CN114989270A - 一种对人源性cea具有结合亲和力的多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种对人源性CEA具有结合亲和力的多肽，首次提出了一种对人源性CEA具有结合亲和力的多肽；本发明还提供了该多肽在诊断检测中的应用，并作为靶向载体在药物或分子靶向试剂的诊断或治疗用途。

Description

一种对人源性CEA具有结合亲和力的多肽及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种对人源性CEA具有结合亲和力的多肽及其用途。
背景技术
胃癌是消化道的常见恶性癌症，目前仍然是当今世界上癌症性疾病导致死亡的主要病因。近年来，随着医学水平的不断提高，血清癌症标志物的定量检测已经成为了发现早期胃癌的重要手段，与普通胃镜或者是无痛胃镜等其他有创检查相比，其有安全、快速、经济、损伤小等优势。
血清癌症标志物包括癌胚抗原(CEA)，CEA的相对分子质量为180-200KDa，是CEA相关细胞粘附(CEACAM)超家族中的一种对人源性CEA具有结合亲和力的多肽及其用途糖蛋白，来源于机体内胚层上皮组织的糖蛋白，正常情况下人体血清CEA的含量极低。但是，据报导，胃癌患者CEA的阳性率为85.58％，由此可见CEA对胃癌诊断具有一定的辅助作用。一旦正常机体出现癌症症状时，CEA会失去极化分布后过度表达。另外，在磷脂酶作用下，细胞表面的CEA可以进入血清，导致血清CEA的增加。此外，血清CEA水平与大肠癌的分期有明确关系，越晚期的病变，CEA浓度越高。
CEA血清含量的检测目前已经被成熟的应用于恶性癌症的诊断和预后指标，并且癌症患者手术治疗后，目前常规术后复查CEA以检测癌症的发展情况。过度表达CEA的恶性癌症常见于原发性结肠癌、大肠癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、食道癌、腺癌、泌尿系统的肿瘤等。CEA在癌细胞粘附，迁移和侵袭中起着重要作用。
目前，CEA已经成为免疫治疗的靶标。放射性标记的单克隆抗体已经被开发用于诊断和治疗CEA阳性癌症。尽管如此，单克隆抗体由于表现出缓慢的血液清除速率以及在肝脏的高摄取率对于其用作癌症靶向探针是并不是十分理想的。较小的抗体片段，如抗原结合片段(Fab)和单链可变片段的，特别是纳米抗体，由于它们的具有快速代谢和癌症的高摄取以及更好的药代动力学这些特点使得他们近年来被用作癌症靶向探针。
目前，对于某些恶性癌症而言，市场上已出现相应商品化的单克隆抗体，如来自于罗氏公司的利妥昔单抗和曲妥珠，这些抗体已经用于淋巴瘤以及乳腺癌的有效治疗。但是，单克隆抗体分子存在着明显的缺点：相对分子质量较大，结构复杂，并且在制备过程繁杂、价格十分昂贵，容易产生脱靶现象，而且具有较大的药物副作用。
affibody亲和体分子与抗体相比有着独特的优势，比如化学性质稳定、穿透性良好、可修饰性强、在血浆中易于清除等。因此，亲和体分子在临床诊断和分子靶向治疗中有着重要的作用。
因此，本领域对仍需继续以CEA为核心的亲和体分子筛选及其特性的研究。
发明内容
为有效对本发明的内容进行阐述，先对部分核心材料进行初步介绍：新型小分子材料例如非抗体亲和性蛋白affibody，具有化学性质稳定、分子质量小、亲和力高等特点。最原始的affibody亲和体分子来自于金黄色葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白结合区域B段(SPAZ)。之后研究人员将B段的第29位氨基酸甘氨酸突变为丙氨酸，增加了其结构的稳定性，从而称作为affibody Z结构域。金葡菌A蛋白Z结构域(简称为Zwt)由58个氨基酸组成，具有三个α螺旋结构，分子量约为7KDa。在第一、第二螺旋区域上有13个特定的氨基酸位点，分别位于Q9(谷氨酰胺)、Q10(谷氨酰胺)、N11(天冬酰胺)、F13(苯丙氨酸)、Y14(酪氨酸)、L17(亮氨酸)、H18(组氨酸)、E24(谷氨酸)、E25(谷氨酸)、R27(精氨酸)、N28(天冬酰胺)、Q32(谷氨酰胺)、K35(赖氨酸)。蛋白骨架序列不变的情况下，这13个氨基酸位点的突变不会影响整体结构。通过将结构域Z的α-螺旋受体的13个特定氨基酸行随机化设计，可以产生针对各种靶抗原的相应affibody分子。
通过噬菌体展示技术筛选能够特异性结合不同靶抗原的affibody。噬菌体展示技术筛选获得的affibody亲和体分子，与抗体相比具有比如化学性质稳定、穿透性良好、可修饰性强，在血浆中易于清除等特点。
本发明的目的是提供一种对人源性CEA具有结合亲和力的多肽及其用途。
本发明的其一目的是提供一种对人源性CEA具有结合亲和力的多肽，该多肽的序列如SEQ ID NO:2-4所示
在另一优选例中，所述的该多肽与人源性CEA相互作用的KD值为1.73×10-7M至5.51×10-6M。
在本发明的另一方面，提供一种靶向人源性CEA的靶向性分子，所述的靶向性分子包括前面任一所述的多肽，以及与该多肽相连接的偶联物，所述的偶联物包括：半胱氨酸残基；多肽标签；抗癌活性的物质；或可检测标记物，所述可检测标记物包括荧光标记，酶，生物素或放射性同位素，所述连接方式为偶联，所述的偶联物与所述的对人源性CEA具有结合亲和力的多肽构成融合多肽。
在一个优选例中，该抗癌活性的物质包括用于ADEPT应用的效应酶；用于募集免疫系统的效应细胞的蛋白；毒素：蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物碱；auristatin或阿霉素或放射性同位素。
在一个优选例中，所述的偶联物是肽，所述的偶联物与所述的对人源性CEA蛋白具有结合亲和力的多肽构成融合多肽。
在另一优选例中，所述的多肽标签包括但不限于：His标签，优选为6×His，Myc标签，GST标签，Flag标签。
在另一优选例中，所述的偶联物与所述的对人源性CEA蛋白具有结合亲和力的多肽以柔性肽连接，所述柔性肽包括但不限于：(Gly4Ser)3。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码前面任一所述的对人源性CEA蛋白具有结合亲和力的多肽。
在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的靶向人源性CEA蛋白的靶向性分子，且其中所述的偶联物是肽。
