CN103301163B

CN103301163B - 大肠杆菌混合溶组织内阿米巴在制备治疗肝癌实体瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN103301163B
Application number: CN201310245877.2A
Authority: CN
Inventors: 徐庆; 程训佳; 何松青; 梁荣感; 韦京辰; 张均智; 莫刚; 杨成芳
Original assignee: Guilin Medical University
Current assignee: Guilin Medical University
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2013-06-20
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2033-06-20
Also published as: CN102697816A; CN103301163A

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌混合溶组织内阿米巴在制备治疗肝癌实体瘤药物中的应用，它是将终浓度为1×10⁶个/ml大肠杆菌与终浓度为1.0×10⁵/ml阿米巴滋养体混合，制成大肠杆菌+阿米巴滋养体细胞悬液制剂药物，定向注射接种到肝癌实体瘤中，用于治疗肝癌实体瘤。该方法治疗费用低，治疗效果好，不良反应轻，是一种安全、可靠、经济简便、易于推广的生物制剂，是肝癌治疗方法的新突破。

Description

大肠杆菌混合溶组织内阿米巴在制备治疗肝癌实体瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及治疗肝恶性实体瘤的生物治疗，特别是大肠杆菌混合溶组织内阿米巴在制备治疗肝癌实体瘤药物中的应用。

背景技术

肝癌素有癌中之王的称号,20世纪90年代原发性肝癌已上升为恶性肿瘤的第2位，全球每年约有31万患者，中国每年有13万人死于肝癌，占全球肝癌死亡总数的42%。

目前，原发性肝癌的治疗仍采用以手术为主的综合治疗，包括化疗、物理疗法（放射、超声、热疗、低温技术）、生物治疗、中医中药治疗等。现代分子生物学技术和基因工程技术的迅速发展和生物反应调节剂(biological response modifier，BRM)理论的提出为生物治疗开辟了全新的领域。生物治疗已成为继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的第四种模式，并显示出了良好的应用前景。目前，生物治疗主要包括：免疫治疗、基因治疗、抗血管生成治疗、内分泌治疗等。但是,上述治疗方法仍存在毒副作用大、条件要求高、疗效不满意等问题：如外科切除虽然是目前最有效的治疗手段，但其5年生存率经过几十年努力也未能继续前进一步，仍停滞在7%。肝移植作为一种肝癌根治方法，既不用考虑剩余肝组织的代偿能力而完整切除肿瘤，又能避免残余病肝组织的恶变可能，是目前最彻底、最有效的治疗手段，由于移植适应证的扩大将使大量的肝癌患者纳入移植队列，势必对器官资源的分配产生重要影响。由于肝源的缺乏，等待时间的延长导致候选患者退出率达20％。

溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）可寄生人类大肠，滋养体侵犯宿主肠粘膜可以引起阿米巴性结肠炎和肠外脓肿。溶组织内阿米巴最重要的特性是以接触依赖的方式杀伤宿主细胞，其中半乳糖/乙酰氨基半乳糖可抑制性凝集素（Gal/GalNAc）具有附着宿主细胞的作用,与虫体的吸附和细胞毒性有关。阿米巴穿孔素（amoeba pores）则是一组存在于滋养体胞质颗粒中的小分子蛋白。滋养体与靶细胞接触或侵入组织时可注入这些微孔形成蛋白，在靶细胞，例如肠壁细胞、肝细胞、免疫细胞，脂膜中形成离子通道，使细胞内钙离子浓度上升20倍之多，以致出现细胞毒性作用，使细胞在5分钟至15分钟内死亡。借助溶组织内阿米巴凝集素附着于宿主细胞，继而穿孔素使细胞出现毒性和细胞溶解作用，而另一主要蛋白半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteinase，CP）可以降解细胞外基质蛋白和溶解宿主细胞，参与溶组织内阿米巴侵袭和破坏组织。由于CP的存在，阿米巴显示很强的蛋白水解酶活性，其属于木瓜蛋白酶大家族。。实验证实:溶组织内阿米巴不仅能杀伤正常组织细胞,而且也能吞噬、杀灭肿瘤细胞。我们以KB细胞为靶细胞,采取混合培养方法,在显微镜下动态观察了不同时间段溶组织内阿米巴对KB细胞的吞噬杀灭过程,1×10⁴虫体/ml在18小时内可将浓度为1×10⁶/ml KB细胞全部杀灭。在我们前期工作中证实：溶组织内阿米巴SAW755CR（强毒株）与Caco-2cell(人结肠癌细胞);Hela cell(人宫颈癌细胞);HepG-2cell（人肝癌细胞）共同孵育2小时，肿瘤细胞可被杀灭约50%。

