EA027336B1 - Ингибирующие апоптоз фрагменты белка daxx, их пептидомиметики, конъюгаты и композиции и их применение - Google Patents

Abstract

Изобретение касается фрагментов ассоциированного с доменом смерти белка DAXX, ингибирующих апоптоз клеток, в частности опосредованный рецептором Fas апоптоз. Данные фрагменты содержат от 16 до 24 последовательных аминокислот из белка DAXX и в обязательном порядке включают последовательность SEQ ID NO: 5. Изобретение также касается пептидомиметиков данных антиапоптозных фрагментов, содержащих их конъюгатов, фармацевтических композиций, в состав которых входят антиапоптозные фрагменты, и медицинского применения данных фрагментов, их пептидомиметиков, конъюгатов и фармацевтических композиций для лечения или профилактики заболеваний и состояний, при которых существует необходимость в ингибировании апоптоза.

Description

Настоящая патентная заявка претендует на приоритет по Международной патентной заявке № РСТ/1В2010/003158, поданной 18 ноября 2010 г., которая включена сюда путем ссылки во всей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение имеет отношение к ингибиторам апоптоза и их применению, в частности, в медицине. Уровень техники

Коронарная болезнь сердца является ведущей причиной смертности во всем мире, что составляет 3,8 млн. смертей у мужчин и 3,4 млн. смертей у женщин в год. По мере старения популяции и распространения сопутствующих заболеваний (например, ожирения и метаболического синдрома), как в последние годы, огромное бремя для общественного здравоохранения, обусловленное ишемической болезнью сердца, вероятно, будет еще больше возрастать (см. обзор в Уе11 оп с1 а1., N Епд1 1 Мей, 2007, 357: 1121-1135).

Коронарная болезнь сердца означает неспособность коронарного кровообращения обеспечить адекватное кровоснабжение сердечной мышцы и окружающей ткани. Наиболее распространенной причиной развития коронарной болезни сердца является скопление атероматозных бляшек (т.е. жировых отложений) в стенках коронарных артерий. Закупорка коронарных артерий ограничивает приток крови к сердцу, вызывает ишемию клеток миокарда (т.е. голодание клеток вследствие отсутствия кислорода) и может привести к гибели клеток миокарда, что называют инфарктом миокарда (ΜΙ) или острым инфарктом миокарда (ΑΜΙ) - широко известным как сердечный приступ. ΑΜΙ является ведущей причиной смертности как в Европе, так и в США, и остается распространенным (более 1,5 млн. новых случаев за год в США) и вызывающим инвалидность (приводящим к сердечной недостаточности) заболеванием. Главным фактором, определяющим восстановление функции миокарда и смертность после ΑΜΙ, является размер инфаркта. В настоящее время наиболее эффективным способом ограничения размера инфаркта является как можно более быстрая реперфузия пораженного миокарда при помощи коронарной ангиопластики или тромболиза и предотвращение повторной закупорки коронарной артерии с помощью антитромбоцитарной терапии. Реперфузия или восстановление притока крови в ишемический миокард достигается тромболитической терапией, растворяющей тромб, или расширением закупоренной артерии с помощью чрескожной коронарной ангиопластики. Реперфузия необходима для спасения клеток миокарда и сердечной функции в целом. Однако реперфузия запускает каскад событий, вызывающих реперфузионное повреждение. Оно также возникает при восстановлении от кардиоплегической остановки сердца во время операции шунтирования. Реперфузионное повреждение характеризуется аритмией, дисфункцией эндотелия, вызывающей явление потери кровотока, и оглушением миокарда (обратимой потерей сократимости миокарда).

Кульминацией реперфузионного повреждения является апоптотическая гибель тех сердечных клеток, которые были жизнеспособными непосредственно перед реперфузией миокарда. Участие сильно зарегулированной формы гибели клеток при ишемии/реперфузии миокарда может привести к появлению новых форм лечебного воздействия в фазе реперфузии. Однако сигнальные пути апоптоза, задействованные при ишемии/реперфузии миокарда, еще не полностью установлены ίη νίνο.

Таким образом, поиск новых способов лечения для ингибирования апоптоза (т.е. запрограммированной гибели клеток), в частности, для лечения инфаркта миокарда и реперфузионного повреждения, представляет реальный прорыв для защиты функции сердца и спасения жизней.

Сущность изобретения

Изобретение основывается на открытии того, что можно уменьшить апоптоз сердечных клеток после инфаркта миокарда путем ингибирования сигнального пути Рак. Рецептор Рак подвергается тримеризации при связывании с РакЬ (лигандом Рак) и индуцирует апоптоз через цитоплазматический домен, называемый ΌΌ (домен смерти), который взаимодействует с сигнальными адаптерами, такими как РАР-1 (связанный с Рак фактор-1), ΕΑΌΌ (связанный с Рак домен смерти), ΌΑΧΧ (связанный с доменом смерти белок), ΡΑΡ-1, ΡΕΑδΗ (связанный с РЬ1СЕ гигантский белок) и РТР (взаимодействующий с рецептором белок). ΌΑΧΧ и ΡΑΌΌ независимо связываются с Рак и активируют различные пути апоптоза. ΌΑΧΧ может усиливать опосредованный Рак апоптоз путем активации каскада киназы ίΝΚ, который завершается фосфорилированием и активацией таких факторов транскрипции, как с-ίιιη. В противоположность этому ΕΑΌΌ, через каскад сигнальных каспаз, запускает высвобождение митохондриальных проапоптотических факторов типа Су1оС (цитохром-С) и δΜΑС (второго происходящего из митохондрий активатора каспаз), также называемого ΌίηΝο.

Авторы изобретения показали, что ингибирование взаимодействия рецептора Рак с ΌΑΧΧ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1) или ΕΑΌΌ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 8) приводит к сильному снижению апоптоза сердечных клеток после инфаркта миокарда. Кроме того, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что небольшие фрагменты ΌΑΧΧ и ΕΑΌΌ сохраняют антиапоптозную способность полных белков ΌΑΧΧ и ΕΑΌΌ соответственно.

Соответственно настоящее изобретение касается пептидов, содержащих фрагмент из 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 последовательных аминокислотных остатков белка ΌΑΧΧ по δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1, причем данный фрагмент включает аминокислотную последовательность, при- 1 027336 веденную в 8ЕО ΙΌ N0: 5, или фрагмент из 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 последовательных аминокислотных остатков белка ΡΛΌΌ по 8Е0 ГО N0: 8, причем данный фрагмент включает аминокислотную последовательность, приведенную в 8Е0 ГО N0: 12, при этом данный пептид способен ингибировать апоптоз клеток.

В некоторых воплощениях антиапоптозный пептид по изобретению представлен фрагментом белка ΌΑΧΧ, состоящим из аминокислотной последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 5. В других воплощениях антиапоптозный пептид по изобретению представлен фрагментом белка ΌΑΧΧ, состоящим из аминокислотной последовательности, приведенной в любой из 8Е0 ГО N08: 21-44.

В других воплощениях антиапоптозный пептид по изобретению представлен фрагментом белка ΡΑΌΌ, состоящим из аминокислотной последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 12 или 8Е0 ГО N0: 9. В других воплощениях антиапоптозный пептид по изобретению представлен фрагментом белка ΡΑΌΌ, состоящим из аминокислотной последовательности, приведенной в любой из 8Е0 ГО N08: 45-57.

В другом аспекте настоящее изобретение касается пептидомиметиков антиапоптозных пептидов по изобретению.

В следующем аспекте настоящим изобретением предусмотрены конъюгаты, включающие антиапоптозные пептиды или пептидомиметики по изобретению, соединенные с проникающим в клетку пептидом. Проникающий в клетку пептид может быть представлен Та!, ΚΧΚ, Врер или Ир2Ь.

В некоторых воплощениях проникающий в клетку пептид соединяется с пептидом или пептидомемитиком через линкер.

В некоторых воплощениях проникающий в клетку пептид выбирается из группы, состоящей из Та!, ΚΧΚ, Врер и Ир2Ь.

В частности, в некоторых предпочтительных воплощениях конъюгат состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 58, 8Е0 ГО N0: 59, 8Е0 ГО N0: 60 или 8Е0 ГО N0: 61.

В следующем аспекте настоящее изобретение касается фармацевтических композиций, содержащих по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель и эффективное количество по меньшей мере одного пептида, или по меньшей мере одного пептидомиметика, или по меньшей мере одного конъюгата по изобретению.

В некоторых воплощениях фармацевтические композиции по изобретению дополнительно содержат по меньшей мере одно дополнительное биологически активное средство. В частности, биологически активное средство может быть выбрано из группы, состоящей из циклоспорина А, ВН4 и их комбинаций.

В следующем аспекте настоящим изобретением предусмотрены пептиды, пептидомиметики, конъюгаты и фармацевтические композиции по изобретению для применения в способах лечения людей или животных, в частности для применения в способе ингибирования клеточного апоптоза у человека или животных.

В некоторых воплощениях пептиды, пептидомиметики, конъюгаты и фармацевтические композиции по изобретению применяются в способе лечения острого инфаркта миокарда (ΑΜΙ), церебрального инфаркта, при трансплантации органов, операциях на сердце (экстракорпоральном кровообращении и временной окклюзии сосудов) или остром нарушении кровообращения (состоянии шока) у человека или животных.

В других воплощениях пептиды, пептидомиметики, конъюгаты и фармацевтические композиции по изобретению применяются в способе лечения ишемии, в частности сердечной ишемии, почечной ишемии, ишемического колита, брыжеечной ишемии, ишемии головного мозга, ишемии конечностей или кожи у человека или животных.

В следующих воплощениях пептиды, пептидомиметики, конъюгаты и фармацевтические композиции по изобретению применяются в способе лечения реперфузионного повреждения у человека или животных.

В родственном аспекте настоящим изобретением также предусмотрен способ лечения заболеваний, связанных с апоптозом у субъекта, который включает стадию: введения данному субъекту эффективного количества по меньшей мере одного пептида, или по меньшей мере одного пептидомиметика, или по меньшей мере одного конъюгата, или по меньшей мере одной фармацевтической композиции по изобретению.

В некоторых воплощениях способ дополнительно включает стадию введения данному субъекту по меньшей мере одного дополнительного биологически активного средства, выбранного из группы, состоящей из циклоспорина А, ВН4 и их комбинаций.

Как указано выше, в этих способах лечения заболевание, связанное с апоптозом, может быть выбрано из группы, состоящей из острого инфаркта миокарда (ΑΜΙ), церебрального инфаркта, трансплантации органов, операций на сердце, острых нарушений кровообращения, реперфузионного повреждения и ишемии.

Эти и другие цели, преимущества и особенности настоящего изобретения станут понятными рядовым специалистам после прочтения следующего подробного описания предпочтительных воплощений.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Определение эпитопа ΌΑΧΧ методом 8Р0Т-синтеза. (А) Аминокислотную последователь- 2 027336 ность ΌΑΧΧ нарезали на перекрывающиеся наборы пептидов (пепскан; 15-мерные пептиды со сдвигом в аминокислоты) и анализировали методом ферментной блот-гибридизации. Черным прямоугольником выделены четыре наиболее ярких пятна с соответствующими последовательностями эпитопа. Условия инкубации: Шк-теговый внутриклеточный участок рецептора Рак [10 мкг/мл]; антитела: анти-Нт8-(мышь) (δί§πκ·ι Н1029, 1:6000)/против мыши с НКР (Са1ЪюсНет 401207, 1:2000), время обработки: 1 мин. (В) Выравнивание последовательности ΌΑΧΧ человека, содержащей 16-мер ΚΚδΚΚΕΚΚφΤΟδΟΡΡΟ (=ΌΑΧΧρ δΕΟ ΙΌ N0: 5), с последовательностями ΌΆΧΧ из других видов (мышь, крыса, собака (САКРА) и зеленая мартышка (СНЬАЕ)).

Фиг. 2. Определение оптимальной длины эпитопа ΌΑΧΧ (=ΌΑΧΧρ) методом δΡΟΤ-синтеза. (А) Пептиды ΌΑΧΧρ-211 и ΌΑΧΧρ-209 (δΕΟ ΙΌ N0: 2 и δΕΟ ΙΌ N0: 3 соответственно) последовательно урезали на один аминокислотный остаток с Ν-конца, С-конца и одновременно с С-конца и Ν-конца и анализировали методом ферментной блот-гибридизации. Пятна, указанные стрелками, проявляли самые высокие интенсивности сигнала (ВЬИ). Условия инкубации: Шк-теговый внутриклеточный участок рецептора Рак [10 мкг/мл]; антитела: анти-Шк-(мышь) (δί§πκ·ι Н1029, 1:6000)/против мыши с НКР (Са1ЪюсНет 401207, 1:2000), время обработки: 1 мин. (В) Выравнивание последовательностей двух пептидов ΌΑΧΧρ-211 и ΌΑΧΧρ-209, соответствующих наиболее ярким пятнам, для определения оптимальной последовательности пептидов ΌΑΧΧ.

Фиг. 3. Оценка подверженности ΤΗΐ-ΌΑΧΧρ и Ρίρ2ΆΌΑΧΧρ протеазам. (А) Определение стабильности конъюгатов ΤΗΐ-ΌΑΧΧρ и Ρίρ2^ΌΑΧΧρ в эмбриональной бычьей сыворотке (ΡΒδ, Вю\Уек1) и (В) свежеприготовленной мышиной сыворотке (Μδ). Пептиды инкубировали с 20%-ной сывороткой при 37°С в течение 0, 1, 2, 4, 8, 24 и 48 ч, а затем 50 мкл инкубационной смеси осаждали в 100 мкл 10%-ной дихлоруксусной кислоты (Όί’Α) в Н₂0/СН₃СК (50/50). Образцы смешивали и хранили при -20°С. Осажденные сывороточные белки разделяли центрифугированием (14 000 об/мин, 10 мин), и анализировали супернатанты методом обратнофазовой НРЬС (измерение площади пиков в тУхс). При каждой обработке п>2. После 2 ч инкубации в мышиной сыворотке более 70% пептидов оставались интактными, а через 24 ч все пептиды разлагались.

Фиг. 4. Клеточное распределение зависит от времени инкубации. Первичные кардиомиоциты инкубировали с 1 мкМ раствором меченных СР конъюгатов ΤηΙ-ΌΑΧΧρ (зеленая флуоресценция) в течение 1, или 6 ч. Клеточные ядра окрашивали с помощью красителя НоесНк! (синие). Белые полоски - 10 мкм. После 1-часовой инкубации внутриклеточное распределение ίΈ-ΤΗΐ-ΌΑΧΧρ проявляло точечный профиль в цитозоле (что характерно для эндосомной локализации пептидов после интернализации посредством эндоцитоза), а ядерная локализация не обнаруживалась. После 4-часовой инкубации оказалось, что СР-Τаΐ-^ΑXXρ может высвобождаться из эндосомных пузырьков, что дает более диффузный профиль окрашивания. Кроме того, наблюдалось и накопление в ядре. После более продолжительной инкубации (6 ч) СР-меченый пептид инкапсулировался в большие пузырьки (белые стрелки) и выводился из клеток.

