CN106046144B - 与凋亡或坏死相关的TNFα短肽及其应用 - Google Patents
与凋亡或坏死相关的TNFα短肽及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及与凋亡或坏死相关的TNF‑α短肽及其应用。具体地,本发明提供了鉴定引起细胞凋亡和坏死的肿瘤坏死因子TNF‑α激动剂多肽的方法,以及用该方法鉴别出的多肽。本发明多肽具有明确的引起细胞凋亡和/或坏死的功能,因此可用于治疗肿瘤、感染性疾病。
Description
本申请是申请日为2011年5月7日、申请号为201110117853.X、发明名称为“与凋亡或坏死相关的TNFα短肽及其应用”的发明申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及医学领域,更具体地涉及引起细胞凋亡和坏死的肿瘤坏死因子TNF-α激动剂多肽及其制法和用途。
背景技术
TNF-α是一种多功能的细胞因子,可由多种细胞分泌,其中最主要是来自巨噬细胞。TNF-α通过与靶细胞受体TNFR结合发挥多种生理功能,例如引起恶病质、刺激淋巴细胞生长、诱发炎症反应、诱导细胞凋亡和坏死性死亡。
TNF-α是以三聚体的形式与它的受体三聚体结合。然而,人们并不知道TNF-α与受体结合后为什么会引起以及如何引起不同的的功能,有时甚至是引起相反的功能。
有研究显示,TNF-α在低pH环境下会产生结构上的变化,然后插入细胞膜,从而促使细胞发生裂解[Proc.Natl.Acad.Sci.1996;USA 93:1021-1026]。这一结果提示TNF-α结构的改变可能是它发挥功能的关键。
此外,受体TNFR存在两种形式,但是TNFR2受体只有存在于人体的某些细胞里,因此无法以此解释为什么TNF-α与受体结合会引起的不同功能。这些未解之谜对TNF-α的临床应用造成了一定影响。
因此,本领域迫切需要确定导致TNF-α不同功能的原因,并开发具有明确功能的TNF-α或其衍生多肽。
发明内容
本发明的目的就是提供一种鉴定引起细胞凋亡和/或坏死的肿瘤坏死因子TNF-α激动剂多肽的方法。
本发明的另一目的是提供上述能引起细胞凋亡和/或坏死的肿瘤坏死因子TNF-α激动剂多肽及其制法和用途。
在本发明的第一方面,提供了一种鉴别引起细胞凋亡和/或细胞坏死的肿瘤坏死因子TNF-α激动剂多肽的方法,包括步骤:
(a)提供基于肿瘤坏死因子TNF-α的多肽,所述多肽的长度为7-50个氨基酸;
(b)测定所述多肽引起细胞凋亡的能力和测试所述多肽引起细胞坏死的能力,如果所述多肽能够明显引起细胞凋亡且引起凋亡的程度远大于引起坏死的程度,则该多肽是引起细胞凋亡的TNF-α激动剂多肽;如果所述多肽能够明显引起细胞坏死且引起坏死的程度远大于引起凋亡的程度,则该多肽是引起细胞坏死的TNF-α激动剂多肽。
在另一优选例中,在步骤(b)中,如果所述多肽能够明显引起细胞胞内表达caspase-3但没有细胞膜破坏,而且这种(Caspase-3阳性,细胞膜破坏阴性)细胞的百分比超过阴性对照中同样细胞20%以上,则该多肽是引起早期细胞凋亡的TNF-α激动剂多肽;如果所述多肽既能够明显引起细胞胞内表达caspase-3又能引起细胞膜破坏,而且这种(Caspase-3阳性,细胞膜破坏阳性)细胞的百分比超过阴性对照中同样细胞20%以上,则该多肽是引起晚期细胞凋亡的TNF-α激动剂多肽;如果所述多肽不激活胞内caspase-3的表达但却能够明显引起细胞膜破坏,而且这种细胞(caspase-3阴性,细胞膜破坏阳性)的百分比超过阴性对照中同样细胞20%以上,则该多肽是引起细胞坏死的TNF-α激动剂多肽。
在另一优选例中,所述的阴性对照是在不添加所述的待测多肽的情况下,在相同培养条件下培养的相同种类的细胞。
在另一优选例中,在步骤(b)中,当该多肽满足以下条件时,则该多肽是TNF-α的细胞凋亡型激动剂多肽:
(i)该多肽可引起≥20%(较佳地≥30%,更佳地≥50%,最佳地≥70%)细胞表达caspase-3或发生凋亡;
(ii)设Z1=Q1-Q2,则Z1≥20%,其中Q1为在相同条件下,该多肽引起的胞内caspase-3表达(发生凋亡)的细胞百分比数量,而Q2为无多肽(或阴性多肽)引起胞内表达caspase-3的细胞百分比数量。较佳地,Z1≥30%,更佳地Z1≥50%;最佳地Z1≥70%。
在另一优选例中,还包括根据以下条件,进一步细分凋亡型激动剂的类型:
(iii)设Z2=Q3-Q4,其中Q3为在相同条件下,该多肽引发的胞膜破坏的细胞百分比数量,而Q4为无多肽(或阴性多肽)引起的细胞膜破坏数量(百分比);当Z1≥20%,Z2≤5%,判定为早期细胞凋亡;当Z1≥20%,Z2≥20%,判定为晚期细胞凋亡。
在另一优选例中,在步骤(b)中,当该多肽满足以下条件时,则该多肽是TNF-α的细胞坏死型激动剂多肽:
(i)在无caspase-3胞内表达的条件下,该多肽可引起≥20%(较佳地≥30%,更佳地≥50%,最佳地≥70%)细胞膜破坏(细胞坏死);
(ii)当无细胞凋亡或Z1=≤5%(如0%),设Z2=Q3-Q4,则Z2≥20%,其中Q3为在相同条件下,该多肽引发的胞膜破坏的细胞百分比数量,而Q4为无多肽(或阴性多肽)引起的细胞细胞膜破坏的细胞百分比数量。(较佳地,Z2≥30%,更佳地Z2≥50%;最佳地Z2≥70%。)
在另一优选例中,所述的多肽的序列来源于人TNF-α,更佳地来源于SEQ ID NO.:1(或参见uniprot/P01375)。
在另一优选例中,所述多肽的长度为8-40个氨基酸,更佳地9-30个氨基酸,最佳地10-20个氨基酸。
在本发明的第二方面,提供了一种TNF-α的激动剂多肽,所述的多肽具有以下特征:
(i)该多肽的序列来源于肿瘤坏死因子TNF-α的氨基酸序列;
(ii)该多肽的长度为7-50个氨基酸;
(iii)该多肽具有明显引起细胞凋亡或明显引起细胞坏死的能力。
在另一优选例中,被诱导凋亡或被诱导细胞坏死的细胞包括肿瘤细胞、过度增长的细胞包括与自身免疫相关的细胞(如自身免疫T细胞、B细胞)。
在另一优选例中,所述的多肽是细胞凋亡型激动剂多肽。
在另一优选例中,所述的细胞凋亡型激动剂多肽含有或具有选自下组的序列:SEQID NO.:3(P8)、6(P11)、7(P12)、8(P13)、15(P20)和16(P21)。
在另一优选例中,所述的细胞凋亡型激动剂多肽包括P8、P11、P12、P13、P20、P21、P13-2、P13-3、P13-4、P13-5、P13-6、P13-7、P13-8、P13-9、P13-10、P16-6、P16-7、P16-8、P16-9、P16-10、P16-11或其组合。
在另一优选例中,所述的多肽是细胞坏死型激动剂多肽。
在另一优选例中,所述的细胞坏死型激动剂多肽含有或具有选自下组的序列:SEQID NO.:9(P14)、10(P15)、和11(P16)。
在另一优选例中,所述的细胞坏死型激动剂多肽包括P14、P15、P16、P13-10、P14-1、P14-2、P14-3、P14-4、P16-5或其组合。
在本发明的第三方面,提供了一种药物组合物,其特征在于,包括药学上可接受的载体和本发明第二方面中所述的TNF-α的激动剂多肽。
在本发明的第四方面,提供了本发明第二方面中所述的TNF-α的激动剂多肽的用途,它被用于制备诱导细胞凋亡和/或坏死的药物组合物。
在本发明的第五方面,提供了本发明第二方面中所述的TNF-α的激动剂多肽的用途,它被用于制备治疗肿瘤的药物组合物;或用于制备治疗自身免疫病及感染性疾病的药物组合物。
在另一优选例中,所述的肿瘤包括:口腔癌、食道癌、胃癌、十二指肠癌、小肠癌、结肠癌、肛门癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、壶腹癌、鼻咽癌、肺癌、皮肤癌(黑色素瘤)、骨癌、骨髓癌、T及B细胞淋巴瘤、白血病、何杰金氏瘤、非何杰金氏瘤、卡波氏肉瘤、头颈部肿瘤、脑瘤、神经胶质瘤、甲状腺癌、胸腺癌、肾癌、输尿管癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、阴茎癌、子宫癌、子宫颈癌、卵巢癌、输卵管癌、阴道癌。
在另一优选例中,所述的感染性疾病包括HIV感染。
在本发明的第六方面,提供了一种体外(非治疗性)诱导细胞凋亡和/或细胞坏死的方法,包括步骤:在本发明第二方面所述的TNF-α的激动剂多肽存在下,培养细胞,从而诱导细胞凋亡和/或细胞坏死。
在本发明的第七方面,提供了一种诱导对象发生细胞凋亡和/或细胞坏死的方法,包括步骤:给需要治疗的对象施用第二方面所述的TNF-α的激动剂多肽,从而诱导细胞凋亡和/或细胞坏死。
在本发明的第八方面,提供了一种减少或封闭对象发生TNF-α相关炎症的方法,包括步骤:给需要治疗的对象施用第二方面所述的TNF-α的激动剂多肽,从而诱导细胞凋亡和/或细胞坏死。
