ES2886576T3 - Compuesto de múltiples dianas con actividad anticoagulante y antiplaquetaria, método de preparación para el mismo y uso del mismo - Google Patents

Abstract

Un compuesto de múltiples dianas con anticoagulación y antagonismo del receptor GPIIb/IIIa de plaquetas, teniendo dicho compuesto una estructura como se muestra en la Fórmula (1): A-L-B-L'-C Fórmula (1) en donde A y B son sitios de unión a trombina, C es un sitio de unión al receptor GPIIb/IIIa de plaquetas, L es un primer enlazador y L' es un segundo enlazador, en donde L' tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (2): ((Gly)n1-(Ser)n2)n3 Fórmula (2) en donde n1 es 1, 2, 3 o 4; n2 es 0 o 1; y n3 es 0, 1, 2 o 3; o L' tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (3): (Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)n1 Fórmula (3) en donde n1 es 0, 1, 2 o 3 o L' tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (4): (Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala)n1 Fórmula (4) en donde n1 es 0, 1, 2 o 3; en donde A tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (5): A1-A2-A3-A4 Fórmula (5) en donde A1 es D-Phe; A2 es Pro o Pip; A3 es Arg, Lys, Orn o Har; y A4 es Pro, D-Pro o Ser; en donde B tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (6): B1-B2-B3-B4-B5 Fórmula (6) en donde B1 es un dipéptido que consiste en cualesquiera dos aminoácidos ácidos; B2 es Val, Leu, Ile, Nle o Phe; B3 es Hyp, Ser, Pro o un N-metil aminoácido; B4 es un dipéptido que consiste en cualesquiera dos aminoácidos ácidos; y B5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha y Pro o B5 es un dipéptido que comprende al menos un aminoácido seleccionado de Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha y Pro; en donde C tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (7): Cys-Har-C1-Asp-Trp-Pro-C2 Fórmula (7) en donde C1 es Gly o Ser; C2 es Cys o una estructura obtenida reemplazando -OH en Cys por -NH2; y se forma un enlace disulfuro entre dos grupos mercapto en la Fórmula (7); en donde L tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (8): L1-L2-L3-L4-Gly-Asp-L5 Fórmula (8) en donde L1 es Gly, Ala, Val o Gly-Gly; L2 es Gly o Cys; L3 es Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly o un aminoácido dextrógiro; L4 0 es Asn o Gln; L5 es uno seleccionado de Phe, Tyr, un derivado en el cual un anillo de benceno de Phe está sustituido y un derivado en el cual está sustituido un anillo de benceno de Tyr.

Description

DESCRIPCION

Compuesto de múltiples dianas con actividad anticoagulante y antiplaquetaria, método de preparación para el mismo y uso del mismo

Campo

La presente invención se refiere al campo biomédico, en particular a un compuesto de múltiples dianas con anticoagulación y antagonismo del receptor GPIIb/IIIa de plaquetas así como un método de preparación del mismo y uso del mismo.

Antecedentes

La trombosis es un evento temprano durante la aparición de enfermedades trombóticas y pasa por el desarrollo de las enfermedades. La activación plaquetaria y la activación del sistema de coagulación sanguínea juegan un papel importante en el proceso de trombosis y están estrechamente relacionadas entre sí in vivo. La trombina, que se produce cuando se activa el sistema de coagulación sanguínea, es un potente factor de activación de plaquetas para activar las plaquetas, que a su vez facilita el proceso de coagulación sanguínea. El principio de prevención y tratamiento de las enfermedades trombóticas es mejorar el estado de hipercoagulabilidad, para prevenir la extensión de trombos y la formación de nuevos trombos, para disolver el trombo y luego para limpiar o reconstruir la ruta del flujo sanguíneo, evitando de esta manera la isquemia y la necrosis de los tejidos. Los métodos para tratar las enfermedades trombóticas incluyen terapias antitrombóticas, trombolíticas de intervención y quirúrgicas. Entre ellas, la terapia antitrombótica incluye terapias antiplaquetarias y anticoagulantes y ha sido motivo de preocupación como base para el tratamiento de enfermedades trombóticas, especialmente enfermedades cardiovasculares. Los fármacos anticoagulantes previenen el proceso de coagulación de la sangre y, por lo tanto, previenen la trombosis al actuar sobre los factores de coagulación de la sangre; los fármacos antiplaquetarios inhiben la trombosis mediante la función de inhibir la adhesión, agregación y liberación plaquetaria. Actualmente, los inhibidores de trombina usados clínicamente incluyen principalmente heparina de bajo peso molecular y bivalirudina; y los antagonistas de los receptores GPIIb/IIIa de plaquetas incluyen principalmente lamivudina, tirofibán, etc. Estos medicamentos tienen efectos secundarios tales como tendencia al sangrado y están sujetos a algunas limitaciones de aplicación. De manera más importante, todos estos fármacos inhiben la trombosis a través de un único sitio diana y, actualmente, los fármacos para diferentes sitios diana se usan a menudo en combinación clínicamente, de tal manera que se logren efectos clínicos en términos de aumento en la efectividad y reducción de los efectos secundarios. Sin embargo, actualmente, para la combinación de fármacos, hay problemas, tales como compatibilidad de dosis, sangrado, coordinación, los cuales tienen una gran influencia sobre el efecto antitrombótico clínico.

Por lo tanto, es necesario desarrollar una solución técnica que sea capaz de inhibir la trombosis mediante la inhibición de múltiples dianas, de tal manera que se logre el efecto de acción simultánea en diferentes sitios diana mediante la administración de un solo fármaco y se eviten los problemas provocados por la combinación de fármacos.

Sumario

Un objeto de la presente invención es superar los defectos existentes en la técnica anterior y proporcionar un compuesto antagonista de múltiples dianas que sea capaz de dirigirse simultáneamente a trombina y a los receptores GPIIb/IIIa de plaquetas.

La presente divulgación proporciona un compuesto antagonista de múltiples dianas con anticoagulación y antagonismo del receptor GPIIb/IIIa de plaquetas, teniendo dicho compuesto una estructura representada por la Fórmula (1): A-L-B-L'-C Fórmula (1),

en donde A y B son sitios de unión a trombina, C es un sitio de unión al receptor GPIIb/IIIa de plaquetas, L es un primer enlazador y L' es un segundo enlazador,

en donde L' tiene una estructura representada por la Fórmula (2):

((Gly)_n1-(Ser)_n2)_n3 Fórmula (2)

en donde n1 es 1, 2, 3 o 4; n2 es 0 o 1; y n3 es 0, 1, 2 o 3; o.

L' tiene una estructura representada por la Fórmula (3):

(Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)ⁿ¹ Fórmula (3)

en donde n1 es 0, 1, 2 o 3 o

L' tiene una estructura representada por la Fórmula (4):

(Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala)ⁿ¹ Fórmula (4)

en donde n i es 0, 1, 2 o 3;

en donde A tiene una estructura representada por la Fórmula (5):

A1-A2-A3-A4 Fórmula (5),

en donde A1 es D-Phe; A2 es Pro o Pip; A3 es Arg, Lys, Orn o Har; y A4 es Pro, D-Pro o Ser.

en donde B tiene una estructura representada por la Fórmula (6):

B1-B2-B3-B4-B5 Fórmula (6),

en donde B1 es un dipéptido que consiste en cualesquiera dos aminoácidos ácidos; B2 es Val, Leu, Ile, Nle o Phe; B3 es Hyp, Ser, Pro o un N-metil aminoácido; B4 es un dipéptido que consiste en cualesquiera dos aminoácidos ácidos; y B5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha y Pro o B5 es un dipéptido que comprende al menos un aminoácido seleccionado de Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha y Pro en donde C tiene una estructura representada por la Fórmula (7):

Cys-Har-C1-Asp-Trp-Pro-C2 Fórmula (7),

en donde C1 es Gly o Ser; C2 es Cys o una estructura obtenida reemplazando -OH en Cys por -NH2; y se forma un enlace disulfuro entre dos grupos mercapto en la Fórmula (7) en donde L tiene una estructura representada por la Fórmula (8):

L1-L2-L3-L4-Gly-Asp-L5 Fórmula (8),

en donde L1 es Gly, Ala, Val o Gly-Gly; L2 es Gly o Cys; L3 es Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly o un aminoácido dextrógiro; L4 es Asn o Gln; L5 es uno seleccionado de Phe, Tyr, un derivado en el cual un anillo de benceno de Phe está sustituido y un derivado en el cual está sustituido un anillo de benceno de Tyr.

Opcionalmente, A-L-B se selecciona de una de las secuencias polipeptídicas mostradas en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 3.

Opcionalmente, dicho compuesto tiene una estructura representada por la Fórmula (9):

X-A-L-B-L'-C-Y Fórmula (9),

en donde X es uno seleccionado de hidrógeno, uno o dos alquilo C1-C6, uno o dos acilo C2-C10, benciloxicarbonilo y ferc-butoxicarbonilo; Y es uno seleccionado de OH, alcoxi C1-C6, un amino y un amino sustituido con uno o dos alquilo C1-C4.

Opcionalmente, dicho compuesto comprende una secuencia polipeptídica de estructuras polipeptídicas mostradas en SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 7.

Opcionalmente, dicho compuesto se selecciona de una de las estructuras polipeptídicas mostradas en SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 7.

La presente divulgación proporciona además un compuesto antagonista de múltiples dianas con anticoagulación y antagonismo del receptor GPIIb/IIIa de plaquetas.

Opcionalmente, dicha sal es una sal de acetato del compuesto o una sal de trifluoroacetato del compuesto.

La presente divulgación proporciona además un método para preparar el compuesto de la presente divulgación, en donde el método comprende las etapas de:

(1) conectar secuencialmente aminoácidos protegidos o fragmentos a partir de un carboxilo terminal de acuerdo con una secuencia de polipéptidos usando un método de síntesis en fase sólida, para obtener un polipéptido-resina de Wang en el cual todas las cadenas laterales de aminoácidos están protegidas; (2) someter el polipéptido-resina de Wang en el cual las cadenas laterales de aminoácidos están todas protegidas a la hidrólisis ácida con un agente hidrolizante ácido para obtener un polipéptido lineal bruto; y (3) ciclar el polipéptido lineal bruto para formar un enlace disulfuro y después purificar el resultante con cromatografía líquida preparativa de alta presión, para obtener una secuencia polipeptídica.

La presente divulgación también proporciona una composición farmacéutica, en donde dicha composición farmacéutica comprende el compuesto de la presente divulgación o una sal del compuesto de la presente divulgación como un principio activo y, preferentemente

la forma de dosificación de dicha composición farmacéutica es una inyección, un comprimido, una cápsula, una píldora, un polvo, un gránulo, una suspensión o una emulsión.

La presente divulgación también proporciona el uso del compuesto de la presente divulgación o una sal del compuesto de la presente divulgación en la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de trombosis arterial periférica, trombosis de derivación arterial y venosa. La presente divulgación también proporciona el uso del compuesto de la presente divulgación o una sal del compuesto de la presente divulgación en la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de ictus isquémico progresivo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trombosis en síndromes coronarios agudos, intervención coronaria percutánea o terapia con una endoprótesis vascular coronaria en PCI, en la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de embolia pulmonar aguda o en la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de trombosis en el trasplante de órganos y tejidos.