Фиг. 5. Оценка антиапоптозной активности СРРк и конъюгатов СРР ίη νίίτο. Последовательность операций и количественная оценка фрагментации ДНК в клетках С2С12 (А), первичных кардиомиоцитах (В), клетках Н9с2 (С) и клетках N0108-15 (Ό). Данные нормировали к 100% по δΤδ. Данные представляют средние значения ±δΕΜ при п>5. Клетки высеивали в 24-луночные планшеты и культивировали в течение ночи. На следующий день клетки инкубировали с δΤδ отдельно или с δΤδ+1 мкМ пептида (в 0ρΐίΜΕΜ) (концентрация δΤδ и время инкубации для каждых клеток приведены на фигуре). После этого растворы удаляли, заменяли их полной средой и инкубировали еще 40 ч. После фазы регенерации клетки подвергали лизису и определяли фрагментацию ДНК согласно инструкциям производителя (набор для определения гибели клеток Се11 ОеаШ Де1есйоп ΕΕΙδΑ^|,υ'^δ ΚίΙ фирмы КосНе О1адпокНск).

Фиг. 6. Антиапоптозная активность вариантов последовательности ΤΗΐ-ΌΑΧΧρ на первичных кардиомиоцитах. Как описано в подписи к фиг. 5, различные аналоги последовательности ΌΑΧΧρ (см. табл. 2) оценивали на антиапоптозные свойства против δΤδ (набор Се11 Оеа1Н НеЮсОоп ΕΕΙδΑ^|,υ'^δ фирмы КосНе 0|адпок11с5). Ни один из аналогов не смог защитить первичные кардиомиоциты - факт, который подтверждает, что 16-мер ΌΑΧΧρ имеет оптимальную длину и последовательность для самого сильного кардиопротекторного действия.

Фиг. 7. Сравнение ΌΑΧΧρ мыши/крысы с последовательностью ΌΑΧΧρ человека по антиапоптозной активности на клетках С2С12, первичных кардиомиоцитах и Н9с2. Последовательность ΌΑΧΧρ мыши, конъюгированного с Τаΐ (Τаΐ-т^ΑXXρ-δΕ^ ΙΌ N0: 61), которая идентична последовательности ΌΑΧΧρ крысы (см. фиг. 1В), сравнивали с конструкцией человека (ΤΗΐ-ΌΑΧΧρ) в отношении антиапоптозных свойств против δΤδ (набор Се11 Оеа1Н Де1есНоп ΕΕΙδΑ^|,υ'^δ фирмы КосНе О1адпокНск). Использовали клетки С2С12 и первичные кардиомиоциты мыши и клетки Н9с2 крысы. Во всех клетках наблюдалось усиление антиапоптозного действия при использовании последовательности ΤΗΐ-ιηΌΑΧΧρ мыши вследствие мышиного или крысиного типа клеток.

Фиг. 8. Определение ΡΑΌΌρ15 и его антиапоптозного действия на кардиомиоцитах. (А) Последовательность белка ΡΑΌΌ нарезали на перекрывающиеся комплекты пептидов (пепскан; 15-мерные пептиды со сдвигом в 3 аминокислоты) и анализированы методом ферментной блот-гибридизации. Черным

- 3 027336 прямоугольником выделены три наиболее ярких пятна, а соответствующие последовательности эпитопа, номера пятен и интенсивности сигнала (ВЬИ) приведены ниже. (В) Последовательность пептида ΡΑΌΌρ11 (=ΡΑΌΌρ15=δΕΟ ΙΌ N0: 9) последовательно урезали на один аминокислотный остаток с С-конца, Νконца или одновременно с С-конца и Ν-конца и анализировали методом ферментной блот-гибридизации. Пятна, указанные стрелками, проявляли самые высокие интенсивности сигнала (ВЬИ). Самый короткий эпитоп ΕΑΌΌ (9-мер с последовательностью КРКЬЕРУОЗ (=РАЭЭр=8Е0 ГО N0: 12)) соответствовал пятну № 24. Условия инкубации: Ηίκ-теговый внутриклеточный участок рецептора Рак [10 мкг/мл]; антитела: анти-Н1к-(мышь) (§1§та Η1029, 1:6000)/против мыши с НРР (Са1Ъюсйет 401207, 1:2000), время обработки: 1 мин.

Фиг. 9. Сравнение конструкций ΡΑΟΟρ с Та1-ЭАХХр в отношении антиапоптозной активности на первичных кардиомиоцитах и на клетках Н9с2. Количественная оценка фрагментации ДНК на первичных кардиомиоцитах (А) и клетках Н9с2 (В). Данные нормировали к 100% ЗТЗ. Данные представляют средние значения ±ЗЕМ при п>5. Клетки высеивали в 24-луночные планшеты и культивировали в течение ночи. На следующий день клетки инкубировали с ЗТЗ отдельно или с ЗТЗ+1 мкМ пептида (в ΟρΐίМЕМ) (концентрация ЗТЗ приведена на рисунке, а время инкубации приведены на фиг. 5). После этого растворы удаляли, заменяли их полной средой и инкубировали еще 40 ч. После фазы регенерации клетки подвергали лизису и определяли фрагментацию ДНК согласно инструкциям производителя (набор для определения гибели клеток Се11 Эеа1й беЮсОоп Ε^IЗΑ^{Р^υз} фирмы Росйе Эхадпокйск). Короткая последовательность Таΐ-РΑ^^ρ оказалась менее эффективной, чем Таΐ-^ΑXXρ, но более длинная Таΐ-РΑ^^ρ 15 обладала равным (на Н9с2) или более сильным антиапоптозным действием (на первичных кардиомиоцитах).

Фиг. 10. Сравнение Таΐ-^ΑXXρ и Таΐ-РΑ^^ρ 15 одних или в комбинации на первичных кардиомиоцитах и клетках Н9с2. Инкубация с 0,5 мкМ Таΐ-^ΑXXρ вместе с 0,5 мкМ Таΐ-РΑ^^ρ 15, как оказалось, дает такой же или даже больший антиапоптозный эффект по сравнению с одним только пептидом при 1 мкМ. Кроме того, инкубация с обоими пептидами при 1 мкМ давала наибольшую защиту при обоих типах клеток, свидетельствуя о том, что комбинация Таΐ-^ΑXXρ и Таΐ-РΑ^^ρ 15 может оказаться перспективной для применения.

Фиг. 11. Методика экспериментов ίη νίνο. Мышей С57В16 подвергали хирургической операции ишемии миокарда с реперфузией (ΙΡ). Черной рамкой представлена продолжительность ишемии, которой подвергались мыши. По окончании операции для каждой методики проводили измерения размера инфаркта или гибели клеток (указано 1). ΙΡ^: 40 мин ишемии, 60 мин реперфузии. ΙΡ₂._4|: 40 мин ишемии и 24 ч реперфузии.

Фиг. 12. Кардиопротекторные эффекты Таΐ-^ΑXXρ (1 мг/кг в/в) на мышах, подвергавшихся ΙΡ^. Определяли размер инфаркта (в % от зоны риска ΑΡ) и измеряли фрагментацию межнуклеосомной ДНК методом ΕΕΚΑ у мышей, подвергавшихся ΙΡ^ и обработанных Та1. Таΐ-^ΑXXρ или Таΐ-8С^^ΑXXρ (1 мг/кг), а также ΌΑΧΧρ (10 мг/кг) (внутривенное введение (в/в) за 5 мин до реперфузии). Представлены средние значения±ЗЕМ для:(А) площади зоны риска ΑΡ/массы ЬУ (левого желудочка), (В) размера инфаркта (в % от площади зоны риска ΑΡ) и (С) отношения Ι/ΝΙ, соответствующего соотношению растворимых нуклеосом в ишемической части относительно неишемической части тканей ЬУ. Статистический анализ проводили односторонним методом ΑΝΟνΑ с посткритерием №итап-Кеи18 для множественных сравнений (программа ΟπιρΙιΡαά Рпкт). Значения Р<0,05, Р<0,01 и Р<0,001 по сравнению с Таΐ-^ΑΧΧρ отмечены как *, ** и *** соответственно. Р=пк (не значимо, н.з.) для Р>0,05.

Фиг. 13. Доза-эффект для Таΐ-^ΑΧΧρ и ΌΑΧΧρ на мышах, подвергавшихся ΙΡ₆₀·. Определяли размер инфаркта (в % от зоны риска ΑΡ) и измеряли фрагментацию межнуклеосомной ДНК методом ΕΕΚΑ у мышей, подвергавшихся ΙΡ₆₀· и обработанных Та1 (1 мг/кг), Таΐ-^ΑΧΧρ (0,1, 1 и 10 мг/кг) или ΌΑΧΧρ (0,1, 1 и 10 мг/кг) при внутривенном введении за 5 мин до реперфузии. Представлены средние значения±ЗЕМ для: (А) площади зоны риска ΑΡ/массы ЬУ (левого желудочка), (В) размера инфаркта (в % от площади зоны риска ΑΡ) и (С) отношения Ι/ΝΙ, соответствующего соотношению растворимых нуклеосом в ишемической части относительно неишемической части тканей ЬУ.

Фиг. 14. Кардиопротекторные эффекты Таΐ-^ΑΧΧρ (1 мг/кг в/в) на мышах, подвергавшихся ΙΡ₂₄^. Определяли размер инфаркта (в % от зоны риска ΑΡ) и измеряли фрагментацию межнуклеосомной ДНК методом ΞΕ^Α у мышей, подвергавшихся ΙΡ₂₄^ и обработанных Так Таΐ-^ΑΧΧρ или Таΐ-8С^^ΑΧΧρ (1 мг/кг), а также ΟΑΧΧρ (10 мг/кг) (в/в введение за 5 мин до реперфузии). Представлены средние значения±ЗЕМ для: (А) площади зоны риска ΑΡ/массы ЬУ (левого желудочка), (В) размера инфаркта (в % от площади зоны риска ΑΡ) и (С) отношения Ι/ΝΙ, соответствующего соотношению растворимых нуклеосом в ишемической части относительно неишемической части тканей ЬУ. Статистический анализ проводили односторонним методом ΑNΟУΑ с посткритерием №итап-Кеи18 для множественных сравнений (программа ΟπιρΙιΡαά Рпкт). Значения Р<0,05, Р<0,01 и Р<0,001 по сравнению с Таΐ-^ΑΧΧρ отмечены как *, ** и *** соответственно. Р=пк (не значимо, н.з.) для Р>0,05.

Фиг. 15. Доза-эффект для Таΐ-^ΑΧΧρ и ΟΑΧΧρ на мышах, подвергавшихся ΙΡ_24Η. Измеряли площадь зоны риска и размер инфаркта (в % от зоны риска ΑΡ) у мышей, подвергавшихся ΙΡ₂₄^ и обрабо- 4 027336 танных Та( (1 мг/кг), Та1-ЭАХХр (0,1, 1 и 10 мг/кг) или ЭАХХр (0,1, 1 и 10 мг/кг) при внутривенном введении за 5 мин до реперфузии. Представлены средние значения±§ЕМ для: (А) площади зоны риска АК/массы ЬУ (левого желудочка), (В) размера инфаркта (в % от площади зоны риска АК).

Фиг. 16. Визуализация конструкций ТаСОАХХр в миокарде. Мышам во время реперфузии вводили 1 мг/кг конструкции СР-Та1-ЭАХХр (СЕ - карбоксифлуоресцеин). Через 2 ч после фиксации параформальдегидом (4% РЕА в фосфатном буфере) делали срезы ЬУ (20 мкм) на вибратоме. На конфокальных снимках в 2 мкм четко видно зеленое окрашивание в миоцитах, что свидетельствует о присутствии пептидной конструкции в цитозоле. Кружочками выделено присутствие пептидной конструкции в ЭАР1положительном ядре, как это наблюдалось в нескольких случаях (масляная иммерсия, х40).

Фиг. 17. Предварительные данные о повреждении от холодовой ишемии/реперфузии при трансплантации почек. Смерть мозга и длительная холодовая ишемия являются главными причинами неблагоприятного долгосрочного исхода при трансплантации почек от умерших доноров, причем этот эффект еще больше усиливается при использовании растянутых критериев для доноров (маргинальные органы). Воздействие на воспаление трансплантатов при вызванном ишемией-реперфузией (ΙΚ) повреждении является привлекательной концепцией для улучшения исхода у таких трансплантатов. (А) Последовательность операций холодовой ишемии/реперфузии при трансплантации почек у крыс. После 24часовой холодовой ишемии трансплантаты почек пересаживали ортотопически самцам-реципиентам ЬЕ^ с использованием стандартных методов микрохирургии. Пептиды вводили сразу после реперфузии в виде одной в/в инъекции в дозе 1 мг/кг. Через три дня после трансплантации трансплантаты извлекали для анализа методом КТ-ПЦР (п=3). (В) Тотальный препарат РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК и проводили количественную КТ-ПЦР в реальном времени на установке СепеАтр 5700 Бесщепсе ЭеЮсОоп §у8(ет (АррйеД В1О8у8(ет8, ХУеПепЛаДк Германия). Реакции Тасрпап-ПЦР для 1САМ-1, ΙΕΝ-γ, ТНЕ-α, интерлейкина (1Ь)-6 и Ьс1-2 (синтезирован на фирме Ме(аЬюп, МагйпкгюД, Германия) проводили в конечном объеме 25 мкл. Эти предварительные данные свидетельствуют, что в присутствии Та1ЭАХХр происходит снижение экспрессии мРНК ΙΕΝ-γ и 1САМ-1 в трансплантатах почек через 3 дня после трансплантации.

Определения.

По всему описанию используются некоторые термины, которые определены в следующих параграфах.

Термины белок, полипептид и пептид в настоящем изобретении используются взаимозаменяемым образом и относятся к аминокислотным последовательностям различной длины, либо в нейтральной форме (незаряженные), либо в виде солей, а также либо немодифицированные, либо модифицированные посредством гликозилирования, окисления боковых цепей или форфорилирования. В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность представлена полноразмерным нативным белком. Однако в предпочтительных воплощениях аминокислотная последовательность представлена фрагментом полноразмерного белка. В других воплощениях аминокислотная последовательность модифицирована дополнительными заместителями, присоединенными к боковым цепям аминокислот, такими как гликозильные звенья, липиды или такие неорганические ионы, как фосфаты, а также модификации, связанные с химическим преобразованием цепей, как-то окислением сульфгидрильных групп. Таким образом, термин белок (или эквивалентные ему термины) охватывает аминокислотные последовательности полноразмерного нативного белка или его фрагмента, при условии, что эти модификации существенно не изменяют его специфические свойства. В частности, термин белок охватывает изоформы белка, т.е. варианты, которые кодируются одним и тем же геном, но различаются по значениям р1 или м.в. или того и другого. Такие изоформы могут отличаться по аминокислотной последовательности (например, в результате альтернативного сплайсинга или ограниченного протеолиза) или же могут возникать при дифференциальной посттрансляционной модификации (например, гликозилировании, ацилировании, фосфорилировании).

Термин аналог в применении к белку или полипептиду означает такой пептид, который обладает сходной или идентичной функцией, что и белок или полипептид, но необязательно имеет аминокислотную последовательность, сходную или идентичную аминокислотной последовательности белка или полипептида, либо структуру, сходную или идентичную таковой у белка или полипептида. Предпочтительно в контексте настоящего изобретения аналог имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% идентична аминокислотной последовательности белка или полипептида. В некоторых предпочтительных воплощениях аналог белка имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности белка.

Термин фрагмент в применении к белку или полипептиду означает такой пептид, который имеет аминокислотную последовательность из не менее 5 последовательных аминокислотных остатков и не более 30 последовательных аминокислотных остатков белка или полипептида, к примеру из 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 последовательных аминокислотных остатков

- 5 027336 белка или полипептида, предпочтительно из 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 последовательных аминокислотных остатков белка или полипептида, более предпочтительно из 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 последовательных аминокислотных остатков белка или полипептида. В контексте настоящего изобретения фрагмент белка или полипептида сохраняет функциональную активность полноразмерного белка или полипептида.

