BR112015004854A2 - novo composto com efeitos de trombólise, eliminação de radical livre e direcionamento ao trombo bem como método de preparação e uso do mesmo - Google Patents

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Abstract

resumo “novo composto com efeitos de trombólise, eliminação de radical livre e direcionamento ao trombo bem como método de preparação e uso do mesmo” a presente invenção revela um novo composto com efeitos de trombólise, eliminação de radicais livres e direcionamento ao trombo, bem como um método de preparação e uso do mesmo. o composto é um conjugado ternário formado por con-jugação a um peptídeo trombolítico, um eliminador de radical livre e um peptídeo com direcionamento ao trombo/anti-trombótico unido através de um braço de liga-ção. a presente invenção também revela uma composição farmacêutica contendo os compostos, em que os compostos formam uma estrutura nanoesférica.

Description

“NOVO COMPOSTO COM EFEITOS DE TROMBÓLISE, ELIMINAÇÃO DE RADICAL LIVRE E DIRECIONAMENTO AO TROMBO BEM COMO MÉTODO DE PREPARAÇÃO E USO DO MESMO”
Campo Técnico [001 ]A presente invenção relaciona-se a um novo composto simultaneamente tendo efeitos de trombólise, eliminação de radical livre e direcionamento ao trombo, bem como um método de preparação e uso do mesmo. A presente invenção ainda relaciona-se a um novo conjugado ternário de um peptídeo compreendendo uma sequência PAK/imidazolina/um peptídeo compreendendo uma sequência RGD formado por ligação junto a um oligopeptídeo trombolítico compreendendo uma sequência PAK (Pro-Ala-Lys) 1-(4-oxiacetil-fenil)-3,3,4,4-tetrametilimidazolina e um peptídeo direcionado a trombo/oligopetídeo anti-trombo compreendendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp) através de um braço ligante conteno grupos carboxila e amino. A presente invenção ainda relaciona-se a uma composição farmacêutica compreendendo o composto acima para uso na eliminação de radical livre NO, trombólise, direcionamento ao trombo/terapia anti-trombo, e tratamento de derrame/infarto cerebral. A presente invenção ainda se relaciona a um método para preparação do composto.
Antecedente da Técnica [002]Doenças trombóticas se classificam como a primeira em morbidade e mortalidade global.Trombose de artéria coronária resulta em infarto do miocárdio. Trombose vascular cerebral leva a infarto cerebral, isto é, o derrame isquêmico clínico. Pacientes com infarto do miocárdio podem ser intravenosamente injetados com agentes trombolíticos ou têm cirurgias de bypass. Deve ser notado que o resultado positivo da injeção intravenosa de agentes trombolíticos para pacientes com infarto do miocárdio é isquemia/reperfusão. Desde que uma grande quantidade de radicais livres NO são gerados durante o processo de isquemia/reperfusão, o processo de
2/95 trombólise é associado com dano do miocárdio e morte do paciente. Isto é um sério problema no corrente tratamento de trombólise do infarto do miocárdio. Presentemente, o tratamento do infarto cerebral é confrontado com mesmo mais problem as complicados. Por exemplo, agentes trombolíticos correntes não todos capazes de atravessar a barreira hemato-encefálica, e assim a eficácia da injeção intravenosa dos agentes trombolíticos em pacientes com infarto cerebral é muito limitado. Também, por exemplo, nenhum procedimento cirúrgico que pode salvar pacientes com infarto cerebral é disponível correntemente. Similarmente, mesmo que haja um resultado positivo a partir dos agentes trombolíticos de injeção intravenosa em pacientes com infarto cerebral, uma quantidade tremenda de radicais livres NO pode ainda ser gerada no processo de isquemia/reperfusão tal que o processo de trombólise é associado com dano de tecidos cerebrais e morte do paciente. Isto é um problema sério no tratamento de trombólise corrente de infarto cerebral. Além disso, quatro problemas sérios estão presentes no tratamento clínico para pacientes com derrame: 1) nennhum medicamento outro que tPA (ativador de plasminogênio tipo tecidual) mostra eficácia nos pacientes com derrame; 2) tratamento tPA é somente efetivo dentro de 3 horas a partir do início do derrame, isto é, existe somente uma janela de 3 horas para tratamento tPA; 3) tratamento tPA sempre resulta em sangramento sistêmico; 4) dano de tecido cerebral em pacientes e morte de paciente associada com a quantidade tremenda de radicais livres NO produzida no processo de isquemia/reperfusão não pode ser evitada pelo tratamento tPA. É então imperativo resolver esses quatro problemas a fim de alcançar um avanço substantivo no tratamento clínico de pacientes com derrame.
[003]Dois compostos, Na-(1,3-dioxo-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-2-fenil-4’oxiacetil)-nw-acilgraxo-Lys-Arg-Gly-Asp-Val e Na-(1,3-dioxo-4,4,5,5tetrametilimidazolina-2-fenil-4’-oxiacetil)-nw-acilgraxo-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe, são revelados no Pedido de Patente Chinês CN102807604 e CN102807605. Ambos com
3/95 postos são derivados a partir de uma conjugação de uma imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO com um oligopeptídeo anti-trombo compreendendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp) através de lisina. Ao contrário o composto da presente invenção, esses dois compostos não têm um peptídeo trombolítico ligado ao mesmo. Esses dois compostos não têm uma função na trombólise, e assim não são adequados na fabricação de medicamentos tromboliticos e não adequados no tratamento de pacientes com derrame isquêmico.
[004]Para solucionar os problemas acima, existe uma necessidade para um novo composto simultaneamente ter efeitos de trombólise, eliminação de radical livre e direcionamento de trombo. Além disso, é requerido que tal um novo composto seja capaz de ser efetivo mesmo se administrado após 3 horas a partir do início do derrame nos pacientes, isto é, não restrito por uma janela de 3 horas como no tratamento usando tPA; não causa uma hemorragia sistêmica como no tratamento tPA; e pode limpar a tremenda quantidade de radicais livres NO gerados durante isquemica/reperfusão.
Resumo da Invenção [005]A presente invenção provê um conjugado ternário simultaneamente tendo atividades de atravessar a barreira hemato-encefálica, trombólise, anti-trombo e eli minação de radical livre NO, em que os três no conjugado ternário referem-se a uma imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO, um peptídeo tendo atividade trombolítica, e um peptídeo com direcionamento de trombo, em que os três membros são ligados juntos através de um braço ligante apropriado.
[006]Especificamente, o conjugado ternário da presente invenção pode ser repre sentado pelo composto de fórmula I:
-AA2
NN—AAj \aA3 (D [007] em que, NN representa uma imidazolina tendo atividade de eliminação de
4/95 radical livre NO; AAi representa um braço de ligação tendo pelo menos três grupos para ligação; AA2 representa um peptídeo tendo atividade trombolítica; e AA3 representa um peptídeo com direcionamento ao trombo.
[008]A imidazolina usada na presente invenção pode incluir radicais imidazol nitroxil nitróxido (NN) que podem eliminar NO e funcionar para eliminar radicais livres de oxigênio, provendo forte proteção para células danificadas por radicais livres de oxigênio. A imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO de acordo com a presente invenção é preferivelmente 1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5tetrametilimidazolina, que tem excelente estabilidade química e física, e não é somente adequada para qualquer reação química de conjugação de um peptídeo tendo atividade trombolítica com um peptídeo direcionado ao trombo, mas também não susceptível a decomposição durante o armazenamento, assim satisfazendo os requerimentos para formulações.
[009]O braço de ligação usado na presente invenção pode compreender pelo menos três grupos para ligação, por exemplo, grupos carboxila e amino, que são usados para ligar à imidazolina, o peptídeo tendo atividade trombolítica, e o peptídeo direcionado ao trombo juntos. O braço de ligação de acordo com a presente invenção pode ser aminoácido natural, por exemplo, L-Lys, L-Asp e L-Glu. Quando o braço de ligação (AA-i) usado na presente invenção tem três ou mais grupos para ligação, um ou mais NN, AA2 ou AA3 podem ser ligados ao mesmo, em que dois ou mais NN AA2 ou AA3 podem ser os mesmos ou diferentes. Por exemplo, quando AAi tem quatro grupos para ligação, um NN, dois AA2 e um AA3 podem ser ligados, assim enquanto dos dois AA2 podem ser os mesmos ou diferentes peptídeos tendo a atividade trombolítica.
[010]Q peptídeo tendo atividade trombolítica usado na presente invenção pode ser um oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK (Pro-Ala-Lys), uma sequência AKP (Ala-Lys-Pro) ou uma sequência KAP (Lys-Ala-Pro), ou um peptídeo
5/95 tendo unidades de repetição da sequência PAK, a sequência AKP ou a sequência KAP. Um oligonucleotídeo refere-se a um peptídeo de molécula pequena tendo um peso molecular de 1000 Dalton (D) ou menos, que é geralmente composto de 3 a 8 aminoácidos. O oligopeptídeo tendo atividade trombolítica de acordo com a presente invenção pode ser um tripeptídeo a octopeptídeo que compreende uma sequência PAK, uma sequência AKP, ou uma sequência KAP, preferivelmente um tripeptídeo para pentapeptídeo que compreende uma sequência PAK, uma sequência AKP, ou uma sequência KAP. Por exemplo, o oligopeptídeo usado para a presente invenção que compreende uma sequência PAK, uma sequência AKP, ou uma sequência KAP pode ser PAK, RPAK (Arg-Pro-Ala-Lys), ARPAK (Ala-Arg-Pro-Ala-Lys), GRPAK (GlyArg-Pro-Ala-Lys), QRPAK (Gln-Arg-Pro-Ala-Lys), AKP, KAP, KPAK (Lys-Pro-AlaLys), PAKP (Pro-Ala-Lys-Pro), AKPAK (Ala-Lys-Pro-Ala-Lys) ou PAKPA (Pro-AlaLys-Pro-Ala). Por exemplo, o peptídeo tendo unidades repetidas da sequência PAK, a sequência AKP ou a sequência KAP usado na presente invenção pode ser quaisquer daqueles peptídeos sendo descrito na publicação de patente Chinês CN101190941 como um peptídeo tendo atividade trombolítica, incluindo um peptídeo tendo unidades repetidas da sequência PAK, tais como (PAK)2, (PAK)3, (PAK)4, (PAK)5 e (PAK)6; um peptídeo tendo unidades repetidas da sequência AKP, tais como (AKP)2, (AKP)3, (AKP)4, (AKP)5 e (AKP)6; e um peptídeo tendo unidades repetidas da sequência KPA, tais como (KPA)2, (KPA)3, (KPA)4, (KPA)5 e (KPA)6.
[011]O peptídeo direcionado ao trombo/anti-trombo usado na presente invenção pode ser um oligopeptídeo contendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp). O oligopeptídeo contendo uma sequência RGD pode ser um tetrapeptídeo baseado em RGD, tais como RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser), RGDV (Arg-Gly-Asp-Val) e RGDF (ArgGly-Asp-Phe). Ligação específica de fibrinogênio (Fg) ao receptor de glicoproteína de membrana de plaqueta ativada (GP) llb/llla é uma via de final comum levando a agregação de plaqueta iniciada por vários indutores fisiológicos, e desenvolve um
6/95 papel importante na formação de trombo. Ainda, sequências RGD servem como sítios ativos para a ligação de ligantes Fg e receptores GPIIb/llla ativados e têm uma propriedade de direcionamento de plaqueta ativada. Estruturas compreendendo uma sequência RGD podem competitivamente inibir e bloquear a ligação de Fg e receptores GPIIb/llla, assim prevenindo a agregação de plaquetas e formação de trombo, de forma a permitir um oligopeptídeo contendo RGD se tornar uma molécula com direcionamento ao trombo efetiva e agente anti-trombo.
[012]Ainda, o peptídeo com direcionamento ao trombo usado na presente invenção pode ser quaisquer dos polipeptídeos sendo descritos na publicação de patente Chinesa CN101190940 como um polipeptídeo tendo alvo e atividade anti-trombo, incluindo os polipeptídeos obtidos a partir da modificação da conjugação de um peptídeo RGD com um peptídeo YIGS (Tyr-lle-Gly-Ser). Os polipeptídeos obtidos por modificação incluem YIGSRRGDS, YIGSRRGDV, YIGSRRGDF, YIGSRYIGSK, YIGSRYIGSR, YIGSKRGDS, YIGSKRGDF, YIGSKRGDV, YIGSKYIGSK, YIGSKYIGSR, RGDSRGDS, RGDVRGDV, RGDFRGDF, RGDSYIGSR, RGDSYIGSK, RGDVYIGSR, RGDVYIGSK, RGDFYIGSR, ou RGDFYIGSK.
[013]Em uma modalidade preferida, no composto de acordo com a presente invenção, a imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO é 1,3-dioxo-
2-[(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, o peptídeo tendo atividade trombolítica é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK (Pro-Ala-Lys), e o peptídeo com direcionamento ao trombo é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp). Então, a presente invenção provê um conjugado ternário de um peptídeo compreendendo uma sequência PAK/imidazolina/um peptídeo compreendendo uma sequência RGD simultaneamente tendo atividades em atravessar a barreira hemato-encefálica, trombólise, anti-trombo e eliminação de radical livre NO.
[014]Em uma modalidade, no composto de acordo com a presente invenção, a
7/95 imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO é 1,3-dioxo-2-[(4oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, o braço de ligação é L-Lys, o peptídeo tendo atividade trombolítica é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK (Pro-Ala-Lys), e o peptídeo com direcionamento ao trombo é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp). Neste caso, o oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK pode ser um pentapeptídeo ARPAK, um pentapeptídeo GRPAK, um tetrapeptídeo RPAK, ou um tripeptídeo PAK; o oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp) pode ser um tetrapeptídeo baseado em RGD, tais como RGDS, RGDV ou RGDF. Quando L-Lys é usado como o braço de ligação, o composto de acordo com a presente invenção pode ser da seguinte fórmula geral 1-1 ou I-2:
Figure BR112015004854A2_D0001
Figure BR112015004854A2_D0002
[015]em que, aai e aa2 podem ser ambos presentes ou ambos ausentes, ou aai está presente mas aa2 está ausente; quando ambos de aai e aa2 estão presentes, aa1 é R (Arg), e aa2 é G (Gly), A (Ala) ou Q (Gin); quando aai está presente mas aa2 está ausente, aai é R (Arg); aa3 pode ser S (Ser), V (Vai), ou F (Phe).
[016]Para exemplos relacionados ao composto de fórmula geral 1-1, em um exemplo preferido, o composto de acordo com a presente invenção pode ser um conjugado terciário de ARPAK/imidazolina/RGD representado pela seguinte fórmula
1-1-1; em outro exemplo preferido, o composto de acordo com a presente invenção pode ser um conjugado ternário de GRPAK/imidazolina/RGD representado pela seguinte fórmula 1-1-2; em ainda outro exemplo preferido, o composto de acordo com a presente invenção pode ser um conjugado ternário de RPAK/imidazolina/RGD re-
8/95 presentado pela seguinte fórmula 1-1-3; e e ainda outro exemplo preferido, o composto de acordo com a presente invenção pode ser um conjugado ternário de PAK/imidazolina/RGD representado pela seguinte fórmula 1-1-4;
Figure BR112015004854A2_D0003
Figure BR112015004854A2_D0004
[017] em que aa3 pode ser S (Ser), V (Vai) ou F (Phe), preferivelmente V (Vai).
[018]Para exemplos relacionados ao composto de fórmula geral I-2, o composto de acordo com a presente invenção pode ser preferivelmente da seguinte fórmula geral 1-2-1, I-2-2, I-2-3 ou I-2-4:
Figure BR112015004854A2_D0005
Figure BR112015004854A2_D0006
Figure BR112015004854A2_D0007
Figure BR112015004854A2_D0008
RPAK
Figure BR112015004854A2_D0009
PAK
9/95 [019] em que aa3 pode ser S (Ser), V (Vai) ou F (Phe), preferivelmente V (Vai).
[020]Em outra modalidade, no composto de acordo com a presente invenção, a imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO é 1,3-dioxo-2-[(4oxiacetóxi-fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, o braço de ligação é L-Asp, o peptídeo tendo atividade trombolítica é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK (Pro-Ala-Lys), e o peptídeo com direcionamento ao trombo é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp). Quando L-Asp é usado como o braço de ligação, o composto de acordo com a presente invenção pode ser da seguinte fórmula geral I-3 ou I-4;
Figure BR112015004854A2_D0010
[021 ]em que, aai e aa2 podem ser ambos presentes ou ambos ausentes, ou aa1 está presente mas aa2 está ausente; quando ambos de aai e aa2 estão presentes, aai é R (Arg), e aa2 é G (Gly), A (Ala) ou Q (Gin); quando aai está presente mas aa2 está ausente, aai é R (Arg); aa3 pode ser S (Ser), V (Vai), ou F (Phe). Aai é preferivelmente R (Arg), aa2 é preferivelmente G (Gly), e aa3 é preferivelmente V (Vai).
[022]Para exemplos relacionados ao composto de fórmula geral I-3, o composto de acordo com a presente invenção pode ser preferivelmente da seguinte fórmula geral 1-3-1, I-3-2, I-3-3 ou I-3-4:
10/95
Figure BR112015004854A2_D0011
Figure BR112015004854A2_D0012
[023] em que aa3 pode ser S (Ser), V (Vai) ou F (Phe), preferivelmente V (Vai).
[024]Para exemplos relacionados ao composto de fórmula geral I-4, o composto de acordo com a presente invenção pode ser preferivelmente da seguinte fórmula geral 1-4-1, I-4-2, I-4-3 ou I-4-4:
Figure BR112015004854A2_D0013
Figure BR112015004854A2_D0014
Figure BR112015004854A2_D0015
Figure BR112015004854A2_D0016
[025] em que aa3 pode ser S (Ser), V (Vai) ou F (Phe), preferivelmente V (Vai). [026]Em ainda outra modalidade, no composto de acordo com a presente invenção, a imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO é 1,3-dioxo-2[(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, o braço de ligação é L-Glu, o peptí
11/95 deo tendo atividade trombolítica é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência
PAK (Pro-Ala-Lys), e o peptídeo com direcionamento ao trombo é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp), Quando L-Glu é usado como o braço de ligação, o composto de acordo com a presente invenção pode ser da seguinte fórmula geral I-5 ou I-6:
Q
Figure BR112015004854A2_D0017
Q·
Figure BR112015004854A2_D0018
[027] em que, aai e aa2 podem ser ambos presentes ou ambos ausentes, ou aai está presente mas aa2 está ausente; quando ambos de aai e aa2 estão presentes, aai é R (Arg), e aa2 é G (Gly), A (Ala) ou Q (Gin); quando aai está presente mas aa2 está ausente, aai é R (Arg); aa3 pode ser S (Ser), V (Vai), ou F (Phe). Aai é preferivelmente R (Arg), aa2 é preferivelmente G (Gly), e aa3 é preferivelmente V (Vai).
[028]Para exemplos relacionados ao composto de fórmula geral I-5, o composto de acordo com a presente invenção pode ser preferivelmente da seguinte fórmula geral 1-5-1, I-5-2, I-5-3 ou I-5-4:
12/95
Figure BR112015004854A2_D0019
Figure BR112015004854A2_D0020
[029] em que aa3 pode ser S (Ser), V (Vai) ou F (Phe), preferivelmente V (Vai).
[030]Para exemplos relacionados ao composto de fórmula geral I-6, o composto de acordo com a presente invenção pode ser preferivelmente da seguinte fórmula geral 1-6-1, I-6-2, I-6-3 ou I-6-4:
Figure BR112015004854A2_D0021
Figure BR112015004854A2_D0022
Figure BR112015004854A2_D0023
Figure BR112015004854A2_D0024
[031] em que aa2 pode ser S (Ser), V (Vai) ou F (Phe), preferivelmente V (Vai).
[032]Em outro aspecto, a presente invenção ainda relaciona-se a uma composição farmacêutica compreendendo o composto acima de acordo com a presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, a composição
13/95 farmacêutica de acordo com a presente invenção compreende o composto de fórmula geral acima 1-1, I-2, I-3, I-4, I-5 ou I-6. Mais preferivelmente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção compreende o composto de fórmula geral acima 1-1-1, 1-1-2, 1-1-3 ou 1-1-4. Quando a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção compreende o composto de fórmula geral 1-1-1, 1-1-2, 1-1-3 ou 1-1-4, o composto pode estar na forma de uma estrutura dímera, trímera ou tetrâmera na composição farmacêutica, e pode estar na forma de uma nanoesfera tendo um diâmetro de 2 a 300 nm. Na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, a estrutura nanoesférica pode preferivelmente ter um diâmetro de 2 a 100 nm. É um fato bem conhecido na nanofarmacologia que nanoesferas tendo um diâmetro de menos que 100 nm são propensas a serem engolfadas por macrófagos durante o transporte no sangue e podem facilmente cruzar a parede capilar sanguínea. Essas propriedades permitem o composto de acordo com a presente invenção cruzar a barreira hemato-encefálica. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser usada como uma droga trombolítica no tratamento de doenças tais como infarto do miocárdio, derrame isquêmico, trombose de veia profunda, embolismo pulmonar, doença oclusiva da artéria periférica, dispositivos de acesso vascular central ocluído, fistula e shunt arteriovenoso coagulados, e estenose da carótida. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode também ser usada como uma droga de eliminação de radical livre NO no tratamento de doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doenças de neurônio motor, esclerose lateral amiotrófica, perda de audição induzida por barulho, doença de Lou Gehring ou doença de Huntington; no tratamento de doenças cardiovasculares, tais como ateroesclerose, doença coronária cardíaca ou infarto do miocárcio; no tratamento de doenças mentais, tais como distúrbio bipolar, esquizofrenia ou autismo; e no tratamento de doenças incluindo doença de altitude, diabetes, artrite reumatóide, injúria cerebral traumática, câncer,
14/95 sindrome do X frágil, doença de anemia falciforme, líquen plano, vitiligo, síndrome da fadiga crônica e semelhantes. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ainda ser usada como uma droga direcionada ao trombo/anti-trombo no tratamento das doenças tais como trombocitose, doença mieloproliferativa, polietemia vera ou síndrome de Budd-Chiari. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode também ser usada como uma droga no tratamento de derrame ou infarto cerebral, preferivelmente no tratamento de derrame ou infarto cerebral depois de 3, 4, 6 e 24 horas a partir do início dos sintomas com adminsitrações sucessivas. A composição/composto farmacêutico de acordo com a presente invenção simultaneamente tem funções de eliminação de radical livre NO, trombólise, e anti-trombo/direcionamento ao trombo, e então mostra eficácia mesmo quando sendo administrada após 3 horas do início do derrame nos pacientes; a saber não é restrito pela janela de 3 horas como no tratamento usando tPA, não causa uma resposta de hemorragia sistêmica como tPA, e pode limpar a tremenda quantidade de radicais livres NO gerados durante isquemia/reperfusão, prevenindo dano aos tecidos do nervo cranial em pacientes durante o tratamento. Na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, as estruturas nanoesféricas dos compostos são capazes de maximizar os efeitos de atravessar a barreira hemato-encefálica, trombólise, direcionamento ao trombo/anti-trombo, bem como o efeito de limpar os radicais livres NO durante isquemia/reperfusão.