在本发明的另一方面，提供一种重组载体，该载体包含所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含所述的重组载体，或其包含有或基因组中整合有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的对人源性CEA蛋白具有结合亲和力的多肽的方法，所述方法包括：(1)培养所述的细胞，从而表达所述的对人源性CEA蛋白具有结合亲和力的多肽；(2)分离纯化(1)获得的多肽。
在本发明的另一方面，提供一种对人源性CEA蛋白具有结合亲和力的多肽的用途，用于制备检测人源性CEA蛋白的检测试剂中的应用，或者在制备诊断人源性CEA蛋白表达阳性癌症的诊断试剂的应用。
所述的对人源性CEA蛋白具有结合亲和力的多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2-4任一所示。
在本发明的另一方面，提供所述的对人源性CEA蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人源性CEA蛋白的靶向性分子的用途，
所述偶联物是抗癌活性药物，用于制备治疗人源性CEA表达阳性癌症的药物；或所述偶联物是多肽标签或可检测标记物，所述可检测标记物包括荧光标记，酶，生物素或放射性同位素，用于制备检测人源性CEA蛋白的检测试剂或用于制备诊断人源性CEA蛋白表达阳性癌症的诊断试剂。
在另一优选例中，所述的人源性CEA蛋白表达阳性癌症包括：结肠癌、大肠癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、食道癌、腺癌、泌尿系统的肿瘤，等。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含：前面所述的对人源性CEA蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人源性CEA蛋白的靶向性分子；和药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供一种用于诊断人源性CEA表达阳性癌症的药盒，包括：所述的对人源性CEA具有结合亲和力的多肽；
或述的靶向人源性CEA的靶向性分子，所述偶联物是多肽标签或可检测标记物；
或所述的药物组合物，所述偶联物是多肽标签或可检测标记物。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗人源性CEA表达阳性癌症的药盒，包括：所述的靶向人源性CEA的靶向性分子，所述靶向性分子的偶联物是抗癌活性药物；
或所述的药物组合物，所述靶向性分子的偶联物是抗癌活性药物。
在一个优选例中，所述的对人源性CEA蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人源性CEA蛋白的靶向性分子是有效量的。
本发明的其它方面由于本申请的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍
附图说明
图1各ZCEA以及Zwt序列的对比。本发明的ZCEA多肽中被修饰的氨基酸位点在图中己用下划线标出(SEQ ID NO：2-4)。
图2为pET21a(+)/ZCEA质粒图以及测序峰图。
图3为pET21a(+)/ZCEA PCR鉴定示意图。
图4为ZCEA重组蛋白的SDS-PAGE电泳示意图。
M：D2000；1：pET21a/ZCEA 539；2：pET21a/ZCEA 546；3：pET21a/ZCEA 919；4：pET21a/Zwt；5：阴性对照
图5为ZCEA重组蛋白WesternBlot实验结果示意图。
图6为不同浓度的ZCEA539，ZCEA546，ZCEA919，Zwt与CEA全长蛋白之间的SPR结果示意图。
图7为ZCEA546、Zwt分别与靶多肽CEA(148-175aa)ELISA实验结果。
图8为HT-29，MKN-45以及Hela细胞的CEA表达情况示意图。
M:D2000Marker；1：MCF-7细胞株；2：HT-29细胞株；3：MKN 45细胞株；
4：Hela细胞株5：PBS
图9A:CEA多抗与天然CEA特异性结合的细胞免疫荧光共定位鉴定；9B:ZCEA546与天然CEA特异性结合的细胞免疫荧光共定位鉴定；9C:ZWT与天然CEA特异性结合的细胞免疫荧光共定位鉴定。
图10为ZCEA亲合体蛋白与Dylight标记的鉴定，10A：Dylight755荧光标记ZCEA重组蛋白；10B：胰岛素注射器。
图11A：荧光蛋白在正常裸鼠内的代谢情况示意图；11B：荧光蛋白在正常裸鼠内的荧光代谢强度结果示意图。
图12A：Dylight-ZCEA546在HT-29，MKN-45以及Hela细胞对应荷瘤小鼠中的成像结果；12B：Dylight-ZCEA546在各个时间点的荧光强度分析结果；12C：Dylight-Zwt在HT-29，MKN-45以及Hela细胞对应荷瘤小鼠中的成像结果；12D：Dylight-Zwt在各个时间点的荧光强度分析结果。
图13A：为注射ZCEA546、Zwt蛋白后4小时的成像结果；13B：相应的肿瘤/皮肤组织的荧光数据分析示意图(***代表P＜0.01)。
图14为分别小鼠给药ZCEA546、Zwt4小时后各器官的成像结果示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
如本申请所用，“对CEA具有结合亲和力的多肽”是指以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽，且该多肽能够特异性结合CEA、具有极少或没有非特异性结合。
如本申请所用，所述的“本发明的多肽”、“对CEA具有结合亲和力的多肽”、“CEA结合多肽”、“ZCEAaffibody多肽”、“ZCEAaffibody”、“ZCEA”、“affibody蛋白”、“affibody重组蛋白”、“ZCEA重组蛋白”可以互换使用；SPAZ与Zwt可以互换使用。
如本申请所用，所述的“靶向性分子”是指将本发明的对CEA具有结合亲和力的多肽与其它功能性偶联物连接后获得的、可以靶向CEA的分子。所述的偶联物可以是半胱氨酸残基，多肽标签，对人源性CEA的药物，酶或可检测标记物等。
如本申请所用，所述的“融合多肽”是所述的“靶向性分子”的下位概念，是指本发明的对CEA具有结合亲和力的多肽与其它功能性肽(例如毒素蛋白或功能性蛋白片段)连接后获得的、可以靶向CEA的分子。
本发明人选择CEA作为靶抗原。将CEA N端第148～175肽段(SISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDAT)进行全基因合成，作为淘洗的抗原。本发明人以葡萄球菌A蛋白的Z结构域(Zwt，SEQ ID NO:1)作为支架，将其表面氨基酸残基模拟抗体结合位点进行随机突变，通过噬菌体展示技术构建突变文库，以CEA作为靶抗原对该文库进行亲和筛选，经过大量的筛选工作，最终获得了对于CEA具有高度亲和力的多肽。
