KR101913285B1

KR101913285B1 - 세포자멸사의 억제제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101913285B1
Application number: KR1020137015652A
Authority: KR
Inventors: 스테파니 바헤흐; 조엘 나흐조; 베흐나흐 르블르; 프리스카 부아스겔랑; 크리스토프 피오
Original assignee: 상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄; 위니베르시테 드 몽펠리에 2 - 시엉스 에 테크니크; 위니베르시테 드 몽펠리에 1
Priority date: 2010-11-18
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2018-10-30
Also published as: CN103403023B; GT201300117A; NZ610620A; MA34670B1; ME02291B; HRP20151165T1; NI201300045A; CR20130190A; IL226005A0; UA112420C2; MY170604A; PL2640739T3; CN103403023A; CN106188271A; EP2640739B1; ES2653734T3; EP2982685B1; CN106188271B; HK1184791A1; WO2012066103A3

Abstract

본 발명은 세포자멸사, 특히 Fas 수용체에 의해 매개된 세포자멸사를 억제하는 DAXX 및 FADD 단백질의 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포자멸사와 관련된 질병 또는 질환의 치료 또는 예방에서 항-세포자멸사 단편의 유도체, 단편을 포함하는 컨쥬게이트, 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 단편, 유도체, 컨쥬게이트 및 이의 약학적 조성물의 의학적 용도에 관한 것이다.

Description

세포자멸사의 억제제 및 이의 용도{Inhibitors of Apoptosis and Uses Thereof}

본 발명은 특히 의학적 치료에서 세포자멸사의 억제제 및 이의 용도에 관한 것이다.

관상동맥 심장병은 전세계 사망의 주요 원인이며, 연간 3백80만 명의 남성 사망 그리고 3백40만 명의 여성 사망의 원인이 된다. 인구가 노령화되고 공존장애(예를 들어, 비만 및 신진대사 증후군)가 더욱 널리 퍼짐에 따라, 허혈성 심장 질환에 의해 유발된 막대한 공중 위생 부담은 더욱더 증가할 것이다(Yellon et al, N Engl J Med, 2007; 357: 1121-1135에서 재검토).

관상동맥 심장 질환은 심근과 주위 조직에 적절한 혈액 공급을 제공하는 관상동맥 순환의 고장을 의미한다. 관상동맥 심장 질환의 가장 일반적인 원인은 관상동맥의 벽 내에 죽상경화반(즉, 지방 퇴적물)의 축적이다. 관상동맥의 폐색은 심장으로부터 혈류를 제한하여, 심근 세포들의 허혈(즉, 산소 부족에 따른 세포 아사)을 유도하고 심근 세포 사망을 초해라 수 있으며, 이는 일반적으로 심장마비로 알려진 심근 경색(MI) 또는 급성 심근 경색(AMI)으로 불린다. AMI는 유럽과 미국 모두에서 사망의 주요 원인이며, 빈번하고(미국에서 연당 150만 이상의 새로운 케이스) 기능을 손상시키는(심부전 유도) 질환으로 남아있다. 경색 크기는 AMI 이후 심근 기능 회복과 사망률의 주요 결정요인이다. 현재, 경색 크기를 제한하는 가장 효과적인 방법은 심장동맥성형술 또는 혈전의 사용에 의해 가능한 한 빨리 위험에 빠진 심근을 재관류하고 항혈소판 요법의 사용에 의해 관상 동맥의 재폐색을 예방하는 것이다. 허혈성 심근으로 혈류의 재관류 또는 회복은 혈전을 용해하는 혈전용해치료에 의해 또는 경피적 심장동맥성형술에 의해 폐색된 동맥의 희석을 통해 성취된다. 재관류는 일반적으로 심근 세포들 및 심장 기능의 구조에 필수적이다. 그러나, 재관류는 "재관류 손상"을 유도하는 사건들의 캐스케이드를 일으킨다. 이것은 또한 우회 수술 동안 심장 정지로부터의 회복 이후에 일어난다. 재관류 손상은 부정맥, 내피기능이상을 특징으로 하며 무관류 현상(no-reflow phenomenon) 및 심근기절현상(myocardial stunning)(심근 수축성의 가역적 손실)을 유도한다.

재관류 손상은 심근 재관류 직후 생존할 수 있었던 심장 세포들의 세포자멸사에서 정점에 달한다. 심근 허혈/재관류 동안 매우 제약된 형태의 세포 사망의 관여가 재관류 상태에서 새로운 치료적 개입을 유도할 수 있다. 그러나, 심근 허혈/재관류 동안 관여하는 세포자멸사 시그널링 경로들은 인비보로 아직 정확하게 서술되지 않았다.

세포자멸사(즉, "프로그램된 세포 사망")를 억제하는 특히 심근 경색 및 재관류 손상을 치료하기 위한 새로운 치료법들을 발견하는 것은 심장 기능을 보호하고 생명을 살리기 위한 실질적인 도전을 구성한다.

본 발명은 Fas 시그널링 경로를 억제함으로써 심근 경색 이후 심장 세포들의 세포자멸사를 감소시킬 수 있다는 발견을 기초로 한다. Fas 수용체는 FasL(Fas 리간드)에 결합하자마자 삼합체를 형성하고 FAF-1 (Fas-Associated Factor-1), FADD (Fas-Associated Death Domain), DAXX (Death-Domain Associated protein), FAP-1, FLASH (FLICE-associated huge) 및 RIP (Receptor-Interacting Protein)와 같은 시그널링 어댑터와 상호작용하는 DD(사망 도메인)로 불린 세포질 도메인을 통해 세포자멸사를 유도한다. DAXX 및 FADD는 Fas에 독립적으로 결합하며 뚜렷한 세포자멸사 경로를 활성화한다. DAXX는 JNK 키나아제 케스케이드(kinase cascade)를 활성화함으로써 Fas-매개 세포자멸사를 강화시킬 수 있으며, c-Jun과 같은 전사 인자들의 포스포릴화 및 활성화에서 정점에 달한다. 반대로, FADD는 시그널링 카스파제(signalling caspases)의 캐스케이드를 통해, CytoC (Cytochrome-C) 및 SMAC (Second Mitochondria-derived Activator of Caspases)와 같은 디아블로(Diablo)도 불리는 미토콘트리아성 친-세포자멸사 인자들의 방출을 유발한다.

본 발명자들은 Fas 수용체와 DAXX (SEQ ID NO: 1) 또는 FADD (SEQ ID NO: 8)와의 상호작용을 억제하면 심근 경색 이후 심장 세포들의 세포자멸사에 강한 감소를 유도한다는 것을 입증하였다. 또한, 본 발명자들은 DAXX 및 FADD의 소형 단편들이 각각 전장 단백질 DAXX 및 FADD의 항-세포자멸사 능력을 보유한다는 것을 예상치못하게 발견하였다.

따라서, 본 발명은 다음으로 이루어진 펩티드에 관한 것이다:

- SEQ ID NO: 1의 DAXX 단백질의 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적인 아미노산 잔기의 단편, 상기 단편은 SEQ ID NO: 5에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다, 또는

- SEQ ID NO: 8의 FADD 단백질의 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 연속적인 아미노산 잔기의 단편, 상기 단편은 SEQ ID NO: 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다,

상기 펩티드는 세포자멸사를 억제할 수 있다.

특정 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-세포자멸사 펩티드는 SEQ ID NO: 5에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 DAXX 단백질 단편이다. 다른 실시태양에서, 항-세포자멸사 펩티드는 SEQ ID NOs: 21-44의 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 DAXX 단편이다.

다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-세포자멸사 펩티드는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 9에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 FADD 단백질 단편이다. 다른 실시태양에서, 항-세포자멸사 펩티드는 SEQ ID NOs: 45-57의 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 FADD 단편이다.

다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-세포자멸사 펩티드의 펩티도미메틱(peptidomimetic)에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 침투 펩티드와 연결된 본 발명에 따른 항-세포자멸사 펩티드 또는 펩티도미메틱을 포함하는 컨쥬게이트(conjugate)를 제공한다. 세포 침투 펩티드는 Tat, RXR, Bpep 또는 Pip2b일 수 있다.

특정 실시태양에서, 세포 침투 펩티드는 링커를 통해 펩티드 또는 펩티도미메틱에 연결된다.

특정 실시태양에서, 세포 침투 펩티드는 Tat, RXR, Bpep 및 Pip2b로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특히, 특정 바람직한 실시태양에서, 컨쥬게이트는 SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 또는 SEQ ID NO: 61에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 및 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드 또는 적어도 하나의 펩티도미메틱 또는 적어도 하나의 컨쥬게이트의 유효량을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

특정 실시태양에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 적어도 하나의 추가의 생물학적 활성 물질을 더 포함한다. 특히, 생물학적 활성 물질은 사이클로스포린 A, BH4 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 또는 동물 신체의 치료에 사용하기 위한, 특히 인간 또는 동물 신체에서 세포자멸사를 억제하기 위한 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드, 펩티도미메틱, 컨쥬게이트 및 약학적 조성물을 제공한다.

특정 실시태양에서, 본 발명에 따른 펩티드, 펩티도미메틱, 컨쥬게이트 및 약학적 조성물은 인간 또는 동물 신체에서 급성 심근 경색(AMI), 뇌 경색, 장기 이식, 심장 중재시술(체외순환 및 일시적 혈관 폐색) 또는 급성 순환 불안(쇼크 상태)의 치료 방법에 사용된다.

다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 펩티드, 펩티도미메틱, 컨쥬게이트 및 약학적 조성물은 인간 또는 동물 신체에서 허혈, 특히 심장 허혈, 신장 허혈, 허혈 결장염, 장간막 허혈, 뇌 허혈, 하지 허혈, 또는 피부 허혈의 치료 방법에 사용된다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 펩티드, 펩티도미메틱, 컨쥬게이트 및 약학적 조성물은 인간 또는 동물 신체에서 재관류 손상의 치료 방법에 사용된다.

관련 양태에서, 본 발명은 대상에게 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드 또는 적어도 하나의 펩티도미메틱 또는 적어도 하나의 컨쥬게이트 또는 적어도 하나의 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, 대상에서 세포자멸사와 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다.

특정 실시태양에서, 본 발명은 대상에게 사이클로스포린 A, BH4 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 생물학적 활성 물질을 투여하는 단계를 더 포함한다.

상기한 대로, 이런 치료 방법에서, 세포자멸사와 관련된 질병 또는 질환은 급성 심근 경색(AMI), 뇌 경색, 장기 이식, 심장 중재시술, 급성 순환 불안, 재관류 손상 및 허혈로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 이런 및 다른 목적, 이점 및 특징은 바람직한 실시태양의 다음 상세한 설명을 읽는 당업자에게 명백해질 것이다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.