Термин гомологичный (или гомологичность) в настоящем изобретении является синонимом термину идентичность и означает сходство последовательности между двумя полипептидными молекулами. Если какое-то положение в обеих сравниваемых последовательностях занимает один и тот же аминокислотный остаток, то соответствующие молекулы являются гомологичными по этому положению. В настоящем изобретении степень идентичности последовательностей означает сравнение между аминокислотными последовательностями и определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, при этом часть аминокислотной последовательности в окне сравнения может содержать вставки или делеции (т.е. пробелы) в сравнении с контрольной последовательностью (не содержащей вставок или делеций) для оптимально выравнивания двух последовательностей. Степень можно рассчитать путем определения числа положений, по которым в обеих последовательностях находятся идентичные аминокислотные остатки, получая число совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100, получая степень идентичности последовательностей в процентах. С другой стороны, степень можно рассчитать путем определения числа положений, по которым в обеих последовательностях либо находятся идентичные аминокислотные остатки, либо аминокислотные остатки совмещаются с пробелами, получая число совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100, получая степень идентичности последовательностей в процентах. Специалистам должно быть известно, что существует много установленных алгоритмов для выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для их сравнения может проводиться, например, с помощью алгоритма локальной гомологии §тйй апй \7а1сгтап. 1981, Αάν. Αρρί. Ма!й. 2: 482, с помощью алгоритма выравнивания по гомологии №с41стап αηά ^ипксй, 1970, 1. Μοί. Βίοί. 48:443, методом поиска сходства Реагкоп αηά Ыртап, 1988, Ргос. ЫаЙ. Асай. 8с1. И8А 85:2444, используя компьютерные реализации этих алгоритмов (ОАР, ΒΕδΤΡΙΤ, ΡΑδΤΑ и ΤΡΑδΤΑ в пакете программного обеспечения ОСО ЛАсопкт 5>оП\уаге Раскаде), либо путем визуального осмотра (вообще см. Ситгеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Ρ. М. ΑикиЪеί е! а1., ейк., Сиггеп! Рго!осо1к, а )опИ νеη!и^е Ъе1\\ееп Огеепе РиЪйкЬшд Αккοс^а!ек, 1пс. апй 1оЬп \7Пеу & §оп8, 1пс. (1995 8ирр1етеп1) (ΑикиЪеί)). Примерами алгоритмов, подходящих для определения степени идентичности последовательностей, являются алгоритмы ΒΕΑδΤ и ΒΕΑδΤ 2.0, которые описаны в Α1ΐ^1ιιι1 е! а1., 1990, 1. Мо1. Β^ί 215: 403-410; и ΑΚκοΜ е! а1., 1977, Ыис1е1с Ααάκ Кек. 3389-3402 соответственно.

Гомологичные аминокислотные последовательности имеют идентичные или сходные аминокислотные последовательности. В контексте настоящего изобретения сходные остатки представляет собой консервативные замены или разрешенные точечные мутации соответствующих аминокислотных остатков в контрольной последовательности. Консервативные замены остатков в контрольной последовательности являются такими заменами, которые физически или функционально сходны с соответствующим контрольным остатком, например имеют сходный размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность к образованию ковалентных или водородных связей, и т.п. Особенно предпочтительны такие консервативные замены, которые соответствуют критериям, установленным для разрешенных точечных мутаций в ОаукоГГ е! а1. (Αΐ1πκ оГ Рто!еш §ециепсе апй 81гис!иге, 1978, ΝπΙ. ΒΟο^ά. Кек. Роипйайоп, ^акЫпд!оп, ОС, 8ирр1. 3, 22: 354-352).

В контексте настоящего изобретения термин лечение применяется для характеристики способа, который предназначается для замедления или предупреждения возникновения заболевания, замедления или прекращения прогрессирования, обострения или ухудшения симптомов заболевания, для ослабления симптомов заболевания и/или излечения заболевания. Лечение может проводиться до возникновения заболевания для профилактического или предупреждающего действия. С другой стороны, оно может проводиться после возникновения заболевания для терапевтического действия.

Термин субъект в настоящем изобретении относится к людям или животным, в частности млекопитающим (например, приматам, собакам, кошкам, козам, лошадям, свиньям, мышам, крысам, кроликам и др.), которые могут быть поражены заболеванием, связанным с апоптозом, но могут и не страдать этим заболеванием. Во многих воплощениях настоящего изобретения субъектом является человек. В таких воплощениях субъект часто именуется индивидом. Термин индивид не означает какой-то конкретный возраст, поэтому он охватывает детей, подростков и взрослых.

Фармацевтическая композиция определяется здесь как содержащая эффективное количество пептида по изобретению и по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого носителя или наполнителя.

Термин эффективное количество в настоящем изобретении относится к такому количеству пептида, соединения, средства или композиции, которое достаточно для выполнения своего прямого назначения, например, требуемого биологического ответа в клетках, ткани, системе или у субъекта. Например, в

- 6 027336 некоторых воплощениях настоящего изобретения назначением может быть: ингибирование, предотвращение или уменьшение апоптоза, такого, к примеру, как апоптоз, связанный с реперфузионным повреждением или трансплантацией органа; и/или предотвращение или лечение заболеваний, связанных с апоптозом.

Термин фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель относится к такой среде носителя, которая не влияет на эффективность биологической активности активного ингредиента и практически не токсична для организма в той концентрации, при которой она вводится. Термин охватывает растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и вещества, замедляющие всасывание, и др. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных субстанций хорошо известно в данной области (напр, см. РепипдЮп'к Рйагшасеипса1 Зшеисек, Е.^. Майи, 18Πι ЕТ. 1990, Маек РиЬйкйид Со.: ЕакЮп РА, который включен сюда путем ссылки во всей полноте).

Раскрытие сущности изобретения

Как указано выше, настоящее изобретение имеет отношение к пептидам с антиапоптозными свойствами, которые применимы в качестве терапевтических средств при лечении и/или профилактике большого числа заболеваний, связанных с апоптозом.

Пептиды, ингибирующие апоптоз клеток.

Пептиды по изобретению включают фрагменты ЭАХХ и фрагменты ΡΑΌΌ, которые проявляют антиапоптозную активность.

Термины ЭАХХ и белок ЭАХХ применяются здесь взаимозаменяемым образом. Они относятся к белку, который называется связанный со смертью белок 6 и у человека кодируется геном ЭАХХ (КеГЗец (шКЛА): ΝΜ_001141969.1), локализованным в положении 21.3 короткого плеча (р) хромосомы 6. В предпочтительных воплощениях ЭАХХ имеет аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕО ГО N0: 1. Однако белок ЭАХХ может быть представлен изоформой белка ЭАХХ по ЗЕЦ ГО N0: 1, поэтому он может иметь любую аминокислотную последовательность, кодируемую геном ЭАХХ человека.

Термины ΡΑΌΌ и белок ΡΑΌΌ применяются здесь взаимозаменяемым образом. Они относятся к белку, который называется связанный с Рак белок с доменом смерти, который у человека кодируется геном РАЭЭ (РеГЗес.] (ιηΡ,ΝΑ): ΝΜ_003824.3), локализованным в положении 13.3 длинного плеча (ц) хромосомы 11. В предпочтительных воплощениях РАЭЭ имеет аминокислотную последовательность, приведенную в 8Е0 ГО N0: 8. Однако белок РАЭЭ может быть представлен изоформой белка РАЭЭ по 8Е0 ГО N0: 8, поэтому он может иметь любую аминокислотную последовательность, кодируемую геном РАЭЭ человека.

Авторы изобретения показали, что пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, приведенной в 8ЕО ГО N0: 5 (ЭАХХр), 8ЕО ГО N0: 6 (ЭАХХр-14) или 8ЕО ГО N0: 2 (ЭАХХр15='ГОАХХр-211), которые все являются фрагментами белка ЭАХХ (8ЕЦ ГО N0:1), взаимодействуют с рецептором Рак, но только ЭАХХр способен уменьшить клеточный апоптоз. Точно так же авторы изобретения обнаружили, что пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 9 (РАЭЭр15) и 8Е0 ГО N0: 12 (РАЭЭр), которые оба являются фрагментами белка РАЭЭ (8Е0 ГО N0: 8), взаимодействуют с рецептором Рак и уменьшают клеточный апоптоз.

Итак в одном предпочтительном воплощении антиапоптозный пептид по изобретению представлен фрагментом ЭАХХ из 16 последовательных аминокислотных остатков, входящих в 8Е0 ГО N0: 5. В другом предпочтительном воплощении антиапоптозный пептид по изобретению представлен фрагментом ЭАХХ, состоящим из 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 последовательных аминокислотных остатков, входящих в аминокислотную последовательность, приведенную в 8Е0 ГО N0: 5. Предпочтительно такой антиапоптозный пептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

- 7 027336

8ЕО ГО N0: 17 (ΚΚ3ΚΚΕΚΚ0ΤΟ8ΟΡΕΟΝ),

ЗЕО Ю N0: 18 (ΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΕΟΝδ),

ЗЕО ГО N0: 19 (ΚΚδΚΚΕΚΚΟΤϋδΟΡΕϋΝδΥ), δΕΟ ГО N0: 20 (ΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΕΟΝδΥν),

8Ε0 ГО N0: 21 (СККЗККЕККОТОЗОРЬО),

ЗЕО ГО N0: 22 (РСККЗККЕККОТОЗОРЬО),

ЗЕО ГО N0: 23 (РРСККЗККЕККОТОЗОРЬО),

ЗЕО ГО N0: 24 (ОРРСККЗККЕККОТОЗСРРЕО),

ЗЕО ГО N0: 25 (8СРРСКК8ККЕКК0ТС8ОРШ),

ЗЕО ГО N0: 26 (ΟΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΕΟΝ),

ЗЕО ГО N0: 27 (ΟΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΕΟΝδ),

ЗЕО ГО N0: 28 (СККЗККЕККОТОЗОРЬОИЗУ),

ЗЕО ГО N0: 29 (0ΚΚ3ΚΚΕΚΚ0ΤΟ8ΟΡΙΌΝ8Υν),

ЗЕО ГО N0:30 (РСККЗККЕКК0ТОЗОРЬ(Ж),

ЗЕО ГО N0: 31 (ΡΟΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΕΟΝδ),

ЗЕО ГО N0: 32 (РСККЗККЕКК0ТСЗОРЬ(ЖЗУ),

ЗЕО ГО N0: 33 (ΡΟΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΕΟΝδΥν), δΕΟ Ю N0: 34 (ΡΡΟΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΕΟΝ), δΕΟ ГО N0: 3 5 (ΡΡΟΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΕΟΝδ), δΕΟ ГО N0: 36 (ΡΡΟΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΕΟΝδΥ), δΕΟ ГО N0:37 (РРСККЗККЕККОТОЗОРЬОИЗУУ),

8Ε0 ГО N0: 38 (ОРРСККЗККЕККОТОЗОРЬОЩ, δΕΟ ГО N0: 39 (ΟΡΡΟΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΕΟΝδ), δΕΟ ΙΟ N0: 40 (ΟΡΡΟΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΕΟΝδΥ), δΕΟ ΙΟ N0: 41 (ΟΡΡΟΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΕΟΝδΥν), δΕΟ ГО N0: 42 (δΟΡΡΟΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΕΟΝ), δΕΟ ГО N0: 43 (δΟΡΡΟΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΙ,ΟΝδ), и δΕΟ ГО N0: 44 (3ΟΡΡΟΚΚ3ΚΚΕΚΚ0ΤΟδΟΡΕΟΝ3Υ).

В одном предпочтительном воплощении антиапоптозный пептид по изобретению представлен фрагментом ΡΆΌΌ из 9 последовательных аминокислотных остатков, входящих в ЗЕр ГО N0: 12. В другом предпочтительном воплощении антиапоптозный пептид по изобретению представлен фрагментом ΡΆΌΌ из 15 последовательных аминокислотных остатков, входящих в ЗЕр ГО N0: 9. В следующих предпочтительных воплощениях антиапоптозный пептид по изобретению представлен фрагментом ΡΆΌΌ из 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 последовательных аминокислотных остатков, входящих в ЗЕр ГО N0: 12. Предпочтительно такой антиапоптозный пептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

ЗЕО ГО N0: 45	(КККЬЕКУОЗО),
8Е0 ГО N0: 46	(КККЬЕКУОЗОЬ),
δΕΟ ГО N0: 47	(КККЬЕКУОЗОЕО),
8Е0 ГО ΝΟ: 48	(КККЬЕКУОЗОЕОЬ),
ЗЕО ГО N0: 49	(ККККЬЕКУОЗ),
δΕΟ ΙΟ ΝΟ: 50	КККККЪЕКУОЗ),
ЗЕО ГО N0:51	(ОКККЬЕКУОЗО),
ЗЕО Ю N0: 52	(ОКККЬЕКУОЗОЬ),
ЗЕО ГО N0: 53	(СКККРЕКУОЗСЕО),
δΕΟ ГО N0: 54	(ОКККЕЕКУОЗОЬОЬ),
8Е0 ГО N0: 55	(УОКККЬЕКУОЗО),
δΕΟ ГО ΝΟ: 56	(УОКККЬЕКУОЗОЬ), и
ЗЕО ГО N0: 57	(νθΚ1<ΚΕΕΙ<νθδΟΕϋ).

Как указано выше, в некоторых воплощениях белок ΌΆΧΧ представлен изоформой белка ΌΆΧΧ из ЗЕр ГО N0: 1. В таких воплощениях антиапоптозный белок по изобретению может быть представлен фрагментом ΌΆΧΧ из 16 последовательных аминокислотных остатков, соответствующих фрагменту ЗЕр ГО N0: 5 у белка ΌΆΧΧ из ЗЕр ГО N0: 1.

Точно так же, как указано выше, в некоторых воплощениях белок ΡΆΌΌ представлен изоформой белка ΡΆΌΌ из ЗЕр ГО N0: 8. В таких воплощениях антиапоптозный белок по изобретению может быть представлен фрагментом ΡΆΌΌ из 9 последовательных аминокислотных остатков, соответствующих фрагменту ЗЕр ГО N0: 12 у белка ΡΆΌΌ из ЗЕр ГО N0: 8; или же фрагментом ΡΆΌΌ из 15 последовательных аминокислотных остатков, соответствующих фрагменту ЗЕр ГО N0: 9 у белка ΡΆΌΌ из ЗЕр ГО N0: 8.

Изоформы ΌΆΧΧ и изоформы ΡΆΌΌ предпочтительно имеют аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более 99% идентична ЗЕр ГО N0: 1 и ЗЕр ГО N0: 8 соответственно, более предпочтительно по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или более 99% идентична ЗЕР ГО N0: 1 и ЗЕР ГО N0: 8 соответственно.

- 8 027336

Пептиды по изобретению, а также их производные и конъюгаты (см. ниже) способны ингибировать, предупреждать и/или уменьшать апоптоз клеток, в частности апоптоз кардиомиоцитов. Эту способность можно оценить любым подходящим методом, известным специалистам, как-то, к примеру, с помощью набора для выявления апоптоза клеток. Примером такого набора, подходящего для измерения апоптоза клеток, является Се11 Эеа1й ЭсЮсОоп ЕЬ1§А^РШ8® ΕίΙ (Са!. Νο. 11 774 425 001, Косйе Аррйеб 8с1еисе).

Производные пептидов по изобретению.