在体内，滋养体可藉其溶解破坏之能力，随血流进入门静脉系统，首先至肝脏，因肝小叶微静脉有过滤作用而停留在微静脉末端。如果侵入肝脏的原虫数量不多，且人体抵抗力强，可将原虫消灭而不造成损害。若机体抵抗力下降，或肝脏内环境发生改变，侵入肝脏的阿米巴滋养体可引起微静脉及其周围组织的炎性反应，滋养体迅速繁殖，形成微静脉栓塞，导致该处肝组织缺氧、缺血，滋养体从被破坏的血管内逸出，引起肝组织的灶性坏死、液化而成为微小脓肿，相邻之脓肿互相融合，最后形成临床上的大脓肿(amoebic liver abscess)。发明内容

本发明的目的是要提供大肠杆菌配合溶组织内阿米巴在制备治疗肝癌实体瘤药物中的应用。具体地说是将大肠杆菌与溶组织内阿米巴滋养体按比例混合制成治疗肝癌恶性实体瘤的细胞悬液制剂药物。

实现本发明目的的技术方案是：

大肠杆菌混合溶组织内阿米巴制剂的用途，它是将终浓度为1×10⁶个/ml大肠杆菌与终浓度为1.0×10⁵/ml的溶组织内阿米巴滋养体混合制成大肠杆菌+阿米巴滋养体细胞悬液制剂药物，用于治疗肝癌实体瘤。其方法是，行麻醉后，常规消毒，手术开腹，暴露肝脏肿瘤组织，根据肿块大小，用1ml灭菌注射器将终浓度为1.0×10⁵/ml溶组织内阿米巴滋养体与终浓度为1×10⁶个/ml的大肠杆菌混悬液0.1-0.5ml直接接种于肝恶性实体瘤内。如肿瘤位置处于肝脏较表浅位置，亦可不做手术，在B超指引下，经皮穿刺接种，每一肝癌患者接种1次，根据脓肿形成进程，分别于接种后第7天、第10天、第14天、第20天等，做肝脏B超检查，当发现，肿块完全转化为脓肿时即开始进行抗菌与抗阿米巴治疗（引流、抗阿米巴、抗菌药物使用等）。

所述的大肠杆菌+阿米巴滋养体细胞悬液制剂通过以下方法制得：

（1）大肠杆菌培养：按常规方法培养大肠杆菌；

（2）溶组织内阿米巴培养：采用Robinson’s培养基按有菌培养方法培养，每隔2-3天转种一次；取培养72小时生长至对数生长期的阿米巴培养管，冰浴5min，混匀，收集培养物；用200目筛网过滤，收集滤液，1500rpm离心5min，弃上清；取沉淀物上层，用NS清洗，1500rpm离心5min，洗涤两次；取沉淀物用NS重悬，计数板计数，调整虫数为1×10⁵/ml，用0.1%台盼蓝染色显微镜下计数鉴定其活度，保证阿米巴活虫数达95%以上用于实验；

（3）将阿米巴悬液1ml加入1×10⁶个/ml的大肠杆菌液1ml，1500rpm离心5min，去掉1ml 上清液，混匀，即制得混合液里阿米巴终浓度为1.0×10⁵/ml，大肠杆菌终浓度为1×10⁶个/ml的大肠杆菌溶组织阿米巴滋养体悬液。

动物实验证明，将无菌培养的溶组织内阿米巴滋养体1×10⁵直接接种在动物（裸鼠BALB/C）肝癌模型肿块中14天后，并不能将肝癌转化为肝脓疡（见图2），将大肠杆菌1×10⁶直接接种在动物（裸鼠BALB/C）肝癌模型肿块中14天后，10只裸鼠肝癌肿块有3只肝癌肿块转化形成了肝脓疡，转化率为30%，而将有菌培养的溶组织内阿米巴滋养体1×10⁵+大肠杆菌1×10⁶同时接种于肝癌组织中14天，10只裸鼠肝癌肿块有9只转化形成了肝脓疡，转化率为90%，（结果见表4、图3）；镜下，在脓液涂片中观查到活动的阿米巴大滋养体。这一研究结果启示我们，在使肝癌衍化成肝脓肿的过程，溶组织内阿米巴与大肠杆菌相互之间存在重要的协同及互补效应。

