CN107759662B

CN107759662B - 一种抗凝血化合物、其制备方法和用途、及包含其的药物组合物

Info

Publication number: CN107759662B
Application number: CN201711050744.4A
Authority: CN
Inventors: 马骉; 杜欣; 孔双泉
Original assignee: Beijing Pharmaceutical Race And Co ltd
Current assignee: Beijing Pharmaceutical Race And Co ltd
Priority date: 2013-08-28
Filing date: 2013-08-28
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2033-08-28
Also published as: CN104418938A; CN104418938B; CN107759662A

Abstract

本发明涉及一种如下述通式(Ⅰ)和通式(Ⅱ)所示的化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐。本发明还涉及了所述化合物的制备方法及其用途。此外，本发明还涉及了包含所述化合物的药物组合物及其用途。本发明提供了一种可用作凝血酶和/或血小板GPⅡb/Ⅲa受体抑制剂的化合物，具有良好的体外人凝血酶抑制活性、体外血小板GPⅡb/Ⅲa受体抑制作用以及体外/体内抗血小板聚集功效，并且无明显毒性。本发明提供的化合物结构新颖、生物活性好、合成简便，是一种具有良好应用前景的具有抗凝功效的药物。

Description

一种抗凝血化合物、其制备方法和用途、及包含其的药物组合物

本申请是对申请日2013.08.28；申请号2013103819956；发明名称“一种抗凝血化合物、其制备方法和用途、及包含其的药物组合物”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种抗凝血化合物、其制备方法和用途、及包含其的药物组合物及其用途。

背景技术

血栓是在血管中形成的血块，于循环系统中会妨碍或阻断血流。当血管受损时，血液中的血小板和纤维蛋白会聚集而形成血块修补之，以避免失血或因血流冲击造成血管进一步伤害。但若血块脱落，就很可能成为血栓。作为一种严重的周围血管疾病，血栓是一种发病范围非常广泛的全身性疾病，它可以影响上肢、下肢、内脏血管和颈动脉；当血栓发生于心脏部位时，可出现心肌梗塞；发生在头部时可造成脑梗塞，俗称中风；发生于下肢，则可导致下肢深静脉血栓及动脉血栓。血栓发病率高、危害更甚，资料统计，因血栓栓塞性疾病导致的死亡已占到全球总死亡人数的51％，远远超过肿瘤传染疾病、呼吸系统疾病等造成的死亡。我国每年以血栓栓塞为主要表现的脑卒中和心肌梗塞所导致的死亡人数约为260万，平均每12秒就死亡1人。

心血管内膜内皮细胞损伤，是血栓形成的最重要和最常见的原因。内皮细胞损伤，暴露了内皮下的胶原纤维，激活血小板和凝血因子Ⅻ，启动了内源性凝血系统。损伤的内皮细胞释放组织因子，激活凝血因子Ⅶ，启动外源性凝血系统。在触发凝血过程中重要作用的是血小板的活化，包括以下三步：

1)黏附反应：血小板在vWF的介导下粘附于内皮损伤处的胶原纤维。

2)释放反应：血小板的α颗粒(含有纤维蛋白原、纤维连接蛋白、抗肝素即血小板第4因子、血小板生长因子及血小板所合成的凝血酶敏感白)和致密颗粒(含有丰富的ADP、Ca²⁺、去甲肾上腺素、组胺、5-HT)的内容物向血小板外释出，其中ADP对在此经过的血中血小板不断地互相粘集起了重大作用。与此同时，血小板的膜磷脂(PF3)也暴露于细胞膜，成为和凝血因子Ⅸa、Ⅷa、Ca²⁺结合的场所，X在这里被激活后，Xa、Va、Ca²⁺也在这里结合，形成凝血酶原酶、将凝血酶原激活成凝血酶。

3)粘集反应：在ADP、凝血酶、血栓素A2等诱导下，血小板GPⅡb/Ⅲa受体形成，血小板之间通过GPⅡb/Ⅲa受体与纤维蛋白原相互连接，形成可逆性的血小板聚集体。血小板的膜磷脂(PF3)提供凝血反应表面，加速凝血酶原酶和凝血酶(FⅡa)的形成，后者可进一步使血小板聚集，变为不可逆性血小板聚集体，在整个血小板聚集体中，凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而使血小板紧紧交织在一起，逐渐形成血栓。

凝血酶属于胰蛋白酶样丝氨酸蛋白水解酶，具有多种生理活性，在止血和血栓形成过程中起枢纽性作用。以凝血酶为靶点来抑制血栓的形成，近年来成为药学领域研究热点。

直接凝血酶抑制剂分为二价抑制剂和一价抑制剂：

1)二价直接凝血酶抑制剂可同时作用于凝血酶的活性部位和底物识别位点，例如比伐卢定。比伐卢定是一种合成的抗凝药，是天然的水蛭素的类似物。比伐卢定为可逆的凝血酶特异抑制剂，具有很强的抗凝血作用。2)一价凝血酶抑制剂为合成的小分子化合物，以阿加曲班为代表，这类药物只能作用于凝血酶的活性部位。可逆的竞争性凝血酶抑制剂—阿加曲班属于精氨酸的衍生物。阿加曲班主要用于治疗外周血栓病和急性脑卒中，后被批准用于肝素诱发的血小板减少和血栓综合征，是目前世界上用于急性缺血性脑卒中治疗的唯一合成药物。

