PT95582B

PT95582B - Processo para a preparacao de compostos peptidicos antagonistas do receptor do fibrinogenio

Info

Publication number: PT95582B
Application number: PT95582A
Authority: PT
Inventors: Ruth F Nutt; Daniel F Veber; Stephen F Brady; Mark E Duggan
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1990-10-12
Publication date: 1999-02-26
Also published as: JPH03173897A; JP2914582B2; DE69017138D1; ATE118783T1; DK0422938T3; NO904431D0; IL95917A; AU634294B2; EP0422938A1; IL95917A0; EP0422938B1; PT95582A; ZA908156B; KR910007704A; IE65197B1; FI905022A0; DE69017138T2; IE903665A1; NO904431L; CA2027315A1

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS PEPTÍDICOS DO RECEPTOR DO FIBRINOSÉNIO

ANTASOMISTAS

RESUMO

MEMÓRIA DESCRITIVA

O presente invento diz respeito s um processo para £ preparação de um antagonista do receptor do fibrinogériio, nomeadamente da fórmulas •Z Z ^y

XX-Gly-Asp em que XX representa um alfa-aminoácido sintético contendo uma cadeia lateral linear e íZ representa uma sequência de i 4 quatro aminoácidos» o ou referido processo consiste esis

a) acoplamento do aminoácido de terminal carboxi, tendo o seu grupo alfa-amino adequadaiBsnte protegido, com uma resina de poliestireno clorometilada?

b) remoção do grupo protector do alfa-amino?

c) adição do derivada protegido na cadeia lateral e no amino do aminoácido que se segue na sequência e de um agente de acoplamento por condensação, á resina, e acoplamento do aminoácido que se segue na sequência ao aminoácido previamente acoplado;

d) repetição do passo íc) na ordem sequencial desejada de aminoácidos de modo a obter um intermediário peptídico acoplado à resina;

e) remoção do intermediário peptídico a partir da resina e dos grupos protectores da cadeia lateral restantes;

e

f) ciclização do intermediário peptídico.

FUNDAMENTO DO INVENTO

Este invento está relacionada com compostos para inibição da ligação do fibrinogénio às plaquetas sanguíneas a para a inibição da agregação de plaquetas sanguíneas.

fibrinogénio é uma glicoproteína, presente no plasma do sangue, que participa na agregação de plaquetas e formação de fibrina. As plaquetas são fragmentos anucleados tipo célula, encontrados no sangue de todos os mamíferos, que participam na coagulação do sangue. Sabe-se que a intsracção do fibrinogénio com um receptor no complexo de glicoproteínas Ilb/IIIa da membrana das plaquetas é essencial para a função normal das plaquetas»

Zimmerman et al., Patente U.S. M2 4, 683, 291 descreve peptídeos com utilidade no estudo das interseções fibrinogénio-plaqueta, plaqueta-plaqueta e célula-célula. Os peptídeos estão descritos como tendo utilidade onde é desejável retardar ou evitar a formação de um trombus ou coágulo no sangue. A fórmula geral para os peptídeos és

C Ch > -Arg-B 1 i-Asp- C Cx ί -H onde Ch e Cx são sequências de aminoácidos.

Pierschbacher et al., Patente U.S» N2 4,589,881, descreve a sequência de um fragmento polipeptídico de 11,5 kDa da fibronectina que representa a actividade promotora da aderência celular da fibronectina» Um fragmento especificamente descrito è?.

- 'Vd - ''⁵

H-Tir-Ala—Vai-Tre-Gli-Arg~Gli-AspSer-Pro-Ala—Ser—Ser-Lis-Pro-IleSer-Xle™Asn~Tir-Arg-Tre-Glu-IleAsp-L i s-Pro—Ser-Θ1n-Met-OH

Ruoslahti et al», Patente U»S deos que alteram a actividade

N2 4,614,51/ descreve tetrapeptíde aderência celular de células a vários substratos

Estabeleceu-se que os peptídeos «consistem essencialmente» na seguinte sequência?

J

X-Arg-Gli-Asp-Ssr-Y

em que X é H	ou	um ou mais aminoácidos» A	Figura 1	enumera	DS
po1i pepfídeos	que	foram sintetizados por	Ruoslahti	et al»	na
«determinação	do	peptideo mais pequeno apresentando actividade	de

aderência celular»»

Ruoslahti et al» , Patente U.S, N24,578,©79, descreve tetrapeptídeos semelhantes tendo Ser substituída por Tre ou Cis»

Pierschbacher et al», Proc» Natl» Acad» Sei» USA» Vol, 81, pp» 5985-5988, Outubro de 1984, descreve variantes do sítio ds reconhecimento celular da fibronectina que retêm & actividade promotora do crescimento» Eles testaram as actividades promotoras da aderência celular de uma série de estruturas muito parecidas com o peptideo firg-Gli-Asp-Ser e encontrou-se «que os não podem ser substi— relacionados, mas que sem perda de actividade» » resíduos de argxnma, giicma e aspartaio tuidos mesmo por aminoácidos estreitamente vários aminoácidos podem substituir serina discutem

Ruoslahti etal», Science, Vol» 238, pp» 491-497, as proteínas de adesão celular» Eles estabelecem

especificamente que a «elucidação da sequência de aminoácidos do domínio de aderência celular na fibronectina e sua duplicação com peptideos sintéticos estabelece a sequência Arg-Gli-Asp (RSD)como a estrutura essencial reconhecida pelas células na fibronectina».

