CN1229799A - 抗膀胱癌的基因工程免疫毒素及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗膀胱癌的免疫毒素,它是由抗膀胱癌的基因工程抗体和毒素蛋白连接而成的。本发明还提供了两种含有本发明免疫毒素基因的大肠杆菌的表达质粒pAHM和pTMF。本发明还提供了一种生产抗膀胱癌的免疫毒素的方法。这一免疫毒素具有特异杀伤膀胱癌细胞的作用。
Description
本发明涉及抗癌基因工程免疫毒素，表达该免疫毒素的核苷酸序列，含有该核苷酸序列的载体，以及含有该载体的宿主细胞。
免疫毒素(IT)是指将抗体与毒素蛋白相融合而产生的一种大分子蛋白。其中抗体部分主要负责引导毒素蛋白与靶抗原的特异性结合，毒素部分则主要是实施对细胞的杀伤作用。长期以来，人们就已致力于用单克隆抗体治疗多种疾病，然而效果并不理想。为此人们不得不设计另一种方案以达到更为有效的治疗结果，免疫毒素正是在此情况下应运而生的。第一代免疫毒素是通过化学方法将完整的单抗分子与完整的毒蛋白分子相偶联。偶联后的分子很大，毒性也很强，偶联的效率低，生产成本高，而且偶联物很容易在体内解离，产生很大的副作用。第二代IT则是用Fab代替完整的单抗，与毒蛋白分子中负责杀死细胞的部分偶联，从而使分子变小，渗透力增强，同时也降低了免疫原性，但是，第一代IT所存在的其他问题并没有得到解决。而且，所用的Fab是以蛋白酶切单克隆抗体的方法获得的，效率低、成本高．1984年人-鼠嵌合抗体的出现标志着基因工程抗体时代的开始，所谓基因工程抗体就是在单克隆抗体的基础上用基因工程技术改造和创造出来的新型抗体，它包括三种基本类型：人-鼠嵌合抗体、改形抗体、小分子抗体(Fab、Fv、单链抗体即scFv、单域抗体、最小结合单位)。基因工程抗体的出现使免疫毒素的研究进入了新的时代。第三代IT就是目前方兴未艾的基因工程免疫毒素，它是利用基因重组技术将基因工程抗体与经过删节的毒素蛋白基因相融合并克隆到大肠杆菌表达载体中进行表达，直接得到了均一的活性蛋白。第三代IT大大简化了免疫毒素的构建过程，使大量生产免疫毒素成为可能，同时它又进一步降低了分子量，使其穿透力大大增强，从而更易穿透实体瘤，到达肿瘤高压区。另外，由于第三代IT为均一的蛋白，这一特点无疑在一定程度上提高了免疫毒素的活性降低其毒副作用，从而使IT更具威力。
免疫毒素作为一种新型的治疗战略主要有三个特性以区别于其它类型的抗体定向治疗方案：其一是免疫毒素对细胞的作用方式是不依赖于其它试剂或寄主的附属机制的。其二是免疫毒素对正常细胞是无害的并能有效地被内吞入细胞。最后一点是免疫毒素毒杀细胞的机制与传统的化疗放疗的方法截然不同。另外，作为一个具有实际治疗效果的免疫毒素，以下几个特点是必备的：1，免疫毒素应具有特异性，不与正常组织反应。2，毒素与抗体连接不能损害抗体结合抗原的能力。3．免疫毒素必须被内吞进入内吞泡。4．毒素的活性部分必须转移到胞质中。5．对于体内治疗，毒素与抗体的连接部分必须足够稳定以确保免疫毒素能够穿过组织到达作用部位。以上述几点为依据，人们研制开发了多种免疫毒素以治疗各种不同疾病。与抗体连接的毒素蛋白通常有篦麻毒蛋白(Ricin)、白喉毒素(DT)和假单胞菌属外毒素(PE)。假单胞菌属外毒素(PE)在IT的构建方面扮演了越来越重要的角色。虽然，同属于ADP-核糖基化酶的白喉毒素(DT)也常被用于IT的构建，但有研究表明，用由PE构建的免疫毒素与由DT构建的免疫毒素比较，前者比后者具有更强的细胞毒性。本发明用的是PE。PE是由三个结构域(Domain,D)构成的：DⅠ,DⅡ和DⅢ。其中DⅠ又由DⅠa和DⅠb组成，具有结合细胞的能力，负责引导PE与靶细胞膜受体结合。DⅡ由6至7个α-螺旋组成，负责PE的跨膜运输。而DⅢ则具有核糖基转移酶活性，负责催化EF-2的ADP-核糖基化。并且，其C-端的REDLK序列与内质网保留序列KDEL相似，可引导PE进入内质网。
早期的免疫毒素通常是用完整的毒蛋白与抗体相偶联而成的，交叉反应严重，从而失去了其导向药物的意义。为了解决这个问题，将PE基因中编码受体识别和结合的那部分(DⅠa和DⅠb)基因删除，成为PE40或PE38基因，再与抗体基因相连接，表达所得到的蛋白产物即为PE40或PE38免疫毒素。缺失了结合区的免疫毒素大大提高了对靶细胞的特异性。