位于纤维蛋白原上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列是血小板GPⅡb/Ⅲa受体的识别位点，两者的结合是血小板聚集的最后共同通路。含RGD序列的多肽或化合物可竞争性的结合于血小板GPⅡb/Ⅲa受体，从而阻断血栓形成的最后通路，治疗各种因素引起的血栓疾病。开发血小板GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂已经成为抗凝血新药研发的一个热点。

目前，临床应用的血小板GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂主要为静脉制剂，从结构上可以分为三类：

1)单克隆抗体

阿昔单抗(Abciximab)是第一个临床应用的血小板GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂。

2)环状肽类

依菲巴肽(Eptifibatide)是FDA批准上市的第一个肽类血小板GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂，是合成的环七肽竞争性拮抗剂。

3)小分子非肽类

此类的代表药物为替罗非班(Tirofiban)，它是根据RGD序列设计合成的非肽类酪氨酸衍生物，对血小板GPⅡb/Ⅲa受体的选择性较强。

发明内容

为了寻找一种新的具有抗凝血功能的化合物，本发明的目的是提供一种抗凝血化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐。

本发明的另一目的是提供所述化合物的制备方法。

本发明的另一目的是提供所述化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐的用途。

本发明的另一目的是提供一种药物组合物及其用途。

本发明提供了一种如下述通式(Ⅰ)所示的化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐：

其中，Ar₁选自取代或未取代的以下基团：苯基、萘基、3-甲基-1,2,3,4-四氢-8-喹啉磺酰基、D-苯丙氨酰-L-脯氨酰基或(S)-1-((R)-2-氨基-3-苯基丙基-1-酮)-2-甲酰哌啶基；取代基选自羟基、C_1-6直链或支链的烷基、C_3-6环烷基、C_1-6直链或支链的烷氧基、卤素、单或多卤代甲基；

R₁选自4-胍基丙基、3-胍基丙基、3-氨基丙基或咪唑亚甲基。

优选地，所述Ar₁为未取代的3-甲基-1,2,3,4-四氢-8-喹啉磺酰基或D-苯丙氨酰-L-脯氨酰基。

优选地，所述R₁为4-胍基丙基、3-胍基丙基或3-氨基丙基。

优选地，所述化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐为以下所述的化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐：

上述技术方案中，通式(Ⅰ)所示的化合物存在不对称中心，具有S构型或R构型，本发明技术方案包括所有可能的立体异构体以及两种或多种异构体的混合物。通式(Ⅰ) 所示的化合物如存在顺/反异构体，本发明技术方案亦包括其顺式异构体、反式异构体或这些异构体的混合物。其中，单一异构体可根据常规方法分离或通过立体选择合成制备。

上述技术方案中，生理上可接受的盐是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。生理上可接受的盐在所属领域是为本领域技术人员所熟知的。生理上可接受的盐包括但并不限于，无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、高氯酸盐等，以及有机酸盐如乙酸盐、草酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐等，或通过文献所记载的其他方法如离子交换法来得到的盐。

本发明还提供了上述技术方案中所述化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)式(Ⅰ-1)化合物与DL-甘氨酸甲酯盐酸盐进行缩合反应生成式(Ⅰ-2)化合物；

(2)式(Ⅰ-2)化合物水解酯基得到式(Ⅰ-3)化合物；

(3)式(Ⅰ-3)化合物与DL-天冬氨酰-β-甲酯-DL-色氨酸甲酯盐酸盐进行缩合反应得到式(Ⅰ-4)化合物；

(4)式(Ⅰ-4)化合物氨基脱Boc保护得到式(Ⅰ-5)化合物；

(5)式(Ⅰ-5)化合物与式(Ⅰ-6)化合物反应得到式(Ⅰ-7)化合物；

(6)式(Ⅰ-7)化合物酯基水解得到通式(Ⅰ)所示化合物；其中，Ar₁、R₁如上述技术方案任一项所限定。

本发明还提供了一种如下述通式(Ⅱ)所示的化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐：

其中，Ar₂选自取代或者未取代的以下基团：(S)-2-羧酸吡咯烷基或(2R,4S)-4-甲基-2- 羧酸哌啶基；取代基选自羟基、C_1-6直链或支链的烷基、C_3-6环烷基、C_1-6直链或支链的烷氧基、卤素、单或多卤代甲基；

R₂选自4-胍基丙基、3-胍基丙基、3-氨基丙基或咪唑亚甲基。

优选地，所述Ar₂为未取代的(S)-2-羧酸吡咯烷基或(2R,4S)-4-甲基-2-羧酸哌啶基。

优选地，所述R₂为4-胍基丙基、3-胍基丙基或3-氨基丙基。

上述技术方案中，通式(Ⅱ)所示的化合物存在不对称中心，具有S构型或R构型，本发明技术方案包括所有可能的立体异构体以及两种或多种异构体的混合物。通式(Ⅱ) 所示的化合物如存在顺/反异构体，本发明技术方案亦包括其顺式异构体、反式异构体或这些异构体的混合物。其中，单一异构体可根据常规方法分离或通过立体选择合成制备。