Cheresh, Proc» Natl» Acad. Sei. USA, Vol» 84, pp» 6471—6475, Setembro 1987, descreve o receptor de adesão dirigido por Arg-Gli-Asp envolvido na ligação ao fobrinogénio e ao Factor de von Wi11ebrand »

Adams et al». Patente- U»S» N2 4,857,508 descreve os tetrapeptídeos que inibem a agrgação de plaquetas e a formação de um trombus» Os tetrapeptídeos têm a fórmulas

X-Gli-Asp-Y em que X pode ser H2NCC=NH)WHCCH2)nCHCZ 1C00H ou Ac-Arg, em que Z=H, NH2 ou NH-Acil e n=l-4, e em que Y pode ser Tir-íMH2, Fen—NH2 ou um grupo de uma fórmula especificamente definida»

Os requerentes descobriram antagonistas do receptor do fibrinogénio que não contêm a sequência de aminoácidos Arg-Gli-Asp que é descrita nal itera tura. como sendo especif icamente necessária para a ligação ao complexo de glicoproteínas Ilb/llla da membrana das plaquetas»

J

SUMÁRIO DD INVENTO

Os compostos do presente invento inibem a ligação do fibrinogénio ao receptor complexo de glicoproteínas IlbZIIIa da membrana das plaquetas e contêm uma sequência ds aminoácidos;

XX-G1i-Asp em que XX é um alia-aminoácido sintético contendo uma cadeia 1atera1 linear»

---- NH //

-(CH₂)_n-^M-<^CH2>n'-^N-^C-⁽ⁱ⁾

H ou

-<^CH2>n--<^CH2>n'-<“>

em que;

n é 1,2,3 ou 4? n’ é 2,3 ou 4?

AA é um átomo de oxigénio, um átomo de enxofre ou uma ligação simples? e

R ê H, alquilo Cj_^, arilo substituído não substituído, arilmetilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído, desde que no casa Ci), quando AA for Lima ligação simples e R for H, então n+n’ não iguala 1, 2, 3 ou 4»

ria para se conseguir a ligação ao receptor IlfaZIIIa» anteriores que ensinam que que a sequência Arg-Sli-Asp é necessáSão compostos preferidos do invento os que têm selectividade relativamente -aos receptores irttegrina. Qs compostos preferidos incluem aqueles em que XX è alfa-amxnoácido sintético contendo uma cadeia lateral linear com um grupo amina, conforme representado acima por (ii).

□ presente invento é um antagonista do receptor do 'ihrinogénio tendo a seguinte estrutura;

em que XX representa abaixoe ZZ representa como definido abaixo» um «-aminoácido sintético como definido a sequência de 1_? 2_? 3 ou 4 aminoácidos

XX partilha uma ligação amida com Sli e uma ligação amida com e é definido como tendo uma cadeia lateral X

Z.X ou

-(CH₂)_n-AA-<CH₂)_n'

NH

II

N—-C-NHR ( i )

I

H esn que 3

-(CH₂)_n-AA-(CH₂)_n·-MHR (ii) n é 1, 2, 3 du 4; n’ é 2» 3 ou 4s

AA é um átomo de oxigénio, um átomo de enxofre ou ums ligação simples? ε

R ê H, alquilo C» ,, ~ã ’ tuido, arilmetilo substituído ou substituído ou não substituído, for uma ligação simples e R for ou 4, arilo substituído ou não substinão substituído ou cicloalquilo desde que no caso íi5, quando AA

H, então n+n’ não iguala í, 2, 3 ue preferência, quando X for definido por <i>, então n+n ³ é 3, AA é uma ligação simples e R é fenilo ou benzilo»

De preferência, quando X for definido por (ii), então n+n³ ê 5, AA é uma ligação simples e R é H»

Z é como definido abaixo:

em ques

A* é H, sci1amido, acilsminoscilamido, acilamino-N-meti1amino-ac i1amido;

R⁵ e R’ são independendtemente H, metilo, etilo ou um grupo alquilo inferior tendo 1 a 5 carbonos;

X’-Y^? é S-S, CH..-S, S-CH.-j, CHyCH.__?, CH.-,, CH.-.CH.-.CH.-,,

CH„-S-S» Q-U-B-B

CH2 o τ & r«W Γ'Π

E^f é H, COOH, CQNH^, CONFIRA, CQNR^R ‘, CH_Q ^un’ 2 , CH'’ ^34 em que R é um grupo alquilo tendo i s 4 átomos de carbono, RR a

έ um grupo alquilo tendo 1 a 4 átomos de carbono ou NR'“R’ é um amxnoácído secundário» ou ou ZZ é

em que s

A⁵ é como definido atrás;

R^s e R⁵são como definidos atrás?

X’ - Y’ é como definido atrás?

B³ é um D- ou L~ a-amínoácitio?

