按照本技术领域常规程序提取总RNA，用RNase-free水调整浓度到1μg/μL。

1.4反转录合成cDNA：根据逆转录试剂盒说明书(Roche公司的transcripor firststand cDNA synthesis KIT)以1.3步骤获得的RNA为模板进行逆转录cDNA。

1.5抗体可变区基因扩增：将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：

CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG

CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃7分钟使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μL。

第二轮PCR的引物序列如下：

VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG

VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT

PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，15个循环；72℃7分钟使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物。

1.6载体构建：将pMES4与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μL T₄DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μL总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μL水洗脱。1％琼脂糖电泳凝胶检测pMES4载体双酶切结果。

1.7电转化及库容测定：取10μL纯化后的连接产物，加入到含有50μL大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(美国BTX的ECM630电转仪)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选18个克隆，进行菌落PCR鉴定。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性率×10)。

引物序列如下：

MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG

GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG

1.8噬菌体扩增：取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃,200rpm培养到培养物OD₆₀₀＝0.5。取出10mL菌液加入4×10¹⁰VCSM13，37℃静止感染30分钟。4000rpm，常温离心10分钟，去净上清。用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃,200rpm培养过夜。离心取上清40mL管中，加入10mL PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1mL冰PBS洗涤离心，取上清250μL预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。

测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD₆₀₀＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。

噬菌体滴度(pfu/ml)＝稀释倍数×噬菌斑数目×100

1.9纳米抗体筛选：通过ELISA方法以抗原筛选阳性克隆。以PE40包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μL噬菌体上清液，37℃放置1小时。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1小时。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5小时，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。挑选噬菌体ELSIA结果阳性的克隆，进行测序，筛选出获得抗铜绿假单胞菌外毒素的纳米抗体。

根据1.1-1.9的程序，以相同的方法筛选出抗CEACAM-5的纳米抗体。

1.10细胞ELISA鉴定：从筛选出的抗CEACAM-5纳米抗体中，选择11C12、2D5、6E8进行细胞ELISA鉴定。分别以2×10⁴/孔的量接种CEA表达阳性的大肠癌细胞和表达阴性的正常细胞于96孔细胞培养板，100μL/孔，过夜培养。用含1％CEA的PBS溶液洗涤1次后，以4％多聚甲醛固定，并滴加3％过氧化氢溶液以阻断内源性过氧化物酶活性，于室温下孵育30min。PBS洗板3次，加入含2％BSA的PBS溶液于37℃孵育2h进行封闭。用PBST洗板3次后，每孔加入100μL含1％BSA和0.1％Tween-20的单克隆噬菌体样品，同时以不展示VHH的野生型VCSM13噬菌体为阴性对照样品，在37℃孵育2h。用PBST洗板3次后，每孔加入100μL含1％BSA的anti-M13-HRP抗体(1:5 000稀释)，在37℃孵育1h。用PBST洗板6次后，每孔加入TMB显色液100μL，在室温下反应15min，随后加入50μL硫酸(浓度为2mol/L)终止显色，并在酶标仪上测定光密度值OD₄₅₀。结果见图1，纳米抗体11C12、2D5和6E8均能特异性结合CEA表达阳性的大肠癌细胞，而不与CEA表达阴性的正常细胞2950结合。