本发明还提供了上述技术方案任一项所述化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)式(Ⅱ-1)化合物与式(Ⅱ-2)化合物缩合得到式(Ⅱ-3)化合物；

(2)式(Ⅱ-3)化合物氨基脱Boc保护得到式(Ⅱ-4)化合物；

(3)式(Ⅱ-4)化合物与Boc-DL-甘氨酸缩合得到式(Ⅱ-5)化合物；

(4)式(Ⅱ-5)化合物氨基脱Boc保护得到式(Ⅱ-6)化合物；

(5)式(Ⅱ-6)化合物与Boc-DL-天冬氨酸-β-甲酯缩合得到式(Ⅱ-7)化合物；

(6)式(Ⅱ-7)化合物经氨基脱Boc保护得到式(Ⅱ-8)化合物；

(7)式(Ⅱ-8)化合物与Boc-DL-色氨酸缩合得到式(Ⅱ-9)化合物；

(8)式(Ⅱ-9)化合物经氨基脱Boc保护、酯基水解得到通式(Ⅱ)所示化合物；

其中，其中，Ar₂、R₂如上述技术方案任一项所限定。

本发明还提供了上述技术方案任一项所述的化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐在制备用于治疗血栓引发疾病的药物中的用途。

其中，所述血栓引发疾病为外周血栓病、急性脑卒中或心肌梗塞引发的疾病。

本发明还提供了一种药物组合物，其包括：上述技术方案任一项所述的化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

本发明提供的药物组合物可根据本领域已知的方法制备，制成适于人或动物使用的任何剂型。活性成分在所述药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％，或可根据不同的应用由本领域技术人员进行相应调整。

本发明提供的药物组合物中，所述药物组合物选自片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、悬浮剂、乳剂或注射剂。

为制成不同剂型的药物组合物，可将通式(Ⅰ)或通式(Ⅱ)的化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐按已知方法与药学上可接受的合适制药载体物质如填充剂、芳香剂、调味剂、着色剂、润湿剂、赋形剂、崩解剂、表面活性剂等采用已知的方法进行混合，并被制成片剂等固体剂型、或悬浮剂等液体剂型等等。

本发明的药物组合物可以制成普通制剂，也可制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统等。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物组合物可用任何公知的给药方法进行给药。

本发明药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明药物组合物活性成分的每天合适剂量范围为0.01-300mg/kg体重，优选为0.1-200mg/kg体重，更优选为10-150mg/kg体重，最优选为25-100mg/kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分为几个剂量单位给药，取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的药物组合物的给药途径可为肠道或非肠道，如口服，静脉注射，肌肉注射，皮下注射，鼻腔、口腔黏膜、眼、肺和呼吸道给药，皮肤给药，直肠给药等等。

本发明药物组合物可单独进行给药，也可与其他治疗药物或对症药物共同使用。当本发明的药物组合物与其他治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明还提供了上述技术方案任一项所述的药物组合物作为凝血酶抑制剂、血小板GP Ⅱb/Ⅲa受体抑制剂或凝血酶及血小板GPⅡb/Ⅲa受体双靶点抑制剂的用途。

本发明还提供了上述技术方案任一项所述的药物组合物制备用于治疗血栓引发疾病的药物中的用途。

本发明提供了一种具有抗凝血作用的化合物，具有良好的体外人凝血酶抑制活性、体外血小板GPⅡb/Ⅲa受体抑制作用以及体内/体外抗血小板聚集功效，并且无明显毒性。本发明提供的化合物结构新颖、生物活性好、合成简便，是一种具有良好应用前景的具有抗凝功效的药物。

附图说明

图1为实施例1化合物TM₁的合成路线图示；

图2为实施例2化合物TM₁₃的合成路线图示；

图3为实验例2化合物TM₁对血小板GPⅡb/Ⅲa受体与纤维蛋白原结合的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

化合物的结构是通过核磁共振(NMR)来确定的。NMR位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。柱层析一般使用200～300目硅胶为载体。NMR测定是用INOVA-500，测定溶剂为DMSO-d₆，内标为TMS，化学位移是以ppm作为单位给出。

以下试剂如无特别说明均为常见市售试剂。以下溶液浓度如无特别说明均为质量百分比浓度。

实施例1TM₁的制备

1)甘氨酸甲酯盐酸盐(37.7g，0.3mol)溶于适量二氯甲烷中，搅拌条件下加入41.68 ml三乙胺，产生大量絮状物，将沉淀滤除，滤液浓缩，得白色固体甘氨酸甲酯，不做处理，直接投反应。

反应瓶中加入450mL干燥的四氢呋喃，加入N^G-硝基-N²-Boc-L-高精氨酸(33.3g，0.1mol，购自吉尔生化(上海)有限公司)，冷却反应液到-20℃，搅拌条件下依次加入三乙胺(10.1g，0.1mol)以及氯甲酸异丁酯(13.6g，0.1mol)。30分钟后，向反应液中加入甘氨酸甲酯，在-20℃的温度下搅拌30分钟后将反应液温度恢复至室温。反应液减压浓缩后加入400mL乙酸乙酯，溶解后，依次用200mL水、100mL 5％的碳酸氢钠溶液、100 mL 10％柠檬酸溶液以及200mL水洗有机层。无水硫酸钠干燥乙酸乙酯过夜，浓缩后得到油状物a 30.3g，收率为75％。