[033]A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser qualquer formulação clinicamente aceitável, por exemplo, uma formulação injetável (pó para injeção, pó liofilizado para injeção, líquido para injeção, infusão etc), um comprimido, líquido oral, um grânulo, uma cápsula, uma cápsula mole, uma dripping pill e semelhantes, em que os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser um ou mais de xilitol, manitol, lactose, frutose, dextran, glicose, polivinilpirrolidona, dextran de baixo peso molecular, cloreto de sódio, gluconato de cálcio, ou fosfato de
15/95 cálcio. Em adição, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ainda compreender um excipiente que pode ser um agente complexantes antioxidante, um enchimento, um material estrutural e semelhantes.
[034]Em outro aspecto, a presente invenção ainda relaciona-se a um método de preparação do composto acima mencionado de fórmula I, compreendendo os passos de:
[035](1) prover uma imidazolina tendo atividade de eliminação radical livre NO (NN), um braço de ligação tendo pelo menos três grupos para ligação (AA-i), um peptídeo tendo atividade trombolítica (AA2) e um peptídeo direcionado ao trombo (AA3), em que o braço de ligação tem um primeiro grupo para ligação, um segundo grupo para ligação, e um terceiro grupo para ligação;
[036](2) sob condições de reação apropriadas, ligar a imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO (NN) ao primeiro grupo para ligação no braço de ligação (AA-i), para formar um composto de fórmula geral IM-1:
NN-AAi (IM-1);
[037](3) sob condições de reação apropriadas, ligação do peptídeo tendo atividade trombolítica (AA2) ao composto de fórmula geral IM-1, em que uma terminação do peptídeo tendo atividade trombolítica é ligada ao segundo grupo para ligação no braço de ligação, para formar um composto de fórmula geral IM-2:
NN-AA1-AA2 (IM-2); e [038](4) sob condições de reação apropriadas, ligar o peptídeo com direcionamento ao trombo (AA3) ao composto de fórmula geral IM-2, em que uma terminação do peptídeo com direcionamento ao trombo é ligado ao terceiro grupo para ligação no braço de ligação, para formar o composto de fórmula I;
[039]em que passo (3) e (4) são passíveis de mudança em sua ordem.
[040]No método de preparação de acordo com a presente invenção, passo (1) ainda compreende proteção do segundo e terceiro grupos para ligação no braço de
16/95 ligação (AA-ι) com grupos de proteção, e grupos ativos protetores do peptídeo tendo atividade trombolítica (AA2) e do peptídeo com direcionamento ao trombo (AA3), outro que a terminação a ser usada para ligação com grupos protetores; passo (3) ainda compreende desproteção do segundo grupo protegido para primeira ligação, e então ligando ao peptídeo tendo atividade trombolítico ao segundo grupo desprotegido para ligação; passo (4) ainda compreende desproteção do terceiro grupo protegido para primeira ligação, e então ligando ao peptídeo com direcionamento ao trombo para o terceiro grupo desprotegido para ligação; e após passo (4), existe ainda um passo de desproteção dos grupos ativos protegidos do peptídeo tendo atividade trombolítica (AA2), e do peptídeo com direcionamento ao trombo (AA3). Por aplicação de técnicas de adição e remoção dos grupos protetores, a ordem em que NN, AA2 e AA3 são ligadas ao braço de ligação e posição de ligação dos mesmos são controláveis. Grupos protetores nos grupos ativos são então removidos após o término do acoplamento. Condições de reação apropriadas referem-se a condições convencionais empregadas na síntese de peptídeo. A imidazolina tendo atividade de eliminação radical livre de NO (NN), o braço de ligação tendo pelo menos três grupos para ligação (ΑΑ-ι), o peptídeo tendo atividade trombolítica (AA2), e o peptídeo com direcionamento ao trombo (AA3) são os mesmos como definido acima para o composto de fórmula I de acordo com a presente invenção.
[041 ]O método de preparação da presente invenção pode ser ainda entendido a partir da descrição mais detalhada como segue.
[042]Em uma modalidade, o primeiro grupo para ligação no braço de ligação no método de preparação de acordo com a presente invenção é um grupo amino, enquanto o segundo e terceiros grupos para ligação são selecionados a partir do grupo consistindo de um grupo carboxila e um grupo amino.
[043]Em uma modalidade preferida do método de preparação de acordo com a presente invenção, a imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO é
17/95
1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, o braço de ligação é LLys, o peptídeo tendo atividade trombolítica é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK (Pro-Ala-Lys), e o peptídeo com direcionamento ao trombo é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp). Quando o braço de ligação é L-Lys, pode ocorrer as seguintes duas formas para conjugação:
[044](1) 1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina é ligado a um grupo amino no braço de ligação L-Lys, um grupo carboxila no oligopetpídeo compreendendo uma sequência PAK é ligado a outro grupo amino no braço de ligação L-Lys, e um grupo amino no oligopetídeo compreendendo uma sequêcia RGD é ligado a um grupo carboxila no braço ligante L-Lys (como mostrado no composto acima de fórmula 1-1); ou [045](2) 1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina é ligado a um grupo amino no braço de ligação L-Lys, um grupo amino do oligopeptídeo, compreendendo uma sequência PAK é ligado a um grupo carboxila no braço de ligação L-Lys, e um grupo carboxila no oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD é ligado a outro grupo amino no braço de ligação L-Lys (como mostrado no composto acima de fórmula I-2).
[046]Para exemplos relacionados ao composto de fórmula 1-1, quando o composto de fórmula geral 1-1-1, 1-1-2, 1-1-3 ou 1-1-4 é preparado, o método de preparação da presente invenção pode ser realizado de acordo com os esquemas de síntese mostrados nas Figs. 1 a 4. Fig. 1 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral 1-1-1. Fig. 2 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral 1-1-2. Fig. 3 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-
1-3. Fig. 4 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral 1-1-4. Nas Figs. 1 a 4, aa3 pode ser S (Ser), V (Vai), ou F (Phe), como aqui descrito. Para exemplos relacionados ao composto de fórmula geral 1-1-2, o método de preparação de acordo com a presente invenção é descrito como segue:
18/95 [047](1) preparar 1,3-dioxo-2-(4-oxiacetóxi-fenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina;
[048](2) preparar 1,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Lys-OMe)fenil]-4,4,5,5tetrametilimidazolina (o grupo carboxila no braço de ligação Lys é protegido com um grupo de proteção);
[049](3) preparar HCI-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl, HCI-Arg(NO2)-GlyAsp(OBzl)-Val-Obzl or HCI-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl;
[050](4) preparar Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z);
[051 ](5) ligação de Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z) à lisina de 1,3-dioxo-2-[(4'oxiacetil-Lys-OMe)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina para prover 1,3-dioxo-2-{4'oxiacetil-{Nw-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina;
[052](6) respectivamente, conjugar HCI-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl, HCI-Arg(NO2)-Gly-Asp (OBzl)-Val-Obzl, ou HCI-Arg (NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl ao 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}- 4,4,5,5tetrametilimidazolina para fornecer 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Gly-Arg(N02)Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg(NG2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina, 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-AlaLys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp-(OBzl)-Val-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, ou 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg(N02)Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, respectivamente;
[053](7) desproteção dos compostos resultantes a partir do passo (6) para fornecer 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Gly-Arg-Pro-Ala-Lys]-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser}fenil}-
4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Gly-Arg-Pro-Ala-Lys]-LysArg-Gly-Asp-Val}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina ou 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw[Gly-Arg-Pro-Ala-Lys]-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina.
[054]No caso que os composto de fórmula geral -1-1, 1-1-3 e 1-1-4 são preparados, o processo de fabricação acima é repetido mas substituindo “Boc-Gly-Arg(N02)Pro-Ala-Lys(Z)” no passo (4) com “Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)”, “Boc19/95
Arg(NQ2)-Pro-Ala-Lys(Z)” e “Boc-Pro-Ala-Lys(Z)”.
[055]Grupos ativos nas posições apropriadas no oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK e o oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD podem ser protegidos por necessidade de desenho de conjugação, de forma que a terminação das sequências selecionadas (compreendendo um grupo ativo a ser ligado ao braço de ligação) é usado para acoplar a um grupo ativo no braço de ligação. O passo de acoplamento do oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK e o passo de acoplamento do oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD são passíveis de mudança na ordem. Por exemplo, o oligonucleotídeo compreendendo uma sequência RGD é acoplado ao primeiro braço de ligação, e então o oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK é acoplado ao mesmo.
[056]Grupos ativos incluem grupos que podem ser sujeitos à reação de condensação, tais como grupo amino ou um grupo carboxila. Grupos protetores amino podem ser carboxibenzila (CBz), t-butóxi carbonila (Boc), 9-florenil metóxi carbonila (Fmoc), benzil (Bn) ou p-metoxifenil (PMP). Grupos protetores carboxila podem ser metil éster (OMe), benzil éster (OBn), benzil metil éster (Obzl), t-butil éster (OBUT), ou silil éster (OSi(CH3)3).
[057]Para exemplos relacionados ao composto de fórmula I-2, quando o composto de fórmula geral 1-2-1, I-2-2, I-2-3 ou I-2-4 é preparado, o método de preparação da presente invenção pode ser realizado de acordo com os esquemas sintéticos nas Figs. 5 a 8. Fig. 5 mostram um esquema sintético para o composto de fórmula geral
1-2-1. Fig. 6 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-2-2. Fig. 7 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-2-3. Fig. 8 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-2-4. Nas Figs. 5 a 8, aa3 pode ser S (Ser), V (Vai) ou F (Phe), como descrito acima. Quando o composto de fórmula geral 1-2-1, I-2-2, I-2-3 ou I-2-4 é preparado, 1,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetilLys-OMe)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina pode ser preparado primeiro, e então o
20/95
C terminal do oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD é ligado ao grupo amino no braço de ligação Lys; e finalmente, o terminal N do oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK é ligado ao grupo carboxila desprotegido no braço de ligação.
[058]Em outra modalidade, no método de preparação de acordo com a presente invenção, a imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO é 1,3dioxo-2-[(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, o braço de ligação é L-Asp, o peptídeo tendo atividade trombolítica é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK (Pro-Ala-Lys), e o peptídeo de direcionamento ao trombo é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp), em que 1,3-dioxo-
2-[(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina é ligado ao grupo amino no braço de ligação L-Asp, o grupo amino no oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK é ligado ao um grupo carboxila no braço de ligação L-Asp, e o grupo amino no oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD é ligado a outro grupo carboxila no braço de ligação L-Asp (como mostrado no composto acima de fórmula I-3 ou I4).
[059]Para exemplos relacionados ao composto de fórmula I-3, quando o composto de fórmula geral 1-3-1, I-3-2, I-3-3 ou I-3-4 é preparado, o método de preparação da presente invenção pode ser realizado de acordo com os esquemas sintéticos mostrados nas Figs. 9 a 12. Fig. 9 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral 1-3-1. Fig. 10 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-3-2. Fig. 11 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-3-3. Fig. 12 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-3-4. Nas Fig.s 9 a 12, aa3 pode ser S (Ser), V (Vai), ou F (Phe), como descrito acima. Quando o composto de fórmula geral 1-3-1, I-3-2, I-3-3 ou I-3-4 é preparado, 1,3dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Asp-OMe)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina pode ser preparado primeiro, e então o N terminal do oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK
21/95 é ligado a um grupo carboxila no braço de ligação Asp; e finalmente, o N terminal do oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD é ligado a outro grupo carboxila desprotegido no braço de ligação Asp.
[060]Para exemplos relacionados ao composto de fórmula I-4, quando o composto de fórmula geral 1-4-1, I-4-2, I-4-3 ou I-4-4 é preparado, o método de preparação da presente invenção pode ser realizado de acordo com os esquemas sintéticos mostrados nas Figs. 13 a 16. Fig. 13 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral 1-4-1. Fig. 14 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-4-2. Fig. 15 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-4-3. Fig. 16 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral de I-4-4. Nas Figs. 13 a 16, aa3 pode ser S (Ser), V (Vai), ou F (Phe), como descrito acima. Quando o composto de fórmula geral 1-4-1, I-4-2, I-4-3 ou I-4-4 é preparado,
1.3- dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Asp-OMe)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina pode ser preparado primeiro, e então o N terminal do olipeptídeo compreendendo uma sequência RGD é ligado a um grupo carboxila no braço de ligação Asp; e finalmente, o N terminal do oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK é ligado a outro grupo carboxila desprotegido no braço de ligação Asp.
[061 ]Em ainda outra modalidade, no método de preparação de acordo com a presente invenção, a imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO é
1.3- dioxo-2-[(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, o braço de ligação é LGlu, o peptídeo tendo atividade trombolítica é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK (Pro-Ala-Lys) e o peptídeo com direcionamento ao trombo é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp), em que 1,3dioxo-2-[(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina é ligado ao grupo amino no braço de ligação L-Glu, o grupo amino no oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK é ligado a um grupo carboxila no braço de ligação L-Glu, e o grupo amino no oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD é ligado a outro grupo
22/95 carboxila no braço de ligação L-Glu (como mostrado no composto acima de fórmula 1-5 ou 1-6).
[062]Para exemplos relacionados ao composto de fórmula 1-5, quando o composto de fórmula geral 1-5-1, I-5-2, I-5-3 ou I-5-4 é preparado, o método de preparação da presente invenção pode ser realizado de acordo com os esquemas sinstéticos mostrados nas Figs. 17 a 20. Fig. 17 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral 1-5-1. Fig. 18 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-5-2. Fig. 19 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-5-3. Fig. 20 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-5-4. Nas Figs. 17 a 20, aa3 pode ser S (Ser), V (Vai), ou F (Phe), como descrito acima. Quando o composto de fórmula geral 1-5-1, I-5-2, I-5-3 ou I-5-4 é preparado,
1,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Glu-OMe)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina pode ser preparado primeiro, e então o N terminal do oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD é ligado a um grupo carboxila no braço de ligação Glu; e finalmente, o terminal N do oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK é ligado a outro grupo carboxila desprotegido no braço de ligação Glu.
[063]Para exemplos relacionados ao composto de fórmula I-6, quando o composto de fórmula geral 1-6-1, I-6-2, I-6-3 ou I-6-4 é preparado, o método de preparação da presente invenção pode ser realizado de acordo com os esquemas sintéticos nas Figs. 21 a 24. Fig. 21 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral 1-6-1. Fig. 22 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-6-
2. Fig. 23 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-6-3. Fig. 24 mostra um esquema sintético para o composto de fórmula geral I-6-4. Nas Figs. 21 a 24, aa3 pode ser S (Ser), V (Vai), ou F (Phe), como descrito acima. Quando o composto de fórmula geral 1-6-1, I-6-2, I-6-3 ou I-6-4 é preparado, 1,3-dioxo-2-[4'oxiacetil-Glu-OMe)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina pode ser preparado primeiro, e então o N terminal do oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK é ligado a
23/95 um grupo carboxila no braço de ligação Glu; e finalmente, o N terminal do oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD é ligado a outro grupo carboxila desprotegido no braço de ligação Glu.
[064]No método de preparação previamente descrito, o oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK pode ser ARPAK(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys), GRPAK(Gly-ArgPro-Ala-Lys), QRPAK(Gln-Arg-Pro-Ala-Lys), RPAK(Arg-Pro-Ala-Lys) ou PAK(ProAla-Lys), e o oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD pode ser RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val) ou RGDF(Arg-Gly-Asp-Phe).
[065]Para o composto ou composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, alta atividade de eliminação de radical livre NO é demonstrada por modelos de rato in vivo de eliminação de radical livre NO; trombólise superior e atividades anti-trombo são demonstradas por experimentos in vivo e in vitro de trombólise e anti-trombo; eficácia neuroprotetora e atividade anti-derrame superior são demonstradas por modelos de derrame em rato in vivo; e eficácia na diminuição do volume de infarto é deminstrada por modelos de derrame de rato.
Descrição dos Desenhos [066]Fig. 1 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmulag eral 1-1-1);
[067]Fig. 2 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral 1-1-2);
[068]Fig. 3 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral 1-1-3);
[069]Fig. 4 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral 1-1-4);
[070]Fig. 5 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral 1-2-1);
[071 ]Fig. 6 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de
24/95 acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral 1-2-2);
[072]Fig. 7 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral 1-2-3);
[073]Fig. 8 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmulag eral 1-2-4);
[074]Fig. 9 mostra um esquema sintético de uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral 1-3-1);
[075]Fig. 10 mostra um esquema sintético de uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral I-3-2);
[076]Fig. 11 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral I-3-3);
[077]Fig. 12 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral I-3-4);
[078]Fig. 13 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral 1-4-1);
[079]Fig. 14 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral I-4-2);
[080]Fig. 15 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral I-4-3);
[081 ]Fig. 16 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral I-4-4);
[082]Fig. 17 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral 1-5-1);
[083]Fig. 18 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral I-5-2);
[084]Fig. 19 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral I-5-3);
25/95 [085]Fig. 20 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral 1-5-4);
[086]Fig. 21 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral 1-6-1);
[087]Fig. 22 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral I-6-2);
[088]Fig. 23 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral I-6-3);
[089]Fig. 24 mostra um esquema sintético para uma modalidade do composto de acordo com a presente invenção (o composto de fórmula geral I-6-4);
[090]Fig. 25 mostra as nanoestruturas do composto Ia de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1 χ10'6 M, 1 χ10'9 M e 1 χ10'12 M;
[091 ]Fig. 26 mostra as nanoestruturas do composto Ib de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1 χ10'6 M, 1 χ10'9 M e 1 χ10'12 M;
[092]Fig. 27 mostra as nanoestruturas do composto Ic de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1 χ10'6 M, 1 χ10'9 M e 1 χ10'12 M;
[093]Fig. 28 mostra as nanoestruturas do composto Id de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1 χ10'6 M, 1 χ10'9 M e 1 χ10'12 M;
[094]Fig. 29 mostra as nanoestruturas do composto le de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1 χ10'6 M, 1 χ10'9 M e 1 χ10'12 M;
[095]Fig. 30 mostra as nanoestruturas do composto If de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1 χ10'6 M, 1 χ10'9 M e 1 χ10'12 M;
[096]Fig. 31 mostra as nanoestruturas do composto Ig de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1 χ10'6 M, 1 χ10'9 M e 1 χ10'12 M;
[097]Fig. 32 mostra as nanoestruturas do composto Ih de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1 χ10'6 M, 1 χ10'9 M e 1 χ10'12 M;
[098]Fig. 33 mostra as nanoestruturas do composto li de acordo com a presente
26/95 invenção em soluções aquosas 1 χ10'6 M, 1 χ10'9 M e 1 χ10'12 M;
[099]Fig. 34 mostra as nanoestruturas do composto Ij de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1 χ10'6 M, 1 χ10'9 M e 1 χ10'12 M;
[01 OO]Fig. 35 mostra as nanoestruturas do composto Ik de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1 χ10'6 M, 1 χ10'9 M e 1 χ10'12 M;
[0101 ]Fig. 36 mostra as nanoestruturas do composto II de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1 χ10'6 M, 1 χ10'9 M e 1 χ10'12 M;
[0102]Fig. 37 mostra o espectro FT-MS de alta resolução do composto le de acordo com a presente invenção em uma concentração de 0,01 μΜ;
[0103]Fig. 38 mostra o espectro FT-MS de alta resolução do composto le de acordo com a presente invenção em uma concentração de 0,1 μΜ;
[0104]Fig. 39 mostra o espectro FT-MS de alta resolução do composto le de acordo com a presente invenção em uma concentração de 1 μΜ;
[0105]Fig. 40 mostra o espectro FT-MS de alta resolução do composto le de acordo com a presente invenção em uma concentração de 10 μΜ.
Descrição Detalhada das Modalidades [0106]A presente invenção será agora descrita em conexão com os seguintes exemplos específicos, e as vantagens e características dos mesmos se tornarão aparentes na visão da descrição. Esse exemplos são meramente ilustrativos e de forma alguma limitam o objeito da presente invenção. Um versado na técnica pode entender que modificação ou substituição pode ser feita em detalhes e formalidade de soluções técnicas da presente invenção sem desviar do espírito e objetivo da presente invenção, e essas modificações ou substituinções são tencionadas estar dentro do objetivo de proteção da presente invenção.
[0107] Preparação de imdazolinas tendo atividade de eliminação de radical livre NO: 1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina
Exemplo 1. Preparação de 2,3-dimetil-2,3-dinitrobutano
27/95 [0108]69 g (0,78 mol) 2-nitropropano foram adicionados a 130 mL de solução aquosa de NaOH (6N). 20 mL (0,38 mol) de Br2 foram adicionados gota a gota sob agitação em um banho de sal gelado dentro de 1 h. Depois do término da adição de Br2, 240 mL de etanol foram adicionados ao mesmo e deixados em refluxo a 90°C por 3 h. A solução reacional, enquanto ainda quente, foi instantanemente vertida em 800 mL de água gelada, e então filtrada para fornecer 55 g do composto título (81%) como um cristal escamoso incolor, Mp 110-112 °C.
Exemplo 2. Preparação de 2,3-dimetil-2,3-diidroxiaminobutano [0109]7 g (40 mmol) de 2,3-dimetil-2,3-dinitrobutano e 4 g de NH4CI foram misturados e suspensos em 80 mL de solução aquosa de etanol (50%) e agitados em banho de gelo, no qual 16 g de pó de zinco foram adicionados dentro de 3 h. Após a adição de pó de zinco ser completada, o banho de gelo foi removido, e uma reação continuada por 3 h em temperatura ambiente (TA) sob agitação, e então a mistura reacional foi filtrada a vácuo. A massa filtrada foi lavada repetidamente com solução aquosa de etanol (50%). O filtrado e o líquido de lavagem foram combinados, ajustados para pH=2 com HCI conc., e então destilados sob pressão reduzida em uma mistura. Depois adição de uma quantidade apropriada de carbonato de potássio, a mistura foi uniformemente misturada e extraída por 6 h pelo uso de um extrator Soxhlet com clorofórmio como o extrator. O extrato foi concentrado sob pressão reduzida em uma pequena quantidade, em que o éter de petróleo foi adicionado para precipitar 2,60 g do composto título (44%) como um cristal incolor, Mp 157-159 °C.