1.11融合免疫毒素载体构建：选择可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:3的纳米抗体11C12(公开于CN 106946989A)作为靶向CEACAM-5的纳米抗体。载体构建示意图见图2。根据PE40、11C12基因序列设计出融合PCR上、下游引物，同时在11C12基因片段的3’端引入Nco I酶切位点及保护性碱基，在PE40基因片段的5’端引入EcoR I酶切位点及保护性碱基。11C12的上游引物命名为11C12-F，下游引物命名为11C12-R。PE40的上游引物命名为PE40-F，下游引物命名为PE40-R。分别以pMES4-11C12和pUC57-PE40(金唯智公司合成)为模板，PCR扩增11C12和PE40基因片段。PCR反应条件及程序为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃7min。图3A为扩增产物11C12进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，M为Trans 2K DNAMarker；1为阴性对照；2为PCR产物。图3B为扩增产物PE40进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，M为Trans 5K DNA Marker；1为PCR产物；2为阴性对照。使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物。将11C12和PE40进行融合PCR，PCR体系见表1。融合PCR反应条件及程序为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。将上述融合PCR扩增产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观察电泳结果，见图4：M为Trans 5K DNA Marker；1为融合PCR产物。按凝胶回收试剂盒说明书操作回收并纯化1.5kb的目的DNA扩增片段。使用Nco I和EcoRⅠ将11C12-PE40克隆至载体pET28a，构建质粒pET28a-11C12/PE40。图5为质粒pET28a-11C12/PE40双酶切鉴定结果：M为Trans 5K DNA Marker；1为未酶切质粒pET28a-11C12/PE40；2为双酶切产物。

表1.融合PCR反应体系

1.12保护性融合免疫毒素载体构建：选择2F2作为融合免疫毒素的保护性纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。载体构建示意图见图6。根据11C12/PE40、2F2基因序列设计出PCR上、下游引物，同时在11C12/PE40的5’端引入Nco I酶切位点及保护性碱基，在其3’端引入MMP2/9识别序列的DNA片段、EcoR I酶切位点及保护性碱基，同时在纳米抗体2F2基因片段的5’端引入柔性多肽序列DNA片段、EcoR I酶切位点及保护性碱基，在其3’端引入Xho I酶切位点及保护性碱基，11C12/PE40的上游引物命名为FE-F，下游引物命名为FE-R。2F2的上游引物命名为F-F，下游引物命名为F-R。分别以质粒pET-28a-11C12/PE40、pMES4-2F2为模板进行PCR得到目的片段11C12/PE40和2F2，图7为PCR结果图：M为Trans 5KDNA Marker；1为扩增11C12/PE40的阴性对照；2为11C12/PE40扩增产物；3为2F2扩增产物；4为扩增2F2的阴性对照。按PCR产物回收试剂盒说明书操作分别回收两种目的片段。将pET-28a、11C12/PE40和2F2同时进行Nco I、EcoRⅠ和XhoⅠ三酶切反应，利用PCR产物回收试剂盒回收三种目的片段，T4连接酶进行过夜连接，得到质粒pET28a-11C12/PE40/2F2，其中目的基因11C12/PE40/2F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。图8为质粒pET28a-11C12/PE40/2F2的三酶切鉴定结果：M为Trans 5K DNA Marker；1为质粒pET28a-11C12/PE40/2F2；2为酶切产物。结果显示分别为5000bp、1500bp、400bp左右条带，符合pET28a、11C12/PE40、2F2片段大小。

1.13融合免疫毒素的表达：将从DH5α菌株中提取的重组质粒pET28a-11C12/PE40及pET28a-11C12/PE40/2F2转化至BL21(DE3)感受态细胞中：取-80℃冻存的BL21(DE3)感受态细胞，冰浴条件下加入准备的重组质粒；冰浴30min，42℃热激80s；迅速冰浴2min；加不含抗生素的LB培养液500μL，37℃恒温振荡器中振荡1h；涂于选择性培养琼脂kana/LB平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆菌落在终浓度50μg/mL卡纳霉素选择压力下37℃培养过夜，按1:100转接于相同浓度卡纳霉素的LB培养液中37℃继续培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度1mmol/L IPTG诱导4h，留取未诱导的菌液作为诱导前对照，诱导前后的细菌培养液经离心回收菌体，加入适量SDS上样缓冲液于100℃煮沸5min制备样品。配制12％分离胶、4％浓缩胶，小心取出电泳梳，将凝胶安置于SDS-PAGE电泳槽中，加入1×电泳缓冲液，每孔内加入上述样品20μL，80V电压30min至溴酚蓝进入分离胶后调整电压至120V，继续电泳60min，分离胶经考马斯亮蓝染色，脱色并观察结果。图9为pET28a-11C12/PE40诱导表达结果：M为彩虹180广谱蛋白Marker；1为未诱导菌液；2为诱导后菌液。诱导后细菌裂解液中出现了分子量约为55kD的融合蛋白条带，与11C12(分子量约为15kD)和PE40(分子量约为40kD)二者形成的融合蛋白的分子量大致相等。图10为pET28a-11C12/PE40/2F2诱导表达结果：M为彩虹180广谱蛋白Marker；1为未诱导菌液；2为诱导后菌液。诱导后细菌裂解液中出现了分子量约为55kD的融合蛋白条带，与11C12/PE40(分子量约为55kD)和2F2(分子量约为15kD)二者形成的融合蛋白的分子量大致相等。