Изобретение также имеет отношение к биологически активным производным пептидов по изобретению. Под биологически активным производным подразумеваются любые производные пептидов изобретения, которые сохраняют способность пептидов ингибировать, предотвращать или уменьшать апоптоз клеток.

В некоторых воплощениях биологически активные производные имеют аминокислотную последовательность антиапоптозного пептида изобретения, которая была модифицирована химическим и/или биологическим путем.

Примерами производных являются пептиды по изобретению, у которых по меньшей мере один аминокислотный остаток пептида был заменен или подвергнут делеции, был введен по меньшей мере один дополнительный аминокислотный остаток в пептид, и/или по меньшей мере один аминокислотный остаток пептида был химически изменен или дериватизирован.

Предпочтительно биологически активные производные по изобретению содержат только одну или только две модификации аминокислотных остатков, выбранные из группы, состоящей из замен, вставок, делеций, изменений и/или дериватизаций. В некоторых предпочтительных воплощениях биологически активные производные содержат одну консервативную замену или две консервативные замены. В некоторых предпочтительных воплощениях производные фрагмента ΌΆΧΧ по изобретению содержат одну или две модификации, которые затрагивают аминокислотные остатки, не входящие в §ЕЦ ГО N0: 5 (т.е. они не содержатся в §ЕЦ ГО N0: 5); а производные фрагмента ΡΛΌΌ по изобретению содержат одну или две модификации, которые затрагивают аминокислотные остатки, не входящие в §ЕЦ ГО N0: 12 (т.е. они не содержатся в §ЕЦ ГО N0: 12).

Подходящие химически измененные или дериватизированные аминокислоты включают, к примеру, производные аминокислот природного происхождения, например 4-гидроксипролин вместо пролина, 5-гидроксилизин вместо лизина, гомосерин вместо серина, орнитин вместо лизина и др. Другие химически измененные или дериватизированные аминокислоты включают аминокислоты, присоединенные, например, к метке, такой как флуоресцеин, тетраметилродамин или цианиновый краситель Су5.5; либо аминокислотные остатки с одной или несколькими посттрансляционными модификациями, такими как ацетилирование, амидирование, формилирование, гидроксилирование, метилирование, фосфорилирование, сульфатирование, гликозилирование или липидирование. Так некоторые химические модификации, в частности Хконцевое глизилирование, как было показано, увеличивают стабильность пептидов в сыворотке человека (Ро^ей е! а1., Рйагта Ке8 1993:10:1268-1273). Химически измененные или дериватизированные аминокислоты также включают аминокислоты с повышенной мембранной проницаемостью посредством Хмиристоилирования (Вгапб е! а1., Ат 1 Рйукю1 Се11 Рйукю1 1996; 270:С1362-С1369).

Другими производными пептидов по изобретению являются пептидомиметики данных пептидов. Пептидомиметиками являются такие химические соединения, которые имеют практически такие же структурные и/или функциональные характеристики, что и пептиды по изобретению. Миметики могут полностью состоять из синтетических, не встречающихся в природе аналогов аминокислот, или могут быть химерными молекулами, содержащими одну или несколько природных аминокислот и один или несколько не встречающихся в природе аналогов аминокислот. Миметик может включать в себя любое число консервативных замен природных аминокислот, которые не нарушают активность миметика. Чтобы проверить, обладает ли миметик требуемой активностью, может использоваться обычное тестирование при помощи Теста А по изобретению. Выражение практически такой же в применении к миметику или пептидомиметику означает, что миметик или пептидомиметик обладает одной или несколькими активностями или функциями сравниваемой молекулы, в частности ингибирует клеточный апоптоз. Пептидомиметики разрабатываются стандартными методами. Например, пептидные связи можно заменить непептидными связями или не встречающимися в природе аминокислотами, позволяющими пептидомиметику принять аналогичную структуру, а тем самым и биологическую активность природного пептида. Могут проводиться и другие модификации путем замены химических групп аминокислот другими химическими группами сходной структуры. Разработке пептидомиметиков может способствовать определение третичной структуры исходного фрагмента/пептида, либо свободного, либо связанного с внутриклеточным участком рецептора Рак, методами ЯМР-спектроскопии, кристаллографии и/или компьютеризированного молекулярного моделирования. После идентификации вероятного соединенияпептидомиметка его можно синтезировать и определить его способность к ингибированию апоптоза клеток.

Пептидомиметики могут содержать любые комбинации не встречающихся в природе компонентов, которые, как правило, входят в три структурные группы: группу связей между остатками, отличающихся

- 9 027336 от естественной связи через амин (пептидной связи); не встречающихся в природе остатков вместо природных аминокислотных остатков; остатков, индуцирующих мимикрию вторичной структуры (например, конформации типа β-складки, γ-складки, β-листа, α-спирали); или другие изменения, придающие устойчивость к протеолизу. Например, лизиновые миметики могут быть получены при реакции с ангидридами янтарной или других карбоновых кислот. Миметики лизина и других содержащих αаминогруппу остатков также могут быть получены при реакции с такими имидоэфирами, как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксальхлорборгидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, Ометилизомочевина, 2,4-пентандион и при реакциях с глиоксилатом, катализируемых трансамидазой.

Также можно заменить один или несколько остатков аминокислотой (или остаткомпептидомиметиком) противоположной хиральности. Так, любая аминокислота, которая встречается в природе в Ь-конфигурации (которая также может относиться к К или δ в зависимости от структуры химической молекулы), может быть заменена такой же аминокислотой или миметиком, но противоположной хиральности, которая именуется Ό-аминокислотой, но также может именоваться К- или δ-формой.

Как должно быть известно специалистам, пептидомиметики настоящего изобретения также могут включать одну или несколько модификаций, описанных здесь для химически измененных или дериватизированных аминокислот, например, метки либо одну или несколько посттрансляционных модификаций.

Пептиды, производные и пептидомиметики можно получать и выделять любыми методами, известными в данной области. Пептиды можно синтезировать, полностью или частично, используя обычные химические методы. Методы получения библиотек пептидов и пептидомиметиков хорошо известны и включают, к примеру, мультипиновые методы, методы чайного пакетика, методы типа расщепить, соединить и смешать и δΡΟΤ-синтеза.

Конъюгаты.

Изобретение также имеет отношение к конъюгатам, содержащим пептиды изобретения или их производные, соединенные с проникающим в клетки пептидом или СРР.

Так, для облегчения захвата пептидов по изобретению или их производных через клеточные мембраны, такие как плазматическая мембрана или мембрана клетки, авторы изобретения показали, что очень полезно конъюгировать эти пептиды или их производные с проникающими в клетку пептидами (СРР§). СРР§ являются хорошо известными пептидами, которые можно конъюгировать с нагрузками, чтобы облегчить их транспорт через мембраны. Например, СРР§ хорошо описаны в ЬеЫеи В. е! а1., Αάуаиеей 1)гад Иейуегу Кеу1е^§ 60 (2008) 517-529; и в δαΐά И১аие Т. е! а1., Се11. Мо1. ЫРе δοϊ. (2010) 67:715-726. Для улучшения цитоплазматической доставки фрагментов или их производных по изобретению можно использовать любые СРР.

Примеры СРР§, которые можно конъюгировать с фрагментами ΌΆΧΧ или ΡΆΌΌ либо их производными по изобретению, включают, без ограничения

Название	Последовательность
Та1	ОКККККЧКККРРО
кхк	кхккхккхдкхк
Врер	кхкквкюжквкхв
Ρϊρ2Β	ЕХККХКЕХК1Н1ЬРр№КМКтаК

где X - аминогексил, β - аланил, η - аминобензоил, изонипекотил или 4-аминобутирил, В - β-аланин, строчная буква - Ό-аминокислота (Ό-аминокислоты могут быть заменены Р-аминокислотами).

Как правило, СРР содержит две или несколько катионных аминокислот с гидрофобными аминокислотами или спейсерными группами, разделяющими некоторые катионные аминокислоты. Например, катионная аминокислота - аргинин (К). Как правило, СРР обычно содержит по меньшей мере 3 или 4 остатка аргинина. В некоторых воплощениях СРР содержит 5, 6 или больше остатков аргинина.

Как правило, СРР соединяется с Ν-концом или С-концом пептида или его производного по изобретению, предпочтительно с С-концом. Химическое соединение может осуществляться через любую химическую связь, как-то, к примеру, дисульфидную связь, тиоэфирную или тиол-малеимидную связь.

В предпочтительном воплощении пептид или его производное по изобретению соединяется с СРР через линкер. Можно использовать любой тип линкера при условии, что данный линкер также позволяет установить химическую связь пептида или его производного с СРР. Возможны различные линкеры, включая аминокислотные последовательности с остатком цистеина на С-конце, позволяющим образование дисульфидной, тиоэфирной или тиол-малеимидной связи. Другие способы соединения пептида или его производного по изобретению с СРР включают использование С-концевого альдегида с образованием оксима. В других линкерах применяется химия СНск.

Примеры подходящих линкеров включают, без ограничения, аминокислоты или последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из С, ВС, ХС, ОС, ВВСС, ВХСС, ХВС, X, XX, В, ВВ, ВХ и ХВ, где Χ - аминогексил, β - аланил, η - аминобензоил, изонипекотил или 4-аминобутирил, В - βаланин.

Применение.

- 10 027336

Изобретение также имеет отношение к пептидам, их производным и их конъюгатам, как описано здесь, для применения в способах лечения человека или животных и к соответствующим способам лечения. В частности, изобретение касается пептидов, их производных и их конъюгатов, как описано здесь, для применения в способах лечения заболеваний, связанных с апоптозом клеток, и/или способах ингибирования апоптоза клеток у человека или животных. Изобретением также предусмотрены способы лечения заболеваний, связанных с апоптозом клеток, и/или ингибирования апоптоза клеток у нуждающегося в этом субъекта, причем способы включают стадию введения субъекту эффективного количества пептида по изобретению, его производного и/или его конъюгата. В некоторых воплощениях субъекту вводится по меньшей мере один антиапоптозный пептид ΌΑΧΧ по изобретению и по меньшей мере один антиапоптозный пептид ΡΆΌΌ по изобретению.

Термин заболевание, связанное с апоптозом клеток в настоящем изобретении относится к любым заболеваниям или клиническим состояниям, которые вызваны, приводят к или включают апоптоз клеток. В некоторых воплощениях заболевание связано с опосредованным Рак-рецептором апоптозом клеток. Термин заболевание или клиническое состояние, связанное с апоптозом клеток также охватывает любые медицинские процедуры, которые вызывают, приводят к или индуцируют апоптоз клеток и которые выполняются в связи с наличием заболевания или клинического состояния у субъекта.

Таким образом, пептиды, их производные и их конъюгаты, а также способы лечения по настоящему изобретению могут применяться для лечения острого инфаркта миокарда (ΑΜΙ), церебрального инфаркта или острого нарушения кровообращения кровообращения (состояния шока) у человека или животных, в особенности для ингибирования или уменьшения апоптоза клеток, связанного с этими заболеваниями. Пептиды, их производные и их конъюгаты, а также способы лечения по настоящему изобретению также могут применяться для лечения субъектов, подвергающихся трансплантации органов (например, трансплантации печени, сердца, почек, островков и кишечника), при операциях на сердце (реперфузионной терапии, экстракорпоральном кровообращении, например при сердечно-легочном шунтировании и временной окклюзии сосудов), в частности для ингибирования или уменьшения апоптоза клеток, вызванного этими медицинскими процедурами.

Пептиды, их производные и их конъюгаты и способы лечения по настоящему изобретению могут применяться для лечения ишемии, как-то сердечной ишемии, ишемии почек, ишемического колита, брыжеечной ишемии, ишемии головного мозга, ишемии конечностей или ишемии кожи у человека или животных, в частности для ингибирования или уменьшения апоптоза клеток, связанного с ишемией.

Пептиды, их производные и их конъюгаты и способы лечения по настоящему изобретению могут применяться для субъектов, подвергающихся или подвергавшихся реперфузии, в частности для ингибирования или уменьшения апоптоза клеток, связанного с реперфузионным повреждением.

Все пептиды, их производные и их конъюгаты по настоящему изобретению можно вводить до и во время ишемии, до, одновременно с или после реперфузии.

Было показано, что опосредованный Рак-рецептором апоптоз задействован при заболеваниях печени у человека, включая вирусный гепатит, болезнь Вилсона, алкогольный гепатит, холестатическая болезнь печени, и при аутоиммунных заболеваниях (например, см. обзор в Ейтеиксйетеибег е! а1., Αάν. Ехр. Меб. ΒίοΙ., 2009, 647: 64-93). Таким образом, пептиды, их производные и их конъюгаты и способы лечения по настоящему изобретению также могут применяться и для лечения этих заболеваний.

В способах лечения по настоящему изобретению пептиды, их производные или их конъюгаты можно комбинировать с другими терапевтическими средствами, в частности средствами, применяемыми при лечении апоптоза, ишемии и/или реперфузионного повреждения. В частности, большой интерес представляет комбинированное лечение средствами, направленными на собственный путь апоптоза, т.е. митохондриальный путь.

Так, в родственном аспекте настоящим изобретением предусмотрены пептиды, их производные или их конъюгаты в комбинации с другими терапевтическими средствами, в частности средствами, используемыми при лечении апоптоза, ишемии и/или реперфузионного повреждения, для применения в способах лечения по изобретению. В одном воплощении способы лечения по изобретению также включают стадию введения человеку или животным циклоспорина А и/или пептида ВН4. В самом деле было показано, что циклоспорин А ингибирует открывание митохондриального РТР и уменьшает размер инфаркта как у пациентов, так и у животных на моделях ΑΜΙ (Соте/ е! а1., Сагбюздкс Кек. 2009, 83(2):226-33; Ρίοΐ е! а1., N Еи§1 1 Меб. 2008, 359(5):473-81; МемЮи е! а1., 1 Ат Со11 Сатбю1. 2010, 55(12): 1200-5). ΒΗ4, происходящий из антиапоптозного белка Вс1-х1, как сообщалось, эффективно уменьшает апоптоз при ишемии-реперфузии при введении в виде конъюгата с белком Та! во время реперфузии (Оио е! а1., Еиг 1 Сагбю!йотас 8ит§. 2005, 27(1): 117-121; Όοηηίηί е! а1., Се11 Сус1е 2009, 8(8):1271-1278; ВоЦдиегш е! а1., 1. Сои!го1 Ке1еаке, 2011, бог 10.1016^.асоиге1.2011.07.037).

В способах лечения по изобретению все соединения (пептиды, производные, конъюгаты, комбинированные продукты) можно вводить любым из целого ряда подходящих способов, включая, без ограничения, внутривенно, парентерально, интраартериально, внутримышечно, перорально или интраназально. Введение пептида по изобретению, его производного или его конъюгата должно осуществляться при такой дозировке, чтобы вводимое количество было эффективным по назначению. Способ введения, ком- 11 027336 позиция (см. ниже) и вводимые дозы зависят от требуемого терапевтического эффекта, тяжести подлежащего лечению заболевания, если таковое уже имеется, наличия любой инфекции, возраста, пола, веса и общего состояния здоровья пациента, а также от силы действия, биодоступности и периода полужизни ίη νίνο используемого пептида, производного или конъюгата, использования (или нет) сопутствующей терапии и других клинических факторов. Эти факторы легко определяются лечащим врачом по ходу лечения.

Лечение по настоящему изобретению может состоять из однократной дозы или многократных доз. Так, введение пептида, его производного или его конъюгата может быть постоянным в течение определенного времени или периодическим через определенные промежутки времени, например, ежечасно, ежедневно, еженедельно (или через другие промежутки в несколько дней) и т.д. С другой стороны, введение может быть непрерывным в течение какого-то времени, например, внутривенно.