2)将a(29.1g，0.072mol)加入100mL乙醇以及100mL氢氧化钠(5.76g，0.144mol)溶液中室温搅拌24小时。反应完全后，反应液用1M的盐酸溶液中和，然后浓缩至120mL。用1M氢氧化钠溶液将反应液pH调至11，然后分别利用200mL乙酸乙酯、200mL氯仿洗，然后使用1M盐酸溶液酸化，析出固体。将固体滤除，50mL水洗，得到白色固体b 27.5 g，收率98％。

3)L-色氨酸甲酯盐酸盐(76.2g，0.3mol)加入适量二氯甲烷中，搅拌条件下加入41.68 ml三乙胺，有大量絮状物生成，将沉淀过滤，滤液减压浓缩，得白色固体L-色氨酸甲酯，不做处理，直接投下一步反应。

向反应瓶中加入300mL干燥的四氢呋喃，加入Boc-L-天冬氨酸-β-甲酯(24.7g，0.1mol)，冷却反应液到-20℃，搅拌条件下依次加入三乙胺(10.1g，0.1mol)以及氯甲酸异丁酯(13.6g，0.1mol)。30分钟后，向反应液中加入L-色氨酸甲酯，在-20℃的温度下搅拌30分钟后将反应液温度恢复至室温。反应液减压浓缩后加入300mL乙酸乙酯，溶解后，分别使用150mL水、80mL 5％的碳酸氢钠溶液、80mL 10％柠檬酸溶液以及150mL水洗有机层。无水硫酸钠干燥乙酸乙酯过夜。乙酸乙酯浓缩后得到油状物Boc-L-天冬氨酰-β- 甲酯-L-色氨酸甲酯38.1g，收率为80.2％。

取Boc-L-天冬氨酰-β-甲酯-L-色氨酸甲酯(33.1g，0.074mol)溶解于200mL乙酸乙酯，0℃搅拌条件下加入140mL 10％HCl-乙酸乙酯。反应3小时后，向反应液中加入300mL 干燥的乙醚，得到粘性油状样沉淀。将沉淀过滤，用乙醚洗，得到针状固体26.4g，将固体溶于适量二氯甲烷中，加入9.55ml三乙胺，有絮状物生成，将沉淀滤除，滤液减压浓缩，得透明油状物c 22.19g，收率为93％。

4)向反应瓶中加入350mL干燥的四氢呋喃，加入b(22.2g，0.057mol)，冷却反应液到-20℃，搅拌条件下依次加入三乙胺(5.76g，0.057mol)以及氯甲酸异丁酯(7.8g，0.057mol)。30分钟后，向反应液中加入c(26.4g，0.069mol)，在-20℃的温度下搅拌30 分钟后将反应液温度恢复至室温。反应液减压浓缩后加入350mL乙酸乙酯，溶解后，分别使用200mL水、100mL 5％的碳酸氢钠溶液、100mL 10％柠檬酸溶液以及200mL水洗有机层。无水硫酸钠干燥乙酸乙酯过夜。乙酸乙酯浓缩后得到油状物d 28.3g，收率为69％。

5)取d(24.4g，0.034mol)溶解于150mL乙酸乙酯，0℃搅拌条件下加入140mL 10％HCl-乙酸乙酯。反应3小时后，向反应液中加入200mL干燥的乙醚，得到粘性油状样沉淀。将沉淀过滤，用乙醚洗，得到针状固体20.9g，将固体溶于适量二氯甲烷中，加入4.43 ml三乙胺，生成大量絮状沉淀，将沉淀滤除，滤液浓缩，得黄色油状物e 35.13g，收率为 94％。

6)将L-脯氨酸甲酯盐酸盐(12.4g，0.075mol)溶于二氯甲烷，搅拌条件下加入10.44 ml三乙胺，有白色絮状物生成，将沉淀滤除，滤液减压浓缩，得白色固体L-脯氨酸甲酯，不做处理，直接投下一步反应。

向反应瓶中加入150mL干燥的四氢呋喃，加入Boc-D-苯丙氨酸(6.63g，0.025mol)，冷却反应液到-20℃，搅拌条件下依次加入三乙胺(2.53g，0.025mol)以及氯甲酸异丁酯(3.4g，0.025mol)。30分钟后，向反应液中加入L-脯氨酸甲酯，在-20℃的温度下搅拌 30分钟后将反应液温度恢复至室温。反应液减压浓缩后加入150mL乙酸乙酯，溶解后，分别使用100mL水、100mL 5％的碳酸氢钠溶液、100mL 10％柠檬酸溶液以及100mL水洗有机层。无水硫酸钠干燥乙酸乙酯过夜。乙酸乙酯浓缩后得到油状Boc-D-苯丙氨酰-L- 脯氨酸甲酯8.7g，收率93％。

将Boc-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸甲酯(8.0g，0.021mol)加入50mL乙醇以及50mL氢氧化钠(1.70g，0.042mol)溶液中室温搅拌24小时。反应完全后，反应液用1M的盐酸溶液中和，然后浓缩至70mL。用1M氢氧化钠溶液将反应液pH调至11，然后分别利用 80mL乙酸乙酯、80mL二氯甲烷洗，然后使用1M盐酸溶液酸化，析出固体。将固体滤除，50mL水洗，得到f6.31g，收率83％。