本发明的多肽是以葡萄球菌A蛋白Z结构域的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个(较佳地为13个)氨基酸变异后获得的多肽。作为本发明的优选方式，本发明的多肽相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，在第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35位上发生氨基酸突变。更优选地，本发明的多肽具有SEQ ID NO:2-4任一所示的氨基酸序列，如表1所示。
本发明还涵盖了在所述CEA结合多肽的氨基酸序列任一末端或两端加入额外的氨基酸残基而形成的多肽。这些额外的氨基酸残基可以在多肽结合CEA时起作用，但是也可同样用于其它目的，如涉及该多肽的生产、纯化、稳定、偶联或检测的一种或几种。这些额外的氨基酸残基可以包括一或多种为了化学偶联目的而添加的氨基酸残基。如在多肽链的第一位或最后一位添加，即在V或K末端添加一个半胱氨酸残基等。这种额外的氨基酸残基也可以包括用于多肽纯化或检测的一个“标记”，如与标记抗体相互作用的六组氨酸肽(His6)标记，或“myc”标记或“flag”标记。此外，其它本领域技术人员熟知的替代方式也包含在本发明中。
所述“额外的氨基酸残基”也可构成具有预期功能的一个或多个多肽结构域，如与第一个、CEA结合结构域相同的结合功能，或者其它结合功能，或是一种酶促功能，或是一种荧光功能，或是其组合。
本发明也包含在所述的CEA结合多肽基础上，经修饰进而增加其在碱性条件下的稳定性的多肽。这种稳定性包括用对于碱性条件较不敏感的氨基酸残基定点取代在没有修饰的序列中出现的任何天冬酞胺残基。由于在不同的反应之间亲和层析柱要经受频繁的强碱处理以进行洗脱，这种对碱降低敏感性的特性，有利于使用本发明的多肽作为亲和层析中的亲和配体，能够延长亲和层析基质的使用寿命。
本发明也包含在本发明的CEA结合多肽基础上，进行其它修饰后获得的多肽。这些修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明的CEA结合多肽可以与偶联物连接，从而构成功能性的靶向性分子，这种连接可通过化学键(包括肽键)相连或吸附；所述的化学键是共价键或非共价键。作为一种优选方式，通过肽键连接，从而形成融合多肽。所述的CEA结合多肽与偶联物之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-30个氨基酸；较佳地为1-20个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响融合蛋白中各多肽的活性。较佳地，可以利用柔性肽(Gly4Ser)3进行连接。其它本领域技术人员熟知的连接肽也可应用于本发明。
在“异源”融合多肽中，所述CEA结合多肽构成了第一个结构域或第一个部分，第二和其它部分具有除了结合CEA外的其它功能，这些可预期的结果也在本发明的范围内。该融合多肽的第二和其它部分可能包含对除了CEA外的其它靶分子具有亲和力的结合结构域。这种结合结构域也可能与SPA结构域相关，但在1到大约20个位置具有取代突变。结果是融合多肽有至少一个CEA结合结构域和至少一个与所述其它靶分子具有亲和力的结构域。这扩展了本发明的多肽的应用，如作为治疗制剂或作为捕获、检测或分离试剂。
本发明融合多肽第二和其它部分的其它选择包括用于治疗性应用的一或多种部分。在治疗性应用中，其它分子也可以通过其它方法共价或非共价偶联到本发明的多肽上。可以将改造的铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL通过柔性肽连接于CEA结合多肽的C-末端，构成融合蛋白。非限制性例子包括用本发明多肽引导效应酶(例如羧肽酶)而进行“ADEPT"(抗体介导的酶前药治疗，antibody-directedenzymeprodrugtherapy)的酶；包括用以募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白质；包括细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFα、IP10；包括促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白A、calcheamicin、美登木素生物碱；包括毒性小分子，如auristatin类似物、阿霉素等。同时，为了更方便掺入放射性核素(如68Ga、76Br、111In、99Tc、124I、125I)用于诊断或放射性核素(如90Y、131I、211At)用于治疗，可以考虑上述列举的额外的氨基酸(特别是六组胺酸标记和半胱氨酸)，其目的是将放射性同位素的鳌合剂偶联到多肽序列，但不限于上述抗癌活性物质。
本发明还涵盖了在所述的CEA结合多肽上连接一个可检测标记物(如荧光标记，生物素或放射性同位素)，从而可基于本发明的多肽的特异性，实现检测表达CEA阳性癌症的目的。
“CEA结合亲和力”是指可以例如通过利用表面等离子共振(surfaceplasmonresonance)技术如
Figure BDA0003724023670000061
装置进行检测的一种多肽特性。CEA结合亲和力可以通过一个实验进行检测，其中将CEA固定在该装置的感应芯片上，然后将含有待测多肽的样品通过该芯片。或者，也可以将待检测的多肽固定在该装置的感应芯片上，然后将含有CEA的样品通过该芯片。本领域技术人员可以利用所获得的感应图像建立多肽的CEA结合亲和力的至少一种定性测量方法。如果需要定量测量方法，例如为了建立相互作用间的某个KD值，也可以使用表面等离子共振方法。例如，结合值可以利用
Figure BDA0003724023670000071
2000装置(BiocoreAB)进行测定。CEA固定于该装置的感应芯片上，而亲和力待检测的多肽样品通过连续稀释制备并以随机顺序进行注射。然后可从结果中计算KD值。在本发明的实施例中，所述的多肽的KD值达到1.73×10-7M至5.51×10-6M。
本发明还提供了编码本发明的CEA结合多肽或靶向性分子或融合多肽的分离的核酸，也可以是其互补链。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得。