Фармацевтические композиции.

Как указано выше, пептиды изобретения, их производные либо их конъюгаты могут вводиться сами по себе или в виде фармацевтической композиции. Соответственно настоящим изобретением предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество по меньшей мере одного антиапоптозного пептида изобретения (либо его производного или его конъюгата) и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых воплощениях композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно дополнительное биологически активное средство. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один антиапоптозный пептид ΌΆΧΧ по изобретению и по меньшей мере один антиапоптозный пептид ΡΆΌΌ по изобретению.

Фармацевтическая композиция по изобретению может вводиться в любом количестве и любым способом введения, эффективным для получения требуемого профилактического и/или терапевтического эффекта. Оптимальный фармацевтический состав может варьироваться в зависимости от способа введения и требуемой дозы. Такие составы могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ίη νίνο и скорость выведения ίη νίνο вводимого активного ингредиента.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть составлены в стандартной дозовой форме для легкости введения и однородности дозы. Выражение стандартная дозовая форма в настоящем изобретении обозначает физически дискретную единицу из по меньшей мере одного пептида изобретения (или по меньшей мере одного его производного или его конъюгата) и по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого носителя или наполнителя. Однако следует иметь в виду, что общая суточная доза композиции должна определяться лечащим врачом в рамках здравого медицинского суждения.

Лекарственные формы.

Препараты для инъекций, к примеру стерильные водные или масляные суспензии для инъекций, могут быть составлены по известным в данной области правилам с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих веществ и суспендирующих веществ. Стерильные препараты для инъекций также могут представлять собой стерильные растворы для инъекций, суспензии или эмульсии в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, к примеру, в виде раствора в 2,3бутандиоле. В число приемлемых носителей и растворителей, которые можно использовать, входят вода, раствор Рингера по И.8.Р. и изотонический раствор хлористого натрия. Кроме того, обычно используются стерильные нелетучие масла в виде раствора или суспендирующей среды. Для этой цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- и диглицериды. Также при получении составов для инъекций можно использовать такие жирные кислоты, как олеиновая кислота. Стерильные жидкие носители применимы в композициях типа стерильных жидких форм для парентерального введения.

Формы для инъекций можно стерилизировать, к примеру, фильтрованием через задерживающий бактерии фильтр или включением стерилизующих средств в форме стерильных твердых композиций, которые можно растворить или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной среде для инъекций перед использованием. Жидкие фармацевтические композиции, представляющие собой стерильные растворы или суспензии, можно вводить, к примеру, посредством внутривенной, внутримышечной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции. Инъекции можно делать за один раз или путем постепенного вливания. Там, где это необходимо или желательно, композиция может включать местный анестетик для облегчения боли в месте инъекции.

Для продления эффекта активного ингредиента зачастую требуется замедлить всасывание ингредиента при подкожной или внутримышечной инъекции. Замедление всасывания вводимого парентерально активного ингредиента может осуществляться путем растворения или суспендирования ингредиента в масляном носителе. Депо-формы для инъекций получают путем формирования микроинкапсулированного матрикса активного ингредиента в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения активного ингредиента к полимеру и природы конкретного используемого полимера можно контролировать скорость высвобождения ингредиента. Примеры других биоразлагаемых полимеров включают полиортоэфиры и полиангидриды. Депо-формы для инъекций также можно получить путем заключения активного ингредиента в такие липосомы или микроэмульсии, которые со- 12 027336 вместимы с тканями организма.

Жидкие дозовые формы для перорального введения включают, без ограничения, фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы, эликсиры и композиции под давлением. Наряду с активным ингредиентом жидкие дозовые формы могут содержать инертные разбавители, широко используемые в данной области, такие, к примеру, как вода или другой растворитель, такие солюбилизирующие вещества и эмульгаторы, как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, зародышное, оливковое, касторовое и кунжутное масло), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана и их смеси. Помимо инертных разбавителей пероральные композиции также могут включать такие вспомогательные вещества, как смачивающие вещества, суспендирующие вещества, консерванты, подсластители, ароматизаторы и отдушки, загустители, красители, регуляторы вязкости, стабилизаторы или осморегуляторы. Примеры подходящих жидких носителей для перорального введения включают воду (потенциально содержащую вышеприведенные добавки, например, производные целлюлозы, как-то раствор натриевой карбоксиметилцеллюлозы), спирты (включая одноатомные спирты и многоатомные спирты типа гликолей) и их производные, а также масла (например, фракционированное кокосовое масло или арахисовое масло). Для композиций под давлением жидким носителем может быть галогенированный углеводород или другой фармацевтически приемлемый вытеснитель (сжатый газ).

Твердые дозовые формы для перорального введения включают, к примеру, капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых дозовых формах пептиды изобретения (либо их производные или их конъюгаты) могут быть смешаны по меньшей мере с одним инертным физиологически приемлемым наполнителем или носителем типа цитрата натрия или дикальцийфосфата и одним или несколькими: (а) наполнителями или разбавителями, такими как крахмал, лактоза, сахароза, глюкоза, маннитол и кремниевая кислота; (Ь) связывающими веществами, такими, к примеру, как карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и гуммиарабик; (с) увлажнителями типа глицерина; (6) дезинтегрирующими веществами, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или крахмал тапиоки, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия; (е) замедляющими растворение веществами типа парафина; (ί) ускоряющими всасывание типа четвертичных аммониевых соединений; (д) смачивающими веществами, такими, к примеру, как цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (Ь) абсорбентами типа каолина и бентонита и (ί) смазывающими веществами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия, и их смесями. Другими наполнителями, пригодными для твердых композиций, являются поверхностно-активные вещества, такие как неионные и анионные поверхностно-активные вещества. Типичные примеры поверхностно-активных веществ включают, без ограничения, полоксамер 188, безалкония хлорид, стеарат кальция, цетостеариловый спирт, эмульгирующий воск цетомакрогол, сложные эфиры сорбитана, коллоидная двуокись кремния, фосфаты, додецилсульфат натрия, силикат магния-алюминия и триэтаноламин. В случае капсул, таблеток и пилюль дозовые формы также могут содержать буферные вещества.

Твердые композиции подобного типа также могут применяться в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах с использованием таких наполнителей, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и др. Твердые дозовые формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул также можно приготовить с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия, покрытия для контролиремого высвобождения и другие покрытия, хорошо известные в области фармацевтики. Они необязательно могут включать контрастные вещества, а также могут представлять собой такие композиции, которые высвобождают активные ингредиенты только или предпочтительно в определенной части желудочно-кишечного тракта, необязательно замедленным образом. Примеры композиций для заливки, которые можно использовать, включают полимерные субстанции и воски.

В некоторых воплощениях может потребоваться введение антиапоптозного пептида изобретения (либо его производного или его конъюгата) локально в область, требующую обработки (например, миокард). Это может осуществляться, к примеру, но без ограничения, путем местной инфузии во время чрескожной коронарной ангиопластики или во время коронарного шунтирования.

Для топического введения фармацевтическая композиция предпочтительно составляется в виде геля, мази, лосьона или крема, которые могут включать носители, такие как вода, глицерин, спирт, пропиленгликоль, жирные спирты, триглицериды, эфиры жирных кислот или минеральное масло. Другие топические носители включают вазелиновое масло, изопропилпальмитат, полиэтиленгликоль, этанол (95%), полиоксиэтиленмонолаурат (5%) в воде или лаурилсульфат натрия (5%) в воде. При необходимости можно добавить и другие материалы, как-то антиоксиданты, увлажнители, стабилизаторы вязкости и подобные вещества.

Кроме того, в некоторых случаях предусматривается, что композиции по изобретению могут находиться внутри трансдермальных устройств, помещаемых на, в или под кожу. Такие устройства включают пластыри, импланты и инъекции, которые высвобождают активный ингредиент по пассивному или активному механизму высвобождения. Трансдермальное введение включает все введения через поверхность тела и внутренние оболочки организма, включая эпителиальные и слизистые ткани. Такое введе- 13 027336 ния может осуществляться с использованием представленных композиций в лосьонах, кремах, пенах, пластырях, суспензиях, растворах и свечах.

Материалы и методы получения различных лекарственных форм известны в данной области и могут быть адаптированы для практического применения настоящего изобретения. Подходящие лекарственные формы для доставки антител приведены, к примеру, в Кетт§1ои'8 Рйагтасеийса1 8с1спсс5. Е.^. Майт, 181й Ей., 1990, Маск РиЬЙ8Й1ид Со.: Еа81ои, РА.

Дополнительные биологически активные средства.

В некоторых воплощениях пептид изобретения является единственным активным ингредиентом в фармацевтической композиции настоящего изобретения. В других воплощениях фармацевтическая композиция дополнительно содержит одно или несколько биологически активных средств. Примеры подходящих биологически активных средств включают, без ограничения, антиапоптозные средства, противовоспалительные средства, иммуномодуляторные средства, анальгетики, противомикробные средства, антибактериальные средства, антибиотики, антиоксиданты, антисептики и их комбинации.

В некоторых воплощениях дополнительные биологически активные средства выбираются из группы, состоящей из циклоспорина А, ВН4 и их комбинаций.

В таких фармацевтических композициях можно комбинировать антиапоптозный пептид по изобретению (либо его производное или его конъюгат) и дополнительные терапевтические средства в одном или нескольких препаратах для одновременного, раздельного или последовательного введения различных компонентов. Более конкретно, композиция по изобретению может быть составлена таким образом, чтобы пептид (либо его производное или его конъюгат) и эти терапевтические средства можно было вводить одновременно или независимо друг от друга. Например, пептид (либо его производное или его конъюгат) и терапевтическое средство могут быть заключены вместе в одной композиции. С другой стороны, они могут содержаться (например, в различных композициях и/или контейнерах) и вводиться по отдельности.

Примеры

В следующих примерах описаны некоторые предпочтительные способы практического применения настоящего изобретения. Однако следует иметь в виду, что эти примеры представлены только в целях иллюстрации и не должны ограничивать объем изобретения.

Синтез мембраносвязанных наборов инвертированных пептидов.

Пептиды синтезировали на мембранах из Ν-модифицированного САРЕ (Вйатдауа е1 а1., Мо1. Ресодий, 2002, 15: 145) и получали при помощи робота МиШРер 8РОТ (ΙΝΤΑνίδ Вюаиа1уйса1 1и81гитеи18 АО, Со1одие, Германия). Разработка набора осуществлялась с помощью внутрифирменной программы Ь18А 1.71. Синтез начинали с определения пятен по стандартной методике [Ртаик, ТеЦайейгои, 1992, 48: 9217) с последующей конденсацией раствора Ртос-цистеина-(Тт1)-Ор1р (0,3 М) в Ν-метилпирролидоне (NМР) и Ртос-аланина-ОрЕр (двойная конденсация, каждая реакция по 15 мин). После отщепления Ртос пиперидином в ЭМР (20%) добавляли 4-гидроксиметилфеноксиуксусную кислоту (НМРА), растворенную в диметилформамиде (ИМР, 0,6 М раствор) и активированную ЕЕЭО (1,1 экв.), и образцы наносили непосредственно на мембрану (4хконденсация, каждая реакция по 15 мин). Мембрану ацетилировали уксусным ангидридом в ЭМЕ (2%), промывали ЭМР (5x3 мин), этанолом (2x3 мин) и диэтиловым эфиром (2x3 мин), а затем высушивали на воздухе. На мембрану наносили растворы Ртос-аминокислота-ОН (0,4 М), активированные 1,1'-карбонилдиимидазолом (СИ1, 3 экв.) в ЭМР (4хконденсация, каждая реакция по 15 мин). Пролин, тирозин и глутамин активировали с помощью 1,1'-карбонилди(1,2,4-триазола) (СОТ). Из пятен удаляли группу Ртос, а последовательности пептидов завершали по стандартной методике §РОТ-синтеза (Ргаик, ТеБтайейтои, 1992, 48: 9217) с последующим присоединением Ν-концевой метки β-аланина.

Для стандартного 8РОТ-синтеза использовали Ртос-аа-Ор1р со следующей защитой боковых цепей: Е-, И-(О1Ви); С,- 8-, Т-, У-(1Ви); К-, \У-(Вос); Ν-, 0-, Н-(Тй); К-(РМ). Для тиоэфирной циклизации все пептиды подвергали Ν-ацетилированию с помощью 2,4-динитрофенилового эфира бромуксусной кислоты в ИМР (1 М) (двойная конденсация, каждая реакция по 15 мин).

Мембрану промывали ИМР (3x3 мин) и дихлорметаном (ИСМ, 3x3 мин) и высушивали. Для реакции циклизации тритиловую защитную группу боковых цепей цистеина отщепляли трифторуксусной кислотой (ТРА, 7%), Н₂О (2%) в ИСМ (1x5 мин), а затем ТРА (7%), Т1В8 (3%), Н₂О (2%) в ИСМ. Мембрану промывали ИСМ (3x3 мин), ИМР (2x3 мин) и ИМР (2x3 мин). Пептиды подвергали циклизации в течение ночи путем обработки 25%-ным водным С8₂СО₃/ИМР (1:1). Мембрану промывали ИМР (2x3 мин), Н₂О (2x3 мин), этанолом (2x3 мин) и диэтиловым эфиром (2x3 мин), а затем высушивали на воздухе.

Гидролиз и деблокирование боковых цепей осуществляли однократной обработкой ТРА (60%), Т1В8 (3%) и Н₂О (2%) в ИСМ в течение 2,5 ч без встряхивания с последующими стадиями промывки (ИСМ 3x3 мин, ИМР 3x3 мин, этанол 3x3 мин, диэтиловый эфир 2x3 мин), а затем ТРА (90%), Т1В8 (3%) и Н₂О (2%) в ИСМ в течение 30 мин без встряхивания. Мембрану промывали ИСМ (3x3 мин), ИМР (3x3 мин), этанолом (2x3 мин), фосфатным буфером (рН 7,4, 0,1М, 2x3 мин), Н₂О (2x3 мин), этанолом (2x3

- 14 027336 мин) и диэтиловым эфиром (2x3 мин), а затем высушивали на воздухе.

Разработка и получение фрагментов по изобретению.

Первичную последовательность белка Γ)ΑΧΧ (ЗЕ^ ГО N0: 1) нарезали на перекрывающиеся 15мерные пептиды (со сдвигом в 3 аминокислоты), и все пептиды (243 пептида) синтезировали на целлюлозной мембране методом ЗР0Т-синтеза, как описано выше. Библиотеку пептидов инкубировали с ΗΪ8теговым внутриклеточным участком Баз-рецептора (Зщта). Взаимодействие между Баз и пептидами определяли при помощи сэндвича анти-Н1з(мышь)/против мыши с НКР, а сигналы проявляли на БишИтадег (КосБе), как показано на фиг. 1А. Было обнаружено, что пятно № 211 (ЗЕ^ ГО N0: 2) проявляет наибольшую интенсивность сигнала, а пятна №№ 209, 210 и 212 (ЗЕ^ ГО N0: 3, ЗЕО ГО N0: 4 и ЗЕО ГО N0: 7 соответственно) включают минимальную последовательность эпитопа (КЗККЕККОТ).

Тем не менее, анализ длины последовательностей 15-меров КЗККЕККОТОЗОРБО (пятно № 211, ЗЕО ГО N0: 2) и ЗОРРСККЗККЕККОТ (пятно № 209, ЗЕО ГО N0: 3) показал, что невозможно произвольно укоротить эти последовательности до минимального эпитопа, приведенного на фиг. 1. Методом ЗР0Т-синтеза, представленным выше, анализировали влияние длины пептида путем укорочения данных последовательностей с Оконца, С-конца и в обоих направлениях (фиг. 2А). Последовательности пептидов, проявляющих самые высокие интенсивности сигнала, приведены на фиг. 2В.