C^? é um D- ou L~ a-amínoácido secundário de preferência seleccionado de entre prolina, β-metilprolina, B,β-dimetilprolina, gama-hidroxiprolina, anidroprolina, tioprolina, β-metiltioprolina, β,β-dimetiltioprolina, ácido pipecólico, azetidina-ácido carboxílico e um N-metil-aminoácido ou D- ou Lα-aminoácido primário? e

E³ é como definido atráss ou ZZ é

em que:

A³ é como definido atrás

R³

X³ e R³ sSo como definidos atrás; - Y³ são como definidos atrás.

E⁵ é como definido atrás?

F³ é um L-aminoácido, de preferência um L-aminoácido seleccionado entre triρtofano, feniialanina, leucina, vaiina, isoleucina, α-naftilalanina, β-naftlalanina , metíonina, tirosina, arginina, lisina, homoarginína, ornitina, histidina, triptofano substituído, feniialanina substituída ou. tirosina substituida? e Rr5 é H ou metilo?

ou ZZ é

JET sm que

A⁵ é como definido atrás;

R³ ε R^?i são como definidos atrás? X’ - Y’ é como definido atrás?

C³ é como definido atrás? e E^? é como definido atrás.

ou ZZ é

em que

A³ é como definido atrás?

R³ e R³’’ são como definidos atrás?

X³ - Y³ é como definido-atrás?

F é como definido atrás?

S³ é como um D- ou L-«-aminoácido, aminoácido cíclico secundário ou N-metilaminoácido?

E’ é como definido atrás? e 5

R e como definido -atrás.

G presente invento também é um antagonista do receptor do fibrinogénio da fórmula

HO í'

B-Q-C-C-Gly-Asp-NH-ÇH

X ^E' em que:

B representa zero, um ou dois aminoãcidos substituídos ou não substituídos?

Q representa H, NH, NH.-, ou Ac—NH;

I⁵ representa uma cadeia lateral de um aminoácido definido por F⁵s

E’ é como definido atrás? e

X representa a caoeia lateral oe aminoáuxQo XX come préviamente definido?

desde que q substituídos mais aminoác uando ó for sero aminoãcidos substituídos ou não , então Q é H, NH_O ou Ac—NH e que quando B for um ou idos substituídos ou não substituídos, então Q é NH.

São exemplos de compostos do presente invento;

Ac-(Arg(Ph))-Gly-Asp-Phe;

Ac-(Arg(Bzl))-Gly-Asp-Phe;

Aha-Gly-Asp-Phe;

Aha-Gly-Asp-Trp;

ι----Ac-Cys-Asn-(DiMeTzl)-(homoLys)-'-’¹y ^AsP Cy^{s 0H}»

C---- . — 1

Ac-Cys-(DiMeTzl)-(homoLys)-Gly- As p-Cys-OH;

(GuaValA)-Gly-Asp-Phe;

(GuaValA)-Gly-Asp-Trp;

(GuaHexA)-Gly-Asp-Trp;

(GuaHepA)-Gly-Asp-Trp;

(7-AhepA)-Gly-Asp-Trp;

(8-AoctA)-Gly-Asp-Trp;

H₂N S A^zs^Gly-Asp-Phe;

r —————

Ac-Cys-(homoLys)-Gly-Asp-Cys-OH;

Ac-Pen-(homoLys)-Gly-Asp-Cys-OH;

Γ '

Ac-Cys-(Arg(Phenyl))-Gly-Asp-Cys-OH;

r^- -—————---Ac-Cys-(Arg(Benzyl))-Gly-Asp-Cys-OH;

C . _-_v

Ac-Cys-(homoLys)-Gly-Asp-Trp-Cys-OH;

I---—-A

Ac-Cys-(homoLys)-Gly-Asp-Trp-(N-MeCys)-OH;

t-¹--n

Ac-Cys-Ar g-(homoLys)-Gly-As ρ-Cys-OH;

I---^-

Ac-Cys-(homoLys)-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH₂;

c((7-Ahe ρΑ) -fcomoLys)-Gly-As p-T rp-Pro);

c((6-AhexA)-(homoLys)-Gly-Asp-Trp-Pro);

c((7-AhepA)-(homoLys)-Gly-Asp-(beta-Nal)-Pro);

c< (7-AhepA)-(Ârg (Phenyl) )-Gly-Asp-Trp-Pro);

c((7-AhepA)-(Arg(Benzyl))-Gly-Asp-Trp-Pro);

I------“-*

Ac-Cys-Asn-Pro-(homoLys)-Gly-Asp-Cys-OH;

Ac-Pen-Asn-(DiMeTzl)-(homoLys)-Gly-Asp-Cys-OH;

f— _ ' —\

Ac-Cys-Asn-Pro-(Arg(Phenyl))-Gly-Asp-Cys-OH;

Γ”-*

Ac-Cys-Asn-(DiMeTzl)-(Arg(Phenyl))-Gly-Asp-Cys-OH;

Ac-Cys-Asn-(DiMeTzl)-(Arg(Benzyl))-Gly-Asp-Cys-OHj and c(Aha-(homoLys)-Gly-Asp-Trp-Pro).