El compuesto antagonista de múltiples dianas con anticoagulación y antagonismo del receptor GPIIb/IIIa de plaquetas proporcionado en la presente divulgación tiene una función antitrombina directa, reversible y específica y también inhibe los receptores GPIIb/IIIa, lo cual puede lograr el efecto anticoagulante y antitrombótico a una dosis baja. Al mismo tiempo, el riesgo de hemorragia se reduce y se evitan problemas tales como compatibilidad de dosis, sangrado, coordinación y similares provocados por la combinación de fármacos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los resultados de detección de espectrometría de masas

del polipéptido 1. La Figura 2 muestra los resultados de detección de espectrometría de masas

del polipéptido 2. La Figura 3 muestra los resultados de detección de espectrometría de masas

del polipéptido 3. La Figura 4 muestra los resultados de detección de espectrometría de masas

del polipéptido 4. La Figura 5 muestra el efecto del polipéptido 2 sobre la trombosis de la vena cava inferior inducida por FeCh en ratas.

La Figura 6 muestra el efecto del polipéptido 2 sobre la trombosis de la arteria carótida común inducida por FeCh en ratas.

La Figura 7 muestra el efecto del polipéptido 2 sobre APTT en ratas.

La Figura 8 muestra el efecto del polipéptido 2 sobre PT en ratas.

La Figura 9 es un diagrama de flujo de una prueba de modelo de trombosis arterial.

La Figura 10 muestra el efecto de la administración intravenosa única del polipéptido 2 sobre el peso seco del trombo de trombosis de la arteria femoral inducida por FeCh en conejos.

La Figura 11 muestra el efecto de 15 minutos después de la administración intravenosa única del polipéptido 2 sobre el peso seco del trombo de la arteria femoral y de trombosis de derivación venosa en conejos.

La Figura 12 muestra el efecto de la administración intravenosa única del polipéptido 2 sobre la agregación plaquetaria en conejos (una tasa inhibitoria de agregación plaquetaria).

La Figura 13 muestra el efecto de la administración intravenosa única del polipéptido 2 sobre APTT en conejos. La Figura 14 muestra el efecto de la administración intravenosa única del polipéptido 2 sobre PT en conejos. La Figura 15 muestra el efecto de la administración intravenosa única del polipéptido 2 sobre ACT en conejos. La Figura 16 muestra el efecto del polipéptido 2 sobre el coeficiente pulmonar en un modelo de embolia pulmonar de ratón inducida por trombina (1500 U/kg).

Descripción detallada de las realizaciones

En la presente divulgación, la trombina se refiere a una enzima proteolítica formada a partir de un precursor de trombina (un componente esencial en el plasma sanguíneo) que puede promover la coagulación de la sangre al catalizar la conversión de fibrinógeno en fibrina. El receptor GPIIb/IIIa de plaquetas es una glucoproteína adhesiva en la superficie de las plaquetas, que es miembro de la familia de las integrinas. Cada plaqueta inactivada tiene aproximadamente 50.000 a 80.000 moléculas de receptor GPIIb/IIIa en su superficie y es la integrina más abundante en la superficie plaquetaria. Aminoácido se refiere a un término general para una clase de compuestos orgánicos que contienen grupos amino y carboxilo, que es una unidad constituyente básica de una proteína y es una sustancia básica de las proteínas necesarias para la nutrición animal. Los aminoácidos de la presente divulgación se expresan mediante sus abreviaturas convencionales en la técnica. Aminoácido ácido se refiere a un aminoácido que tiene un punto isoeléctrico de menos de 7, incluyendo ácido aspártico (Asp) y ácido glutámico (Glu). El N-metil aminoácido se refiere a un aminoácido obtenido por sustitución de un amino en los aminoácidos por un metilo. Un derivado en el cual un anillo de benceno está sustituido significa un derivado de un aminoácido en el cual un anillo de benceno del aminoácido está sustituido con un alquilo lineal o ramificado, un halógeno, un alcoxi, una amida, un aciloxi o similares. Un alquilo C1-C6 significa un alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono y un acilo C2-C10 significa un acilo que tiene de 2 a 10 átomos de carbono.

Una realización de la presente divulgación proporciona un compuesto antagonista de múltiples dianas con anticoagulación y antagonismo del receptor GPIIb/IIIa de plaquetas, teniendo dicho compuesto una estructura representada por la Fórmula (1): A-L-B-L'-C Fórmula (1), en donde A y B son sitios de unión a trombina, C es un sitio de unión al receptor GPIIb/IIIa de plaquetas, L es un primer enlazador y L' es un segundo enlazador. En el presente documento, el primer enlazador L conecta A y B juntos para formar una estructura A-L-B y el segundo enlazador L' conecta la estructura A-L-B y una estructura C juntas para formar la estructura representada por la Fórmula (1). En una realización de la presente divulgación, la estructura A-L-B puede conectarse directamente a la estructura C para formar un compuesto antagonista de múltiples dianas.

En dicho compuesto L' tiene una estructura representada por la Fórmula (2): ((Gly)ⁿ¹-(Ser)ⁿ²)ⁿ³ Fórmula (2). En la fórmula (2), n1 es 1,2, 3 o 4; n2 es 0 o 1; y n3 es 0, 1, 2 o 3.

En una realización preferida, L' tiene una estructura de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser o Gly-Gly-Gly-Ser.

Alternativamente, L' tiene una estructura representada por la Fórmula (3): (Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)ⁿ¹ Fórmula (3), en donde n1 es 0, 1, 2 o 3.

En una realización preferida, L' tiene una estructura de Glu-Ala-Ala-Ala-Lys.

Alternativamente, L' tiene una estructura representada por la Fórmula (4): (Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala)ⁿ¹ Fórmula (4), en donde n1 es 0, 1, 2 o 3.

En una realización preferida, L' tiene una estructura de Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala.

A tiene una estructura representada por la Fórmula (5): A1-A2-A3-A4 Fórmula (5), en donde A1 es D-Phe; A2 es Pro o Pip; A3 es Arg, Lys, Orn o Har; y A4 es Pro, D-Pro o Ser. En el presente documento, Pip se refiere a 4-aminopiperidinil-4-carboxi, Orn se refiere a ornitina y Har se refiere a homoarginina.

En una realización preferida, A tiene una estructura de D-Phe-Pro-Arg-Pro.

B tiene una estructura representada por la Fórmula (6): B1-B2-B3-B4-B5 Fórmula (6), en donde B1 es un dipéptido que consiste en cualesquiera dos aminoácidos ácidos; B2 es Val, Leu, Ile, Nle o Phe; B3 es Hyp, Ser, Pro o un N-metil aminoácido; B4 es un dipéptido que consiste en cualesquiera dos aminoácidos ácidos; B5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha y Pro o B5 es un dipéptido que comprende al menos un aminoácido seleccionado de Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha y Pro. En el presente documento, Nle representa norleucina e Hyp representa hidroxiprolina.

En una realización preferida de la presente divulgación, B tiene una estructura de Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu.

C tiene una estructura representada por la Fórmula (7): Cys-Har-C1-Asp-Trp-Pro-C2

Fórmula (7), en donde C1 es Gly o Ser; C2 es Cys o una estructura obtenida reemplazando -OH en Cys por -NH²; y se forma un enlace disulfuro entre dos grupos mercapto en la Fórmula (7). En el presente documento, Har representa homoarginina.

Y en donde, L tiene una estructura representada por la Fórmula (8): L1-L2-L3-L4-Gly-Asp-L5 Fórmula (8), en donde L1 es Gly, Ala, Val o Gly-Gly; L2 es Gly o Cys; L3 es Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly o un aminoácido dextrógiro; L4 es Asn o Gln; L5 se selecciona de uno de Phe, Tyr, un derivado en el cual un anillo de benceno de Phe está sustituido y un derivado en el cual está sustituido un anillo de benceno de Tyr. En el presente documento, L1 es preferentemente Gly-Gly, L2 es preferentemente Gly, L3 es preferentemente Gly, L4 es preferentemente Asn y L5 es preferentemente Phe.

En un caso preferido, A-L-B se selecciona de una de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 3. En las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 3, la fenilalanina en el N-terminal es D-fenilalanina.

SEQ ID NO:

-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Tyr Glu Asp Ile Pro Glu Glu Tyr Leu

SEQ ID NO:

-Phe Pro Arg Ser Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Asp Ile Pro Glu Glu Tyr Leu

SEQ ID NO:

-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu

En una realización de la presente divulgación, dicho compuesto tiene una estructura representada por la Fórmula (9): X-A-L-B-L'-C-Y Fórmula (9), en donde X se selecciona de uno de hidrógeno, uno o dos grupos alquilo C1-C6, uno o dos grupos acilo C2-C10, benciloxicarbonilo o ferc-butoxicarbonilo, en el cual opcionalmente, el grupo alquilo C1-C6 puede ser metilo o etilo; Y se selecciona de uno de OH, alcoxi C1-C6, amino, amino sustituido con uno o dos alquilo C1-C4, en el cual en una realización de la presente divulgación, Y es OH o NH2. En una realización particularmente preferida, cuando el compuesto tiene la estructura mostrada en SEQ ID NO: 5 e Y en el C-terminal es NH2, el compuesto se une al receptor de plaquetas GPIIb/IIIa durante más tiempo y tiene una mejor función inhibidora de plaquetas.

En el presente documento, el grupo alquilo puede ser una estructura lineal o una estructura ramificada y el grupo acilo puede ser una estructura lineal o una estructura ramificada, en donde cuando X es dos grupos alquilo C1-C6, las clases de los dos grupos alquilo C1-C6 pueden ser iguales o diferentes; en donde cuando X es dos grupos acilo C2-C10, los tipos de los dos grupos acilo C2-C10 pueden ser iguales o diferentes. Cuando Y es un amino sustituido con dos alquilos C1-C4, las clases de grupos amino sustituidos con alquilo C1-C4 pueden ser iguales o diferentes.

Opcionalmente, el compuesto comprende una secuencia polipeptídica de estructuras polipeptídicas mostradas en SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 7. En las secuencias polipeptídicas mostradas en SEQ iD NO: 4 a SEQ ID NO: 7, la fenilalanina en el N-terminal es D-fenilalanina.

SEQ ID NO: 4: D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gly Gly Gly Gly Ser Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys

SEQ ID NO: 5: D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Ala Ala Lys Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys

SEQ ID NO: 6: D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys

SEQ ID NO: 7: D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Arg Val Leu Ala Glu Ala Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys

En una realización preferida de la presente divulgación, dicho compuesto se selecciona de una de las estructuras polipeptídicas mostradas en SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 7.

En un aspecto de la presente divulgación, se proporciona una sal del compuesto antagonista de múltiples dianas con anticoagulación y antagonismo del receptor de GPIIb/IIIa de plaquetas.

En la presente divulgación, la sal está en una forma de sal farmacéuticamente aceptable. La "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal adecuada para estar en contacto con tejidos humanos o animales sin toxicidad, estimulación, alergias y similares excesivas. La sal farmacéuticamente aceptable es bien conocida en la técnica. Una sal tal puede prepararse en la separación y purificación finales del compuesto peptídico de la presente divulgación y también puede prepararse por separado haciendo reaccionar una base o ácido libre con un ácido o base orgánico o inorgánico adecuado. Las sales de adición de ácido representativas incluyen, pero no se limitan a, acetato, trifluoroacetato, dihexanoato, citrato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, heptanoato, hexanoato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, lactato, maleato, mesilato, oxalato, propionato, fosfato, glutamato, bicarbonato, p-toluenosulfonato. Preferentemente, la sal es una sal de acetato, trifluoroacetato o clorhidrato del compuesto y en particular preferentemente, la sal es una sal de acetato o una sal de trifluoroacetato del compuesto.