在另一优选例中,所述的多肽是细胞凋亡型激动剂多肽(包括P12和P13)。
在本发明的第九方面,提供了一种治疗感染性疾病的方法,其特征在于,包括步骤:给需要治疗的对象施用第二方面所述的TNF-α的激动剂多肽。
在另一优选例中,所述的感染性疾病是HIV感染。
在另一优选例中,所述的多肽是细胞凋亡型激动剂多肽(包括P12和P13)。
在本发明的第十方面,提供了一种第二方面所述的TNF-α的激动剂多肽的用途,它被用于制备提高体重的药物组合物。
在本发明的第十一方面,提供了一种提高治疗对象体重的方法,包括步骤:给需要的对象施用第二方面所述的TNF-α的激动剂多肽。
在另一优选例中,所述的对象是肿瘤患者。
在另一优选例中,所述的多肽是细胞凋亡型激动剂多肽(包括P12)、细胞凋亡型激动剂多肽(包括P16)、或其组合。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1a显示了完整TNF-α不能诱导T细胞死亡。
图1b显示了TNF-α激活NF-kB(细胞生长)。
图1c显示了TNF-α片段(多肽)可诱导细胞凋亡和坏死。
图1d显示了各NF-多肽(20aa)诱导之细胞凋亡和坏死的图谱。
图1f显示了TNF-α多肽诱导之新鲜或经PHA刺激过的PBMC凋亡情况。
图1g显示了TNF-α多肽诱导之新鲜或经PHA刺激过的PBMC坏死情况。
图2显示了TNF-α结合可溶性的TNF受体。
图3a显示了P12和p13抑制TNF-α的杀伤作用。
图3b显示了P12和p13可抑制TNF-α的杀伤作用。
图3c显示了Anti-P12抗体抑制的杀伤作用。其中,纵坐标为细胞数,横坐标为caspase-3表达量。空峰为阴性对照(就是无TNF-α,只有L929细胞),因此无细胞凋亡(无caspase-3表达)。TNF-α加L929细胞后会引起细胞凋亡。黑峰表示细胞表达caspase-3,细胞凋亡。右图表明加对照血清对TNF-α杀L929细胞没影响。左图表示加了抗P12抗体后,抑制了TNF-α引起的L929凋亡,黑峰左移,细胞凋亡减少。“1”和“2”是分别来源于两只老鼠的抗血清。TNF-α的浓度是0.59nM。
图4a显示了HIV感染导致MT2细胞死亡。
图4b显示了HIV感染导致MT2细胞死亡的曲线。
图4c显示了HIV感染或不感染的MT2细胞,在未经P13或P16处理下细胞凋亡和坏死的情况。
图4d显示了HIV感染或不感染的MT2细胞,经P13和P16处理后细胞凋亡和坏死的情况。
图4e用柱形图总结图4c的结果。
图4f用柱形图总结图4d的结果。
图4g显示了随着P13浓度的增加,HIV感染逐渐减少。
图4h显示了使用P13和P16时,HIV感染细胞的数量图。
图4i显示了细胞凋亡激动剂多肽P12和P13可以使上清液中的病毒含量减少。
图5显示了P16对多种肿瘤细胞的杀伤作用。
图6显示了肽P12和P16对老鼠体重的影响。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次意外地发现和证实了,完整的TNF-α可以刺激细胞生长,不会诱导细胞死亡,但是变性的TNF-α(如降低TNF-α溶液的pH值所导致的变性、酶降解所导致的变性)、片段化的TNF-α多肽却能诱导细胞凋亡和/或坏死。这一发现对于治疗炎症、感染和肿瘤具有极重要的应用价值。在此基础上,本发明人完成了本发明。
具体地,完整的TNF-α能刺激一些正常的细胞(如PBMC)和其它许多细胞株的生长(如Jurkat A3和MT2细胞),但是很少会引起这些细胞的凋亡或坏死。完整的TNF-α也能引起一些肿瘤细胞(如L929和U937细胞)的死亡、凋亡及坏死。然而,一些TNF-α衍生多肽分别具有明显的诱导细胞凋亡和/或细胞坏死的功能。
本发明不仅提供了定量鉴定细胞凋亡与坏死的方法(并以TNF-α为例子),而且除TNF-α外,该方法还可以用于药物(如小分子药物及生物药物)毒性的筛选。
术语
如本文所用,术语“TNF-α”和“肿瘤坏死因子α”可互换使用,指哺乳动物(包括人)的肿瘤坏死因子α。优选的TNF-α来源于人,野生型人TNF-α蛋白具有233个氨基酸,序列见http://www.uniprot.org/uniprot/P01375或SEQ ID NO.:1。应理解,该术语也包括天然存在的、上述野生型人TNF-α的突变体。
本发明多肽
