CN103374056A - 1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰氨基酸苄酯、其合成和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了通式I的1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰氨基酸苄酯(式中AA选自L-Ala，L-Ile，L-Val，L-Glu，L-Leu，L-Phe，Gly，L-Asp，L-Trp，L-Ser，L-Met，L-Lys，L-Asn，L-Gln和L-Thr残基)、公开了它们的制备方法、进一步公开了它们作为抗肿瘤剂的应用。

Description

1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰氨基酸苄酯、其合成和应用

技术领域

本发明涉及通式I的1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰氨基酸苄酯(式中AA选自L-Ala，L-Ile，L-Val，L-Glu，L-Leu，L-Phe，Gly，L-Asp，L-Trp，L-Ser，L-Met，L-Lys，L-Asn，L-Gln和L-Thr残基)、涉及它们的制备方法、涉及它们在荷瘤小鼠模型上的抗肿瘤活性、进一步涉及它们作为抗肿瘤剂的应用。本发明属于生物医药领域。 

背景技术

恶性肿瘤作为一种复杂的疾病，严重危害着人民生命健康，如何有效有力地治疗肿瘤得到了越来越多学者的关注和研究。目前，化学治疗仍然是临床治疗肿瘤的主要手段，寻找抗肿瘤药物是新药研究的热点之一。发明人了解，天然β-咔啉类生物碱具有抗肿瘤活性。在具有抗肿瘤活性的天然β-咔啉类生物碱中，骆驼蓬碱(Harmaline)、去氢骆驼蓬碱(Harmine)、去甲氧基骆驼蓬碱(Harmalol)、THBC、诺哈明(Noharmane)和哈尔明(Harmane)广为人知。作为抗肿瘤剂，它们的缺点是活性低和毒副作用高。发明人是最早提出β-咔啉-3-羧酸可插入肿瘤细胞DNA阻滞DNA解链而抑制肿瘤细胞增殖的优秀的抗肿瘤先导化合物的研究人员。发明人在长期研究中提出了1位取代和3位甲酰氨基酸苄酯取代对于抗肿瘤活性至关重要。在β-咔啉类嵌插剂研究中，发明人广泛筛选了各种1位取代基对抗肿瘤活性的影响，发现1-乙酰基取代的β-咔啉-3-羧酸是优秀的抗肿瘤先导结构。按照这些认识，发明人提出了本发明。 

发明内容

本发明的第一个内容是提供通式I代表的具有抗肿瘤活性的15种化合物(5a-o)： 

式中AA＝Ala，Ile，Val，Glu，Leu，Phe，Gly，Asp，Trp，Ser，Met，Lys，Asn，Gln，Thr. 

本发明的第二个内容是提供通式I代表的15种抗肿瘤化合物(5a-o)的制备方法，该方法可用图1描述，包括以下步骤： 

(1)在SOCl₂的存在下，甲醇中色氨酸酯化得到色氨酸甲酯； 

(2)在HCl存在下，水中色氨酸甲酯与1，3-二羟基丙酮缩合得到1-乙酰基-β-咔啉-3羧酸甲酯； 

(3)在NaOH存在下，在二氧六环中将1-乙酰基-β-咔啉甲酯皂化为1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸； 

(4)在DCC和HOBt存在下1-乙酰基-β-咔啉羧酸在无水DMF中与AA-OBzl缩合为为5a-o。 

本发明的第三个内容是通式I代表的15种化合物(5a-o)的抗肿瘤作用。 

本发明的第四个内容是通式I代表的15种化合物(5a-o)作为抗肿瘤剂的应用。 

附图说明

图1.合成路线(i)SOCl₂，MeOH(ii)1，3-二羟基丙酮，HCl，H₂O(iii)NaOH，二氧六环(iv)AA-OBzl，HOBt，DCC，DMF。 

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。 

实施例1制备色氨酸甲酯(2) 