构成免疫毒素的另一个组分是抗体。抗体在免疫毒素中行使导向功能，将免疫毒素带到靶细胞周围，由毒素蛋白杀伤靶细胞。因此，抗体分子的大小、特异性、稳定性及与毒素蛋白结合的稳定性均直接关系到IT是否能有效地行使其功能。第一代的免疫毒素用的是完整的单克隆抗体分子，抗体的特异性和稳定性虽不存在问题，但分子太大，不易穿透组织到达靶部位，而且免疫原性高容易引起免疫反应，因此，现在已不采用这种方法。第二代的免疫毒素使用Fab代替完整的抗体分子，虽解决了分子太大的问题，但仍然用化学偶联的方法将毒素蛋白与抗体连接，所得到的免疫毒素在体内容易解离，而且连接效率低，生产成本高。利用基因工程抗体技术制备的第三代免疫毒素基本上解决了上述的问题。目前，IT的抗体部分常用抗体的Fv片段来构建。这不仅是因为Fv片段分子小，它是含有完整抗原结合位点的最小单位，还因为可以用大肠杆菌表达，发酵生产，大大降低生产成本，使免疫毒素得以普及使用。但由于VH和VL间不能形成共价键，在体内不稳定，很容易解离。为了提高Fv片段的稳定性，在VH和VL间插入一条多肽链，即连接肽，把VH和VL连接起来，形成所谓单链抗体(scFv)。连接肽通常为一条15aa长的具有柔韧性的短肽，最常用的是(Gly4Ser)3。(参考文献：1．黄华梁，基因工程抗体，单克隆抗体通讯，1991,7(3):1-4；2．刘喜富、黄华梁，基因工程抗体研究进展，生物工程进展，1994,14(1):54；3．黄华梁，人源化抗体、小分子抗体与肿瘤治疗，单克隆抗体通讯，1993,9(3):19；4.WawrzynczakEJ,Systemic immunotoxin therapy of cancer:advances andprospects,Br.J.Cancer,1991,64:624-630；5.Brinkmann U&Pastan I,Recombinant immunotoxins:From basic research tocancer therapy,METHOD:A companion to methods in enzymology,1995,8,143-156)。
膀胱癌在中国是泌尿系统发生率最高的恶性肿瘤。它是多发性，多病灶的，并且在经过化疗和放疗等标准治疗方法后，还有很高的发病率。
本发明的目的就是用基因工程抗体技术开发一种低毒、高效、价廉的膀胱癌的生物治疗制剂-抗膀胱癌的基因工程免疫毒素。
本发明的另一个目的是提供一种编码所述免疫毒素的核苷酸序列。
本发明的又一个目的是提供两种可用于构建和表达免疫毒素的通用的大肠杆菌质粒，及含有编码所述免疫毒素核苷酸序列的表达载体。
本发明的再一个目的是提供一种用本发明的表达载体转化的宿主细胞。
本发明的再一个目的是提供一种生产低毒、高效、价廉的膀胱癌的生物治疗制剂-抗膀胱癌的基因工程免疫毒素的方法。
因而，本发明提供了一种抗膀胱癌的免疫毒素，它是由基因工程抗体和毒素蛋白连接而成的。其中，基因工程抗体部分可以是完整的抗体分子、Fab、单域抗体或单链抗体(scFv)；毒素蛋白部分可以是篦麻毒蛋白、白喉毒素(DT)或假单孢菌外毒素(PE)。
抗膀胱癌的基因工程抗体最好是单链抗体(其分子量只为原单克隆抗体的1/6)，毒素蛋白最好是截去了与细胞膜结合的结构域的假单孢菌外毒素，即PE38。
本发明的抗膀胱癌的基因工程免疫毒素最好是由抗膀胱癌单链抗体和假单孢菌外毒素PE38构成的杂合蛋白。它是由抗膀胱癌单克隆抗体的重、轻链可变区基因通过一段接头与PE38基因连接起来之后，在宿主中表达的产物。它能特异地杀伤膀胱癌细胞。
本发明提供了一种编码所述免疫毒素的核苷酸序列。其中包括单链抗体基因和PE38基因之间的接头序列，该接头可以是任何一种使单链抗体和PE38在表达的融合蛋白中保持一定的距离的接头，从而使它们互不影响各自的折叠。但最好使用含有多聚组氨酸，从而有利于以后的纯化，并含有适当的酶切位点，便于以后替换不同的单链抗体或毒素蛋白的接头。
本发明提供了两种可用于构建和表达免疫毒素的通用的大肠杆菌质粒，及含有编码本发明免疫毒素核苷酸序列的表达载体。在本发明的优选实施方案中，一种质粒为pAHM，它是以pAL781为背景质粒。选择该质粒、单链抗体基因、PE38基因三者均没有的酶切位点，设计并合成含有这些酶切位点的DNA片段，取代背景质粒的多克隆位点，构建而成的通用的免疫毒素表达质粒。该质粒具备如下特点：在已构建好的免疫毒素基础上，置换任何一种单链抗体基因或毒素蛋白基因，从而获得不同类型的免疫毒素，含有编码本发明免疫毒素核苷酸序列的pAHM命名为pHMTX。另一种质粒为pTMF，它是以pET28a为背景质粒。根据免疫毒素的酶切位点和进一步研究的需要，设计和合成了一个DNA片段，将这一片段置换pET28a中的多克隆位点，构建而成的不仅限于免疫毒素的高效表达的质粒。该质粒除了具有高效表达的特点外，还具备如下特点：具有多种较稀少的酶切位点，便于插入各种外源基因使它们或共表达或成融合蛋白表达；在两组酶切位点之间有一凝血酶的酶切位点，可将表达的融合蛋白纯化后分开；在多克隆位点的3捰端(His6)密码子，便于表达产物作金属鳌合层析纯化。含有编码本发明免疫毒素核苷酸序列的pTMF命名为pTMF-IT。
