CN101265288B

CN101265288B - Crm197突变体的纯化方法

Info

Publication number: CN101265288B
Application number: CN2007100133785A
Authority: CN
Inventors: 王克波; 孙丽霞; 董婷; 张薛; 徐同文; 王晶翼
Original assignee: Qilu Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Qilu Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-03-13
Filing date: 2007-03-13
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2027-03-13
Also published as: CN101265288A

Abstract

本发明涉及一种大肠杆菌表达的CRM197突变体的纯化方法，属于医药技术领域。纯化方法步骤包括如下：将包涵体变性、复性后，先利用超滤方法进行浓缩后，在利用阴离子交换层析进行纯化，收集蛋白峰，即可得到高纯度的蛋白样品。本方法具有适合规模化生产、操作简便、生产周期短、产品纯度高、工艺稳定性强等特点。

Description

CRM197突变体的纯化方法

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，具体涉及大肠杆菌表达的CRM197突变体的纯化方法，属于医药技术领域。

背景技术

CRM197(cross—reacting forms of toxin 197)是白喉毒素丧失了毒性的一种突变体，它是由野生型白喉毒素的碱基序列中由一个碱基G突变为A，从而导致了第52位氨基酸GLY突变为GLU。从结构上看，CRM197具有完整的白喉毒素功能结构，但实验表明，NAD结合位点的变化影响了白喉毒素的酶活性及毒性。后来研究证明52位的GLY在白喉毒素NAD结合位点起着重要作用，这就导致白喉毒素酶活性位点——同NAD:EF2 ADP核糖转移酶结合区发生改变，导致CRM197片断A不能与EF2结合，不能对细胞起到毒性作用。

CRM197不具有酶活性以及毒性，但具有白喉毒素的免疫原性，因此CRM197也常被用作一种免疫蛋白载体交联其它半抗原一起作为疫苗。早在1985年美国科学家就利用CRM197的免疫原性，将嗜血流感菌表面的多糖交联到白喉类毒素及CRM197的蛋白载体上制作疫苗防治呼吸道感染，从防治效果上看，两种交联疫苗在效果上没有显著差异，但都能使小孩产生较强的免疫记忆。美国科学家针对小儿在2岁前对于肺炎球菌疫苗(球菌表面多糖，PnPs)不能产生免疫记忆，因此将球菌表面七价多糖交联于多种蛋白载体以便在小儿2岁前能对肺炎球菌产生抗体，经过多种蛋白载体交联后的动物及临床效果比较，发现PnPs—CRM197能产生较好的免疫效果，而且安全无毒副作用。目前该产品也已通过美国FDA批准上市，商品名为Prevnar。意大利科学家Francesco针对流行性脑膜炎也采用了利用其病菌表面多糖交联CRM197制作疫苗，他们从CRM197的结构上分析了交联的可行性，其中CRM197带有39个Lysin氨基酸残基和16个Arg残基，能提供较多的交联用的游离氨基。从实验结果来看，虽然化学交联率较高，但都没有达到理论交联率。

美国专利US6,962,803描述了白喉毒素CRM107采用棒状杆菌表达分泌到培养液中，得到的CRM107毒素收率虽然比较高，可高达培养基总蛋白的70％以上，但是由于培养基中的成分比较复杂，且盐离子强度较高，导致后续的纯化过程比较困难，工艺复杂，成本偏高，目的产物收率低等。

针对现有CRM197的不足，海南天源康泽医药科技有限公司对原有CRM197的基因序列进行了改进，构建了表达CRM197的重组表达质粒并转化至大肠杆菌表达宿主中以包涵体形式表达。参见中国专利CN200610042194.7。

发明内容

对于采用大肠杆菌以包涵体形式表达重组CRM197突变体，本发明提供一种适宜于规模扩大化生产的快速、简便、高效的CRM197突变体的纯化方法，具有工艺简单、成本低，目的产物收率高以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。