本发明还提供了包含编码所述核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。如本申请所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，载体是本领域技术人员所熟知的，并可见于如《CloningVectors》(Pouwels P.H.等，编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)，实验室手册中所描述的载体。
此外，含有所述核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
生产本发明的CEA结合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有相应多肽的编码核酸的重组细胞，获得产物多肽。可将上述制备获得的多肽纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。
基于要表达多肽的信息和目前重组表达蛋白质的技术水平，结合本发明揭示的内容，本领域技术人员易于制备本发明的多肽。例如，表达未被修饰的Z结构域的质粒可以用作起始材料。使用已知技术，所需的取代突变可以被引入这个质粒中以获得本发明的表达载体。
当使用化学多肽合成方法制备本发明的多肽或靶向性分子或融合蛋白时，上述多肽中的任何天然产生的氨基酸残基都可以被任何相应的、非天然产生的氨基酸残基或其衍生物所取代，只要产物多肽的功能基本不被损害。
本发明还涉及所述的CEA结合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的应用，包括应用于治疗、诊断和/或检测。
本发明的CEA结合多肽可作为CEA抗体在不同应用中的一种替代物。
作为非限制性的实例，其可用于治疗特征以CEA表达为特征的疾病，例如癌症(如结肠直肠癌，肺癌，乳腺癌，胰腺癌和胃癌)等。通过结合胞内CEA以对细胞信号传导，用于相关疾病的体内和体外诊断。本发明的多肽可作为一种检测试剂、捕获试剂或者分离试剂，而且还可直接用作为一种治疗制剂或者将其它治疗制剂靶向CEA蛋白的手段。体外使用本发明的多肽的方法可以不同方式进行，如微量滴定板、蛋白阵列、生物传感器表面和组织切片等等。为了使本发明多肽适用于特异的用途，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对本发明的多肽进行修饰和/或添加。
在下面详细描述了这些修饰和添加，其可能包括在同一多肽链中包含的额外的氨基酸，或者标记和/或治疗制剂，其化学修饰或以其它方式结合本发明的多肽。另外，本发明还涵盖了保留了结合CEA能力的该多肽的片段。
本发明多肽的CEA结合特性以及用该多肽生产靶向性分子(包括融合蛋白)和/或标记的结合分子的稳定性意味着该多肽也可以用于将其它活性物质靶向癌症部位，这些癌症包括表达CEA的细胞。因此，本发明的另一方面是提供了本申请所述的CEA结合多肽与一种具有抗癌活性的物质偶联的应用，以将所述物质运送到表达CEA的细胞，产生靶细胞的损伤或凋亡。
这种抗癌活性的物质可能是通过融合或通过化学键偶联到CEA结合多肽上的蛋白质，如选自用于“ADEPT”(antibody-directed enzyme prodrug therapy)应用的效应酶；用于募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白；细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFαa、IP10等；促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子等；毒素，如蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物碱等。或者，所述活性物质也可能是细胞毒性药物，如auristatin类似物或阿霉素或放射性同位素(如90Y、131I、211At等)，这种同位素可与CEA结合多肽直接结合，或通过一种鳌合剂，如熟知的鳌合剂DOTA或DTPA而与CEA结合多肽结合。
在相关方面，本发明还提供了一种在体内将具有抗癌活性的物质导向表达CEA细胞的方法，包括施用给患者本申请所述的所述活性物质与CEA结合多肽的偶联物。这种偶联物在前文已被适当描述。
本发明还包括使用所述的与CEA结合的多肽检测样品中的CEA蛋白。
例如，这种检测可以用来诊断特征为表达CEA的疾病情况。检测CEA的存在可以在体内也可以在体外进行。体内诊断的优选选择是使用正电子放射X线断层摄影术(PET-CT)。被检测的样品可以例如是生物学液体样品或组织样品。现在的普遍方法是用针对与CEA的抗体，这种方法可以适用于本发明的与CEA结合多肽，这种方法是组织化学方法检测与CEA的存在，用来鉴定新鲜、冷冻或福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品中与CEA蛋白的表达。
为了检测CEA，本发明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其中其它结构域是报告酶或荧光酶。或者，其也可以是被一个或多个荧光制剂和/或放射性同位素标记的，任选通过鳌合剂标记。合适的放射性同位素包括68Ga、76Br、111In、99Tc、124I和125I等。
所述的CEA结合多肽的其它应用还包括：检测样品中CEA的方法，包括如下步骤：(1)提供一种怀疑含有CEA的组织样品，例如冷冻切片或用福尔马林包埋的组织切片，(2)在适宜条件下加入本发明的CEA结合多肽到所述样品中，所述条件为益于所述多肽与样品中存在的任何CEA结合，(3)除去未结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。检测到的结合的多肽的量与样品中存在的CEA的量相关。
本发明还提供了一个诊断组织样品中CEA表达的试剂盒，包括与报告酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)融合的、本发明的CEA结合多肽、检测酶活性的试剂、和阳性和阴性对照组织切片。
本发明还提供了一个诊断组织样品中CEA表达的试剂盒，包括通过抗体检测的与标记(如flag标记或myc标记)融合的本发明的CEA结合多肽、一个特异于标记的一抗、特异于一抗并与报告酶偶联的二抗、检测酶活性的试剂，和阳性和阴性对照组织切片。
诊断应用的一个领域就是在体内检测癌细胞或其聚集物。本发明提供了一个进行这种诊断的试剂盒，该试剂盒包括标记有一个鳌合物的、本发明的CEA结合多肽、一种诊断用放射性同位素(非限制性的例子是68Ga、76Br、111In、99Tc、124I和125I等)，以及用于分析掺入效率的试剂。