En un aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para preparar el compuesto antagonista de múltiples dianas con anticoagulación y antagonismo del receptor GPIIb/IIIa de plaquetas de la presente divulgación, en donde dicho método comprende las etapas de: (1) conectar secuencialmente aminoácidos protegidos o fragmentos a partir de un carboxilo terminal de acuerdo con una secuencia de polipéptidos usando un método de síntesis en fase sólida, para obtener un polipéptido-resina de Wang en el cual todas las cadenas laterales de aminoácidos están protegidas; (2) someter el polipéptido-resina de Wang en el cual las cadenas laterales de aminoácidos están todas protegidas a la hidrólisis ácida con un agente hidrolizante ácido para obtener un polipéptido lineal bruto; (3) ciclar el polipéptido lineal bruto para formar un enlace disulfuro y después purificar el resultante con cromatografía líquida preparativa de alta presión, para obtener una secuencia polipeptídica.

En un aspecto de la presente divulgación, también se proporciona una composición farmacéutica, en donde dicha composición farmacéutica comprende un compuesto antagonista de múltiples dianas con anticoagulación y antagonismo del receptor GPIIb/IIIa de plaquetas de la presente divulgación o una sal del compuesto como un principio activo. Opcionalmente, la composición farmacéutica comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede estar en forma de inyección o microemulsión. Los vehículos farmacéuticamente aceptables usados comúnmente en la técnica pueden seleccionarse y usarse de acuerdo con la forma de la composición farmacéutica. En la composición farmacéutica, el contenido del principio activo no es menos del 85 %. La clase de vehículo incluye pero no se limita a solución salina fisiológica. La composición farmacéutica de la presente divulgación puede usarse para el tratamiento y/o prevención de enfermedades trombóticas y sus funciones principales incluyen anticoagulación, antitrombosis y anti-agregación plaquetaria. Un medicamento que comprende el compuesto antagonista de múltiples dianas con anticoagulación y antagonismo del receptor de GPIIb/IIIa de plaquetas o una sal del compuesto como un principio activo se administra a un sujeto.

En un aspecto de la presente divulgación, el uso de un compuesto de la presente divulgación o una sal del compuesto de la presente divulgación en la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de la trombosis arterial periférica y trombosis de derivación arterial y venosa. En un aspecto de la presente divulgación, también se proporciona el uso de un compuesto de la presente divulgación o una sal del compuesto de la presente divulgación en la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de ictus isquémico progresivo. En un aspecto de la presente divulgación, también se proporciona el uso de un compuesto de la presente divulgación o una sal del compuesto de la presente divulgación en la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de embolia pulmonar aguda. La presente divulgación también proporciona el uso de un compuesto de la presente divulgación o una sal del compuesto de la presente divulgación en la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de trombosis en el trasplante de órganos y tejidos, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de síndromes coronarios agudos, intervención coronaria percutánea o tratamiento con una endoprótesis vascular coronaria colocada en PCI, en la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de embolia pulmonar aguda y en la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de trombosis en el trasplante de órganos y tejidos. Los usos descritos en la presente divulgación incluyen la fabricación de un medicamento que comprende el compuesto de la presente divulgación, y la forma de dosificación del medicamento incluye pero no se limita a un polvo liofilizado para inyección, una inyección, una microemulsión, una microesfera, una micela y otras formas de dosificación. El medicamento antitrombótico incluye medicamentos para el tratamiento o prevención de enfermedades oclusivas arteriales periféricas (que funcionan a través de anticoagulación, antitrombosis, anti-agregación plaquetaria), ictus isquémico progresivo, síndromes coronarios agudos y similares. Además, el medicamento antitrombótico también puede incluir medicamentos para la prevención de la trombosis de fístulas arteriovenosas en un paciente en hemodiálisis durante cirugías VAF y VAG.

En lo sucesivo en el presente documento, las realizaciones específicas de la presente divulgación se describirán adicionalmente a modo de ejemplos. Los instrumentos y reactivos implicados en los siguientes ejemplos pueden obtenerse todos comprando productos disponibles en el mercado.

Algunos materiales experimentales en los siguientes ejemplos se muestran en la Tabla 1 y los instrumentos se muestran en la Tabla 2.

Tabla 1

Tabla 2

continuación

EJEMPLO 1

El Ejemplo 1 se usa para ilustrar un compuesto de acuerdo con una realización de la presente divulgación y su proceso de preparación.

1. Preparación del Fragmento I: Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH

Una resina Fmoc-Gly-2-Cl-Trt (23,5 g, 16,5 mmol) con un grado de sustitución de 0,7 mmol/g se sometió a desprotección de Fmoc con 2,5 l de solución de PIP/DMF al 25 % durante 25 minutos. La resina se filtró y después se lavó por turnos con DMF y DCM tres veces, con no menos de 1 minuto cada vez. Se añadió Fmoc-Gly-OH (14,8 g, 50 mmol) y se agitó para la reacción durante 4 horas a 30 °C. Se detectó el punto final de la reacción mediante un método de ninhidrina. Después de completarse la reacción, la resina se filtró y se lavó por turnos con DMF y DCM tres veces.

Las etapas anteriores se repitieron dos veces para conectar dos restos Gly adicionales, obteniendo finalmente una resina Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-2-Cl-Trt. La resina resultante se disolvió en 5 l de una solución de hexafluoroisopropanol/DCM al 30 % y se agitó para que reaccionara durante 2 horas. El filtrado se recogió por filtración y se secó al vacío a 30 °C durante 10 horas para dar 7,2 g de Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH, con un rendimiento del 96 % y una pureza del 95,6 %, EM m/z: 469 (M+1).

2. Preparación del Fragmento II: Resina Fmoc-Cys(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Wang

Se pesaron 10 g de la resina Fmoc-Cys(Trt)-Wang (carga 1,0 mmol/g, 10 mmol) y se colocaron en un reactor de fase sólida, al que se le añadieron 150 ml de solución de PIP/DMF al 25 % para desprotección, que se agitó a 25 °C durante 30 minutos. Después de completarse la reacción, la resina se lavó por turnos con DMF y DCM tres veces. Se disolvieron Fmoc-Pro-OH (10,1 g, 30 mmol) y HOBt (4,05 g, 30 mmol) en 150 ml de DMF y se añadieron al reactor. A la mezcla de reacción se le añadió lentamente DIC (3,78 g, 30 mmol) de 0 °C a 5 °C, después se añadió la resina de aminoácidos desprotegida y se agitó para que reaccionara a 30 °C durante 3 horas. Se detectó el punto final de la reacción mediante el método de la ninhidrina. Después de completarse la reacción, la resina se filtró y se lavó por turnos con DMF y DCM tres veces. Se repitieron las etapas anteriores y Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Har-OH y Fmoc-Cys(Trt)-OH se acoplaron secuencialmente de acuerdo con la secuencia peptídica, para obtener la resina Fmoc-Cys(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Wang, de la cual se detectó un grado de sustitución de 0,6 mmol/g.

3. Síntesis de polipéptido lineal 1-resina

El polipéptido lineal 1-resina fue Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(OtBu)-Leu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(Trt)-Cys(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Wang.

A 20 g de resina Fmoc-Cys(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Wang (grado de sustitución: 0,6 mmol/g, 12 mmol), se añadieron 300 ml de solución de PIP/DMF al 25 % para la desprotección, que se agitó a 25 °C durante 30 minutos. Después de completarse la reacción, la resina se lavó por turnos con DMF y DCM tres veces. Se disolvieron Fmoc-Ser(Trt)-OH (20,5 g, 36 mmol) y HOBt (4,86 g, 36 mmol) en 150 ml de Dm F y se añadieron al reactor. A la mezcla de reacción se le añadió lentamente DIC (4,53 g, 36 mmol) de 0 °C a 5 °C, después se añadió la resina de aminoácidos desprotegida y se agitó para que reaccionara a 30 °C durante 3 horas. Se detectó el punto final de la reacción mediante el método de la ninhidrina. Después de completarse la reacción, la resina se filtró y se lavó por turnos con DMF y DCM tres veces. Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Pro-OH y Fmoc-D-Phe-OH se introdujeron secuencialmente con el método anterior, para obtener la resina de polipéptido 1-Wang en la cual las cadenas laterales de aminoácidos están todas protegidas.

4. Preparación del polipéptido lineal bruto 1

Se añadieron 20 g de la resina de polipéptido 1-Wang en la cual las cadenas laterales de aminoácidos están todas protegidas preparada en la Etapa 3 a un agente acidificante (ácido trifluoroacético: triisopropilsilano: agua = 190 ml: 5 ml: 5 ml) y se hizo reaccionar a 25 °C durante 2 horas. La resina se filtró y se lavó con una pequeña cantidad de ácido trifluoroacético y el filtrado se combinó. En agitación vigorosa, el filtrado se añadió lentamente a 1,1 l de éter dietílico preenfriado y apareció un precipitado blanco. Después de dejarlo reposar durante 1 hora, la mezcla se sometió a filtración por succión y la torta del filtro se lavó con éter dietílico con hielo 5 veces y se secó al vacío para obtener 6 g de producto bruto.

5. Formación de enlaces disulfuro y purificación del polipéptido 1

El polipéptido 1 tiene una fórmula estructural como se muestra a continuación (una secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID NO: 4): D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gly Gly Gly Gly Ser Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys. Se disolvieron 10 g del polipéptido lineal 1 preparado en la etapa 4 en 200 ml de agua pura y a ello mismo se añadió una solución de I2 al 5 % lentamente gota a gota en agitación. La reacción se detectó mediante HPLC. Después de completarse la reacción, el producto diana se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución y se liofilizó para obtener el producto final polipéptido 1 en un peso de 1 g. Los resultados de detección de la espectrometría de masas del polipéptido 1 se muestran en la Figura 1.

EJEMPLO 2

El polipéptido 2 se preparó de la misma manera que el Ejemplo 1, excepto que el fragmento L' era Glu Ala Ala Ala Lys, para obtener el polipéptido 2 en un peso de producto de 1,2 g. Los resultados de detección de la espectrometría de masas del polipéptido 2 se muestran en la Figura 2.

El polipéptido 2 tiene una fórmula estructural como se muestra a continuación (una secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID NO: 5): D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Ala Ala Lys Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys

EJEMPLO 3

El polipéptido 3 se preparó de la misma manera que el Ejemplo 1, excepto que se retiró el fragmento Gly Gly Gly Gly Ser (es decir, el fragmento L') para obtener el polipéptido 3 en un peso de producto de 1,5 g. Los resultados de detección de espectrometría de masas del polipéptido 3 se muestran en la Figura 3.

El polipéptido 3 tiene una fórmula estructural como se muestra a continuación (una secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID NO: 6): D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Ala Ala Lys Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys

EJEMPLO 4

El polipéptido 4 se preparó de la misma manera que el Ejemplo 1, excepto que el fragmento L' era Arg Val Leu Ala Glu Ala para obtener el polipéptido 4 en un peso de producto de 0,86 g. Los resultados de detección de la espectrometría de masas del polipéptido 4 se muestran en la Figura 4.