本发明还提供了一种含有该表达载体的宿主细胞。所述的宿主细胞最好为大肠杆菌。
本发明还涉及一种生产基因工程免疫毒素的方法。这一方法可以归结为如下步骤：1．设计适当的引物，从抗膀胱癌的杂交瘤细胞株中分别扩增和克隆出单克隆抗体的重链和轻链可变区基因；从带有PE38基因的质粒中，扩增出PE38基因；2．将扩增出的单克隆抗体重链可变区，轻链可变区基因，通过适当的接头和毒素蛋白基因连接，插入载体，构建出高效的表达质粒，转化宿主细胞；3．培养转化的宿主细胞，使其表达所述的免疫毒素；4．分离表达的免疫毒素。
本发明的生产基因工程免疫毒素的方法最好包括以下步骤：
1、设计适当的引物，从分泌抗膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株中分别扩增和克隆出单克隆抗体的重链和轻链可变区基因；
2、将得到的重链和轻链可变区基因插入到通用的单链抗体表达载体，构建成单链抗体基因，转化大肠杆菌后，诱导表达进行鉴定；
3、选定一种带有强启动子的质粒作为背景质粒，选择该质粒、单链抗体基因、PE38基因三者均没有的酶切位点，设计并合成含有这些酶切位点的DNA片段，取代背景质粒的多克隆位点，构建成通用的免疫毒素表达质粒；
4、根据单链抗体基因信号肽和轻链FR4的核苷酸序列，设计并合成一对引物，用PCR方法从单链抗体表达质粒中扩增出带有合适的酶切位点、
信号肽和适当接头的单链抗体基因，把此基因插入到免疫毒素表达质粒，转化大肠杆菌；
5、从带有PE38基因的质粒中，酶切出PE38基因，把此基因插入到已带有单链抗体基因和接头的免疫毒素表达质粒，转化大肠杆菌，从而构建成免疫毒素基因；
6、诱导免疫毒素表达质粒表达，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物的分子量、表达量和表达形式，用ELISA检测表达产物的抗膀胱癌抗体活性，用培养的膀胱癌细胞株和其他癌细胞株检测表达产物对膀胱癌细胞的杀伤能力和杀伤特异性；
7、构建高效表达的表达载体，将免疫毒素基因插入该载体，构建出高效的表达质粒；
8、用构建出的高效表达质粒转化宿主细胞；
9、培养转化的宿主细胞，使其表达所述的免疫毒素；
10、分离表达的免疫毒素。
附图简要说明：
图1．扩增抗膀胱癌单克隆抗体重链和轻链可变区基因的引物及表达单链抗体的质粒pWAI80的物理图。
图2．抗膀胱癌单克隆抗体重链和轻链可变区基因的核苷酸序列及所编码的氨基酸序列。
图3．合成的多克隆位点片段及免疫毒素通用表达质粒pAHM的物理图。
图4．从单链抗体表达质粒扩增单链抗体基因的引物、PE38基因的接头及免疫毒素中单链抗体基因与PE38基因之间的接头。
图5．PE38基因的核苷酸序列。
图6．抗膀胱癌免疫毒素的表达质粒pHMTX的物理图。
图7．抗膀胱癌免疫毒素表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
图8．抗膀胱癌免疫毒素对膀胱癌细胞的细胞毒试验结果。
图9．构建提高免疫毒素表达量的表达质粒pTMF的合成片段及其物理图。
图10．抗膀胱癌免疫毒素在pTMF表达的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
实施例：
(一)抗膀胱癌单链抗体的构建：
根据抗体可变区FR1和FR4的序列，设计了一组PCR引物，用其中2对引物(图1)，以分泌抗膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株BDI1细胞提取的总DNA作模板，进行PCR反应。分别扩增出抗膀胱癌单克隆抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因，平端克隆到质粒pUC19，测序验证确为抗体可变区基之后，用相应的限制酶切下这两个基因，插入到本实验室构建的单链抗体表达质粒pWAI80(图1)中，VH在5′端，VL在3′端，两者之间为Linker-(Gly4Ser)3，转化大肠杆菌菌株XL1-blue，挑取转化子，用酶切鉴定，确证已构建成单链抗体基因(基因序列见图2)，该质粒命名为pV4YLH。接种转化子的单菌落到Super Broth(3％BactoTrypton-2％Bacto YeastExtract-1％MOPS pH7.0-20mM MgCl2-0.05mg/ml Amp)中，37℃培养～6h(OD600=0.2)，用1mM IPTG 30℃诱导过夜。收集菌体，用冻融法裂解。离心所得的上清液，用竞争抑制ELISA方法测定单链抗体的活性。结果证明，单链抗体的抑制率为83％(表1)，说明抗膀胱癌单链抗体已构建和表达成功。