如上所述，本发明涵盖了本发明的CEA结合多肽将活性物质靶向表达CEA的细胞如某些类型的癌症细胞的应用。本发明还提供了一个用于此目的的试剂盒，该试剂盒包括用一个鳌合物标记的本发明的CEA结合多肽、一个治疗性放射性同位素(非限制性的例子是90Y、131I、211At)，以及用于分析掺入效率的试剂。
本发明还提供一种药物组合物，其包含：有效量的本发明所述的对人源性CEA具有结合亲和力的多肽或靶向人源性CEA的靶向性分子，和药学上可接受的载体。
如本申请所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。
在使用时，是将安全有效量的本发明所述的对人源性CEA具有结合亲和力的多肽或靶向性分子施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
对于本发明的缩略词汇如下：
英文简写 中文
Amp 氨苄青霉素
CEA 癌胚抗原
ddH<sub>2</sub>O 去离子蒸馏水
E.coli 大肠埃希菌
ELISA 酶联免疫吸附
FITC 异硫氰酸荧光素
His 组氨酸
HRP 辣根过氧化物酶
IPTG 异丙基硫代-β-半乳糖苷
PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBS 磷酸盐缓冲液
SDS 十二烷基磺酸钠
Wt 野生型
DMF 二甲基甲酰胺
实施例1：CEA结合多肽的的筛选鉴定
从本实验室构建的噬菌体随机组合文库中筛选CEA结合多肽，并对其亲和性进行了鉴定。
1、预测人源CEA免疫优势区域，根据预测结果选择淘洗肽段；
在expasy网站上获得的人源CEA全长蛋白的氨基酸序列进行CEA蛋白的细胞表位预测。预测出人源性CEA蛋白的B表位可能所在区域，然后将预测的目标表位进行CTL表位以及Th表位的比对，结合以上结果，选择淘洗目标肽段。结果：CEA全长蛋白的N端148-175氨基酸序列为CEA的免疫优势区段，并委托生物公司进行该肽段合成，作为淘洗的抗原。
构建噬菌体展示CEA结合多肽的随机组合文库，即许多不同的SPA结构域相关多肽的文库，从该文库中筛选CEA结合多肽，并对其亲和性进行了鉴定。
2、CEA结合多肽的随机组合噬菌体展示文库的构建和鉴定
根据野生型SPA-Z的氨基酸序列及结构(Nilsson B等，Protein Eng.1987；1(2)：107-113)，针对其三个螺旋结构区对应的编码序列设计随机引物，利用PCR方法扩增获得可导致随机氨基酸突变的SPA编码序列，命名为SPA-N。
3、pCANTAB5E/SPA-N重组质粒的构建
选择以M13噬菌体系统(购自北京宝科维食安生物公司)进行亲和体的表达，以pCANTAB5E(购自北京宝科维食安生物公司)为载体，通过Ndel和Xhol酶切位点构建pCANTAB5E/SPA-N重组质粒，转化至感受态E.coli.BL21细胞，涂布LB/Amp+平板，培养过夜，标记为affibody初级库备用。
4、CEA结合多肽的筛选和滴度测定
将纯化的CEA的免疫优势区段包被96孔酶标板，经封闭、加噬菌体文库(初级库)孵育、再加入E.coli TG1细胞，37℃洗脱，加4×1010辅助噬菌体M13K07(购自北京宝科维食安生物公司)和2YT-AKG温育，离心后取上清，用10ml2YT-AKG轻悬细胞过夜培养，离心后取上清。即为初级库，标记为affibody初级库备用。重复上述1轮富集筛选，获得CEA分子亲和筛选后的噬菌体文库，为二级，滴度测定为1×106；在二级库的基础上再重复上述1轮富集筛选，为三级文库，滴度测定在1×107以上。同时设置不加噬菌体的空白对照作同步筛选。
5、CEA结合多肽单克隆噬菌体的制备及ELISA鉴定
Phage-ELISA用于筛选表达CEA结合多肽分子的噬菌体。将CEA蛋白以10μg/mL包被96孔酶标板，4℃过夜；PBS洗涤，用5％脱脂奶粉封闭2h；洗涤，取三轮筛选后获得的噬菌体与等体积的3％脱脂奶粉混匀，200μl/孔，37℃，2h。洗涤，加入1∶10000稀释的加入带HRP的抗M13单克隆抗体，100μl/孔，37℃，1h；洗涤，加入TMB显色液50μl/孔，37℃，5-10min；2MH2SO450μl/孔，终止反应；置酶标仪读取OD450值。结果，在三轮淘选循环中选择结合抗原的affibody分子，进一步用噬菌体ELISA检测以分析其CEA结合活性，选取OD450值读数较高的克隆株，送往上海擎科生物科技有限公司进行碱基序列的测定。
6、CEA结合多肽的序列检测及筛选
经上海擎科生物科技有限公司测序，结果获得31个完全正确克隆序列。根据DNA测序结果进行分析，选择与CEA蛋白结合活性最强的3个单克隆噬菌体的DNA序列(分别为ZCEA539、ZCEA546、ZCEA919)作为靶目标进行下续研究，DNA序列分别为SEQ ID NO：5-7，编码的氨基酸序列如(SEQ ID NO：2-4)，如图1。
实施例2：CEA结合affibody分子原核表达、纯化以及鉴定
如前选择了具有较高ELISA读数的3个克隆(表1中的ZCEA539、ZCEA546、ZCEA919)，及Zwt作为CEA结合多肽的阴性对照。为了对筛选的affibody分子进行功能检测，对其进行重组质粒构建、原核蛋白的表达及其鉴定，并制备纯化蛋白。
1、pET21a(+)/affibody的重组质粒构建
参照affibody基因序列设计PCR引物，上游引物
Figure BDA0003724023670000111
Figure BDA0003724023670000112
(SEQ ID NO:9，斜体和下划线表示NedI酶切位点)，下游引物
Figure BDA0003724023670000121
Figure BDA0003724023670000122
(SEQ ID NO:10，斜体和下划线表示XhoⅠ酶切位点)；以筛选的测序正确四级库单克隆affibodyZCEA539、ZCEA546、ZCEA919为模板，
通过PCR扩增affibody目的基因，同时将affibody Zwt经原核密码子优化后全序列(SEQ ID NO:8)合成作为阴性对照。将PCR扩增的目的基因经NdeⅠ和XhoⅠ克隆至pET21a(+)载体，构建pET21a(+)/ZCEA的重组质粒，并经测序鉴定，3种质粒序列完全正确。质粒图和测序峰图见图2，重组质粒电泳图见图3。
2、ZCEA重组蛋白原核表达、纯化以及鉴定