Os compostos preferidos sãos

---Ac-Cys-Asn-(DiMetzl)-(homoLys)-Gly-Asp-Cys-OH; and c(Aha-(homoLys)-Gly-Asp-Trp-Pro)

Além das abreviaturas habituais de três letras usadas para identificar aminoácidos comuns» os requerentes usaram as seguintes des.iqn,ações de abreviaturas:

homoLys Aha, 7-Ahepa Arg (Pb)

Arg (Bzl)

DiMeTzl

AhexA

Aoc t A

QuaValA

SuaHexA

GuaHepA beta-Nal homo-lisina ácido 7-amino-heptanóico fenilargínina ben zi1arginina dimeti1tioprolina ácido 6-am ino-hex an ó i c o ácido B-amino-octanóico ácido 5-guanidovalérico ácido 6-guanido-hexanóico ácido 7-guanido-heptanóico beta-naftilalanina invento também inclui composições, compreendendo peptídeos antagonistas do receptor do fibrinogênio do presente invento e um ou mais veículos farmacêuticamente aceitáveis, e.g» soro fisiológico, a um pH farmacologicamente aceitável, e.g. 7,4, que sejam adequados a administração intravenosa contínua ou oral ou blous intravenoso para promover a inibição da agregação de plaquetas» invento também inclui métodos para inibição da agregação de plaquetas que se caracteriza® pela administração a um paciente de uma quantidade eficaz de uma composição do presente invento por um método intravenosa contínuo ou. oral ou um bolus intravenoso»

DESCRIÇgQ DETALHADA DG INVENTO

Ds compostos do presente invento . são antagonistas do receptor do fibrinogènio que inibem a agregação de plaquetas induzida pelo fibrinogènio» Estes compostos são preparados por síntese em fase sólida que é bem conhecida na especialidade ou pelo método líquido igualmente bem conhecido (Neursth, Hill & Boeder, Eds» «The Proteins» 3ã Edição, Vol II, Academic Press» 1976).

Os compostos do invento são especificamente úteis na prevenção da formação de coágulos pela inibição da ligação do fibrinogènio ao receptor complexo de glicoproteínas Ilb/IIIa da membrana de plaquetas» Os compostos preferidos t'ê'm selectividade relativamente a outros receptores ds integrinas e são portanto especificamente destinados a prevenir trombose»

Os processos para a síntese de aminoácidos sintéticos definidos por XX tais como homolisina, ácido 7-amino-heptanóico, fenilarginina, ácido 5-guanidovalérico e benzilarginina são bem conhecidos» A síntese de DL-homoLis está descrita, por exemplo, sm Payns, Synthetic Comm» 15 (14),. pp 1277-129® (1935)« Os processos de guanilação estão descritos, por exemplo, em Methods o f En z y mo1ogy, Synthesis, pp»

256, 558 (1972) 777-778 (198ά).

e em A =

Mil ler e 3 »3» Bischaff, us compostos da invento podem ser preparados usando síntese de peptídeos em fase sólida, por exemp,lo como descrito por Merrrifield, 3. Am» Chem. Soe«« 85, 2149 (1964), se bem que também possam ser usadas outras sínteses químicas equivalentes conhecidas, como sejam as sínteses ds Houghten, Proc» Natl» Acad»

Sei», 32, 5132 (1985)= A síntese em fase sólida começ:a no extremo 0 do peptídeo pelo acoplamento de um aminoácido protegido a uma

resina adquada, coma estabelecido de um modo” geral na Patente U.S» ΝΘ 4,244,946 de Rivier et al, publicado em 21 de Janeiro de 1982, a descrição da qualé aqui incluída como referência» 0 método em solução pode ser usado como descrito por Neurath et al. Capítulo 2, pp» 106-253» Exemplos de síntese deste tipo geral estão descritos nas Patentes U.S» 4,3€í5,S72 e 4,316,891.

Na síntese destes polipeptídeos, o aminoãcido do extremo carbonilo, tendo o seu grupo alfa-amino adequadamente protegido, foi covalentemente acoplado a uma resina polistireno clorometilada ou similiares, como seja p-hidroximetilfenilacetilaraidomstilresina (resina PAM)» A resina polistireno clorometilada é composta por esferas- finas (20-70 microns de diâmetro) de uma resina sintética preparada por copolimerização do estireno com 1 a 2 por cento de divinilbenzeno. Ds anéis de benzeno na resina são clarometilados numa reacção de Friedel-Crafts com éter metilico de cloromefilo e cloreto estSnico» A reacção de Friedel-Crafts continuou até a resina conter 0,5 a 5 mmoles de cloro por grsa-3 de resina» Após remoção do grupo protector de de alfa-amina, como seja pela utilização de ácido trifluoroacético em cloreto de metileno, o derivado com amina protegida do aminoácido seguinte na sequência é adicionado juntamente com um agente de condensação como seja diciclo-hexilcarbodiimida. Os restantes aminoácidos protegidos em alfa-amina e nas cadeias laterais são então acoplados por passos de condensação na ordem pretendida para se obter um composto intermédio ligado à resina»