Exemplo 3. Preparação de 1,3-diidróxi-2-(4-hidroxifeni 1)-4,4,5,5- tetrametilimidizolidina [0110]1,22 g (10 mmol) p-hidróxi benzaldeído e 1,48g (10 mmol) 2,3-dimetil-2,3diidroxiaminobutano foram dissolvidos em 10 mL de metanol e agitados em TA por 8 h até o ponto do material de partida desaparecer como shown by TLC. Upon vacuum
28/95 filtração, 1.29 g (51%) composto título was obtained as a colorless crystal. EI-MS (m/z) 252 [M]+. 1H-NMR (DMSO-d6) õ(ppm) = 1.03 (s, 6H), 1.05 (s, 6H), 4.39 (s, 1H), 6.70 (d, J =6.9 Hz, 2H), 7.23 (d, J =6.9 Hz, 2H), 7.63 (s, 1H), 7.85(s, 2H).
Exemplo 4. Preparação de 1,3-diidróxi-2-(4’-hidroxifenil)-4,4,5,5tetrametilimidazolina [0111]504 mg (2 mmol) 1,3-diidróxi-2-(4’-hidroxifenil)-4,4,5,5-imidizolidina foramdissolvido in 30 mL metanol seguido por adição de 3 g PbO2, and stirred em TA por 40 min até o material de partida spot desaparecer como mostrado por CCF. Depois remoção dos sólidos por filtração a vácuo, o filtrado foi destilado até secar sob pressão reduzida em TA, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (com clorofórmio como o eluente) para fornecer 260 mg (52%) do composto título como um sólido azul. Mp 134-135 °C, EI-MS (m/z) 249 [M]+. IR (KBr) 3250,1610,1500,1490, 840.
Exemplo 5. Preparação de 1,3-dioxo-2-(4’-(oxiacetato etil éster)-fenil)-
4,4,5,5- tetrametilimidazolina [0112]250 mg (1 mmol) 1,3-diidróxi-2-(4’-hidroxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 0,32 mL bromoacetato de etila e 32 mg de NaH foram dissolvidos em 5 mL THF anidro. A mistura foi agitada a 60 °C por 5 h até o ponto do material de partida desaparecer como mostrado por CCF Depois filtração sob pressão reduzida em TA, o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida até secar, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila:éter de petróleo = 1:5) para dar 300 mg (90%) do composto alvo, MP 107-109°C.
Exemplo 6. Preparação de 1,3-dioxo-2-(4’-oxiacetóxi-fenil)-4,4,5,5- tetrametilimidazolina (TMMZ) [0113]7 gotas de uma solução aquosa de NaOH (2N) foram adicionadas em uma solução de 33 mg (0,1 mmol) 1,3-dioxo-2-(4’-(oxiacetato etil éster)-fenil)-4,4,5,5tetrametilimidazolina em 3 mL de metanol, seguido por agitação em TA por 30 min
29/95 até o ponto de material de partida desaparecer como mostrado por CCF. A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi diluído por adição de 2 mL de salina saturada, ajustados para pH 6 com HCI 2N, e então extraído 3 vezes com acetato de etila (3 mL χ 3). As camadas da fase de acetato de etila foram combinadas e secas em sulfato de sódio anidro e então filtradas. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida a TA até secar para fornecer 30 mg (99%) do composto título como cristal azul. Mp 155-157°C. EI-MS (m/z) 307 [M]+.
[0114]Acoolando as imidazolinas tendo atividade de eliminação de radical livre NO com um braço de ligação: 1,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Lys-OMe)fenill-4,4,5,5tetrametilimidazolina
Exemplo 7. Preparação de 1,3-dioxo-2-[(4’-oxiacetil-Nw-Boc-Lys-OMe)fenil]-
4,4,5,5- tetrametilimidazolina [0115]A solução de 307 mg (1 mmol) 1,3-dioxo-2-(4’-oxiacetil-fenil)-4,4,5,5tetrametilimidazolina em 30 mL de THF anidro foi agitada em um banho de gelo, na qual 250 mg (1,2 mmol) DCC e 135 mg (1 mmol) HOBt foram adicionados e agitados em um banho de gelo por 10 min. Então a solução preparada com 300 mg (1 mmol) HCI Lys(Boc)-Ome, 122 mg (1 mmol) N-metilmorfolina e 6 mL de THF anidro foi adicionado mesma, e a mistura reacional foi reagida em TA por 24 h. CCF (acetato de etila:éter de petróleo = 2:1) mostrou desaparecimento de HCI Lys(Boc)-Ome. A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida até secar, o resíduo foi dissolvido em acetato de etila e material insolúvel foi removido por filtração. O filtrado foi sequencialmente lavado com uma solução aquosa saturada de bicarbonate de sódio e com uma solução aquosa saturada de NaCI, a fase acetato de etila separada foi seca em sulfato de sódio anidro e filtrada, e o filtrado was então concentrado sob pressão reduzida a 37°C (essas operações foram aqui depois referidas como um procedimento de rotina genérico). O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (acetato de etila:éter de petróleo = 2:1) para dar 433 mg (65%) do composto
30/95 título como sólido azul. ESI-MS(m/z) 550 [M + H]+.
Exemplo 8. Preparação de 1,3-dioxo-2-[(4’-oxiacetil-Lys-OMe)fenil]-4,4,5,5tetrametilimidazolina [0116]625 mg (1 mmol) 1,3-dioxo-2-[(4’-oxiacetil-Nw-Boc-Lys-OMe)fenil]-4,4,5,5tetrametilimidazolina foi dissolvida em 15 mL de cloreto de hidrogênio anidro -acetato de etila (4N) e agitada em TA por 3 h até o ponto do material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi então sujeita ao procedimento de rotina. O resíduo foi cristalizado em etil éter anidro para fornecer o composto título.
[0117]Preparação de peptídeo tendo atividade trombolítica: devidamente ARPAK protegido
Exemplo 9. Preparação de Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl [0118]473 mg (2,5 mmol) Boc-Ala foi dissolvido em 10 mL de THF anidro. A solução preparada com 338 mg (2,5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC e 10 mLde THF anidro foi adicionado a mesma em um banho de gelo. A mistura reacional foi agitada em banho de gelo por 20 min antes de uma solução preparada com 936 mg (2,3 mmol) HCI Lys(Z)-Obzl, 232 mg (2,3 mmol)N-metil morfolina e 6 mL de THF anidro foram adicionados a mesma. A mistura reacional resultante reagiu em TA por 24 h até HCI Lys(Z)-Obzl desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH = 30:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para dar 1,204 g (97%) do composto título como sólido incolor. Mp 88-90°C. [a]; =-29,2 (c = 0,1, MeOH). ESI-MS(m/z) 565 [M + Na]+.
Exemplo 10. Preparação de HCI AIa-Lys(Z)-OBzl [0119]1,354 g (2,5 mmol) Boc-Ala-Lys(Z)-Obzl foi dissolvido em aproximadamente 10 mL de solução of cloreto de hidrogênio anidro em acetato de etila (4N) e agitados em TA por 3 h até o ponto de material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 30:1). A solução de mistura reacional foi concentrada sob pres
31/95 são reduzida em TA, e o resíduo foi dissolvido em acetato de etila e então concentrado em TA; o processo acima foi repetido por várias vezes até todo cloreto de hidrogênio livre ser removido (essas operações são aqui depois referidas como um procedimento de rotina). O resíduo foi cristalizado em etil éter anidro para fornecer o composto título que foi diretamente usado na reação do próximo passo.
Exemplo 11. Preparação de Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl [0120]538 mg (2,5 mmol) Boc-Pro foram dissolvidos em uma quantidade apropriada de THF anidro seguido por adição de 338 mg (2,5 mmol) HOBt e 619 mg (3 mmol) DCC em THF anidro em um banho de gelo, e então reagidos por 20 min. A esta solução, a solução preparada com 1,099 g (2,3 mmol) HCI AIa-Lys(Z)-Obzl e 232 mg (2,3 mmol) N-metil morfolina em 10 mL de THF anidro foi adicionada, e a reação foi realizada em TA por 24 h. TLC (CHCI3:MeOH, 20:1) mostrou desaparecimento do ponto de material de partida. Os compostos de reação foram sujeitos ao procedimento de rotina para fornecer 2,847 g (98%) composto título, Mp 82-83 °C.
[a]2 D° =-46,4 (c = 0,11, MeOH). ESI-MS(m/z) 661 [M + Na] +.
Exemplo 12. Preparação de HCI Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl [0121 ]1,596 g (2,5 mmol) Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Obzl foram dissolvidos em 15 mL de solução of cloreto de hidrogênio anidro em acetato de etila (4N) e agitados em TA por 3 h até o ponto de material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina, e o resíduo foi cristalizado em etil éter anidro para dar o composto título que foi diretamente usado na reação do próximo passo.
Exemplo 13. Preparação de Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl [0122]Em um banho de gelo, a solução de 798 mg (2,5 mmol) Boc-Arg(N02), 338 mg (2,5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC em 10 mL THF anidro foram agitados por 20 min, em que a solução preparada com 1,322 g (2.3 mmol) HCI Pro-AlaLys(Z)-Obzl e 232 mg (2,3 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foram
32/95 adicionados e a reação foi realizada em TA por 24 horas até o ponto do material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). O procedimento de rotina foi realizado para dar 1,642 g (85%) do composto título. Mp 84-85 °C. [a]2 D° = -65,0 (c = 0,13, MeOH). ESI-MS (m/z) 864 [M + Na] +.
Exemplo 14. Preparação de HCl· Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl [0123]2,099 g (2,5 mmol) Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl foram dissolvidos em 20 mL de solução de cloreto de hidrogênio anidro em acetato de etila (4N) e agitados em TA por 3 h até o ponto material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina, e o resíduo foi cristalizado em etil éter anidro para dar o composto título que foi diretamente usado na reação do próximo passo.
Exemplo 15. Preparação de Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl [0124]Em um banho de gelo, a solução de 473 mg (2,5 mmol) Boc-Ala, 338 mg (2,5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC em 10 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, em que a solução preparada com 1,785 g (2,3 mmol) HCI Arg(N02)-Pro-AlaLys(Z)-Obzl, 232 mg (2,3 mmol) N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada e a reação foi realizada por 24 horas para dar 1,802 g (86%) do composto título. Mp 87 - 89°C. fa]2 D° =-63,9 (c = 0,12, MeOH). ESI-MS (m/e) 934 [M + Na] +.
Exemplo 16. Preparação de Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z) [0125]921 mg (1 mmol) Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl foram dissolvidos em 3 mL metanol, em que a solução aquosa de NaOH (2N) foi adicionada em um banho de gelo e agitada em TA por 30 min. Com pH mantido em 12, a reação foi agitada em banho de gelo por 10 min até o ponto do material de partida desaparecer como mostrado por CCF. pH foi ajustado para 7 com HCl 2N, e o líquido reacional foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com 2 mL salina saturada e ajustado para pH 2 com HCl 2N, e então extraído 3 vezes com acetato de etila (5 mLx 3). As camadas da fase acetato de etila foram combinadas e secas em sulfato
33/95 de sódio anidro, e concentradas sob pressão reduzida em TA para fornecer 767 mg (80%) de composto título como sólido incolor. EI-MS (m/z) 830 [M - H]_.
[0126]Preoaração de oeotídeo direcionado ao trombo /anti-trombo: devidamente protegido RGDS, RGDV, RGDF
Exemplo 17. Preparação de Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl [0127]Em um banho de gelo, a solução de 808 mg (2,5 mmol) Boc-Asp(OBzl), 338 mg (2,5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC rm 10 mL de THF anidro foi agitada e reagida por 20 min, e então a solução preparada com 740 mg (2,3 mmol) HCI Ser(Bzl)-Obzl, 232 mg (2,3 mmol) N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionado a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). Os compostos reacionais foram sujeitos ao procedimento de rotina para fornecer 1,29 g (95%) do composto título como uma matéria oleosa incolor. ESI-MS(m/z) 591 [M + H]+.
Exemplo 18. Preparação de HCI-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl [0128]1,477 g (2,5 mmol) Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl foram dissolvidos em 15 mL de solução de cloreto de hidrogênio anidro em acetato de etila (4N) e agitados em TA por 3 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina, e o resíduo foi cristalizado em etil éter anidro para dar o composto título que foi diretamente usado na reação do próximo passo.
Exemplo 19. Preparação de Boc-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl [0129]Em um banho de gelo, a solução de 438 mg (2,5 mmol) Boc-Gly, 338 mg (2,5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC em 10 mL THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 1,212 g (2,3 mmol) HCI Asp(OBzl)-Ser(Bzl)Obzl e 232 mg (2,3 mmol) N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento
34/95 de rotina para fornecer 1,461 g (98%) do composto título como sólido incolor. Mp 53 - 55°C. [a]2 D° =-23,7 (c = 0,13, MeOH). ESI-MS (m/z) 649 [M + H]+.
Exemplo 20. Preparação de HCl· Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl [0130]1,619 g (2,5 mmol) Boc-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl foram dissolvidos em 15 mL de solução de cloreto de hidrogênio anidro em acetato de etila (4N) e agitados em TA por 3 h até o ponto de material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina, e o resíduo foi cristalizado em etil éter anidro para dar o composto título que foi diretamente usado na reação do próximo passo.
Exemplo 21. Preparação de Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl [0131]Em um banho de gelo, a solução de 798 mg (2,5 mmol) Boc-Arg(N02), 338 mg (2,5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC em 10 mLde THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 1,343 g (2,3 mmol) HCI GIy-Asp(OBzl)Ser(Bzl)-Obzl e 232 mg (2,3 mmol) N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). Depois o procedimento de rotina, 1,66 g (85%) do composto título foram obtidos como sólido incolor. Mp 74 - 75 °C. [a]2 D° = -26,2 (c = 0,12, MeOH). ESI-MS(m/z) 872 [M + Na]+.
Exemplo 22. Preparação de HCI Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl [0132]Uma mistura de 2,122 g (2,5 mmol) Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)Obzl e 20 mL de solução de cloreto de hidrogênio em acetato de etila (4N) foi agitada em TA por 3 h até o ponto de material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3: MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina, o resíduo foi cristalizado em etil éter anidro para fornecer o composto título.
Exemplo 23. Preparação de Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl [0133]Em um banho de gelo, uma solução de 808 mg (2,5 mmol) Boc-Asp(OBzl), 338 mg (2,5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC em 10 mLde THF anidro foi agita
35/95 da por 20 min, e então a solução preparada com 558 mg (2,3 mmol) de HCI Val-Obzl e 232 mg (2,3 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagidas em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 1,129 g (96%) do composto título como líquido oleoso oncolor. ESI-MS(m/z) 512 [M + H]+.
Exemplo 24. Preparação de HCI Asp(OBzl)-Val-OBzl [0134]1,278 g (2.5 mmol) Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl foram dissolvidos em 15 mL de solução de cloreto de hidrogênio anidro em acetato de etila (4N) e agitada em TA por 3 h até o ponto de material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina, e o resíduo foi cristalizado em etil éter anidro para dar o composto título que foi diretamente usado na reação do próximo passo.
Exemplo 25. Preparação de Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl [0135]Em um banho de gelo, a solução de 438 mg (2,5 mmol) Boc-Gly, 338 mg (2,5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC em 10 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 1,03 g (2,3 mmol) HCI Asp(OBzl)-Val-Obzl e 232 mg (2,3 mmol) N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 1,242 g (95%) do composto título como sólido incolor. Mp 66 - 68 °C. [a]2 D° =-43.8 (c= 0,11, MeOH). ESI-MS(m/z) 592 [M + Na]+.
Exemplo 26. Preparação de HCI GIy-Asp(OBzl)-Val-OBzl [0136]1,421 g (2,5 mmol) Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl foram dissolvidos em 15 mL de solução de cloreto de hidrogênio anidro em acetato de etila (4N) e agitados em TA por 3 h até o ponto de material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina, e o
36/95 resíduo foi cristalizado em etil éter anidro para dar o composto título que foi diretamente usado na reação do próximo passo.
Exemplo 27. Preparação de Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl [0137]Em um banho de gelo, a solução de 798 mg (2,5 mmol) Boc-Arg(N02), 338 mg (2,5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC em 10 mLde THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 1,162 g (2,3 mmol) HCI GIy-Asp(OBzl)-ValObzl e 232 mg (2,3 mmol) N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 1,523 g (86%) do composto título como sólido incolor. Mp 107 - 109 °C. fa]2 D° =-38.0 (c= 0.12, MeOH). ESI-MS(m/z) 793 [M + Na]+.
Exemplo 28. Preparação de HCI GIy-Asp(OBzl)-Val-OBzl [0138]1,925 g (2,5 mmol) Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl foram dissolvidos em 20 mL de solução de cloreto de hidrogênio anidro em acetato de etila (4N) e agitados em TA por 3 h até o ponto de material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina, e o resíduo foi cristalizado em etil éter anidro para dar o composto título.
Exemplo 29. Preparação de Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl [0139]Em um banho de gelo, a solução de 808 mg (2,5 mmol) Boc-Asp(OBzl), 338 mg (2,5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC em 10 mL THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 668 mg (2,3 mmol) de HCI Phe-Obzl e 232 mg (2,3 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada à mesma e reagidas em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). Depois o procedimento de rotina, 1,222 g (95%) do composto título foi obtido como sólido incolor. Mp 79 - 80°°. [a|;j =-24,2 (c = 0,13, MeOH), ESI-MS(m/z) 561 [M + H]+.
Exemplo 30. Preparação de HCI Asp(OBzl)-Phe-OBzl
37/95 [0140]1,398 g (2,5 mmol) Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl foram dissolvidos em 15 mLde solução de cloreto de hidrogênio anidro em acetato de etila (4N) e agitados em TA por 3 h até o ponto de material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina, e o resíduo foi cristalizado em etil éter anidro para dar o composto título que foi diretamente usado na reação do próximo passo.
Exemplo 31. Preparação de Boc-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl [0141]Em um banho de gelo, a solução de 438 mg (2,5 mmol) de Boc-Gly, 338 mg (2,5 mmol) de HOBt, 619 mg (3 mmol) de DCC em THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 1,141 g (2,3 mmol) de HCI Asp(OBzl)-PheObzl e 232 mg (2.3 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mLde THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 1,29 g (91%) do composto título como sólido incolor. Mp 70 71 °C. [a]; =-22,5 (c = 0,14, MeOH). ESI-MS(m/z) 640 [M + Na] +.
Exemplo 32. Preparação de HCI GIy-Asp(OBzl)-Phe-OBzl [0142]1,541 g (2,5 mmol) de Boc-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl foram dissolvidos em 15 mL solução de cloreto de hidrogênio anidro em acetato de etila (4N) e agitados em TA por 3 h até o ponto de material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina, e o resíduo foi cristalizado em etil éter anidro para dar o composto título que foi diretamente usado na reação do próximo passo.
Exemplo 33. Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl [0143]Em um banho de gelo, a solução de 798 mg (2,5 mmol) de Boc-Arg(N02), 338 mg (2,5 mmol) de HOBt, 619 mg (3 mmol) de DCC em 10 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 1,272 g (2,3 mmol) de HCI GIy-Asp(OBzl)-Phe-Obzl e 232 mg (2,3 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL THF
38/95 anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 1,637g (87%) do composto título como sólido incolor. Mp 77 - 79°C. [cr]|>0 =-22,6 (c = 0,09, MeOH). ESI-MS(m/z) 841 [M + Na]+.
Exemplo 34. Preparação de HCIArg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl [0144]2,045 g (2,5 mmol) de Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl foram dissolvidos em 15 mL solução de cloreto de hidrogênio anidro em acetato de etila (4N) e agitados em TA por 3 h até o ponto de material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina, e o resíduo foi cristalizado em etil éter anidro para dar o composto título.
[0145]Preparação de conjugados ternários de ARPAK/imidazolina/RGD (compostos de fórmula geral 1-1-1): Ia, Ib, Ic
Exemplo 35. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Ala-Arg(N02)Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys-OMe}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0146]Em um banho de gelo, a solução de 821 mg (1 mmol) de Boc-Ala-Arg(NG2)Pro-Ala-Lys(Z), 135 mg (1 mmol) de HOBt e 250 mg (1 mmol) de DCC em 10 mLde THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 480 mg (1 mmol) de 1,3-dioxo-2-[(4’-oxiacetil-Lys- OMe)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina e 100 mg (1 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 40:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 925 mg (83%) do composto título como sólido azul. Mp 179 182°C. [a]; =-34.3 (c = 0,14, MeOH), ESI-MS(m/z) 1275 [M + Na]+. IR (KBr) 3319, 2935, 1658, 1531, 1448, 1363, 1254, 1168, 1053, 835, 749, 540 cm’1.
Exemplo 36. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Ala-Arg(N02)39/95
Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys}fenil}- 4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0147]Em um banho de gelo, 1260 mg (1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina foram dissolvidos em 3 mL de metanol seguido por adição de uma solução aquosa de NaOH (2N), e então agitados em TA por 30 min. Com pH mantido em 12, a reação foi agitada em banho de gelo for 10 min até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF. Com pH ajustados para 7 com HCI 2N, o líquido reacional foi concentrado sob pressão reduzida, e o resíduo foi diluído em 2 mL de salina saturada, ajustados para pH 2 com HCI 2N, e então extraída 3 vezes com acetato de etila (5 mLx 3). A fase acetato de etila combinada foi seca em sulfato de sódio anidro e filtrada, e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida em TA para fornecer 945 mg (82%) do composto título como sólido azul. EI-MS (m/z) 1238 [M - H]_.
Exemplo 37. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Ala-Arg(N02)Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0148]Em um banho de gelo, a solução de 618 mg (0,5 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’oxiacetil-{Nw-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina, 69 mg (0,5 mmol) de HOBt e 126 mg (0,6 mmol) de DCC em 20 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 442 mg (0,5 mmol) de HCI Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)- Ser(Bzl)-Obzl e 50 mg (0,5 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 300 mg (31%) do composto título como sólido azul. Mp 138 - 140 °C. [a];, =-39.4 (c = 0.13, MeOH). ESI-MS(m/z) 1991 [M + H]+. IR(KBr) 3309, 2936, 1656, 1531, 1449, 1363, 1256, 836, 743, 697, 601 cm’1.
Exemplo 38. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Ala-Arg(N02)
40/95
Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina [0149]Em um banho de gelo, a solução de 618 mg (0,5 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’oxiacetil-{Nw-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina, 69 mg (0,5 mmol) de HOBt e 126 mg (0,6 mmol) de DCC em 20 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 421 mg (0,5 mmol) de HCI Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-Obzl e 50 mg (0,5 mmol) de Nmetilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 389 mg (36%) do composto título como sólido azul. Mp117 - 120°C. [a]™ =-14.8 (c = 0,01, MeOH). ESI-MS(m/z) 1913 [M + H]+. IR(KBr) 3312, 2937, 1655, 1530, 1448, 1362, 1257, 835, 744, 697, 592 cm’1.