本发明CRM197突变体的纯化方法，包括如下步骤：

(1)采用大肠杆菌以包涵体形式表达重组CRM197突变体，包涵体经过变、复性后得到含有目的蛋白组分的复性液；

(2)复性液通过超滤进行分离和浓缩，并用Tris-HCl缓冲液进行换液，将复性液浓缩5-25倍，得超滤浓缩液；

(3)上述超滤浓缩液通过阴离子交换层析进行纯化层析，截留核酸和大部分杂蛋白质，得到含有目的蛋白CRM197突变体的分级组分；

(4)用平衡缓冲液对阴离子交换层析系统进行平衡，使目的蛋白吸附到阴离子层析柱上，大部分杂质穿出阴离子层析柱；

(5)用添加了NaCl的平衡缓冲溶液对上述步骤(4)处理后的阴离子交换层析柱进行洗脱，使目的蛋白穿出阴离子交换层析柱，收集洗脱蛋白液，即得目的蛋白液。

经过上述步骤的处理，得到的目标蛋白CRM197突变体的纯度高，一次处理量大，且收率大大提高，为大规模生产提供了技术基础。

上述步骤(1)中的变、复性方法可采用蛋白变、复性通用的方法。

上述步骤(2)中所述的复性液通过超滤进行分离和浓缩，可一次性进行超滤浓缩，也可先超滤去除大分子蛋白或杂质，再进行超滤浓缩。

在层析前加上超滤浓缩步骤，除去复性液中的大、小分子蛋白、多肽或其它杂质，以利于后续步骤的操作。

上述步骤(3)中所述的阴离子交换层析，所使用的阴离子交换层析柱的层析介质选自琼脂糖凝胶(Sepharose)类或聚苯乙烯(SOURCE)类，配基选自季铵基(Q)或二乙基氨乙基(DEAE)。所使用的阴离子交换层析介质具体选自下列之一：DEAE-Sepharose FF，Q-Sepharose FF，SOURCE30-Q或Q-Big-Beds，最优选DEAE-Sepharose FF层析介质。

上述步骤(4)和(5)中的平衡缓冲液选用Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，缓冲液的浓度为10mmol/L-1mol/L；缓冲液的pH值为6.0-11.0。

上述步骤(5)中所述的添加了NaCl的平衡缓冲液，其中NaCl浓度为10mmol/L—1mol/L。

上述步骤(5)中的洗脱方式可以采用非梯度洗脱或连续梯度洗脱。

本发明采用大肠杆菌以包涵体形式表达重组CRM197突变体，如CN200610042194.7“白喉毒素突变体CRM197及其制备方法”中提供的包涵体，进行进一步纯化。

本发明的CRM197突变体的纯化方法的技术关键点在于：

在对复性液进行离子交换层析前，先用超滤进行了分离和浓缩，使目的蛋白的含量提高，使后面的纯化过程更简单，节约了成本，提高了收率。

通过本发明的方法制备的CRM197突变体收率高、纯度好，可用于疫苗方面的交联使用；同时采用本发明的方法纯化CRM197突变体，工艺简便、快速，设备投资小，规模放大容易，适合大规模生产。

附图说明

图1是利用SDS-PAGE电泳分析本发明方法纯化后的CRM197突变体纯度图谱。图中的1、2、3分别对应为三次实验的阴离子DEAE层析收集液的SDS-PAGE凝胶电泳图谱。

具体实施方式

以下通过实施例将进一步说明本发明，这些实施例不应作为本发明的限制。

本发明的方法包括顺序使用包涵体的变、复性，复性液的超滤分离，阴离子交换层析来纯化CRM197突变体。CRM197突变体包涵体的制备参见CN200610042194.7“白喉毒素突变体CRM197及其制备方法”实施例1中2.4“采用超声破碎的方法提取包涵体蛋白，经诱导表达后的菌液以5000×g离心10min，然后用缓冲液(50mmol/LTris-HCl、5mmol/L EDTA)重悬，用超声破碎仪按1.25A脉冲破碎10min，然后离心收集沉淀，用缓冲液(50mmol/L Tris—HCl、5mmol/L EDTA)洗包涵体洗8遍，离心收集沉淀得到包涵体。”

以下实施例中使用的超滤器是Millipore公司的Pellicon-2，超滤膜采用盒式膜堆。

实施例1

1、CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性

10g CRM197突变体包涵体加入1000ml变性液中，所用变性液含8mol/L尿素，1mlβ-巯基乙醇，Tris-HCl 50mmol/L，pH8.0，搅拌溶解30min，离心力为15000×g—29000×g离心10min，收集上清，倒入10L Tris-HCl缓冲液中，搅拌混匀后于4-10℃复性24-72小时。