量取120mL甲醇、冰浴下搅拌、恒压漏斗滴加13mL二氯亚砜、活化45分钟后加入10g(49mmol)色氨酸，TLC监测反应(二氯化碳/甲醇＝3∶1)，至色氨酸点消失，制得11g(89％)标题化合物，为淡紫色粉末。ESI-MS(m/e)：219[M+H]⁺。 

实施例2制备1-乙酰基-β-咔啉3-羧酸甲酯(3) 

称取165mg(0.65mmol)色氨酸甲酯，用5mL蒸馏水溶解，得到溶液I。称取235.6mg(2.59mmol)1，3-二羟基丙酮加入溶液1中，冰浴搅拌下滴加浓盐酸3滴开始反应，TLC监测反应(二氯化碳/甲醇＝5∶1)，至色氨酸甲酯点(2)消失，制得57.1mg(32.9％)标题化合物，为淡黄色粉末。ESI-MS(m/e)：269[M+H]⁺；Mp：212.4-12.8℃；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.53(s，1H)，9.03(s，1H)，8.22-8.21(d，J＝3Hz，1H)，7.68-7.63(m，2H)，743-7.40(t，J＝7.4，2H)，4.11(s，3H)，2.99(s，3H). 

实施例3制备1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4) 

将50mg(0.19mmol)1-乙酰基-β-咔啉甲酯溶于二氧六环中，1N氢氧化钠调pH＝12开始反应，TLC监测反应(乙酸乙酯/石油醚＝1∶1)，至1-乙酰基-β-咔啉甲酯(3)消失，制得40mg(85％)标题化合物，为淡黄色粉末。ESI-MS(m/e)：253[M-H]^-；Mp：222.3-222.8℃；¹H NMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝12.923(s，1H)，12.238(s，1H)，9.161(s，1H)，8.466-8.440(d，J＝7.8Hz，1H)，7.872-7.846(d，J＝7.8Hz，1H)，7.666-7.614(t，J＝7.5Hz，1H)，7.387-7.338(t，J＝7.4Hz，1H)，2.861(s，3H). 

实施例4制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-丙氨酸苄酯(5a) 

冰浴冷却下向50mL茄瓶中加入499mg(1.96mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，279.6mg(2mmol)HOBt，758mg(2.15mmol)TosH·Ala-OBzl，加入25mL无水DMF溶解搅拌。452.8mg(2.21mmol)DCC溶于5mL无水DMF，冰浴冷却下滴加至反应瓶中，充分搅拌5分钟。NMM调反应液pH为8，开始反应，TLC监测(乙酸乙酯/石油醚＝1∶1)，至1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)原料点消失，停止反应，抽滤2次滤除DCU，冰浴下向滤液中加入饱和NaCl 50mL，乙酸乙酯萃取，合并酯层转移至250mL分液漏斗中，依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗(10mL×3)、饱和氯化钠水溶液洗(10mL×3)、5％硫酸氢钾水溶液洗(10mL×3)、饱和氯化钠水溶液洗(10mL×3)、饱和碳酸氢钠水溶液洗(10mL×3)、饱和氯化钠水溶液洗(10mL×3)。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥2小时、过滤、滤液干法拌样，进行纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)，得503mg(61.7％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESI-MS(m/e)：416[M+H]⁺；Mp：181.3-181.9℃；[α]＝48.9667(c＝0.50，CDCl₃).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.482(s，1H)，9.006(s，1H)，8.611-8.586(d，J＝7.5Hz，1H)，8.192-8.172(d，J＝7.8Hz，1H)，7.672-7.591(m，2H)，7.418-7.283(m，6H)， 5.345-5.257(t，2H)，5.023-4.927(m，1H)，2.907(s，3H)，1.737-1.666(d，J＝7.2Hz，3H

实施例5制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-异亮氨酸苄酯(5b) 