Делали совмещенную комбинацию из дающего наибольшую интенсивность сигнала ^ΑXXр-211 и ^ΑXXр-209, которая соответствует 16-мерному пептиду (ККЗККЕККОТОЗОРБО), именуемому пептидом Γ)ΑΧΧ или ^ΑXXр (ЗЕО ГО N0: 5). Было установлено, что ^ΑXXр обладает существенной антиапоптозной активностью ίη νίΐΐΌ и ίη νΐνο.

Можно удлинить пептид с С-конца в соответствии с тем, что доминантный негативный белок (^ΑXX-^N) [КоиЬШе е! а1., С1гси1а1юп 2007, 116:2709-2717] охватывает область от пептида ^ΑXXр-211 до С-концевого участка белка Γ)ΑΧΧ (фиг. 1В).

Применение при ΑΜΙ.

Петиды ^ΑXXр, конъюгированные с СРРз или нет, тестировали на предмет антиапоптозной активности на первичных кардиомиоцитах и на их способность уменьшить размер инфаркта у мышей на хирургической модели Ι/К после системного введения.

Оценка ίη νΐΐΓο.

На первом этапе измеряли захват клетками пептидов, перечисленных в табл. 1, на первичной клеточной культуре кардиомиоцитов мыши методом проточной цитометрии (БАСЗ - с СБ-меченными пептидами), и установили отсутствие цитотоксичности.

Таблица 1

Пептиды СРР и конъюгаты СРР-^ΑXXр, использовавшиеся в этом исследовании

Название	Последовательность	Α.κ.
Та!	ΟΚΚΚΚΚ0ΚΚΚΡΡ0-ΝΗ2	13
(КХК)4	(ΚΧΚ)4-ΝΗ2	12
Врер	κχκκβκκχκκβκχβ-νη2	14
Ρϊρ2Β	(ΚΧΚ)3-ΙΗΙΕΡΟ№ΚΜΚ\νΗΚ-ΝΗ2	23
ТаЮАХХр	ΟΚΚΚΚΚ0ΚΚΚΡΡ0-ΚΚδΚΚΕΚΚ0ΤΟδΟΡΕΟ-ΝΗ2 (=δΕΟ ГО N0: 58)	29
Та!-псОАХХр	ΟΚΚΚΚΚ0ΚΚΚΡΡ0-ΑΚΕΥνΥΙΝΕΕΟΤνΕΚ-ΝΉ2 (ηοϋΑΧΧρ = δΕΟ ГО N0:13)	29
ТаЕзсГОАХХр	ΟΚΚΚΙ^0ί^ϊ^Ρ0-ΚΚΟΚΚ0δΟΕδΕΟΤΡΚΚ-ΝΗ2	29
(ΚΧΚ.)4-ΌΑΧΧρ	(ΚΧΚ)4-ΚΚδΚΚΕΚΚ0ΤΟδΟΡΕΟ-ΝΗ2	28
Врер-ϋΑΧΧρ	ΚΧΚΚΒΚΚΧΚΚΒΚΧΒ-ΚΚδΚΚΕΚΚ0ΤΟδΟΡΕΟ-ΝΗ2	30
Ρίρ2Β-ϋΑΧΧρ	(ЮЖ)34ШЕР0№КМК\УНК-КК8ККЕКК0ТО8ОРЕО-14Н2	39
ΏΑΧΧρ	ΚΚδΚΚΕΚΚ0ΤΟδΟΡΕΟ-ΝΗ2 (δΕΟ ГО N0: 5)	16
Та!-0АХХр13	ΟΒΚΚΙ^φΜυ^Ρρ-ΚΚΕΚΚ()ΤΟδΟΡΕΟ-ΝΗ2 (ϋΑΧΧρ13 = δΕφ ГО N0:14)	26
тОАХХр	ΚΚΡΚΚΕΚΚ0ΕΟ8ΟΕΕΟ-ΝΗ2 (δΕΟ ГО N0:15)	16
зсгОАХХр	ΚΚΟΚΚ0δΟΕδΕΟΤΡΚΚ-ΝΗ2 (δΕΟ ГО N0:16)	16
ТаЕтОАХХр	ΟΚΚΚΚΚ.0ΚΚΚΡΡ0-ΚΚΡΚΚΕΚΚ0ΕΟδΟΕΕΟ-ΝΗ2 (δΕΟ Π) N0: 61)	29
Р1р2Ъ-тОаХХр	(ΚΧΚ.)3-ΙΗΙΕΡΟ№ΚΜΚλνΗΚ-ΚΚΡΚΚΕΚΚΟΕΟδΟΕΕΟ-ΝΗ2	39

Χ - аминогексановая кислота, В - □ -аланин, г - Э-аргинин; для измерения методом БАСЗ пептиды метили по Оконцам (5,6)-карбоксифлуоресцеином (СБ); все пептиды подвергали С-концевому амидированию. зсг - смешанный вариант ОАККр; тОАККр - мышиный гомолог ОАККр человека.

Другие производные СРР-^ΑXXр, которые тоже изучали, представлены ниже в табл. 2.

- 15 027336

Таблица 2

Дополнительные производные СРР-ΏΑΧΧρ

Название	Последовательность
ΤΗΐ-ΌΑΧΧρ	ΘΕΚΚΕΕ0ΚΕΚΡΡ0- ККЗККЕКК0ТС5СРЬО-ЫН2 (ЗЕО Ю ΝΟ: 58)
Та!-ОАХХр-209	СЕККЕЕОЕЕЕРРО-ЗСРРСККЗЕКЕККОТ-ЫН2
Ταΐ-ϋΑΧΧρ-210	ΘΕΚΚΕΚςΚΕΚΡΡΟ- РСККЗККЕКК0ТСЗО-ЫН2
Та!-ОАХХр-211	(ЖККРР<2РККРР<2- К5ККЕКК<2ТСЗСРЬС-ЦН2
ТаЮАХХр-212	СККККК<2ШЩРР<2- КЕКК0ТСЗСРЬСИЗУ-ЫН2
ТаЮАХХр	ОККККК0КККРР0-ККЗККЕКК0ТСЗОРЬС-ЫН2
Та1-ОАХХр-15	СЕККЕЕОЕЕЕРРО-КЗККЕККОТСЗСРЬС-ΝΗ2 = ТаЕ-ОАХХр-211
Та!-ОАХХр-14	ΟΕΚΚΕΚΟΡΕΕΡΡΟ- ЗЕКЕКК0ТСЗСРЬС-ЫН2
ТаМЭАХХрЧЗ	дккккЕ<2ЕК.крр<2- ккекк<2ТСЗСрьо-ын2
Та1-ОАХХр-9	СЕКККК0КККРР<2- Κ3ΚΚΕΚΚ<2Τ-ΝΗ2

Кроме того, проверяли возможное взаимодействие фрагментов с внутриклеточным участком рецептора Рак путем измерения сродства связывания (КД методом поверхностного плазмонного резонанса ^РК) (В1аеоге РП'е δс^еηсе, Швеция). Значения сродства связывания самого фрагмента и его конъюгатов с СРРк приведены в табл. 3.

Таблица 3

Значения сродства связывания (К_а в мкМ) использованных конструкций

Название	Последовательность	Ο ΕΓ
ЦАХХр	ΚΚδΚΚΕΚΚΟΤΟδΟΡΙΌ-ΝΗζ	333 ± 62
пЮАХХр	ΚΚΡΚΚΕΚΚ(}ΕΟ5ΟΙΧΟ-ΝΉ2	252 ± 64
зсгЦАХХр	ККОКК08ОЕ8ЬОТРКК-ЦН2	>6000
Ταί-ϋΑΧΧρ	ΟΚΚΚΚΚρΚΚΚΡΡΡ-ΚΚ8ΚΚΕΚΚ0ΤΟ8ΟΡΕΟ-ΝΗ2	13 ±9
Та1-5сгЦАХХр	ΟΚΚΚΚΚ0ΚΚΚΡΡ0-ΚΚΟΚΚ08ΟΕ8ΕΟΤΡΚΚ-ΝΗ2	η/ο
Ταί-ϋΑΧΧρ13	ΟΚΚΚΚΚ^ΚΚΚΡΡ^-ΚΚΕΚΚ^ΤΟ8ΟΡ^Ο-NΗ2	η/ο
Ρΐρ2Β-ϋΑΧΧρ	(ΚΧΚ)3-ΙΗΙΕΡ9ΝΓΚΜΚλνΗΚ-ΚΚ8ΚΚΕΚΚρΤΟ8ΟΡΕΟ-ΝΗ2	0,7 ± 0,2

Все эксперименты проводили на приборе В1аеоге. Для каждого условия приведено среднее значение из трех независимых опытов и соответствующее стандартное отклонение.

После этого оценивали способность этих пептидов ингибировать апоптоз, индуцированный стауроспорином. Апоптоз определяли с помощью набора Се11 Г)еа1И бе!ее!1оп ΕΠδΑ^^υδ кй (Косйе) по измерению фрагментации ДНК.

В большинстве публикаций антиапоптозные пептиды, которые сейчас доступны, вводятся за 3-4 ч перед индуцированием апоптоза, что плохо сочетается с клиническим применением. По этой причине использовавшаяся в настоящем изобретении методика включает введение пептидов вместе со стауроспорином. На фиг. 5В четко видно снижение фрагментации ДНК в первичных кардиомиоцитах на 44% при использовании ΤπΙ-ΩΑΧΧρ и на 55% при использовании Р^ρ2Ь-^ΑXXρ соответственно. Этого не наблюдалось при использовании одного лишь СРР или отрицательных контролен Та!-кс^^ΑXXρ или Та!ηοϋΑΧΧρ. Степень улучшения рассчитывали согласно указаниям поставщиков (фрагментация ДНК в обработанных клетках/фрагментация ДНК в необработанных клетках). Для лучшего сравнения результатов фрагментацию ДНК (которую отражает степень улучшения) выражали относительно обработанных стауроспорином клеток (=100%).

Антиапоптозные эффекты пептидов также анализировали на мышиных клетках N0118-15 (модель для нейрональных клеток) (фиг. 5Ώ), на мышиных клетках С2С12 (модель для мышечных клеток) (фиг. 5А) и на крысиных клетках Н9с2 (модель для сердечных клеток) (фиг. 5С). Наибольшее снижение фрагментации ДНК наблюдалось при использовании Врер-ΏΑΧΧρ на N0118-15 (снижение на 66%), при использовании ΊπΙ-Γ)ΑΧΧρ на С2С12 (снижение на 24%) и при использовании Р^ρ2Ь-^ΑXXρ на Н9с2 (снижение на 31%). Это четко показывает важность оптимального выбора СРР для соответствующего применения или биологического контекста.

Кроме того, определяли связывающий эпитоп белка ΓΑΙΧ) (δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 8), как описано выше для эпитопа ΏΑΧΧ (подробности см. выше). Как видно из фиг. 8А, пятно №11, соответствующее пептиду ΓΑΠΏρ^ (νθΚΡΚΕΕΚν9δΟΕϋΕ; δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 9), обладало наибольшей интенсивностью сигнала, а пятна №№ 10 и 12 (δΕ9 ΙΌ ΝΟ: 10 и δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 11) имели такую же минимальную последовательность эпитопа, что и ΕΑϋΠρ15.

Таблица 4

Последовательности производных белка ΓΑΓ)Ιλ конъюгированных с СРР-пептидом Та!

ТаЕРАОПр	СЕККЕЕ0ЕЕЕРР0-КЕКЪЕЕУ03-ЫН2 (=3Ε0 Ю ΝΟ: 59)
Та1-ГАООр15	СЕККЕЕ0ЕЕЕРР0-УСКЕКЬЕЕУ03СШЬ-ЫН2 (=3Ε<2 ΙΌ ΝΟ: 60)

С помощью урезания библиотеки пептидов по длине определяли минимальный фрагмент ΕΑΏΠρ15, который соответствует ΕΆΡ)Ρ)ρ (δΕ9 ΙΌ ΝΟ: 12; ΚΡΚΡΕΚν9δ) (см. фиг. 8В). В кардиомиоцитах апоптоз снижался на 35% при использовании конъюгата Та!-ΡΑ^^ρ и на 57% при использовании Та!-ΡΑ^^ρ-15 (фиг. 9).

- 16 027336

Оценка ίη νίνο.

На втором этапе изучали кардиопротекторные эффекты ΌΑΧΧρ на модели ишемии миокарда с реперфузией ίη νίνο. Острую ишемию миокарда и реперфузию проводили на мышах С57В16, которых подвергали обратимой закупорке коронарных сосудов на хирургической модели. Самцов мышей (22-28 г) анестезировали и подвергали легочной вентиляции через трахеотомическую трубку с помощью дыхательного аппарата НагуагД. Температуру тела поддерживали между 36,8 и 37,0°С с помощью терморегулируемого хирургического столика. Вскрывали грудную клетку посредством левосторонней торакотомии и обратимо пережимали левую коронарную артерию хирургической петлей. Мышей случайным образом распределяли по двум различным методикам хирургической ишемии миокарда с реперфузией (фиг. 11). По окончании реперфузии артерию снова пережимали, вводили краситель фталоцианиновый синий в полость левого желудочка и давали ему пройти через неишемические участки миокарда. Для определения эффекта ΌΑΧΧρ на размер инфаркта миокарда пептиды вводили внутривенно (хвостовая вена) за 5 мин до реперфузии по методике хирургической ишемии с реперфузией. Контрольные группы получали пептид Та1 или Ρίρ2Ό (для СРР самих по себе). Была выбрана доза в 1 мг/кг (мкМ диапазон), но тестировали и ответы на 0,1 и 10 мг/кг.

По окончании реперфузии мышей снова анестезировали, коронарную артерию окончательно пережимали, вводили синий краситель, извлекали левые желудочки и проводили измерения размера инфаркта (методом ТТС, 5>с11\\аг1/ с1 а1., ί ТНготЬ. ТНготЬ., 2000; 10: 181-187) или фрагментации ДНК (набор Се11 Όοαίΐι άβΐβΛίοη ЕЬ1§А^ръи8 ΗίΙ, КисНе ΌίαβηοδίΚδ) для изучения кардиопротекторных эффектов на повреждения при ишемии-реперфузии. Полученные результаты представлены на фиг. 12-15.

При внутривенном введении ΤαΙ-ΌΑΧΧρ (1 мг/кг) ίη νίνο размер инфаркта после 1-часовой реперфузии уменьшался на 53,4% по сравнению с одним лишь пептидом Та1 (ρ<0,01) (площадь зоны риска была соизмерима между группами; ρ^.β., см. фиг. 12А). Кардиопротекторное действие коррелировало с резким снижением специфической фрагментации ДНК - отличительным признаком апоптоза - в левых желудочках у получавших Τаΐ-^ΑXXρ мышей по сравнению с получавшими Та1 мышами (см. фиг. 12В). Кардиопротекторное действие не наблюдалось при введении Ρίρ2Ε-ΌΑΧΧρ или одного лишь СРР либо отрицательного контроля Τаΐ-8С^^ΑXXρ (данные не приводятся).