도 1: SPOT 합성에 의한 DAXX 에피토프의 측정. (A) DAXX의 아미노산 서열을 겹쳐진 펩티드 어레이(pepscan; 3 아미노산의 시프트(shift)를 가진 15 mer 펩티드)에서 절단하고 효소-연결 블럿에서 분석하였다. 검은 사각형은 상응하는 에피토프 서열을 가진 4개의 가장 밝은 지점들을 나타낸다. 배양 조건: Fas 수용체의 His-태그 세포내 지역[10 ㎍/ml]; 항체: anti-His-(생쥐)((Sigma H1029; 1:6,000) / anti-생쥐-HRP (Calbiochem 401207; 1:2,000), 노출 시간: 1분. (B) 다른 종들(생쥐, 쥐, 개(CANFA) 및 녹색 원숭이(CHLAE))의 DAXX 서열들을 가진 16-mer KKSRKEKKQTGSGPLG(=SEQ ID NO: 5의 DAXXp)를 포함하는 인간 DAXX 서열의 배열.
도 2: SPOT 합성에 의한 DAXX 에피토프(=DAXXp)의 최적 길이의 측정. (A) (각각 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의) DAXXp-211 및 DAXXp-209 펩티드는 N-말단, C-말단 및 N- 및 C-말단 모두에서 하나의 아미노산 서열만큼 연속적으로 짧아졌고 효소-연결 블럿을 사용하여 분석하였다. 화살표에 의해 나타낸 지점들은 최고 신호 강도(BLU)를 나타내었다. 배양 조건: Fas 수용체의 His-태그 세포내 지역[10 ㎍/ml]; 항체: anti-His-(생쥐)(Sigma H1029; 1:6,000) / anti-생쥐-HRP (Calbiochem 401207; 1:2,000), 노출 시간: 1분. (B) 펩티드 서열 DAXXp-211 및 DAXXp-209의 배열; 최적 DAXX 펩티드 서열을 측정하기 위해, 가장 밝은 지점들에 해당.
도 3: Tat - DAXXp 및 Pip2b - DAXXp 프로테아제 능력의 평가. (A) 태아 소 혈청(FBS, BioWest)에서 Tat-DAXXp 및 Pip2b-DAXXp 컨쥬게이트의 안정성 측정 및 (B) 새롭게 제조된 생쥐 혈청(MS). 펩티드를 0h, 1h, 2h, 4h, 8h, 24h, 및 48h 동안 37℃에서 20% 혈청으로 배양하였고 50㎕의 배양 혼합물을 H₂O/CH₃CN (50/50) 속 100㎕ 10% 다이클로로아세트산(DCA)에 침전시켰다. 샘플들을 혼합하고 -20℃로 유지하였다. 침전된 혈청 단백질들을 원심분리(14,000rpm, 10분)에 의해 분리하고 상층액을 역상 HPLC에 의해 분석하였다(mV*sec으로 최대 면적의 측정). 각 조건에 대해 n≥2. 생쥐 혈청에서 2h 배양 후, 펩타이드의 70% 초과가 여전히 온전한 반면, 24시간 후 모든 펩티드가 분해된다.
도 4: 세포 분포는 배양 시간에 의존한다. 최초 심근세포들을 1h, 4h 또는 6h 동안 1μM 용액의 CF-레이블 Tat-DAXXp 컨쥬게이트(녹색 형광)로 배양하였다. 세포 핵들을 호케스트 염료(청색)로 염색하였다. 흰색 막대는 10㎛를 나타낸다. 1시간 배양 후 CF-Tat-DAXXp의 세포내 분포는 세포질에서 절단된 패턴을 나타내었고(이는 엔도시토시스 통한 내재화(internalization) 이후 펩티드의 엔도솜 포획을 특징으로 한다) 핵 위치가 탐지되지 않았다. 4시간 배양 후, CF-Tat-DAXXp는 엔도솜 소포로부터 빠져나올 수 있어서 더욱 확산된 레이블링 패턴을 발생시킨다. 또한, 핵 축적이 관찰되었다. 더 긴 배양 시간(6시간) 후, CF-레이블 펩티드를 큰 소포에 캡슐화하였고(흰색 화살표) 세포들로부터 제거하였다.
도 5: CPPs 및 CPP - 컨쥬게이트의 항- 세포자멸사 활성의 인비트로 평가. (A) C2C12 세포, (B) 최초 심근세포, (C) H9c2 세포 및 (D) NG108-15 세포에서 DNA 단편화의 워크플로우 및 정량화. 데이터는 100% STS에 대해 정규화되었다. 데이터는 평균±SEM이며, n≥5. 세포들을 24-웰 플레이트에 씨드하고 밤새 성장시켰다. 다음 날, 세포들을 STS 단독 또는 STS + 1μM 펩티드(OptiMEM에서)로 배양하였다(각 세포들에 대한 STS 농도 및 배양 시간은 도면에 제공된다). 그런 후에, 용액들을 제거하고, 완전 배지로 대체하고 40h 동안 추가 배양하였다. 재생 상태 이후, 세포들을 용해하고 DNA 단편화를 제조사 지시에 따라 탐지하였다(Cell Death detection ELISA^PLUS kit - Roche Diagnostics).
도 6: 최초 심근세포들에 대한 Tat - DAXXp 서열의 변형체들의 항- 세포자멸사 활성. 도 5의 표제에서 기술한 대로, DAXXp 서열의 상이한 유사체들(표 2 참조)을 STS에 대항하는 항-세포자멸사 특성들에 대해 평가하였다(Cell Death detection ELISA^PLUS kit - Roche Diagnostics). 유사체들 중 어떤 것도 최초 심근세포들을 보호할 수 없었다 - 16mer DAXXp는 최고의 심장보호 효과를 위한 최적 길이와 서열을 가진다는 것을 확인시키는 사실.
도 7: C2C12 세포, 최초 심근세포 및 H9c2 에 대한 항- 세포자멸사 활성의 면에서 인간 DAXXp 서열과 설치류/쥐 DAXXp 의 비교. 쥐 DAXXp 서열과 동일한 Tat (Tat-mDAXXp - SEQ ID NO: 61)에 컨쥬게이트된 설치류 DAXXp 서열(도 1b 참조)을 STS에 대항하는 항-세포자멸사 특성들에 대해 인간 구조체(Tat-DAXXp)와 비교하여 평가하였다(Cell Death detection ELISA^PLUS kit - Roche Diagnostics). 사용된 C2C12 세포 및 최초 심근세포들은 생쥐로부터 얻었고 H9c2 세포들은 쥐로부터 얻었다. 모든 세포에서, 항-세포자멸사 효과의 증가는 설치류 또는 쥐 세포 형태 때문에 설치류 Tat-mDAXXp 서열을 사용하여 관찰하였다.
도 8: 심근세포에서 FADDp15 및 이의 항- 세포자멸사 효과의 측정. (A) FADD의 단백질 서열들을 겹쳐진 펩티드 어레이(pepscan; 3 아미노산의 시프트를 가진 15 mer 펩티드)에서 절단하고 효소-연결 블럿에서 분석하였다. 검은 사각형은 상응하는 에피토프 서열, 지점 숫자 및 아래 제공된 신호 강도(BLU)를 가진 3개의 가장 밝은 지점들을 나타낸다. (B) FADDp-11의 펩티드 서열(=FADDp15 = SEQ ID NO: 9)은 C-말단, N-말단 또는 C- 및 N-말단 모두에서 하나의 아미노산 서열만큼 연속적으로 짧아졌고 효소-연결 블럿을 사용하여 분석하였다. 화살표에 의해 나타낸 지점들은 최고 신호 강도(BLU)를 나타내었다. 가장 짧은 FADD 에피토프(서열 KRKLERVQS (=FADDp = SEQ ID NO: 12)을 가진 9-mer)는 지점 No. 24에 해당하였다. 배양 조건: Fas 수용체의 His-태그 세포내 지역[10 ㎍/ml]; 항체: anti-His-(생쥐)((Sigma H1029; 1:6,000) / anti-생쥐-HRP (Calbiochem 401207; 1:2,000), 노출 시간: 1분.
도 9: 최초 심근세포 및 H9c2 세포에서 항- 세포자멸사 활성의 면에서 Tat -DAXXp와 FADDp 구조체의 비교. (A) 최초 심근세포 및 (B) H9c2 세포들에서 DNA 단편화의 정량화. 데이터는 100% STS에 대해 정규화되었다. 데이터는 평균±SEM이며, n≥5. 세포들을 24-웰 플레이트에 씨드하고 밤새 성장시켰다. 다음 날, 세포들을 STS 단독 또는 STS + 1μM 펩티드(OptiMEM에서)로 배양하였다(각 세포들에 대한 STS 농도 및 배양 시간은 도면 5에 제공된다). 그런 후에, 용액들을 제거하고, 완전 배지로 대체하고 40h 동안 추가 배양하였다. 재생 상태 이후, 세포들을 용해하고 DNA 단편화를 제조사 지시에 따라 탐지하였다(Cell Death detection ELISA^PLUS kit - Roche Diagnostics). 더 짧은 Tat-FADDp 서열은 Tat-DAXXp보다 덜 효과적인 것으로 발견되었으나 더 긴 Tat-FADDp15는 동일한(H9c2에서) 또는 증가된 항-세포자멸사 효과(최초 심근세포에서)를 가졌다.
도 10: 최초 심근세포 및 H9c2 세포에서 Tat - DAXXp 및 Tat - FADDp15 단독 및 조합의 비교. 0.5μM Tat-DAXXp 및 0.5μM Tat-FADDp15 모두에 의한 배양은 1μM 펩티드 단독과 비교할 때 동일하거나 더 높은 항-세포자멸사 효과를 초래하는 것으로 발견되었다. 또한, 1μM 두 펩티드에 의한 배양은 두 세포 형태에서 최고 보호를 유도하였고, Tat-DAXXp 및 Tat-FADDp15의 조합은 가망 있는 응용이 될 수 있다는 것을 암시한다.
도 11: 인비보 실험 프로토콜. C57B16 생쥐는 심근 허혈-재관류(IR)의 수술적 프로토콜을 받았다. 검은 상자는 생쥐가 감수해왔던 허혈의 기간을 나타낸다. 경색 크기 또는 세포 사망 측정을 각 프로토콜에 대한 수술의 말기에 실행하였다(↑로 나타냄). IR_60': 40분의 허혈, 60분의 재관류. IR_24h: 40분 허혈 및 24시간 재관류.
도 12: IR _60' 을 거친 생쥐에서 Tat - DAXXp (1 mg / kg - IV )의 심장보호 효과. ELISA에 의해 측정된 경색 크기(위험 영역의 %) 및 뉴클레오좀 내 DNA 단편을 IR_60'을 거친 생쥐에서 정량화하였고 Tat, Tat-DAXXp 또는 Tat-scrDAXXp(1mg/kg)뿐만 아니라 DAXXp(10mg/kg)로 치료하였다(재관류 5분 전에 정맥 주사(IV)). 평균±SEM을 (A): 위험 영역/LV 질량(좌심실), (B): 경색 크기(위험 영역의 %) 및 (C): 허혈 부분에서 용해성 뉴클레오좀 대 LV 조직의 비-허혈 부분의 비율에 해당하는 (I/NI 비율)에 대해 그래프로 나타내었다. 다중 비교를 위한 네우만-케우르스 포스트 검사로 원-웨이 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 실행하였다(GraphPad Prism software). P<0.05, P<0.01 및 P<0.001 대 Tat-DAXXp를 각각 ^*, ^** 및 ^***로 표시하였다. P>0.05에 대해 P=ns(현저하지 않음).
도 13: IR _60' 을 거친 생쥐에서 Tat - DAXXp 및 DAXXp 에 대한 복용량 반응. ELISA에 의해 측정된 경색 크기(위험 영역의 %) 및 뉴클레오좀 내 DNA 단편을 IR_60'을 거친 생쥐에서 정량화하였고 재관류 5분 전에 정맥 주사된 Tat(1mg/kg), Tat-DAXXp(0.1, 1 및 10mg/kg) 또는 DAXXp(0.1, 1 및 10mg/kg)로 치료하였다. 평균±SEM을 (A): 위험 영역/LV 질량(좌심실), (B): 경색 크기(위험 영역의 %) 및 (C): 허혈 부분에서 용해성 뉴클레오좀 대 LV 조직의 비-허혈 부분의 비율에 해당하는 (I/NI 비율)에 대해 그래프로 나타내었다.
도 14: IR _24h 를 거친 생쥐에서 Tat - DAXXp (1 mg / kg - IV )의 심장보호 효과. ELISA에 의해 측정된 경색 크기(위험 영역의 %) 및 뉴클레오좀 내 DNA 단편을 IR_24H을 거친 생쥐에서 정량화하였고 Tat, Tat-DAXXp 또는 Tat-scrDAXXp(1mg/kg)뿐만 아니라 DAXXp(10mg/kg)로 치료하였다(재관류 5분 전에 정맥 주사(IV)). 평균±SEM을 (A): 위험 영역/LV 질량(좌심실), (B): 경색 크기(위험 영역의 %) 및 (C): 허혈 부분에서 용해성 뉴클레오좀 대 LV 조직의 비-허혈 부분의 비율에 해당하는 (I/NI 비율)에 대해 그래프로 나타내었다. 다중 비교를 위한 네우만-케우르스 포스트 검사로 원-웨이 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 실행하였다(GraphPad Prism software). P<0.05, P<0.01 및 P<0.001 대 Tat-DAXXp를 각각 ^*, ^** 및 ^***로 표시하였다. P>0.05에 대해 P=ns(현저하지 않음).
도 15: IR _24h 를 거친 생쥐에서 Tat - DAXXp 및 DAXXp 에 대한 복용량 반응. 위험 영역 및 경색 크기(위험 영역의 %)를 IR_24H을 거친 생쥐에서 측정하였고 재관류 5분 전에 정맥 주사된 Tat(1mg/kg), Tat-DAXXp(0.1, 1 및 10mg/kg) 또는 DAXXp(0.1, 1 및 10mg/kg)로 치료하였다. 평균±SEM을 (A): 위험 영역/LV 질량(좌심실), (B): 경색 크기(위험 영역의 %)에 대해 그래프로 나타내었다.
도 16: 심근에서 Tat - DAXXp 구조체들의 시각화. 재관류 시에 1 mg/kg CF-Tat-DAXXp 구조체(CF:카복시플루오레세인)를 생쥐에게 주입하였다. 2시간 파라포름알데하이드 고정(포스페이트 버퍼 속 4% PFA) 이후 바이브라톰(vibratome)으로 LV 단편(20㎛)을 얻었다. 2㎛ 공초점 이미지는 세포질에서 펩티드 구조체의 존재를 나타내는 근세포에서 녹색 레이블링을 분명하게 나타내었다. 원들은 몇몇 경우(오일-침지 X40)에서 관찰된 대로 DAPI-양성 핵에서 펩티드 구조체의 존재를 강조한다.
도 17: 신장 이식 동안 냉 허혈/ 재관류 손상에 대한 사전 데이터. 뇌 사망과 장기간 냉 허혈은 사망 공여자 신장 이식으로부터 이식의 더 나쁜 장기간 결과에 대한 주요 원인이며, 만일 확장된 기준의 공여자('한계 공여자')가 사용된 경우 더 심한 영향을 받는다. 허혈-재관류(IR) 손상-관련 인트라그래프트(intragraft) 염증을 표적화하는 것은 이런 이식의 결과를 향상시키기 위한 매력적인 개념이다. (A) 쥐에서 신장 이식 동안 냉 허혈/재관류의 흐름도. 24h 냉 허혈 후, 표적 미세수술 기술을 사용하여 수컷 LEW 수취인에게 수직으로 신장 조직편이 이식되었다. 펩티드를 1mg/kg으로 1회 i.v 주사로 재관류 직후 주사하였다. 이식 3일 후, RT-PCR 분석(n=3)을 위해 조직편을 회수하였다. (B) 전체 RNA를 cDNA로 역전사하고 GeneAmp 5700 Sequence Detection System(Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)을 사용하여 정량적 실시간 RT-PCR 하였다. ICAM-1, IFN-γ, TNF-α, 인터루킨 (IL)-6 및 bcl-2(Metabion, Martinsried, Germany에 의해 합성)에 대한 Taqman-PCR 반응을 25㎕의 최종 부피로 실행하였다. 이런 사전 데이터는 Tat-DAXXp의 존재하에서, 이식 3일 후 신장 조직편에서 발생한 IFN-γ 및 ICAM-1의 mRNA 발현에 감소를 나타낸다.