按照制备5a的操作，由386mg(1.52mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，657mg(1.67mmol)，TosH·Ile-OBzl，216mg(1.59mmol)HOBt，350mg(1.71mmol)DCC制备得到153mg(22.6％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESI-MS(m/e)：457[M+H]⁺；Mp：140.5-141.3℃；[α]＝58.5333(c＝0.50，CDCl₃).¹H NMR(30)0)MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.462(s，1H)，9.509(s，1H)，8.652-8.622(d，J＝8.7Hz，1H)，8.227-8.200(d，J＝8.1Hz，1H)，7.686-7.611(m，2H)，7.432-7.338(m，6H)，5.327-5.221(m，2H)，4.987-4.941(dd，J＝4.8Hz，J＝9.0Hz，1H)，2.906(s，3H)，2.217-2.134(m，1H)，1.681-1.546(m，1H)，1.079-1.056(d，3H)，1.026-0.997(t，3H). 

实施例6制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-缬氨酸苄酯(5c) 

按照制备5a的操作，由420mg(1.65mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，689mg(1.682mmol)，TosH·Val-OBzl，235mg(1.74mmol)HOBt，381mg(1.86mmol)DCC制备得到352.7mg(48.1％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESI-MS(m/e)：444[M+H]⁺；Mp：165.3-165.8℃；[α]＝14.4667(c＝0.50，CDCl₃).¹H NMR(300)MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.517(s，1H)，8.974(s，1H)，8.631-8.601(d，J＝9.0Hz，1H)，8.180-8.154(d，J＝7.8Hz，1H)，7.667-7.588(m，2H)，7.420-7.285(m，6H)，5.337-5.242(m 2H)，4.954-4.909(dd，J＝4.5Hz，J＝9.0Hz，1H)，2.894(s，3H)，2.512-2.406(m，1H)，1.121-1.073(t，J＝7.2Hz，6H). 

实施例7制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-谷氨酸苄酯(5d) 

按照制备5a的操作，由287mg(1.13mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，676mg(1.41mmol)，TosH·Glu(OBzl)-OBzl，160mg(1.19mmol)HOBt，260mg(1.27mmol)DCC制备得到298.2mg(46.8％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESI-MS(m/e)：564[M+H]⁺；Mp：87.9-88.7℃；[α]＝50.1333(c＝0.50，CDCl₃).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.629(s，1H)，8.836(s，1H)，8.699-8.672(d，J＝8.1Hz，1H)，8.078-8.052(d，J＝7.8Hz，1H)，7.705-7.527(m，2H)，7.501-7.351(m，6H)，7.288-7.123(m，5H)，5.315(s，2H)，5.111(s，2H)，5.076-5.012(m，1H)，2.853(s，3H)，2.801-2.517(m，1H)，2.438-2.281(m，1H)，1.329-1.298(d，J＝9.3Hz，1H)，0.917-0.0.832(m，1H). 

实施例8制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸苄酯(5e) 

按照制备5a的操作，由400mg(1.57mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，807mg(1.89mmol)，TosH·Leu-OBzl，224mg(1.66mmol)HOBt，363mg(1.78mmol)DCC制备得到253.8mg(35.3％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESI-MS(m/e)：457[M+H]⁺；Mp：166.8-167.4℃；[α]＝31.2000(c＝0.50，CDCl₃).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.534(s，1H)，8.918(s，1H)，8.456-8.428(d，J＝8.4Hz，1H)，8.150-8.124(d，J＝7.8Hz，1H)，7.659-7.571(m，2H)，7.422-7.286(m，6H)，5.293(s，2H)，5.058-4.952(m，1H)，2.889(s，1H)，1.933-1.834(m，3H)，1.081-1.033(t，J＝7.2Hz，6H). 