Exemplo 39. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Ala-Arg(N02)Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina [0150]Em um banho de gelo, a solução de 618 mg (0,5 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’oxiacetil-{Nw-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina, 69 mg (0,5 mmol) de HOBt e 126 mg (0,6 mmol) de DCC em 20 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 445 mg (0,5 mmol) de HCI Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl e 50 mg (0,5 mmol) de Nmetilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 320 mg (36%) do composto título como sólido azul. Mp115 - 118°C. [a]™ =-21,5 (c = 0,16, MeOH). ESI-MS (m/z) 1961 [M + H]+. IR(KBr) 3316, 2936, 1654, 1529, 1448, 1362, 1256, 1169, 742, 698, 593 cm’1.
41/95
Exemplo 40. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-[Nw-(Ala-Arg-Pro-AlaLys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser]fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina (Ia) [0151]Em um banho de gelo, 199 mg (0,1 mmol) 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[BocAla-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}fenil}-
4.4.5.5- tetrametil- imidazolina foram misturados com 6 mL de ácido trifluoracético e
1,5 mL de ácido trifluormetanossulfônico, e agitados por 1 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 1:1). A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi repetidamente lavado com etil éter anidro e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em água, ajustado para pH=8 com 25% amônia aquosa, desalizado com Sephadex G10, e então purificado em uma coluna C18. As frações coletadas foram liofilizadas para fornecer 109 mg (85%) do composto título como sólido azul. Mp 134 - 135 °C. [a]„ =-39.7 (c = 0,12, MeOH). FT-MS(m/z) 1374.7290 [M + H]+, 2748.4580 [2M + H]+, 4122.1870 [3M + H]+, 5495.9160 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3346, 3180, 2920, 1665, 1537, 1449, 1252, 1179, 1030, 837, 801,720, 639, 518 cm’1.
Exemplo 41. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-[Nw-(Ala-Arg-Pro-AlaLys)-Lys-Arg- Gly-Asp-Val]fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina (Ib) [0152]Em um banho de gelo, 190 mg (0,1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}fenil}-
4.4.5.5- tetrametilimidazolina foram misturados com 6 mL de ácido trifluoracético e
1,5 mL de ácido trifluormetanossulfônico, e agitados por 1 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 1:1). A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi repetidamente lavado com etil éter anidro e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em água, ajustado para pH 8 com 25% de amônia aquosa, dessalinizado com Sephadex G10, e então purificado em uma coluna C18. As frações coletadas foram liofilizadas para fornecer 96 mg (82%) do composto título como sólido azul. Mp 143 - 144°C. [a]„ =
42/95
-31,8 (c = 0,01, MeOH). FT-MS(m/z) 1386.7654 [M + H]+, 2772.5308, [2M + H]+, 4158.2962 [3M + H]+, 5544.0616 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3349, 2942, 1659, 1539, 1394, 1250, 1030, 639 cm’1.
Exemplo 42. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-[Nw-(Ala-Arg-Pro-AlaLys)-Lys-Arg- Gly-Asp-Phe]fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina (Ic) [0153]Em um banho de gelo, 194 mg (0,1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}fenil}-
4,4,5,5-tetrametilimidazolina foram misturados com 6 mL de ácido trifluoracético e
1,5 mL de ácido trifluormetanosulfônico, e agitados por 1 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 1:1). A mistura reacional was concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi repetidamente lavado com etil éter anidro e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em água, ajustado para pH 8 com 25% de amônia aquosa, dessalinizada com Sephadex G10, e então purificado em uma coluna C18. As frações coletadas foram liofilizadas para fornecer 106 mg (81%) do composto título como sólido azul. Mp 96 - 97°C. [a]„ =44,4 (c = 0.15, MeOH). FT-MS (m/z) ESI-MS (m/z) 1444.7654 [M + H]+, ESI-MS(m/z) 2888.5308 [2M + H]+, 4332.2962 [3M + H]+, 5776.0616 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3363, 1665, 1538, 1448, 1256, 1173, 1031,640, 577, 518 cm’1.
[0154]Preparação do peptídeo tendo atividade trombolítica: devidamente GRPAK protegido
Exemplo 43. Preparação de Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl [0155]Em um banho de gelo, a solução de 438 mg (2,5 mmol) de Boc-Gly, 338 mg (2,5 mmol) de HOBt, 619 mg (3 mmol) de DCC em 10 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 1,785 g (2,3 mmol) de HCI Arg(NO2)Pro-Ala-Lys(Z)-Obzl e 232 mg (2,3 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h para dar 1,857 g (90%) do composto título. Mp 85 - 87°C. [a]2, =-38.5 (c = 0.11, MeOH). ESI-MS (m/e) 920 [M
43/95 + Na] +.
Exemplo 44. Preparação de Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z) [0156]907 mg (1 mmol) de Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl foram dissolvidos em 3 mL de metanol seguido por adição de ema solução aquosa de NaOH (2N) em um banho de gelo, e então agitados em TA por 30 min. Com pH mantido a 12, a reação foi agitada em banho de gelo por 10 min até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF. Com pH ajustados para 7 com HCI 2N, o líquido reacional foi concentrado sob pressão reduzida, e o resíduo foi diluído em 2 mL de salina saturada, ajustados para pH 2 com HCI 2N, e então extraído 3 vezes com acetato de etila (5 mLx 3). A fase acetato de etila combinada foi seca em sulfato de sódio anidro, e então concentrada sob pressão reduzida em TA para fornecer 785 mg (82%) do composto título como sólido incolor. EI-MS (m/z) 816 [M - H]_.
[0157]Preparação de conjugados ternários de GRPAK/imidazolina/RGD (compostos de fórmula geral 1-1-2): Id, le, If
Exemplo 45. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Gly-Arg(N02)Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys-OMe}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0158]Em um banho de gelo, a solução de 817 mg (1 mmol) de Boc-Gly-Arg(N02)Pro-Ala-Lys(Z), 135 mg (1 mmol) de HOBt e 250 mg (1 mmol) de DCC em 10 mLde THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 480 mg (1 mmol) de 1,3-dioxo-2-[(4’-oxiacetil-Lys- OMe)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina e 100 mg (1 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 40:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 680 mg (52%) do composto título como sólido azul. Mp 79 - 82 °C. [a]2 D° =-12,3 (c = 0.14, MeOH), ESI-MS(m/z) 1261 [M + Na]+. IR (KBr) 3319, 2935, 1658, 1531, 1448, 1363, 1254, 1168, 1053, 835, 749, 540 cm’1.
Exemplo 46. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Gly-Arg(N02)44/95
Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0159]Em um banho de gelo, 1260 mg (1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina foram dissolvidos em 3 mL de metanol seguido por adição de uma solução aquosa de NaOH (2N), e então agitados em TA por 30 min. Com pH mantido a 12, a reação foi agitada em banho de gelo por 10 min até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF. Com pH ajustados para 7 com HCI 2N, o líquido reacional foi concentrado sob pressão reduzida, e o resíduo foi diluído em 2 mL de salina saturada, ajustados para pH 2 com HCI 2N, e então extraída 3 vezes com acetato de etila (5 mLx 3). A fase acetato de etila combinada foi seca em sulfato de sódio anidro e filtrada, e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida em TA para fornecer 945 mg (82%) do composto título como sólido incolor. EI-MS (m/z) 1223 [M - H]_.
Exemplo 47. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Gly-Arg(N02)Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0160]Em um banho de gelo, a solução de 611 mg (0,5 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’oxiacetil-{Nw-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina, 69 mg (0,5 mmol) de HOBt e 126 mg (0,6 mmol) de DCC em 20 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 442 mg (0,5 mmol) de HCI Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl e 50 mg (0,5 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 500 mg (48%) do composto título como sólido azul. Mp 127 - 129 °C. [ap =-49,4 (c = 0,13, MeOH). ESI-MS(m/z) 1956 [M + H]+. IR(KBr) 3306, 2936, 1652, 1531, 1449, 1362, 1255, 1166, 742, 697, 592 cm’1.
Exemplo 48. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Gly-Arg(N02)
45/95
Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina [0161]Em um banho de gelo, a solução de 611 mg (0,5 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’oxiacetil-{Nw-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina, 69 mg (0,5 mmol) de HOBt e 126 mg (0,6 mmol) de DCC em 20 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 421 mg (0,5 mmol) de HCI Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-Obzl, 50 mg (0,5 mmol) de Nmetilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 392 mg (35%) do composto título como sólido azul. Mp 147 - 150°C. [a]™ =-34.6 (c = 0,16, MeOH). ESI-MS(m/z) 1899 [M + Na]+. IR(KBr) 3311, 3068, 2937, 1661, 1531, 1451, 1395, 1254, 1163, 839, 743, 697, 596 cm’1.
Exemplo 49. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Gly-Arg(N02)Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina [0162]Em um banho de gelo, uma solução de 611 mg (0,5 mmol) de 1,3-dioxo-2{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina, 69 mg (0,5 mmol) de HOBt e 126 mg (0,6 mmol) de DCC em 20 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 445 mg (0,5 mmol) de HCI Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl e 50 mg (0,5 mmol) de Nmetilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 336 mg (31%) do composto título como sólido azul. Mp 125 - 128°C. [a]™ =-31,3 (c = 0,18, MeOH). ESI-MS (m/z) 1925 [M + H]+. IR(KBr) 3315, 2935, 1657, 1529, 1448, 1361, 1257, 1173, 834, 742, 698, 541 cm’1.
46/95
Exemplo 50. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-[Nw-(Gly-Arg-Pro-AlaLys)- Lys-Arg-Gly-Asp-Ser]fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina (Id) [0163]Em um banho de gelo, 195 mg (0,1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina foram misturados com 6 mL de ácido trifluoracético e 1,5 mLde ácido trifluoretanosulfônico, e agitados por 1 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 1:1). A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi repetidamente lavado com etil éter anidro e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foram dissolvidos em água, ajustados para pH 8 com 25% de amônia aquosa, dessalinizado com Sephadex G10, e então purificado em uma coluna C18. As frações coletadas foram liofilizadas para fornecer 102 mg (82%) do composto título como sólido azul. Mp 142 - 145°C. fa]2D° =-29,7 (c = 0.14, MeOH). FT-MS(m/z) 1360.7133 [M + H]+, 2720.4266 [2M + H]+, 4080.1399 [3M + H]+, 5439.8532 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3348, 3180, 2940, 1670, 1539, 1447, 1199, 1134, 1034, 836, 801, 721, 638 cm'1.
Exemplo 51. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-[Nw-(Gly-Arg-Pro-AlaLys)-Lys-Arg- Gly-Asp-Val]fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina (le) [0164]Em um banho de gelo, 190 mg (0,1 mmol) 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[BocGly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-GBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametil- imidazolina foram misturados com 6 mL de ácido trifluoracético e 1,5 mL de ácido trifluormetanosulfônico, e agitados por 1 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 1:1). A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi repetidamente lavado com etil éter anidro e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em água, ajustado para pH 8 com 25% amônia aquosa, dessalinizada com Sephadex G10, e então
47/95 purificado em uma coluna C18. As frações coletadas foram liofilizadas para fornecer 99 mg (84%) do composto título como sólido azul. Mp 147 - 149 °C. [α]„ =-31,1 (c = 0,17, MeOH). FT-MS(m/z) 1372.7497 [M + H]+, 2744.4994 [2M + H]+, 4116.2491 [3M + H]+, 5487.9988 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3338, 2960, 1662, 1539, 1451, 1392, 1251,1170, 1030, 639, 519 cm’1.
Exemplo 52. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-[Nw-(Gly-Arg-Pro-AlaLys)-Lys- Arg-Gly-Asp-Phe]fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina (If) [0165]Em um banho de gelo, 192 mg (0,1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}fenil}-
4,4,5,5-tetrametilimidazolina foram misturados com 6 mL de ácido trifluoracético e
1,5 mL de ácido trifluormetanosulfônico, e agitados por 1 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 1:1). A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi repetidamente lavado com etil éter anidro e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em água, ajustado para pH 8 com 25% amônia aquosa, dessalinizado com Sephadex G10, e então purificado em uma coluna C18. As frações coletadas foram liofilizadas para fornecer 106 mg (81%) do composto título como sólido azul. Mp 84 - 85°C. [a]„ =54,1 (c = 0,15, MeOH). FT-MS (m/z) 1420.7497 [M + H]+, 2840.4994 [2M + H]+, ESIMS FT-MS(m/z) 1420.7497 [M + H]+, 2840.4994 [2M + H]+, 4260.2491 [3M + H]+, 5679.9976 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3344, 3080, 2930, 1666, 1535, 1392, 1250, 1181, 1030, 835, 800, 719, 638 cm’1.
[0166]Preoaração do peptídeo tendo atividade trombolítica: devidamente RPAK protegido
Exemplo 53. Preparação de Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z) [0167]Em um banho de gelo, 850 mg (1 mmol) de Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)OBzl foram dissolvidos em 3 mL de metanol seguido por adição de uma solução aquosa de NaOH (2N), e então agitados em TA por 30 min. Com pH mantido a 12, a
48/95 reação foi agitada em banho de gelo for 10 min até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF. Com pH ajustados para 7 com HCI 2N, o líquido reacional foi concentrado sob pressão reduzida, e o resíduo foi diluído em 2 mL de salina saturada, ajustados para pH 2 com HCI 2N, e então extraída 3 vezes com acetato de etila (5 mLx 3). A fase acetato de etila combinada foi seca em sulfato de sódio anidro, e filtrada, então o filtrado é concentrado sob pressão reduzida em TA para fornecer 742 mg (92%) do composto título como sólido incolor. EI-MS (m/z) 849 [M H]-.
[0168]Preparação de conjugados ternários de RPAK/imidazolina/RGD (compostos de fórmula geral 1-1-3): lg, Ih, li
Exemplo 54. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Arg(N02)-ProAla- Lys(Z)]-Lys-OMe}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0169]Em um banho de gelo, a solução de 760 mg (1 mmol) de Boc-Arg(N02)-ProAla-Lys(Z), 135 mg (1 mmol) de HOBt e 250 mg (1 mmol) de DCC em 10 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 480 mg (1 mmol) de
1,3-dioxo-2-[(4’-oxiacetil-Lys-OMe)fenil]- 4,4,5,5-tetrametilimidazolina e 100 mg (1 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 40:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 920 mg (83%) do composto título como sólido azul. Mp 72 - 76 °C. [a]; =32,7 (c = 0,13, MeOH), ESI-MS(m/z) 1204 [M + Na]+. IR (KBr) 3317, 2937, 1658, 1531, 1447, 1362, 1254, 1168, 1055, 835, 746, 697, 541,460 cm’1.
Exemplo 55. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Arg(N02)-ProAla- Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0170]Em um banho de gelo, 1200 mg (1 mmol) 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[BocArg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina foram dissolvidos em 3 mL de metanol seguido por adição de uma solução aquosa de
49/95
NaOH (2N), e então agitados em TA por 30 min. Com pH mantido a 12, a reação foi agitada em banho de gelo por 10 min até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF. Com pH ajustado para 7 com HCI 2N, o líquido reacional foi concentrado sob pressão reduzida, e o resíduo foi diluído em 2 mL de salina saturada, ajustado para pH 2 com HCI 2N, e então extraído 3 vezes com acetato de etila (5 mLx 3). A fase acetato de etila combinada foi seca em sulfato de sódio anidro e filtrada, e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida em TA para fornecer 899 mg (80%) do composto título como sólido azul. EI-MS (m/z) 1116 [Μ - H]_.
Exemplo 56. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Arg(N02)-ProAla- Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0171]Em um banho de gelo, a solução de 583 mg (0,5 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’oxiacetil-{Nw-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0,5 mmol) de HOBt e 126 mg (0,6 mmol) de DCC em 20 mL de THF anidro foram agitados por 20 min, e então a solução preparada com 442 mg (0,5 mmol) de HCI Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl e 50 mg (0,5 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 421 mg (40%) do composto título como sólido azul. Mp 77 - 79°C. [a]2D° =-45,4 (c = 0,15, MeOH). ESIMS(m/z) 1897 [M + H]+. IR(KBr) 3319, 2934, 1658, 1530, 1449, 1361, 1256, 834, 741,698, 542 cm’1.
Exemplo 57. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Arg(N02)-ProAla-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0172]Em um banho de gelo, a solução de 583 mg (0,5 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’oxiacetil-{Nw-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0,5 mmol) de HOBt e 126 mg (0,6 mmol) de DCC em 20 mL de THF anidro
50/95 foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 421 mg (0,5 mmol) de HCIArg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-Obzl e 50 mg (0,5 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 472 mg (42%) do composto título como sólido azul. Mp 107 - 109°C. [a]; =-28,8 (c = 0,11, MeOH). ESIMS(m/z) 1820 [M + H]+. IR(KBr) 3314, 2938, 1658, 1531, 1448, 1362, 1258, 742, 698, 594 cm’1.
Exemplo 58. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Arg(N02)-ProAla-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina [0173]Em um banho de gelo, a solução de 583 mg (0,5 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’oxiacetil-{Nw-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0,5 mmol) de HOBt e 126 mg (0,6 mmol) de DCC em 20 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 445 mg (0,5 mmol) de HCI Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl e 50 mg (0,5 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 420 mg (47%) do composto título como sólido azul. Mp 141 - 144°C. [a]21’ =-35,7 (c = 0,12, MeOH). ESIMS(m/z) 1867 [M + H]+. IR(KBr) 3319, 2936, 1656, 1529, 1448, 1362, 1257, 1169, 834, 743, 698, 541 cm’1.
Exemplo 59. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-[Nw-(Arg-Pro-Ala-Lys)Lys-Arg-Gly- Asp-Ser]fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina (Ig) [0174]Em um banho de gelo, 170 mg (0,1 mmol) 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[BocArg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina foram misturados com 6 mL de ácido trifluoracético e 1,5 mL de
51/95 ácido trifluormetanosulfônico, e agitados por 1 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 1:1). A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi repetidamente lavado com etil éter anidro e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em água, ajustados para pH 8 com 25% de amônia aquosa, dessalinizado com Sephadex G10, e então purificado em uma coluna C18. As frações coletadass foram liofilizadas para fornecer 102 mg (82%) do composto título como sólido azul. Mp 148 - 150°C. [a]™ =-22,4 (c = 0,14, MeOH). FT-MS(m/z) 1303.6919 [M + H]+, 2606.3838, [2M + H]+, 3909.0757 [3M + H]+, 5211.7676 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3344, 3080, 2930, 1666, 1535, 1392, 1250, 1181,1030, 835, 800, 719, 638.
Exemplo 60. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-[Nw-(Arg-Pro-Ala-Lys)Lys-Arg-Gly- Asp-Val]fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina (Ih) [0175]Em um banho de gelo, 182 mg (0,1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina foram misturados com 6 mL de ácido trifluoracético e 1,5 mL de ácido trifluormetanosulfônico, e agitados for 1 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 1:1). A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi repetidamente lavado com etil éter anidro e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foram dissolvidos em água, ajustados para pH 8 com 25% de amônia aquosa, dessalinizada com Sephadex G10, e então purificado em uma coluna C18. As frações coletadas foram liofilizadas para fornecer 99 mg (84%) do composto título como sólido azul. Mp 137 - 139 °C. [α]„ =-34,3 (c = 0,18, MeOH). FT-MS(m/z) ESI-MS(m/z) 1315.7282 [M + H]+, 2630.4564 [2M + H]+, 3945.1846 [3M + H]+, 5259.9128 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3329, 2953, 1665, 1533, 1391,1198, 1134, 834, 801,720, 599 cm’1.
Exemplo 61. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-[Nw-(Arg-Pro-Ala-Lys)Lys-Arg-Gly- Asp-Phe]fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina (li)
52/95 [0176]Em um banho de gelo, 187 mg (0,1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina foram misturados com 6 mL de ácido trifluoracético e 1,5 mL de ácido trifluormetanosulfônico, e agitados por 1 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 1:1). A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi repetidamente lavado com etil éter anidro e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em água, ajustado para pH 8 com 25% de amônia aquosa, dessalinizado com Sephadex G10, e então purificado em uma coluna C18. As frações coletadas foram liofilizadas para fornecer 96 mg (81%) do composto título como sólido azul. Mp 99 - 100°C. [α]„ =-24,7 (c = 0,14, MeOH). FT-MS (m/z) 1363.7282 [M + H]+, 2726.4564 [2M + H]+, 4089.1846 [3M + H]+, 5451.9128 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3322, 3060, 2928, 1661, 1530, 1391, 1303, 1247, 641 cm’1.
[01771Preparação do peptídeo tendo atividade trombolítica: devidamente PAK protegido
Exemplo 62. Preparação de Boc-Pro-Ala-Lys(Z) [0178]Em um banho de gelo, 638 mg (1 mmol) de Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl foram dissolvidos em 3 mL de metanol seguido por adição de uma solução aquosa de NaOH (2N), e então agitados em TA por 30 min. Com pH mantido a 12, a reação foi agitada em banho de gelo for 10 min até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF. Com pH ajustado para 7 com HCI 2N, o líquido reacional was concentrado sob pressão reduzida, e o resíduo foi diluído em 2 mL de salina saturada, ajustado para pH 2 com HCI 2N, e então extraído 3 vezes com acetato de etila (5 mLx 3). a fase acetato de etila combinada foi seca em sulfato de sódio anidro e filtrada, e o filtrado foi então concentrado sob pressão reduzida em TA para fornecer 509 mg (91,6%) do composto título como sólido incolor. EI-MS (m/z) 547 [M - H]_.
[0179]Preparação de conjugados ternários de PAK/imidazolina/RGD (compostos
53/95 de fórmula geral 1-1-4): li, Ik, II
Exemplo 63. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Pro-AlaLys(Z)]- Lys-OMe}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0180]Em um banho de gelo, a solução de 548 mg (1 mmol) de Boc-Pro-AlaLys(Z), 135 mg (1 mmol) de HOBt e 250 mg (1 mmol) de DCC em 10 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 480 mg (1 mmol) de
1,3-dioxo-2-[(4’-oxiacetil-Lys-OMe)fenil]-4,4,5,5- tetrametilimidazolina e 100 mg (1 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 40:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 876 mg (87%) do composto título como sólido azul. Mp 77 - 80°C. =-
12,6(c = 0,16, MeOH). ESI-MS(m/z) 1003 [M + Na]+. IR (KBr): 3315, 3069, 2937, 1671, 1531, 1449, 1394, 1364, 1302, 1167, 1132, 1054, 836, 743, 698, 596, 541,458 cm'1.