将构建的重组质粒转化BL21感受态，分别在不同IPTG浓度情况下液体培养基浓度情况下(0.1mmol/L-2mmol/L)以及不同诱导表达时间上，离心收集各菌体进行SDS-PAGE分析。结果在IPTG浓度为1.0mM，37℃下诱导6h下蛋白的表达较优，将以上条件诱导后的菌体超声破碎，弃去上清，用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTAAgarose)亲和层析法纯化并经SDS-PAGE分析，SDS-PAGE显示在分子质量约为7.5Kda处出现较为单一的条带，与预期ZCEAaffibody多肽的分子质量大小一致，详见图4。
3、重组融合蛋白Westernblot分析
以ZCEA重组蛋白为目的蛋白，以Zwt为阳性对照，以his单抗作为一抗，进行WesternBlot实验。实验结果显示：在NC膜上，出现阳性斑点，其大小大约为8Kda，与阳性对照一致，结果如图5所示，显示融合蛋白可以与抗His标签小鼠mAb特异性反应。
4、表面等离子共振技术(SPR)检测ZCEA与商业化CEA蛋白之间的亲和力
表面等离子共振技术检测重组蛋白ZCEA539,ZCEA546,ZCEA919与CEA商业化CEA全长蛋白之间的亲和力通过表面等离子共振技术(SPR)分析检测不同浓度的ZCEA539，ZCEA546，ZCEA919，Zwt与CEA之间的亲和力，结果见图6，将affibody分子依次倍比稀释同时设置Zwt作为阴性对照，最高5uM浓度，最低0.625uM，结果显示，affibody分子与靶蛋白之间均能有反应，并且且随着浓度增加，RU值在不断加强，而对照组中各浓度的野生型Zwt蛋白无论浓度高低，其与靶蛋白之间均无响应值，之后结合动力学分析得到affibody的KD值就在umol水平，其亲和力明显好于传统的抗体。SPR的结果表明，ZCEA539，ZCEA546，ZCEA919与商业化CEA全长靶蛋白之间具有较好的亲和力，平衡解离常数(KD)分别为5.059x10-6，1.733x10-7，5.512x10-6；ZWT与商业化CEA全长蛋白之间几乎没有亲和力，其平衡解离常数(KD)为1.628；最终选择ZCEA546进行下一步实验。
实施例3、CEA结合affibody分子亲和力和靶向结合
鉴定ZCEA546affibody多肽与CEA蛋白结合的特异性，质粒pET21a(+)/ZCEA546野生型pET21a(+)/Zwt由之前的实验构建
1、利用Elisa法鉴定ZCEA重组蛋白和CEA多肽之间的亲和性，使用酶标仪出测OD450的值，见图7，通过Elisa实验发现重组蛋白与阴性组照相比，OD值明显具有差异，判断ZCEA546与靶多肽CEA(148-175aa)之间具有亲和性。
2、RT-PCR验证HT-29，MKN-45以及Hela细胞中CEA的表达情况
Trizol法提取HT-29，MKN-45以及Hela细胞的RNA，计算RNA浓度，逆转录后经过聚合酶链式反应扩增获得目的基因CEA：PCR循环条件为：94℃预变性3min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环，72℃末延伸5min。见图8，RT-PCR验证HT-29，MKN-45以及Hela细胞中CEA的表达情况，根据实验结果，HT-29，MKN-45细胞中有CEA表达，而Hela细胞则没有CEA表达。
3、细胞免疫荧光鉴定重组蛋白ZCEA546对天然靶蛋白CEA的特异性亲和力
将HT-29，MKN-45以及Hela细胞细胞复苏培养，冻存；铺板；加入纯化affibidy，无菌滤器过滤蛋白，蛋白浓度调整为100mg/ml，在每个孔内加入200ul的蛋白。37℃培养箱内放置6小时。之后通过200ul多聚甲醛固定细胞；弃去多聚甲醛，PBS清洗后加入0.3％的Triton打破细胞膜，并经过敷一抗His单抗，4℃放置过夜，敷二抗FITC标记的羊抗鼠，弃去一抗，37℃放置2小时，PBST清洗多次后，加入20ul hochest，37℃染10min，然后PBS洗一遍，转移至载玻片，拍片。将ZCEA和对照Zwt蛋白加入到HT-29，MKN-45以及Hela细胞6h后，之后his单克隆抗体作为靶标，将与CEA天然蛋白结合的ZCEA展示，以此来展示析重组蛋白ZCEA细胞中天然存在的CEA之间的的结合能力。见图9，孵育ZCEA546的HT-29，MKN-45的细胞，在胞膜的位置上出现明显绿色团块样的荧光，而Hela细胞中无绿色荧光出现，孵育Zwt蛋白的四种细胞中均未出现明显的绿色荧光。说明HT-29，MKN-45细胞中天然存在的的CEA蛋白可被ZCEA重组蛋白特异性识别并结合，通过筛选得到的三个重组蛋白ZCEA 546对HT-29，MKN-45中天然表达的CEA有一定的靶向结合力。
实施例4：CEA结合affibody分子在荷瘤裸鼠中的成像和肿瘤靶向特性
1、荷瘤小鼠肿瘤模型的建立
4周龄的Balb/c裸鼠在SPF环境内适应一周后，将小鼠分为3组，将处于对数生长期，生长状态良好的HT-29.MKN-45以及Hela用EDTA(胰酶)消化离心后，用无血清的1640重悬细胞，利用细胞计数板，将其细胞密度调整为2x107/ml，在30分钟内将细胞悬液分别接种到3组裸鼠的右侧肩胛骨下，每只小鼠接种200ul。每天观察荷瘤小鼠生长情况，每两天进行拍照记录并且测量肿瘤大小，测量肿瘤大小时，将测得到的肿瘤长径记作为a，短径记作为b，按V＝0.5ab2的公式计算肿瘤大小，等至肿瘤长至200-300mm3时，将荷瘤小鼠带出SPF环境，进行下一步近红外成像实验，成功建立荷瘤裸鼠模型。
2、荧光蛋白的标记以及验证
根据之前的蛋白纯化方法，纯化ZCEA546以及Zwt；将荧光染料Dylight755从-80℃冰箱取出，室温平衡10min，然后12000rpm离心5min，避光下用200ul枪头蘸取少量染料，然后溶解在500ulDMF中，取出100ul偶联的染料加入到1ml已经制备纯化得到的ZCEA546以及Zwt(浓度为500ug/ml)，避光下偶联2小时，然后透析过夜。
偶联蛋白的验证，避光下分别取40ul偶联后的ZCEA546以及Zwt蛋白，加入10ul的Loading Buffer，煮沸约5min，离心后取样品进行跑胶验证，15％的PAGE胶的制备以及跑胶鉴定的方法如前所述。跑胶完成后，将湿润的胶放置于成像仪上，选择成像仪激发光滤片为671-705nm，发射光滤片为750longpass，采用8bit和2X2模式，用730-950nm波长间隔10nm每次曝光2000ms收集图像信息，用Maesro自带的软件进行图像处理及分析。见图10，Dylight标记亲和体蛋白的鉴定如下：在成像仪内曝光后发现红色荧光条带出现在了10kDa以下的位置，处于affibody的理论位置，且抽取100ul蛋白后，将胰岛素注射器放入成像仪内拍照，结果发现抽取的蛋白带红色荧光，说明affibody与Dylight755成功偶联。
3、DyLight-755标记ZCEA546蛋白在荷瘤裸鼠体内成像研究实验