2、复性液的超滤分离和浓缩

先用pH为7.0，浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液对超滤器和大孔径(300KD)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截留浓缩。当复性液浓缩至1L左右时；用1—3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(300kd)超滤膜堆换为小孔径(10kd)超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓缩，浓缩至1L左右时，用2倍体积的上述Tris-HCl缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓缩液。通过超滤浓缩收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到85％以上。

3、阴离子交换层析

用300ml浓度为10mmol/L，pH为7.0的Tris-HCl平衡缓冲液平衡DEAE-Sepharose FF(1.6×15cm)层析柱，将超滤后的浓缩液上柱。

4、平衡、洗脱、过滤

用浓度为10mmol/L，pH为7.0的Tris-HCl平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有0.5mol/L NaCl的pH为7.0、浓度为10mmol/L Tris-HCl缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到8mg/ml以上，纯度达到98％以上。

实施例2

1、CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例1。

2、复性液的超滤分离和浓缩

先用pH为8.0，浓度为30mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液对超滤器和大孔径(300KD)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截留浓缩。当复性缓冲液浓缩至1L左右时；用1—3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(300kd)超滤膜堆换作小孔径(10kd)超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓缩，浓缩至1L左右时，用2倍体积的上述Tris-HCl缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓缩液。通过超滤浓缩收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80％以上。

3、阴离子交换层析

用300ml浓度为100mmol/L，pH为8.0的Tris-HCl平衡缓冲液平衡Q-Sepharose FF(1.6×15cm)层析柱，将超滤后的浓缩液上柱。

4、平衡、洗脱、过滤

用浓度为100mmol/L，pH为8.0的Tris-HCl平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有0.2mol/LNaCl的pH为8.0、浓度为100mmol/L Tris-HCl缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到8mg/ml以上，纯度达到98％以上。

实施例3

1、CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例1。

2、复性液的超滤分离和浓缩

先用pH为9.0，浓度为50mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液对超滤器和和大孔径(500KD)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截留浓缩。当复性缓冲液浓缩至1L左右时；用1—3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(500kd)超滤膜堆换作小孔径(5kd)超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓缩，浓缩至1L左右时，用2倍体积的上述Tris-HCl缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓缩液。通过超滤浓缩收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80％以上。

3、阴离子交换层析

用300ml pH为9.0，浓度为50mmol/L的Tris-HCl平衡缓冲液平衡SOURCE30-Q(1.6×15cm)层析柱，将超滤后的浓缩液上柱。

4、平衡、洗脱、过滤

用浓度为50mmol/L，pH为9.0的Tris-HCl平衡缓冲液冲洗3个柱体积，然后将NaCl的浓度在20min内从0mmol/L升到100mmol/L，继续在100min内将NaCl浓度从100mmol/L升高到1mol/L进行梯度洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白中CRM197突变体的纯度大于98％，浓度达到10mg/ml以上。

实施例4

1、CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例1。

2、复性液的超滤分离和浓缩

先用pH为6.0，浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液对超滤器和小孔径(10kd)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，进行复性液的浓缩。当复性液浓缩至1L左右时；用1—3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。通过超滤浓缩收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80％以上。

3、阴离子交换层析

用300ml浓度为10mmol/L，pH6.0的磷酸盐平衡缓冲液平衡DEAE-Sepharose FF(1.6×15cm)层析柱，将超滤后的浓缩液上柱。

4、平衡、洗脱、过滤

用浓度为10mmol/L，pH6.0的磷酸盐平衡缓冲液冲洗3个柱体积，然后将NaCl的浓度在20min内从0mmol/L升到100mmol/L，继续在100min内将NaCl浓度从100mmol/L升高到1mol/L进行连续梯度洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白中CRM197突变体的纯度大于98％，浓度达到10mg/ml以上。

实施例5

1、CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例1。

2、复性液的超滤分离和浓缩

先用pH为7.0，浓度为50mmol/L磷酸盐缓冲溶液对超滤器和大孔径(500kd)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截留浓缩。当复性缓冲液浓缩至1L左右时；用1—3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(500kd)超滤膜堆换作小孔径(10kd)超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓缩，浓缩至1L左右时，用2倍体积的上述磷酸盐缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓缩液。通过超滤浓缩收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到85％以上。