表1．用竞争抑制ELISA检测抗膀胱癌单链抗体活性的结果
BDI-1：抗膀胱癌单克隆抗体；NIL：未诱导的菌体裂解上清液
(二)抗膀胱癌免疫毒素的构建与表达：
| 组别 | OD402 | 抑制率％ |
| BDI-1(阳性对照) | 0.862 | |
| NIL(阴性对照) | 0.000 | |
| NIL+BDI-1 | 0.715 | |
| 裂解液+BDI-1 | 0.121 | 83 |
1．构建免疫毒素的表达质粒：
为了便于单链抗体基因和PE38基因的插入，以及以后变换单链抗体基因或毒素蛋白基因，需要构建一个具有适当酶切位点的表达质粒。为此设计了一段接头(图3)以置换pAL-781中的多克隆位点，设计这段接头的原则是，它所有的酶切位点都不存在于scFv基因、PE38基因和pAL-781质粒中。经酶切及测序分析，确证GJ1/GJ2接头已成功地装入pAL-781质粒中，并将新质粒命名为pAHM(图3)。该质粒具有如下特点：在已构建好的免疫毒素基础上，置换任何一种单链体基因或毒素蛋白基因，从而获得不同类型的免疫毒素。
2．抗膀胱癌scFv基因的扩增及装入：
根据抗膀胱癌scFv基因中信号肽pelB基因和VL的FR4序列设计并合成了扩增scFv基因所需的引物CH120(5′端)和SCL43(3′端)(图4)。
在CH120中加入NdeⅠ位点，并使扩增出的scFv带有pelB基因，使构建成的免疫毒素具有外分泌功能。在SCL43中则加入了一段经过设计的，以后与PE38连接的接头(图4)。用这两个引物从pV4YLH中扩增出scFv基因，经酶切后，插入质粒pAHM。经过鉴定，新质粒命名为pAHMf-b。
3．PE38与载体pAHMf-b的连接：
通过HindⅢ、EcoRⅠ双酶切可将含终止密码的PE38基因(图5)从载体中切下。由于pAHM载体的多克隆位点中没有HindⅢ位点，合成了一个5′端NotⅠ-HindⅢ接头AD1/AD2(图4)。用此接头与PE38连接，再与同样双切后的pAHMf-b载体连接，转化大肠杆菌G1724，获得了转化株，并通过了酶切鉴定，从而构建完成了抗膀胱癌免疫毒素的表达质粒。该质粒命名为pHMTX(图6)。
4．抗膀胱癌免疫毒素在大肠杆菌中的表达：
将含有pHMTX的GI724单菌落接种到RM培养基(6g Na2HPO4,3g KH2PO4,0.5g NaCl,1g NH4Cl,20g水解酪蛋白，0.095g MgCl2,50％甘油，1ml 100mg/ml氨苄青霉素，加水至1升)中，30℃振荡过夜，第二天取出100μl过夜的GI724转接到20ml诱导培养基中，30℃摇大约3-4小时，使其OD550=0.5。然后加入终浓度为100μg/ml色氨酸，37℃，诱导2小时。离心，4℃,4000rpm,10分钟，去上清，菌体重悬于4ml PBS中。将超声仪探头置于PBS液面稍下方，以最大功率超声3次，每次10秒，然后将超声过的溶液置于液氮中数秒，使其冷冻，再迅速放于37℃水浴中使其融化，如此超声，冻融反复3次。然后，离心，4℃,5000rpm,10分钟，保留上清，沉淀重悬于3-4ml PBS，与上清同放于-20℃保存。跑8％的SDS-PAGE观察表达情况(图7)。以空载体pAHM和只插入scFv的载体pAHMf-b为对照，可观察到在70kDa处有一明显的表达带，上清液的相应位置也有同样的表达带，说明有一部分表达产物是以可溶性形式表达的，因此可以直接用上清液鉴定免疫毒素的生物活性。(三)抗膀胱癌免疫毒素生物活性的鉴定：
1．免疫毒素的抗体活性：