A condensação entre dois aminoácidos, ou um aminoácido e um peptideo, ou um peptideo e um peptideo pode ser efectuado ds acordo com os métodos de condensação habituais como seja o método de azida, método de anidrido ácido misto, método DCC Cdiciclo-hexil-carbodiimida), método BOR (benzotriazole-í—íloxitris (dimetíl amino) fosfónio hexafluorofosfato, método de éster activo (método

do éster p—nitrofenilico, método do éster 'M-flidroxi-succinimido, método do éster cianometilico, etc»), método K do reagente de Woodward, método do carbonildiimidazol, método de oxidação-redução» No caso da elongação da cadeia, peptídica no método de fase sólida, o peptideo é ligado a um veicula insolúvel no aminoácido C-terminal» Como veículos insolúveis podem ser usados os que reagem com o grupo carbonilo do aminoácido C-terminal para formar uma. ligação que é fácilmente clivada mais tarde, por exemplo, resina balometilada como seja resina e1arometilada e resina bromometilada, resina, hidroximetilada, resina sminometilada, benzidirlamina-resina e t-alquiloxicarbonil-hidrazída.

é comum à síntese química, de peptídeos a protecção dos grupos reactivos das cadeias laterais das várias fracções de aminoácidos com grupos protectores adquados até o grupo ser finalmente removido após a cadeia estar totalmente montada» Também é comum a' protecção do grupo alfa-amina. num aminoácido ou num fragmento enquanto a entidade reage no grupo carboxilo seguido da remoção selectiva do grupo protector de alfa—amina para permitir que nesse local se desenrole a reacção subsequente» Assim, é comum que, como um passo na síntese, seja produzido um composto intermediária que inclua; cada um dos resíduos de aminoá— eidos posicionados na sequência pretendida na cadeia peptídica com vários destes resíduos tendo grupos protectores das cadeias laterais» Estes grupos protectores são então removidos substancialmente ao mesmo tempo de modo a produzir o produto resultante a pós pu r i f ícação» ni 1ox icarbon i 1 o C iíMOC), ρ-η í t robenziloxicarbon i1o

Os grupos protectores aplicáveis na protecção de grupos amina de cadeias laterais alfa e omega são exemplificados como benziloxicarbonilo (daqui em diante abreviado como Z), isonicoti0-c1orobenz i1oxicarboni1o CZ(2C1)3,

EZ (Nu.-,) j , p-metQxobenziloxicarboní lo

CZ(0Me)3, t-butoxicarbonilo (Beic), t-amiloxicarbonilo (Aoc), isoborniloxicarboni1o, adamantí1oxicarboni1d «

-oxTemi

-propi loxicarboni lo CBpoc), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), metilsulfoniletoxicarbonilo íMsc), trifluoroacetilo, ftalilo, formilo, 2-nitrofenilsulfenilo (NFS), difenilfosf.inotioílo (Ppt), dimetilfosfinotioílo (Mpt) e similares»

Grupos protectores do grupo carbonilo incluem, por exemplo, éster benzílico COBzl), éster ciclo-hexílico (Chx), éster 4-nitrobenzí1ico ÍQnb), éster t-butílico ÍQBut), éster 4-pirimiriilmetilico COPic) e similares» έ desejável que aminoácidos específicos tais como arginina, císteina e serina possuindo um grupo funcional diferente da grupos amina ou carboxilo estejam protegidos por um grupo protector adequado conforme for neessário» Por exemplo o grupo guar.idino na arginina pode ser protegido com nitro, p--tolueno~su.ltonilo, benziloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, p-metoxíhsnzenossulfonilo, 4—metoxi-2, ó-dimetilbenzenossulfonilo (Mds), 1,3,5—trimetilfenilsulfoniloíMts) e similares» 0 grupo tiol na císteina pode ser protegido com benzilo, p-metoxi ben z iIo, trifenilmetilo, acetilamidometilo, etilcarbamoílo, lo, 2,4,6—trimetilbenzilo (Tmb) etc», e o grupo serina pode ser protegido com benzilo, t-butilo, acetilo, tetra -hidropiranilo etc»

4-meti1benzihidroxilo em

Stewart e Young, «Solid Phase Peptide Synthesis» Pierce Chemical Company, Rockford, IL (Í984) proporciona informação detalhada relativamente a processos para a preparação de peptídeos» A protecção dos grupos α-amina está descrita nas páginas 14—18 e o bloqueamento das cadeias laterais está descrito nas páginas 18-28» Nas páginas 149—151 está representada uma tabela de grupos protectores das funções amina, hidroxilo e sulfidrilo» Estas descrições são aqui incluidas como referências»