3、阴离子交换层析

用300ml浓度为50mmol/L，pH为7.0的磷酸盐平衡缓冲液平衡Q-Big-Beds(1.6×15cm)层析柱，将超滤后的浓缩液上柱。

4、平衡、洗脱、过滤

用浓度为50mmol/L，pH为7.0的磷酸盐平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有20mmol/LNaCl的pH为7.0、浓度为50mmol/L磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到8mg/ml以上，纯度达到98％以上。

实施例6

1、CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例1。

2、复性液的超滤分离和浓缩

先用pH为8.0，浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液对超滤器和和大孔径(500KD)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截留浓缩。当复性缓冲液浓缩至1L左右时；用1—3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(500kd)超滤膜堆换作小孔径(5kd)超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓缩，浓缩至1L左右时，用2倍体积的上述磷酸盐缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓缩液。通过超滤浓缩收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80％以上。

3、阴离子交换层析

用300ml浓度为100mmol/L，pH为8.0的磷酸盐平衡缓冲液平衡Q-Sepharose FF(1.6×15cm)层析柱，将超滤后的浓缩液上柱。

4、平衡、洗脱、过滤

用浓度为100mmol/L，pH为8.0的磷酸盐平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有0.3mol/LNaCl的pH为8.0、浓度为100mmol/L磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到8mg/ml以上，纯度达到98％以上。

实施例7

1、CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例1。

2、复性液的超滤分离和浓缩

先用pH为10.0，浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液对超滤器和大孔径(300kd)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截留浓缩。当复性缓冲液浓缩至1L左右时；用1—3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(300kd)超滤膜堆换作小孔径(10kd)超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓缩，浓缩至1L左右时，用2倍体积的上述磷酸盐缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓缩液。通过超滤浓缩收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80％以上。

3、阴离子交换层析

用300ml浓度为100mmol/L，pH为10.0的磷酸盐平衡缓冲液平衡DEAE-Sepharose FF(1.6×15cm)层析柱，将超滤后的浓缩液上柱。

4、平衡、洗脱、过滤

用浓度为100mmol/L，pH为10.0的磷酸盐平衡缓冲液冲洗3个柱体积，然后将NaCl的浓度在20min内从0mmol/L升到100mmol/L，继续在100min内将NaCl浓度从100mmol/L升高到1mol/L进行梯度洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到9mg/ml以上，纯度达到98％以上。

实施例8

1、CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例1。

2、复性液的超滤分离和浓缩

先用pH为11.0，浓度为200mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液对超滤器和大孔径(500kd)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截留浓缩。当复性缓冲液浓缩至1L左右时；用1—3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(500kd)超滤膜堆换作小孔径(10kd)超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓缩，浓缩至1L左右时，用2倍体积的上述Tris-HCL缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓缩液。通过超滤浓缩收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80％以上。

3、阴离子交换层析

用300ml浓度为200mmol/L，pH为11.0的Tris-HCL平衡缓冲液平衡Q-Sepharose FF(1.6×15cm)层析柱，将超滤后的浓缩液上柱。

4、平衡、洗脱、过滤

用浓度为200mmol/L，pH为11.0的Tris-HCL平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有10mmol/L NaCl的pH为11.0、浓度为200mmol/LTris-HCL缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到10mg/ml以上，纯度达到98％以上。

实施例9

1、CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例1。

2、复性液的超滤分离和浓缩

先用pH为8.0，浓度为500mmol/L的磷酸盐缓冲溶液对超滤器和大孔径(300kd)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截留浓缩。当复性缓冲液浓缩至1L左右时；用1—3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(300kd)超滤膜堆换作小孔径(10kd)超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓缩，浓缩至1L左右时，用2倍体积的上述磷酸盐缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓缩液。通过超滤浓缩收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80％以上。

3、阴离子交换层析

用300ml浓度为500mmol/L，pH为8.0的磷酸盐平衡缓冲液平衡S0URCE30-Q(1.6×15cm)层析柱，将超滤后的浓缩液上柱。

4、平衡、洗脱、过滤

用浓度为500mmol/L，pH为8.0的磷酸盐平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有0.8mol/LNaCl的pH为8.0、浓度为500mmol/L磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到8mg/ml以上，纯度达到98％以上。