El polipéptido 4 tiene una fórmula estructural como se muestra a continuación (una secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID NO: 7): D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Ala Ala Lys Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys

EJEMPLOS DE PRUEBA 1-4

Los Ejemplos de prueba 1 a 4 se usan para demostrar el efecto anticoagulante y de anti-agregación plaquetaria de los polipéptidos 1 a 4 preparados en los Ejemplos 1 a 4 en sangre humana. Se extrajeron 30 ml de sangre venosa de un voluntario sano, se inyectaron rápidamente en un tubo de plástico que contenía 3 ml de solución de citrato sódico al 3,8 % y después se mezcló suavemente mediante inversión hacia arriba y hacia abajo. La sangre extraída se centrifugó a 810 rpm durante 8 minutos para obtener plasma rico en plaquetas (PRP), que se sacó, después la muestra de sangre se centrifugó adicionalmente a 3510 rpm durante 8 minutos para obtener plasma pobre en plaquetas (PPP).

1. Determinación del tiempo de protrombina (PT, por sus siglas en inglés), tiempo de trombina (TT), tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT, por sus siglas en inglés): La reconstrucción y conservación de los reactivos se llevaron a cabo de acuerdo con los requisitos de funcionamiento del kit. Para cada uno de los PPP, se colocaron 10 muestras a detectar en vasos de prueba, respectivamente, y se añadieron individualmente con solución salina fisiológica, polipéptido 1, polipéptido 2, polipéptido 3 o polipéptido 4, 10 pl por muestra, y se añadió además con reactivos PT, TT, APTT, inmediatamente antes de que comenzara la prueba. El efecto de los polipéptidos 1-4 sobre la coagulación de sangre humana in vitro se muestra en la Tabla 3 (n representa el número de casos).

Tabla 3. Efecto de los polipéptidos 1-4 sobre la coagulación de sangre humana in vitro

Los resultados de la Tabla 3 muestran que, todos de los cuatro polipéptidos 1 a 4 pueden afectar a la coagulación de la sangre humana in vitro y prolongar PT, APTT y TT en diferentes grados. Entre estos compuestos a una concentración final de 1x10'6 mol/l, el polipéptido 2 prolongó PT y APTT en la multiplicidad más grande.

2. Determinación de la agregación plaquetaria: Se puso en marcha un instrumento de agregación plaquetaria y se precalentó durante 30 minutos y después se calibró con PPP. En los vasos de prueba se añadieron 270 |jl de PRP y después 10 j l de polipéptido 1, polipéptido 2, polipéptido 3 o polipéptido 4 (1,0x10‘7 mol/l) y/o 20 j l de solución salina fisiológica se añadieron respectivamente, hasta un volumen total de 300 jl. Después de la incubación durante 5 min, se añadieron 5 j l de inductor ADP y 5 j l de epinefrina para iniciar la prueba. Después de 5 minutos, se completó la prueba y se registró la tasa máxima de agregación dentro de los 5 minutos y se imprimieron los datos y mapas. Basándose en los resultados de la prueba, las tasas de inhibición de los polipéptidos 1-4 a diferentes concentraciones sobre la agregación plaquetaria en humanos se calcularon de acuerdo con la ecuación de cálculo 1 y el efecto de los polipéptidos 1-4 sobre la agregación plaquetaria humana inducida por ADP in vitro se lista en la Tabla 4. La ecuación de cálculo 1 es como sigue:

/Tasa de agregación plaquetaria antes de la administración — \

\Tasa de agregación plaquetaria después de la administración/

Tasa de inhibición de la agregación plaquetaria

Tasa de agregación plaquetaria antes de la administración ^{xlOO %}

T l 4. Ef l li i 1-4 r l r i n l ri h m n in i r ADP in vir

Los resultados de la Tabla 4 muestran que, todos de los cuatro compuestos, polipéptido 1, polipéptido 2, polipéptido 3 y polipéptido 4, pueden afectar a la agregación plaquetaria humana inducida por ADP in vitro. La integrilina a una concentración final de 3x10'6 mol/l puede inhibir completamente la agregación plaquetaria humana inducida por ADP in vitro, con una tasa de inhibición del 100 % y, entre los cuatro compuestos, polipéptido 1, polipéptido 2, polipéptido 3, polipéptido 4, a concentraciones finales de 3x 10'6 mol/l y 1x10'5 mol/l, el polipéptido 2 mostró la inhibición más fuerte sobre la agregación plaquetaria humana inducida por a Dp in vitro.

EJEMPLO DE PRUEBA 5

Este ejemplo de prueba se usa para demostrar el efecto antitrombótico del polipéptido 2 preparado en el EJEMPLO 2 en ratas.

1. Animales experimentales: 160 ratas SD sanas macho adultas, con un peso corporal de 250 g ~ 300 g, obtenidas en Beijing Vital River Co., Ltd. Número de licencia de producción animal: SCXK (Beijing) 2012-0001.

2. Muestras a probar: polipéptido 2 con un contenido peptídico del 97,21 %. Inyección de enoxaparina sódica, Aventis Intercontinental, Sanofi (Beijing) Pharmaceutical Co., Ltd., Número de aprobación del subenvasado: Número de aprobación de medicamentos del estado: J20090094. Número de lote: 2SN76, 0,4 ml: 4000 AxaIU x 2 viales. Bivalirudina para inyección, Xi'an Xintong Pharmaceutical Research Co., Ltd., con un peso molecular de 2180,2, una pureza del 96,55 % y un contenido del 69,44 %.

3. Método experimental

3.1 Formulación de reactivos y preparación de materiales

3.1.1 Formulación de reactivos

3.1.1.1 Formulación de la solución de prueba del polipéptido 2: se pesaron con precisión 200 mg de polipéptido 2 y se preparó una solución madre de 10mg/ml con solución salina fisiológica. Se tomó una cantidad apropiada de la solución madre para formular la dosis requerida de acuerdo con el peso corporal de los animales, antes del experimento cada día.

3.1.1.2 Formulación de solución de uretano al 20 %: se pesaron con precisión 20 g de uretano y se dosificaron con agua destilada hasta un volumen de 100 ml.

3.1.1.3 Formulación de solución de citrato sódico al 3,8 %: se pesaron con precisión 4,33 g de citrato sódico dihidrato y se dosifican medidos con solución salina fisiológica hasta un volumen de 100 ml, para obtener una solución al 3,8 % para su uso.

3.1.2 Preparación de materiales

3.1.2.1 Papel de aluminio: El papel de aluminio se midió con una regla y se cortó a 2,5 cm x 2,5 cm, se numeró y se pesó.

3.1.2.2 Preparación de una solución de cloruro férrico al 35 %: se tomaron 35 g de cloruro férrico y se disolvieron en 100 ml de agua destilada.

3.2 Agrupación y administración

160 ratas se dividieron aleatoriamente en grupos, de 5 a 10 ratas por grupo. 1) Grupo control del modelo: inyección intravenosa del mismo volumen de solución salina fisiológica; 2) 6 grupos de dosis de polipéptido 2: iniciando a partir de 1,5 mg/kg+3,75 mg/kg/h, que se disminuyó a 1 mg/kg+2,5 mg/kg/h, 0,5 mg/kg+1,25 mg/kg/h, 0,25 mg/kg+0,75 mg/kg/h, 0,125 mg/kg+0,375 mg/kg/h y 0,041 mg/kg+0,125 mg/kg/h; 3) 5 grupos de dosis de control positivo enoxaparina: iniciando a partir de 30 U/kg+45 U/kg/h, que se aumentó a 60 U/kg+60 U/kg/h, 30 U/kg+120 U/kg/h, 90 U/kg+120 U/kg/h, 60 U/kg 240 U/kg/h, 4) 5 grupos de dosis de control positivo bivalirudina: iniciando a partir de 0,5 mg/kg+2 mg/kg/h, que se disminuyó a 0,35 mg/kg+1,3 mg/kg/h, 0,17 mg/kg+0,65 mg/kg/h, 0,08 mg/kg+0,325 mg/kg/h. Los animales se mantuvieron en ayunas con acceso a agua 12 horas antes del experimento (como se muestra en la Tabla 5).

De acuerdo con el peso corporal en kilogramos de las ratas, la primera dosis de un fármaco se disolvió en 2 ml de solución salina fisiológica para una única inyección en bolo. La dosis de mantenimiento del fármaco se disolvió en 9 ml de solución salina fisiológica y se colocó en una bomba de microinyección de doble canal, que se goteó en 90 minutos a una velocidad de goteo de 0,1 ml/min. Al grupo de operación simulada se le administró el mismo volumen de solución salina fisiológica.

4. Operación experimental

4.1 Preparación quirúrgica de las ratas

Las ratas se mantuvieron en ayunas con acceso libre al agua durante la noche antes del experimento. Las ratas se anestesiaron con inyección intravenosa de una solución de uretano al 20 % a 5 ml/kg, se fijaron en la posición supina y después, se aislaron las arterias carótidas comunes bilaterales, las venas yugulares externas y la vena cava inferior. La vena yugular externa se sometió a intubación para su administración; la arteria carótida común de un lado se sometió a intubación para la extracción de sangre para determinar las funciones de coagulación sanguínea PT y APTT, y la arteria carótida común del otro lado se usó para el establecimiento de un modelo de trombosis arterial; y la vena cava inferior se usó para el establecimiento de un modelo de trombosis venosa.

4.2 Determinación de la función de coagulación sanguínea

Las muestras de sangre se tomaron antes de la administración, en administración durante 60 minutos y antes de finalizar la administración, respectivamente, para determinar su tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) y tiempo de protrombina (PT). Las muestras de sangre se centrifugaron a 3510 rpm durante 8 minutos para obtener plasma pobre en plaquetas (PPP). La reconstrucción y conservación de los reactivos se llevaron a cabo de acuerdo con los requisitos de funcionamiento del kit. Inmediatamente después de que cada muestra de sangre se colocara en una taza de prueba y después de que se añadieran los reactivos PT y APTT, se inició la prueba. Una vez completada la prueba, se registraron los resultados.

4.3 Modelo de trombosis arterial

Después de la administración a un mantenimiento de dosificación de carga durante 30 minutos, un papel de filtro con un diámetro de 3 mm y sumergido con solución de FeCl3 al 35 % se aplicó debajo de la arteria carótida común, debajo del cual se colocó un pequeño trozo de película de plástico (2,5 cm x 2,0 cm) para proteger los tejidos circundantes. La temperatura corporal se detectó con una sonda de temperatura en el extremo distal de la arteria, y el tiempo requerido desde el inicio de la estimulación hasta el punto en que la temperatura disminuyó 2,5 grados se examinó como el tiempo de oclusión vascular.

4.4 Modelo de trombosis venosa

Después de la administración a un mantenimiento de dosificación de carga durante 30 minutos, un papel de filtro con un diámetro de 3 mm y sumergido con solución de FeCl3 al 35 % se aplicó debajo de la vena cava inferior, debajo del cual se colocó un pequeño trozo de película de plástico (2,5 cm x 2,0 cm) para proteger los tejidos circundantes.

15 minutos después, se retiró el papel de filtro. Y a continuación, después de la observación durante 45 minutos, se enjuagaron los vasos sanguíneos y tejidos locales con solución salina fisiológica tibia y se cortaron los vasos sanguíneos cubiertos. El trombo que se adhirió a las paredes de los vasos sanguíneos se despegó para pesarlo en una lámina de estaño para determinar su peso húmedo y después se pesó durante la noche a temperatura ambiente para determinar su peso seco. La administración se continuó hasta la finalización del experimento.