7)向反应瓶中加入200mL干燥的四氢呋喃，加入f(9.4g，0.026mol)，冷却反应液到-20℃，搅拌条件下依次加入三乙胺(2.63g，0.026mol)以及氯甲酸异丁酯(3.6g，0.026mol)，30分钟后，向反应液中加入e(21.0g，0.032mol)，在-20℃的温度下搅拌30 分钟后将反应液温度恢复至室温。反应液减压浓缩后加入200mL乙酸乙酯，溶解后，分别使用150mL水、80mL 5％的碳酸氢钠溶液、80mL 10％柠檬酸溶液以及150mL水洗有机层。无水硫酸钠干燥乙酸乙酯过夜。乙酸乙酯浓缩后得到油状物g 19.8g，收率为79％。

8)取g(19.3g，0.02mol)溶解于200mL乙酸乙酯，0℃搅拌条件下加入150mL 10％HCl-乙酸乙酯。反应3小时后，向反应液中加入400mL干燥的乙醚，得到粘性油状样沉淀。将沉淀过滤，用乙醚洗，得到针状固体h 17.3g，收率为96％。

9)将h(17.1g，0.019mol)加入100mL乙醇以及100mL氢氧化钠(1.52g，0.038mol)溶液中室温搅拌24小时。反应完全后，反应液用1M的盐酸溶液中和，然后浓缩至120mL。用1M氢氧化钠溶液将反应液pH调至11，然后分别利用200mL乙酸乙酯、200mL氯仿洗，然后使用1M盐酸溶液酸化，析出固体。将固体滤除，50mL水洗，得到白色固体i 15.1 g,收率95％。

10)反应瓶中加入40mL乙醇以及10mL醋酸，向其中依次加入i(5.0g，0.0060mol)、0.4g 5％钯碳，反应液加热至80℃，并且氢气加压至50kg/cm²反应4小时。反应完成后，滤除钯碳，浓缩反应液。向所得到的油状物中加入30mL氯仿，溶解后以及30mL饱和的碳酸氢钠溶液洗，氯仿层再用30mL水洗然后浓缩。乙醇重结晶得到白色固体TM₁ 4.7g，收率为98％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.27-7.60(m,10H,ArH),7.18(s,1H,CH),4.86(dd,1H,J＝6.9Hz,15.7Hz,CH),4.72(dd,1H,J＝5.6Hz,16.2Hz,CH),4.53(dd,1H,J＝6.2Hz,15.9Hz,CH),4.40(dd,1H,J＝5.9Hz,16.4Hz,CH),4.09(s,2H,CH₂),3.95(dd,1H,J＝6.4Hz,15.8Hz,CH),3.31(dd,2H,J＝6.6Hz,15.8Hz,CH₂),3.19-3.51(m,4H,CH₂,CH₂),2.90(dd,1H,J＝7.8Hz,16.0Hz,CH₂),2.87(m,2H,CH₂),2.65(dd,1H,J＝6.5Hz,16.1Hz,CH₂), 1.89-2.35(m,4H,CH₂,CH₂),1.79(dd,2H,J＝5.9Hz,16.9Hz,CH₂),1.50(dd,2H,J＝5.8Hz,17.2Hz,CH₂),1.32(dd,2H,J＝6.4Hz,16.7Hz,CH₂)。

实施例2TM₁₃的制备

1)将L-脯氨酸甲酯盐酸盐(49.5g，0.3mol)溶于二氯甲烷，搅拌条件下加入41.68ml 三乙胺，有白色絮状物生成，将沉淀滤除，滤液减压浓缩，得白色固体L-脯氨酸甲酯，不做处理，直接投下一步反应。

向反应瓶中加入300mL干燥的四氢呋喃，加入N^G-硝基-N²-Boc-L-高精氨酸(33.3g，0.1mol)，冷却反应液到-20℃，搅拌条件下依次加入三乙胺(10.1g，0.1mol)以及氯甲酸异丁酯(13.6g，0.1mol)。30分钟后，向反应液中加入L-脯氨酸甲酯，在-20℃的温度下搅拌30分钟后将反应液温度恢复至室温。反应液减压浓缩后加入300mL乙酸乙酯，溶解后，分别使用200mL水、100mL 5％的碳酸氢钠溶液、100mL 10％柠檬酸溶液以及200mL 水洗有机层。无水硫酸钠干燥乙酸乙酯过夜。乙酸乙酯浓缩后得到油状物a 36.4g，收率为 82％。

2)取a(33.7g，0.076mol)溶解于150mL乙酸乙酯，0℃搅拌条件下加入140mL 10％HCl-乙酸乙酯。反应3小时后，向反应液中加入400mL干燥的乙醚，得到粘性油状样沉淀。将沉淀过滤，用乙醚洗，得到非晶形的固体26.0g，将固体溶于适量二氯甲烷中，加入9.51ml三乙胺，生成大量絮状沉淀，将沉淀滤除，滤液浓缩，得黄色油状物b 21.18g，收率为90％。