用竞争性抑制ELISA测定免疫毒素的抗体活性。抗原为膀胱癌细胞株EJ细胞。将膀胱癌细胞株EJ细胞接种于酶标板内，CO2孵化箱37℃培养，待细胞铺满每个孔底，取出，每孔加100μl 0.05％戊二醛(溶于0.01M PBS)10分钟以固定细胞。然后用0.01M PBS洗三次，每孔加入200μl保存液(明胶200mg,NaN3 0.1g,BSA 1g,PBS 100ml)，封盖，4℃保存备用。取出备用酶标板，每孔加满4％脱脂奶粉37℃，再封闭1小时。用洗涤液(PBS/0.05％Tween20)洗3次，加入待测液pHMTX上清100μl/well，并作空白对照(只加酶标二抗)，阳性对照(只加单抗，酶标二抗，不加待测液)，37℃,1小时。用洗涤液洗5次，每孔加100μl 0.5％戊二醛，室温3分钟，弃掉，用三蒸水洗5次，再加入抗膀胱癌单克隆抗体(杂交瘤细胞BDI-1所得的腹水)100μl/孔，37℃,1小时。用洗涤液洗6次，加入酶标二抗(HRP-羊抗鼠IgG)100μl/孔，37℃,1小时。用洗涤液洗6次，加入OPD溶液(总体积为100ml:48.6ml 0.05M柠檬酸，51.4ml 0.1M磷酸氢二钠，40mg邻苯二胺，150μl H2O2)100μl/孔，37℃,15-30分钟，加2M H2SO4终止反应，用酶标仪测OD492。结果表明，免疫毒素能显著抑制单克隆抗体的活性，抑制率为37％(表2)。说明免疫毒素的scFv部分是有活性的。
表2．抗膀胱癌免疫毒素的抗体活性检测结果
2．抗膀胱癌免疫毒素对膀胱癌细胞的杀伤活性：
| OD402 | 抑制率 | |
| 阳性对照(单抗) | 0.70 | |
| 待测液(免疫毒素) | 0.44 | 37％ |
| 空白对照 | 0.08 |
将膀胱癌细胞株EJ细胞接种于96孔细胞培养板，每孔100μl(约5000个细胞)，在CO2孵箱中过夜。待测液pHMTX表达上清液按三种不同量5μl,10μl,50μl加样，同时作空载体pAHM上清液，单链抗体载体pAHMf-b上清液，死细胞和活细胞对照，37℃,CO2孵箱培养48小时。每孔加入25μl MTT(5μg/ml，溶于PBS)，再于37℃,CO2孵箱保温4小时。倒掉孔内液体，每孔分别加入100μl DMSO,37℃,1小时后，用酶标仪测OD492。按如下公式计算出细胞存活率，并作图。
结果如表3、图8所示，5μl pHMTX上清对膀胱癌细胞杀伤作用较小，存活率为63％，当加样量增至10μl及50μl时，存活率仅为37％。正如所料，空载体pAHM和单链抗体载体pAHMf-b的上清液对细胞的存活率没有明显的影响。
表3．抗膀胱癌免疫毒素对膀胱癌细胞的细胞毒试验结果
3．免疫毒素对细胞杀伤的特异性：
| 项目 | 5μl上清加样量 | 10μl上清加样量 | 50μl上清加样量 | |||
| OD492 | 存活率 | OD492 | 存活率 | OD492 | 存活率 | |
| pHMTX | 0.23±0.026 | 63％ | 0.17±0.012 | 37％ | 0.17±0.021 | 37％ |
| pAHMf-b | 0.28±0.021 | 78％ | 0.31±0.013 | 89％ | 0.28±0.010 | 78％ |
| pAHM | 0.34±0.096 | 100％ | 0.27±0.021 | 74％ | 0.33±0.030 | 96％ |
| 活细胞 | 0.34±0.033 | |||||
| 死细胞 | 0.07±0.013 | |||||
为测定IT的细胞杀伤特异性，选择了除靶细胞BIU-87和EJ(膀胱癌细胞)外，还选用了另外五种细胞Hela(宫颈癌细胞)，MCF-7(乳腺癌细胞)，3T3(小鼠成纤维细胞)，A549(肺腺癌细胞)，BCL(肝癌细胞)作为对照。每种细胞均设死细胞及活细胞对照。其它方法与具体步骤与上述相同。结果表明[表4]，与各自的活细胞对照比较来看，当加样量为50μl时，可以清楚看出靶细胞BIU-87和EJ(膀胱癌细胞)明显被杀伤：细胞皱缩，边界不清，看不到活细胞所具有的多边形边界，细胞内溶物外流。而对于3T3(小鼠成纤维细胞)，Hela(宫颈癌细胞)，BCL(肝癌细胞)以及MCF-7(乳腺癌细胞)则无明显作用：细胞饱满伸展，多边形边界清晰。然而，A549(肺腺癌细胞)在50μl免疫毒素的作用下，则有一定反应，但无膀胱癌细胞作用明显。推测，可能是A549细胞表面亦有与抗膀胱癌单链抗体类似的靶抗原，从而，发生了交叉反应。
表4．抗膀胱癌免疫毒素的细胞毒特异性试验结果
-：无杀伤作用；+：有杀伤作用
(四)高效表达质粒的构建与表达：
| 细胞株 | 对照 | 细胞杀伤程度 |
| BIU-87(人膀胱癌细胞) | - | +++ |
| EJ(人膀胱癌细胞) | - | +++ |
| 3T3(小鼠成纤维细胞) | - | - |
| Hela(人宫颈癌细胞) | - | - |
| MCF-7(人乳腺癌细胞) | - | - |
| A549(人肺腺癌细胞) | - | ++ |
| BCL(人肝癌细胞) | - | - |