实施例9制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-苯丙氨酸苄酯(5f) 

按照制备5a的操作，由400mg(1.57mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，743mg(1.89mmol)，TosH·Phe-OBzl，224mg(1.66mmol)HOBt，363mg(1.78mmol)DCC制备得到490mg(63.3％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESI-MS(m/e)：492[M+H]⁺；Mp：148.8-149.3℃；[α]＝12.9333(c＝0.50，CDCl₃).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.451(s，1H)，9.041(s，1H)，8.491-8.463(d，J＝8.4Hz，1H)，8.250-8.224(d.J＝7.8Hz，1H)，7.732-7.545(m，2H)，7.485-7.332(m，6H)，7.311-7.239(m，3H)，7.214-7.124(m，2H)，5.281-5.215(m，2H)，3.422-3.292(m，2H)，2.745(s，3H). 

实施例10制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-甘氨酸苄酯(5g) 

按照制备5a的操作，由400mg(1.57mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，637mg(1.89mmol)，TosH·Gly-OBzl，224mg(1.66mmol)HOBt，363mg(1.78mmol)DCC制备得到379mg(60.0％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESl-MS(m/e)：400[M-H]^-；Mp：220.4-220.9℃； ¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝12.207(s，1H)，9.159-9.119(m，1H)，8.482-8.456(d，J＝7.8Hz，1H)，7.869-7.842(d，J＝8.1Hz，1H)，7.665-7.614(t，J＝7.7Hz，1H)，7.411-7.336(m，6H)，5.213(s，2H)，3.998-3.976(d，J＝5.7Hz，2H)，2.932(s，3H). 

实施例11制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-天冬氨酸苄酯(5h) 

按照制备5a的操作，由400mg(1.57mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，916mg(1.89mmol)，TosH·Asp(OBzl)-OBzl，224mg(1.66mmol)HOBt，363mg(1.78mmol)DCC制备得到479mg(54.1％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESl-MS(m/e)：564[M+H]⁺；Mp： 120.5-120.9℃；[α]＝24.8000(c＝0.50，CDCl₃)，¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.490(s，1H)，9.064-9.036(d，J＝8.4Hz，1H)，8.985-8.943(s，1H)，8.184-8.158(d，J＝7.8Hz，1H)，7.675-7.606(m，2H)，7.468-7.284(m，10H)，5.313-5.184(m，3H)，5.184(s，2H)，3.365-3.131(m，2H)，2.811(s，3H)，0.904-0.823(m，1H). 

实施例12制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-色氨酸苄酯(5i) 

按照制备5a的操作，由500mg(1.97mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，800mg(2.72mmol)，TosH·Trp-OBzl，280mg(2.07mmol)HOBt，453mg(2.22mmol)DCC制备得到472mg(45.1％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESI-MS(m/e)：531[M+H]⁺；Mp：112.9-113.7℃；[α]＝-6.7333(c＝0.50，CDCl₃).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.379(s，1H)，9.055(s，1H)，8.582-8.554(d，J＝8.4Hz，1H)，8.207-8.181(dJ＝7.8Hz，1H)，8.128(s，1H)，7.672-7.584(m，3H)，7.422-7.330(m，5H)，7.295-7.250(m，3H)，7.204-7.040(m，2H)，7.016(s，1H)，5.367-5.303(m，1H)，5.186(s，1H)，3.610-3.474(m，2H)，2.446(s，3H)，1.657(s，1H). 

实施例13制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-丝氨酸苄酯(5j) 

按照制备5a的操作，由561mg(2.21mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，871mg(2.71mmol)，TosH·Ser(Bzl)-OBzl，314.2mg(2.32mmol)HOBt，509mg(2.49mmol)DCC制备得到511mg(45.3％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESI-MS(m/e)：522[M+H]⁺；Mp：144.0-144.8℃；[α]＝24.2667(c＝0.50，CDCl₃).¹H NMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝10.286(s，1H)，9.188(s，1H)，8.482-8.456(d，J＝7.8Hz，1H)，7.874-7.847(d，J＝8.1Hz，1H)，7.666-7.618(t，J＝7.2Hz，1H)，7.585-7.561(d，J＝7.2Hz，2H)，7.471-7.311(m，5H)，5.495(s，2H)，5.173-5.135(t，J＝5.7Hz，1H)，4.505-4.487(d，J＝5.4Hz，1H)，2.834(s，3H). 