在本发明中,术语“本发明的短肽”、“本发明的多肽”或“TNF-α衍生多肽”可互换使用,指衍生自TNF-α序列的、具有确定的引起细胞凋亡和/或细胞坏死功能的多肽。通常,这些断短肽的长度为7-50个氨基酸,较佳地8-40个氨基酸,更佳地9-30个氨基酸,最佳地10-20个氨基酸。
应理解,本发明的短肽通常包括两类多肽,即“TNF-α的细胞凋亡型激动剂多肽”和“TNF-α的细胞坏死型激动剂多肽”。
在本发明中,当TNF-α及某一多肽满足以下条件时,可认为是TNF-α的细胞凋亡型激动剂多肽:
(i)该多肽可引起≥20%(较佳地≥30%,更佳地≥50%,最佳地≥70%)细胞表达caspase-3或发生凋亡;
(ii)设Z1=Q1-Q2,则Z1≥20%,其中Q1为在相同条件下,该多肽引起的胞内caspase-3表达(发生凋亡)的细胞百分比数量,而Q2为无多肽(或阴性多肽)引起胞内表达caspase-3的细胞百分比数量。较佳地,Z1≥30%,更佳地Z1≥50%;最佳地Z1≥70%。
此外,可进一步基于(iii)进行细分:
(iii)设Z2=Q3-Q4,其中Q3为在相同条件下,该多肽引发的胞膜破坏的细胞百分比数量,而Q4为无多肽(或阴性多肽)引起的细胞膜破坏数量(百分比)。当Z1≥20%,Z2≤5%,为早期细胞凋亡;当Z1≥20%,Z2≥20%,为晚期细胞凋亡。
在步骤(b)中,当该多肽满足以下条件时,则该多肽是TNF-α的细胞坏死型激动剂多肽:
(i)在无caspase-3胞内表达的条件下,该多肽可引起≥20%(较佳地≥30%,更佳地≥50%,最佳地≥70%)细胞膜破坏(细胞坏死);
(ii)当无细胞凋亡或Z1=≤5%(如0%),设Z2=Q3-Q4,则Z2≥20%,其中Q3为在相同条件下,该多肽引发的胞膜破坏的细胞百分比数量,而Q4为无多肽(或阴性多肽)引起的细胞细胞膜破坏的细胞百分比数量。则该多肽是引起细胞坏死的TNF-α激动剂多肽。较佳地,Z2≥30%,更佳地Z2≥50%;最佳地Z2≥70%。
本发明的多肽可以是重组多肽、合成多肽,优选重组多肽。本发明的多肽可以是化学合成的产物,或使用重组技术从原核或真核宿主(例如,细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的,或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明“TNF-α的细胞凋亡型激动剂多肽”和“TNF-α的细胞坏死型激动剂多肽”的片段、衍生物和类似物也包括在本发明范围内。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的“TNF-α的细胞凋亡型激动剂多肽”和“TNF-α的细胞坏死型激动剂多肽”相同的生物学功能或活性(诱导凋亡或坏死)的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(i i)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(i ii)该多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中,还包括具有与上述“TNF-α的细胞凋亡型激动剂多肽”和“TNF-α的细胞坏死型激动剂多肽”相同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-3个,较佳地1-2个,更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为5个以内,较佳地为3个以内,更佳地为2个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变多肽的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
本发明多肽的变异形式包括同源序列和保守性变异体等。
本发明还提供多肽的类似物。这些类似物与“TNF-α的细胞凋亡型激动剂多肽”和“TNF-α的细胞坏死型激动剂多肽”的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到,如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变,还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中,“保守性变异多肽”指与相应的“TNF-α的细胞凋亡型激动剂多肽”和“TNF-α的细胞坏死型激动剂多肽”的氨基酸序列相比,有至多5个,较佳地至多3个,更佳地至多2个,最佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu | Glu |