Exemplo 64. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Pro-AlaLys(Z)]- Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0181]Em um banho de gelo, 980 mg (1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys- OMe}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina foram dissolvidos em 3 mL de metanol seguido por adição de uma solução aquosa de NaOH (2N), e então agitada em TA por 30 min. Com pH mantido a 12, a reação foi agitada em banho de gelo por 10 min até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF Com pH ajustado para 7 com HCI 2N, o líquido reacional foi concentrado sob pressão reduzida, e o resíduo foi diluído em 2 mL de salina saturada, ajustados para pH 2 com HCI 2N, e então extraído 3 vezes com acetato de etila (5 mLx 3). A fase acetato de etila combinada foi seca em sulfato de sódio anidro e filtrada, e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida em TA para fornecer 867 mg (80%) do composto título como sólido azul. EI-MS (m/z) 965 [M - H]_.
54/95
Exemplo 65. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Pro-AlaLys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina [0182]Em um banho de gelo, a solução de 483 mg (0,5 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’oxiacetil-{Nw-[Boc-Pro- Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0,5 mmol) de HOBt e 126 mg (0,6 mmol) DCC em 20 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 442 mg (0,5 mmol) de HCI Arg(NO2)-GlyAsp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl e 50 mg (0,5 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 421 mg (42%) do composto título como sólido azul. Mp 97 - 100 °C. [a]2, =-42,5 (c = 0,14, MeOH). ESI-MS(m/z) 1697 [M + H]+. IR(KBr) 3298, 3070, 2935, 2869, 1642, 1534, 1450, 1369, 1253, 741, 697, 596 cm'1.
Exemplo 66. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Pro-AlaLys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0183]Em um banho de gelo, a solução de 483 mg (0,5 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’oxiacetil-{Nw-[Boc- Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0,5 mmol) de HOBt e 126 mg (0,6 mmol) de DCC em 20 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 432 mg (0,5 mmol) de HCI Arg(NO2)Gly-Asp(OBzl)-Val-Obzl e 50 mg (0,5 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 357 mg (37%) do composto título como sólido azul. Mp 117 - 120°C. [a]2^ =-22,3 (c = 0,17, MeOH). ESI-MS(m/z) 1620 [M + H]+. IR(KBr) 3303, 3072, 2935, 1644, 1533, 1451, 1394, 1364, 1255, 1167, 745, 697, 597 cm’1.
55/95
Exemplo 67. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw-[Boc-Pro-AlaLys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina [0184]Em um banho de gelo, a solução de 483 mg (0,5 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’oxiacetil-{Nw-[Boc-Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0,5 mmol) de HOBt e 126 mg (0,6 mmol) de DCC em 20 mL de THF anidro foi agitada por 20 min, e então a solução preparada com 439 mg (0,5 mmol) de HCI Arg(NO2)Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl e 50 mg (0,5 mmol) de N-metilmorfolina em 5 mL de THF anidro foi adicionada a mesma e reagida em TA por 24 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 20:1). A mistura reacional foi sujeita ao procedimento de rotina para fornecer 472 mg (48%) do composto título como sólido azul. Mp 111 - 114°C. [cr]|>0 =-15,3 (c = 0,13, MeOH). ESI-MS(m/z) 1667 [M + H]+. IR(KBr) 3296, 3071, 2935, 1641, 1534, 1394, 1253, 1170, 834, 745, 697, 594 cm’1.
Exemplo 68. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-[Nw-(Pro-Ala-Lys)-LysArg-Gly-Asp- Ser]fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina (Ij) [0185]Em um banho de gelo, 169 mg (0,1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys- Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina foram misturados com 6 mL de ácido trifluoracético e 1,5 mL de ácido trifluormetanosulfônico, e agitados for 1 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 1:1). A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi repetidamente lavado com etil éter anidro e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em água, ajustado para pH 8 com 25% de amônia aquosa, dessalinizado com Sephadex G10, e então purificado em uma coluna C18. As frações coletadass foram liofilizadas para fornecer 98 mg (80%) do composto título como sólido azul. Mp 127 - 128 °C. [α]„ =-22,4 (c = 0,13, MeOH). FT-MS(m/z) 1147.5907 [M + H]+, 2294.1814 [2M + H]+, 3440.7721 [3M + H]+, 4587.3628 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3204, 1672, 1543, 1436,1199,
56/95
1133, 837, 801,722, 598 cm’1.
Exemplo 69. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-[Nw-(Pro-Ala-Lys)-LysArg-Gly-Asp- Val]fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina (Ik) [0186]Em um banho de gelo, 162 mg (0,1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina foram misturados com 6 mL de ácido trifluoracético e 1,5 mL de ácido trifluormetanosulfônico, e agitados for 1 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 1:1). A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi repetidamente lavado com etil éter anidro e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em água, ajustado para pH 8 com 25% de amônia aquosa, dessalinizado com Sephadex G10, e então purificado em uma coluna C18. As frações coletadass foram liofilizadas para fornecer 96 mg (81%) do composto título como sólido azul. Mp 123 - 124°C. [α]„ =-24,6 (c = 0,13, MeOH). FT-MS(m/z) 1159.6271 [M + H]+, 2318.2542 [2M + H]+, 3476.8813 [3M + H]+, 4635.5084 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3388, 2959, 1666, 1540, 1494, 1198, 1134, 835, 801,720, 598 cm’1.
Exemplo 70. Preparação de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-[Nw-(Pro-Ala-Lys)-LysArg-Gly-Asp- Phe]fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina (II) [0187]Em um banho de gelo, 169 mg (0,1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4’-oxiacetil-{Nw[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}fenil}-4,4,5,5tetrametilimidazolina foram misturados com 6 mL de ácido trifluoracético e 1,5 mL de ácido trifluormetanosulfônico, e agitados por 1 h até o material de partida desaparecer como mostrado por CCF (CHCI3:MeOH, 1:1). A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi repetidamente lavado com etil éter anidro e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em água, ajustado para pH 8 com 25% de amônia aquosa, dessalinizado com Sephadex G10, e então purificado em uma coluna C18. As frações coletadas foram liofilizadas para fornecer
57/95 mg (81%) do composto título como sólido azul. Mp 153 - 154°C. [afâ =-12,6 (c = 0,16, MeOH). FT-MS (m/z) 1207.6271 [M + H]+, 2414.2542 [2M + H]+, 3620.8813 [3M + H]+, 4827.5084 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3385, 2938, 1659, 1541, 1450, 1391, 1251,1126, 963, 841,599, 456 cm’1.
Exemplo experimental 1. Experimentos na eliminação de radical NO por compostos la a II da presente invenção [0188]Ratos Wistar machos pesando 250 a 300 g foram deixados em jejum por 12 h antes da operação com livre acesso à água, e sacrificados por deslocamento cervical. Toracotomia foi imediatamente realizada e aorta torácica foi retirada, tecidos conectivos ligados a mesma foram dissecados, e vasos foram cortados em anéis de aorta com um comprimento de 3 a 5 mm e colocados em um banho de perfusão. O banho continha 15 mL de solução de Krebs-Henseleit e foi mantido em uma temperatura constante de 37°C, em que 95% O2 - 5% de CO2 foi carregado. A âncora a qual os anéis da aorta foram imobilizados foi conectada e um transdutor de tensão, e curvas de vasomoção foram gravadas em um gravador de duplo traço em um papel em velocidade de 1 mm/min. Com a tensão estática ajustada para 1,0 g e 30 min de equilíbrio, norepinefrina em uma concentração final de 10'8 M foi dosada para permitir a aorta contrair para pré-excitação. Norepinefrina foi lavada, seguido por 30 min de equilíbrio, e norepinefrina foi adicionada no banho a uma concentração final de 10'8 M. Quando a tensão de contração estava constante em um nível de platô, 20 pL de salina normal (branco), uma solução de 20 pL de qualquer um dos compostos Ia a II em salina normal (em uma concentração final de 5χ10'6 M), ou 20 pL de solução de eliminação de radical livre NO (1,3-dioxo-2-(4'-oxiacetoxil-fenil)-4,4,5,5tetrametilimidazolina, TMMZ) em salina normal (em uma concentração final de 5x10' 6 M) foram adicionados (em uma concentração final de 10'6 Μ). A habilidade de eliminar NO das drogas foi expressa como uma percentagem de inibição de acetilcolina induziu vasodilação. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 1.
58/95 [0189]Como mostrado nos resultados experimentais, la a II foram capazes de inibir o efeito de vasodilatação de acetilcolina em pedaços de vasos por eliminar o NO. Tal como, por ligação de um peptídeo trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK e um peptídeo alvo RGDS, RGDV ou RGDF a um eliminador de radical livre (1,3-dioxo-2(4'-oxiacetoxil-fenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, TMMZ) através de Lys, 9 compostos tiveram atividade substancialmente maior na inibição de vasodilatação induzida por acetilcolina que TMMZ, 2 compostos tiveram a mesma atividade na inibição de vasodilatação induzida por acetilcolina como TMMZ, e um composto foi menor ativo na inibição de vasodilatação induzida por acetilcolina que TMMZ. Entre os 12 compostos sob avaliação, 4 compostos tiveram uma percentagem de inibição maior que 30%, e esses 4 compostos foram posicionados pela atividade na inibição de vasodilatação induzido por acetilcolina como le > Ih > lb > If. Isto demonstrou que a atividade da fração TMMZ em eliminar os radicais NO livres foi geralmente melhorada por ligação do peptídeo trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK e o peptídeo alvo RGDS, RGDV ou RGDF para o eliminador de radical livre TMMZ através de Lys.
Tabela 1. Percentagem de inibição de la a II da vasodilação induzida por acetilacolina
Compostos Percentagem de inibição (Média ± DP %)
TMMZ 15,47 ±2.20
Ia 22,82 ±3.27 a
Ib 35,32 ± 4.74 a
Ic 21,78 ±3.11 a
Id 17,60 ±2.75 D
le 41,28 ±3.27 a
If 32,55 ± 2.55 a
Ig 24,40 ±3.60 a
Ih 37,54 ± 1.84 a
li 13,75 ±2.07 D
1 27,22 ±2.68 a
Ik 11,13 ±2.92 c
II 22,62 ±3.60 a
n = 6 ; a) p<0,01 vs. TMMZ ; b) p > 0,05 vs. TMMZ ; c) p<0,05 vs. TMMZ
59/95
Exemplo experimental 2. Experimentos na lise do coágulo euglobina por Compostos la a II da presente invenção [0190]Sangue de porco foi tomado e misturado com 3,8% de citrato de sódio em uma proporção de volume de 9:1, imediatamente centrifugado a 3000 r/min por 10 min, e plasma pobre em plaqueta foi separado. 2 mL de plasma de porco pobre em plaqueta e 36 mL de água ultrapura foram adicionadas em um tubo de centrifugação de 50 mL. Em cada tubo, 0,4 mL de ácido acético (1%) foral adicionados e completamente misturado, e o tubo foi colocado em um refrigerador a 4o C por 10 min e então centrifugado a 3000 r/min por 10 min. Os tubos de centrifugação foram invertidos, e então a parede interna dos tubos foi seca usando um papel de filtro após o líquido ser drenado. Os concentrados euglobuina resultando a partir de centrifugação foi liofilizada por cerca de 40 min e raspado. Cerca de 35 mg de euglobuina foi tomada e dissolvida em 7 mL de tampão borax (pH 9.28). A euglobuina foi em sua maioria dissolvida após 1 h, em que 0,7 mL de solução CaCI2 (25 mM) foram adicionados e imediatamente colocados em uma placa de vidro 10 x 10 cm com uma espessura de cerca de 1 mm. Após a formação do coágulo, 10 pL de salina normal, ou 10 pL de uma solução de um dos compostos de la a II em salina normal (1 mM) ou 10 pL de uma solução de uroquinase em salina normal (0,8 mg/mL) foram pipetados e colocados na placa de coágulo, com um intervalo entre cada duas gotas mais que
1,5 cm, e cada amostra foi colocada 3 vezes. O diâmetro do círculo da lise do coágulo foi medido após 4 h, e as leituras são listadas na Tabela 2.
[0191]Como mostrado nos resultados experimentais, por ligação de um peptídeo trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK e um peptídeo alvo RGDS, RGDV ou RGDF a um eliminador de radical livre TMMZ através de Lys, todos os compostos exibiram atividade de lise de coágulo euglobulina.
Tabela 2. O diâmetro de lise de coágulo euglobulina após 4 h de tratamento la-ll
Compostos Diâmetro (Média ± DP mm)
60/95
Salina Normal 2,9 ± 0.6 a
uroquinase 10,7 ± 0.4 a
la 4,0 ±0.0
Ib 5,2 ±0.3
Ic 3,8 ±0.3
Id 5,2 ±0.3
le 5,5 ±0.3
If 4,5 ±0.5
Ig 5,2 ±0.3
Ih 4,2 ±0.3
li 4,0 ±0.0
1 4,0 ±0.0
Ik 4,5 ±0.5
II 4,2 ±0.3
n=3 ; a) p < 0.01, vs. la-l
Exemplo experimental 3. Experimentos de trombólise in vitro para compostos la a II da presente inveção [0192]Ratos SD (machos, 350 a 400 g) foram anestesiados por injeção intraperitoneal de uma solução uretano em uma dose de 1200 mg/kg. Os ratos anestesiados foram fixados em uma posição supina, e a artéria carótida comum direita foi dissecada, grampeada no terminal proximal com um grampo arterial, e penetrado com uma sutura nas terminações proximal e distai, respectivamente. A sutura na terminação distai é grampeada fortemente por um grampo hemostático na pele. Canulação foi feita na terminação distai, o grampo arterial foi removido, e o sangue arterial total foi recarregado em um recipiente de 50 mL previamente tratado com óleo silicone. 0,8 mL de sangue arterial de rato foi injetado em um tubo de vidro verticalmente fixado (20 mm em comprimento, com um diâmetro interno de 4 mm e um diâmetro externo de 5 mm, selado com uma tampa de borracha no fundo), em que foi imediatamente inserido um parafuso de imobilização de trombo de aço inoxidável. O parafuso de imobilização de trombo, formado por bobinamento de um fio de aço inoxidável tendo um diâmetrod e 0,2 mm, teve uma parte espiral de 18 mm em comprimento, 15 bobinas cada tendo um diâmetro de 1,8 mm, e uma haste de 7,0 mm em comprimento que foi conectada à parte espiral e teve uma forma tipo ponto de interroga
61/95 ção. 40 min após o sangue foi coagulado, a tampa de borracha no fundo do tubo de vidro foi removido, o tronco do parafuso de imobilização de trombo foi cortado por fórceps, e o parafuso de imobilização de trombo envolvido no trombo foi cuidadosamente tirado do tubo de vidro. O parafuso foi então suspenso e mergulhado em água triplamente destilada para remover sangue excessivo, e acuradamente pesado após 1 h. O trombo foi suspenso em 8 mL de salina normal, ou uma solução de compostos la-ll em salina normal (em uma concentração de 100 nM), ou uma solução de ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK em salina normal (em uma concentração de 100 nM), ou uma solução de uroquinase em salina normal (100 lU/mL), então agitada a 37° C em um agitador termostático (53 r/min), e removido após 2 h e acuradamente pesado para determinar o peso do trombo. A diferença na massa do trombo antes e após a administração foi calculada, e os resultados são listados na Tabela 3.
[0193]Como mostrado nos resultados experimentais, por ligação de um peptídeo trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK e um peptídeo alvo RGDS, RGDV ou RGDF a um eliminador de radical livre TMMZ através de Lys, todos os compostos exibiram atividade trombolítica in vitro substancial. Desde que a atividade de Ia a Ic foi comparável àquela de ARPAK, a atividade de Id a If foi comparável àquela de GRPAK, a atividade de Ig a li foi comparável àquela de RPAK, e a atividade de Ij a li foi comparável àquela de PAK, em uma lado a atividade trombolítica in vitro de la a II pode ser atribuído à atividade do peptídeo trombolítico e por outro a ligação do peptídeo trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK e o peptídeo alvo RGDS, RGDV ou RGDF ao eliminador radical livre TMMZ através de Lys não abate a atividade do peptídeo trombolítico.
Tabela 3. Atividade trombolítica in vitro por 2 h de tratamento de la-11
Compostos Peso de redução do trombo (Média ± DP mg)
Salina Normal 16,67 ± 1.86 a
uroquinase 58,33 ± 4.08a
ARPAK 26,35 ±3.10
Ia 28,50 ±2.59
Ib 28,17 ±2.31
62/95
Ic 27,33 ±2.07
GR PAK 15,47 ±2.61
Id 14,17 ±3.55
le 14,00 ±1.41
If 15,29 ±3.36
RPAK 26,01 ±3.11
ig 27,83 ±2.56
Ih 29,33 ±3.01
li 24,83 ±1.17
PAK 26,67 ±3.20
1 26,16 ±3.15
Ik 25,00 ±1.54
II 25,83 ±2.31
n=6 ; a) p < 0,01, vs. la-ll
Exemplo experimental 4. Experimentos de trombólise in vivo para compostos la a II da presente invenção [0194]Ratos SD (machos, 220 a 230 g) foram anestesiados por injeção intraperitoneal de uma solução uretano em uma dose de 1200 mg/kg. Os ratos de anestesiados foram fixados em uma posição supina, e a artéria carótida comum direita foi dissecada, grampeada e a terminal proximal com um clip arterial, e penetrado com uma sutura nas terminações proximal e distai, respectivamente. A sutura na terminação distai é grampeada firmemente por um grampo hemostático na pele. Canulação foi feita na terminação distai, o grampo arterial fo removido, e cerca de 1 mL de sangue arterial foi colocado em um eppendorf de 1 mL. 0,1 mL de sangue arterial de rato foi injetado em um tubo de vidro verticalmente fixado (15 mm em comprimento, com um diâmetro interno de 2,5 mm e um diâmetro externo de 5,0 mm, selado com uma tampa de borracha no fundo), em que foi imediatamente inserido um parafuso de imobilização de trombo feito de aço inoxidável. O parafuso de imobilização de trombo, formado por bobinamento de um fio de aço inoxidável tendo um diâmetro de 0,2 mm, tiveram uma parte espiral de 12 mm em comprimento, 15 rolos cada tendo um diâmetro de 1,8 mm, e uma haste de 1,0 mm em comprimento que foi conectado à parte espiral e teve uma forma tipo ponto de interrogação. 15 min após o sangue foi coagulado, a tampa de borracha no fundo do tubo de vidro foi removido, a haste do
63/95 parafuso de imobilização de trombo foi cortado por fórceps, e o parafuso de imobilização de trombo envolvido em trombo foi cuidadosamente tirada do tubo de vidro e então acuradamente pesado.
[0195]Uma cânula bypass foi composta de 3 segmentos. O segmento do meio foi um tubo de polietileno tendo um comprimento de 60,0 mm e um diâmetro interno de
3,5 mm. Os segmentos e ambas terminações foram similares a tubos de polietileno tendo um comprimento de 100,0 mm, um diâmetro interno de 1,0 mm e um diâmetro externo de 2,0 mm, um terminal do qual foi puxado para formar uma ponta, com um diâmetro externo de 1,0 mm, que pode ser inserido na artéria ou veia carótida do rato, e a outra terminação da qual foi revestida por um tubo polietileno tendo um comprimento de 7,0 mm e um diâmetro externo de 3,5 mm (espessura a fim de ser inserida no tubo de polietileno do segmento médio). A parede interna da cânula do segmento 3 foi inteiramente sililada (com 1% de óleo de silicone em etil éter). O parafuso de imobilização de trombo envolvido no trombo foi colocado no tubo de polietileno do segmento médio, e ambas as terminações do tubo cobriram as terminações espessadas dos tubos de polietileno. A cânula foi enchida com uma solução heparina em salina normal (50 lU/kg) através da ponta final pelo uso de um injetor e estava pronto para uso. A traquéia do rato anestesiado foi então dissecada e canulação traqueal foi feita. A veia carótida externa esquerda do rato foi dissecada, e penetrada com uma sutura nas terminações proximal e distai, respectivamente. Uma incisão aberta irregular foi cuidadosamente feita na veia carótida externa esquerda exposta, e a ponta da cânula bypass preparada como descrito acima foi inserida em uma terminação proximal da incisão aberta na veia carótida externa esquerda, fora da haste do parafuso de imobilização do trombo no segmento médio da cânula bypass (que acomodou o parafuso de imobolização de trombo acuradamente pesado). Uma quantidade de heparina em salina (50 lU/kg) foi injetada através da ponta na outra terminação pelo uso de um injetor. Neste momento, sem remover o injetor do tubo
64/95 etileno, o tubo entre o injetor e o tubo polietileno foi grampeado com forceps. O fluxo de sangue foi parado por grampeamento da terminação proximal da artéria carótida comum direita com um clip arterial, e uma incisão aberta irregular foi cortada cuidadosamente através da artéria carótida comum perto do grampo. O injetor foi retirado da ponta do tubo de polietileno, e a ponta do tubo polietileno foi então inserida na terminação proximal da incisão aberta na artéria. Ambas as terminações da cânula bypass foram fixadas à artéria ou veia com #4 suturas.
[0196]Salina normal (3 mL/kg), ou uma solução uroquinase na salina normal (em uma dose de 20000 lU/kg), ou uma solução de um dos compostos la-ll em salina normal (em uma dose de 0,1 pmol/kg), ou uma solução ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK em salina normal (em uma dose de 0,1 pmol/kg), ou uma soluc'ão ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK em salina normal (e uma dose de 1 pmol/kg), foi conectado a uma posição perto da veia fora do parafuso de imobilização de trombo pelo uso de uma agulha couro cabeludo para punção da cânula bypass (que acomodou o parafuso de imobilização de trombo acuradamente pesado). O grampo da artéria foi então removido para permitir sangue fluir a partir da artéria à veia através da cânula bypass. Um modelo de trombólise bypass arteriovenoso em rato foi então estabilizado. A solução no injetor foi lentamente injetado no sangue, permitindo salina normal (controle branco), uroquinase (controle positivo), ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK (controle componente), ou la-ll para atuar no trombo através da circulação de sangue na ordem de veia-coração-artéria. O processo teve o tempo medido no início da injeção, e o parafuso de imobilização de trombo foi removido a partir da cânula de bypass após 1 h e pesado acuradamente. A diferença na massa do parafuso de imobilização de trombo na cânula de bypass de rato antes e após a administração foi determinada, e os resultados experimentais são mostrados na Tabela 4.