实施例14制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-蛋氨酸苄酯(5k) 

按照制备5a的操作，由721mg(2.84mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，1.4g(3.40mmol)，TosH·Met-OBzl，404mg(2.99mmol)HOBt，654mg(3.19mmol)DCC制备得到570mg(42.3％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESI-MS(m/e)：476[M+H]⁺；Mp：140.3-140.8℃；[α]＝16.6000(c＝0.50，CDCl₃).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.549(s，1H)，8.886(s，1H)，8.739-8.717(d，J＝7.8Hz，1H)，8.115-8.089(d，J＝7.8Hz，1H)，7.640-7.557(m，2H)，7.511-7.284(m，6H)，5.399-5.267(m，2H)，5.134-5.068(m，1H)，2.863(s，3H)，2.813-2.559(m， 2H)，2.484-2.395(m，1H)，2.371-2.231(m，1H)，2.114(s，3H). 

实施例15制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-赖氨酸苄酯(51) 

按照制备5a的操作，由619mg(2.44mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，983mg(2.93mmol)，Lys(Boc)-OBzl，347mg(2.57mmol)HOBt，561mg(2.75mmol)DCC制备得到589mg(42.3％)淡黄色粉末，4N盐酸/乙酸乙酯脱除Boc，TLC监测反应(二氯化碳/甲醇＝5∶1)得标题化合物400mg(82.3％)。ESI-MS(m/e)：473[M+H]⁺；Mp：128.2-128.9℃；[α]＝33.7333(c＝0.50，CDCl₃)，¹H NMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝9.105(s，1H)，g.g94-8.867(d，J＝8.1Hz，1H)，8.472-8.446(d，J＝7.8Hz，1H)，7.871-7.844(d，J＝8.1Hz，1H)，7.673-7.621(t，J＝7.8Hz，1H)，7.423-7.299(m，6H)，5.221(s，2H)，4.741-4.668(m，1H)，3.338(s，1H)，2.915(s，3H)，2.791-2.741(t，J＝7.5Hz，2H)，2.039-1.966(m，2H)，1.616-1.500(m，2H)，1.473-1.319(m，2H)， 

实施例16制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-谷酰胺苄酯(5m) 

按照制备5a的操作，由502mg(1.98mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，613mg(2.38mmol)，TosH·Asn-OBzl，281mg(2.08mmol)HOBt，456mg(2.24mmol)DCC制备得到521mg(57.6％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESl-MS(m/e)：457[M-H]^-；Mp：195.3-195.8℃；[α]＝31.8000(c＝0.50，CDCl₃).¹H NMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝12.210(s，1H)，9.483-9.457(d，J＝7.8Hz，2H)，9.122(s，1H)，8.473-8.478(d，J＝7.5Hz，1H)，7.866-7.839(d，J＝8.1Hz，1H)，7.631(s，2H)，7.381-7.164(m，7H)，5.282-5.152(m，2H)，5.022(s，1H)，3.0.88-2.813(m，5H). 

实施例18制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-天冬酰胺苄酯(5n) 

按照制备5a的操作，由562mg(2.01mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，865mg(2.41mmol)，TosH·Gln-OBzl，313mg(2.31mmol)HOBt，496mg(2.43mmol)DCC制备得到478mg(45.8％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESI-MS(m/e)：473[M+H]⁺；Mp：218.6-219.0℃；[α]＝-22.9333(c＝0.50，CDCl₃).¹H NMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝12.201(s，1H)，9.132-9.104(s，2H)，8.469-8.443(d，J＝7.8Hz，1H)，7.869-7.841(d，J＝8.1Hz，1H)，7.662-7.612(t，J＝7.5Hz，1H)，7.426-7.293(m，7H)，6.825(s，1H)，5.214(s，2H)，4.715-4.661(m，1H)，2.955(s，3H)，2.354-2.124(m，4H). 