大肠杆菌为兼性厌氧型细菌，在有氧和无氧环境中均可生存。实验证明，大肠杆菌能在肿瘤组织中优先复制增殖，与肿瘤组织竞争微环境中的营养素和生长因子；其抗肿瘤作用还可能与下列因素有关：①细菌所含的脂多糖(LPS)能刺激自细胞增殖分化，诱发TNF—a等细胞因子的释放，从而加强机体的免疫应答能力。②细菌大量聚集于肿瘤部位，引起局部炎症反应，浓集大量特异性与非特异性免疫效应细胞。③细菌毒性产物破坏肿瘤微环境。④细菌分泌的蛋白水解酶等破坏了肿瘤细胞。⑤感染诱导了与肿瘤抗原有关的交叉免疫以及机体的抗肿瘤免疫反应。选用非致病性的大肠杆菌，提取、纯化其染色体DNA，进行抗肿瘤的实验研究。动物体内抑瘤实验证明，通过多种途径(SC、IL、IP)，E．coli DNA均具有效的抗肿瘤作用，coli DNA的抑瘤作用主要由机体本身介导。大肠杆菌的DNA能激活机体NK／MΦ细胞活性，诱生IFN一7及调节TNF—α水平，有利于肿瘤细胞表面MHC分子的表达，且形成NK—IFN相互作用的正反馈环路，增强协同抗瘤能力。

大肠杆菌溶组织阿米巴滋养体悬液可用于治疗肝癌实体瘤，能使小鼠的肝癌的实体瘤发生肝脓肿，将难治性、不可治性的疾病转化为易治性、可治性的疾病的模式，即应用一种和平演变的方式将恶性实体瘤转化为微生物感染性脓肿的模式，我们可称之为“疾病转化医学”，其中，贯彻了“变大害为小害，变小害为无害”的哲学思想。这一方法避免了传统外科手术、药物、放疗给癌症病人带来极大损害且易复发，现有生物治疗方法疗效不确定的问题，将有可能明显提高肝恶性实体瘤的治愈率。

该方法治疗费用低，治疗效果好，不良反应相对较轻，是一种安全、可靠、经济简便、易于推广的生物制剂，是肝癌治疗方法的新突破。

附图说明

图1为动物（裸鼠BALB/C）肝癌模型肿块中14天后，大体观察示意图；

图2为纯培养的溶组织内阿米巴滋养体1×10⁵直接接种在动物（裸鼠BALB/C）肝癌模型肿块中14天后，大体观察示意图，图中鱼肉样组织为肝癌组织，占据了肝左叶，肝右叶也有转移。

图3为注射了大肠杆菌+溶组织内阿米巴的动物（裸鼠BALB/C）肝癌模型肝脏肿瘤转化为脓液的大体观察示意图；

图4为注射了大肠杆菌+溶组织内阿米巴的动物（裸鼠BALB/C）肝癌模型肝脏肿瘤转化为脓液后，脓液涂片中的溶组织内阿米巴大滋养体镜下观察示意图（400×）。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1：

(1)大肠杆菌培养：按常规方法培养大肠杆菌;

(2)溶组织内阿米巴培养：

采用Robinson’s培养基按有菌培养方法培养，每隔2-3天转种一次。取培养72小时生长至对数生长期的阿米巴培养管，冰浴5min，混匀，收集培养物，用200目筛网过滤，收集滤液，1500rpm离心5min，弃上清，取沉淀物上层，用NS清洗，1500rpm离心5min，洗涤两次，取沉淀物用NS重悬，计数板计数，调整虫数为1×10⁵/ml。用0.1%台盼蓝染色显微镜下计数鉴定其活度，保证阿米巴活虫数达95%以上用于实验。

(3)大肠杆菌溶组织内阿米巴滋养体悬液的制备:

将以上阿米巴悬液1ml加入1×10⁶个/ml的大肠杆菌液1ml，1500rpm离心5min，去掉1ml上清液，混匀，即混合液里阿米巴终浓度为1.0×10⁵/ml，大肠杆菌终浓度为1×10⁶个/ml。

（4）裸鼠种植性肝癌模型的制备：

将人肝癌细胞株HepG2培养与DMEM培养基（（含10%灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素），取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，计数，离心1000rpm,5min，弃上清，用生理盐水定容至细胞浓度为1.2×107/ml。取0.1ml细胞悬液皮下注射接种于BALB/C裸鼠右侧腋下皮下，15天后成瘤，40天肿瘤生长至直径约1.5cm大小。无菌条件下，分离、取出生长旺盛的鱼肉状瘤组织，置于冰浴的生理盐水中，剪成直径约0.1mm大小的瘤组织备用。