명세서 전체에서, 다음 문단에서 정의된 여러 용어들이 사용된다.

용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 본 발명에서 서로 교환하여 사용되며, 중성(하전되지 않은) 형태 또는 염으로서 및 변형되지 않은 또는 글리코실화, 측쇄 산화 또는 포스포릴화에 의해 변형된 다양한 길이의 아미노산 서열을 의미한다. 특정 실시태양에서, 아미노산 서열은 전장 천연 단백질이다. 그러나, 바람직한 실시태양에서, 아미노산 서열은 전장 단백질의 단편이다. 또 다른 실시태양에서, 아미노산 서열은 글리코실 유닛과 같은 아미노산 측쇄, 지질 또는 포스페이트와 같은 무기 이온들에 부착된 추가 치환체뿐만 아니라 설프하이드릴기의 산화와 같은 사슬의 화학적 변화에 관한 변형에 의해 변형된다. 따라서, 용어 "단백질"(또는 이의 동등한 용어)은 특정 특성들을 현저하게 변화시키지 않는 변형들이 일어난 전장 천연 단백질의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 것으로 생각된다. 특히 용어 "단백질"은 동일한 유전자에 의해 암호화되나 이들의 pI 또는 MW 또는 둘 다가 다른 단백질 아이소형, 즉, 변형체를 포함한다. 이런 아이소형은 (예를 들어, 교대적 스플라이싱 또는 제한된 단백질 분해의 결과에 의해) 아미노산 서열이 다를 수 있으며, 다른 경우에, 상이한 번역 후 변형(예를 들어, 글리코실화, 아실화, 포스포릴화)으로부터 발생할 수 있다.

단백질 또는 폴리펩티드를 참조하여 본 발명에서 사용될 때 용어 "유사물"은 단백질 또는 폴리펩티드와 유사하거나 동일한 기능을 가지지만 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 유사하거나 동일한 아미노산 서열 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 구조와 유사하거나 동일한 구조를 반드시 포함할 필요가 없는 펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 내용에서, 유사물은 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 약 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 특정 바람직한 실시태양에서, 단백질의 유사물은 단백질의 아미노산 서열에 적어도 80% 동일하거나 적어도 85% 동일한, 바람직하게는 적어도 90% 동일한, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가진다.

단백질 또는 폴리펩티드를 참조하여 본 발명에서 사용될 때 용어 "단편"은 단백질 또는 폴리펩티드의 적어도 5개 연속 아미노산 잔기 및 30개 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 단백질 또는 폴리펩티드의 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 연속 아미노산 잔기, 바람직하게는 단백질 또는 폴리펩티드의 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 연속 아미노산 잔기 및 더욱 바람직하게는 단백질 또는 폴리펩티드의 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 의미한다. 본 발명의 내용에서, 단백질 또는 폴리펩티드의 단편은 전장 단백질 또는 폴리펩티드의 기능적 활성을 보유한다.

본 발명에 사용된 용어 "상동한"(또는 "상동")은 용어 "동일성"과 동의어이며 두 폴리펩티드 분자 사이의 서열 유사성을 의미한다. 두 비교된 서열에서 위치가 동일한 아미노산 잔기에 의해 차지되는 경우, 개별 분자들은 그 위치에서 상동하다. 본 발명에서 사용된 서열 동일성의 백분율은 아미노산 서열들 중에서 비교를 의미하며 비교 창 위에서 2개의 최적으로 배열된 서열들을 비교함으로써 측정되며, 비교 창에서 아미노산 서열의 부분은 두 서열의 최적 배열에 대한 (첨가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 추가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 아미노산 잔기가 두 서열에서 발생하는 위치들의 수를 측정하여 일치된 위치의 수를 얻고, 비교 창에서 위치들의 전체 수로 일치된 위치들의 수를 나누고 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 얻음으로써 계산될 수 있다. 또한, 백분율은 동일한 아미노산 잔기가 두 서열에서 발생하거나 아미노산 잔기가 갭과 배열되는 위치들의 수를 측정하여 일치된 위치의 수를 얻고, 비교 창에서 위치들의 전체 수로 일치된 위치들의 수를 나누고 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 얻음으로써 계산될 수 있다. 당업자는 두 서열을 배열하는데 사용될 수 있는 여러 정립된 알고리즘이 존재하는 것을 안다. 비교를 위한 서열들의 최적 배열은, 예를 들어, Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482의 국소 상동 알고리즘, Needleman and Wunsch, 1970, J. MoI. Biol. 48:443의 상동 배열 알고리즘, Pearson and Lipman의 유사성 방법, 1988, Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:2444에 대한 연구, 이런 알고리즘의 컴퓨터 실행(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the GCG Wisconsin Software Package) 또는 시각적 검사(generally, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel) 참조)를 사용하여 수행될 수 있다. 백분율 서열 동일성 및 서열 유사성을 측정하는데 적합한 알고리즘의 예들은 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 각각 Altschul et al., 1990, J. MoI. Biol. 215: 403-410 and Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402에 기술된다.

상동한 아미노산 서열들은 동일하거나 유사한 아미노산 서열들을 공유한다. 본 발명의 내용에서, 유사한 잔기들은 참조 서열에서 상응하는 아미노산 잔기들에 대한 보존성 치환 또는 "허용된 점 변형(allowed point mutations)"이다. 참조 서열에서 잔기의 "보존성 치환"은 상응하는 참조 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한, 예를 들어, 유사한 크기, 모양, 전기 전하, 공유 결합 또는 수소 결합을 형성하는 능력 등을 포함하는 화학적 특성 치환이다. 특히 바람직한 보존성 치환은 데이호프 등("Atlas of Protein Sequence and Structure", 1978, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, DC, Suppl. 3, 22: 354-352)에 의한 "허용된 점 변형"에 대해 정의된 기준을 충족하는 것이다.

본 발명의 내용에서, 용어 "치료"는 질병 또는 질환의 개시를 지연 또는 예방하고, 질환의 증상들의 진행, 증가 또는 악화를 늦추거나 멈추고, 질환의 증상들의 완화를 가져오고 및/또는 질환을 치료하는 것을 목표로 하는 방법의 특징을 나타내는데 사용된다. 치료제는 예방적 또는 사전적 작용을 위해, 질병 또는 질환의 개시 이전에 투여될 수 있다. 선택적으로 또는 추가로, 치료제는 치료적 작용을 위해 질병 또는 질환의 개시 후 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "대상"는 세포자멸사와 관련된 질병 또는 질환에 의해 괴롭힘을 받을 수 있으나 질병 또는 질환을 갖거나 갖지 않는 인간 또는 동물, 특히 포유류(예를 들어, 영장류, 개, 고양이, 염소, 말, 돼지, 생쥐, 쥐, 토끼 등)을 의미한다. 본 발명의 여러 실시태양들에서, 대상은 인간이다. 이런 실시태양에서, 대상은 "개체"로 주로 언급된다. 용어 "개체"는 특정 나이를 의미하지 않으며 따라서 어린이, 십대 및 성인을 포함한다.

"약학적 조성물"은 본 발명의 유효량의 펩티드 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 것으로 정의된다.

본 발명에서 사용된 용어 "유효량"은 의도한 목적(들), 예를 들어, 세포, 조직, 시스템 또는 대상에서 원하는 생물학적 또는 의학적 반응을 충족하는데 충분한 펩타이드, 화합물, 물질 또는 조성물의 임의의 양을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 실시태양에서, 목적(들)은 세포자멸사, 예를 들어, 재관류 손상 또는 기관 이식과 관련된 세포자멸사를 억제, 예방 또는 감소; 및/또는 세포자멸사와 관련된 질병 또는 질환을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다.

용어 "약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제"는 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않으며 투여되는 곳에서 특정 농도로 숙주에게 현저하게 유독하지 않은 담체 매질을 의미한다. 이 용어는 용매, 분산제, 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 물질 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 대한 이런 매질 및 물질의 사용은 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, 본 발명에 전문이 참조로 포함된 "Remington's Pharmaceutical Sciences" E.W. Martin, 18^th Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA 참조)

상기한 대로, 본 발명은 세포자멸사와 관련된 매우 다양한 질병 또는 질환의 치료 및/또는 예방에서 치료제로서 유용한 항-세포자멸사 특성을 가진 펩티드에 관한 것이다.

세포자멸사를 억제하는 펩티드

본 발명의 펩티드는 항-세포자멸사 활성을 나태는 DAXX 단편 및 FADD 단편을 포함한다.

용어 "DAXX" 및 "DAXX 단백질"은 서로 교환해서 사용된다. 이들은 인간에서, 염색체 6의 짧은 팔(p) 상의 위치 21.3에 위치한 DAXX 유전자(RefSeq (mRNA): NM_001141969.1)에 의해 암호화된 사망-관련 단백질 6으로 불린 단백질을 의미한다. 바람직한 실시태양에서, DAXX는 SEQ ID NO: 1로 나타낸 아미노산 서열을 가진다. 그러나, DAXX 단백질은 SEQ ID NO: 1의 DAXX 단백질의 아이소형일 수 있으며 따라서 인간 DAXX 유전자에 의해 암호화된 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

용어 "FADD" 및 "FADD 단백질"은 서로 교환해서 사용된다. 이들은 인간에서, 염색체 11의 긴 팔(q) 상의 위치 13.3에 위치한 FADD 유전자(RefSeq (mRNA): NM_003824.3)에 의해 암호화된 사망 도메인을 가진 Fas-관련 단백질로 불린 단백질을 의미한다. 바람직한 실시태양에서, FADD는 SEQ ID NO: 8로 나타낸 아미노산 서열을 가진다. 그러나, FADD 단백질은 SEQ ID NO: 8의 FADD 단백질의 아이소형일 수 있으며 따라서 인간 FADD 유전자에 의해 암호화된 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명자들은 모두 DAXX 단백질(SEQ ID NO: 1)의 단편들인 SEQ ID NO: 5("DAXXp"), SEQ ID NO: 6("DAXXp-14") 또는 SEQ ID NO: 2("DAXXp-15" = "DAXXp-21")에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드는 Fas 수용체와 상호작용하나, 단지 DAXXp가 세포자멸사를 감소시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 유사하게, 본 발명자들은 모두 FADD 단백질(SEQ ID NO: 8)의 단편들인 SEQ ID NO: 9 ("FADDp15") 및 SEQ ID NO: 12("FADDp")에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 펩티드가 Fas 수용체와 상호작용하여 세포자멸사를 감소시킨다는 것을 발견하였다.

따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-세포자멸사 펩티드는 SEQ ID NO: 5로 이루어진 16개 연속 아미노산 잔기의 DAXX 단편이다. 다른 특정 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-세포자멸사 펩티드는 SEQ ID NO: 5에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 연속 아미노산 잔기의 DAXX 단편이다. 바람직하게는, 이런 항-세포자멸사 펩티드는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.

SEQ ID NO: 17 (KKSRKEKKQTGSGPLGN),

SEQ ID NO: 18 (KKSRKEKKQTGSGPLGNS),

SEQ ID NO: 19 (KKSRKEKKQTGSGPLGNSY),

SEQ ID NO: 20 (KKSRKEKKQTGSGPLGNSYV),

SEQ ID NO: 21 (CKKSRKEKKQTGSGPLG),

SEQ ID NO: 22 (PCKKSRKEKKQTGSGPLG),

SEQ ID NO: 23 (PPCKKSRKEKKQTGSGPLG),

SEQ ID NO: 24 (GPPCKKSRKEKKQTGSGPLG),

SEQ ID NO: 25 (SGPPCKKSRKEKKQTGSGPLG),

SEQ ID NO: 26 (CKKSRKEKKQTGSGPLGN),

SEQ ID NO: 27 (CKKSRKEKKQTGSGPLGNS),

SEQ ID NO: 28 (CKKSRKEKKQTGSGPLGNSY),

SEQ ID NO: 29 (CKKSRKEKKQTGSGPLGNSYV),

SEQ ID NO: 30 (PCKKSRKEKKQTGSGPLGN),

SEQ ID NO: 31 (PCKKSRKEKKQTGSGPLGNS),

SEQ ID NO: 32 (PCKKSRKEKKQTGSGPLGNSY),

SEQ ID NO: 33 (PCKKSRKEKKQTGSGPLGNSYN),

SEQ ID NO: 34 (PPCKKSRKEKKQTGSGPLGN),

SEQ ID NO: 35 (PPCKKSRKEKKQTGSGPLGNS),

SEQ ID NO: 36 (PPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSY),

SEQ ID NO: 37 (PPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSYV),

SEQ ID NO: 38 (GPPCKKSRKEKKQTGSGPLGN),

SEQ ID NO: 39 (GPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNS),

SEQ ID NO: 40 (GPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSY),

SEQ ID NO: 41 (GPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSYV),

SEQ ID NO: 42 (SGPPCKKSRKEKKQTGSGPLGN),

SEQ ID NO: 43 (SGPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNS), 및

SEQ ID NO: 44 (SGPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSY).