На фиг. 13 представлена зависимость доза-эффект при введении Τаΐ-^ΑXXρ в дозах 0,1, 1 и 10 мг/кг, из которой видно, что максимальный эффект достигается при дозе в 1 мг/кг. При введении одного лишь ΌΑΧΧρ (10 мг/кг) (без СРР) он предохранял миокард путем уменьшения как размера инфаркта, так и фрагментации ДНК в такой же степени, как и Τаΐ-^ΑXXρ.

Кардиопротекторные эффекты Τаΐ-^ΑXXρ сохранялись при увеличении продолжительности реперфузии с 1 до 24 ч (см. фиг. 14 и 15).

Конфокальная микроскопия показала, что СΡ-Τаΐ-^ΑXXρ (1 мг/кг) локализуется как в цитозоле, так и в ядре кардиомиоцитов левого желудочка (фиг. 16).

Предварительные результаты, полученные при исследовании ίη νίνο на модели трансплантации почек (у крыс), показали, что Τаΐ-^ΑXXρ (1 мг/кг) может предохранять от ишемических-реперфузионных повреждений и при других клинических применениях.

По всей настоящей заявке в различных ссылках описан уровень техники в той области, к которой относится изобретение. Содержание этих ссылок тем самым включено путем ссылки в настоящее описание.

- 17 027336

Список последовательностей <110> СИКЗ ваккеке, ВЬйрКапте

<120>	тКтКтьогз оТ Арорьозт 5 апс! изез тКегеоТ
<130>	ВСТ1104060Т
<150>	РСТ/1В2О1О/ОО3158
<151>	2010-11-18
<160>	61
<170>	РагепПп уегзтоп 3.5
<210>	1
<211>	740
<212>	РКТ
<213>	ното зартепз

<400> 1

мег

А1а

ТКг

А1а

Азп

Вег

Пе

Пе

Уа1

ьеи

Азр

А5р

Азр

Азр

с!и

АЗр

1

5

10

15

с1и

А1а

А1а

А1а

С1п

Рго

С1у

РГО

Вег

НТ 5

Рго

Ьеи

Рго

Азп

А1а

А1а

20

25

30

Вег

РГО

С1у

А1а

С1и

А1а

Рго

Вег

Вег

Вег

С1и

РГО

НТ 5

С1у

А1а

Агд

35

40

45

с1у

Вег

вег

Зег

Вег

С1у

с1у

ьуз

ьуз

Суз

Туг

ьуз

Ьеи

С1и

Азп

С1и

50

55

60

ьуз

Ьеи

РКе

С1и

С1и

РКе

Ьеи

С1и

ьеи

Суз

Ьуз

меь

С1п

тКг

А1а

Азр

65

70

75

80

НТ 5

РГО

С1и

Уа1

Уа1

РГО

РКе

ьеи

туг

АЗП

Агд

С1п

С1п

Агд

А1а

НТ 5

85

90

95

вег

ьеи

РКе

ьеи

А1а

вег

А1а

С1и

РКе

Суз

Азп

Пе

Ьеи

Вег

Агд

Уа1

100

105

110

ьеи

вег

Агд

А1а

Агд

Зег

Агд

РГО

А1а

ьуз

Ьеи

туг

Уа1

Туг

Пе

АЗП

115

120

125

С1и

ьеи

Суз

ТКг

Уа1

ьеи

ьуз

АТа

нт 5

Вег

А1а

ЬУ5

ьуз

ьуз

ьеи

АЗП

130

135

140

ьеи

А1а

РГО

А1а

А1а

тКг

тКг

вег

Азп

С1и

РГО

Вег

С1у

АЗП

АЗП

РГО

145

150

155

160

Рго

тКг

НТ 5

ьеи

Вег

Ьеи

Азр

РГО

ТКг

АЗП

А1а

С1и

Азп

тКг

А1а

вег

165

170

175

с1п

Вег

Рго

Агд 180

ТКг

Агд

С1у

вег

Агд 185

Агд

С1п

Пе

С1п

Агд 190

Ьеи

с1и

С1п

ьеи

ьеи 195

А1а

Ьеи

Туг

Уа1

А1а 200

С1и

Пе

Агд

Агд

ьеи 205

с1п

С1 и

ьуз

С1и

ьеи

АЗр

ьеи

Вег

с1 и

ьеи

А5р

Азр

Рго

Азр

Вег

А1а

туг

Ьеи

С1п

210

215

220

С1и 225

А1а

Агд

ьеи

ьуз

Ж

ьуз

Ьеи

Пе

Агд

Ьеи 235

РКе

с!у

Агд

ьеи

суз 240

С1и

ьеи

Ьуз

Азр

Суз

вег

Вег

Ьеи

ТКг

С1у

Агд

Уа1

Пе

С1и

С1 п

Агд

245

250

255

Пе

Рго

Туг

Агд

С1у

тКг

Агд

Туг

РГО

С1и

Уа1

Азп

Агд

Агд

Пе

С1и

260

265

270

Агд

ьеи

Пе

АЗП

ьуз

Рго

С1у

Рго

Азр

тКг

РКе

Рго

Азр

туг

б!у

Азр

275

280

285

Уа1

ьеи 290

Агд

А1а

Уа1

с1и

ьуз 295

А1а

А1а

А1а

Агд

нт 5 300

Вег

Ьеи

С1у

ьеи

РГО

Агд

С1п

Οίη

ьеи

с1п

Ьеи

мег

А1а

С1п

А5р

А1а

РКе

Агд

Азр

Уа1

305

310

315

320

С1у

Пе

Агд

ьеи

С1п

С1и

Агд

Агд

НТ 5

ьеи

Азр

ьеи

Пе

туг

АЗП

РКе

325

330

335

С1у

СУ5

НТ 5

ьеи

тКг

Азр

Азр

туг

Агд

РГО

С1у

Уа1

А5р

РГО

А1а

ьеи

340

345

350

Вег

А5р

РГО 355

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

Агд 360

Ьеи

Агд

С1и

АЗП

Агд 365

Вег

Ьеи

А1а

Μθΐ

Вег 370

Агд

ьеи

Азр

С1 и

Уа1 375

Пе

Вег

ьуз

туг

А1а 380

меь

Ьеи

С1п

Азр

ЬУ5

Вег

С1и

С1и

с1у

С1и

Агд

ьуз

ьуз

Агд

Агд

А1а

Агд

ьеи

С1п

С1у

385

390

395

400

тКг

Вег

Зег

НТ 5

вег

а1 а

Агр

тКг

РГО

С1 и

А1а

вег

ьеи

Азр

Вег

С1у

405

410

415

С1и

с1у

Рго

Вег

С1у

меь

а! а

вег

С1п

С1у

суз

Рго

вег

а! а

Вег

Агд

420

425

430

А1а

С1и

тКг

Азр

Азр

с! и

Азр

Азр

с1и

С1и

вег

Азр

с!и

С1и

С1и

с! и

435

440

445

С1и

с1и

С1и

С1и

с! и

с! и

с1и

С1 и

С1и

А1а

тКг

Азр

Вег

С1 и

С1и

С1и

450

455

460

- 18 027336

С1и А5р 465

ьеи

с1и С1п мет 470

С1п

С1и С1у С1п С1и 475

Азр

Азр

С1и

С1 и

С1 и 480

АЗр

С1 и

С1и

С1и

С1и 485

А1а

А1а

А1а

С1у

ьуз 490

Азр

С1у

Азр

Ьуз

Зег 495

РГО

Μθΐ

Зег

Зег

Ьеи

С1п

11е

Зег

АЗП

С1и

Ьуз

АЗП

ьеи

С1и

РГО

С1у

ьуз

500

505

510

С1п

11е

Зег 515

Агд

Зег

Зег

С1у

С1 и 520

С1п

С1п

АЗП

ьуз

С1у 525

Агд

Не

уа1

зег

Рго

Зег

ьеи

Ьеи

Зег

С1и

С1 и

Рго

Ьеи

А1а

РГО

5ег

Зег

Не

АЗр

530

535

540

А1а

с! и

Зег

АЗП

с!у

С1и

С1п

РГО

с!и

с!и

ьеи

тНг

ьеи

С1 и

С1и

С1 и

545

550

555

560

Зег

РГО

Уа1

Зег

С1п

Ьеи

РНе

С1 и

Ьеи

С1и

Пе

С1и

А1а

Ьеи

Рго

565

570

575

Азр

тНг

РГО

зег

Зег

Уа1

с1и

ТНг

Азр

11е

5ег

Зег

Зег

Агд

ьуз

580 585 590

Зег С1и С1и Рго РНе тНг тНг Уа1

		595					600
Зег	зег 610	тНг	зег	РНе	АЗП	С1у 615	с1у
зег 625	С1у	Рго	РГО	Суз	ьуз 630	Ьуз	Зег
Зег	С1у	Рго	ьеи	С1у 645	Азп	Зег	туг
С1и	ьуз	Азп	С1у 660	ьуз	ьуз	Пе	суз
ьеи	А1а	Зег 675	ьеи	А1а	Рго	Уа1	А1а 680
Рго	зег 690	НТ 5	С1у	Ьеи	Уа1	тНг 695	Зег
Агд 705	ьеи	Зег	С1п	ТНг	РГО 710	НТ 5	Зег
ьуз	тНг	зег	Уа1	А1а 725	ТНг	С1п	суз
5ег А5Р	зег	А5р 740

Ьеи	С1и	Азп	С1у	А1а 605	С1у	мет	Уа1
Уа1	Зег	Рго	Нт 5 620	АЗП	тгр	С1у	АЗр
Агд	ьуз	С1и 635	ЬУ5	ьуз	С1п	ТНг	с1у 640
Уа1	С1и 650	Агд	С1п	Агд	Зег	Уа1 655	НТ 5
тНг	Ьеи	Рго	Зег	Рго	РГО	5ег	РГО

665 670

Азр Зег Зег тНг Агд Уа1 Азр Зег 685

Зег ьеи Суз 11е Рго Зег Рго А1а 700 е1п Рго РГО Агд РГО С1у тНг Суз 715 720

Азр рго С1и С1и 11е 11е Уа1 ьеи 730 735 <210> 2 <211> 15 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 2 ьуз 5ег Агд ьуз с!и ьуз ьуз С1п тНг с1у зег с1у Рго ьеи С1у 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 3

Зег с1у Рго рго Суз ьуз Ьуз зег 1 5

Агд ьуз С1и ьуз ьуз С1п тНг 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 4

Рго Суз ьуз ьуз Зег Агд ьуз с!и

1	5
<210>	5
<211>	16
<212>	РКТ
<213>	Ното зартепз

<400> 5

Ьуз Ьуз С1п ТНг С1у Зег С1у 10 15

Ьуз Ьу5 Зег Агд Ьуз С1и Ьуз Ьуз 1 5

С1п тНг С1у зег с1у Рго ьеи с1у 10 15 <210> б <211> 14 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 6

Зег Агд Ьу5 С1и Ьу5 ьуз с!п ТНг 1 5 <210> 7 <211> 15 <212> РКТ <213> ното зартепз <400> 7

Ьуз С1и ьуз ьуз с1п ТНг с1у Зег 1 5

С1у Зег С1у Рго Ьеи С1у 10

С1у Рго Ьеи С1у Азп Зег Туг 10 15

- 19 027336 <210> 8 <211> 208 <212> ΡΚΤ <213> ното зартепз <400> 8 мет Азр рго РНе ьеи Уа1 ьеи ьеи нт'з зег Уа1 5ег зег зег ьеи Зег

1

5

10

15

Зег

5ег

С1 и

Ьеи 20

тНг

С1и

Ьеи

ьуз

РНе 25

ьеи

Суз

Ьеи

С1у

Агд 30

Уа1

С1у

Ьуз

Агд

Ьуз

Ьеи

С1и

Агд

Уа1

С1п

Зег

с!у

Ьеи

Азр

Ьеи

РНе

Зег

МеТ

35

40

45

ьеи

ьеи

С1и

с1п

Азп

Азр

ьеи

С1и

РГО

С1у

НТ 5

тНг

С1и

ьеи

ьеи

Агд

50

55

60

с1и 65

ьеи

ьеи

А1а

Зег

ьеи 70

Агд

Агд

НТ 5

Азр

ьеи 75

Ьеи

Агд

Агд

Уа1

Азр 80

Азр

РНе

С1и

А1а

С1у

А1а

а! а

А1а

С1у

А1а

А1а

Рго

С1у

С1и

С1и

Азр

90 95 ьеи Суз А1а А1а РНе Азп Уа1 11е Суз Азр Азп Уа1 С1у ьуз А5р тгр 100 105 110

Агд

Агд

ьеи 115

А1а

Агд

С1 п

ьеи

ьуз 120

Уа1

Зег

Азр

ТНг

ьуз 125

11е

Азр

5ег

11е

С1и

Азр

Агд

Туг

Рго

Агд

АЗП

Ьеи

тНг

С1и

Агд

Уа1

Агд

С1и

Зег

130

135

140

ьеи Агд 11е тгр ьуз Азп тНг с1и ьуз С1и Азп А1а тНг Уа1 А1а нт'з 145 150 155 160

ьеи

Уа1 С1у

А1а ьеи Агд 165

зег

суз с1п мет 170

Азп ьеи Уа1 А1а Азр 175

ьеи

Уа1

е1п

С1и

Уа1

с1п

С1п

А1а

Агд

Азр

Ьеи

С1п

АЗП

Агд

Зег

С1у

А1а

180

185

190

мет

Зег

Рго

мет

Зег

тгр

АЗП

Зег

Азр

А1а

Зег

ТНг

Зег

С1и

А1а

зег

195

200

205

<210>	9
<211>	15
<212>	РКТ
<213>	ното 5артепз

<400> 9

Уа1 С1у ьуз Агд Ьуз Ьеи С1и Агд Уа1 С1п Зег С1у Ьеи Азр ьеи 15 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 10 ьеи с1у Агд Уа1 с1у ьуз Агд ьуз ьеи С1и Агд Уа1 С1п 5ег с!у 15 10 15

<210>	11
<211>	15
<212>	РИТ
<213>	Ното зартепз

<400> 11

Агд Ьуз Ьеи С1и Агд Уа1 С1п Зег С1у Ьеи Азр Ьеи РНе Зег мет 15 10 15 <210> 12 <211> 9 <212> РКТ <213> ното зартепз <400> 12

Ьуз Агд Ьуз ьеи С1и Агд Уа1 С1п 5ег <210> 13 <211> 15 <212> РКТ <213> ното зартепз <400> 13

А1а Ьуз Ьеи Туг Уа1 Туг 11е Азп С1и Ьеи Суз тНг Уа1 Ьеи Ьуз 15 10 15 <210> 14 <211> 13 <212> РИТ <213> Ното зартепз <400> 14

Агд Ьуз С1и ьуз ьуз с!п тНг с!у зег с1у рго ьеи С1у

1	5
<210>	15
<211>	16
<212>	РКТ
<213>	миз	тизсиТиз
<400>	15

Ьуз Агд РНе Агд Ьуз С1и Ьуз ьуз С1п ьеи С1у Зег С1у Ьеи Ьеи С1у 15 10 15 <210> 16

- 20 027336 <211>

<212>

<213>

<220>

<223>

ΡΚΤ

Агп'Ртста! Зедиепсе зсгатЫес! зедиепсе <400> 16 |_уз ьуз С1у Агд ьуз с!п зег С1у с!и зег ьеи с!у тНг рго ьуз ьуз <210>

<211>

<212>

<213>

РКТ ното зартепз <400> 17 ьуз ьуз зег Агд Ьуз с!и ьуз ьуз С1п тКг с1у Зег с!у Рго ьеи С1у <210> 18 <211> 18 <212> РКТ <213> ното зарп'епз <400> 18