研究荧光蛋白在正常小鼠体内的荧光代谢情况：将未接种肿瘤的健康裸小鼠带出SPF环境，尾静脉注射100ul的荧光蛋白剂量(实际的荧光蛋白含量为50ug)，2.5％水合氯醛以12ul/g的剂量诱导麻醉，5ul/g的剂量进行维持麻醉。待小鼠麻醉后，将小鼠放入成像仪，选择成像仪激发光滤片为671-705nm,发射光滤片为750longpass，采用8bit和2X2模式，用730-950nm波长间隔10nm每次曝光2000ms收集图像信息，经尾静给药后在5min，30min，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，48h，72h用Maesro自带的软件进行图像处理及分析。见图11，5分钟后全身普遍发红，表示荧光蛋白已经在裸鼠体内循环，30分钟后荧光慢慢减退。直到2小时左右，荧光开始值存在于肾脏，其他部位无明显亮点，说明Dylight-ZCEA在裸鼠体内主要以肾脏途径进行代谢，以肾脏/皮肤荧光比值来反映肾脏的荧光代谢强度，统计后发现5min-6小时比值逐渐提高，直到6小时达到最高值，然后慢慢下降，表明体内代谢的高峰期是尾静脉给药后6小时，并于72小时内完全排泄。
待裸鼠的肿瘤长至300-500mm3时将裸鼠带出SPF屏障系统，经2.5％水合氯醛以12ul/g的剂量诱导麻醉后，以每只小鼠100ul的剂量(实际的荧光蛋白含量为50ug)经尾静给药，将小鼠放入成像仪，选择成像仪激发光滤片为671-705nm,发射光滤片为750longpass，采用8bit和2X2模式，用730-950nm波长间隔10nm每次曝光2000ms收集图像信息，在5min，30min，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h用Maesro自带的软件进行图像处理及分析，以肿瘤/皮肤的荧光值代表荧光蛋白在肿瘤处的聚集情况。
结果见图12，荷瘤小鼠尾静脉分别给与Dylight-ZCEA546、Dylight-ZWT后，CEA阳性细胞株HT-29和MKN-45形成的肿瘤，其肿瘤/皮肤荧光值随时间改变十分明显，给药后5min到4h肿瘤部位的荧光逐渐增强，说明Dylight-ZCEA546在肿瘤部位明显聚集，在4小时达到了聚集的高峰，之后肿瘤部位的荧光强度慢慢减弱，直到消失。在两种阳性肿瘤之间进行比较，发现MKN-45的荷瘤小鼠肿瘤处的荧光强于HT-29荷瘤小鼠肿瘤处的荧光。而阴性细胞Hela形成的荷瘤小鼠肿瘤处的荧光则未发现明显的改变。而尾静脉给与Dylight-ZWT后3种荷瘤小鼠的肿瘤部位荧光均没有明显的聚集。
如图13所示，在尾静脉给与Dylight-ZCEA546后4小时，三种荷瘤小鼠，HT-29，MKN-45以及Hela所对应的肿瘤/皮肤荧光比值依次为3.327，4.740，0.977；而在尾静脉给与Dylight-ZWT后4小时，三种荷瘤小鼠，HT-29，MKN-45以及Hela所对应的肿瘤/皮肤荧光比值依次为1.332，0.890，0.893。各组别之间分别进行比较后发现，在CEA阳性荷瘤小鼠给与不同荧光蛋白后，其荧光比值具有明显差异；而CEA阴性荷瘤小鼠给与不同荧光蛋白后，其差异没有明显差别。
另外选择荷瘤裸小鼠，在尾静脉给药后4h以及24h后处死小鼠，解剖小鼠分离肿瘤，肾脏，肝脏，心脏，小肠，胰腺，皮肤，肌肉，肺以及脑，将其排列，置于成像系统扫描。
如图14所示，我们发现各个器官的荧光强度与之前的实验结果相符，在CEA阳性荷瘤小鼠组内，经尾静脉给与Dylight-ZCEA5464小时后的器官中，肿瘤器官和肾脏都有明显的红色荧光，肿瘤组织的荧光强度与其他各脏器的荧光强度有显著性差异(p<0.05)，而在给与Dylight-ZWT后，只有肾脏能够出现红色的荧光。而在CEA阴性Hela细胞的荷瘤小鼠内，给与两种荧光蛋白后4小时处死小鼠，发现只有肾脏部位有明显的荧光，而肿瘤部位没有发现明显的荧光聚集。
结果表明，标记DyLight-755标记ZCEA546蛋白具有靶向结合CEA表达阳性肿瘤的特性。
另外，本发明在个体水平上验证了ZCEA546对CEA阳性肿瘤的特异靶向性，因此在利用ZCEA546的靶向作用，经过改造，偶联抗癌活性药物，其对CEA表达阳性的肿瘤细胞的体内生长的抑制作用，治疗CEA表达阳性的肿瘤的效果是可预期的。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 一种对人源性CEA具有结合亲和力的多肽及其用途
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(58)
<400> 1
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(58)
<400> 2
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1 5 10 15
Arg Ser Leu Pro Asn Leu Asn Ala Val Gln Ala Gln Ala Phe Ile Val
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(58)
<400> 3
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Gly Thr Ala Trp Arg Glu Ile
1 5 10 15
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<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(58)
<400> 4
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Ile His Pro Ala His Thr Glu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Leu Pro Asn Leu Asn His Asp Gln Ala Glu Ala Phe Ile Val
20 25 30
Ser Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 5
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(174)
<210> 5
<211> 174
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<221> misc_feature