Cys(C) | Ser | Ser |
Gln(Q) | Asn | Asn |
Glu(E) | Asp | Asp |
Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
目前,已经可以完全通过化学合成来得到本发明的多肽。
本发明多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于):直接做为药物诱导细胞的凋亡或坏死,因此可用于治疗或辅助治疗疾病,其中包括(但并不限于):肿瘤、感染性疾病(包括病毒感染(如HIV感染)、细菌感染等)。此外,还可用于抑制TNF-α诱导的细胞毒性或封闭TNF-α引起的炎症反应。
抗体
本发明还包括对本发明多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体。这里,“特异性”是指抗体能结合于本发明多肽。较佳地,指那些能与本发明多肽结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的本发明多肽结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab’或(Fab)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子;或嵌合抗体,如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
药物组合物和施用方式
本发明多肽及其抗体,当在治疗上进行施用(给药)时,可提供不同的效果。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明多肽可直接用于疾病治疗,例如,用于肿瘤或感染性疾病方面的治疗。在使用本发明多肽时,还可同时使用其他治疗剂或与其他疗法联用,如与抗体疗法联合应用(包括靶向疗法)、与化疗联合应用、与多聚体联合应用等。
本发明还提供了一种药物组合物,它含有安全有效量的本发明多肽(或其抗体)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时,是将安全有效量的本发明多肽(包括凋亡激动剂或坏死激动剂)施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括:
(a)提供了具有明确的引起细胞凋亡和/或坏死的功能的变性TNF-α及其衍生多肽。
(b)确认了TNF-α序列中引起凋亡的区域及坏死区域,这为设计低副作用的肿瘤治疗方案提供多种不同的选择。比如通过凋亡(区域)治疗肿瘤可以避免由坏死所引起的过度炎症(如细胞因子风暴,休克等);另一方面,通过坏死(区域)治疗肿瘤可以调动机体免疫功能(如释放细胞因子等等)进一步帮助肿瘤治疗。
(c)确认TNF-α序列中引起凋亡的区域及坏死区域,也为设计低副作用的自身免疫病治疗方案提供帮助。目前治疗自身免疫病的有效方法之一是阻断TNF-α,但这也阻断了TNF-α抗感染能力,常见的是引起结核病。如果只阻断TNF-α引起炎症的区域(阻断引起坏死区域),则既阻断自身免疫,又不引起结核。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数为重量百分比和重量份数。
实施例1
TNF-α的衍生多肽
在本实施例中,设计和合成了一系列20个氨基酸(aa)长度的合成重叠多肽,即P1-P22。这些多肽覆盖了膜型TNF-α的全部序列(aa1-233)(SEQ ID NO.:1)。每一段多肽序列与前一段多肽重叠10aa。最后一段多肽全长为23aa。其中,P1至P6分别对应于SEQ ID NO.:1中的第1-10、11-20、21-30、31-40、41-50和51-60位。
由于TNF-α可溶型(或成熟型)(aa77-233)具有激活NF-kB引起凋亡与死亡的功能(Idriss and Naismith,2000;Thoma et al.,1990),因此在本实施例中重点研究多肽P7-P22,这一段多肽覆盖了可溶型TNF-α的全长序列(表1)。