5. Indicadores de prueba

5.1 Determinación de la función de coagulación sanguínea: Las muestras de sangre se tomaron 0 min antes de la administración, en administración durante 60 minutos y en la terminación de la administración, respectivamente, y después se determinaron usando un analizador de factor de coagulación de agregación plaquetaria para las funciones de coagulación de la sangre (PT, APTT) y ACT.

5.2 Tiempo de oclusión

El tiempo desde el punto en que se colocó FeCl3 hasta el punto en que la temperatura de la arteria indicó una disminución de 2,5 °C fue el tiempo de oclusión vascular, que reflejaba el estado de formación de trombos.

5.3 Peso del trombo

Después de completar el experimento, se cortó el segmento de los vasos sanguíneos en los cuales se había formado un trombo, se pesó para el peso húmedo y después se pesó durante la noche a temperatura ambiente para el peso seco del trombo. Se calculó la tasa de inhibición de la trombosis.

Tabla 5. A ru ación de dosis del oli é tido 2 fármacos de control

Tabla 6. Efecto de la administración de mantenimiento intravenosa del polipéptido 2 y fármacos de control a if r n ifi i n r r m i in i r F n r xl

Tabla 7. Efecto de la administración intravenosa de mantenimiento del polipéptido 2 y fármacos de control a diferentes dosificaciones sobre la función de coa ulación san uínea en ratas xls

(continuación)

Como puede verse en los resultados de las Tablas 6 y 7, el polipéptido 2 puede inhibir de forma dependiente de la dosis la trombosis de la vena cava inferior inducida por FeCl3 en ratas, inhibir la trombosis de la arteria carótida común inducida por FeCl3 en ratas y prolongar APTT y PT en ratas.

La Figura 5 muestra el efecto del polipéptido 2 sobre la trombosis de la vena cava inferior inducida por FeCl3 en ratas, con *P<0,05, **P<0,01 en comparación con el grupo modelo. La Figura 6 muestra el efecto del polipéptido 2 sobre la trombosis de la arteria carótida común inducida por FeCb en ratas, que muestra el múltiplo de variación en el tiempo de oclusión arterial, con *P<0,05, **P<0,01 en comparación con el grupo modelo. La Figura 7 muestra el efecto del polipéptido 2 sobre APTT en ratas. La Figura 8 muestra el efecto del polipéptido 2 sobre PT en ratas.

EJEMPLO DE PRUEBA 6

Este ejemplo de prueba se usa para ilustrar una prueba farmacodinámica de inhibición de trombos en conejos mediante administración de mantenimiento intravenosa del polipéptido 2 preparado en el

EJEMPLO 2.

1. Animales experimentales y materiales

1.1 Animales experimentales: 10 conejos macho adultos sanos, que pesaban de 2 a 2,5 kg, proporcionados por Xi’an Dilepu Biological Resources Development Co., Ltd. Número de licencia de producción animal: SCXK (Shaanxi) 2006-001. Muestras a probar: polipéptido 2 que tiene un contenido peptídico del 97,21 %. Control positivo: Inyección de enoxaparina sódica, Aventis Intercontinental, Sanofi (Beijing) Pharmaceutical Co., Ltd., Número de aprobación del subenvasado: número de aprobación de medicamentos del estado: J20090094. Número de lote: 2SN76, 0,4 ml: 4000 AxaIU x 2 viales.

1.2 Los materiales experimentales se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8

1.3 Formulación de la solución de prueba de polipéptido 2: se pesaron de forma precisa 200 mg de polipéptido 2 con una balanza electrónica y se prepararon en una solución madre de 10 mg/ml con solución salina fisiológica, que se mezcló bien suficientemente, se subenvasó en 5 ml para cada uno y se almacenó a -20 °C. Durante la prueba, se diluyó una cantidad apropiada de la solución madre y se usó mediante cálculo basado en el peso corporal de los conejos.

Solución de pentobarbital sódico al 3 %: se pesaron de forma precisa 3 g de pentobarbital sódico y se dosificaron medidos con agua destilada hasta un volumen de 100 ml.

Solución de citrato sódico al 3,8 %: se pesaron con precisión 4,33 g de citrato sódico dihidrato y se dosifican medidos con solución salina fisiológica hasta un volumen de 100 ml, para obtener una solución al 3,8 % para su uso.

Solución de epinefrina: se tomaron 1,319 ml de solución madre y se dosificaron medidos a 100ml con solución salina fisiológica para preparar una solución 60 pM, que se almacenó a 4°C en un refrigerador y se subenvasó antes de su uso.

Solución de ADP: se pesaron con precisión 14,3 mg de ADP y se disolvieron en 5 ml de solución salina fisiológica para obtener una solución de ADP 6000 pmol/l que se almacenó a 4 °C y se diluyó con solución salina fisiológica a 600 pmol/l antes del experimento.

1.4 Preparación de materiales

Papel de aluminio: El papel de aluminio se midió con una regla y se cortó a 2,5 cm x 2,5 cm, se numeraron y se pesaron; sutura quirúrgica no absorbible: se tomaron 8 cm de longitud de la sutura con una regla y se pesaron. Solución de cloruro férrico al 50 %: se tomaron 50 g de cloruro férrico y se disolvieron en 100 ml de agua destilada.

2. Agrupación y administración: 10 conejos se dividieron aleatoriamente en 3 grupos, de 2 a 3 conejos por grupo. 1) Grupo de operación simulada (NS): Inyección intravenosa del mismo volumen de solución salina fisiológica, con el mismo método de operación que anteriormente; 2) grupo de administración del polipéptido 2: 8,0 mg/kg+20,0 mg/kg/h; 3) grupo de control positivo enoxaparina: 50 U/kg+150 U/kg/h. De acuerdo con el peso corporal en kilogramos de los conejos, la primera dosis del fármaco a probar se disolvió en 2 ml de solución salina fisiológica para una única inyección en bolo. La dosis de mantenimiento se disolvió en 9 ml de solución salina fisiológica y se colocó en una bomba de microinyección de doble canal, que se goteó en 90 minutos a una velocidad de goteo de 1 ml/min. Al grupo de operación simulada se le administró el mismo volumen de solución salina fisiológica.

3. Operación experimental

3.1 Preparación quirúrgica de los conejos: Los conejos se enviaron al laboratorio para su alojamiento durante un día y después se examinaron al principio. Se tomaron muestras de sangre de las arterias dentro de los oídos, que se sometieron a análisis de sangre de rutina y ensayo de APTT y se seleccionaron para los experimentos los conejos con hemateikon en sangre normal y APTT entre 16 s y 28 s. Los conejos que iban a probarse se mantuvieron en ayunas con acceso libre al agua durante la noche anterior al experimento. Los conejos se anestesiaron con inyección intravenosa de solución de pentobarbital sódico al 3 % a 1 ml/kg, se fijaron en la posición supina y después, la arteria carótida común en un lado, la vena yugular externa, la arteria femoral en un lado, la vena femoral y la vena de la extremidad anterior en un lado se aislaron. La vena de la extremidad anterior se sometió a intubación para su administración; la vena femoral izquierda se sometió a intubación para la extracción de sangre para determinar la tasa de agregación plaquetaria; la arteria femoral se utilizó para el establecimiento de un modelo de trombosis arterial; la arteria carótida común y la vena yugular externa se usaron para el establecimiento de un modelo de trombosis de derivación arterial y venosa.

3.2 Modelo de trombosis arterial (AT): Se aplicó un pequeño trozo de papel de filtro (1 cm x 1,5 cm) absorbido con solución de FeCh al 50 % se aplicó sobre la arteria femoral derecha mientras se administra, debajo del cual se colocó un pequeño trozo de película de plástico (2,5 cm x 2,0 cm) para proteger los tejidos circundantes. Después de 10 minutos, se retiró el papel de filtro y después, se enjuagaron los vasos sanguíneos y tejidos locales con solución salina fisiológica tibia y se cortaron los vasos sanguíneos cubiertos. El trombo que se adhirió a las paredes de los vasos sanguíneos se despegó para pesarlo en una lámina de estaño para su peso húmedo y después se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente y se pesó para su peso seco.

3.3 Procedimientos experimentales: Las arterias femorales en la extremidad anterior y ambos lados en los conejos se aislaron y se estabilizaron durante 10 minutos antes de que comenzara la administración. Se estableció un modelo de AT cubriendo la arteria femoral con un papel de filtro con FeCh al 50 % durante la administración y el papel de filtro se retiró después de 15 minutos. La observación se continuó durante 120 minutos después de la administración hasta que se completó el experimento.

4. Indicadores de prueba

4.1 Tasa de agregación plaquetaria: En los puntos de 0 min antes de la administración; 30 min, 60 min, 90 min para la administración; 60 min, 120 min, 180 min después de que se terminase la administración, se tomaron muestras de sangre de 2,7 ml de la vena femoral, se inyectaron rápidamente en un tubo de centrífuga que contenía 0,3 ml de solución de citrato sódico al 3,8 % y se mezcló bien por completo. Las muestras de sangre resultantes se centrifugaron a 810 rpm (100 g) durante 8 min para obtener PRP y se centrifugaron a 3500 rpm (1863 g) durante 8 min para obtener PPP que se usó para determinar la agregación plaquetaria.

Se tomaron muestras de sangre antes de la administración (0 min), 5 min y 15 min después de la administración, respectivamente, para determinar la tasa de agregación plaquetaria que se usó para calcular la tasa inhibitoria de agregación plaquetaria con una ecuación de cálculo como sigue:

4.2 Determinación de la función de coagulación sanguínea: Se tomaron muestras de sangre y se determinó la función sanguínea (PT, APTT) a los 0 min antes de la administración, en puntos de 30 min, 60 min, 90 min después de la administración, y en puntos de 60 min, 120 min y 180 min después de la finalización de la administración, usando un analizador de factores de coagulación de agregación plaquetaria. Las muestras de sangre se centrifugaron a 3510 rpm durante 8 min para obtener plasma pobre en plaquetas (PPP). La reconstrucción y conservación de los reactivos se llevaron a cabo de acuerdo con los requisitos de funcionamiento del kit. Inmediatamente después de que se colocó cada muestra de sangre en una taza de prueba y después de que se añadieran reactivos PT, TT y APTT, se inició la prueba. Una vez completada la prueba, se registraron los resultados.

4.3 Determinación de ACT: A 0 min antes de la administración y en los puntos de administración de 5 min y 15 min, se extrajo sangre completa, a la cual se añadió caolín y se colocó en un baño de agua a 37 °C para registrar el tiempo de coagulación de la sangre completa.