따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-세포자멸사 펩티드는 SEQ ID NO: 12로 이루어진 9개 연속 아미노산 잔기의 FADD 단편이다. 다른 특정 실시태양에서, 항-세포자멸사 펩티드는 SEQ ID NO: 9로 이루어진 15개 연속 아미노산 잔기의 FADD 단편이다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-세포자멸사 펩티드는 SEQ ID NO: 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개 연속 아미노산 잔기의 FADD 단편이다. 바람직하게는, 이런 항-세포자멸사 펩티드는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.

SEQ ID NO: 45 (KRKLERVQSG),

SEQ ID NO: 46 (KRKLERVQSGL),

SEQ ID NO: 47 (KRKLERVQSGLD),

SEQ ID NO: 48 (KRKLERVQSGLDL),

SEQ ID NO: 49 (RKRKLERVQS),

SEQ ID NO: 50 KRKRKLERVQS),

SEQ ID NO: 51 (GKRKLERVQSG),

SEQ ID NO: 52 (GKRKLERVQSGL),

SEQ ID NO: 53 (GKRKLERVQSGLD),

SEQ ID NO: 54 (GKRKLERVQSGLDL),

SEQ ID NO: 55 (VGKRKLERVQSG),

SEQ ID NO: 56 (VGKRKLERVQSGL), 및

SEQ ID NO: 57 (VGKRKLERVQSGLD).

상기한 대로, 특정 실시태양에서, DAXX 단백질은 SEQ ID NO: 1의 DAXX 단백질의 아이소형이다. 이런 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-세포자멸사 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 DAXX 단백질에서 SEQ ID NO: 5의 단편에 해당하는 16개 연속 아미노산 잔기의 DAXX 단편일 수 있다.

유사하게, 상기한 대로, 특정 실시태양에서, FADD 단백질은 SEQ ID NO: 8의 FADD 단백질의 아이소형이다. 이런 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-세포자멸사 펩티드는 SEQ ID NO: 8의 FADD 단백질에서 SEQ ID NO: 12의 단편에 해당하는 9개 연속 아미노산 잔기의 FADD 단편일 수 있거나 SEQ ID NO: 8의 FADD 단백질에서 SEQ ID NO: 9의 단편에 해당하는 15개 연속 아미노산 잔기의 FADD 단편일 수 있다.

DAXX 아이소형 및 FADD 아이소형은 바람직하게는 각각 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 8과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 초과 동일성, 더욱 바람직하게는 각각 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 8과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 초과 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가진다.

본 발명에 따른 펩티드뿐만 아니라 이의 유도체 및 이의 컨쥬게이트(아래 참조)는 세포자멸사, 특히 심근세포 세포자멸사를 억제, 예방 및/또는 감소시킬 수 있다. 이 능력은, 예를 들어, 세포자멸사 탐지 키트를 사용하는 것과 같은 당업자에게 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 세포자멸사를 측정하는데 적합한 키트의 한 예는 세포 사망 탐지 ELISA^PLUS®키트(Cat. No. 11　774　425　001, Roche Applied Science)이다.

본 발명에 따른 펩티드의 유도체

본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드의 생물학적 활성 유도체에 관한 것이다. "생물학적 활성 유도체"는 세포자멸사를 억제, 예방 또는 감소시키는 펩티드의 능력을 보유하는 본 발명의 펩티드의 임의의 유도체를 의미한다.

특정 실시태양에서, 생물학적 활성 유도체는 화학적 및/또는 생물학적으로 변형된 본 발명의 항-세포자멸사 펩티드의 아미노산 서열을 가진다.

유도체들의 예는 본 발명에 따른 펩티드이다:

- 펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기는 치환되거나 결실되었다,

- 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기는 펩티드 속에 삽입되었고, 및/또는

- 펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기는 화학적으로 변형되거나 유도되었다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 펩티드의 생물학적 활성 유도체는 치환, 삽입, 결실, 변형 또는 유도로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단지 하나 또는 단지 두 개의 아미노산 잔기 변형을 포함한다. 특정 바람직한 실시태양에서, 생물학적 활성 유도체는 하나의 보존성 치환 또는 두 개의 보존성 치환을 포함한다. 특정 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 DAXX 단편의 유도체는 SEQ ID NO: 5의 외부인(즉, SEQ ID NO: 5 내에 포함되지 않는) 아미노산 잔기에 영향을 미치는 하나 또는 두 변형을 나타내며 본 발명에 따른 FADD 단편의 유도체는 SEQ ID NO: 12의 외부인(즉, SEQ ID NO: 12 내에 포함되지 않는) 아미노산 잔기에 영향을 미치는 하나 또는 두 변형을 나타낸다.

적절한 "화학적으로 변형 또는 유도된" 아미노산은, 예를 들어, 천연적으로 발생하는 아미노산 유도체들, 예를 들어, 프롤린에 대한 4-하이드록시프롤린, 리신에 대한 5-하이드록시리신, 세린에 대한 호모세린, 리신에 대한 오르니틴 등을 포함한다. 다른 "화학적으로 변형 또는 유도된" 아미노산은 플루오레세인, 테트라메틸로다민 또는 시아닌 염료 Cy5.5와 같은 레이블에 부착된 아미노산; 또는 아세틸화, 아미드화, 포밀화, 하이드록실화, 메틸화, 포스포릴화, 황산화, 글리코실화 또는 지질화와 같은 하나 이상의 번역 후 변형을 가진 아미노산 잔기를 포함한다. 또한, 특정 화학적 변형, 특히 N-말단 글리코실화는 인간 혈청에서 펩티드의 안정성을 증가시키는 것을 입증하였다(Powell et al, Pharma Res 1993:10:1268-1273). "화학적으로 변형 또는 유도된" 아미노산은 또한 N-미리스톨화에 의해 얻은 증가된 막 투과성을 가진 것들을 포함한다(Brand , et al, Am J Physiol Cell Physiol 1996; 270:C1362-C1369).

본 발명에 따른 펩티드들의 다른 유도체들은 상기 펩티드들의 펩티도미메틱들이다. 펩티도미메틱은 본 발명에 따른 펩티드의 실질적으로 동일한 구조 및/또는 기능적 특징들을 가지는 합성 화학적 화합물을 의미한다. 미메틱은 합성, 비-천연 아미노산 유사물로 전적으로 구성될 수 있거나 하나 이상의 천연 아미노산 및 하나 이상의 비-천연 아미노산 유사물을 포함하는 키메릭 분자일 수 있다. 미메틱은 또한 미메틱 활성을 파괴하지 않는 임의의 수의 천연 아미노산 보존성 치환을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 검사 A를 사용하여, 미메틱이 필수 활성을 가지는지를 확인하기 위해 일상적인 검사를 사용하였다. 미메틱 또는 펩티도미메틱과 관련하여 사용될 때, "실질적으로 동일한"이란 문구는 미메틱 또는 펩티도미메틱은 참조 분자의 하나 이상의 활성 또는 기능, 특히 세포자멸사의 억제를 가진다는 것을 의미한다. 펩티도미메틱을 개발하기 위한 기술들은 보통으로 행해진다. 예를 들어, 펩티드 결합은 펩티드미메틱이 유사한 구조를 채택하도록 허용하며 따라서 최초 펩티드에 대한 생물학적 활성을 허용하는 비-펩티드 결합 또는 비-천연 아미노산에 의해 대체될 수 있다. 추가 변형은 또한 아미노산의 화학적 그룹들을 유사한 구조의 다른 화학적 그룹들로 대체함으로써 실행될 수 있다. 펩티도미메틱의 개발은 NMR 분광기, 결정학 및/또는 컴퓨터-지원 분자 모델링에 의해, Fas 수용체의 세포내 지역에 결합되거나 결합되지 않은 최초 단편/펩티드의 3차 구조를 측정함으로써 촉진될 수 있다. 일단 잠재적인 펩티도미메틱 화합물이 확인된 후, 합성될 수 있고 세포자멸사를 억제하는 이의 능력이 평가될 수 있다.

펩티도미메틱은 통상적으로 3개 구조 그룹: 천연 아민 결합("펩티드 결합") 이외의 잔기 결합 그룹; 천연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 대체하는 비-천연 잔기; 2차 구조 모조물(예를 들어, 베터 턴, 감마 턴, 베타 시트, 알파 나선 구조)을 유도하는 잔기; 또는 단백질분해에 대한 저항성을 제공하는 다른 변화로부터의 것인 비-천연 구조 성분들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리신 미메틱은 숙신산 또는 다른 카복실산 무수물과의 반응에 의해 생성될 수 있다. 리신 및 다른 알파-아미노-함유 잔기 미메틱은 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로하이드라이드, 트라이나이트로벤젠설폰산, O-메틸리소우레아, 2,4-펜테인다이온과 같은 이미도에스터와의 반응 및 글리옥실레이트와의 트랜스아미다제-촉매화 반응에 의해 생성될 수 있다.

하나 이상의 잔기는 반대 키랄성의 아미노산(또는 펩티도미메틱 잔기)에 의해 대체될 수 있다. 따라서, L-형태(화학적 본질의 구조에 의존하는 R 또는 S로 언급될 수 있다)에서 천연적으로 발생하는 임의의 아미노산은 D-아미노산으로 불리나, 또한 R- 또는 S-형태로 불릴 수 있는 반대 키랄성의 동일한 아미노산 또는 미메틱으로 대체될 수 있다.

당업자에 의해 알 수 있듯이, 본 발명의 펩티도미메틱은 "화학적으로 변형 또는 유도된" 아미노산에 대해 기술된, 예를 들어, 레이블인 하나 이상의 변형들 또는 하나의 번역 후 변형을 포함할 수 있다.

펩티드, 유도체 및 펩티도미메틱은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생산되고 분리될 수 있다. 펩티드는 화학적 방법을 사용하여 전체 또는 일부가 합성될 수 있다. 펩티드 및 펩티도미메틱 라이브러리를 생성하는 기술들은 주지되어 있고 예를 들어 멀티핀(multipin), 티 백(tea bag), 스플릿-커플-믹스(split-couple-mix) 기술 및 SPOT 합성을 포함한다.

컨쥬게이트

본 발명은 또한 세포 침투 펩티드 또는 CPP에 연결된 본 발명의 펩티드 또는 이의 유도체를 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것이다.

실제로, 세포의 혈장 막과 같은 세포막을 가로지르는 본 발명의 펩티드 또는 이의 유도체의 흡수를 촉진하기 위해서, 본 발명자들은 이런 펩티드 또는 이의 유도체와 "세포 침투 펩티드"(CPPs)를 컨쥬게이트하는 것이 매우 유용하다는 것을 입증하였다. CPP는 막을 가로지르는 수송을 촉진하기 위해 카고(cargos)와 컨쥬게이트할 수있는 주지된 펩티드이다. 예를 들어 CPP는 Lebleu B. et al., Advanced Drug Delivery Reviews 60 (2008) 517-529 및 Said Hassane F. et al ., Cell. Mol. Life Sci. (2010) 67:715-726에 의해 잘 기술된다. 임의의 CPP가 본 발명에 따른 단편 또는 이의 유도체의 세포질 전달을 개선하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 DAXX 또는 FADD 단편 또는 이의 유도체와 컨쥬게이트할 수 있는 CPP의 예들은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다:

이름 서열

Tat GRKKRRQRRRPPQ

RXR RXRRXRRXRRXR

Bpep RXRRBRRXRRBRXB

Pip2b RXRRXRRXRIHILFQNrRMKWHK

여기서:

- X = 아미노헥실, β-알라닐, p-아미노벤조일, 아이소니페코틸, 또는 4-아미노부티릴

- B = 베타알라닌

- 소문자 = D-아미노산(D-아미노산은 L-아미노산에 의해 대체될 수 있다).

CPP는 통상적으로 소수성 아미노산 또는 양이온성 아미노산의 일부를 분리하는 스페이스 그룹을 가진 둘 이상의 양이온성 아미노산을 가진다. 예를 들어, 양이온성 아미노산은 아르기닌(R)이다. 통상적으로, CPP는 일반적으로 적어도 3 또는 4개 아르기닌 잔기를 가진다. 일부 실시태양에서 CPP는 5, 6 이상의 아르기닌 잔기를 포함한다.

CPP는 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 유도체의 N-말단 또는 C-말단 단부, 바람직하게는 C-말단에 통상적으로 연결된다. 화학적 결합은 예를 들어 이황화 결합, 티오에터 또는 티올-말레이미드 결합과 같은 임의의 화학적 결합을 통해 실행될 수 있다.