2@

'? ri \ * ^ν

Após completada a sequência de aminaácidos pretendida, o peptídeo intermediário é removido do suporte de resina por tratamento com um reagente, como seja HF líquido, que não só cliva o peptídeo da resina, como também cliva todos os restantes grupos protectores da cadeia lateral que não interfiram na reacção de cielização» Os grupos das cadeias laterais potencialmente reactivos são protegidos com grupos bloqueadores que são estáveis ao HF» Os peptídeos são tornados cíclicos através de um de vários métodos conhecidos (ver Scroder e Lubke, «The Peptidess Methods of Psptide Synthesis» Vol» I», Academic Press» New York 271-286, cujo conteúdo ê aqui íncluido como referênpor formação de uma ligação dissulfureto entre os resíduos de císteina usando iodo em AcQH ou oxidação ao ar a pH 8 em tampão NH^ OAc» 0 polipeptídeo pode ser então purificado por cromatografia de permeação em gel seguido ds HPLC preparativa, como descrita em Rivier et al«, Peptidess Structure and Biological Function (1979) pp« 125-128« ? rr cia), e»g

EXEMPLO 1 bxnrese de

Ac~Cis(Pmfa)—Asn~(SiMetzI)—(homoLis(Cbz))—Bli—AspCBzX)-Cis (Pmb)—Q

Pam R e finaImente

Ac-Cis-Asn-(DiMeT ζ1)-(homoLis)-81i-Asp-Cis-QH

PMB

Começando com a resina Boc-Cis-Q-Pam, o grupo protector Boc de alfa-amina Ctert-butilearbonil) foi removido (ao mesmo tempo que a cadeia lateral de Cis permanece protegida por p-metii benzilo) usando ácido trifluoroacêtico e cloreto de metileno e a císteina «-desprotegida Asp í benzi1> (Asp ( Bz1)) neutralizada com diísopropiletilamina» protegida com Boc foi então acoplada a cxsteina inediauo

por diciclo-hexiIcarbodiimida e desprotegida com ácido trifluoroacético e cloreto de metileno» Asp foi então neutral iz-adacoffl diieopropiletilamina» Após este processo de acoplagem realizado passo por passo com diciclo-hexilcarbodiimida, a desprotecção com ácido trifluoroacético e cloreto de metileno e neutralização com diisopropiletilamina, os resíduos Sli protegida com Boc, homoLisíCfaz) DiMeTzl» Asn, CisíPmb) foram acoplados sucessivamente» A Cis final foi então acetilada com ácido acético anidro»

Após acetilação, formou-se a segu nte peptídeo-resinas PMB Cbz Bzl PMB

Aceti 1—Cis-Asn-íDiMeTz1s — <homoLis>—Gli—Asn—Cis—Q—Pam R

A clivagem do peptídeo da resina é conseguida usando HFZanisole (Psí <vZv>> para formar;

Η H

Aceti1—Cis—Asn— í DiMeT z1) — ChomoLis)—Gli—Asp—Cis—UH.

Formou-se uma estrutura cíclica por formação de uma ₍ ponte dissulfureto entre os resíduos císteina» 0 peptídeo foi dissolvido em 00-80% de AcQH;H_O à temperatura ambiente e a solução agitada durante a rápida adição de uma solução de iodo em AcOHpara uma concentração final de 2,25 mgZrol de iodo» Após í~2 horas ds tempo de reacção, o excesso de I,-, e de AcOH foram —V removidos por evaporação rotativa sob vácuo e a solução aquosa contendo o peptídeo tornado cíclico foi purificado usando HPLC preparativa num gradiente de 0,1% TFA Η^,Ο-CH^CN sendo os D- e L-diastereómeros separados por meios convencionais» 0 produto final sal de TFA foi convertido em sal de HOftc por passagem

através ds uma coluna ds permuta iónica BioRad A83-X4A (ciclo actato). □ peptídeo acabado és f-----, ! _ í

Aceti 1-Cis-fisn- CDifle í s 1) -í homoLis) -Θ1 i-Asp-Cis~OH»

Como alternativa a formação de dissulfureto por oxidação com iodo, o peptídeo com SH livre foi dissolvido em 1-5% HOAc numa concentração de aproximadamente 2mg/ml e a solução foi ajustada a aproximadamente pH 7-8,5 com NH^OH concentrado. A ciclização foi conseguida sob agitação forte (de preferência com u® pedaço pequeno arame de cobre adicionado para acelerar a reacção? durante um período de í-4 horas a 25*C„ A mistura de reacção foi então concentrada como anteriormente e o produto purificado por HPLC preparativa.

Uti1 idade Terapêutica composto do invento pode ser administrado a doentes em que se pretenda prevenção de trombose por inibição da ligação do fihrinogénio ao receptor complexo de glicoproteínas Ilb/IIIa da membrana de plaquetas. Eles são úteis em cirúrgia nas artérias periféricas (enxertos de artérias, endarterectomia das carótidas) e em cirúrgia cardiovascular em que a manipulação de artérias e orgãos, e/ou a interacção de palquetas com superfícies artificiais, conduza à agregação e consumo de plaquetas. As plaquetas agregadas podem formar coágulos e tromboembolias. Os polipeptídeos do invento podem ser administrados a estes doentes que sofrem intervenções cirúrgicas para evitar a formação de trombos e de tromboembolias»

A circulação ©xtracorporal ê de rotina usada na cirúrgia cardiovascular para oxigenar o sangue» As plaquetas aderem ás superfícies da circuita ex tr-scorporal. A adesão está dependente da interacção entre GPIIb/IIIa nas membranas de plaquetas e o fibrinogénio adsarvido à superfície da circuita, (Sluszka et ai», Arner. J. Phvsioi., 1987 , 252sH, pp óí5~é2í). As plaquetas libei·— tadas de superfícies artificiais apresentam a função hemostática inibida. Os polipeptídeos do invento podem ser administrados para evitar adesão.