4.4 Peso del trombo: Después de completar el experimento, se cortó el segmento de los vasos sanguíneos en los cuales se había formado un trombo, se pesó para el peso húmedo y después se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente y se pesó para el peso seco. La tasa de inhibición de la trombosis se calculó con una ecuación de cálculo como sigue:

í Peso del trombo antes de la administración —

^{^}Tasa de inhibición de tromb ^, osi ^.s = - ^\-^P--^e-^s--^o-- ^d--^e —^{l tr}--^o-^m---^b-^o --- ^d--^e-^s--^p-^u--^é--^s -— ^de -- ^l-^a-- ^a--^d--^m--ⁱ-ⁿ--ⁱ-^s-^t-^r-^a--^c ;ⁱ—^ón : xlOO %

Peso del trombo antes de la administración

5. Resultados de prueba:

5.1 Efecto de la administración de mantenimiento intravenoso del polipéptido 2 sobre la trombosis de la arteria femoral inducida por FeCb en conejos

Los resultados muestran el efecto del polipéptido 2 a 8,0 mg/kg+20,0 mg/kg/h sobre la trombosis de la arteria femoral inducida por FeCb en conejos, en los cuales la tasa de inhibición de la trombosis de enoxaparina a 50 U/kg+150 U/kg/h es menor que la del polipéptido 2, que no tiene diferencia estadística (P>0,05) en comparación con el grupo de solución salina fisiológica. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9. Efecto de la administración de mantenimiento intravenosa del polipéptido 2 sobre la trombosis de la arteria femoral en coneos x±s

5.2 Efecto de la administración de mantenimiento intravenosa del polipéptido 2 sobre la función de agregación plaquetaria en conejos

Los resultados muestran que, la administración de mantenimiento intravenoso del polipéptido 2 puede inhibir la agregación plaquetaria en conejos. Después de terminarse la administración, la inhibición de la agregación plaquetaria se debilitó gradualmente con el tiempo. La tasa de inhibición de la agregación plaquetaria por enoxaparina a 50 U/kg+150 U/kg/h es menor que la del polipéptido 2. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10. Efecto de la administración intravenosa única del polipéptido 2 sobre la función de agregación plaquetaria

5.3 Efecto de la administración de mantenimiento intravenosa del polipéptido 2 sobre la función de coagulación sanguínea en conejos

Los resultados se muestran en las Tablas 11-14. La Tabla 11 muestra el efecto de la administración de mantenimiento intravenosa del polipéptido 2 sobre la función de coagulación sanguínea APTT en conejos (S, (x±s)); La Tabla 12 muestra el efecto de la administración de mantenimiento intravenosa del polipéptido 2 sobre la función de coagulación sanguínea PT en conejos (S, (x±s)); La Tabla 13 muestra el efecto de la administración de mantenimiento intravenosa del polipéptido 2 sobre la función de coagulación sanguínea TT en conejos (S, (x±s)); y la Tabla 14 muestra el efecto de la administración de mantenimiento intravenosa del polipéptido 2 sobre ACT en conejos (S, (x±s)). En las Tablas 11-14, la unidad de dosis es (mg/kg+mg/kg/h). Los resultados muestran que la administración de mantenimiento intravenosa del polipéptido 2 puede inhibir la agregación plaquetaria en conejos. Después de terminarse la administración, la inhibición de la agregación plaquetaria se debilitó gradualmente con el tiempo.

Los resultados anteriores muestran que, la inyección en bolo (iv) goteo intravenoso (vd) del polipéptido 2 durante 90 minutos puede inhibir la agregación plaquetaria en conejos, afectar a la función de coagulación de la sangre en conejos, prolongar APTT, PT, TT y ACT y también inhibir la trombosis de la arteria femoral. Cuando el polipéptido 2 y la enoxaparina tienen el efecto comparable de inhibir la trombosis de la arteria femoral e inhibir la agregación plaquetaria, la enoxaparina prolonga APTT más que el polipéptido 2, lo que indica que el riesgo de hemorragia de la enoxaparina es mayor que el del polipéptido 2.

EJEMPLO DE PRUEBA 7

Este ejemplo de prueba se usa para ilustrar experimentos antitrombóticos así como anticoagulantes y anti-agregación plaquetaria in vivo con administración intravenosa única en conejos. Animales experimentales: 48 conejos macho adultos sanos, que pesaban de 2 a 2,5 kg, proporcionados por Xi'an Dilepu Biological Resources Development Co., Ltd., Número de licencia de producción animal: SCXK (Shaanxi) 2006-001. Muestras a probar: polipéptido 2 que tiene un contenido peptídico del 97,21 %. Fármacos positivos: enoxaparina y bivalirudina.

[Método experimental]

1. Agrupación y administración: 48 Conejos se dividieron aleatoriamente en 6 grupos, 8 conejos por grupo. 1) Grupo de operación simulada (NS): Inyección intravenosa del mismo volumen de solución salina fisiológica; 2) grupo de control positivo bivalirudina (6 mg/kg); 3) grupo de control positivo enoxaparina (200 U/kg); 4) Grupo de dosis baja de polipéptido 2 (3,0 mg/kg); 5) Grupo de dosis media de polipéptido 2 (6,0 mg/kg); 6) Grupo de dosis alta de polipéptido 2 (12,0 mg/kg). El polipéptido 2 se administró mediante administración intravenosa única. De acuerdo con el peso corporal en kilogramos de los conejos, la muestra se disolvió en 2 ml de solución salina fisiológica para una única inyección en bolo. Al grupo de operación simulada se le administró el mismo volumen de solución salina fisiológica.

2. Operación experimental

2.1 Preparación quirúrgica de los conejos: Los conejos se enviaron al laboratorio para su alojamiento durante un día y después se examinaron al principio. Se tomaron muestras de sangre de las arterias dentro de los oídos, que se sometieron a análisis de rutina de sangre y exámenes APTT y los conejos con un hemograma sanguíneo normal y APTT entre 16 y 28 segundos se seleccionaron para los experimentos. Los conejos que iban a analizarse se mantuvieron en ayunas con acceso libre al agua la noche anterior al experimento. Los conejos se anestesiaron con inyección intravenosa de solución de pentobarbital sódico al 3 % a 1 ml/kg, se fijaron en la posición supina y después, la arteria carótida común en un lado, la vena yugular externa, la arteria femoral en un lado, la vena femoral y la vena de la extremidad anterior en un lado se aislaron. La vena de la extremidad anterior se sometió a intubación para su administración; la vena femoral izquierda se sometió a intubación para la extracción de sangre para determinar la tasa de agregación plaquetaria; la arteria femoral se utilizó para el establecimiento de un modelo de trombosis arterial; la arteria carótida común y la vena yugular externa se usaron para el establecimiento de un modelo de trombosis de derivación arterial y venosa.

2.2 Modelo de trombosis de derivación arterial y venosa (AVST): Una derivación arterial y venosa que consiste en dos carcasas, de las cuales una carcasa exterior tiene una longitud de aproximadamente 8 cm y un diámetro interno de 7,9 mm, la carcasa interior tiene una longitud de aproximadamente 2,5 cm y un diámetro interno de 4,8 mm. El tubo de polietileno se cargó con un hilo de seda de aproximadamente 8 cm de largo y se llenó con una solución de heparina 50 M/ml, del cual un extremo se insertó en la arteria femoral izquierda y el otro extremo se insertó en la vena femoral derecha. Después de la administración durante 30 segundos, se liberó el flujo sanguíneo, que fluía desde la arteria izquierda al tubo de polietileno y regresaba a la vena derecha. Después de 15 minutos, el flujo de sangre se interrumpió, el hilo de seda se retiró rápidamente y se colocó en un papel de aluminio (tamaño: 2,5 cm x 2,5 cm), se midió para su peso húmedo y se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente y se pesó para su peso seco.

2.3 Modelo de trombosis arterial (AT): Un pequeño trozo de papel de filtro (1 cm x 1,5 cm) absorbido con solución de FeCl3 al 50 % se aplicó en la arteria femoral derecha mientras la administración, debajo del cual se colocó un pequeño trozo de película de plástico (2,5 cm x 2,0 cm) para proteger los tejidos circundantes. Después de 10 minutos, se retiró el papel de filtro y después, se enjuagaron los vasos sanguíneos y tejidos locales con solución salina fisiológica tibia y se cortaron los vasos sanguíneos cubiertos. El trombo que se adhirió a las paredes de los vasos sanguíneos se despegó para pesarlo en una lámina de estaño para su peso húmedo y después se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente y se pesó para su peso seco.

2.4 Procedimientos experimentales: Los procedimientos experimentales se muestran en la Figura 9. Las arterias femorales en la extremidad anterior y ambos lados en los conejos se aislaron y estabilizaron durante 10 min antes de que comenzara la administración. Se estableció un modelo AT cubriendo la arteria femoral con papel de filtro con FeCh al 50 % durante la administración y el papel de filtro se retiró después de cubrir durante 15 minutos. Se estableció un modelo AVST y se retiró después de 40 minutos. La observación se continuó durante 120 minutos después de la administración hasta que se completó el experimento.

3. Indicadores de prueba

3.1 Tasa de agregación plaquetaria: se extrajeron 2,7 ml de sangre de la vena femoral, se inyectaron rápidamente en un tubo de centrífuga que contenía 0,3 ml de solución de citrato sódico al 3,8 % y se mezcló bien por completo. Las muestras de sangre resultantes se centrifugaron a 810 rpm (100 g) durante 8 min para obtener PRP, que se quitó y se centrifugó a 3500 rpm (1863 g) durante 8 min para obtener PPP, que se usó para determinar la agregación plaquetaria.

Se tomaron muestras de sangre en un punto antes de la administración (0 min) y en los puntos de administración durante 5 min y 15 min, respectivamente, para determinar la tasa de agregación plaquetaria, que se usó para calcular la tasa inhibitoria de agregación plaquetaria con una ecuación de cálculo como sigue:

/Tasa de agregación plaquetaria antes de la administración — \

^,Tasa d ^,e inhibición de la agregació ^,n plaquetaria = - ^\-^T--^a-^s--^a-- ^d-^e -- ^a-^g--^r-^e--^g-^a--^c-ⁱ-^ó-^{n l} ;-- ^p--^a --^q-^u--^e-^t-^a--^r-ⁱ-^a-- ^d--^e-^s-^p--^u-^é--^s -— ^de--- ^l-^a- ^a --^d--^m--ⁱ-ⁿ--ⁱ-^s-^t-^r-^a-^ción/ ;-----xlOO %_{Tasa de agregación plaquetaria antes de la administración}

3.2 Determinación de la función de coagulación sanguínea: Se tomaron muestras de sangre y la función sanguínea (PT, TT, APTT) se determinó 0 min antes de la administración, en puntos de 5 min y 15 min después de la administración, usando un analizador de factores de coagulación de agregación plaquetaria. Las muestras de sangre se centrifugaron a 3510 rpm durante 8 min para obtener plasma pobre en plaquetas (PPP). La reconstrucción y conservación de los reactivos se llevaron a cabo de acuerdo con los requisitos de funcionamiento del kit. Inmediatamente después de que se colocó cada muestra de sangre en una taza de prueba y después de que se añadieran reactivos Pt , TT y APTT, se inició la prueba. Una vez completada la prueba, se registraron los resultados.

3.3 Determinación de ACT: A 0 min antes de la administración y en los puntos de administración de 5 min y 15 min, se extrajo sangre completa, a la cual se añadió caolín y se colocó en un baño de agua a 37 °C para registrar el tiempo de coagulación de la sangre completa.

3.4 Peso del trombo: Después de completar el experimento, se cortó el segmento de los vasos sanguíneos en los cuales se había formado un trombo, se pesó para el peso húmedo y después se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente y se pesó para el peso seco. La tasa de inhibición de la trombosis se calculó con una ecuación de cálculo como sigue:

/ Peso del trombo antes de la administración — \

\Peso del trombo después de la adm inistración/

Tasa de inhibición de trombosis xlOO %

Peso del trombo antes de la administración

4. Resultados de prueba:

4.1 Efecto de la administración intravenosa única del polipéptido 2 sobre la trombosis de la arteria femoral inducida por FeCl3 en conejos.