实施例10

1、CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例1。

2、复性液的超滤分离和浓缩

先用pH为8.0，浓度为1000mmol/L的Tris-HCL缓冲溶液对超滤器和小孔径(10kd)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，进行复性液的浓缩。当复性液浓缩至1L左右时；用1—3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同的体积；如此稀释2次，收集浓缩液。通过超滤浓缩收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80％以上。

3、阴离子交换层析

用300ml浓度为1000mmol/L，pH为8.0的Tris-HCL平衡缓冲液平衡DEAE-Sepharose FF(1.6×15cm)层析柱，将超滤后的浓缩液上柱。

4、平衡、洗脱、过滤

用浓度为1000mmol/L，pH为8.0的Tris-HCL平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有1mol/L NaCl的pH为8.0、浓度为1000mmol/L Tris-HCL缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到10mg/ml以上，纯度达到98％以上。

Claims

1.一种CRM197突变体的纯化方法，所述CRM197突变体结构是：

Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser

1 5 10 15 20

Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys

21 25 30 35 40

Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys

41 45 50 55 60

Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly

61 65 70 75 80

Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala

81 85 90 95 100

Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly

101 105 110 115 120

Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro

121 125 130 135 140

Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu

141 145 150 155 160

Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr

16l 165 170 175 180

Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu

181 185 190 195 200

Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser

201 205 210 215 220

Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser

221 225 230 235 240

Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu

241 245 250 255 260

Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala

261 265 270 275 280

Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys

281 285 290 295 300

Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly

30l 305 310 315 320

Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met

321 325 330 335 340

Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn

341 345 350 355 360

Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala

361 365 370 375 380

Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn

381 385 390 395 400

Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys

401 405 410 415 420

Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly

421 425 430 435 440

Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met

441 445 450 455 460

Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val

461 465 470 475 480

Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile

481 485 490 495 500

His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp

501 505 510 515 520

His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

521 525 530 535 ；

包括如下步骤：

CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性步骤如下：

10g CRM197突变体包涵体加入1000ml变性液中，所用变性液含8mol/L尿素，1mlβ-巯基乙醇，Tris-HCl 50mmol/L，pH8.0，搅拌溶解30min，离心力为15000×g-29000×g离心10min，收集上清，倒入10L Tris-HCl缓冲液中，搅拌混匀后于4-10℃复性24-72小时；

(3)上述超滤浓缩液通过阴离子交换层析进行纯化层析，截留核酸和大部分杂蛋白质，得到含有目的蛋白CRM197突变体的分级组分；所使用的阴离子交换层析柱的层析介质选自琼脂糖凝胶类或聚苯乙烯类，配基选自季铵基或二乙基氨乙基；

(4)用平衡缓冲液对阴离子交换层析系统进行平衡，使目的蛋白吸附到阴离子层析柱上，大部分杂质穿出阴离子层析柱；所述平衡缓冲液选用Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，缓冲液的浓度为10mmol/L-1mol/L；缓冲液的pH值为6.0-11.0；

(5)用添加了NaCl的平衡缓冲溶液对上述步骤(4)处理后的阴离子交换层析柱进行洗脱，使目的蛋白穿出阴离子交换层析柱，收集洗脱蛋白液，即得目的蛋白液；

所述的添加了NaCl的平衡缓冲液，其中NaCl浓度为10mmol/L-1mol/L，平衡缓冲液选用Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，缓冲液的浓度为10mmol/L-1mol/L；缓冲液的pH值为6.0-11.0。

2.如权利要求1所述的CRM197突变体的纯化方法，其特征在于步骤(2)中所述的复性液通过超滤进行分离和浓缩，是一次性进行超滤浓缩。

3.如权利要求1所述的CRM197突变体的纯化方法，其特征在于步骤(2)中所述的复性液通过超滤进行分离和浓缩，是先超滤去除大分子蛋白或杂质，再进行超滤浓缩。

4.如权利要求1所述的CRM197突变体的纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中所述的阴离子交换层析，所使用的阴离子交换层析介质选自下列之一：DEAE-Sepharose FF，Q-Sepharose FF，SOURCE30-Q或Q-Big-Beds。

5.如权利要求1所述的CRM197突变体的纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中所述的阴离子交换层析，所使用的阴离子交换层析介质DEAE-Sepharose FF层析介质。

6.如权利要求1所述的CRM197突变体的纯化方法，其特征在于所述步骤(5)中的洗脱方式采用非梯度洗脱或连续梯度洗脱。