实施例19制备1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰-L-苏氨酸苄酯(5o) 

按照制备5a的操作，由512mg(1.74mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸(4)，723mg(2.38mmol)，TosH·Thr-OBzl，285mg(2.11mmol)HOBt，452mg(2.21mmol)DCC制备得到501mg(55.8％)淡黄色粉末，为纯标题化合物。ESI-MS(m/e)：446[M+H]⁺；Mp：154.3-154.7℃；[α]＝18.2667(c＝0.50，CDCl₃).¹H NMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝12.25(s，1H)，9.15(s，1H)，8.76-8.74(d，J＝6Hz，1H)，8.49-8.47(d，J＝6Hz，1H)，7.87-7.86(d，J＝3Hz，1H)，7.67-7.63(t，J＝6Hz，1H)，7.43-7.35(m，6H)，5.46-5.45(d，J＝3Hz，1H)，5.23(s，2H)，4.43-4.38(m，1H)，2.87(s，3H)，1.23-1.22(d，J＝3Hz，2H). 

实验例15a-o抗肿瘤细胞增殖活性评价 

1)受试样品 

本发明的5a-o均用含1％DMSO的PBS配制成所需浓度。 

2)细胞株 

C6(大鼠脑胶质瘤细胞)、HL60(人早幼粒细胞白血病细胞)、K562(人慢性粒细胞白血病细胞)、SH-sy5y(人神经母细胞瘤细胞)4株肿瘤细胞均购自美国标准菌种收藏所(ATCC)。 

3)主要仪器及材料 

石英自动双重纯水蒸馏器：1018-B，江苏荣华仪器制造有限公司； 

高压灭菌锅：400Ep-Z，H+P公司； 

水浴锅：YLE-1000，北京德天佑科技发展有限公司； 

超净台：VS-1300-U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司； 

细胞孵育箱：INC153，北京五洲东方科技发展有限公司； 

低温离心机：SPD111V，Thermo公司； 

酶标仪：MULTISJKAN MK3，Thermo公司； 

平板振荡器：MS2Minishaker，IKA公司； 

96孔细胞培养板、25cm²培养瓶：Corning Costar公司； 

2mL冻存管：Corning Costar公司； 

0.22μm、0.45μm微孔滤膜：上海兴亚净化材料厂。 

4)主要试剂 

RPMI-1640培养基干粉：Gibco公司； 

PBS缓冲液：每升溶液中含有NaCl 8.2g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·H₂O 1.56g、KH₂PO₄0.2g，PH值7.4； 

胎牛血清：Hyclone公司； 

0.25％胰酶溶液：Hyclone公司； 

青霉素、链霉素：solarbio公司； 

MTT(四噻唑蓝)：solarbio公司，溶于PBS溶液中，制成5mg/mL的溶液，过滤除菌后使用，避光保存； 

阿霉素(ADR)：北京华丰联合技术有限公司。 

DMSO：二甲基亚枫，Hyclone公司； 

5)试验方法 

分别将生长状态良好、处于对数生长期的C6、HL60、K562、Sh-sy5y细胞按照5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl。4株细胞按预设的浓度梯度加入待测、经灭菌处理的5a-o，每孔25μl，对照孔加入等体积的PBS。在37℃、5％CO₂培养箱中培养48小时，每孔加入25μl浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续置于37℃、5％CO₂培养箱中培养4小时。离心4分钟(3000rpm/min)。小心吸出上清液，每孔加入100μl DMSO溶解紫色残留物(甲瓒)，平板振荡10分钟使沉淀全部溶解，于570nm酶标仪上测定O.D.值(吸光度)，波长570nm。 