采用全人工合成法,合成表1所示的各TNF-α衍生多肽。
表1.多肽序列
*凋亡百分比和坏死百分比基于实施例4。
实施例2
TNF-α对细胞的影响
在本实施例中,测试完整TNF-α对细胞的影响。方法如下:
将常规的人体外周血单个核细胞(PBMC)、Jurkat A3细胞、MT2细胞和老鼠纤维肉瘤细胞L929分別与TNF-α共培养过夜。细胞经固定后用Live/Dead Cell Staining Kit和anti-(active)caspase-3抗体进行染色。方法根据试剂盒说明书)。经染色后的细胞用流式细胞仪进行分析。
结果如图1a所示,图中上象限为凋亡细胞(有时左上象限为早期凋亡细胞–因为细胞膜依然完整没有缺损;而右上象限为晚期凋亡细胞–因为细胞膜具有某种程度的破坏,所以能被Live/dead cell染料检测到)。然而,坏死的细胞由于不表达caspase-3,且细胞膜受到严重的破坏,所以出现在图中的右下象限。因此,我们把图中上半象限的细胞定义为凋亡细胞,而右下象限的细胞定义为坏死细胞。
图1a结果显示,完整TNF-α不能杀死正常的细胞如PBMC以及T细胞Jurkat A3和MT2细胞,但是它可以通过引起某种程度的凋亡和坏死杀死老鼠肿瘤细胞L929(L929是一种对TNF-α敏感的细胞,用来作阳性对照)。
实施例3
完整TNF-α刺激细胞
在本实施例中,将Jurkat A3细胞与TNF-α按指定的浓度和时间进行共培养。通过测定NF-κB抑制因子IκBα的表达来检测TNF-α对细胞的刺激作用。NF-κB是一个转录因子,在细胞生长和受到刺激的时候会被激活。IκBa的减少意味着细胞受到刺激后NF-κB被激活。PCNA为上样对照(显示所有样品的上样量相同)(PCNA即增殖细胞核抗原(ProliferatingCell Nuclear Antigen)。
结果如图1b所示,当以TNF-α浓度为1、10或20ng/ml,刺激细胞10,20,30或60分钟后,NF-κB通路可被激活。这表明完整TNF-α刺激细胞。
实施例4
TNF-α衍生多肽对细胞的影响
将人类T细胞Jurkat A3(来自白血病)与表1的各段TNF-α多肽(P7-P22)或者与完整TNF-α共培养过夜。
结果如图1c和1d所示,其中图中数据结果为代表超过20次的重复实验。从图1d可以清楚地看出,每段TNF-α多肽引起细胞凋亡和坏死的百分比(基于图1c)是不同的。
细胞凋亡激动剂包括:P8,P11,P12,P13,P20及P21。
细胞坏死激动剂包括:P14,P15及P16。
实施例5
TNF-α衍生十肽的合成
采用全人工合成法,合成表2所示的各TNF-α衍生多肽。
表2.基于P13-P16的十肽序列(10aa)
*凋亡百分比和坏死百分比基于实施例6。
实施例6
TNF-α衍生十肽对细胞的影响
重复实施例4,不同点在于用表2的十肽替换表1的各肽。
结果如图1e所示,这表明,不同的十肽对细胞(Jurkat A3)有不同的影响,有的可明显引起细胞凋亡,有的可明显引起细胞坏死。
其中,细胞凋亡激动剂包括:P13-2、P13-3、P13-4、P13-5、P13-6、P13-7、P13-8、P13-9及P13-10;P16-6、P16-7、P16-8、P16-9、P16-10及P16-11(图1e)。
细胞坏死激动剂包括:P13-10、P14-1、P14-2、P14-3和P14-4以及P16-5(图1e)
实施例7
TNF-α衍生多肽对PHA激活与不激活PBMC细胞的影响
用表1所示的各衍生多肽与下述两种白细胞培养:(1)从志愿者提供的新鲜血中分离出白细胞(PBMC),用PHA刺激三天,洗去PHA及变酸的培养液;(2)新鲜分离的白细胞不经任何处理。
肽与上述两种白细胞培养过夜后检测细胞凋亡及坏死。
结果如图1f和1g所示。与报道的“激活的白细胞更易凋亡及坏死”不同,本实施例的结果表明,PHA激活的PBMC与不激活的PBMC,在去除变酸的培养液后,没有明显区别。激活的细胞与不激活的细胞相比,没有对衍生多肽更敏感。
注:结果为三位志愿者的平均值。
该结果还表明,多肽在正常白细胞(多克隆)中诱导凋亡与坏死的趋势与T细胞株(白血病、单克隆)类似。特别有效的多肽包括:
(1)细胞凋亡激动剂包括:P12。
(2)细胞坏死激动剂包括:P11,P14,P15及P16