[0197]Como mostrado nos resultados experimentais, não somente fez os compostos la-lc, obtidos pela ligação de um peptídeo trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK ou
65/95
PAK e um peptídeo alvo RGDS, RGDV ou RGDF a um eliminador de radical livre TMMZ através de Lys, exibem atividade trombolítica em uma dose de 0,1 pmol/kg, a potência de sua atividade foi também comparável àquela do peptídeo trombolítico correspondente ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK em uma dose de 1 pmol/kg. Tal como, pela ligação do peptídeo trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK e o peptídeo alvo RGDS, RGDV ou RGDF ao eliminador de radical livre TMMZ através de Lys, a dose efetiva pode ser diminuída por 10 vezes.
Tabela 4. Atividade trombolítica in vivo de la-ll
Compostos Redução do peso no trombo (Média ± DP mg)
Salina Normal 11,05 ± 1.51 a
uroquinase 18,02 ±2.32a
ARPAK 15,20 ±2.55
Ia 15,39 ±3.19
Ib 14,35 ±2.95
Ic 15,79 ±3.07
GRPAK 15,47 ±2.61
Id 14,17 ±3.55
le 14,00 ±1.41
If 15,29 ±3.36
RPAK 15,67 ±2.61
ig 16,35 ±2.42
Ih 15,37 ±1.82
li 15,73 ±2.95
PAK 15,00 ±2.61
1 14,89 ±1.84
Ik 15,47 ±2.61
II 16,21 ±2.84
n = 10 ; a) p < 0.01 vs. la-ll
Exemplo experimental 5. Experimentos anti-trombo in vivo para compostos la a II da presente ivenção [0198]Ratos SD (machos, 220 a 230 g) foram aleatoriamente divididos com 11 ratos em cada grupo. Os ratos foram alimentados em um estado de repouso por 1 dia e deixados em jejum por uma noite. Aos ratos foram dados salina normal (em uma dose de 3 mL/kg), uma solução de um dos compostos la-ll em salina normal (em uma dose de 0,1 pmol/kg), uma solução do peptídeo de direcionamenteo RGDS,
66/95
RGDV ou RGDF em salina normal (em uma dose de 10 pmol/kg), ou aspirina (em uma dose de 33 mg/kg) por gavagem. Após 30 min, os ratos foram anestesiados com uma solução de 20% de uretano, e a artéria carótida direita e a veia carótida esquerda foram dissecadas. Uma cânula foi preenchida com heparina de sódio em salina normal, e uma terminação da mesma foi inserida na veia esquerda, enquanto a outra terminação foi injetada com uma certa quantidade de heparina de sódio para anticoagulação com um injetor e então inserida na artéria direita. Sangue fluiu a partir da artéria direita para a veia esquerda através do tubo polietileno, e o fio ligado com trombo foi tomada após 15 min e o peso do mesmo foi gravado. O peso do trombo úmido foi determinado por substração do peso do fio a partir do peso total. Os resultados são mostrados na Tabela 5.
[0199]Como mostrado nos resultados experimentais, não somente fizeram compostos la-lc, obtidos pela ligação de um peptídeo trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK e um peptídeo de direcionamento RGDS, RGDV ou RGDF a um eliminador de radical livre TMMZ através de Lys, exibem atividade anti-trombo em uma dose oral de 0,1 pmol/kg, a potência de sua atividade foi também comparável àquela do peptídeo alvo RGDS, RGDV ou RGDF em uma dose de 10 pmol/kg. Tal como,pela ligação o peptídeo trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK e o peptídeo de direcionamenteo RGDS, RGDV, ou RGDF ao eliminador radical livre TMMZ via Lys, a dose efetiva pode ser diminuída por 100 vezes.
[0200]Tabela 5. Atividade anti-trombo in vivo de la-ll_________
Compostos Peso úmido de trombo (Média ± DP mg)
salina normal 27,38 ±2.62 a
aspirina 12,85 ±2.49 a
RGDS 20,02 ±2.35
RGDV 21,26 ±2.07
RGDF 19,55 ±2.21
Ia 24,32 ±2.10
Ib 20,14 ±2.45
Ic 20,50 ±2.26
Id 19,46 ±1.84
67/95
le 16,92 ±1.53
If 17,99 ±2.47
Ig 17,89 ±2.05
Ih 18,24 ±1.89
li 17,79 ±2.02
1 19,45 ±1.79
Ik 22,25 ±2.25
II 19,32 ±2.56
n=11 ; a) p < 0.01 vs. la-ll [0201 ]Estabelecimento de modelos animais para avaliação da eficácia dos compostos de acordo com a presente invenção no tratamento de pacientes com derrame [0202](1) O protocolo experimental de rato descrito aqui foi de acordo com o guia Geneva nos experimentos animais e aprovados pelo comitê ético universitário. Ratos SD machos saudáveis de categoria limpa, pesando 280 a 305 g, foram comprados do Vital River Laboratories of Experimental Animals. Esses ratos foram aleatoriamente usados para preparação de trombo ou estabelecimento de modelos de derrame.
[0203](2) Uma solução de hidrato de cloral 10% foi injetada intraperitonealmente nos ratos SD em uma dose de 400 mg/kg de peso corpóreo para anestesia. A artéria carótida foi dissecada, 15 mL de sangue arterial fresco foi retirado, e alíquotas de 10 pL foram então adicionadas em frascos EP de 1,5 mL. O trombo formado foi mantido em TA por 2 h e então em um refrigerador -20° C por 22 h. Quando usado, 0,5 mL de salina foram adicionados ao trombo que foi quebrado pelo uso de uma haste de vidro, de forma a preparar uma solução de suspensão de homogenato de trombo, com um volume de cerca de 0,1 mm3 para cada pedaço de trombo.
[0204](3) Uma solução de hidrato de cloral 10% foi injetada intraperitonealmente em ratos SD em uma dose de 400 mg/kg de peso corpóreo para anestesia. A artéria carótida foi dissecada, 15 mL de sangue arterial fresco foi retirado e alíquotas de 10 pL cada foram então adicionadas em frascos de EP de 1,5 mL. O trombo formado foi primeiramente mantido em TA por 24 h. Quando usado, 1,5 mL de salina foi adicionado ao trombo que foi quebrado pelo uso de uma faste de vidro, de forma a prepa
68/95 rar uma solução de suspensão de homogenato de trombo, com um volume de cerca de 0,1 mm3 para cada pedaço de trombo.
[0205](4) Uma solução de hidrato de cloral 10% foi injetada intraperitonealmente em ratos SD machos em uma dose de 400 mg/kg de peso corporal para anestesia. Uma incisão aberta longitudinal foi feita no centro do pescoço, e o tronco da artéria carótida comum direita foi dissecada (cerca de 3 cm em comprimento). Ramificações de artéria externa carótida foram cada dissecadas e ligadas no nível hiode, e a artéria interna carótida foi dissecada na parte edemaciada do pescoço. As incisões abertas na artéria interna carótida e a terminação proximal da artéria carótida comum foram ocluídsa respectivamente com grampos arteriais não invasivas, e a terminação distai da artéria externa carótida foram ligadas. Um catéter contendo 0,5 mL de suspensão de trombo em salina normal foi inserida no tronco da artéria carótida externa. Ao mesmo tempo quando o grampo na artéria carótida interna foi liberada, 0,5 mL da suspensão de trombo em salina normal no catéter lentamente fluiu a partir da artéria carótida externa para sua terminação proximal, e então injetada nas artérias no cérebro através da artéria carótida interna. Subsequentemente, a terminação proximal da artéria carótida interna foi ligada, os grampos arteriais na artéria carótida interna e a artéria carótida comum foram liberados, e o fluxo de sangue foi restabelecido. A veia jugular externa principal foi dissecada, e salina normal (controle branco) ou uma solução dos compostos da presente invenção na salina normal foi infusionada através da veia jugular externa. Após a ferida ser costurada, 20000 IU de penicilidade foi intramuscularmente injetada para prevenção a partir da infecção. O modelo do tratamento imediato após o início do derrame foi então estabelecido.
[0206](5) Uma solução de hidrato de cloral 10% foi injetada intraperitonealmente em ratos SD machos em uma dose de 400 mg/kg de peso corpóreo para anestesia. Uma incisão aberta longitudinal foi feita no centro do pescoço, e o tronco da artéria carótida comum direita foi dissecado (cerca de 3 cm em comprimento). Ramificações
69/95 da artéria carótida externa foram cada dissecadas e ligadas ao nível hioide, e a artéria interna carótida foi dissecada na parte edemacionada do pescoço. A incisão aberta na artéria carótida interna e a terminação proximal da artéria carótida comum foram ocluídas respectivamente com grampos arteriais não invasivos, e a terminação distai da artéria carótida externa foi ligada. Um catéter contendo 0,5 mL de suspensão de trombo em salina normal foi inserida no tronco da artéria carótida externa. Ao mesmo tempo, quando o grampo na artéria interna carótida foi liberado, 0,5 mL da suspensão do trombo em salina normal no catéter lentamente fluiu a partir da artéria carótida externa ao seu terminal proximal, e então foi injetado nas artérias no cérebro através da artéria carótida interna. Subsequentemente, a terminação proximal da artéria carótida foi ligada, os grampos arteriais na artéria carótida interna e a artéria carótida comum foram liberadas, e o fluxo sanguíneo foi restaurado. Após a ferida ser costurada, 20000 IU de penicilina foi intramuscularmente injetados para prevenção de infecção. Após 4 h, 6 h ou 24 h, salina normal (controle branco) ou uma solução dos compostos da presente invenção em salina normal foi infusionada através da veia da cauda. Os modelos de rato de 4 h, 6 h e 24 h pós início do tratamento de derrame foram então estabelecidos.
[02071Estabelecimento de modelos animais para avaliação da eficácia dos compostos de acordo com a presente invenção após 4 h, 6 h, e 24 h a partir do início do derrame [0208](1) A eficácia após tratamento imediato, 4 h pós-início do tratamento, e 6 h pós-início do tratamento do derrame de ratos com os compostos de acordo com a presente invenção significa o resultado da classificação dos comportamento dos ratos 24 h após os ratos recuperarem a consciência. Os comportamentos incluem a forma de andar, o grau de inclinar a pálpebra do olho direito, o grau de regidez a cauda, tensão dos músculos, o grau de inclinação da cabeça, a força suporte dos membros, e o estado de morte.
70/95 [0209](2) A eficácia em 24 h pós-início do tratamento de derrame em ratos com os compostos de acordo com a presente invenção significa o resultado de observação dos comportamentos dos ratos 24 h após os ratos recuperarem a consciência. Os comportamentos incluem a forma de andar, o grau de inclinar a pálpebra do olho direito, o grau de regidez a cauda, tensão dos músculos, o grau de inclinação da cabeça, a força suporte dos membros, e o estado de morte.
[0210](3) A eficácia em ratos com derrame tratamentos uma vez com o composto da presente invenção foi comparada à eficácia em ratos com derrame tratamentos uma vez com salina.
[0211](4) Ratos com derrame com tratamento contínuo foram injetados com os compostos da presente invenção na salina normal a cada 24 h através da veia da cauda. No próximo dia, os vídeos foram gravados, e comparação foi feita entre os resultados gravados.
[0212]Resultados dos testes dos compostos la a II de acordo com a presente invenção nos modelos animais acima são como seque:
Exemplo experimental 6. Experimentos em ratos que receberam tratamento imediato após derrame iniciado com compostos la a II da presente invenção [0213]A atividade anti-derrame in vivo da presente invenção foi representada por classificação de função neural, com uma classificação inferior indicando atividade mais alta. Uma solução de hidrato de cloral 10% (400 mg/kg) foi injetada intraperitonealmente em ratos machos SD (250-300 g) para anestesia. Uma incisão aberta de 2 cm em comprimento foi longitudinalmente feita levemente na direita ao centro do pescoço, e o tronco da artéria carótida comum direita, artéria carótida externa e artéria carótida interna foram dissecadas junto com a margem da lateral interna de músculos esternocleidomastóides. As incisões abertas na artéria carótida interna e a terminação proximal da artéria carótida comum foram ocluídas respectivamente com grampos arteriais não invasivos. Uma pequena incisão aberta foi feita através da
71/95 artéria carótida externa, e a terminação distai da artéria carótida externa foi ligada. O grampo arterial na terminação proximal da artéria carótida externa foi liberada, e 10 pL de sangue foi retirado antes da terminação proximal da artéria carótida comum ser novamente ocluída com o grampo arterial não invasivo. Os 10 pL de sangue retirados foram colocados em um frasco EP 1 mL e mantidos em TA por 30 min coagulação sanguínea, e então transferida em um refrigerador -20° C pro 1 h para permitir coagulação. Após 1 h, os coágulos sanguíneos foram retirados, em que 1 mL de salina foi adicionado, e então quebrado em microtrombos uniformes pelo uso de uma espátula de aço. A suspensão com microtrombos foi então transferida a um injetor de 1 mL até o uso. Ao mesmo tempo quando o grampo na artéria carótida interna do rato foi liberado, 1 mL de suspensão de trombo no injetor foi lentamente injetado a partir da artéria carótida externa do rato à sua terminação proximal, e a suspensão foi injetada no cérebro do rato através da artéria carótida interna. Subsequentemente, a terminação proximal da artéria carótida externa foi ligada, os grampos arteriais na artéria carótida interna e a artéria carótida comum foram liberados, e fluxo de sangue foi restaurado. A veia comum jugular dos ratos foi dissecada. A veia foi imediatamente ligada, 3 gotas de penicilina foram pingadas no local da ferida, a ferida foi costurada, e os animais foram o grupo de operação simulada. Ou injeção de uroquinase em salina normal (grupo controle positivo, em uma dose de 20000 lU/kg), salina normal (grupo controle branco, em uma dose de 3 mL/kg), TMMZ em salina normal (grupo controle componente, em uma dose de 1 pmol/kg), um peptídeo trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK em salina normal (grupo controle componente, em uma dose de 1 pmol/kg), ou um dos compostos la-ll em salina normal (em uma dose de 0,1 pmol/kg) ser realizado. 24 h após os ratos estare acordados, o grau de dano na função neural foi avaliada pelo método Zealonga. Uma classificação de 0 indica nenhum sinal de perda na função neural, 1 indicou os membros dianteiros no lado não danificado pode não puderam esticar, 2 indicou a direção de caminhada no
72/95 lado não danificado, 3 indicou andar atrás da própria cauda em círculos para o lado não danificado, 4 indicou caminhar não voluntário com distúrbio de consciência, e 5 indicou morte. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 6.
[0214]Como mostrado nos resultados experimentais, os compostos la-lc, obtidos pela ligação de um peptídeo trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK e um peptídeo direcinado RGDS, RGDV ou RGDF a um eliminador do radical livre TMMZ via Lys, exibiu atividade anti-derrame em uma dose de 0,1 pmol/kg, embora uroquinase não exiba atividade anti-derrame em uma dose de 20000 lU/kg. Similarmente, o peptídeo trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK não exibem atividade antiderrame em uma dose de 1 pmol/kg. Tal como, pela ligação do peptídeo trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK ou PAK e o peptídeo com direcionamento RGDS, RGDV ou EGDF ao eliminador de radical livre TMMZ via Lys, os compostos foram providos com uma função anti-derrame. Especialmente, na dose de 1 pmol/kg, 4 compostos tiveram atividade anti-derrame comparáveis àqueles da uroquinase em uma dose de 20000 lU/kg, e 8 compostos tiveram atividade anti-derrame notavelmente maior que a uroquinase em uma dose de 20000 lU/kg.
Tabela 6. Atividade anti-derrame in vivo de la-lc
Composto Classificação da função neural (Média ± DP)
salina normal 3,07 ±1.04
uroquinase 1,90 ± 1.37 a
TMMZ 2,83 ± 0.75 a
ARPAK 2,21 ± 0.94 a
Ia 1,00 ±1.01°
Ib 0,56 ± 1.01 c
Ic 0,89 ± 1.36 c
GRPAK 2,38 ±0.92 a
Id 1,22 ± 1.32 0
le 0,44 ± 1.01 c
If 0,60 ±0.84 c
RPAK 2,38 ± 0.97a
ig 1,00 ± 1.19 0
Ih 1,33 ± 1.22 D
li 0,87 ± 1.05 c
73/95
PAK 2,42 ±0.95 a
1 0,90 ± 1.10 c
Ik 0,56 ± 0.53 c
II 0,50 ± 0.53 c
n = 10 ; a) p > 0,05 vs. salina normal; b) p > 0,05 vs. uroquinase; p< 0.01 vs. salina normal; c) p< 0,01 vs. salina normal ou uroquinase
Exemplo experimental 7. Experimentos no volume do infarto cerebral em ratos que receberam tratamento imediato com compostos la a II da presente invenção após o início do derrame [0215]Após os ratos estarem despertos por 24 h e avaliados por seu grau de dano na função neural no Exemplo experimental 6, eles foram anestesiados com uretano seguido por decapitação imediata e remoção do cérebro. Tecidos cerebrais foram mantidos em um refrigerador de -20° C por 2 h, e seções coronais de cerca de 2 mm foram sucessivamente cortadas a partir da terminação pré-frontal por um total de 6 seções, e então colocadas em uma solução de TTC 2% para incubar no escuro a 37° C por 30 min. A mudança de cor nas seções cerebrais foi observada: tecidos cerebrais normais foram corados em vermelho por TTC, enquanto tecidos cerebrais isquêmicos, isto é, tecidos cerebrais com infrações, pareceram em uma cor branca. Fotografias foram tirads pelo uso de uma câmera digital e processadas com programa de estatística SPSS, e o volume de infarto nos tecidos cerebrais e o volume dos tecidos cerebrais normais nas seções coronais foram calculados. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 7.
[0216]Como mostrado nos resultados experimentais, não somente fazem os compostos la-lc, obtidos pela ligação de um peptídeo trombolítico ASPAK, GRPAK, RPAK ou PAK e um peptídeo com direcionamento RGDS, RGDV ou RGDF a um eliminador de radical livre TMMZ através Lys, exibiu um efeito na redução do volume de infarto cerebral em ratos com derrame em uma dose de 0,1 pmol/kg, tal um efeito foi substancialmente mais potente que aquela de uroquinase em uma dose de 20000
74/95 lU/kg.
Tabela 7. Volume de infarto cerebral em ratos com derrame tratados com la-
Compostos Percentagem de volume de infarto (Média ± DP%)
salina normal 22,92 ±2,74
uroquinase 11,00 ±2,42 0
TMMZ 22,96 ±2,43 a
ARPAK 22,00 ±2,20 a
Ia 7,21 ±0,82
Ib 7,13 ±0,83
Ic 7,40 ±1,65
GRPAK 21,77 ±2,46 a
Id 8,21 ±1,91
le 6,44 ±1,51
If 7,47 ±1,31
RPAK 22,11 ± 2,25 a
ig 6,40 ±0,28
Ih 7,35 ±1,14
li 7,06 ±1,08
PAK 22,07 ±2,40 a
1 6,84 ±0,82
Ik 7,86 ±1,02
II 6,56 ±0,41
n = 10 ; a) p > 0.05, vs. salina normal; b) p<0.01 vs. salina normal e la-lc
Exemplo experimental 8: Experimentos em ratos que receberam tratamento imediato com doses diferentes do composto le da presente invenção após o início do derrame [0217]Qualquer análise e comparação de todos os resultados na presente invenção, composto le foi usado como o representativo, a fim de demonstrar o efeito terapêutico dose-dependente exibido pelos compostos la a II nos experimentos acima. Deve ser notado que outros compostos de la a II podem alcançar efeito terapêutico dose-dependente similar como composto le, desde que outros compostos de la a II alcançarem o mesmo efeito como composto le em eliminação de radical livre NO, lise de coágulo euglobulina, trombólise, ação anti-trombo, e tratamento de derrames nos ratos.
75/95 [0218]Uma solução de hidrato de cloral 10% (400 mg/kg) foi injetada intraperitonealmente em ratos SD machos (250 a 300 g) para anestesia. Uma incisão de cerca de 2 cm em comprimento foi longitudinalmente feita levemente na direita ao centro do pescoço, e a artéria carótida direita comum, artéria carótida externa e artéria carótida interna foram dissecadas junto com a margemda lateral interna de músculos esternocleidomastórides. A incisão aberta na artéria carótida e a terminação proximal da artéria carótida comum foram ocluídas respectivamente com grampos arteriais não invasivos. Uma pequena incisão foi feita na artéria externa carótida, e a terminação distai da artéria externa carótida foi ligada. O grampo arterial na terminação proximal da artéria externa carótida foi liberado, e 10 pL de sangue foram retirados antes da terminação proximal da artéria externa carótida comum ser novamente ocluída com um grampo arterial não invasiva. A retirada de sangue de 10 pL foi colocada em um frasco EP de 1 mL e mantida em TA por 30 min até a coagulação de sangue, e então transferida em um refrigerador a -20° C por 1 h para permitir a coagulação sólida. Após 1 h, os coágulos sanguíneos foram retirados, adicionados em 1 mL de salina, e então quebrados em microtrombos relativamente uniformes pelo uso de uma espátula de aço. A suspensão de microtrombos foi então transferida em um injetor de 1 mL até uso. Ao mesmo tempo quando o grampo na artéria carótida interna do rato foi liberado, 1 mL de suspensão de trombo no injetor foi lentamente injetada a partir da artéria carótida externa do rato a sua terminação proximal, e então foi injetada no cérebro do rato através da artéria carótida interna. Subsequentemente, a terminação proximal da artéria carótida externa foi ligada, os grampos arteriais na artéria carótida interna e a artéria carótida comum foram liberados, e fluxo sanguíneo foi restaurado. Injeção de uroquinase em salina normal (grupo controle positivo, em uma dose de 20000 lU/kg), tPA em salina normal (grupo controle positivo, em uma dose de 3 mg/kg), salina normal (grupo controle branco, em uma dose de 3 mL/kg), ou composto le em salina normal (em uma dose de 1 pmol/kg, 0,1 pmol/kg ou 0,1 pmol/kg)
76/95 foi realizada. 24 h após os ratos estarem acordados, o grau de dano na função neural foi avaliado pelo método Zealonga. Uma classificação de 0 indicou nenhum sinal de perda na função neural, 1 indicou que os membros frontais no lado não danificado podem não esticar, 2 indicou a direção de caminhada no lado não danificado, 3 indicou andar atrás da própria cauda em círculos para o lado não danificado, 4 indicou caminhar não voluntário com distúrbio de consciência, e 5 indicou morte. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 8. Como mostrado nos resultados, nos ratos recebendo tratamento imediato após o início do derrame com 1 pnmol/kg, 0,1 pnmol/kg e 0,01 pnmol/kg do composto le, a percentagem de ratos com uma classificação neural de 0 foi 60%, 30%, e 0 %, respectivamente; e a percentage de ratos com uma classificação de função neural de 1 foi 20%, 30%, e 10%, respectivamente. Então, isto mostra que a atividade anti-derrame do composto le foi dosedependente. Ainda, em ratos com derrame tratados com 20000 lU/kg de uroquinase e 3 mg/kg tPA, a percentagem de ratos com uma classificação de função neural de 0 foi 10% e 40%, respectivamente, e a percentagem de ratos com uma classificação de função neural de 1 foi 50% e 10%, respectivamente; em comparação, a eficácia de 1 pnmol/kg e 0,1 pnmol/kg do composto le foi obviamente superior.