특정 실시태양에서, 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 유도체는 링커를 통해 CPP에 연결된다. 링커가 펩티드 또는 이의 유도체의 CPP에 대한 화학적 결합을 허용하는 한, 임의의 형태의 링커가 당업자에 의해 사용될 수 있다. 이황화 결합, 티오에터 또는 티올-말레이미드 결합의 형성을 허용하는 C-말단 시스테인 잔기를 가진 아미노산 서열들을 포함하는 다양한 링커가 가능하다. 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 유도체를 CPP에 연결하는 다른 방식은 옥심을 형성하기 위해 C-말단 알데하이드의 사용을 포함한다. 또 다른 링커는 클릭 화학물질(Click chemistry)을 사용한다.

적절한 링커들의 예는 C, BC, XC, GC, BBCC, BXCC, XBC, X, XX, B, BB, BX 및 XB로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다,

여기서:

- B = 베타알라닌

응용분야

본 발명의 인간 또는 동물 신체의 치료 방법 및 상응하는 치료 방법에서 사용하기 위한 상기한 펩티드, 이의 유도체 및 이의 컨쥬게이트에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 인간 또는 동물 신체에서 세포자멸사와 관련된 질병 또는 질환을 치료 및/또는 세포자멸사를 억제하기 위한 방법에 사용하기 위한 펩티드, 이의 유도체 및 이의 컨쥬게이트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 대상에서 세포자멸사와 관련된 질병 또는 질환을 치료 및/또는 세포자멸사를 억제하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명에 따른 유효량의 펩티드, 이의 유도체 및/또는 이의 컨쥬게이트를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, 대상은 본 발명에 따른 적어도 하나의 항-세포자멸사 DAXX-펩티드 및 본 발명에 따른 적어도 하나의 항-세포자멸사 FADD-펩티드를 투여받는다.

본 발명에서 사용된 용어 "세포자멸사와 관련된 질병 또는 질환"은 세포자멸사에 의해 유발되고, 세포자멸사를 초래하거나 이를 포함하는 임의의 질병 또는 임상적 질환을 의미한다. 특정 실시태양에서, 질병 또는 질환은 Fas 수용체-매개 세포자멸사와 관련이 있다. 용어 "세포자멸사와 관련된 질병 또는 임상적 질환"은 세포자멸사를 일으키고, 초래하거나 유도하며 대상에서 질병 또는 임상적 질환의 존재에 의해 실행되는 임의의 의학적 절차를 포함한다.

따라서, 본 발명에 따른 펩티드, 이의 유도체 및 이의 컨쥬게이트 및 치료 방법은 인간 또는 동물 신체에서 급성 심근 경색(AMI), 뇌 경색, 또는 급성 순환 불안(쇼크 상태)을 치료하는데 사용될 수 있으며 특히 이런 질병들과 관련된 세포자멸사를 억제 또는 감소시키는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드, 이의 유도체 및 이의 컨쥬게이트 및 치료 방법은 장기 이식(예를 들어, 간, 심장, 신장, 섬(islet) 및 장 조직편), 심장 중재시술(재관류 치료, 심폐바이패스와 같은 체외순환 및 일시적 혈관 폐색)을 받은 대상을 치료하는데 사용될 수 있고 특히 이런 의학적 절차에 의해 유발된 세포자멸사를 억제 또는 감소시키는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드, 이의 유도체 및 이의 컨쥬게이트 및 치료 방법은 인간 또는 동물 신체에서 심장 허혈, 신장 허혈, 허혈 결장염, 장간막 허혈, 뇌 허혈, 하지 허혈, 또는 피부 허혈을 치료하는데 사용될 수 있고 특히 허혈과 관련된 세포자멸사를 억제 또는 감소시키는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드, 이의 유도체 및 이의 컨쥬게이트 및 치료 방법은 재관류를 받고 있는 또는 이미 받은 대상을 치료하는데 사용될 수 있고 특히 재관류 손상과 관련된 세포자멸사를 억제 또는 감소시키는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 모든 펩티드, 이의 유도체 및 이의 컨쥬게이트는 허혈 이전 및 동안, 재관류 이전, 재관류와 동시에 또는 이후에 투여될 수 있다.

Fas 수용체에 의해 매개된 세포자멸사는 바이러스성 간염, 윌슨 질병, 알코올성 간염, 콜레스테롤성 간 질병 및 자가면역질병을 포함하는 인간 간 질병과 연관이 있는 것을 입증되었다(예를 들어, Ehrenschwender et al ., Adv. Exp. Med. Biol., 2009, 647: 64-93 참조). 따라서, 본 발명에 따른 펩티드, 이의 유도체 및 이의 컨쥬게이트 및 치료 방법은 이런 질병의 치료를 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 치료 방법에서, 펩티드, 이의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트는 다른 치료제, 특히 세포자멸사, 허혈 및/또는 재관류 손상의 치료에 사용된 치료제와 조합될 수 있다. 특히, 세포자멸사의 고유 경로, 즉 미토콘트리아성 경로를 표적으로 하는 치료제들과의 조합된 치료는 큰 관심대상이다. 따라서, 관련 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 치료 방법에서 사용하기 위해, 다른 치료제, 특히 세포자멸사, 허혈 및/또는 재관류 손상의 치료에 사용된 치료제와 조합된 펩티드, 이의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트를 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명에 따른 치료 방법은 상기 인간 또는 동물 신체에 사이클로스포린 A 및/또는 BH4 펩티드를 투여하는 단계를 포함한다. 사실, 사이클로스포린 A는 미토콘드리아 PTP 개방(opening)을 억제하고 AMI의 환자 및 동물 모델 모두에서 경색 크기를 감소시키는 것으로 입증되었다(Gomez et al, Cardiovasc Res. 2009 ;83(2):226-33; Piot et al, N Engl J Med. 2008;359(5):473-81; Mewton al, J Am Coll Cardiol. 2010 Mar 23; 55(12): 1200-5). 항세포자멸사 Bcl-xl 단백질로부터 유도된 BH4는 재관류 시에 Tat 단백질의 컨쥬게이트로서 투여될 때 허혈-재관류 동안 세포자멸사를 감소키는데 효과적인 것으로 보고되었다(Ono et al, Eur J Cardiothorac Surg . 2005, 27(1): 117-121; Donnini et al, Cell Cycle 2009; 8(8):1271-1278; Boisguerin et al., J. Control Release, 2011, doi:10.1016/j.jconrel.2011.07.037).

본 발명에 따른 치료 방법들에서, 모든 화합물들(펩티드, 유도체, 컨쥬게이트, 조합된 생성물)은 정맥내, 비경구, 동맥내, 근내, 경구 및 비강을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 적절한 경로 중 임의의 것을 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 펩티드, 이의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트의 투여는 투여된 양이 의도된 목적에 효과적인 복용량일 것이다. 투여 경로, 투여된 제제(아래 참조) 및 복용량은 원하는 치료 효과, 이미 존재하는 경우 치료될 질환의 심각성, 임의의 감염의 존재, 환자의 나이, 성별, 체중 및 일반적인 건강 상태뿐만 아니라 사용된 펩티드, 유도체 또는 컨쥬게이트의 효능, 생체이용가능성, 및 인비보 반감기, 공존하는 치료의 사용(또는 미사용) 및 다른 임상적 인자들에 의존할 것이다. 이런 인자들은 치료 과정에서 주치의에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 치료는 1회 복용 또는 수 회 복용으로 이루어질 수 있다. 따라서, 펩티드, 이의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트는 특정 시간 동안 또는 주기적 및 예를 들어, 시간, 일, 주(또는 일부 다른 여러 날 간격)와 같은 정해진 간격 등 동안 일정할 수 있다. 선택적으로, 투여는 시간의 기간 동안 연속적 전달, 예를 들어, 정맥내 전달일 수 있다.

약학적 조성물

상기한 대로, 본 발명의 펩티드, 이의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트는 그 자체로 또는 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 항-세포자멸사 펩티드(또는 이의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트) 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 조성물은 적어도 하나의 추가 생물학적 활성 물질을 더 포함한다. 특정 실시태양에서, 약학적 조성물은 본 발명에 따른 적어도 하나의 항-세포자멸사 DAXX-펩티드 및 본 발명에 따른 적어도 하나의 FADD-펩티드를 포함한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 임의의 양으로 원하는 예방 및/또는 치료 효과를 얻기 위해 효과적인 임의의 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 최적의 약학적 제제는 투여 경로 및 원하는 복용량에 따라 변할 수 있다. 이런 제제는 투여된 활성 성분(들)의 물리적 상태, 안정성, 인비보 방출의 속도 및 인비보 청소율의 속도에 영향을 줄 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여의 용이함과 복용량의 균일성을 위해 단위 제형으로 제제화될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "단위 제형"은 본 발명의 적어도 하나의 펩티드(또는 이의 적어도 하나의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트) 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제의 물리적으로 구별된 단위를 의미한다. 그러나, 조성물의 총 일일 복용량은 적절한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것이 이해될 것이다.

제제. 주사용 제제, 예를 들어, 살균 주사용 수성 또는 유성 현탁액이 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 살균 주사용 제제는 비-독성의 비경구로 허용가능한 희석제 또는 용매 속 살균 주사 용액, 현탁액 또는 에멀젼, 예를 들어, 2,3-부테인다이올 속 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매는 물, 링거 용액, U.S.P. 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 살균성, 고정 오일은 용액 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이런 목적을 위해서 합성 모노- 또는 다이-글리세라이드를 포함하는 임의의 무자극성 고정 오일이 사용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산이 또한 주사용 제제의 제조에 사용될 수 있다. 살균 액체 담체는 비경구 투여를 위한 살균 액체형 조성물에 유용하다.

주사용 제제는, 예를 들어, 박테리아-보유 필터를 통한 여과 또는 사용 전에 살균수 또는 다른 살균 주사용 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 살균 고체 조성물 형태로 살균제를 포함함으로써 살균될 수 있다. 살균 용액 또는 현탁액인 액체 약학적 조성물은, 예를 들어, 정맥, 근내, 복강내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 주사는 1회 주입 또는 점진적 주입을 통할 수 있다. 필요하거나 바람직할 때, 조성물은 주사 위치에서 통증을 완화하는 국소 마취제를 포함할 수 있다.

활성 성분의 효과를 연장하기 위해서, 피하 또는 근내 주사에 의한 성분의 흡수를 늦추는 것이 주로 바람직할 수 있다. 비경구로 투여된 활성 성분의 흡수를 지연하는 것은 오일 비히클에 성분을 용해하거나 현탁함으로써 성취될 수 있다. 주사용 디팟 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 폴리머에 활성 성분의 마이크로-캡슐화 기질을 형성함으로써 제조된다. 활성 성분 대 폴리머의 비율 및 사용된 특정 폴리머의 성질에 따라, 성분 방출의 속도가 제어될 수 있다. 다른 생분해성 폴리머들의 예는 폴리(오르쏘에스터) 및 폴리(안하이드라이드)를 포함한다. 디팟 주사용 제제는 신체 조직들과 양립할 수 있는 리포좀 또는 마이크로에멀젼에 활성 성분을 가둠으로써 제조될 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 제형은 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽, 엘릭서제 및 가압 조성물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 활성 성분(들) 이외에, 액체 제형은 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 에틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 다이메틸포름아마이드, 오일(특히, 목화 씨, 땅콩, 옥수수, 발아, 올리브, 피마자 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라하이드로퍼퓨릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스터 및 이의 혼합물과 같은 유화제와 같은 당업계에서 일반적으로 사용된 불활성 희석제를 포함할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 습윤제, 현탁제, 방부제, 스위트닝제, 향료 및 향수, 점증제, 착색제, 점도 조절제, 안정제 또는 삼투압 조절제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 경구 투여를 위한 적절한 액체 담체들의 예는 물(잠재적으로 상기한 첨가제, 예를 들어, 소듐 카복시메틸 셀룰로오스 용액과 같은 셀룰로오스 유도체를 함유할 수 있다), 알코올(글리콜과 같은 일가 알코올 및 다가 알코올) 및 이의 유도체 및 오일(예를 들어, 분별증류된 코코넛유 및 낙화생유)을 포함한다. 가압 조성물의 경우, 액체 담체는 할로겐화 탄화수소 또는 다른 약학적으로 허용가능한 추진제일 수 있다.

경구 투여를 위한 고체 제형은, 예를 들어, 캡슐, 정제, 알약, 분말 및 과립을 포함한다. 이런 고체 제형에서, 본 발명의 펩티드(또는 이의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트)는 소듐 시트레이트 또는 다이칼슘 포스페이트와 같은 적어도 하나의 불활성인 생리학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체 및 (a) 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨 및 규산과 같은 충전제 또는 증량제; (b) 카복시메틸셀룰로오스, 알지네이트, 젤라틴, 폴리바이닐피롤리돈, 수크로오스 및 아카시아와 같은 접합제; (c) 글리세롤과 같은 습윤제; (d) 아가-아가, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트 및 탄산나트륨과 같은 분해제; (e) 파리핀과 같은 용액 방해제; 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 가속제; (g) 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 수적방지제; (h) 카올린 및 벤토나이트 점토와 같은 흡수제; 및 (i) 활석, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트 및 이의 혼합물과 같은 윤활제의 하나 이상과 혼합될 수 있다. 고체 제형에 적합한 다른 부형제들은 비 이온성 및 음이온성 표면 변형제와 같은 표면 변형제를 포함한다. 표면 변형제의 대표적인 예들은 폴록사머 188, 벤즈알코늄 클로라이드, 칼슘 스테아레이트, 세토스테아릴 알코올, 세토마크로골 에멀젼화 왁스, 소르비탄 에스터, 콜로이드성 실리콘 다이옥사이드, 포스페이트, 소듐 도데실설페이트, 마그네슘 알루미늄 실리케이트 및 트라이에타놀아민을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우에, 제형은 또한 완충제를 포함할 수 있다.