选择体重为18-20g BALB/C裸鼠，适应性喂养3天（自由饮食，昼夜均衡，温度20-25℃，适度50-60%），称重后以戊巴比妥钠100mg/kg腹腔注射麻醉，络合碘消毒腹部皮肤，于剑突下沿腹正中线作一长约0.8cm的切口，用手指轻轻挤压腹腔，暴露肝脏，用用手术刀尖在接种部位作一0.2cm小口，用眼科镊沿与肝脏表面成30°角的倾斜度经小口探入肝脏0.3cm左右，0.2cm(宽)×0.3cm（深），做成隧道。用眼科镊将备好的瘤块沿隧道植入肝脏，消毒棉签轻压切口止血片刻，常规缝合腹部切口，手术全程均为无菌操作。手术完毕将实验动物放回饲养笼饲养。

（5）动物分组与接种：

将荷瘤裸鼠称重后以戊巴比妥钠80mg/kg腹腔注射麻醉后剪开腹腔，暴露肝脏肿块，测量肿瘤大小并记录，按肿瘤大小分组，尽量保证各组肿瘤大小分布一致，分为阿米巴组+大肠杆菌组（10只）和生理盐水组（11只）。用250ul微量注射器，5号针头于肿瘤中心分别瘤内注射阿米巴悬液和等量的无菌生理盐水，0.1ml/只，棉签压迫片刻，常规缝合切口。

（6）大体解剖及脓液检查：

心脏取血后将两组动物处死，解剖剪下肿瘤于肿瘤中心作横、纵切面，观察肿瘤外观及内切面；抽出肿瘤中的脓液，无菌生理盐水悬浮，进行光学显微镜检查。

（7）病理形态学改变观察：

取出肝、脾、胰、心、肺、脑等脏器，肝肿瘤组织肉眼观下于坏死长径部位取材，立即固定于4%中性缓冲甲醛溶液中，梯度乙醇脱水，香柏油透明，石蜡包埋切片，用于HE染色观察。

（8）结果及分析：

采用SPSS17.0统计软件，计量数据以±SD表示。组间比较采用独立样本t检验,计数资料组间比较采用卡方检验，检验水准α=0.05，p<0.05时认为差异具有统计学意义。

病理切片HE染色结果观察分级

①肝肿瘤组织炎性细胞浸润程度分级：-：无炎性细胞浸润；+：少量炎性细胞浸润；++：中等量炎性细胞浸润；+++：大量炎性细胞浸润。

②肝肿瘤组织坏死程度分级：+：点状坏死；++：灶性坏死；+++：大片坏死；++++：严重坏死。

③残存癌组织分级：-：无残存癌细胞；+：残存癌细胞20%-40%；++残存癌细胞40%-60%；+++：残存癌细胞60-80%；++++：残存癌细胞80%-100%。

（9）结果

①肿瘤大体解剖观察

阿米巴干预后第21天将动物解剖后看到肿瘤境界清楚，有包膜，近似圆形或呈卵圆形。切开肿瘤，发现生理盐水组11只裸鼠肿块均未化脓，阿米巴组10只裸鼠中除1只肝脏肿瘤未成脓肿，其余9只肝脏肿块可见不同程度的化脓，脓液呈黄绿色，无臭味，将脓液抽出后，部分肿块只剩一层薄壁（图1）。由表1可知，阿米巴组肝肿块化脓率达90%，生理盐水组比较，用Fisher确切概率法进行检验：p<0.01。

表1溶组织内阿米巴与大肠杆菌混合干预后对裸鼠肝脏肿瘤的影响

注：*P<0.01与生理盐水组比较；阿米巴组代表：阿米巴+大肠杆菌组

②溶组织内阿米巴对种植性肝癌裸鼠癌组织坏死程度的影响

经肝肿块组织切片镜下观察发现，阿米巴组肿块炎症程度明显大于生理盐水组，用Fisher确切概率法进行检验：p<0.01。结果见表2:

表2溶组织内阿米巴对种植性肝癌裸鼠癌组织坏死程度的影响

*P<0.01与生理盐水组比较

③溶组织内阿米巴对肝癌裸鼠残存癌组织的影响

经肝肿块组织切片镜下观察发现，阿米巴组肿块癌组织残留量明显低于生理盐水组，其中4只肝癌动物的癌组织完全消失，用Fisher确切概率法进行检验：p<0.01。结果见表3:

表3溶组织内阿米巴对种植性肝癌裸鼠肝肿瘤残存癌组织的影响

*P<0.01与生理盐水组比较

实施例2：裸鼠移植性肝癌的阿米巴与大肠杆菌联合与单用治疗的效果比较方法：

(1)大肠杆菌、溶组织内阿米巴培养、大肠杆菌溶组织内阿米巴滋养体悬液的制备及肝癌模型制作方法同实施例1中的（1）、（2）、（3）、（4）。

（2）实验方法与结果

取肝脏接种人肝癌HepG2组织成瘤8天的移植性肝癌裸鼠40只，（肿瘤大小0.4-0.5cm³）随机分为生理盐水组；阿米巴+大肠杆菌组，阿米巴组和大肠杆菌组，每组10只，戊巴比妥钠100mg/Kg腹腔注射麻醉，无菌条件下，沿原先切口剪开腹腔，暴露肝脏及其上肿瘤，250ul微量注射器，5号针头直视下肿瘤中心部位瘤内注射各组相应的悬液，0.1ml/只，棉签压迫片刻，常规缝合切口。

（3）结果分析

于接种后第14天戊巴比妥钠100mg/Kg腹腔注射麻醉，无菌条件下进行动物解剖及取样进行结果检测观察。我们发现，生理盐水组转化率为0%，阿米巴+大肠杆菌组转化率为90%与生理盐水组比较有显著性差异（P<0.01）（结果见表4、图3）；镜下，在脓液涂片中观查到活动的阿米巴大滋养体（见图4）。阿米巴组转化率为0%；大肠杆菌组转化率为仅为30%。阿米巴+大肠杆菌组及大肠杆菌组癌组织炎性细胞浸润程度均较严重（见表5），与生理盐水组比较有显著性差异（P<0.01）。而单用阿米巴组较轻，与生理盐水组比较无显著性差异（P﹥0.05）阿米巴+大肠杆菌组及癌组织坏死程度较严重，与生理盐水组比较有显著性差异（P<0.01），其余各组与生理盐水组比较无显著性差异（见表6）。阿米巴+大肠杆菌组及大肠杆菌组肝肿瘤残存癌组织较少与生理盐水组比较有显著性差异（P<0.01）但阿米巴+大肠杆菌组效果更好（见表7）。

表4溶组织内阿米巴与大肠杆菌干预后对裸鼠肝脏肿瘤的影响

#P<0.01与生理盐水组比较

2、各组肝癌组织切片HE染色结果观察

（1）评分标准及统计分析

④统计学处理

表5溶组织内阿米巴与大肠杆菌对肝癌裸鼠癌组织炎性细胞浸润程度的影响

#P<0.01与生理盐水组比较

表6溶组织内阿米巴与大肠杆菌对种植性肝癌裸鼠癌组织坏死程度的影响

#P<0.01与生理盐水组比较

表7溶组织内阿米巴与大肠杆菌对种植性肝癌裸鼠肝肿瘤残存癌组织的影响

#P<0.01与生理盐水组比较。

Claims

1.大肠杆菌混合溶组织内阿米巴在制备治疗肝癌实体瘤药物中的应用，其特征是：它是将终浓度为1×10⁶个/ml大肠杆菌与终浓度为1.0×10⁵个/ml阿米巴滋养体混合，制成大肠杆菌+阿米巴滋养体细胞悬液制剂药物，定向注射接种到肝癌实体瘤中，用于治疗肝癌实体瘤，所述阿米巴培养是采用Robinson’s培养基按有菌培养方法培养，并且保证阿米巴活虫数达95%以上用于实验。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述的大肠杆菌+阿米巴滋养体细胞悬液制剂采用下述方法制得：

（1）大肠杆菌培养：按常规方法培养大肠杆菌；

（2）溶组织内阿米巴培养：采用Robinson’s培养基按有菌培养方法培养，每隔2-3天转种一次；取培养72小时生长至对数生长期的阿米巴培养管，冰浴5min，混匀，收集培养物；用200目筛网过滤，收集滤液，1500rpm离心5min，弃上清；取沉淀物上层，用生理盐水清洗，1500rpm离心5min，洗涤两次；取沉淀物用生理盐水重悬，计数板计数，调整虫数为1×10⁵个/ml，用0.1%台盼蓝染色显微镜下计数鉴定其活度，保证阿米巴活虫数达95%以上用于实验；

（3）将阿米巴悬液1ml加入1×10⁶个/ml的大肠杆菌液1ml，1500rpm离心5min，去掉1ml上清液，混匀，即制得混合液里阿米巴终浓度为1.0×10⁵个/ml，大肠杆菌终浓度为1×10⁶个/ml的大肠杆菌溶组织阿米巴滋养体悬液。