Dutras aplicações destes polipeptídeos incluem preven ção da trombose de plaquetas-, e após terapia trombolítica e tromboembolismo e reociusão durante prevenção da trombose de plaquetas.

tromboembolismo e reociusão após angioplastia das artérias coronárias e de outras artérias e após processos de «bypass» dasartérias coronárias. Os polipeptídeos do invento podem também ser usados para evitar enferte do miocárdio»

Estes polipeptídeos podem ser administrados por quaisquer meios convenientes que resultarão na sua libertação para a corrente sanguínea numa quantidade substanciial incluindo injseção intravenosa contínua ou injecção de holus ou métodos orais. As composições do invento incluem peptídeos do invento e veículos farmacológicamente aceitáveis, e.g. soro fisiológico, a um pH adequado, e.g. 7,4, para se conseguir a inibição da agregação de plaquetas. Eles podem ser combinados com agentes trombeiíticos tais como activadores do plasminogénio ou estreptoquinase de modo a inibir a agregação de plaquetas. Eles podem também ser combinados com anticoagulantes tais como heparina, aspirina ou cumarina.

A administração intravenosa está presentemente contemplada como a via de administração preferida» Eles são solúveis em água e podem portanto ser eficazmente administrados em solução» Num exemplo de aplicação, uma quantidade adequada do peptideo é administrada intravenosamente a uma vítima tíe ataque cardíaco a sr sujeita a angioplastia» A administração ocorre durante vários minutos antes

V' · da angioplastia e é numa quantidade suficiente para inibir a agregação de plaquetas, e.g. uma quantidade que consiga um nível estacionário de concentração no plasma entre cerca de 0,05-30 μΜ por quilo, de freferência entre cerca de 0,3-3 μΜ por quilo» Quando esta quantidade é atingida, mantem-se uma infusão entre cerca de 1-Í00 nM por quilo por min», de preferência entre cerca de 10-30 nMpor quilo por min» para inibir a agregação de plaquetas» Se o doente necessitar de fazer cirúrgia de «bypass», a administração pode ser parada imediatamente e não causara complicações durante a cirúrgia que seriam causadas por outros materiaistais como aspirina ou anticorpos monoclonais. Os efeitos dos quais duram horas após cessar a administração.

presente invento também inclui uma composição farmacêutica compreendendo peptídeos do presente invento e activador da palsminogénio tipo tecido ou estreptoquinase. o invento também inclui um método para promover a trombólíse e prevenir a reoclusão num doente, o qual se caracteriza pela administração a um doente de uma quantidade eficaz das composições do invento» presente invento pode tomar outras formas específicas sem se afastar do seu espirito ou atributos essenciais» Assim, os exemplos específicos descritos atrás não deverão ser interpretados como limitantes do âmbito do presente invento»

Claims

iã= - Processo para a preparação de um antagonista do receptor do fibrinogénio com a fórmula que se segue?

XX-SIi-Asp em que XX representa um alfa-aminoãcido sintética contendo uma cadeia lateral linear definida como

NH ou

-CCh\>---AA-CO-M ,
2 n 2 n

-NHR

-AA-WHR íií)

J em que s n ê i, 2 ₅ 3 ou 4 s n' è 2, 3 ou 4?

AA é um ãtomo de oxigénio, um átomo de enxofre ou uma liqação simples? e

R é H, alquilo Cj_&, arilo substituído ou não substituído, arilmetilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou. não substituído, desde que no caso í i), quando AA é uma ligação simples e R é H, então n-Hrt' não é igual a i, 2, 3 ou. 4;

caracterizada par compreender;

a> o acoplamento do aminoãcido de terminal carboxi, tendo o seu grupo alfa-amino adequadamente protegida, cam uma resina de poliestireno clorometilada;

b) a remoção do grupo protector- do alfa-amino;

c) a adição do derivado protegido na cadeia lateral e no amino da aminoácido que se segue na sequência e de um agente de acoplamento por condensação, â resina, e o acoplamento da aminaácido que se segue na sequência ao aminoácido previamente acoplado;

d) a repetição do passo (c) na ardem sequencial desejada de aminoácidos de modo a obter um intermediário peptídico acoplado à resina;

e) a remoção do intermediário peptídico a partir da resina e dos grupos protectores da cadeia lateral restantes; e

f) a ciclização do intermediário peptídico.

2ã„ - Processo para a preparação de um antagonista do receptor do fibrinogénio da fórmulas em que XX representa um alfa aminoãcido sintético tendo uma cadeia lateral contendo uma cadeia lateral linear definida como

NH

CH₂) _n AA (CH₂ ) _n..-_N-_c-_NHR

Ci)

OLÍ .(CH,

-AA.( CH,-) n' —UMHR (ii) em ques n é í ₅ 2, 3 ou 4 ? n’ é 2, 3 ou 4?