유사한 형태의 고체 조성물은 락토오스 또는 유당과 같은 부형제뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하여 부드럽고 단단한-충전 젤라틴 캡슐 속 충전제로서 사용될 수 있다. 고체 제형의 정제, 드라제, 캡슐, 알약 및 과립은 장 코팅, 방출 제어 코팅 및 약학 조제 업계에서 주지된 다른 코팅제와 같은 코팅제 및 껍질로 제조될 수 있다. 이들은 선택적으로 불투명화제를 포함할 수 있고 조성물이 될 수 있어서 바람직하게는 내장관의 특정 부분에서, 선택적으로 지연 방식으로 단지 활성 성분(들)을 방출한다. 사용될 수 있는 첨가 조성물들의 예는 폴리머 물질 및 왁스를 포함한다.

특정 실시태양에서, 치료가 필요한 지역(예를 들어, 심근)에 국소적으로 본 발명의 항-세포자멸사 펩티드(또는 이의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트)를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은, 제한하지 않는 예로서, 경피적 심장동맥성형술 또는 관상동맥 우회수술 동안 국소 주입에 의해 성취될 수 있다.

국소 투여의 경우, 약학적 조성물은 바람직하게는 겔, 연고, 로션 또는 물, 글리세롤, 알코올, 프로필렌 글리콜, 지방 알코올, 트라이글리세라이드, 지방산 에스터 또는 미네랄 오일과 같은 담체를 포함할 수 있는 크림으로서 제제화된다. 다른 국소 담체는 액체 석유, 아이소프로필 팔미테이트, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올(95%), 물 속 폴리옥시에틸렌모노라우랫(5%) 또는 물 속 소듐 라우릴 설페이트(5%)를 포함한다. 항산화제, 습윤제, 점도 안정제 및 유사한 물질과 같은 다른 재료들이 필수에 따라 첨가될 수 있다.

또한, 특정 예들에서, 본 발명의 조성물들은 피부 위, 속 또는 아래에 놓인 경피 장치 내에 배치될 수 있다고 예상된다. 이런 장치는 수동 또는 능동 방출 메커니즘에 의해 활성 성분을 방출하는 패치, 임플란트 및 주사를 포함한다. 경피 투여는 신체의 표면 및 상피 및 점막 조직을 포함하는 신체 통로의 내벽을 가로지르는 모든 투여를 포함한다. 이런 투여는 로션, 크림, 폼, 패치, 현탁액, 용액 및 좌약으로 본 발명의 조성물을 사용하여 실행될 수 있다.

다양한 제제를 생산하기 위한 재료 및 방법은 당업계에 공지되어 있고 본 발명을 실시하는데 적합할 수 있다. 항체들을 전달하는데 적합한 제제들은, 예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences ", E.W. Martin, 18^th Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA에서 발견하였다.

추가 생물학적 활성 물질. 특정 실시태양에서, 본 발명의 펩티드는 본 발명의 약학적 조성물에서 유일한 활성 성분이다. 한 실시태양에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 생물학적 활성 물질을 더 포함한다. 적절한 생물학적 활성 물질들의 예는 항-세포자멸사제, 항-염증제, 면역조절제, 진통제, 항균제, 항박테리아제, 항생제, 항산화제, 살균제 및 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

특정 실시태양에서, 추가 생물학적 활성 물질은 사이클로스포린 A, BH4 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

이런 약학적 조성물에서, 본 발명의 항-세포자멸사 펩티드(또는 이의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트) 및 다른 치료제(들)는 다른 성분들의 동시, 개별 또는 연속 투여를 위한 하나 이상의 조합제로 조합될 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 조성물은 펩티드(또는 이의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트) 및 다른 치료제(들)가 함께 또는 서로 독립적으로 투여될 수 있는 방식으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 펩티드(또는 이의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트) 및 다른 치료제는 단일 조성물에 함께 제제화될 수 있다. 선택적으로, 이들은 (예를 들어, 다른 조성물 및/또는 용기에) 유지될 수 있고 개별적으로 투여될 수 있다.

실시예

다음 실시예들은 본 발명의 제조 및 실시하는 바람직한 방식들의 일부를 기술한다. 그러나, 실시예들은 단지 설명을 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다는 것을 이해해야 한다.

막-결합 역전 펩티드 어레이의 합성

펩티드를 N-변형 CAPE-막(Bhargava et al, Mol. Recognit, 2002, 15: 145)상에서 합성하고 MultiPep SPOT-robot(INTAVIS Bioanalytical Instruments AG, Cologne, Germany)에 의해 준비하였다. 인-하우스 소프트웨어 LISA 1.71의 도움으로 어레이 디자인을 실행하였다. 표준 프로토콜(Frank, Tetrahedron, 1992, 48: 9217)을 사용하는 스팟 정의(spot definition)로 합성을 시작하였고, N-메틸피롤리돈(NMP) 및 Fmoc-alanine-Opfp(이중 결합, 각 15분 반응) 속 Fmoc-cysteine-(Trt)-Opfp (0.3M)의 용액의 결합이 이어졌다. DMF(20%)에서 피페리딘에 의한 Fmoc 분열 후, 다이메틸포름아마이드(DMF, 0.6M 용액)에 용해되고 EEDQ(1.1 당량)로 활성화된 4-하이드록시메틸페녹시아세트산(HMPA)을 첨가하고 샘플들로 바로 막 위에 반점을 찍었다(4x 결합, 각 15분 반응 시간). 막을 DMF(2%) 속 아세트산 무수물로 아세틸화하고, DMF(5x3분), 에탄올(2x3분) 및 다이에틸 에터(2x3분)로 세척하고 마지막으로 공기 건조하였다. DMF 속 1,1'-카본일다이이미다졸(CDI, 3당량)로 활성화된 Fmoc-아미노산-OH(0.4M)의 용액으로 막 위에 반점을 찍었다(4x 결합, 각 15분 반응 시간). 프롤린, 티로신 및 글루타민을 1,1'-카본일다이(1,2,4-트라이아졸)(CDT)로 활성화하였다. Fmoc 그룹을 반점들로부터 제거하고 펩티드 서열들을 표준 SPOT 합성 프로토콜(Frank, Tetrahedron, 1992, 48: 9217)을 사용하여 완성하고 β-알라닌을 가진 N-말단 태그가 이어진다.

표준 SPOT 합성을 위해서 Fmoc-aa-Opfp를 다음 측쇄 보호와 함께 사용하였다: E-, D-(OtBu); C,- S-, T-, Y-(tBu); K-, W-(Boc); N-, Q-, H-(Trt); R-(Pbf). 티오에터 결정화의 경우 모든 펩타이드를 DMF(1M), 이중 결합, 각 15분 반응 시간으로 브로모아세트산 2,4-다이나이트로페닐 에스터로 N-아실화하였다.

막을 DMF(3x3분) 및 다이클로로메테인(DCM, 3x3분)으로 세척하고 건조하였다. 고리화를 위해서, 시스테인의 트라이틸 측쇄 보호 그룹을 트라이플루오로아세트산(TFA, 7%), DCM 속 H₂O(2%)(1x5분) 뒤이어 TFA(7%), TIBS(3%), DCM 속 H₂O(2%)로 분열되었다. 막을 DCM(3x3분), DMF(2x3분) 및 DMF(2x3분)으로 세척하였다. 펩티드를 25% 수성 Cs₂CO₃/DMF (1:1)에 의한 처리로 밤새 고리화하였다. 막을 DMF (2x3 min), H₂O (2x3 min), 에탄올 (2x3 min), 및 다이에틸 에터 (2x3 min)로 세척하고 공기 건조하였다.

흔들지 않고 2.5시간 동안 TFA (60 %), TIBS (3 %), 및 DCM 속 H₂O (2%)로 1회 처리를 통해 가수분해 및 측쇄 분해를 얻었고, 세척 단계(DCM 3x3분, DMF 3x3분, 에탄올 3x3분, 다이에틸 에터 2x3분)가 이어졌고, 흔들지 않고 30분 동안 TFA (60 %), TIBS (3 %), 및 DCM 속 H₂O (2%)이 이어졌다. 막을 DCM (3x3분), DMF (3x3분), 에탄올(2x3분), 포스페이트 버퍼 (pH 7.4, 0.1M, 2x3분), H₂O(2x3분), 에탄올(2x3분), 및 다이에틸 에터(2x3분)로 세척하고 공기 건조하였다.

본 발명에 따른 단편의 디자인 및 전달

DAXX 단백질(SEQ ID NO: 1)의 최초 서열은 겹치는 15 mer 펩티드(3 아미노산 시프트)에서 절단되었고 모든 펩티드(243 펩티드)는 상기한 대로 SPOT 합성에 의해 셀룰로오스 막 위에 합성하였다. 펩티드 라이브러리를 Fas 수용체의 His-tagged 세포내 지역(Sigma)으로 배양하였다. Fas 및 펩티드 사이의 상호작용을 anti-His(mouse)/anti-mouse-HRP의 샌드위치를 사용하여 측정하였고 도 1a에 도시된 대로 LumiImager(Roche)를 사용하여 밝혔다. 반점 No. 211 (SEQ ID NO: 2)는 최고 신호 강도를 나타내는 것으로 발견되었고 반점 209, 210 및 212 (각각 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 7)은 최소 에피토프 서열(KSRKEKKQT)을 포함하는 것으로 발견되었다.

그럼에도 불구하고, 15mer 서열 KSRKEKKQTGSGPLG (spot 211, SEQ ID NO: 2) 및 SGPPCKKSRKEKKQT (spot 209, SEQ ID NO: 3)의 서열 길이 분석은 도 1에서 발견된 최소 에피토프에 대한 서열들을 임의적으로 짧게 하는 것은 불가능하다는 것을 밝혔다. 상기한 대로 SPOT 합성을 사용하여, 펩티드 길이의 영향은 N-말단, C-말단 및 두 방향에서 소정의 서열을 짧게 함으로써 분석하였다(도 2a). 최고 신호 강도를 나타낸 펩티드 서열은 도 2b에 도시된다.

DAXX 펩티드 또는 DAXXp (SEQ ID NO: 5)로 불리는 16mer 펩티드(KKSRKEKKQTGSGPLG)에 해당하는 DAXXp-211 및 DAXXp-209의 최고 신호 강도의 합병된 조합을 실행하였다. DAXXp는 중요한 인비트로 및 인비보 항-세포자멸사 활성을 갖는 것으로 발견되었다.

지배적인 음성 단백질(DAXX-DN)[Roubille et al., Circulation, 2007;116:2709-2717]은 DAXXp-211 펩티드로부터 DAXX 단백질의 C-말단 단부까지 연장되는 지역을 포함한다는 사실과 보조를 맞추면서 C-말단에 있는 펩티드를 연장하는 것이 가능하다(도 1b).

AMI 에서 응용분야

CPP에 컨쥬게이트되거나 되지 않은 DAXXp를 전신 투여 이후 생쥐 수술 I/R 모델에서 최초 심근세포에서 이들의 항-세포자멸사에 대해 그리고 경색 크기를 감소시키는 이들의 능력에 대해 검사하였다.

인비트로 평가

제 1 단계에서, 표 1에 나열된 펩티드의 세포 흡수를 유세포 분석기 측정(FACS-CF-표지화 펩티드를 가짐)을 사용하는 생쥐 심근세포의 최초 세포 배양액에서 측정하였고 어떠한 세포독성의 부재를 확인하였다.