由于pAHM的表达量不高，不适用于生产，需要构建一个高效表达免疫毒素的质粒。以具有T7启动子的pET28a为背景质粒，根据免疫毒素的酶切位点和进一步研究的需要，设计和合成了一个DNA片段。将这一片段置换pET28a中的多克隆位点，经测序验证之后，构建成一个新的质粒，命名为pTMF(图9)。该质粒除了具有高效表达的特点外，还具备如下特点：具有多种较稀少的酶切位点，便于插入各种外源基因使它们或共表达或成融合蛋白表达；在两组酶切位点之间有一凝血酶的酶切位点，可将表达的融合蛋白纯化后分开；在多克隆位点的3’端有(His)6密码子，便于表达产物作金属鳌合层析纯化。
用NdeⅠ和EcoRⅠ从pHMTX中切下免疫毒素基因，插入到用同样两种酶切的pTMF中，命名为pTMF+IT，转化大肠杆菌BL21，经筛选和酶切鉴定后，挑选单克隆，用1mmol/L IPTG诱导表达。在37℃下诱导6小时，将细菌离心沉淀后，用超声波破碎，跑SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。免疫毒素的表达产物占菌体总蛋白25％，相当于52mg/L培养物，其中以可溶性形式表达的免疫毒素占可溶性蛋白10.6％，相当于42mg/L培养物(图10)。这一表达量已能用于生产。(五)结论：
所构建的抗膀胱癌免疫毒素具有与膀胱癌细胞特异结合并特异地将其杀伤的作用，可发展成为膀胱癌的生物治疗药物。
Claims (16)
1．一种抗膀胱癌的免疫毒素，它是由抗膀胱癌的基因工程抗体和毒素蛋白连接而成的。
2．按照权利要求1所述的免疫毒素，其特征在于，基因工程抗体部分是完整的抗体分子、Fab、单域抗体或单链抗体(scFv)。
3．按照权利要求1所述的免疫毒素，其特征在于，毒素蛋白部分是篦麻毒蛋白、白喉毒素(DT)或假单孢菌外毒素(PE)。
4．按照权利要求1所述的免疫毒素，其特征在于，所述的基因工程抗体是单链抗体，毒素蛋白是截去了与细胞膜结合的结构域的假单孢菌外毒素，即PE38。
5．按照权利要求4所述的免疫毒素，其特征在于，所述的单链抗体具有如下的重链可变区氨基酸序列：1 CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GCA GAA CTT GTG AAG CCA GGG GCC 481 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1649 TCA GTC AAG TTG TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC 9617 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 32
CDR197 TTT ATA CAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT 14433 Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 48145 GGA AGG ATT GAT CCT GCG GAT GGT AAT GTT AAA TAT GAC CCG AAG TTC 19249 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Val Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 64
CDR2193 CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCG GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC 24065 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 80241 CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT 28881 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 96289 GCT AGA TCG GGC TCT ACG GTA ATA GAT TAC TAT GTT ATG GAC TAC TGG 33697 Ala Arg Ser Gly Ser Thr Val Ile Asp Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Trp 112