Tabela 8. Atividade anti-derrame in vivo do composto le da presente invenÇão em diferentes doses
Compostos Classificações da função neural diária (Média ± DP) e número de ratos classificados
Classificação 0 Classificação 1 Classificação 2 Classificação 3 Classificação 4 Classificação 5
salina normal 0 2 3 5 1 0
uroquinase 1 5 0 3 1 0
tPA 4 1 1 3 1 0
I e 1 pnmol/ kg 6 2 0 2 0 0
100 nmol/k g 3 3 0 3 1 0
77/95
10 nmol/k g 0 1 6 1 1 0
η = 10 ; a) ρ< 0.01 vs. salina normal
Exemplo experimental 9. Experimentos em ratos recebendo 6 tratamentos sucessivos com 1 pmol/kg do composto le da presente invenção 4 horas após o início do derrame [0219]A eficácia foi representada pelas classificações de função neural, e um índice inferior indica eficácia maior. Uma solução de hidrato de cloral 10% foi injetada intraperitonealmente em ratos SD machos em uma dose de 400 mg/kg por peso corpóreo para anestesia. Uma incisão longitudinal foi feita no centro do pescoço, e o tronco da artéria carótida comum direita foi dissecada (cerca de 3 cm em comprimento). Ramificações da artéria carótida externa foram cada dissecadas e ligadas ao nível hieoide, e a artéria carótica interna foi dissecada na parte endemacionada do pescoço. A incisão aberta na artéria carótida interna e a terminação proximal da artéria carótida comum foram ocluídas respectivamente com grampos arteriais não invasivos, e a terminação distai da artéria carótida externa foi ligada. Um catéter contendo 0,5 mL da suspensão de trombo em salina normal foi inserido no tronco da artéria carótida externa. Ao mesmo tempo quando o grampo na artéria carótida interna foi liberado, 0,5 mL da suspensão do trombo em salina normal fluiu lentamente no catéter a partir da artéria carótida externa à sua terminação proximal e então foi injetada nas artérias no cérebro através da artéria carótida interna. Subsequentemente, a terminação proximal da artéria carótida foi ligada, os grampos arteriais na artéria carótida interna e a artéria carótida comum foram liberadas, e fluxo sanguíneo foi restabelecido. Após a ferida ser costurada, 20000 IU de penicilina foi intramuscularmente injetada para prevenção a partir da infecção. Após 4 h, composto le em salina normal (em uma dose de 1 pmol/kg, n=11), uroquinase na salina normal (em uma dose de 20000 lU/kg, n=6) ou tPA em salina normal (em uma dose de 3 mg/kg, n=6) foi infusionada através da veia da cauda. Infusão do composto le em salina
78/95 normal através da veia da cauda do rato foi realizada uma vez por dia por 6 dias consecutivos, observado por 7 dias. Os ratos foram comparados a eles mesmos a cada dia, e avaliados para grau de dano na função neural pelo método Zealonga. Alternativamente, infusão de uroquinase em salina normal através da veia da cauda do rato foi realizada uma vez por dia por dois dias consecutivos, os ratos foram comparados a eles mesmos a cada dia, e avaliados para o grau de dano na função neural pelo método Zealonga. Alternativamente, infusão de tPA em salina normal através da veia da cauda do rato foi realizada uma vez ao dia por dois dias consecutivos, os ratos foram comparados a eles mesmos a cada dia, e avaliados para o grau de danos na função neural pelo método Zealonga. Uma classificação de 0 indicou nenhum sinal de perda na função neural, 1 indicou que os membros frontais no lado não danificado podem não esticar, 2 indicou a direção de caminhada no lado não danificado, 3 indicou andar atrás da própria cauda em círculos para o lado não danificado, 4 indicou caminhar não voluntário com distúrbio de consciência, e 5 indicou morte. Os resultados experimentais são mostrados nas Tabelas 9-1,9-2 e 9-3.
[0220]0s dados na Tabela 9-1 demonstraram que, em ratos que receberam tratamento 4 h do início do derrame com uma dose de 1 1 pmol/kg do composto le a cada dia por 6 dias consecutivos, excluindo um que acidentalmente morreu no dia 2, 8 de 10 ratos remanescentes recuperados não tiveram sinal de perda da função neural enquanto o restante dos 2 ratos tiveram somente o sinal de perda leve na função neural. Então, composto le exibiu efeito terapêutico em uma dose de 1 pmol/kg no derrame além da janela de tratamento ouro.
Tabela 9-1. Eficácia em ratos recebendo tratamento com 1 pmol/kg de composto da presente invenção 4 h após o início do derrame__________________________
Tempo de Classificação Classificação da função neural diária (Média ± DP) e número de ratos classificados
Classificação 0 Classificação 1 Classificação 2 Classificação 3 Classificação 4 Classificação 5
Dia 1 1 rato 4 ratos 4 ratos 1 rato 1 rato 0
Dia 2 3 ratos 5 ratos 1 rato 1 rato 0 1 rato
79/95
Dia 3 5 ratos 5 ratos 0 0 0 0
Dia 4 7 ratos 3 ratos 0 0 0 0
Dia 5 8 ratos 2 ratos 0 0 0 0
Dia 6 8 ratos 2 ratos 0 0 0 0
Dia 7 8 ratos 2 ratos 0 0 0 0
[0221 ]0s dados na Tabela 9-2 demonstraram que, em ratos que receberam tratamento por 4 h após o início do derrame com uma dose de 20000 lU/kg de uroquinase a cada dia, 2 de 6 ratos morreram dentro de 48 h. Sob autópsia nos ratos mortos, ambos mostraram hemorragia em órgãos internos, particularmente hemorragia severa nos pulmões. Então, o regime de dose foi descontinuado após as duas doses. Nenhum rato recuperado após receber duas doses apresentou sinal de perda na função neural ou ter somente o sinal de perda leve na função neural.
Tabela 9-2. Eficária nos ratos recebendo tratamento com 20000 lU/kg de uroquinse 4 h após o início do derrame
Tempo de classificação Classificação da função neural diária (Média ± DP) e número de ratos classificados
Classificação 0 Classificação 1 Classificação 2 Classificação 3 Classificação 4 Classificação 5
Dia 1 2 ratos 3 ratos 1 rato
Dia 2 3 ratos 1 rato 1 rato
[0222]Os dados na Tabela 9-3 demonstraram que, em ratos que receberam tratamento 4 h após o início do derrame com uma dose de 3 mg/kg de tPA a cada dia, 1 de 6 ratos morreram dentro de 24 h. Na autópsia no rato morto, foi demonstrado hemorragia em órgãos internos, particularmente heorragia severa nos pulmões. Então, o regime de dose foi descontinuado após duas doses. Nenhum rato recuperado após receber duas doses teve sinal de perda de função neural, e 2 ratos recuperados tiveram somente o dinal de perda leve na função neural.
Tabela 9-3. Eficácia em ratos recebendo tratamento com 3 mg/kg tPA 4 h após o início do derrame
Tempo de classificação Classificação da função neural diária (Média ± DP) e número de ratos classificados
Classifi- Classifi- Classifi- Classifi- Classifi- Classifi-
80/95
cação 0 cação 1 cação 2 cação 3 cação 4 cação 5
Dia 1 2 ratos 3 ratos 1 rato
Dia 2 2 ratos 2 ratos 1 rato
[0223]Em resumo dos dados na Tabela 9-1, 9-2 e 9-3, mesmo para ratos que receberam tratamento 4 h após o início do derrame por dois dias consecutivos, composto le em uma dose de 1 pmol/kg mostrou eficácia muito mais alta que uroquinase em uma dose de 20000 lU/kg e tPA em uma dose de 3 mg/kg.
[0224]Exemplo experimental 10. Experimentos em ratos recebendo 6 tratamentos sucessivos com 1 pmol/kg do composto le da presente invenção 6 h após o início do derrame [0225]A eficácia foi representada por classificações da função neural, e uma classificação inferior indica maior eficácia. Uma solução de hidrato de cloral 10% foi injetada intraperitonealmente em ratos SD machos em uma dose de 400 mg/kg de peso corporal para anestesia. Uma incisão de abertura longitudinal foi feita no centro do pescoço, e o tronco da artéria carótida comum direita foi dissecada (cerca de 3 em comprimento). Ramificações da artéria carótida externa foram dissecadas e ligadas ao nível hoide, e a artéria carótida interna foi dissecada na parte edemacinada do pescoço. A incisão aberta na artéria carótida interna e o terminal proximal da artéria carótida comum foram ocluídos respectivamente com grampos arteriais não invasivos, e a terminação distai da artéria carótida externa foi ligada. Um catéter contendo 0,5 mL de suspensão de trombo em salina normal foi inserida no tronco da artéria carótida externa. Ao mesmo tempo quando o grampo na artéria carótida interna foi liberado, 0,5 mL de suspensão de trombo na salina normal fluiu lentamente no catéter a partir da artéria carótida exerna para o seu terminal proximal, e então foi injetado em artérias no cérebroatravés da artéria carótica interna. Subsequentemente, a terminação proximal da artéria carótica foi ligada, os grampos arteriais na artéria carótida interna e a artéria carótida comum foram liberados, e o fluxo de sangue foi
81/95 restaurado. Após a ferida ser costurada, 20000 IU de penicilina foi intramuscularmente injetada para prevenção da infecção. Após 6 h composto le em salina normal (em uma dose de 1 pmol/kg, n=11), uroquinase em salina normal (em uma dose de 20000 lU/kg, n=6) ou tPA em salina normal (em uma dose de 3 mg/kg, n=6) foi infusionada através da veia da cauda. Infusão do composto le em salina normal através da veia da cauda foi realizada uma vez por dia por 6 dias consecutivos, observado pr 7 dias. Os ratos foram comparados aos mesmos cada dia, e avaliados para o grau de dano na função neural pelo método Zealonga. Alternativamente, infusão de uroquinase em salina normal através da veia da cauda foi realizada uma vez por dia por dois dias consecutivos, os ratos foram comparados aos mesmos a cada dia, e avaliados para o grau de dano na função neural pelo método Zealonga. Alternativamente, infusão de tPA em salina normal através da veia da cauda do rato foi realizada uma vez por dia por dois dias consecutivos, os ratos foram comparados aos mesmos a cada dia, e avaliados paar o grau do dano na função neural pelo método Zealonga. Uma classificação de 0 indicou nenhum sinal de perda na função neural, 1 indicou que os membros frontais no lado não danificado podem não esticar, 2 indicou a direção de caminhada no lado não danificado, 3 indicou andar atrás da própria cauda em círculos para o lado não danificado, 4 indicou caminhar não voluntário com distúrbio de consciência, e 5 indicou morte. Os resultados experimentais são mostrados nas Tabelas 10-1, 10-2 e 10-3.
[0226]Os dados na Tabela 10-1 demonstraram que, em ratos que receberam tratamento 6 h após o início do derrame com uma dose de 1 1 pmol/kg do composto le cada dia por 6 dias consecutivos, excluindo dois que acidentalmente morrem no dia 2, 2 dos 9 ratos remanescentes recuperados não tiveram sinal de perda na função neural, um rato recuperado teve somente o sinal de leve perda de função neural, e 6 mostraram o sinal de andar atrás da própria cauda em círculos em direação ao lado não danificado. Então, composto le exibiu efeito terapêutico em uma dose de 1 pmol/kg
82/95 em derrame além da janela de tratamento de ouro.
Tabela 10-1. Eicácia em ratos recebendo tratamento com 1 1 pmol/kg de com-
posto le d a preesnte invenção 6 h após o início do derrame
Tempo de Classificação Classificação da função neural diária (Média ± DP) e número de ratos classificados
Classificação 0 Classificação 1 Classificação 2 Classificação 3 Classificação 4 Classificação 5
Dia 1 0 3 ratos 5 ratos 2 ratos 1 rato 0
Dia 2 0 2 ratos 2 ratos 4 ratos 1 rato 2 ratos
Dia 3 0 2 ratos 4 ratos 2 ratos 1 rato 0
Dia 4 1 rato 1 rato 2 ratos 4 ratos 0 0
Dia 5 1 rato 1 rato 2 ratos 4 ratos 0 0
Dia 6 2 ratos 1 rato 1 rato 4 ratos 1 rato 0
Dia 7 2 ratos 1 rato 0 6 ratos 0 0
[0227]Os dados na Tabela 10-2 demonstraram que, em ratos que receberam tratament 6 h após o início do derrame com uma dose de 20000 lU/kg de uroquinase a cada dia, 4 de 6 ratos morreram dentro de 24 h. Na autópsia nos ratos mortos, todos demonstraram hemorragia nos órgãos internos, particularmente hemorragia severa nos pulmões. Então, o regime de dose foi descontinuado após duas doses. Um rato recuperado após receber das doses não teve sinal de perda de função neural, e um rato mostrou final de caminhada involuntária com distúrbio de consciência.
Tabela 10-2. Eficácia em ratos recebendo tratamento com 20000 lU/kg de uroquinse 6 h após o início do derrame
Time of scoring Classificação da função neural diária (Média ± DP) e número de ratos classificados
Classificação 0 Classificação 1 Classificação 2 Classificação 3 Classificação 4 Classificação 5
Dia 1 1 rato 1 rato 4 ratos
Dia 2 1 rato 1 rato
[0228]Os dados na Tabela 10-3 demonstraram que, em ratos que receberam tratamento 6 h após o início do derrame com uma dose de 3 mg/kg de tPA a cada dia, 2 de 6 ratos morreram dentro de 24 h. Na autópsia nos ratos mortos, todos demonstraram hemorragia nos órgãos internos, particularmente hemorragia severa nos pulmões. Então, o regime de dose foi descontinuado após duas doses. Nenhum rato
83/95 recuperado após receber duas doses teve sinal de perda de função neural, 2 ratos recuperados tiveram somente o sinal de leve perda de função neural, um rato mostrou o sinal de andar atrás da própria cauda em círculos em direção ao lado não danificado, e um rato mostrou que o sinal da caminhada involuntária com distúrbio de consciência.
Tabela 10-3. Eficácia em ratos recebendo tratamento com 3 mg/kg tPA 6 h após o início do derrame
Tempo de Classificação Classificação da função neural diária (Média ± DP) e número de ratos classificados
Classificação 0 Classificação 1 Classificação 2 Classificação 3 Classificação 4 Classificação 5
Dia 1 1 rato 1 rato 1 rato 1 rato 2 ratos
Dia 2 2 ratos 1 rato 1 rato
[0229]Em resumo dos dados na Tabela 10-1, 10-2 e 10-3, mesmo para ratos que receberam tratamento 6 h após o início do derrame por dois dias consecutivos, composto le em uma dose de 1 pmol/kg mostrou muito mais eficácia que uroquinase em uma dose de 20000 lU/kg e tPA em uma dose de 3 mg/kg.
Exemplo experimental 11. Experimentos em ratos recebendo tratamentos 6 h após o início do derrame com composto le da presente invenção em uma dose inicial de 5 pmol/kg e 5 doses subsequentes de 2 pmol/kg cada [0230]A eficácia foi representada por classificações da função neural, e uma classificação inferior indica maior eficácia. Uma solução de hidrato de cloral 10% foi injetada intraperitonealmente em ratos SD machos em uma dose de 400 mg/kg de peso corpóreo para anestesia. Uma incisão aberta longitudinal foi feita no centro do pescoço, e o tronco da artéria carótida comum direita foi dissecada (cerca de 3 cm em comprimento). Ramificações da artéria carótida externa foram cada dissecadas e ligadas ao nível hioide, e a artéria carótida interna foi dissecada na parte edemaciada do pescoço. A incisão aberta na artéria carótida interna e a terminação proximal da artéria carótida comum foram oclusas respectivamente com grampos arteriais
84/95 não invasivos, e a terminação distai da artéria carótida externa foi ligada. Um catéter contendo 0,5 mL de suspensão de trombo em salina normal foi inserido no tronco da artéria carótida externa. Ao mesmo tempo quando o grampo na artéria carótida interna foi liberado, 0,5 mL da suspensão de trombo em salina normal fluiu lentamente no catéter a partir da artéria carótida externa ao seu terminal proximal, e então foi injetada em artérias no cérebro através da artéria carótida interna. Subsequentemente, o terminal proximal da artéria carótida foi ligado, os grampos arteriais na artéria carótida interna e a artéria carótida comum foram liberados, e fluxo sanguíneo foi restaurado. Após a ferida ser costurada, 20000 IU de penicilina foi intramuscularmente injetada para prevenção a partir da injeção. Após 6 h, composto le na salina normal (em uma dose inicial de 5 pmol/kg, n=12) foi infusionado através da veia da cauda. Então, infusão do composto le na salina normal (em uma dose de 2 pmol/kg, n=12) através da veia da cauda do rato foi realizado uma vez por dia por 6 dias consecutivos, observada por 7 dias. Os ratos foram comparados a eles mesmos a cada dia, e avaliados para o grau de dano na função neural pelo método Zealonga. Uma classificação de 0 indicou nenhum sinal de perda na função neural, 1 indicou que os membros frontais no lado não danificado podem não esticar, 2 indicou a direção de caminhada no lado não danificado, 3 indicou andar atrás da própria cauda em círculos para o lado não danificado, 4 indicou caminhar não voluntário com distúrbio de consciência, e 5 indicou morte. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 11.
[0231 ]Os dados na Tabela 11 demonstrara que, eficácia foi mostrada em ratos que receberam tratamento 6 h após o início do derrame com uma dose de 5 pmol/kg do composto le no dia 1 e uma dose de 2 pmol/kg do composto le por dia para os seguintes 5 dias. Entre os 12 ratos que receberam o tratamento, dois foram mortos, enquanto 6 dos 10 ratos remanescentes recuperados não tiveram sinal de perda na função neural, dois tiveram somente o sinal de leve perda de função neural, um mostrou o
85/95 sinal de caminha na direação do lado não danificado, e um mostrou o sinal de andar atrás da própria cauda em círculos em direção ao lado não danificado. Então, tratamento contínuo com composto le mostrou efeito terapêutico no derrame além da janela do tratamento de ouro.
Tabela 11. Eficácia em ratos recebendo tratamento com composto le da presente invenção 6 h após o início do derrame______________________________
Rato No. Classil icação da função neural diária (Média ± DP)
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7
1 1 1 0 0 0 0 0
2 1 0 0 0 0 0 0
3 3 1 5
4 2 1 1 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0
6 2 2 1 0 0 0 0
7 5
8 2 1 1 1 1 1 1
9 0 0 0 0 0 0 0
10 4 3 3 2 2 2 2
11 3 3 3 2 1 1 1
12 1 1 4 3 3 3 3
Exemplo experimental 12: Experimento em ratos recebendo tratamentos 24 h após o início do derrame com composto le da presente invenção em uma dosagem inicial de 5 pmol/kg e 5 doses subsequentes de 2 pmol/kg cada [0232]A eficácia foi representada por classificações da função neural, e uma classificação inferior indica uma eficácia maior. Uma solução de hidrato de cloral 10% foi injetada intraperitonealmente em ratos SD machos em uma dose de 400 mg/kg de peso corporal para anestesia. Uma incisão aberta longitudinal foi feita no centro do pescoço, e o tronco da artéria carótida comum direita foi dissecada (cerca de 3 cm em comprimento). Ramificações da artéria externa carótida foram cada dissecadas e ligadas ao nível hoide, e a artéria carótida interna foi dissecada na parte edemaciada do pescoço. As incisões abertas na art'reia carótida interna e a terminação proximal da artéria carótida comum foram ocluídas respectivamente com grampos arteriais não invasivos, e a terminação distai da artéria carótica externa foi ligada. Um catéter
86/95 contendo 0,5 mL de suspensão do trombo em salina normal foi inserida no tronco da artéria carótida externa. Ao mesmo tempo quando o grampo na artéria carótida interna foi liberado, 0,5 mL da suspensão de trombo em salina normal fluiu lentamente no catéter a partir da artéria carótidas externa para sua terminação proxinal, e então foi injetada em artérias no cérebro através da artéria carótida interna. Subsequentemente, a terminação proximal da artéria carótida foi ligada, os grampos arteriais na artéria carótida interna e a artéria carótida comum foram liberados, e fluxo de sangue foi restabelecido. Após a ferida foi costurada, 20000 IU de penicilida foi injetada intramuscularmente para prevenção a partir da infecção. Após 24 h, composto le na salina normal (em uma dose inicial de 5 pmol/kg, n=12) foi infusionado através da veia da cauda. Então, infusão do composto le em salina normal (em uma dose de 2 pmol/kg, n=12) através da veia da cauda do rato foi realizada uma vez por dia por 6 dias consecutivos, observada por 7 dias. Os ratos foram comparados a eles mesmos a cada dia, e avaliados para o grau do dano na função neural pelo método Zealonga. Uma classificação de 0 indicou nenhum sinal de perda na função neural, 1 indicou que os membros frontais no lado não danificado podem não esticar, 2 indicou a direção de caminhada no lado não danificado, 3 indicou andar atrás da própria cauda em círculos para o lado não danificado, 4 indicou caminhar não voluntário com distúrbio de consciência, e 5 indicou morte. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 12.
[0233]Os dados na Tabela 12 demonstraram que eficácia foi mostrada em ratos que receberam tratamento 24 h após o início do derrame com uma dose de 5 pmol/kg de composto le no dia 1 e uma dose de 2 pmol/kg do composto le por dia para os seguintes 5 dias. Entre os 12 ratos que receberam o tratamento, três foram mortos, enquanto 8 dos 9 ratos remanescentes recuperados não tiveram sinal de perda da função neural, e um teve somente o sinal de leve perda na função neural. Então, tratamento contínuo com composto le mostrou efeito terapêutico no derrame além
87/95 do tratamento da janela do tratamento ouro.