이 연구에서 사용된 CPPs 및 CPP - DAXXp 컨쥬게이트

이름	서열	AA
Tat	GRKKRRQRRRPPQ-NH2	13
(RXR)4	(RXR)4-NH2	12
Bpep	RXRRBRRXRRBRXB-NH2	14
Pip2b	(RXR)3-IHILFQNrRMKWHK-NH2	23
Tat-DAXXp	GRKKRRQRRRPPQ-KKSRKEKKQTGSGPLG-NH2 (=SEQ ID NO: 58)	29
Tat-ncDAXXp	GRKKRRQRRRPPQ-AKLYVYINELCTVLK-NH2 (ncDAXXp = SEQ ID NO:13)	29
Tat-scrDAXXp	GRKKRRQRRRPPQ-KKGRKQSGESLGTPKK-NH2	29
(RXR)4-DAXXp	(RXR)4-KKSRKEKKQTGSGPLG-NH2	28
Bpep-DAXXp	RXRRBRRXRRBRXB-KKSRKEKKQTGSGPLG-NH2	30
Pip2b-DAXXp	(RXR)3-IHILFQNrRMKWHK-KKSRKEKKQTGSGPLG-NH2	39
DAXXp	KKSRKEKKQTGSGPLG-NH2 (SEQ ID NO: 5)	16
Tat-DAXXp13	GRKKRRQRRRPPQ-RKEKKQTGSGPLG-NH2 (DAXXp13 = SEQ ID NO:14)	26
mDAXXp	KRFRKEKKQLGSGLLG-NH2 (SEQ ID NO:15)	16
scrDAXXp	KKGRKQSGESLGTPKK -NH2 (SEQ ID NO:16)	16
Tat-mDAXXp	GRKKRRQRRRPPQ-KRFRKEKKQLGSGLLG-NH2 (SEQ ID NO: 61)	29
Pip2b-mDAXXp	(RXR)3-IHILFQNrRMKWHK-KRFRKEKKQLGSGLLG-NH2	39

X = 아미노-헥사노산; B = b-알라닌, r = D-아르기닌; FACS 측정의 경우, 펩티드는 (5,6)-카복시플루오레세인(CF)에 의해 N-말단으로 표지화되었다; 모든 펩티드는 C-말단 아미드화되었다. scr = DAXXp의 스크램블드 버전; mDAXXp는 인간 DAXXp의 생쥐 상동체이다.

연구된 다른 CPP-DAXXp 유도체들은 아래 표 2에 제공된다.

연구된 추가 CPP - DAXXp 유도체

Tat-DAXXp	GRKKRRQRRRPPQ- KKSRKEKKQTGSGPLG-NH2 (SEQ ID NO: 58)
Tat-DAXXp-209	GRKKRRQRRRPPQ-SGPPCKKSRKEKKQT-NH2
Tat-DAXXp-210	GRKKRRQRRRPPQ- PCKKSRKEKKQTGSG-NH2
Tat-DAXXp-211	GRKKRRQRRRPPQ- KSRKEKKQTGSGPLG-NH2
Tat-DAXXp-212	GRKKRRQRRRPPQ- KEKKQTGSGPLGNSY-NH2
Tat-DAXXp	GRKKRRQRRRPPQ-KKSRKEKKQTGSGPLG-NH2
Tat-DAXXp-15	GRKKRRQRRRPPQ-KSRKEKKQTGSGPLG-NH2 = Tat-DAXXp-211
Tat-DAXXp-14	GRKKRRQRRRPPQ- SRKEKKQTGSGPLG-NH2
Tat-DAXXp-13	GRKKRRQRRRPPQ- RKEKKQTGSGPLG-NH2
Tat- DAXXp-9	GRKKRRQRRRPPQ- KSRKEKKQT-NH2

또한, Fas 수용체의 세포내 영역 내 단편들의 잠재적 상호작용은 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술(Biacore Life Science, Sweden)을 사용하여 결합 친화력(Kd)을 측정함으로써 교차 평가하였다. 단편 단독 및 CPP와 함께의 결합 친화력은 표 3에 요약된다.

사용된 구조체들의 결합 친화력(Kd, μM)의 측정.

이름	서열	Kd ± SD [μM]
DAXXp	KKSRKEKKQTGSGPLG-NH2	333±62
mDAXXp	KRFRKEKKQLGSGLLG-NH2	252±64
scrDAXXp	KKGRKQSGESLGTPKK-NH2	≥6000
Tat-DAXXp	GRKKRRQRRRPPQ-KKSRKEKKQTGSGPLG-NH2	13±9
Tat-scrDAXXp	GRKKRRQRRRPPQ-KKGRKQSGESLGTPKK-NH2	n.m.
Tat-DAXXp13	GRKKRRQRRRPPQ-RKEKKQTGSGPLG-NH2	n.m.
Pip2b-DAXXp	(RXR)3-IHILFQNrRMKWHK-KKSRKEKKQTGSGPLG-NH2	0.7±0.2

모든 실험은 바이아코어(Biacore) 장치에서 실행한다. 각 조건의 경우, 3개 독립된 실험의 표준 값 및 상응하는 표준 편차를 그래프로 나타낸다.

그런 후에, 스타우로스포린에 의해 유도된 세포자멸사를 억제하는 이런 펩티드들의 능력을 평가하였다. DNA 단편을 측정하는 세포 사망 탐지 ELISA^PLUS®키트(Roche)를 사용하여 세포자멸사를 측정하였다.

대부분의 공보에서, 당업계에서 현재 이용하고 있는 항-세포자멸사 펩티드를 세포자멸사 유도 3-4시간 전에 투여하였고, 이는 임상적 사용과 관련이 적다. 그런 이유로, 본 연구에 사용된 프로토콜은 스타우로스포린과 함께 펩티드의 투여를 포함하였다. 도 5b는 각각 Tat-DAXXp를 사용하는 44% 및 Pip2b-DAXXp를 사용하는 55%의 최초 심근세포에서 DNA 단편화의 감소를 분명하게 나타낸다. 이것은 CPP 단독 또는 Tat-scrDAXXp 또는 Tat-ncDAXXp 음성 대조군에 의해서는 관찰되지 않았다. 농축 인자는 공급사들에 의해 제안된 대로 계산하였다(치료된 세포들의 DNA 단편화/치료되지 않은 세포들의 DNA 단편화). 결과들을 더욱 잘 비교하기 위해서, (농축 인자에 의해 기술된) DNA 단편화는 스타우로스포린-치료 세포들과 관련이 있다(=100%).

또한 펩티드의 항-세포자멸사 효과는 설치류 NG118-15 (뉴론 세포에 대한 모델) (도 5d), 설치류 C2C12 (근육 세포에 대한 모델) (도 5a) 및 쥐 H9c2 (심장 세포에 대한 모델) (도 5c)에서 분석하였다. DNA 단편화의 최고 감소는 NG118-15에서 Bpep-DAXXp를 사용하여(66% 감소) C2C12에서 Tat-DAXXp를 사용하여(24% 감소) H9c2에서 Pip2b-DAXXp를 사용하여(31% 감소) 관찰되었다. 이것은 적절한 응용분야 또는 생물학적 내용에 대한 최적의 CPP 선택의 중요성을 분명하게 나타낸다.

또한, FADD 단백질 (SEQ ID NO: 8)의 결합 에피토프를 상기한 대로 DAXX 에피토프에 대해 측정하였다(위에 세부내용 참조). 도 8a에 도시된 대로, FADDp15 (VGKRKLERVQSGLDL; SEQ ID NO: 9)에 해당하는 반점 no.11은 더 높은 신호 강도를 가지며 반점 no.10 및 12(SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11)는 FADDp15와 최소 에피토프 서열을 공유한다.

Tat CPP에 컨쥬게이트된 FADD 단백질로부터의 서열 유도체

Tat-FADDp	GRKKRRQRRRPPQ-KRKLERVQS-NH2 (=SEQ ID NO: 59)
Tat-FADDp15	GRKKRRQRRRPPQ-VGKRKLERVQSGLDL-NH2 (=SEQ ID NO: 60)

길이를 절단하는 펩티드 라이브러리를 사용하여, FADDp (SEQ ID NO: 12; KRKLERVQS)에 해당한 FADDp15의 최소 단편을 측정하였다(도 8b). 심근세포에서, 세포자멸사의 감소는 Tat-FADDp의 컨쥬게이트를 사용하여 35% 및 Tat-FADDp-15를 사용하여 57%이었다(도 9).

인비보 평가

두 번째 단계에서, DAXXp의 심장보호 효과를 심근-허혈 재관류의 인비보 모델에서 평가하였다. 가역적 관상동맥 폐색의 수술 모델을 조건으로 하는 C57B16 생쥐에서 급성 심근 허혈 및 재관류를 실행하였다. 수컷 생쥐(22-28g)를 마취하고 하버드 로던트 레시피레이터(harvard rodent respirator)를 사용하여 기관내 삽관을 통해 산소를 공급하였다. 열-조절 수술 케이블을 사용하여 36.8℃ 내지 37.0℃로 체온을 유지하였다. 가슴을 좌 측방 개흉술로 개방하고 좌 관상동맥 쥐에 가역적 관상동맥 스내어 오클루더(reversible coronary artery snare occluder)를 놓았다. 생쥐들에게 심근 허혈-재관류의 2개의 상이한 수술 프로토콜로 무작위로 배분하였다(도 11). 재관류의 종료시에, 동맥을 재폐색하고 프탈로시아닌 블루 염료를 좌심실 공동 속에 주사하고 심근의 비-허혈성 부분을 관류시켰다. 심근 경색 크기에 대한 DAXXp의 효과를 측정하기 위해서, 허혈-재관류의 수술 프로토콜 동안 재관류 5분 전에 정맥으로(미정맥) 펩티드를 투여하였다. 대조군을 (CPP 단독에 대해) Tat 또는 Pib2b 펩티드로 치료하였다. 1mg/kg의 복용량을 선택하였고(μ몰 범위) 0.1 및 10mg/kg에 대한 복용량 반응을 검사하였다.

재관류의 종료시에, 생쥐를 재마취하고, 관상동맥 결찰을 명확하게 단단히 하고 청색 염료를 주사하고 채취한 좌심실을 경색 크기(TTC method, Schwartz et al, J Thromb. Thromb., 2000; 10: 181-187) 또는 DAN 단편화 측정(Cell death detection ELISA^PLUS kit, Roche Diagnostics)하여 허혈-재관류 손상에 대한 심장보호 효과를 조사하였다. 얻은 결과는 도 12 내지 15에 도시된다.

Tat-DAXXp (1mg/kg)을 정맥으로 인비보 주사했을 때, 1시간-재관류 후 측정된 경색 크기는 Tat 펩티드 단독에 비해 53.4% 감소하였다(p<0.01)(위험 영역은 그룹들 중에서 필적할만하였다; p=ns - 도 12a). 이런 심장보호는 Tat-DAXXp 주사된 생쥐 대 Tat-주사된 생쥐로부터의 좌심실에서, 특이적 DNA 단편화, 세포자멸사의 특징의 급격한 감소와 연관이 있었다(도 12b 참조). 이런 심장보호는 Pip2b-DAXXp 또는 CPP 단독에 의해 또는 음성 대조군 Tat-scrDAXXp에 의해 관찰되지 않았다(데이터 도시되지 않음).

도 13은 0.1, 1 및 10mg/kg 주사시에 Tat-DAXXp에 대한 복용량 반응을 도시하며 1mg/kg의 복용량에 대해 최대 효과를 얻은 것을 나타낸다. (CPP 없이) 단독으로 주사된 DAXXp(10mg/kg)은 Tat-DAXXp과 동일한 정도로 경색 크기 및 DNA 단편화 모두를 감소시킴으로써 심근세포를 보호할 수 있었다.

Tat-DAXXp의 심장보호 효과는 재관류 지속기간을 1시간으로부터 24시간으로 연장할 때 유지되었다(도 16).

신장 이식 모델(쥐)에서 실행된 인비보 평가에서 얻은 사전 결과는 Tat-DAXXp(1mg/kg)이 다른 임상 응용분야에서의 허혈-재관류 손상으로부터 보호할 수 있다는 것을 나타내었다.