CDR3337 GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 366113 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 122
6．按照权利要求4所述的免疫毒素，其特征在于，所述的单链抗体具有如下的轻链可变区氨基酸序列：1 GAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CTA GGG 481 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1649 GAA CGG GTC ACC ATG ACC TGC ACT GCC AGC TCA AGT ATA AGT TCC ACT 9617 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Thr 32
CDR197 TAC TTG CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CTC TGG 14433 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 48145 ATT TAT AGC ACT TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCA ACT CGC TTC AGT 19249 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser 64
CDR2193 GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGC ATG GAG 24065 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 80241 GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAC CAG TAT CAT CGT TCC CCA 28881 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 96
CDR3289 TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG GAA CTA AAA 32497 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 108
7．按照权利要求4所述的免疫毒素，其特征在于，所述的PE38具有如下的核苷酸序列：1 GGCGGCAGCC TGGCCGCGCT GACCGCGCAC CAGGCTTGCC ACCTGCCGCT GGAGACTTTC61 ACCCGTCATC GCCAGCCGCG CGGCTGGGAA CAACTGGAGC AGTGCGGCTA TCCGGTGCAG121 CGCCTGGTCG CCCTCTACCT GGCGGCGCGG CTGTCGTGGA ACCAGGTCGA CCAGGTGATC181 CGCAACGCCC TGGCCAGCCC CGGCAGCGGC GGCGACCTGG GCGAAGCGAT CCGCGAGCAG241 CCGGAGCAGG CCCGTCTGGC CCTGACCCTG GCCGCCGCCG AGAGCGAGCG CTTCGTCCGG301 CAGGGCACCG GCAACGACGA GGCCGGCGCG GCCAACGGCC CGGCGGACAG CGGCGACGCC361 CTGCTGGAGC GCAACTATCC CACTGGCGCG GAGTTCCTCG GCGACGGCGG CGACGTCAGC421 TTCAGCACCC GCGGCACGCA GAACTGGACG GTGGAGCGGC TGCTCCAGGC GCACCGCCAA481 CTGGAGGAGC GCGGCTATGT GTTCGTCGGC TACCACGGCA CCTTCCTCGA AGCGGCGCAA541 AGCATCGTCT TCGGCGGGGT GCGCGCGCGC AGCCAGGACC TCGACGCGAT CTGGCGCGGT601TTCTATATCG CCGGCGATCC GGCGCTGGCC TACGGCTACG CCCAGGACCA GGAACCCGAC661 GCACGCGGCC GGATCCGCAA CGGTGCCCTG CTGCGGGTCT