Ьуз ьуз зег Агд ьуз с1и ьуз ьуз с1п тНг с!у зег с1у Рго ьеи с1у 15 10 15 <210>

<211>

<212>

РКТ <213> Ното зартепз <400> 19

Ьуз ьуз Зег Агд ьуз С1и ьуз ьуз с!п тКг с!у Зег С1у Рго ьеи С1у 15 10 15

А5П Зег Туг <210>

<211>

<212>

<213>

РКТ

Ното зартепз <400> 20

Ьуз ьуз Зег Агд ьуз С1и ьуз ьуз с!п тЬг С1у Зег С1у Рго ьеи с!у 15 10 15

Азп Зег туг	Уа1 20
<210>	21
<211>	17
<212>	РКТ
<213>	Ното	зартепз

<400> 21

Суз ьуз ьуз Зег Агд ьуз С1и ьуз Ьуз С1п тНг С1у зег с!у рго ьеи сТу <210> 22 <211> 18 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 22

Рго Суз ьуз ьуз Зег Агд ьуз с1и ьуз Ьуз С1п тНг С1у зег С1у Рго 15 10 15 ьеи с!у <210>

<211>

<212>

<213>

РКТ

Ното зартепз

Рго Рго Су5 ьуз ьуз Зег Агд ьуз с1и ьуз ьуз С1п тКг с1у Зег с1у 15 10 15

Рго ьеи С1у <210> 24 <211> 20 <212> РКТ <213> Ното зарэепз <400> 24 с1у рго рго Суз ьуз ьуз зег Агд ьуз с1и ьуз ьуз с1п тКг с!у 5ег 15 10 15

СТу Рго ьеи С1у 20 <210> 25 <211> 21 <212> РКТ <213> ното зартепз

<400>	25
Зег сЪ	' Рго	Рго Суз
1		5
Зег с1у	' РГО	ьеи с1у
		20
<210>	26
<211>	18
<212>	РКТ
<213>	ното	зартепз
<400>	26

Суз ьуз Ьуз зег Агд ьуз с1и ьуз ьуз с!п тКг С1у Зег с!у Рго ьеи 15 10 15

С1у А5П <210> 27 <211> 19 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 27

Су5 Ьуз ьуз зег Агд ьуз С1и ьуз ьуз с1п тЬг С1у зег С1у рго ьеи 15 10 15

С1у Азп Зег <210>

<211>

<212>

<213>

РКТ ното зартепз <400> 28

Су5 ьуз ьуз 5ег Агд ьуз С1и ьуз ьуз С1п тКг С1у Зег С1у Рго ьеи 15 10 15

С1у Азп Зег туг 20 <210> 29 <211> 21 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 29

Суз ьуз ьуз зег Агд ьуз С1и ьуз ьуз С1п тКг С1у Зег С1у Рго ьеи 15 10 15

С1у Азп Зег Туг Уа1 20 <210> 30 <211> 19 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 30

Рго Суз ьуз ьуз 5ег Агд ьуз с1и ьуз ьуз С1п тКг с!у Зег С1у Рго 15 10 15 ьеи С1у Азп <211>

<212>

<213>

РКТ

Ното зартепз

Рго Суз ьуз ьуз Зег Агд ьуз С1и ьуз ьуз С1п тКг с!у Зег С1у Рго 15 10 15 ьеи С1у Азп зег 20 <210>

<211>

<212>

РКТ <213> Ното зартепз <400> 32 рго Суз Ьуз ьуз Зег Агд ьуз С1и ьуз ьуз С1п тпг с1у Зег С1у Рго 15 10 15 ьеи С1у Азп зег Туг 20 <210>

<211>

<212>

<213>

РКТ

Ното зартепз

Рго Суз ьуз ьуз Зег Агд ьуз С1и ьуз ьуз С1п тпг С1у Зег С1у Рго 15 10 15 ьеи С1у Азп зег Туг Уа1 20 <210>

<211>

<212>

<213>

РКТ

Ното зартепз <400> 34

Рго Рго Суз ьуз ьуз Зег Агд ьуз С1и ьуз ьуз С1п тНг с!у зег с!у

- 22 027336

Рго 1_еи С1у Азп 20 <210> 35 <211> 21 <212> РКТ <213> ното :

<400> 35

РГО РГО Су5 1 ьуз ьуз зег Агд 1_уз с!и ьуз ьуз С1п тКг С1у Зег с1у 5 10 15

Рго ьеи С1у азп 5ег 20 <210> 36 <211> 22 <212> РКТ <213> Ното :

<400> 36

РГО РГО суз 1 ьуз ьуз зег Агд 1_уз с1и 1_уз ьуз с1п тНг с1у Зег с1у 5 10 15

Рго Ьеи С1у Αδη зег туг 20 <210> 37 <211> 23 <212> РКТ <213> ното :

<400> 37

Рго Рго Суз 1

Ьуз Ьуз Зег Агд Ьуз С1и 1_уз Ьуз С1п ТКг С1у Зег с1у 5 10 15

Рго ьеи С1у А5П 5ег туг Уа1 20 <210> 38 <211> 21 <212> РКТ <213> Ното : <400> 38 с1у Рго рго 1

Суз ьуз 1_уз Зег Агд ьуз с1и ьуз Ьуз С1п тНг С1у зег 5 10 15

С1у рго Ьеи С1у Азп 20 <210> 39 <211> 22 <212> РКТ <213> ното :

С1у Рго Рго 1

Суз ьуз ьуз Зег Агд ьуз е1и ьуз ьуз е1п тКг С1у Зег 5 10 15

С1у Рго ьеи с1у Азп зег 20 <210> 40 <211> 23 <212> РКТ <213> Ното :

<400> 40

С1у РГО РГО 1

Суз ьуз ьуз Зег Агд ьуэ С1и ьуз ьуз С1п тНг С1у Зег 5 10 15

С1у Рго Ьеи С1у Азп 5ег туг 20 <210> 41 <211> 24 <212> РКТ <213> Ното <400> 41

С1у РГО Рго 1 зартепз

Суз Ьу5 ьуз Зег Агд ьуз С1и Ьуз ьуз С1п тНг С1у Зег 5 10 15

С1у Рго Ьеи С1у Азп Зег Туг Уа1 20 <210> 42 <211> 22 <212> РКТ <213> Ното <400> 42

Зег с1у Рго 1 зартепз

Рго Суз ьуз ьуз зег Агд ьуэ С1и ьуз ьуз С1п тКг С1у 5 10 15

Зег с!у Рго ьеи с1у А5п 20 <210> 43 <211> 23 <212> РКТ <213> Ното :

<400> 43

Зег С1у Рго 1

Рго Суз ьуз ьуз Зег Агд ьуз С1и ьуз ьу5 с!п тКг с!у 5 10 15

- 23 027336

Зег С1у Рго	ьеи С1у 20
<210>	44
<211>	24
<212>	РКТ
<213>	Ното	зарт епз

зег С1у рго Рго Суз ьуз ьуз зег Агд ьуз с!и 1_у5 ьуз С1п тКг е1у 15 10 15

Зег С1у Рго ьеи С1у Αδη зег туг 20 <210> 45 <211> 10 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 45

Ьуз Агд ьуз ьеи С1и Агд Уа1 с1п Зег с1у 1 5 10 <210>

<211>

<212>

РКТ <213> ното зартепз <400> 46

Ьуз Агд Ьуз Ьеи с1и Агд Уа1 С1п Зег с1у ьеи 15 10 <210>

<211>

<212>

РКТ <213> ното зартепз <400> 47 ьуз Агд ьуз ьеи с!и Агд Уа1 с!п Зег с1у ьеи Азр <210>

<211>

<212>

РКТ <213> Ното зартепз <400> 48

Ьуз Агд ьуз ьеи е1и Агд Уа1 С1п 5ег еТу ьеи Азр ьеи 1 5 10 <211>

<212>

РКТ <213> ното зартепз <400> 49

Агд ьуз Агд ьуз ьеи С1и Агд Уа1 с!п зег 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> РКТ <213> ното зартепз <400> 50

Ьуз Агд ьуз Агд ьуэ ьеи с1и Агд Уа1 с1п зег 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 51

С1у Ьуз Агд Ьуз Ьеи С1и Агд Уа1 С1п Зег С1у 1 5 10 <210> 52 <211> 12 <212> РКТ <213>

Ното зартепз с!у ьуз Агд Ьу5 ьеи с1и Агд Уа1 с!п зег с1у ьеи - 5 10 <400>

С 1 <210> 53 <211> 13 <212> РКТ <213> ното зартепз <400> 53

С1у Ьуз Агд Ьуз Ьеи С1и Агд Уа1 С1п Зег С1у ьеи Азр <210> 54 <211> 14 <212> РКТ <213> Ното 5артеп5 <400> 54

С1у Ьуз Агд Ьуз Ьеи С1и Агд Уа1 С1п Зег С1у Ьеи А5р ьеи <210>

<211>

<212>

РКТ <213> Ното зартепз

Уа1 с!у ьуз Агд ьу5 ьеи С1и Агд 7а1 С1п зег с1у 1 5 10

- 24 027336

<210>	56
<211>	13
<212>	РКТ
<213>	Ното зартепз

<400> 56

Уа1 С1у ьуз Агд ьуз ьеи с1и Агд Уа1 с1п 5ег с!у ьеи 1 5 10 <210> 57 <211> 14 <212> РКТ <213> ното зартепз <400> 57

Уа1 С1у ьуз Агд Ьуз ьеи С1и Агд Уа1 С1п Зег с!у ьеи Азр 1 5 10 <210> 58 <211> 29 <212> РКТ <213> αγϊτРтста1 зециепсе <220>

<223> согцидаге так-ОАХХр <400> 58

С1у Агд ьуз ьуз Агд Агд с!п Агд Агд Агд Рго Рго С1п ьуз ьуз Зег 15 10 15

Агд Ьуз С1и ьуз ьуз е1п тНг с1у Зег с1у рго Ьеи С1у 20 25 <210> 59 <211> 22 <212> РКТ <213> ΑΓΐϋΊ’ст а1 Зециепсе <220>

<223> согцидаге тат-РАООр <400> 59

С1у Агд ьуз ьуз Агд Агд с1п Агд Агд Агд Рго Рго С1п ьуз Агд ьуз 15 10 15 ьеи С1и Агд Уа1 с1п Зег 20 <210> 60 <211> 28 <212> РКТ <213> АПтРтста! 5еяиепсе <220>

<223> согцидаге ТаГ-РАООр15 <400> 60

С1у Агд Ьуз Ьуз Агд Агд С1п Агд Агд Агд Рго Рго С1п Уа1 С1у Ьуз 15 10 15

Агд Ьуз ьеи С1и Агд Уа1 с1п зег с1у Ьеи Азр ьеи 20 25 <2Ю> 61 <211> 29 <212> РКТ <213> АПтРтста1 Зециепсе <220>

<223> сопз'идаРе ТаР-тОАХХр <400> 61

С1у Агд ьуз ьуз Агд Агд С1п Агд Агд Агд Рго Рго С1п Ьуз Агд РНе 15 10 15

Агд ьуз С1и ьуз ьуз С1п ьеи С1у Зег С1у ьеи ьеи С1у 20 25

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Пептид, представляющий собой фрагмент из 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 последовательных аминокислотных остатков ассоциированного с доменом смерти белка (ΌΑΧΧ) с последовательностью 8ЕР ΙΌ N0: 1, причем данный фрагмент включает аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ N0: 5 и способен ингибировать апоптоз клеток.
2. 2. Пептид по п.1, состоящий из аминокислотной последовательности 8ЕР ΙΌ N0: 5 или любой из 8Ер ΙΌ Ж)к: 17-44.
3. 3. Пептидомиметик пептида по п.1 или 2, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности указанного пептида.
4. 4. Конъюгат, включающий пептид по п.1 или 2 или пептидомиметик по п.3, соединенный с проникающим в клетки пептидом.
5. 5. Конъюгат по п.4, в котором пептид или пептидомиметик соединен с проникающим в клетки пептидом через линкер.
6. 6. Конъюгат по п.4 или 5, в котором проникающий в клетки пептид выбран из Та!, КХК, Врер или Р1р2Ь.
7. 7. Конъюгат по п.6, состоящий из аминокислотной последовательности 8ЕР ΙΌ N0: 58.
8. 8. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество пептида по п.1 или 2, или пептидомиметика по п.3, или конъюгата по любому из пп.4-7 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель, используемая для лечения заболевания или состояния, которые требуют ингибирования апоптоза в организме человека или животного и которые выбраны из острого инфаркта миокарда (ΑΜΙ), церебрального инфаркта, трансплантации органов, операции на сердце, ост- 25 027336 рого нарушения кровообращения, реперфузионного повреждения или ишемии.
9. 9. Фармацевтическая композиция по п.8, где ишемия выбрана из сердечной ишемии, ишемии почек, ишемического колита, брыжеечной ишемии, ишемии головного мозга, ишемии конечностей или ишемии кожи.
10. 10. Фармацевтическая композиция по п.8 или 9, дополнительно содержащая по меньшей мере одно биологически активное средство, выбранное из циклоспорина А, пептида ВН4 и их комбинации.
11. 11. Применение пептида по п. 1 или 2 для ингибирования апоптоза клеток в организме человека или животного.
12. 12. Применение пептидомиметика по п.3 для ингибирования апоптоза клеток в организме человека или животного.
13. 13. Применение конъюгата по любому из пп.4-7 для ингибирования апоптоза клеток в организме человека или животного.
14. 14. Применение пептида по п.1 или 2 для лечения заболевания или состояния, которые требуют ингибирования апоптоза в организме человека или животного и которые выбраны из острого инфаркта миокарда (ΑМI), церебрального инфаркта, трансплантации органов, операции на сердце, острого нарушения кровообращения, реперфузионного повреждения или ишемии.
15. 15. Применение пептидомиметика по п.3 для лечения заболевания или состояния, которые требуют ингибирования апоптоза в организме человека или животного и которые выбраны из острого инфаркта миокарда (ΑМI), церебрального инфаркта, трансплантации органов, операции на сердце, острого нарушения кровообращения, реперфузионного повреждения или ишемии.
16. 16. Применение конъюгата по любому из пп.4-7 для лечения заболевания или состояния, которые требуют ингибирования апоптоза в организме человека или животного и которые выбраны из острого инфаркта миокарда (ΑМI), церебрального инфаркта, трансплантации органов, операции на сердце, острого нарушения кровообращения, реперфузионного повреждения или ишемии.
17. 17. Применение по любому из пп.14-16, где ишемия выбрана из сердечной ишемии, ишемии почек, ишемического колита, брыжеечной ишемии, ишемии головного мозга, ишемии конечностей или ишемии кожи.
18. 18. Способ лечения заболевания или состояния, которые требуют ингибирования апоптоза в организме человека или животного, где способ включает введение указанному человеку или животному эффективного пептида по п.1 или 2, или пептидомиметика по п.3, или конъюгата по любому из пп.4-7, или фармацевтической композиции по любому из пп.8-10, где заболевание или состояние выбрано из острого инфаркта миокарда (ΑМI), церебрального инфаркта, трансплантации органов, операции на сердце, острого нарушения кровообращения, реперфузионного повреждения или ишемии.
19. 19. Способ по п.18, дополнительно включающий введение указанному человеку или животному по меньшей мере одного биологически активного средства, выбранного из циклоспорина А, пептида ВН4 или их комбинации.
20. 20. Способ по п.18 или 19, где ишемия выбрана из сердечной ишемии, ишемии почек, ишемического колита, брыжеечной ишемии, ишемии головного мозга, ишемии конечностей или ишемии кожи.