3)向反应瓶中加入250mL干燥的四氢呋喃，加入Boc-甘氨酸(11.2g，0.064mol)，冷却反应液到-20℃，搅拌条件下依次加入三乙胺(13.5g，0.064mol)以及氯甲酸异丁酯(8.7g，0.064mol)。30分钟后，向反应液中加入b(24.1g，0.070mol)，在-20℃的温度下搅拌30分钟后将反应液温度恢复至室温。反应液减压浓缩后加入250mL乙酸乙酯，溶解后，分别使用200mL水、100mL 5％的碳酸氢钠溶液、100mL 10％柠檬酸溶液以及200 mL水洗有机层。无水硫酸钠干燥乙酸乙酯过夜。乙酸乙酯浓缩后得到油状物c 25.7g，收率为80％。

4)取c(24.5g，0.049mol)溶解于100mL乙酸乙酯，0℃搅拌条件下加入70mL 10％HCl-乙酸乙酯。反应3小时后，向反应液中加入300mL干燥的乙醚，得到粘性油状样沉淀。将沉淀过滤，用乙醚洗，得到针状固体19.3g，将固体溶于适量二氯甲烷中，加入6.13 ml三乙胺，生成大量絮状沉淀，将沉淀滤除，滤液浓缩，得黄色油状物d 16.26g，收率为 92％。

5)向反应瓶中加入300mL干燥的四氢呋喃，加入Boc-L-天冬氨酸-β-甲酯(10.9g，0.044mol)，冷却反应液到-20℃，搅拌条件下依次加入三乙胺(4.44g，0.044mol)以及氯甲酸异丁酯(6.0g，0.044mol)。30分钟后，向反应液中加入d(19.25g，0.048mol)，在 -20℃的温度下搅拌30分钟后将反应液温度恢复至室温。反应液减压浓缩后加入300mL 乙酸乙酯，溶解后，分别使用200mL水、100mL 5％的碳酸氢钠溶液、100mL 10％柠檬酸溶液以及200mL水洗有机层。无水硫酸钠干燥乙酸乙酯过夜。乙酸乙酯浓缩后得到油状物e 20.8g，收率为75％。

6)取e(23.9g，0.038mol)溶解于100mL乙酸乙酯，0℃搅拌条件下加入80mL 10％HCl-乙酸乙酯。反应3小时后，向反应液中加入300mL干燥的乙醚，得到粘性油状样沉淀。将沉淀过滤，用乙醚洗，得到针状固体19.1g，将固体溶于适量二氯甲烷中，加入4.68 ml三乙胺，生成大量絮状沉淀，将沉淀滤除，滤液浓缩，得黄色油状物f 15.92g，收率为 89％。

7)向反应瓶中加入100mL干燥的四氢呋喃，加入Boc-L-色氨酸(7.9g，0.026mol)，冷却反应液到-20℃，搅拌条件下依次加入三乙胺(2.6g，0.026mol)以及氯甲酸异丁酯(3.5g，0.026mol)。30分钟后，向反应液中加入f(17.0g，0.032mol)，在-20℃的温度下搅拌 30分钟后将反应液温度恢复至室温。反应液减压浓缩后加入100mL乙酸乙酯，溶解后，分别使用100mL水、50mL 5％的碳酸氢钠溶液、50mL 10％柠檬酸溶液以及100mL水洗有机层。无水硫酸钠干燥乙酸乙酯过夜。乙酸乙酯浓缩后得到油状物g 17.4g，收率为82％。

8)取g(17.1g，0.021mol)溶解于130mL乙酸乙酯，0℃搅拌条件下加入90mL 10％HCl-乙酸乙酯。反应3小时后，向反应液中加入300mL干燥的乙醚，得到粘性油状样沉淀。将沉淀过滤，用乙醚洗，得到针状固体h 14.7g，收率为93％。

9)将h(15.0g，0.020mol)加入100mL乙醇以及100mL氢氧化钠(1.6g，0.04mol) 溶液中室温搅拌24小时。反应完全后，反应液用1M的盐酸溶液中和，然后浓缩至120mL。用1M氢氧化钠溶液将反应液pH调至11，然后分别利用100mL乙酸乙酯、100mL氯仿洗，然后使用1M盐酸溶液酸化，析出固体。将固体滤除，50mL水洗，得到白色固体i 13.2 g，收率96％。

10)反应瓶中加入40mL乙醇以及10mL醋酸，向其中依次加入i(4.3g，0.0062mol)、0.4g 5％钯碳，反应液加热至80℃，并且氢气加压至50kg/cm²反应4小时。反应完成后，滤除钯碳，浓缩反应液。向所得到的油状物中加入30mL氯仿，溶解后以及30mL饱和的碳酸氢钠溶液洗，氯仿层再用30mL水洗然后浓缩。乙醇重结晶得到白色固体TM₁₃ 3.8g，收率为94％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.11-7.60(m,5H,ArH),7.06(s,1H,CH),4.53(dd,1H,J＝5.4Hz,16.0Hz,CH),4.33(dd,1H,J＝5.9Hz,16.2Hz,CH),4.10(dd,1H,J＝6.9Hz,16.8Hz,CH),3.99(s,2H,CH₂),3.89(dd,1H,J＝6.2Hz,16.4Hz,CH),3.41-3.51(m,2H,CH₂), 3.31(m,2H,CH₂),2.95(dd,1H,J＝6.7Hz,17.1Hz,CH₂),2.89(dd,1H,J＝6.8Hz,16.3Hz, CH₂),2.87(dd,2H,J＝5.7Hz,16.2Hz,CH₂),1.92-2.33(m,4H,CH₂,CH₂),1.82(dd,2H,J＝ 6.6Hz,15.9Hz,CH₂),1.55(dd,2H,J＝6.8Hz,17.2Hz,CH₂),1.25(dd,2H,J＝6.5Hz,16.7 Hz,CH₂)。