ATGTGCCGCG CTCGAGCCTG721 CCGGGCTTCT ACCGCACCAG CCTGACCCTG GCCGCGCCGG AGGCGGCGGG CGAGGTCGAA781 CGGCTGATCG GCCATCCGCT GCCGCTGCGC CTGGACGCCA TCACCGGCCC CGAGGAGGAA841 GGCGGGCGCC TGGAGACCAT TCTCGGCTGG CCGCTGGCCG AGCGCACCGT GGTGATTCCC901 TCGGCGATCC CCACCGACCC GCGCAACGTC GGCGGCGACC TCGACCCGTC CAGCATCCCC961 GACAAGGAAC AGGCGATCAG CGCCCTGCCG GACTACGCCA GCCAGCCCGG CAAACCGCCG1021 CGCGAGGACC TGAAGTAACT GCCGCGACCG GCCGGCTCCC TTCGCAGGAG CCGGCCTTCT1081 CGGGGCCTGG CCATACATCA GGTTTTCCTG ATGCCAGCCC AATCGAATAT GAGAATTC
8．按照权利要求4所述的免疫毒素，其特征在于，在单链抗体基因与PE38基因之间的接头具有如下核苷酸序列：CAT CAC CAT CAC CAT GGC GGT GGT GAG CTC GCG GCC GCT
(His)5 SacⅠ NotⅠGGT GAA GCT TCC GGA GGT CCC GAG
HindⅢ
9．一种编码权利要求1至8中任何一项所述的免疫毒素的核苷酸序列。
10．一种含有权利要求9所述序列的表达载体。
11．按照权利要求10所述的载体，它是pAHM。
12．按照权利要求10所述的载体，它是pTMF。
13．一种含有权利要求10-12中任何一项所述的载体的宿主细胞。
14．按照权利要求13所述的宿主细胞，它是大肠杆菌菌株。
15．一种生产抗膀胱癌的基因工程免疫毒素的方法，包括：
a．设计适当的引物，从抗膀胱癌的杂交瘤细胞株中分别扩增和克隆出单克隆抗体的重链和轻链可变区基因；从带有PE38基因的质粒中，扩增出PE38基因；
b．将扩增出的单克隆抗体重链可变区，轻链可变区基因，通过适当的接头和毒素蛋白基因连接，插入载体，构建出高效的表达质粒，转化宿主细胞；
c．培养转化的宿主细胞，使其表达所述的免疫毒素；
d．分离表达的免疫毒素。
16．一种生产抗膀胱癌的基因工程免疫毒素的方法，包括：
a．设计适当的引物，从分泌抗膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株中分别扩增和克隆出单克隆抗体的重链和轻链可变区基因；
b．将得到的重链和轻链可变区基因插入到通用的单链抗体表达载体，构建成单链抗体基因，转化大肠杆菌后，诱导表达进行鉴定；
c．选定一种带有强启动子的质粒作为背景质粒，选择该质粒、单链抗体基因、PE38基因三者均没有的酶切位点，设计并合成含有这些酶切位点的DNA片段，取代背景质粒的多克隆位点，构建成通用的免疫毒素表达质粒；
d．根据单链抗体基因信号肽和轻链FR4的核苷酸序列，设计并合成一对引物，用PCR方法从单链抗体表达质粒中扩增出带有合适的酶切位点、信号肽和适当接头的单链抗体基因，把此基因插入到免疫毒素表达质粒，转化大肠杆菌；
e．从带有PE38基因的质粒中，酶切出PE38基因，把此基因插入到已带有单链抗体基因和接头的免疫毒素表达质粒，转化大肠杆菌，从而构建成免疫毒素基因；
f．构建高效表达的表达载体，将免疫毒素基因插入该载体，构建出高效的表达质粒；
g．用构建出的高效表达质粒转化宿主细胞；培养转化的宿主细胞，使其表达所述的免疫毒素；
h．分离表达的免疫毒素。
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Cited By (1)
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| CN108484781A (zh) * | 2018-04-23 | 2018-09-04 | 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 | 一种纳米抗体与铜绿假单胞菌外毒素的融合蛋白及应用 |
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1999
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