1.14融合免疫毒素的western blot鉴定：同1.13的方法进行12％SDS-PAGE电泳，取出分离胶浸在转移缓冲液(25mmol/L Tris，190mmol/L甘氨酸，20％甲醇)中，分离胶上对齐放置同等大小PVDF膜，在胶与PVDF膜的两边各放三张相同大小的滤纸，排净空气，凝胶以Bio-RAD微型蛋白转印系统100V恒压，转膜90min，取出PVDF膜，丽春红(0.2％丽春红，3％三氯己酸，3％磺基水杨酸)染色检查转移情况，水洗除去丽春红，1％BSA作为封闭剂37℃封闭PVDF膜2h，0.02M PBST洗涤PVDF膜3次，每次5min，PVDF膜置入用PBS稀释的3B8-Fc(VHH-PE3，公开于CN 107827981A中)中孵育2h，0.02M PBST洗涤PVDF膜2次，每次5min，PVDF膜置入辣根过氧化物酶标记的Goat Anti-Rabbit IgG H&L(abcam，ab6721)中继续37℃孵育20min，0.02M PBST振荡洗涤PVDF膜4次，每次5min，DAB显色液(0.02M PBST 2mL加入试剂盒自带DAB浓缩液，加入终浓度0.03％H₂O₂混匀)均匀加至PVDF膜上，室温显色，三蒸水洗涤PVDF膜终止显色。11C12的western blot鉴定方法同上，抗体为Goat Anti-Llama IgG H&L(HRP)(abcam，ab112786)。图11为融合免疫毒素的western blot鉴定结果：A为11C12/PE40中验证PE40的western blot结果；B为11C12/PE40中验证11C12的western blot结果；C为11C12/PE40/2F2中验证PE40的western blot结果。

1.15融合免疫毒素的酶切鉴定：将纯化后的11C12/PE40/2F2蛋白分别用MMP2和MMP9切割，裂解融合表达在免疫毒素分子上的保护性纳米抗体2F2，将酶切产物用12％SDS-PAGE电泳观察，结果如图12所示：M为彩虹180广谱蛋白Marker；1为11C12/PE40/2F2；2为11C12/PE40/2F2的MMP2酶切产物；3为11C12/PE40/2F2的MMP9酶切产物。融合免疫毒素均可被MMP2或者MMP9切割为目的条带为55kD和15kD大小的蛋白。

1.16融合免疫毒素的分离纯化：将诱导表达后的菌液4℃8000rpm离心10min，回收菌体，加入适量PBS溶液重悬沉淀，超声破碎后离心取上清经阴离子交换层析柱纯化，得到纯度较高的11C12/PE40及11C12/PE40/2F2。图13为融合免疫毒素的纯化结果：M为彩虹180广谱蛋白Marker；1为纯化后的11C12/PE40；2为纯化后的11C12/PE40/2F2。