按照公式“相对生存率＝(D含药-D空白)/(D对照-D空白)×100％”计算每一个样品浓度下的样品对肿瘤细胞的抑制率。 

以抑制率对化合物浓度作图，计算本发明化合物(5a-o)的IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。 

6)实验结果 

表15a-o抗肿瘤细胞增殖活性IC₅₀(μM)

a)100μM时该化合物对该种肿瘤细胞的抑制率 

实验例25a-o体内抗肿瘤活性评价 

1)实验材料 

受试化合物：本发明得到的所有化合物5a-o； 

阳性对照为阿霉素； 

实验动物：ICR雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。每12只小鼠一组，空白和阳性对照各一组； 

瘤源：小鼠S180肉瘤，由北京大学医学部动物实验中心提供，自行传代维持； 

溶剂：生理盐水。 

2)剂量设置 

5a-o给药剂量均为0.1μmol/kg，阿霉素为2μmol/kg，均采用腹腔单次给药。 

3)药物配制 

5a-o加入少量吐温80助溶，逐渐加入生理盐水至所需浓度即可。阿霉素为生理盐水溶液。 

4)给药剂量及给药设置 

5a-o均以腹腔单次给药，按0.1μmol/kg的给药剂量每天一次，0.2mL每鼠，连续给药7天，共给药7次。 

生理盐水对照以等体积的相应溶液，均以腹腔单次给药，0.2mL每鼠，连续给药7天， 共给药7次。 

阿霉素均以腹腔单次给药，按2μmol/kg的给药剂量每天一次，0.2mL每鼠，连续给药7天，共给药7次。 

5)动物模型的建立 

采用体内抗肿瘤腋皮下接种模型；无菌条件下抽取接种7d后生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶3)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。 

细胞浓度＝(4大方格内活细胞数/4)×10⁴稀释倍数＝细胞数/mL 

细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％ 

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成2×10⁷个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮下接种0.2mL/只，造成实体瘤动物模型。 

6)实体瘤抑瘤率的测定 

实验进行至第8天，称小鼠体重，脱颈椎处死小鼠，并剖取各组小鼠的肿瘤及各主要脏器称重，最后统计各组药物的抑瘤率。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率％＝(1-给药组瘤重/空白组瘤重)×100％。 

统计方法 

本实验数据统计均采用t检验和方差分析。 

8)实验结果 

5a-o对荷S180肉瘤小鼠的体内抗肿瘤活性结果如表2所示。表2的数据表明在0.1μmol/kg剂量下5a-o几乎都显示抗肿瘤作用，其中5a，5i的抗肿瘤作用最强。 

表2.5a-o对荷S180小鼠肿瘤重量的影响 

注：a)与生理盐水组比较P＜0.01，b)与生理盐水组比较P＜0.03，c)与生理盐水组比较P＜0.05。 

Claims (4)

1.通式I的1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰氨基酸苄酯，式中AA选自L-Ala，L-Ile，L-Val，L-Glu，L-Leu，L-Phe，Gly，L-Asp，L-Trp，L-Ser，L-Met，L-Lys，L-Asn，L-Gln和L-Thr残基。

2.制备通式I的1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰氨基酸苄酯的方法，该方法由以下步骤构成：

(1)在SOCl₂存在下将L-色氨酸在甲醇中甲酯化，得到L-色氨酸甲酯；

(2)在HCl存在下L-色氨酸甲酯与1，3-二羟基丙酮在水中缩合，得到1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸甲酯；

(3)在NaOH存在下1-乙酰基-β-咔啉甲酯在二氧六环中水解生成1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸；

(4)1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸与L-氨基酸苄酯偶联生成式I的1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰氨基酸苄酯。

3.通式I的1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰氨基酸苄酯的抗肿瘤活性。

4.通式I的1-乙酰基-β-咔啉-3-甲酰氨基酸苄酯在制备抗肿瘤药物中的应用。

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