AA é um átomo de oxigénio, um átomo de enxofre ou uma ligação simples? e

R é H, alquilo arilo substituído ou não substituído, arilmetilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído, desde que no caso (i), quando AA é uma ligação simples e R ê H, então n+n' não é igual a 1, 2, 3 ou 4, e ZZ representa uma sequência de 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos substituídos ou não substituídos?

caracterizado por compreender;

a) o acoplamento do aminoácida de terminal carboxi, tendo o seu grupo alfa-amino sdequadamente protegido, com uma resina de poliestireno clorometilada?

D) a remoção do grupo protector do alfa-amino?

c) a adição do derivado protegido na cadeia lateral e no amino do aminoácido que se segue na sequência ε de um agente ds acoplamento por condensação, à resina, e o acoplamento do aminoácido que se segue na sequência ao aminoácido previamente acoplado?

d) a repetição do passo Cc) na. ordem sequencial desejada de aminoácidos de modo a obter um intermediário peptídico acoplado à resina?

e) a remoção do intermediário peptídica a partir da resina e dos grupos protectores da cadeia lateral restantes? e

í) a ciclização do intermediário peptídico.
3â. ~ Processo para a preparação de um antagonista, do receptor do fibrinogénio da fórmulas

H

Β - β - C i

i

X ^!* i

C - 61i - Asp - NH - CH

Eem que B representa zero, um ou dois aminoácidos substituídos ou não substituídos? Q representa H, NH, NH.-, ou -Ac-NH? X representa, uma cadeia, lateral de aminoácido definida corno

NH ou

- C CH--?}.

-NHR

Ci) em ques •ff

AA é um átomo de oxigénio, um átomo de enxofre du um-a ligação simples; e

R é H, alquilo arilo substituído ou não substituído, arilmetílo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído, desde que no caso Ci), quando AA é uma ligação simples e R é H, então n+n' não ê igual a 1, 2, 3 ou 4

B

I' representa uma cadeia lateral de um L-aminoácido,

C0NR³R⁴, CH^OH, CO^R², CH., em que R^- é um grupo alquilo tendo í a 4 átomos de carborso ou 7 4

MR’^-R é um aminoácido secundário ou ê H, COOH, CONH„., CGNR% 'Λ-Z //

N \

N -NH desde que quando B for zero aminoácidos substituídos ou não substituídos, então Q é Η, ΝΗ._? du Ac-NH e quando B for um ou dois aminoácidos substituídos ou não substituídos, então Q é NH»
4ã« - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um composto em que ΣΖ é ί, 2, 3 ou aminoácidos de acordo com as fórmulas I, II, III, IV ou V;

'slilih em que

A' é H, acilaraido, acilaminoacilamido, aeilamino-N-metilaminoacil-amido?

R 1

R' e ' ⁹“ são independentemente H, metilo, etilo ou um grupo alquilo inferior tendo 1 a 5 carbonos?

Χ'-Y' è S-3, CHy-S, S~CH₂, CH^CH^ CH^,

CH₂-3-5, CH^-3-S-CH^? e

E' é H, COOH, CONH„, C0NR³r\ CH^OH, CQ„R², CH* em que

O 3R4

R ê um grupo alquilo tendo 1 a 4 átomos de carbono, R e um

7 4 grupo alquila tendo 1 a 4 átomos de carbono ou NR~R é um aminoácido secundário, ou //

N

N -NH tí’’ é um D— ou L- «-aminoácido?

C' é D- ou L- «-aminoácido secundário ou u.m D- ou Laminoácido primário?

F' έ um L- «-aminoácido?

S' ê um D- ou L- «-aminoãcido, aminoácido cíclico secundária ou N—metil-aminoácido? e

R~ é H ou metilo.
5ã» - Processo de acordo com a reivindicação caracterizada por se preparar um composto que ê

S _ <

Ac-Cis-Asn-C DiKeT z 1) — {homoLis)—BIi—Asp—Cis-OH éâ, - Processa de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um composto que é c í Alia-í homoLis?-SIi-Asp-Trp-Pro)
7é„ - Processo para a preparação de um-a composição para a inibição da agregação de plaquetas dependente do fibrinogénio num mamífero, caracterizado por se incluir na referida composição um composto de acordo com a. reivindicação 1, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável, nomeadamente solução salina.

Sã, - Método para a inibição da ligação do fibrinogénio a plaquetas de mamífero, caracterizado por compreender a administração de uma composição de acordo com a reivindicação 7 a um paciente, sendo a gama de dosagem de composto activo de í a 100 nil por quilograma por minuto,
9ã» - Processo para a preparação de uma composição para a inibição da agregação de plaquetas dependente do fibrinogénio num mamífero, caracterizado por se incluir na referida composição um composto de acordo com a reivindicação 2, juntamente com um veículo farmacêuticamente aceitável, nomeadamsnte solução salina,
10â,~ Método para a inibição da ligação do fibrinogénio a plaquetas de mamífero, caracterizado por compreender a administração de uma composição de acordo com a reivindicação 9 a um paciente, sendo a gama ds dosagem de composto activo de i a 100 nM por quilograma por minuto.