Los resultados se muestran en la Figura 10 y la Tabla 15. La administración intravenosa única de diferentes concentraciones de polipéptido 2 puede reducir el peso seco del trombo de la arteria femoral inducido por FeCl3 en conejos e inhibe la trombosis de la arteria femoral inducida por FeCl3 en conejos. En comparación con el grupo de solución salina fisiológica, hubo una diferencia estadística significativa (P<0,05) para el grupo de dosis baja de polipéptido 2 en 3,0 mg/kg (P<0,05); hubo una diferencia estadística muy significativa para el grupo de dosis media de polipéptido 2 en 6,0 mg/kg y el grupo de dosis alta de polipéptido 2 en 12,0 mg/kg (P<0,01); y el efecto de anti-trombosis arterial en el grupo de dosis media del polipéptido 2 fue mejor que el del grupo de bivalirudina.

Tabla 15. Efecto de la administración intravenosa única de polipéptido 2 sobre la trombosis de la arteria femoral inducida or FeCÍ3 en coneos x±s

continuación

4.2 Efecto de la administración intravenosa única de polipéptido 2 sobre la trombosis de derivación arterial femoral y venosa en conejos

Como se muestra en la Figura 11 y la Tabla 16, la administración intravenosa única de diferentes concentraciones de polipéptido 2 puede reducir el peso seco del trombo en la derivación arterial y venosa femoral en conejos e inhibir la trombosis de derivación femoral y venosa en conejos. En comparación con el grupo de solución salina fisiológica, hubo una diferencia estadística muy significativa para el grupo de dosis media del polipéptido 2 en 6,0 mg/kg y el grupo de dosis alta del polipéptido 2 en 12,0 mg/kg (P<0,01) y el efecto anti-trombosis de derivación venosa y arterial en el grupo de dosis media del polipéptido 2 fue significativamente mejor que en los grupos de bivalirudina y enoxaparina.

Tabla 16. Efecto de la administración intravenosa única de polipéptido 2 durante 15 min sobre la trombosis de derivación arterial femoral venosa en coneos x±s

4.3 Efecto de la administración intravenosa única del polipéptido 2 sobre la función de agregación plaquetaria en conejos

Los resultados se muestran en la Figura 12 y la Tabla 17, lo que indica que la administración intravenosa única del polipéptido 2 en cada grupo de dosis puede inhibir la agregación plaquetaria en conejos. Después de terminarse la administración, la inhibición sobre la agregación plaquetaria se debilitó gradualmente con el tiempo.

La administración intravenosa única del polipéptido 2 en cada grupo de dosis durante 5 minutos puede inhibir la agregación plaquetaria en conejos en diferentes grados. En comparación con el grupo de solución salina fisiológica, hubo una diferencia estadística significativa para el grupo de dosis media del polipéptido 2 en 6,0 mg/kg y el grupo de dosis alta del polipéptido 2 en 12,0 mg/kg (P<0,05); y el efecto antiplaquetario en el grupo de dosis media del polipéptido 2 fue significativamente mejor que en los grupos de bivalirudina y enoxaparina. Para el punto de administración durante 15 min, la inhibición de la agregación plaquetaria en conejos se debilitó gradualmente. En comparación con el grupo de solución salina fisiológica, hubo una diferencia significativa para el grupo de dosis alta de polipéptido 2 en 12,0 mg/kg (P<0,05).

Tabla 17. Efecto de la administración intravenosa única del polipéptido 2 sobre la función de agregación plaquetaria

continuación

4.4 Efecto de la administración intravenosa única del polipéptido 2 sobre la función de coagulación sanguínea en conejos

Los resultados muestran que, la administración del polipéptido 2 puede prolongar APTT, PT, TT y ACT en conejos. Después de terminarse la administración, la prolongación de los indicadores de coagulación sanguínea anteriores se debilitó gradualmente con el tiempo.

4.4.1 Efecto sobre APTT en conejos

Los resultados se muestran en la Figura 13 y las Tablas 18 y 19. En cada grupo de dosis del polipéptido 2, el APTT en conejos puede prolongarse en diferentes grados. La prolongación de APTT se debilitó gradualmente en el tiempo en 15 minutos. Después de la administración durante 5 min, en comparación con el grupo de solución salina fisiológica, hubo una diferencia estadística significativa para el grupo de dosis media del polipéptido 2 en 6,0 mg/kg y el grupo de dosis alta del polipéptido 2 en 12,0 mg/kg (P<0,05); y después de la administración durante 15 min, en comparación con el grupo de solución salina fisiológica, hubo una diferencia estadística significativa para el grupo de dosis media del polipéptido 2 en 6,0 mg/kg y el grupo de dosis alta del polipéptido 2 en 12,0 mg/kg (P<0,05).

Tabla 19. Efecto de la administración intravenosa única de polipéptido 2 sobre APTT en conejos (multiplicidad de rolon ación x±s

Efecto sobre PT en conejos

Los resultados se muestran en la Figura 14, la Tabla 20 y la Tabla 21. El polipéptido 2 en cada grupo de dosis puede prolongar el PT en conejos en diferentes grados y la prolongación del t P se debilitó gradualmente con el tiempo en 15 min.

Después de la administración durante 5 min, en comparación con el grupo de solución salina fisiológica, hubo una diferencia estadística significativa para el grupo de dosis media del polipéptido 2 en 6,0 mg/kg y el grupo de dosis alta del polipéptido 2 en 12,0 mg/kg (P<0,05); y después de la administración durante 15 min, en comparación con el grupo de solución salina fisiológica, hubo una diferencia estadística significativa para el grupo de dosis media del polipéptido 2 en 6,0 mg/kg y el grupo de dosis alta del polipéptido 2 en 12,0 mg/kg (P<0,05).

Tabla 20. Efecto de la administración intravenosa única del oli é tido 2 sobre el PT en coneos S xtSc

Tabla 21. Efecto de la administración intravenosa única de polipéptido 2 sobre PT en conejos (multiplicidad de r l n i n x±

4.4.3 Efecto sobre TT en conejos

Los resultados se muestran en la Tabla 22. La administración durante 5 min y 15 min en cada grupo de dosis del polipéptido 2 puede prolongar TT en conejos, que es más largo que el límite de detección en 180 segundos.

Tabla 22. Efecto de la administración intravenosa única del oli é tido 2 sobre el TT en coneos S xtSc

4.4.4 Efecto del polipéptido 2 sobre ACT en conejos

Los resultados se muestran en la Figura 15, la Tabla 23 y la Tabla 24. El polipéptido 2 en cada grupo de dosis puede prolongar el ACT en conejos en diferentes grados y la prolongación del ACT se debilitó gradualmente con el tiempo en 15 min.

Después de la administración durante 5 min, en comparación con el grupo de solución salina fisiológica, hubo una diferencia estadística significativa para el grupo de dosis alta de polipéptido 2 en 12,0 mg/kg (P<0,05). Después de la administración durante 15 min, en comparación con el grupo de solución salina fisiológica, hubo una diferencia estadística significativa para el grupo de dosis baja en 3,0 mg/kg, el grupo de dosis media en 6,0 mg/kg y el grupo de dosis alta en 12,0 mg/kg de polipéptido 2 (P<0,05).

T l 2 . Ef l mini r i n inr v n ni li i 2 r A T n n x±

Tabla 24. Efecto de la administración intravenosa única de polipéptido 2 sobre ACT en conejos (multiplicidad de r l n i n x±

La administración intravenosa única del polipéptido 2 puede inhibir la trombosis de la arteria femoral inducida por FeCh en conejos e inhibe de forma dependiente de la dosis la trombosis de derivación venosa y arterial femoral en conejos, en los cuales el efecto antitrombótico en los grupos de dosis media y alta de los mismos es superior al del grupo de bivalirudina; así como el polipéptido 2 puede inhibir la agregación plaquetaria en conejos de una manera dependiente de la dosis, afectar a la función de coagulación de la sangre en conejos y prolongar APTT, PT, TT y ACT.

EJEMPLO DE PRUEBA 8

Este ejemplo de prueba se usa para demostrar el efecto protector del polipéptido 2 sobre el ictus isquémico progresivo.

1. Animales experimentales: 60 ratas SD macho adultas sanas, con un peso corporal de 250 g a 300 g, adquiridas en el Centro Animal de Xi'an Jiaotong University Medical College. Número de licencia de producción animal: SCXK (shaanxi) 2012-003.

2. Muestras a probar: polipéptido 2 que tiene un contenido peptídico del 97,21 %; fármaco control: inyección de enoxaparina, producida por Sanofi (Beijing) Pharmaceutical Co., Ltd., Número de lote: 4SH69.

3. Método experimental:

3.1 Formulación de solución: polipéptido 2: se formuló una solución madre de 2 mg/ml antes de su uso.

3.2 Agrupación y administración: A los 15 minutos de que se hubiera establecido el molde, la administración se inició mediante intubación de la vena yugular, con la primera dosis y la dosis de mantenimiento durante 60 min, en que al grupo de administración se le administró polipéptido 2 a una dosis de 0,25 mg/kg+0,75 mg/kg/h, mientras que al grupo modelo se le administró solución salina fisiológica.

3.3 Operación experimental: Método de sutura (método de inserción de la arteria carótida común): la piel del cuello se abrió a partir de una incisión media en el mismo y las arterias carótidas común, externa e interna se aislaron de la misma. La arteria carótida común se ligó en el extremo proximal del corazón y la arteria carótida externa se ligó en el extremo distal. El extremo distal de la arteria carótida interna se ocluyó temporalmente con una pequeña pinza vascular y en la bifurcación de las arterias carótidas común, externa e interna, se reservó un hilo para ligadura. Se cortó una pequeña abertura con una tijera ocular en la arteria carótida común que estaba cerca de la arteria carótida interna, para permitir un cierto grado de flexión de la rosca MCAO, que se inserta en la arteria carótida interna a lo largo de la arteria carótida común. Durante la inserción del hilo, el hilo se dobló hacia la dirección del operador, que se empujó lentamente hacia adelante unos 18 mm (desde la bifurcación de las arterias) y terminó cuando se sintió una resistencia. El hilo reservado se ligó en la bifurcación para fijar el hilo. A los 15 minutos de que se hubiera establecido el molde, se administró la primera dosis seguida de la dosis de mantenimiento durante 60 min y después de que finalizara la administración, la herida en el cuello se suturó de manera convencional.

4. Indicadores de prueba

4.1 Puntuaciones neuroconductuales: Las ratas de ambos grupos fueron evaluadas en términos de sus puntuaciones neuroconductuales a las 4, 8 y 24 horas después de la cirugía, con un método de cuarteado de cinco puntos Longa como el patrón: 0 punto: sin defecto neurológico; 1 punto: aducción y falto de extensión completa de las extremidades anteriores en el lado contralateral al levantar la cola; 2 puntos: rotación hacia el lado contralateral; 3 puntos: volcar y caer hacia el lado contralateral al caminar; 4 puntos: incapacidad para caminar o coma. Los casos con 1 a 4 puntos se clasificaron como modelos válidos.