实验例1对人凝血酶的体外抑制作用

测定原理：

凝血酶催化水解底物S-2238所得到的对硝基苯胺在405nm有吸收。因此对硝基苯胺在405nm条件下吸收值的大小可以直接反映凝血酶活性的强弱，体外观察到化合物对凝血酶活性的影响。

测定方法：

1mL含有0.1％PEG和1％DMSO，pH为7.2的磷酸盐缓冲液中加入8μM底物S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-p-nitroaniline·2HCl)以及特定浓度化合物。加入10mU从人血浆中提取的凝血酶。10分钟过后，在405nm条件下测定吸收值。

结果：分别测定了TM₁-TM₂₀以及阿加曲班在终浓度为10^-4M、10^-5M时对人凝血酶的抑制率；测定并计算化合物对凝血酶的半数抑制浓度IC₅₀。结果如表1所示。

表1受试化合物对人凝血酶的抑制作用

ND＝NotD etermined

实验例2对血小板GPⅡb/Ⅲa受体的体外抑制作用

测定原理：

人的血小板GPⅡb/Ⅲa受体表达在仓鼠卵巢上皮细胞表面，可以与纤维蛋白原结合。本发明化合物TM₁可以抑制血小板GPⅡb/Ⅲa受体与纤维蛋白原的结合，因此，可以利用仓鼠卵巢上皮细胞测定TM₁对结合的抑制率；未表达血小板GPⅡb/Ⅲa受体的仓鼠卵巢上皮细胞，或表达其他糖蛋白受体的细胞不会与纤维蛋白原结合，可以用作对照，来测定TM₁对血小板GPⅡb/Ⅲa受体抑制作用的特异性。与纤维蛋白原结合的仓鼠卵巢上皮细胞数可以通过测定细胞的内源性磷酸化酶的活性来进行比较。

测定方法：

1)将纤维蛋白原在磷酸缓冲液中稀释到20μg/mL(pH值为7.4)，然后在96孔平板中，每孔加入100μL，让其黏附过夜。

2)用PBS清洗96孔板一次，每孔加入100μL不同浓度的TM₁，覆盖一小时。

3)将准备好的表达不同受体的仓鼠卵巢上皮细胞，每孔加入100μL(10万单位)。37℃，孵化60分钟后，洗脱三次。

4)洗脱后，每孔加入100μL细胞溶解液，加入磷酸酶底物(1％Triton X-100，6mg/ml 硝基苯磷，50mM醋酸钠)。60分钟后，加入50μL的1M氢氧化钠中止反应。

5)利用平板分光光度计测定细胞内源性磷酸化酶的活性。

结果：TM₁只能抑制表达了血小板GPⅡb/Ⅲa受体的仓鼠卵巢上皮细胞与纤维蛋白原的结合，IC₅₀为8μM，而不影响未表达该受体或表达其它受体的仓鼠卵巢上皮细胞与纤维蛋白原的结合。这说明了本发明化合物TM₁对血小板GPⅡb/Ⅲa受体抑制作用的特异性。结果如图3所示。

采用同样的方法测试化合物TM₂-TM₂₀，都表现出对血小板GPⅡb/Ⅲa受体的特异性抑制作用。

实验例3体外抗血小板聚集作用的量效关系研究

测定原理：

富血小板血浆(Plantelet-rich plasma,PRP)具有一定浊度，PRP中所含血小板数目直接影响浊度高度。当诱导剂加入PRP后，在搅拌条件下，血小板聚集成聚集物，PRP浊度下降，透光度增加，因此通过测定PRP的浊度变化来表示血小板的聚集程度。由于血小板聚集仪中的光电系统可将PRP的浊度变化转化为电讯号变化，并用记录仪记录。因此从记录的曲线可计算出血小板聚集的程度。

测定指标：

以血小板最大聚集率为观测指标，并计算血小板聚集抑制率(％)＝{(NS组血小板最大聚集率—样品组血小板最大聚集率)/NS组血小板最大聚集率}·100％。

在量效研究中经直线回归分析估算IC₅₀。(IC₅₀是化合物抑制PRP的聚集率达到最大的一半时化合物的浓度)。

测定方法：

1)富血小板血浆(PRP)及贫血小板血浆(PPP)的制备：

家兔清醒状态下心脏取血，以3.8％枸橼酸钠抗凝(血与抗凝剂的体积比为9:1)，室温下，500r/min离心8min，取乳白色上清液得到PRP，分离PRP。将余血再以3000r/min 离心10min，去上层血浆得到PPP。

2)血小板聚集仪准备

开启血小板聚集仪，预热30min，恒温至37℃，在测试通道中插入PPP比浊管，仪器自动检测零点。在另一比浊管中加入400μL PRP，按键后显示血小板数，使计数稳定在25万/μL，若计数过高，可用PPP稀释。