上述实施例1-6结果表明,完整TNF-α未能引起PBMC、Jurkat A3及MT2细胞死亡,但能刺激它们的生长(图1a和1b)。片段化的TNF-α多肽可诱导PBMC以及肿瘤细胞的凋亡及坏死(图1f,1c和1d)。
因此,降解后的TNF-α或TNF-α衍生多肽可用于治疗肿瘤及感染性疾病。另外,凋亡激动剂和坏死激动剂可用于治疗肿瘤及感染性疾病。
实施例8
TNF-α衍生多肽与受体的结合
将指定的多肽(P11至P17)点印渍到硝酸纤维膜上,再先后与可溶性的TNF-α受体1(sTNFR1)和HRP标记的抗-sTNFR1抗体共同反应,最后再把硝酸纤维膜用HRP催化的底物进行显色。
结果如图2所示。多肽P12和P15具有结合可溶性的TNFa受体1(sTNFR1)的能力。
实施例9
TNF-α衍生多肽可抑制炎症反应
将浓度为600uM的各多肽和20ng/ml浓度的TNF-α与L929细胞一起孵育,并进行检测。对照为仅有L929细胞,以及L929细胞+TNF-α。
L929细胞是贴壁细胞。根据这一特性可使用结晶紫染色法检测。细胞越多,孔中颜色就越深。当TNF-α杀伤L929细胞时,贴壁的细胞会从培养板上脱落,从而显示出较浅颜色(如图3a第三行所示)并导致较低OD值(见图3b,OD=0.06)。
结果如图3a和3b所示。多肽P12和P13可抑制TNF-α的杀伤作用(TNF-α诱导的细胞毒性),细胞仍然贴在培养板上,从而可以通过结晶紫染色法显示出来(OD=0.18)。
P12和P13可能的作用机制是:1.竞争结合TNFR1(从而抑制TNF-α与受体结合);2.竞争抑制TNF-α相关的坏死作用。然而,应理解,本发明的保护范围并不受这些机理的限制。
上述结果提示,多肽P12和P13可竞争结合TNF-α受体,故可用于封闭TNF-α相关的炎症反应。
实施例10
抗TNF-α衍生多肽的抗体可抑制TNF-α引起的L929细胞死亡
在本实施例中,抗P12血清是用P12+佐剂免疫小鼠三次后,从小鼠获取的抗血清。对照血清是用佐剂免疫小鼠三次后,从小鼠获取的抗血清。
TNF-α存在或不存在的情况下,L929细胞与anti-P12抗血清或对照血清共培养,然后检测Caspase-3的表达。
结果如图3c所示,空心的波峰代表未经处理L929细胞caspase-3的表达;黑色的波峰代表L929细胞经过TNF-α和抗血清处理后caspase-3的表达。结果显示,抗-TNF-α多肽抗体(Anti-P12抗体)可抑制TNF-α引起的L929细胞死亡。
上述结果提示,抗本发明的细胞凋亡激动剂多肽(例如P8,P11,P12,P13,P20和P21)的抗体,可用于封闭TNF-α引起的炎症反应。
实施例11
对感染性疾病的影响(HIV感染)
(a)HIV感染导致MT2细胞在感染后的第三天和第四天死亡:
MT2细胞(是一种CD4+的T细胞)感染HIV到指定天数后,经细胞固定后,再用Live/Dead cel l staining试剂盒进行染色(细胞膜被破坏)。
结果如图4a和4b所示。HIV感染导致MT2细胞在感染后的第三天和第四天死亡。。
(b)细胞坏死是HIV感染引起细胞死亡的原因:
对HIV感染(4天)和不感染的MT2细胞进行凋亡和坏死情况分析(二重复)。
结果如图4c所示,HIV感染导致的大部分细胞死亡是因细胞坏死引起(82.8%和83%vs 21.3%和18.3%)。
(c)细胞凋亡激动剂P13和细胞坏死激动剂P16对HIV感染的MT2细胞具有不同的影响:
HIV感染四天或不感染,用多肽(P13和P16)处理或不处理的MT2细胞经固定后染色,anti-caspase-3抗体用于检测细胞凋亡,Live/Dead Cell Staining试剂盒用于检测细胞坏死。
结果如图4c,4d,4e和4f所示,其中图4e和4f用柱形图总结了图4c和4d的结果。
结论如下:
①.P13可诱导细胞凋亡(图4d和4f);
②.P16可诱导细胞坏死(图4d和4e);
③.P13可抑制HIV感染引起的细胞坏死:随着P13浓度的增加,HIV引起的细胞坏死逐渐减少(图4d和4e);
④.P16不可抑制HIV感染引起的细胞坏死(图4d和4f)。
(d)感染HIV的第四天,活的MT2细胞内P24(HIV感染的标志)的表达:
感染HIV特定时间后的MT2细胞,经P13和P16处理后进行细胞固定和胞内P24(HIV蛋白)染色。
结果表明,随着P13浓度的增加,HIV感染逐渐减少(图4g和4h)。
(e)感染HIV的MT2细胞,上清液中P24的含量检测:
用ELISA实验检测感染HIV的MT2细胞经多肽处理或未处理后上清液中HIV(P24抗原)的含量。
结果如图4i所示。引起细胞凋亡的激动剂多肽P12和P13可以使上清液中的病毒含量减少,呈剂量依赖关系;而引起细胞坏死的激动剂多肽P16和对照多肽P10则不能减少上清液中的病毒含量。
上述结果提示:
TNF-α的细胞凋亡激动剂(包括P13及P12)可诱导T细胞(MT2)凋亡。例如,P13可抑制HIV引起的细胞坏死同时把病毒限制在细胞内。
细胞坏死激动剂(包括P16)可诱导HIV感染的T细胞(MT2)坏死,并促使病毒从细胞内释放到细胞外。
TNF-α的细胞凋亡激动剂(包括P13,P8,P11,P12,P20,P21)可用于治疗病毒和细菌感染性疾病。它们具有将病毒限制在细胞内而不散播到细胞外的特性。
TNF-α的细胞坏死激动剂(包括P16,P14,P15)可用于治疗病毒和细菌感染性疾病。然而,细胞坏死导致病原体释放,因此最好能结合使用抗体或其它能中和或杀死细胞外病原体的药。
实施例12
杀伤肿瘤细胞
在本实施例中,测试多种TNF-α衍生多肽对肿瘤细胞的杀伤作用
(a)杀死白血病T细胞株–Jurkat细胞
方法见实施例4。结果如图1a所示。结果表明,
(i)可诱导细胞凋亡的多肽包括:P8,P11,P12,P13,P20和P21;
(ii)可诱导细胞坏死的多肽包括:P14,P15和P16。
这表明,所有引起细胞凋亡和坏死的多肽都能杀死肿瘤细胞。
(b)P16对多种肿瘤细胞的杀伤作用:
将肿瘤细胞(神经胶质瘤和乳腺癌)与TNF-α或不同浓度的引起细胞坏死的激动剂多肽P16共培养。
结果如图5所示。P16可诱导51%神经胶质瘤细胞死亡,同样地,也可以诱导高达50%的乳腺癌细胞死亡。
实施例13
使用肽P12和P16对老鼠体重的影响
TNF-α被认为会引起恶病质。令人意外是,当用TNF-α激动剂多肽P12和P16免疫老鼠时,可增加这些老鼠的体重。
试验方法:三组(每组n=4)老鼠分别用多肽P16、P12和佐剂免疫三次(间隔时间为三周)。第一组只用佐剂免疫第二组为P16加佐剂,第三组为P12加佐剂,。在最后一次免疫三周后称老鼠体重。
结果如图6所示。与佐剂免疫组比较,P16和P12免疫组老鼠体重明显增加。
实施例14
药物组合物
制备一药物组合物,所述组合物包括:
(a)P16多肽(或P12多肽);和
(b)生理盐水。
这些组合物有多种用途。例如,P16制剂可与抗病毒抗体(如抗HIV抗体)合用。P16可引起细胞膜破坏,细胞浆内物质释放。如联合抗病毒抗体则抗体会将释放的病毒中和。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种TNF-α的激动剂多肽,其特征在于,所述的多肽具有以下特征:
(i)该多肽的序列来源于肿瘤坏死因子TNF-α的氨基酸序列;
(ii)该多肽的长度为7-50个氨基酸;
(iii)该多肽具有明显引起细胞坏死的能力;
所述的多肽选自下组:SEQ ID NO.10、11、52;或者所述的多肽选自P15、P16、P16-5或其组合。
2.如权利要求1所述的激动剂多肽,其特征在于,被诱导细胞坏死的细胞包括肿瘤细胞、过度增长的细胞。
3.一种药物组合物,其特征在于,包括药学上可接受的载体和如权利要求1所述的TNF-α的激动剂多肽。
4.权利要求1所述的TNF-α的激动剂多肽的用途,其特征在于,用于制备诱导细胞坏死的药物组合物,所述的多肽为SEQ ID NO.11,所述细胞为白细胞、HIV感染的T细胞和肿瘤细胞,所述肿瘤细胞为来源于白血病、神经胶质瘤、乳腺癌的肿瘤细胞。
5.权利要求1所述的TNF-α的激动剂多肽的用途,其特征在于,用于制备诱导细胞坏死的药物组合物,所述的多肽为SEQ ID NO.10,所述细胞为白细胞和肿瘤细胞,所述肿瘤细胞为来源于白血病的肿瘤细胞。
6.权利要求1所述的TNF-α的激动剂多肽的用途,其特征在于,用于制备诱导细胞坏死的药物组合物,所述的多肽为SEQ ID NO.52,所述细胞为来源于白血病的肿瘤细胞。
7.权利要求4所述的TNF-α的激动剂多肽的用途,其特征在于,用于制备治疗肿瘤或HIV感染的药物组合物,所述的肿瘤为白血病、神经胶质瘤、乳腺癌。
8.权利要求5或6所述的TNF-α的激动剂多肽的用途,其特征在于,用于制备治疗白血病的药物组合物。
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