4.2 observación de lesiones de infarto y volumen de infarto mediante tinción con TTC: En las 24 horas después de la cirugía, los animales se sacrificaron y se cogió el cerebro para la tinción con TTC. El volumen de infarto se calculó usando un software de mapeo.

4.3 Índice cerebral, contenido de agua cerebral: Las ratas de cada grupo se decapitaron rápidamente 24 horas después de la cirugía y el establecimiento del modelo y todo el cerebro se despegó rápidamente, que se pesó después para determinar el peso húmedo y se usó para calcular el índice cerebral: Índice cerebral = peso húmedo del cerebro/peso corporal * 100 %

5. Resultados de las pruebas

Los resultados de las pruebas en las Tablas 25 y 26 muestran que, el polipéptido 2 a las dosis de 0,5+1,25 y 1,0+2,5 (mg/kg+mg/kg/h) redujo el volumen del infarto cerebral de (23,41 ±10,08)% a (11,12±6,56)% y (8,01±6,66)% 24 horas después la cirugía, respectivamente; y la lesión neuroconductual también mejoró, indicando el efecto protector sobre el infarto cerebral experimental.

T l 2 . Ef l li i 2 r l m r mi n n r l i x ±

T l 2 . Ef l li i 2 r l v l m n l inf r r r l l ín i r r l x±

EJEMPLO DE PRUEBA 9

Este ejemplo de prueba se usa para demostrar el efecto protector del polipéptido 2 sobre la embolia pulmonar inducida por trombina en ratones.

1. Animales experimentales: Ratones Kunming, macho, de 6 a 8 semanas de edad, de 20 g a 25 g, proporcionados por el centro de animales experimentales de Xi'an Jiaotong University. Número de licencia de producción animal SCXK (Shaanxi) 2012-003.

2. Reactivos experimentales

2.1 Trombina: sigma Company, Número de lote T4648, derivado de suero bovino, especificación: 1000 U/botella.

2.2 Inyección de enoxaparina: 0,4 ml: 4000AxalU, Sanofi (Beijing) Pharmaceutical Co., Ltd., Número de aprobación del subenvasado: Aprobación de medicina estatal N.°: J20090094.

2.3 Polipéptido 2, que se obtuvo encomendando a Jill Biochemical (Shanghai) Co., Ltd., Número de lote P131029-ML360794, que tiene un contenido peptídico del 97,21 %.

3. Equipo experimental

Analizador automático de células sanguíneas BC-2800Vet Mindray, Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.

4. Método experimental

Los ratones se dividieron aleatoriamente en 7 grupos con 10 ratones por grupo, en los cuales el grupo 1 era el grupo de solución salina fisiológica, el grupo 2 era el grupo control modelo, el grupo 3 fue el grupo de control positivo de enoxaparina 0,5 mg/kg, el grupo 4 fue el grupo de control positivo de bivalirudina 8 mg/kg, el grupo 5 fue el grupo de dosis baja de polipéptido 2 a 2,5 mg/kg, el grupo 6 fue el grupo de dosis media del polipéptido 2 a 5,0 mg/kg y el grupo 7 fue el grupo de dosis alta del polipéptido 2 a 10,0 mg/kg. Excepto que el grupo de solución salina fisiológica y el grupo control modelo se sometieron a una inyección intravenosa en la cola de 200 pl de solución salina fisiológica, los otros grupos se administraron de acuerdo con las dosis, respectivamente. Después de 2 min, a los ratones del grupo de solución salina fisiológica se les administró 100 pl de solución salina fisiológica a través de inyección intravenosa en la cola y a los otros grupos se les administraron a cada uno 100 pl de trombina basado en 1500 u/kg (80 % al 90 % de la dosis letal) mediante inyección intravenosa en la cola. Se observó a los ratones después de la administración de su muerte dentro de los 15 min. Los ratones que no murieron en 15 minutos se sometieron a los tratamientos como sigue.

(1) Registro de la tasa de mortalidad: se registró el estado de muerte de los ratones con embolia pulmonar aguda en 15 minutos y se registró el tiempo de supervivencia, para calcular la tasa de mortalidad;

(2) Determinación del coeficiente pulmonar: inmediatamente después de la muerte, los tejidos bronquiales y adiposos se disecaron del tejido pulmonar y el tejido pulmonar se lavó con agua destilada y se pesó para determinar el peso del pulmón después de absorber el agua de la superficie del pulmón con un papel de filtro. Se extrajo el pulmón y se pesó, para calcular el coeficiente pulmonar. Coeficiente pulmonar = peso pulmonar/peso corporal x 100 %;

(3) Determinación del número de plaquetas: para los ratones que no murieron en 15 minutos, se extrajo sangre de los ojos y se midió su número de plaquetas después de la anticoagulación con EDTA. El pulmón se diseccionó inmediatamente y se extrajo y se pesó para determinar el coeficiente pulmonar.

5. Resultados experimentales

En el grupo de modelo de LPS, 12 de 13 ratones murieron con una tasa de mortalidad del 85%, que tuvo una diferencia muy significativa con la del grupo de solución salina fisiológica (P<0,01). En los grupos de enoxaparina 0,5 mg/kg, bivalirudina 8 mg/kg y polipéptido 2 a una dosis alta de 10,0 mg/kg, 1 de 10 ratones murieron con una tasa de mortalidad del 10 %, que tiene una diferencia muy significativa con la del grupo modelo, respectivamente (P<0,01). En el grupo de dosis media del polipéptido 2 a 5,0 mg/kg, 3 de 10 ratones murieron con una tasa de mortalidad del 30 %, que tuvo una diferencia muy significativa con la del grupo modelo (P<0,01). No hubo diferencias significativas en la mortalidad entre los grupos de polipéptido 2 y enoxaparina 0,5 mg/kg o bivalirudina 8 mg/kg, respectivamente (P>0,05).

En el grupo de dosis baja de polipéptido 2 a 2,5 mg/kg, 6 de 10 ratones murieron con una tasa de mortalidad del 60 %, que no tiene una diferencia significativa en comparación con la del grupo modelo (P>0,05), tuvo una diferencia significativa en comparación con la de enoxaparina 250 U/kg y bivalirudina 8 mg/kg (P<0,01) y tuvo una diferencia significativa en comparación con los grupos de polipéptido 2 en una dosis media de 5,0 mg/kg y en una dosis alta 10,0 mg/kg (P<0,05). Para los ratones del grupo modelo, el coeficiente pulmonar aumentó significativamente, que tenía una diferencia muy significativa (P<0,01) en comparación con el grupo de solución salina fisiológica; el

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de múltiples dianas con anticoagulación y antagonismo del receptor GPIIb/IIIa de plaquetas, teniendo dicho compuesto una estructura como se muestra en la Fórmula (1):

A-L-B-L'-C Fórmula (1)

en donde A y B son sitios de unión a trombina, C es un sitio de unión al receptor GPIIb/IIIa de plaquetas, L es un primer enlazador y L' es un segundo enlazador,

en donde L' tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (2):

((Gly)n1-(Ser)n2)n3 Fórmula (2)

en donde n1 es 1, 2, 3 o 4; n2 es 0 o 1; y n3 es 0, 1,2 o 3; o L' tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (3):

(Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)n1 Fórmula (3)

en donde n1 es 0, 1,2 o 3 o L' tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (4):

(Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala)n1 Fórmula (4)

en donde n1 es 0, 1, 2 o 3;

en donde A tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (5):

A1-A2-A3-A4 Fórmula (5)

en donde A1 es D-Phe; A2 es Pro o Pip; A3 es Arg, Lys, Orn o Har; y A4 es Pro, D-Pro o Ser;

en donde B tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (6):

B1-B2-B3-B4-B5 Fórmula (6)

en donde B1 es un dipéptido que consiste en cualesquiera dos aminoácidos ácidos;

B2 es Val, Leu, Ile, Nle o Phe;

B3 es Hyp, Ser, Pro o un N-metil aminoácido;

B4 es un dipéptido que consiste en cualesquiera dos aminoácidos ácidos; y

B5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha y Pro o B5 es un dipéptido que comprende al menos un aminoácido seleccionado de Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha y Pro; en donde C tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (7):

Cys-Har-C1-Asp-Trp-Pro-C2 Fórmula (7)

en donde C1 es Gly o Ser; C2 es Cys o una estructura obtenida reemplazando -OH en Cys por -NH2; y se forma un enlace disulfuro entre dos grupos mercapto en la Fórmula (7);

en donde L tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (8):

L1-L2-L3-L4-Gly-Asp-L5 Fórmula (8)

en donde L1 es Gly, Ala, Val o Gly-Gly; L2 es Gly o Cys; L3 es Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly o un aminoácido dextrógiro; L4 es Asn o Gln; L5 es uno seleccionado de Phe, Tyr, un derivado en el cual un anillo de benceno de Phe está sustituido y un derivado en el cual está sustituido un anillo de benceno de Tyr.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde A-L-B se selecciona de una de las secuencias polipeptídicas mostradas en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 3.

3. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicho compuesto tiene una estructura como se muestra en la Fórmula (9):

X-A-L-B-L'-C-Y Fórmula (9)

en donde X es uno seleccionado de hidrógeno, uno o dos alquilo C1-C6, uno o dos acilo C2-C10, benciloxicarbonilo y ferc-butoxicarbonilo; Y es uno seleccionado de OH, alcoxi C1-C6, un amino y un amino sustituido con uno o dos alquilo C1-C4.

4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho compuesto comprende una secuencia polipeptídica de estructuras polipeptídicas mostradas en SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 7.

5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho compuesto es uno seleccionado de estructuras polipeptídicas mostradas en SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 7.

6. Una sal de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. La sal de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha sal es una sal de acetato del compuesto o una sal de trifluoroacetato del compuesto.

8. Un método para preparar un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho método comprende las etapas de:

(1) conectar secuencialmente aminoácidos protegidos o fragmentos a partir del carboxilo terminal de acuerdo con la secuencia polipeptídica usando un método de síntesis en fase sólida, para obtener un polipéptido-resina de Wang en el cual todas las cadenas laterales de aminoácidos están protegidas;

(2) someter el polipéptido-resina de Wang en el cual las cadenas laterales de aminoácidos están todas protegidas a la hidrólisis ácida con un agente hidrolizante ácido para obtener un polipéptido lineal bruto; y

(3) ciclar el polipéptido lineal bruto para formar un enlace disulfuro y después purificar con cromatografía líquida preparativa de alta presión, para obtener una secuencia polipeptídica.

9. Una composición farmacéutica, en donde dicha composición farmacéutica comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una sal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7 como un principio activo y, preferentemente, la forma de dosificación de dicha composición farmacéutica es una inyección, un comprimido, una cápsula, una píldora, un polvo, un gránulo, una suspensión o una emulsión.

10. El compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en la prevención y el tratamiento de trombosis arterial periférica, trombosis de derivación arterial y venosa; trombosis formada en síndromes coronarios agudos, intervención coronaria percutánea o terapia con una endoprótesis vascular en PCI; ictus isquémico progresivo; embolia pulmonar aguda; o trombosis en el trasplante de órganos y tejidos.

11. La sal de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7 para su uso en la prevención y el tratamiento de trombosis arterial periférica, trombosis de derivación arterial y venosa; trombosis formada en síndromes coronarios agudos, intervención coronaria percutánea o terapia con una endoprótesis vascular en PCI; ictus isquémico progresivo; embolia pulmonar aguda; o trombosis en el trasplante de órganos y tejidos.