본 명세서 전체에서, 다양한 참고문헌은 본 발명이 속한 최신기술을 기술한다. 이런 참고문헌들의 공개공보는 참조로 본 발명에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> CNRS BARRERE, St?hanie <120> Inhibitors of Apoptosis and Uses Thereof <130> BCT110406QT <150> PCT/IB2010/003158 <151> 2010-11-18 <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 740 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Thr Ala Asn Ser Ile Ile Val Leu Asp Asp Asp Asp Glu Asp 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Gln Pro Gly Pro Ser His Pro Leu Pro Asn Ala Ala 20 25 30 Ser Pro Gly Ala Glu Ala Pro Ser Ser Ser Glu Pro His Gly Ala Arg 35 40 45 Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Lys Lys Cys Tyr Lys Leu Glu Asn Glu 50 55 60 Lys Leu Phe Glu Glu Phe Leu Glu Leu Cys Lys Met Gln Thr Ala Asp 65 70 75 80 His Pro Glu Val Val Pro Phe Leu Tyr Asn Arg Gln Gln Arg Ala His 85 90 95 Ser Leu Phe Leu Ala Ser Ala Glu Phe Cys Asn Ile Leu Ser Arg Val 100 105 110 Leu Ser Arg Ala Arg Ser Arg Pro Ala Lys Leu Tyr Val Tyr Ile Asn 115 120 125 Glu Leu Cys Thr Val Leu Lys Ala His Ser Ala Lys Lys Lys Leu Asn 130 135 140 Leu Ala Pro Ala Ala Thr Thr Ser Asn Glu Pro Ser Gly Asn Asn Pro 145 150 155 160 Pro Thr His Leu Ser Leu Asp Pro Thr Asn Ala Glu Asn Thr Ala Ser 165 170 175 Gln Ser Pro Arg Thr Arg Gly Ser Arg Arg Gln Ile Gln Arg Leu Glu 180 185 190 Gln Leu Leu Ala Leu Tyr Val Ala Glu Ile Arg Arg Leu Gln Glu Lys 195 200 205 Glu Leu Asp Leu Ser Glu Leu Asp Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Leu Gln 210 215 220 Glu Ala Arg Leu Lys Arg Lys Leu Ile Arg Leu Phe Gly Arg Leu Cys 225 230 235 240 Glu Leu Lys Asp Cys Ser Ser Leu Thr Gly Arg Val Ile Glu Gln Arg 245 250 255 Ile Pro Tyr Arg Gly Thr Arg Tyr Pro Glu Val Asn Arg Arg Ile Glu 260 265 270 Arg Leu Ile Asn Lys Pro Gly Pro Asp Thr Phe Pro Asp Tyr Gly Asp 275 280 285 Val Leu Arg Ala Val Glu Lys Ala Ala Ala Arg His Ser Leu Gly Leu 290 295 300 Pro Arg Gln Gln Leu Gln Leu Met Ala Gln Asp Ala Phe Arg Asp Val 305 310 315 320 Gly Ile Arg Leu Gln Glu Arg Arg His Leu Asp Leu Ile Tyr Asn Phe 325 330 335 Gly Cys His Leu Thr Asp Asp Tyr Arg Pro Gly Val Asp Pro Ala Leu 340 345 350 Ser Asp Pro Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Glu Asn Arg Ser Leu Ala 355 360 365 Met Ser Arg Leu Asp Glu Val Ile Ser Lys Tyr Ala Met Leu Gln Asp 370 375 380 Lys Ser Glu Glu Gly Glu Arg Lys Lys Arg Arg Ala Arg Leu Gln Gly 385 390 395 400 Thr Ser Ser His Ser Ala Asp Thr Pro Glu Ala Ser Leu Asp Ser Gly 405 410 415 Glu Gly Pro Ser Gly Met Ala Ser Gln Gly Cys Pro Ser Ala Ser Arg 420 425 430 Ala Glu Thr Asp Asp Glu Asp Asp Glu Glu Ser Asp Glu Glu Glu Glu 435 440 445 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Thr Asp Ser Glu Glu Glu 450 455 460 Glu Asp Leu Glu Gln Met Gln Glu Gly Gln Glu Asp Asp Glu Glu Glu 465 470 475 480 Asp Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ala Gly Lys Asp Gly Asp Lys Ser Pro 485 490 495 Met Ser Ser Leu Gln Ile Ser Asn Glu Lys Asn Leu Glu Pro Gly Lys 500 505 510 Gln Ile Ser Arg Ser Ser Gly Glu Gln Gln Asn Lys Gly Arg Ile Val 515 520 525 Ser Pro Ser Leu Leu Ser Glu Glu Pro Leu Ala Pro Ser Ser Ile Asp 530 535 540 Ala Glu Ser Asn Gly Glu Gln Pro Glu Glu Leu Thr Leu Glu Glu Glu 545 550 555 560 Ser Pro Val Ser Gln Leu Phe Glu Leu Glu Ile Glu Ala Leu Pro Leu 565 570 575 Asp Thr Pro Ser Ser Val Glu Thr Asp Ile Ser Ser Ser Arg Lys Gln 580 585 590 Ser Glu Glu Pro Phe Thr Thr Val Leu Glu Asn Gly Ala Gly Met Val 595 600 605 Ser Ser Thr Ser Phe Asn Gly Gly Val Ser Pro His Asn Trp Gly Asp 610 615 620 Ser Gly Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly 625 630 635 640 Ser Gly Pro Leu Gly Asn Ser Tyr Val Glu Arg Gln Arg Ser Val His 645 650 655 Glu Lys Asn Gly Lys Lys Ile Cys Thr Leu Pro Ser Pro Pro Ser Pro 660 665 670 Leu Ala Ser Leu Ala Pro Val Ala Asp Ser Ser Thr Arg Val Asp Ser 675 680 685 Pro Ser His Gly Leu Val Thr Ser Ser Leu Cys Ile Pro Ser Pro Ala 690 695 700 Arg Leu Ser Gln Thr Pro His Ser Gln Pro Pro Arg Pro Gly Thr Cys 705 710 715 720 Lys Thr Ser Val Ala Thr Gln Cys Asp Pro Glu Glu Ile Ile Val Leu 725 730 735 Ser Asp Ser Asp 740 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Gly Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu Gly Asn Ser Tyr 1 5 10 15 <210> 8 <211> 208 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Asp Pro Phe Leu Val Leu Leu His Ser Val Ser Ser Ser Leu Ser 1 5 10 15 Ser Ser Glu Leu Thr Glu Leu Lys Phe Leu Cys Leu Gly Arg Val Gly 20 25 30 Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu Asp Leu Phe Ser Met 35 40 45 Leu Leu Glu Gln Asn Asp Leu Glu Pro Gly His Thr Glu Leu Leu Arg 50 55 60 Glu Leu Leu Ala Ser Leu Arg Arg His Asp Leu Leu Arg Arg Val Asp 65 70 75 80 Asp Phe Glu Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Glu Glu Asp 85 90 95 Leu Cys Ala Ala Phe Asn Val Ile Cys Asp Asn Val Gly Lys Asp Trp 100 105 110 Arg Arg Leu Ala Arg Gln Leu Lys Val Ser Asp Thr Lys Ile Asp Ser 115 120 125 Ile Glu Asp Arg Tyr Pro Arg Asn Leu Thr Glu Arg Val Arg Glu Ser 130 135 140 Leu Arg Ile Trp Lys Asn Thr Glu Lys Glu Asn Ala Thr Val Ala His 145 150 155 160 Leu Val Gly Ala Leu Arg Ser Cys Gln Met Asn Leu Val Ala Asp Leu 165 170 175 Val Gln Glu Val Gln Gln Ala Arg Asp Leu Gln Asn Arg Ser Gly Ala 180 185 190 Met Ser Pro Met Ser Trp Asn Ser Asp Ala Ser Thr Ser Glu Ala Ser 195 200 205 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Val Gly Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu Asp Leu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Gly Arg Val Gly Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu Asp Leu Phe Ser Met 1 5 10 15 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser 1 5 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Lys Leu Tyr Val Tyr Ile Asn Glu Leu Cys Thr Val Leu Lys 1 5 10 15 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Lys Arg Phe Arg Lys Glu Lys Lys Gln Leu Gly Ser Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scrambled sequence <400> 16 Lys Lys Gly Arg Lys Gln Ser Gly Glu Ser Leu Gly Thr Pro Lys Lys 1 5 10 15 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu Gly 1 5 10 15 Asn <210> 18 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu Gly 1 5 10 15 Asn Ser <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu Gly 1 5 10 15 Asn Ser Tyr <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu Gly 1 5 10 15 Asn Ser Tyr Val 20 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu 1 5 10 15 Gly <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro 1 5 10 15 Leu Gly <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly 1 5 10 15 Pro Leu Gly <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gly Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gly Pro Leu Gly 20 <210> 25 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ser Gly Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Gly 20 <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu 1 5 10 15 Gly Asn <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu 1 5 10 15 Gly Asn Ser <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu 1 5 10 15 Gly Asn Ser Tyr 20 <210> 29 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu 1 5 10 15 Gly Asn Ser Tyr Val 20 <210> 30 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro 1 5 10 15 Leu Gly Asn <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro 1 5 10 15 Leu Gly Asn Ser 20 <210> 32 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro 1 5 10 15 Leu Gly Asn Ser Tyr 20 <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro 1 5 10 15 Leu Gly Asn Ser Tyr Val 20 <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly 1 5 10 15 Pro Leu Gly Asn 20 <210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly 1 5 10 15 Pro Leu Gly Asn Ser 20 <210> 36 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly 1 5 10 15 Pro Leu Gly Asn Ser Tyr 20 <210> 37 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly 1 5 10 15 Pro Leu Gly Asn Ser Tyr Val 20 <210> 38 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gly Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gly Pro Leu Gly Asn 20 <210> 39 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gly Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gly Pro Leu Gly Asn Ser 20 <210> 40 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Gly Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gly Pro Leu Gly Asn Ser Tyr 20 <210> 41 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Gly Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gly Pro Leu Gly Asn Ser Tyr Val 20 <210> 42 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Ser Gly Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Gly Asn 20 <210> 43 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ser Gly Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Gly Asn Ser 20 <210> 44 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ser Gly Pro Pro Cys Lys Lys Ser Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Gly Asn Ser Tyr 20 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu Asp 1 5 10 <210> 48 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Arg Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Lys Arg Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gly Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly 1 5 10 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Gly Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu 1 5 10 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Gly Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu Asp 1 5 10 <210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Gly Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Val Gly Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly 1 5 10 <210> 56 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Val Gly Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu 1 5 10 <210> 57 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Val Gly Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu Asp 1 5 10 <210> 58 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> conjugate Tat-DAXXp <400> 58 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Lys Lys Ser 1 5 10 15 Arg Lys Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ser Gly Pro Leu Gly 20 25 <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> conjugate Tat-FADDp <400> 59 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Lys Arg Lys 1 5 10 15 Leu Glu Arg Val Gln Ser 20 <210> 60 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> conjugate Tat-FADDp15 <400> 60 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Val Gly Lys 1 5 10 15 Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu Asp Leu 20 25 <210> 61 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> conjugate Tat-mDAXXp <400> 61 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Lys Arg Phe 1 5 10 15 Arg Lys Glu Lys Lys Gln Leu Gly Ser Gly Leu Leu Gly 20 25

Claims

SEQ ID NO: 1의 DAXX 단백질의 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적인 아미노산 잔기의 단편으로 이루어지는 펩티드로, 상기 단편은 SEQ ID NO: 5에 나타낸 아미노산 서열을 함유하고, 상기 펩티드는 세포자멸사를 억제할 수 있는 펩티드.
제 1 항에 있어서,
펩티드는 DAXX 단백질 단편이며 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NOs: 17-44의 임의의 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드.
세포 침투 펩티드에 연결된 제 1 항에 따른 펩티드를 포함하는 컨쥬게이트.
제 3 항에 있어서,
상기 펩티드는 링커를 통해 세포 침투 펩티드에 연결되는 컨쥬게이트.
제 4 항에 있어서,
상기 세포 침투 펩티드는 Tat, RXR, Bpep 및 Pip2b로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 컨쥬게이트.
제 5 항에 있어서,
상기 컨쥬게이트는 SEQ ID NO: 58에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 컨쥬게이트.
인간 또는 동물 신체에서 급성 심근 경색, 뇌 경색, 장기 이식, 심장 중재시술 또는 급성 순환 불안의 치료 방법에 사용하기 위한 제 1 항에 따른 적어도 하나의 펩티드 또는 제 3 항에 따른 적어도 하나의 컨쥬게이트의 유효량 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
제 7 항에 있어서,
적어도 하나의 추가 생물학적 활성 물질을 더 포함하는 약학적 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 추가 생물학적 활성 물질은 사이클로스포린 A, BH4 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약학적 조성물.
인간 또는 동물 신체에서 심장 허혈, 신장 허혈, 허혈 결장염, 장간막 허혈, 뇌 허혈, 하지 허혈, 및 피부 허혈로부터 선택된 허혈의 치료 방법에 사용하기 위한 제 1 항에 따른 적어도 하나의 펩티드 또는 제 3 항에 따른 적어도 하나의 컨쥬게이트의 유효량 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
제 10 항에 있어서,
적어도 하나의 추가 생물학적 활성제를 더 포함하는 약학적 조성물.
제 11 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 추가 생물학적 활성제는 사이클로스포린 A, BH4 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약학적 조성물.
인간 또는 동물 신체에서 재관류 손상의 치료 방법에 사용하기 위한 제 1 항에 따른 적어도 하나의 펩티드 또는 제 3 항에 따른 적어도 하나의 컨쥬게이트의 유효량 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
제 13 항에 있어서,
적어도 하나의 추가 생물학적 활성제를 더 포함하는 약학적 조성물.
제 14 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 추가 생물학적 활성제는 사이클로스포린 A, BH4 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
인간 또는 동물 신체에서 급성 심근 경색, 뇌 경색, 장기 이식, 심장 중재시술 또는 급성 순환 불안의 치료 방법에 사용하기 위한 펩티드.
제 1 항에 있어서,
인간 또는 동물 신체에서 심장 허혈, 신장 허혈, 허혈 결장염, 장간막 허혈, 뇌 허혈, 하지 허혈, 및 피부 허혈로부터 선택된 허혈의 치료 방법에 사용하기 위한 펩티드.
제 1 항에 있어서,
인간 또는 동물 신체에서 재관류 손상의 치료 방법에 사용하기 위한 펩티드.
제 3 항에 있어서,
인간 또는 동물 신체에서 급성 심근 경색, 뇌 경색, 장기 이식, 심장 중재시술 또는 급성 순환 불안의 치료 방법에 사용하기 위한 컨쥬게이트.
제 3 항에 있어서,
인간 또는 동물 신체에서 심장 허혈, 신장 허혈, 허혈 결장염, 장간막 허혈, 뇌 허혈, 하지 허혈, 및 피부 허혈로부터 선택된 허혈의 치료 방법에 사용하기 위한 컨쥬게이트.
제 3 항에 있어서,
인간 또는 동물 신체에서 재관류 손상의 치료 방법에 사용하기 위한 컨쥬게이트.