3)测试

在测试样品比浊管中加入一小磁棒和400μL PRP置恒温孔中预热5min备用。取出PPP 比浊管插入PRP比浊管，取400μL PRP注入比浊管，开启搅拌，加入生理盐水或替罗非班或TM₁或TM₁₃(剂量见表2)，然后用微量进样器加50μL诱导剂，同时开始测定，连续记录10min，记录聚集区线、最大聚集率以及最大聚集时间。每次试验重复2次。

结果：TM₁和TM₁₃在体外对20μM二磷酸腺苷(adenosine diphosphate、ADP)、10μg/mL 胶原(collagen、COLL)诱导的家兔血小板聚集均有明显的抑制作用，随着剂量增加，作用增强，呈现出量效相关性。各剂量组与对照组比较，均有显著性差异(p<0.05)。结果见表2。

表2化合物对20μM ADP、10μg/mL COLL诱导的血小板聚集的抑制作用

*p<0.05,**p<0.01vs Control

采用同样的方法测试化合物TM₂-TM₁₂及TM₁₄-TM₂₀，都显示出了明显的体外抗血小板聚集作用。

实验例4体内抗血小板聚集作用的时效关系研究

测定方法：

1)取家兔30只，每组10只，随机分成3组：NS组(生理盐水)、TM₁组(TM₁，0.4 mg/kg)、TM₁₃组(TM₁₃，0.4mg/kg)。心脏取血一次后，清醒状态经耳缘静脉注射给药。

2)给药后0h、0.25h、0.5h、0.75h、1h、2h自心脏取血，按上述实施例方法测定ADP(20μM)诱导下的血小板聚集率。

结果：TM₁、TM₁₃分别以0.4mg/kg的浓度静脉注射后，即可迅速产生强的抗血小板聚集效应，能使血小板聚集率较对照组显著降低，抗血小板聚集的药理效应可维持30-45 分钟，然后随时间的推移逐渐降低。给药2h后，TM₁以及TM₁₃所产生的抗血小板聚集药理效应消失，血小板聚集率与对照组无显著差异。TM₁的体内抗血小板聚集作用强于TM₁₃。结果如表3所示。

表3体内分别静脉注射TM₁、TM₁₃对20μM ADP诱导的血小板聚集率的影响

*p<0.05,**p<0.01vs Control

采用同样的方法测试化合物TM₂-TM₁₂及TM₁₄-TM₂₀，都显示出了良好的体内抗血小板聚集作用。

实验例5小鼠静脉注射急性毒性研究

测定方法：

取雄性、雌性小鼠各一只，以20mg/kg体重的剂量静脉注射给药TM₁。给药后，动物活动量及饮食摄水状态正常。连续7天测定雄性、雌性小鼠体重，结果如表4所示：雄性小鼠体重平均每天增长0.9g左右，雌性小鼠体重平均每天增长0.7g左右；未见死亡及异常症状。

表4 TM₁给药小鼠体重变化表

给药后第8天，断头处死小鼠，解剖观察心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、消化道等脏器，均未见明显病理变化。测定并计算心、肝、脾、肺、肾脏器指数，结果均在正常范围之内(见表5)。

表5 TM₁给药小鼠脏器指数

结果：对TM₁进行初步小鼠静脉注射急性毒性实验，数据显示：TM₁在静脉注射20mg/kg体重的剂量下未表现出明显毒性。

采用同样的方法测试化合物TM₂-TM₂₀，同样未表现出明显毒性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种如T₁₃～T₂₀所述结构的化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐：

2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)式(Ⅱ-1)化合物与式(Ⅱ-2)化合物缩合得到式(Ⅱ-3)化合物；

(2)式(Ⅱ-3)化合物氨基脱Boc保护得到式(Ⅱ-4)化合物；

(3)式(Ⅱ-4)化合物与Boc-DL-甘氨酸缩合得到式(Ⅱ-5)化合物；

(4)式(Ⅱ-5)化合物氨基脱Boc保护得到式(Ⅱ-6)化合物；

(6)式(Ⅱ-7)化合物经氨基脱Boc保护得到式(Ⅱ-8)化合物；

(7)式(Ⅱ-8)化合物与Boc-DL-色氨酸缩合得到式(Ⅱ-9)化合物；

其中，Ar₂、R₂如权利要求1所限定；

3.权利要求1所述的化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐在制备凝血酶抑制剂、血小板GPⅡb/Ⅲa受体抑制剂或凝血酶及血小板GPⅡb/Ⅲa受体双靶点抑制剂的用途。

4.权利要求1所述的化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐在制备用于治疗血栓引发疾病的药物中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述血栓引发疾病为外周血栓病、急性脑卒中或心肌梗塞引发的疾病。

6.一种药物组合物，其特征在于，其包括：权利要求1所述的化合物、其立体异构体或其生理上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物选自片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、悬浮剂、乳剂或注射剂。

8.权利要求6或7所述的药物组合物作为在制备凝血酶抑制剂、血小板GPⅡb/Ⅲa受体抑制剂或凝血酶及血小板GPⅡb/Ⅲa受体双靶点抑制剂的用途。

9.权利要求6或7所述的药物组合物在制备用于治疗血栓引发疾病的药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述血栓引发疾病为外周血栓病、急性脑卒中或心肌梗塞引发的疾病。