Tabela 12. Eficácia em ratos receberam tratamento com composto le da preente invenção 24 h após o início do derrame______________________________
Rato No. Classificações da funç ;ão neural diária (Média ± DP)
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7
1 3 2 2 1 0 0 0
2 3 2 1 1 1 0 0
3 2 1 1 0 0 0 0
4 3 2 2 1 1 0 0
5 5
6 2 1 1 1 1 0 0
7 3 3 3 2 1 1 1
8 3 4 2 1 1 0 0
9 5
10 3 3 1 1 1 1 1
11 5 0 0 0 0 0 0
12 2 1 1 1 0 0 0
[0234] Exemplo experimental 13. Experimentos em ratos recebendo tratamentos com 6 administrações sucessivas de 2 pmol/kg do composto le da presente invenção 6 h após o início do derrame [0235]A eficácia foi representada por classificações da função neural, e uma classificação inferior indica uma maior eficácia. Uma solução de hidrato de cloral 10% foi injetada intraperitonealmente em ratos SD machos em uma dose de 400 mg/kg do peso corpóreo para anestesia. Uma incisão de abertura longitudinal foi feita no centro do pescoço, e o tronco da artéria carótida comum direita foi dissecada (cerca de 3 cm em comprimento). Ramificações da artéria carótida externa foram dissecadas e ligadas no nível hioide, e a artéria carótida interna foi dissecada na parte edemaciada do pescoço. As incisões abertas na artéria carótida interna e a terminação proximal da artéria carótida comum foram ocluídas respectivamente com grampos arteriais não invasivos, e o terminal distai da artéria carótida externa foi ligado. Um catéter contendo 0,5 mL de suspensão trombo em salina normal foi inserido no tronco da artéria carótida externa. Ao mesmo tempo quando o grampo na artéria carótida interna foi liberada, 0,5 mL da suspensão de trombo em salina normal flui lentamente
88/95 no catéter a partir da artéria da carótida externa ao seu terminal proximal, e então foi injetada nas artérias no cérebro através da artéria carótida interna. Diferente a partir dos exemplos experimentais prévios, o trombo usado neste exemplos experimental foi notavelmente suspensão de trombo sólido em salina normal preparada pelo uso de trombo mais antigo tendo sido armazenado em TA por 24 h, ao invés da suspensão trombo em salina normal preparada pelo uso de trombo armazenado a -24° C. Subsequentemente, o terminal proximal da artéria carótida foi ligado, os grampos arteriais na artéria carótida interna e a artéria carótida comum foram liberadas, e fluxo de sangue foi restaurado. Após a ferida ser costurada, 20000 IU de penicilina foi intramuscularmente injetada para prevenção a partir da infecção. Após 6 h, composto le em salina normal (em uma dose inicial de 5 pmol/kg, n=12) foi infusionada através da veia da cauda. Então, infusão do composto le na salina normal (em uma dose de 2 pmol/kg, n=12) através da veia da cauda do rato foi realizada uma vez por dia por 6 dias consecutivos, observada por 7 dias. Os ratos foram comparados ao mesmos a cada dia, e avaliados para o grau de dano na função neural pelo método de Zealonga. Uma classificação de 0 indicou nenhum sinal de perda na função neural, 1 indicou que os membros frontais no lado não danificado podem não esticar, 2 indicou a direção de caminhada no lado não danificado, 3 indicou andar atrás da própria cauda em círculos para o lado não danificado, 4 indicou caminhar não voluntário com distúrbio de consciência, e 5 indicou morte. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 13.
Tabela 13. Eficácia em ratos recebendo tratamento com 2 pmol/kg do composto le da presente invenção 6 h após o início do derrame_______________
Rato No. Classificações da funç ;ão neural diária (Média ± DP)
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7
1 4 3 2 1 1 1 1
2 3 2 1 1 0 0 0
3 3 3 3 3 1 1 1
4 3 3 1 1 1 1 1
5 5
6 3 3 1 1 1 1 1
89/95
7 5
8 3 3 1 1 1 1 1
9 5
10 5
11 5
12 3 5
[0236] Os dados na Tabela 13 demonstraram que, nos modelos de rato 6 h após ο início do derrame induzido pelo trombo envelhecido, eficácia foi mostrada após 6 tratamentos sucessivos com uma dose de 2 pmol/kg do composto le por dia por 6 dias consecutivos. Entre os 12 ratos que receberam o tratamento, seus foram mortos, enquanto 1 dos 6 ratos remanescentes recuperados não teve sinal de perda na função neural, e cinco tiveram somente o sinal de leve perda na func'ão neural. Então, tratamento contínuo com composto le mostrou efeito terapêutico em derrame antigo.
[0237]Deve ser notado que, por que compostos la a II, exceto le, nos Exemplos experimentais 1 a 7 alcançaram os efeitos na eliminação do radical livre NO, lise do coágulo por euglobulina, trombólise, ação anti-trombo, e tratamento em ratos com derrame similar àqueles do composto le, os outros compostos de la a II podem alcançar os mesmos efeitos no derrame antigo como composto o le teve.
Exemplo experimental 14. Experimentos em nanoestruturas dos compostos la a II da presente invenção em uma concentração de 1 χ10'6 M, 1 χ10'9 M e 1 χ10'12 M [0238]Compostos la a II de acordo com a presente invenção foram preparados em soluções 1x10’6M, 1x10’9M e 1x10'12M, respectivamente. 10 pL de solução foram retirados e gotejados em uma grade de cobre com um filtro de papel colocado debaixo, secos, e então observados sob um microscópio eletrônico de transmissão (MET) (JEOL, JEM- 1230). Fotografias foram tiradas para gravar a morfologia e tamanho da partícula.
[0239]1. Composto teste: compostos la a II da presente invenção [0240]2. Método do teste: o composto teste (la a II) foi preparado em soluções 1x10’6 M, 1x10’9 M e 1x10'12 M com água triplamente destilada, respectivamente. Uma pequena quantidade (cerca de 10 pL) foi retirada e gotejada na superfície de
90/95 uma grade de cobre com um filtro de papel debaico, seca com ar, e então observada sob MET (JEOL, JEM-1230) para a morfologia e tamanho de partícula que foram gravas nas fotografias.
[0241 ]3. Resultados do teste: resultados são mostrados nas Figs. 25 a 36. Fig. 25 mostra as nanoestruturas do composto la de acordo com a presente invenção em soluções aquosas de 1x10'6M, 1x10'9M e 1x10'12M, e as nanoestruturas de la nas soluções aquosas são nanoesferas tendo um diâmetro de 3,1 a 86,1 nm; Fig. 26 mostra as nanoestruturas do composto Ib de acordo com a presente invenção em soluções aquosas de 1x10'6M, 1x10'9M e 1x10'12M, e as nanoestruturas de Ib nas soluções aquosas são nanoesferas tendo um diâmetro de 4,3 a 297,9 nm; Fig. 27 mostra as nanoestruturas de composto Ic de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1x10'6 M, 1x10'9 M e 1x10'12 M, e nanoestruturas de Ic nas soluções aquosas são nanoesferas tendo um diâmetro de 2,2 a 165,7 nm; Fig. 28 msotra as nanoestruturas do composto Id de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1x10'6 M, 1x10'9 M e 1x10'12 M, e as nanoestruturas de Id nas soluções aquosas são nanoesferas tendo um diâmetro de 16,2 a 201,2 nm; Fig. 29 mostra as nanoestruturas do composto le de acordo com a presente invenção em soluções aquosas 1x10'6 M, 1x10'9 M e 1x10'12 M, e as nanoestruturas de le nas soluções aquosas são nanoesferas tendo um diâmetro de 3,3 a 138,9 nm; Fig. 30 mostra as nanoestruturas do composto If de acordo com a presente invenção em soluções aquosas a 1x10'6M, 1x10'9M e 1x10'12M, e as nanoestruturas de If nas soluções aquosas são nanoesferas tendo um diâmetro de 3,6 a 82,4 nm; Fig. 31 mostra as nanoestruturas do composto Ig de acordo com a presente invenção nas soluções aquosas a 1x10'6M, 1x10'9M e 1x10'12M, e as nanoestruturas de Ig nas soluções aquosas são nanoesferas tendo um diâmetro de 6,3 a 264,5 nm; Fig. 32 mostra as nanoestruturas do composto Ih de acordo com a presente invenção em soluções aquosas a 1x10'6M, 1x10'9M e 1x10'12M, e as nanoestruturas de Ih nas
91/95 soluções aquosas são nanoesferas tendo um diâmetro de 5,1 a 149,8 nm; Fig. 33 mostra as nanoestruturas do composto li de acordo com a presente invenção em soluções aquosas a 1x10'6M, 1x10'9M e 1x10'12M, e as nanoestruturas de li nas soluções aquosas são nanoesferas tendo um diâmetro de 4,7 a 107,7 nm; Fig. 34 mostra as nanoestruturas do composto Ij de acordo com a presente invenção nas soluções aquosas 1x10'6 M, 1x10'9 M e 1x10'12 M, e as nanoestruturas de Ij nas soluções aquosas são nanoesferas tendo um diâmetro de 9,1 a 73,7 nm; Fig. 35 mostra as nanoestruturas do composto Ik de acordo com a presente invenção nas soluções aquosas a 1x10'6M, 1x10'9M e 1x10'12M, e as nanoestruturas de Ik nas soluções aquosas são nanoesferas tendo um diâmetro de 10,1 a 66,7 nm; Fig. 36 mostra as nanoestruturas do composto II de acordo com a presente invenção nas soluções aquosas de 1x10'6M, 1x10'9M e 1x10'12M, e as nanoestruturas de II nas soluções aquosas são nanoesferas tendo um diâmetro de 6,1 a 153,3 nm.
Exemplos experimental 15. Experimentos de FT-MS e alta resolução dos compostos la a II da presente invenção em concentrações de 1x10'6M, 1x10'9M e 1x10’12M [0242]Compostos la a II foram preparados em uma solução 12,5 μΜ com água triplamente destilado, e 10 pL da amostra fora carregados em um espectroscópio de massa FT-ICR solariX (Bruker Daltonik). Estado de associação intermolecular foi observado e dados foram adquiridos. Os resultados são listados na Tabela 14 a 16.
Tabela 14. Dados de FT-MS de alta resolução de fimeros formados por compostos la-ll da presente invenção em três concentrações diferentes______
Compostos Concentração
1 x10’tí M/dímero 1 x10’9 M/ dímero 1 x10’12 M/ dímero
Ia 2748.4580 2748.4580 2748.4580
Ib 2772.5308 2772.5308 2772.5308
Ic 2888.5308 2888.5308 2888.5308
Id 2720.4266 2720.4266 2720.4266
le 2744.4994 2744.4994 2744.4994
If 2840.4994 2840.4994 2840.4994
Ig 2606.3838 2606.3838 2606.3838
Ih 2630.4564 2630.4564 2630.4564
92/95
li 2726.4564 2726.4564 2726.4564
1 2294.1814 2294.1814 2294.1814
Ik 2318.2542 2318.2542 2318.2542
II 2414.2542 2414.2542 2414.2542
Tabela 15. Dados FT-MS de alta resolução de trímeros formados por compostos la-ll da presente invenção nas três diferentes concentrações__________
Compostos Concentração
1x10’6 M/trímero 1 χ10'9 M/ trímero 1 x10’12 M/ trímero
Ia 4122.1870 4122.1870 4122.1870
Ib 4158.2962 4158.2962 4158.2962
Ic 4332.2962 4332.2962 4332.2962
Id 4080.1399 4080.1399 4080.1399
le 4116.2491 4116.2491 4116.2491
If 4260.2491 4260.2491 4260.2491
Ig 3909.0757 3909.0757 3909.0757
Ih 3945.1846 3945.1846 3945.1846
li 4089.1846 4089.1846 4089.1846
lj 3440.7721 3440.7721 3440.7721
Ik 3476.8813 3476.8813 3476.8813
II 3620.8813 3620.8813 3620.8813
Tabela 16. Dados FT-MS de alta resolução de tetrâmeros formados por compostos la-ll da presente invenção em três concentrações diferentes_________
Compostos Concentração
1 x10'tí M/tetrâmero 1 x10’9 M/tetrâmero 1 x10’12 M/tetrâmero
Ia 5495.9160 5495.9160 5495.9160
Ib 5544.0616 5544.0616 5544.0616
Ic 5776.0616 5776.0616 5776.0616
Id 5439.8532 5439.8532 5439.8532
le 5487.9988 5487.9988 5487.9988
If 5679.9976 5679.9976 5679.9976
93/95
ig 5211.7676 5211.7676 5211.7676
lh 5259.9128 5259.9128 5259.9128
li 5451.9128 5451.9128 5451.9128
1 4587.3628 4587.3628 4587.3628
Ik 4635.5084 4635.5084 4635.5084
II 4827.5084 4827.5084 4827.5084
[0243]Tabela 14 a 16 mostram os números de massa precisos medidos por FT MS de alta resolução. Esses números de massa indicam que dímeros, trímeros e tetrâmeros foram todos detectados em três concentrações diferentes dos compostos la-ll da presente invenção. Então, os compostos de acordo com a presente invenção podem formar dímeros, trímeros e tetrâmeros em uma solução aquosa ao mesmo tempo.
Exemplo experimental 16. Experimentos FT-MS de alta resolução do composto le da presente invenção em concentrações de 10,0 μΜ, 1,0 μΜ, 0,1 μΜ e 0,01 μΜ [0244]Para visualização MS, Compostos le fora preparados em soluções 10,0 μΜ, 1,0 μΜ, 0,1 μΜ e 0,01 μΜ com água triplamente destilada, e uma amostra de 10 pL foi carregado em uma espectroscopia de massa FT-ICR solariX (Bruker Daltonik). Estado de associação intermolecular foi observado e dados foram adquiridos. Os resultados são mostrados nas Figs 37 a 40. Fig. 37 é o espectro FT-MS de alta resolução do composto le de acordo com a presente invenção em uma concentração de 0,01 μΜ: 915.84146 é um íon triplamente carregado do dímero, 1030.32114 é um íon quadruplamente carregado do trímero, e 1099.00914 é um íon quintuplicamente carregado do tetrâmero; Fig. 38 é o espectro FT-MS de alta resolução do composto le de acordo com a presente invenção em uma concentração de 0,1 μΜ: 915.84124 é um íon triplamente carregado do dímero, 1030.32208 é o íon quadruplamente carregado no trímero, e 1099.00829 é o íon quintuplicamente carregado do tetrâmero; Fig. 39 é o espectro FT-MS de alta resolução do composto le de acordo com a presente invenção em uma concentração de 1 μΜ: 915.84095 é o íon triplamente carregado do dímero, 1030.32067 é um íon quadruplamente carregado do trímero, e
94/95
1099.00914 é o ion quintuplamente carregado do tetrâmero; Fig. 40 é um espectro FT-MS de alta resolução do compost le de acordo com a presente invenção em uma concentração de 10 μΜ: 915.84163 é o ion triplamente carregado do dímero, 1030.32067 é ο ίοη quadruplamente carregado do trímero, e 1099.00914 é o ion quintuplamente carregado do tetrâmero.
[0245]Os dímeros, trímeros e tetrâmeros formados pelos compostos da presente invenção ainda são unidos em nanoesferas tendo um diâmetro de 2 a 300 nm. Entre nanoesferas de tais tamanhos, nanoesferas tendo um diâmetro menor que 100 nm foi além de 99%. É bem conhecido o fato em nanofarmacologia que nanoesfersa tendo um diâmetro de menos que 100 nm são improvavelmente englobadas por macrófagos durante o transporte no sangue e pode facilmente atravessar a parede capilar. Essas propriedades permitem os compostos de acordo com a presente invenção para atravessar a barreira hemato-encefálica. É a propriedade de atravessar a barreira hemato-encefálica dos compostos de acordo com a presente invenção que permite os produtos metabólicos dos compostos de acordo com a presente invenção serem detectáveis em tecidos cerebrais em ratos recebendo o tratamento de derrame.
Exemplo experimental 17. Experimentos em monitoramento FT-MS de alta resolução os produtos metabólicos nos tecidos cerebrais tratados com composto le de acordo com a presente invenção [0246]O cérebro inteiro do rato foi tomado e colocado em um tubo de centrífuga de 50 mL, em que 10 mL de NaCI 0,9% foram adicionados, e homogeneizado para obter uma suspensão uniforme que foi então centrifugado a 3000 rom por 10 min. 5 mL de sobrenadante foi adicionado em 10 mL de metanol e eventualmente misturado por agitação, e centrifugado em 3000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi concentrado sob pressão reduzida até secar, seguido por adição de 1 mL de metanol, e novamente centrifugado a 12000 rpm por 10 min. O sobrenadante resultante foi usado
95/95 para monitoramento do conteúdo dos produtos metabólicos nos tecidos cerebral em ratos tratados com composto le.
[0247]Resultados experimentais de FT-MS de alta resolução mostrou dois produtos metabólicos M1 e M2 no cérebro. Entre eles, M1 teve um [M+1]+ de 291.06971 e uma fórmula molecular de C15H-19O5N2; e M2 teve um [M+1]+ de 307.04350 e uma fórmula molecular de Ci5H19O4N2. (Condições MS: carregamento: 10 pL; modo de ionização: ES+; voltagem do cone: 30 V; taxa de fluxo da fase móvel: 0,2 mL/min). De acordo com os dados acima, os produtos metabólicos M1 e M2 foram assumidos como os seguintes compostos:
Figure BR112015004854A2_D0025
M1 M2
PM Teórico 291,1345 307,1249
PM teórico 291,0697 307,0435
[0248]lsto demonstrou que 0 composto le da presente invenção de fato atravessou a barreira hemato-encefálica, permitindo 0 efeito de eliminação do radical livre NO, trombólise e 0 efeito anti-trombo no cérebro.

Claims (3)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composto de fórmula I:
    NN—AAj ^AAs /1X
    CARACTERIZADO pelo fato de que NN representa uma imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO; AAi representa um braço de ligação ten do pelo menos três grupos para ligação; AA2 representa um peptídeo tendo atividade trombolítica; e AA3 representa um peptídeo com direcionamento ao trombo.
    2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO é 1,3-dioxo-2 [(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina.
    3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que os grupos para ligação são selecionados a partir do grupo consistindo de um grupo carboxila e um grupo amino.
    4. Composto, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o braço de ligação é um aminoácido natural, particularmente L-Lys, L-Asp ou
    L-Glu.
    5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo tendo atividade trombolítica é um oligonucleotídeo compreenden do uma sequência PAK (Pro-Ala-Lys), uma sequência AKP (Ala-Lys-Pro) ou uma sequência KAP (Lys-Ala-Pro), ou um peptídeo tendo unidades de repetição da se quência PAK, a sequência AKP ou a sequência KAP.
    6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo com alvo em trombo é um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp).
    7. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo direcionado ao trombo é um polipeptídeo obtido a partir de conju
    2/5 gar a modificação de um peptídeo RGD (Arg-Gly-Asp) com um peptídeo YIGS (Tyrlle-Gly-Ser).
    8. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a imidazolina tendo atividade de eliminação do radical livre NO é 1,3-dioxo-2[(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, o braço de ligação é L-Lys, L-Asp ou L-Glu, o peptídeo tendo atividade trombolítica é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK (Pro-Ala-Lys), e o peptídeo com direcionamento ao trombo é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp).
    9. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de compreender o composto conforme descrito em quaisquer das reivindicações 1 a 8 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
    10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o composto está na forma de uma estrutura nanosférica.
    11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de ser para uso como uma droga trombolítica, uma droga de eliminação de radical livre NO ou uma droga anti-trombo.
    12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de ser para uso como uma droga no tratamento de derrame ou infarto cerebral.
    13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12,
    CARACTERIZADA pelo fato de ser para uso no tratamento de derrame ou infarto cerebral acima de 3 horas a partir do início dos sintomas.
    14. Método para preparação do composto de fórmula I, de acordo com a rei vindicação 1,
    NN—AAi (D
    3/5
    CARACTERIZADO pelo fato de que NN representa uma imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO; AAi representa um braço de ligação tendo pelo menos três grupos para ligação; AA2 representa um peptídeo tendo atividade trombolítica; e AA3 representa um peptídeo com alvo em trombo;
    o referido método compreendendo os passos de:
    (1) prover a imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO (NN), o braço ligante tendo pelo menos três grupo para ligação (ΑΑ-ι), o peptídeo tendo atividade trombolítica (AA2) e o peptídeo com direcionamento ao trombo (AA3), em que o braço de ligação tem um primeiro grupo para ligação, um segundo grupo para ligação, e um terceiro grupo para ligação;
  2. (2) sob condições de reação apropriadas, ligando a imidazolina tendo a atividade de eliminação de radical livre NO (NN) ao primeiro grupo para ligação no braço ligante (AA1), para formar um composto de fórmula geral IM-1:
    NN-AAi (IM-1);
  3. (3) sob condições de reação apropriadas, ligação do peptídeo tendo atividade trombolítica (AA2) ao composto de fórmula geral IM-1, em que uma terminação do peptídeo tendo atividade trombolítica é ligada ao segundo grupo para ligar no braço ligante, para formar um composto de fórmula geral IM-2:
    NN-AA1-AA2 (IM-2); e (4) sob condições de reação apropriadas, ligando o peptídeo com direcionamento ao trombo (AA3) ao composto de fórmula geral IM-2, em que uma terminação do peptídeo com direcionamento ao trombo é ligado ao terceiro grupo para ligação no braço ligante, para formar o composto de fórmula I;
    em que passos (3) e (4) são de forma passível de troca em sua ordem ordem.
    15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o passo (1) ainda compreende proteção do segundo e terceiros grupos para
    4/5 ligação ao braço ligante (AA-i) com grupos protetores, e grupos ativos protetores do peptídeo tendo atividade trombolítica (AA2) e do peptídeo com direcionamento ao trombo (AA3), outro que a terminação a ser usada para ligação, com grupos protetores; passo (3) ainda compreende desproteção do grupo secundário protegido para primeira ligação, e então ligando o peptídeo tendo atividade trombolítica ao segundo grupo desprotegido para ligação; passo (4) ainda compreende desproteção do terceiro grupo protegido para primeira ligação, e então ligação do peptídeo com direcionamento ao trombo ao terceiro grupo desprotegido para ligação; e após passo (4), existe ainda um passo de desproteção dos grupos ativos protegidos do peptídeo tendo atividade trombolítica (AA2) e do peptídeo de direcionamento ao trombo (AA3).
    16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro grupo para ligação é um grupo amino, e os segundo e terceiro grupos para ligação são selecionados a partir do grupo consistindo de um grupo carboxila e um grupo amino.
    17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o braço de ligação é um aminoácido natural, particularmente L-Lys, L-Asp ou L-Glu.
    18. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo tendo atividade trombolítica é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK (Pro-Ala-Lys), uma sequência AKP (Ala-Lys-Pro) ou uma sequência KAP (Lys-Ala-Pro), ou um peptídeo tendo unidades de repetição da sequência PAK, a sequência AKP ou a sequência KAP.
    19. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo direcionado ao trombo é um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência RGD (Arg-Gly-Asp).
    20. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a imidazolina tendo atividade de eliminação de radical livre NO é
    5/5
    1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetóxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, o braço de ligação é LLys, L-Asp ou L-Glu, o peptídeo tendo atividade trombolítica é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência PAK (Pro-Ala-Lys), e o peptídeo com direcionamento ao trombo é um oligopeptídeo compreendendo uma sequência RGD (Arg-GlyAsp).
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