实施例2融合免疫毒素的细胞毒性实验

2.1SW480和LoVo细胞中MMP酶定量检测：准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1～5×10⁶个)，小心加入3mL Reagent A，覆盖生长表面，小心抽去清理液，使用细胞刮轻柔刮下细胞。加入3mL Reagent A，混匀细胞，移入到预冷的15mL锥形离心管，放进4℃台式离心机离心5min，速度为300g，小心抽去上清液。加入500μL Reagent B，充分混匀，转移到预冷的1.5mL离心管，强力涡旋震荡15s，置于冰槽里孵育30min。放进4℃微型台式离心机离心5min，速度为13 000rpm。小心移取500μL上清液到新的预冷的1.5mL离心管，移取10μL进行蛋白定量检测，即刻放进-70℃保存。开启并设定好分光光度仪(温度为37℃)：波长412nm，间隔1min，读数15次(共15min)，并置零。移取212.5μL Reagent C到新的比色皿，加入25μL Reagent D，阴性对照加入2.5μL Reagent F或者待检样品加入2.5μLReagent E，上下倾倒数次，混匀，在37℃温度下孵育3min。加入10μL待测样品(100μg总蛋白)，上下倾倒数次，混匀(限定在3s之内)，即刻放进分光光度仪检测(0-15min读数)。表2为SW480细胞中MMP2/MMP9的检测结果，表3为LoVo细胞中MMP2/MMP9的检测结果。可见SW480细胞表达MMP2和MMP9，而LoVo细胞只表达MMP2。

表2.SW480细胞中MMP2/MMP9的检测

表3.LoVo细胞中MMP2/MMP9的检测

2.2SW480和LoVo细胞间接免疫荧光检测：向24孔板底滴加20μL完全培养液，将细胞爬片轻轻的放入24孔板内。细胞消化后浓度调整至5×10⁴个/mL，每孔滴加100μL，放入培养箱中。待细胞达到80％左右后，取出爬片，放置在载玻片上。按照甲醛、丙酮1:1的比例配制固定液。将固定液滴在爬片上，室温放置15min，用PBST洗涤3次，每次5min。5％BSA室温封闭1h，用PBST洗涤3次，每次5分钟。将一抗11C12-Fc用1％BSA稀释后(1mg/mL，稀释度约为1：200)，常温孵育2h，用PBST洗涤3次，每次5min。将二抗Donkey anti-Rabbit IgG H&L(abcam，ab98488)用1％BSA稀释后，避光常温孵育1h，PBST洗涤5遍，每遍3min。滴加30％甘油，防止干燥，镜下观察。结果见图14。11C12纳米抗体与LoVo及SW480细胞都有明显的荧光现象。通过镜下观察可以看出LoVo荧光强度要略强于SW480细胞，而正常结肠细胞2950有微弱的荧光现象。说明融合免疫毒素可以靶向结合表达CEA的肿瘤细胞；LoVo细胞荧光强度较强，与两种细胞CEA的表达量有关；而2950细胞中存在微弱的荧光，说明CEA在该细胞中也有少量的表达。

2.3融合免疫毒素对细胞的活性检测：胰蛋白酶消化对数生长期的SW480和LoVo细胞，用含10％小牛血清RMPI1640配制细胞悬液，记数细胞数，按每孔5×10⁴接种于96孔板，每孔100μL，置37℃CO₂孵箱培养24h，11C12/PE40和11C12/PE40/2F2经0.22μm微孔滤器除菌，不同终浓度依次加入各培养孔(浓度范围0.1μg/L-100mg/L)，置37℃CO₂孵箱继续培养24h，加入CCK8溶液10μL显色2h，酶标仪测定450nm波长处的光吸收值A₄₅₀值，每组样品设置3个重复孔，取其均值。以PBS作为阴性对照，同时以正常人结肠上皮细胞做相同处理对照。