<222> (1)..(174)
<400> 5
gttgacaaca aattcaacaa agaagacatg gcggctcacc acgaaatccg 50
ctctctgccg aacctgaacg cggtgcaggc ccaggctttc atcgtctctc 100
tgcgcgacga cccgtctcag tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa 150
ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa174
<210> 6
<211> 174
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<221> misc_feature
<222> (1)..(174)
<400> 6
gttgacaaca aattcaacaa agaaatgggg accgcttggc gggaaatctt 50
cgagctgccg aacctgaacg acgcgcaggc tgctgctttc atcgaatctc 100
tgcacgacga cccgtctcag tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa 150
ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174
<210> 7
<211> 174
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<221> misc_feature
<222> (1)..(174)
<400> 7
gttgacaaca aattcaacaa agaaatccac ccggctcaca ccgaaatcct 50
caccctgccg aacctgaacc atgaccaggc agaggctttc atcgtctctc 100
tggtagacga cccgtctcag tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa 150
ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174
<210> 8
<211> 174
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<221> 人工序列
<222> (1)..(174)
<400> 8
gttgacaaca aattcaacaa agaacagcag aacgctttct acgaaatcct gcacctgccg 60
aacctgaacg aagaacagcg taacgctttc atccagtctc tgaaagacga cccgtctcag 120
tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174
<210> 9
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<221> 人工序列
<222> (1)..(30)
<400> 9
gggaattcca tatggttgac aacaaattca acaaagaa 38
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<221> 人工序列
<222> (1)..(38)
<400> 10
ccggaattcc gtttcggagc ctgagcgt 23

Claims (11)

1.一种对人源性CEA具有结合亲和力的多肽，其特征是：所述的对人源性CEA具有结合亲和力的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-4任一所示。
2.根据权利要求1所述的一种对人源性CEA具有结合亲和力的多肽，其特征是：该多肽与人源性CEA相互作用的KD值为1.73×10-7M至5.51×10-6M。
3.一种靶向人源性CEA的靶向性分子，其特征是：所述的靶向性分子包括权利要求1-2任一所述的多肽，以及与该多肽相连接的偶联物，所述的偶联物包括：半胱氨酸残基；多肽标签；抗癌活性的物质；或可检测标记物。
4.一种分离的多核苷酸，其特征是：其编码权利要求1-2任一所述的对人源性CEA具有结合亲和力的多肽。
5.一种重组载体，其特征是：该载体包含权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞包含权利要求5所述的重组载体，或其包含有基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种对人源性CEA具有结合亲和力的多肽的用途，其特征是：用于制备检测人源性CEA的检测试剂中的应用，或者在制备诊断人源性CEA表达阳性癌症的诊断试剂的应用，所述多肽包括权利要求1-2任一所述的对人源性CEA具有结合亲和力的多肽。
8.权利要求3所述的一种靶向人源性CEA的靶向性分子的用途，其特征是：所述偶联物是抗癌活性药物，用于制备治疗人源性CEA表达阳性癌症的药物；或所述偶联物是多肽标签或可检测标记物，用于制备检测人源性CEA蛋白的检测试剂或用于制备诊断人源性CEA蛋白表达阳性癌症的诊断试剂。
9.一种药物组合物，其特征是：其包含：权利要求1-2任一所述的对人源性CEA蛋白具有结合亲和力的多肽或权利要求3所述的靶向人源性CEA蛋白的靶向性分子；和药学上可接受的载体。
10.一种用于诊断人源性CEA表达阳性癌症的药盒，其特征是：包括：权利要求1-2任一所述的对人源性CEA具有结合亲和力的多肽；
或权利要求3所述的靶向人源性CEA的靶向性分子，所述偶联物是多肽标签或可检测标记物；
或权利要求9所述的药物组合物，所述偶联物是多肽标签或可检测标记物。
11.一种用于治疗人源性CEA表达阳性癌症的药盒，其特征在于，包括：权利要求3所述的靶向人源性CEA的靶向性分子，所述靶向性分子的偶联物是抗癌活性药物；
或权利要求9所述的药物组合物，所述靶向性分子的偶联物是抗癌活性药物。
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支轶;吴玉章;万瑛;邹丽云;郭晟;刘娜;: "癌胚抗原低亲和力表位改造中的分子对接", 免疫学杂志, no. 06, 25 November 2005 (2005-11-25) *

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