细胞相对存活率＝(处理组A₄₅₀/对照组A₄₅₀)×100％。

11C12/PE40抑制细胞活性结果见表4-5、图15(其中表4为11C12/PE40对SW480和LoVo细胞的A₄₅₀值；表5为SW480、LoVo和2950细胞相对存活率；图15为11C12/PE40对SW480和LoVo细胞的作用曲线图)。11C12/PE40/2F2抑制细胞活性结果见表6-7、图16(其中表6为11C12/PE40/2F2对SW480和LoVo细胞的A₄₅₀值；表7为SW480、LoVo和2950细胞相对存活率；图16为11C12/PE40/2F2对SW480和LoVo细胞的作用曲线图)。结果显示，两种融合免疫毒素对人结直肠癌细胞系SW480和LoVo细胞均具有较好的杀伤效果，融合免疫毒素的浓度与肿瘤细胞存活率之间有较明显的相关性，呈较好的剂量-效应关系，而该融合毒素与正常人结肠上皮细胞不存在明显的剂量-效应关系。在融合免疫毒素浓度约为10μg/mL时对SW480和LoVo细胞均具有明显的杀伤作用，在浓度大于10μg/mL时正常细胞存活率与癌细胞存活率之间的方差P值小于0.01，具有统计学意义，说明该两种融合免疫毒素对大肠癌细胞具有不错的杀伤效果。保护性免疫毒素的MMT实验中细胞的存活率均高于非保护性免疫毒素MTT实验中细胞的存活率，说明PE毒素的保护性纳米抗体对PE毒素起到了保护作用。

在间接免疫荧光的实验中LoVo细胞的荧光强度略强与SW480，而在细胞毒实验中LoVo细胞的抑制效果略低于SW480细胞的抑制作用，这可能是由于两种细胞中MMP的分泌以及CEA表达的量相关。

表4. 11C12/PE40对SW480和LoVo细胞的A₄₅₀值

注：表中*表示3次实验均值

表5. 11C12/PE40作用SW480、LoVo和2950细胞后的相对存活率

表6. 11C12/PE40/2F2对SW480和LoVo细胞的A₄₅₀值

注：表中*表示3次实验均值

表7. 11C12/PE40/2F2作用SW480、LoVo和2950细胞后的相对存活率

序列表

<110> 深圳市国创纳米抗体技术有限公司

<120> 一种纳米抗体与铜绿假单胞菌外毒素的融合蛋白及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 362

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu

1 5 10 15

Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln

20 25 30

Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu

35 40 45

Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala

50 55 60

Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser

85 90 95

Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala

100 105 110

Ser Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys

115 120 125

Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro

130 135 140

Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Ile Ser Phe Ser Thr

145 150 155 160

Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg

165 170 175

Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe

180 185 190

Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser

195 200 205

Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly

225 230 235 240

Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser

245 250 255

Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala

260 265 270

Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu

275 280 285

Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile

290 295 300

Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile

305 310 315 320

Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile

325 330 335

Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln

340 345 350

Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys

355 360

<210> 2

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Glu Phe Gly Pro Gln Gly Ile Trp Gly Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 3

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Gly Arg Trp Asp

20 25 30

Arg Leu Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Ser

35 40 45

Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

50 55 60

Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Thr Lys

65 70 75 80

Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ala His Asn Gly

85 90 95

Arg Gly Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105

<210> 4

<211> 117

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 4

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ala

1 5 10 15

Cys Val Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Asp Tyr Arg Met Ala Trp Phe

20 25 30

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val Ala Arg Ile Arg Trp

35 40 45

Thr Ser Gly Ala Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

50 55 60

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn

65 70 75 80

Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Gln

85 90 95

Thr Met Thr Ala Tyr Ser Asp Pro Thr Thr Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr

115

<210> 5

<211> 1935

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

atggacgtgc agctgcagga aagcggtggt ggtctggttc agccgggtgg cagcctgcgt 60

ctgagttgtg ccgcaagcgg ctttaccttt agcagttaca ccggccgctg ggatcgtctg 120

gcacctggta aggaacgcga actggttgcc accattacca gcaccggtgg cagcaccaat 180

tatgccgaca gtgtgaaggg ccgcttcacc atcagccgtg ataatgccaa aaataccatt 240

tatctgcaaa tgaccaaact gaaaccggac gacaccgccg tgtactactg tgtggcccat 300

aatggtcgcg gttactttgg ccagggcacc caggtcaccg tgagcagtag cggcggtggc 360

ggcagcggcg gtggcggcag cggcggtggt ggtagtgaag gtggcagtct ggccgcctta 420

acagcccatc aggcctgcca tctgccgctg gaaacattta cacgccatcg tcagcctcgt 480

ggctgggaac agctggaaca gtgcggttat ccggttcagc gcctggtggc cttatatctg 540

gccgcacgtc tgagctggaa tcaggtggac caagtgattc gcaatgcact ggccagtccg 600

ggtagtggtg gcgatctggg tgaagcaatt cgcgaacagc ctgaacaagc ccgcttagca 660

ctgaccctgg cagccgccga aagtgaacgt tttgtgcgcc aaggcaccgg caacgatgaa 720

gcaggtgcag caagcgccga tgttgtgagc ctgacatgtc ctgtggcagc aggtgaatgt 780

gccggcccgg cagatagtgg cgacgcactg ctggaacgca attatccgac cggtgcagag 840

tttctgggcg acggcggtga tattagcttt agcacccgcg gtacccagaa ctggaccgtg 900

gagcgtctgt tacaagccca tcgtcaactg gaagagcgcg gttatgtgtt cgtgggctat 960

catggtacat ttctggaagc cgcacagagc atcgtttttg gtggtgtgcg tgcacgcagc 1020

caggatctgg acgcaatctg gcgcggcttt tatattgccg gtgatccggc actggcatat 1080

ggttatgcac aggaccagga accggacgcc cgtggtcgta ttcgtaatgg cgccctgctg 1140

cgcgtttatg tgcctcgcag tagcctgccg ggcttttatc gtaccggcct gacactggca 1200

gcaccggaag cagcaggtga ggtggaacgt ctgatcggtc atcctctgcc gctgcgcctg 1260

gatgccatta caggtccgga agaagaaggc ggccgtctgg aaacaattct gggctggcct 1320

ctggccgaac gtaccgtggt gattccgagt gccattccga ccgacccgcg taatgtgggc 1380

ggcgatctgg atccgagcag tatcccggat aaggagcagg caattagcgc cctgccggat 1440

tacgcaagtc aaccgggtaa accgccgcgt gaagatctga aagaattcgg tccgcagggt 1500

atttggggtc agggcggtgg tagtggtggt ggtagtggcg gtggtagcgg tggtggtagc 1560

caggtgcagc tgcaggaaag cggtggtggt ctggtgcagg caggtgatag cctgcgcctg 1620

gcatgtgttg caagcggccg tgcctttagc gattatcgta tggcctggtt ccgccaggca 1680

ccgggtaaag aacgtgaggt ggtggcccgt attcgctgga ccagcggtgc caccgcctat 1740

tataccgata gcgtgaaagg ccgctttacc atcagccgtg acaacgccaa gaacaccgtg 1800

tacttacaaa tgaacagcct gaaaccggaa gataccgccg tgtactactg cgccgccggt 1860

cagaccatga ccgcctatag cgatccgacc acctatgcct attggggcca gggtacccag 1920

gtcaccgtga gcagc 1935

Claims

1.一种纳米抗体与铜绿假单胞菌外毒素的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由以下部分串联而成：

(1)可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的抗CEACAM-5纳米抗体；

(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的铜绿假单胞菌外毒素；

(3)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的含有基质金属蛋白酶的作用位点的连接肽；

(4)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的作为铜绿假单胞菌外毒素的配体的纳米抗体。

2.权利要求1所述的融合蛋白在制备表达CEACAM-5的肿瘤治疗药物中的应用。