JPH09505805A

JPH09505805A - スーパーオキシドディスムターゼおよびその模倣物

Info

Publication number: JPH09505805A
Application number: JP7512010A
Authority: JP
Inventors: クラポ，ジェームズ・ディー; フリドヴィッチ，アーウィン; アウリー，ティム; デイ，ブライアン・ジェイ; フォルツ，ロドニー・ジェイ; フリーマン，ブルース・エイ
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 1993-10-15
Filing date: 1994-10-13
Publication date: 1997-06-10
Also published as: EP0723398A1; DE69434313D1; ATE291351T1; AU702596B2; DE69434313T2; US5747026A; CA2174236A1; EP0723398A4; WO1995010185A1; ES2237753T3; CA2174236C; EP0723398B1; AU7976394A; EP1442747A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般には生理学的および病理学的プロセスを調節する方法に関し、特にスーパーオキシドラジカルの細胞内および細胞外レベルを調節する方法ならびにこのことによりそのようなラジカルが関与するプロセスを調節する方法に関する。本発明はまた、そのような方法において用いるのに適した化合物および組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】スーパーオキシドディスムターゼおよびその模倣物本出願は、１９９３年１０月１５日に出願された米国特許出願第０８／１３６，２０７号の一部継続出願であり、この出願の内容を本明細書の一部としてここに引用する。技術分野本発明は、一般的には生理学的および病理学的プロセスを調節する方法に関し、具体的にはスーパーオキシドラジカルの細胞内および細胞外レベルを調節する方法、ならびにこのことによりそのようなラジカルが関与するプロセスを調節する方法に関する。本発明はまた、そのような方法において用いるのに適する化合物および組成物に関する。背景酸素フリーラジカルは、すべての細胞の正常な代謝の一部として生成するが、また、多くの疾患プロセスの病因の重要な成分である。例えば、酸素フリーラジカルは、肺、中枢神経系および骨格筋の疾患の病因の重大な要素である。酸素フリーラジカルはまた、酸化窒素（ｎｉｔｏｒｉｃｏｘｉｄｅ）（ＮＯ・）の影響を調節する上でも役割を果たしている。この意味において、これらは血管の疾患、炎症性疾患および老化プロセスの病因に寄与している。細胞および臓器の正常な機能を維持するためには、酸素ラジカルに対する防御酵素の重要なバランスが必要である。スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）は、金属酵素のファミリーであり、細胞内および細胞外でのＯ₂ ^-からＨ₂Ｏ₂＋Ｏ₂への変換を触媒し、スーパーオキシドラジカルの有害な効果に対する第一線の防御としての意義を有する。哺乳動物は３つの異なるＳＯＤを産生する。第１は、二量体の銅および亜鉛含有酵素（ＣｕＺｎＳＯＤ）であり、すべての細胞の細胞質に見いだされる。第２は、四量体のマンガン含有ＳＯＤ（ＭｎＳＯＤ）であり、ミトコンドリア内に見いだされる。第３は、四量体のグリコシル化された銅および亜鉛含有酵素（ＥＣ−ＳＯＤ）であり、細胞外体液において見いだされ、細胞外マトリックスに結合する。カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼを含むいくつかの他の重要な抗酸化剤酵素が細胞内に存在することが知られている。細胞外体液および細胞外マトリックスは、これらの酵素を少量しか含まないが、他の細胞外抗酸化剤が存在することが知られている。これらには、アスコルビン酸、尿酸およびα−トコフェロール等のラジカルスカベンジャーおよび脂質過酸化阻害剤が含まれる(Halliwell et al.，Arch．Biochem．Biophys．2 80:1(1990)。細胞外抗酸化剤酵素が比較的欠失していることは、細胞外反応性酸素種がバイオエフェクター分子として機能する可能性を反映するのかもしれない (Halliwell et al.，Arch．Biochem．Biophys．280:1(1990)。また、このような酵素が比較的不全であることにより、細胞外酸化剤のストレスに対する感受性がより高くなるかもしれない。酵素ＥＣ−ＳＯＤは、多くの細胞外局在において低い濃度でしか存在しない。そのインビボにおける生理学的役割はまだ定義されていないが、多くの細胞外局在においてＥＣ−ＳＯＤはＯ₂ ^-のバルクスカベンジャーとしては機能していないと考えられている。上で示されるように、ＥＣ−ＳＯＤは、サブユニット分子量３０，０００の四量体Ｃｕ／Ｚｎ含有糖蛋白質である(Narklund，Proc．Natl．A cad．Sci．USA 79: 7634(1982); Tibell et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 6634(1987)、またＵＳＰ５，１３０，２４５およびＷＯ９１／０４３１５を参照されたい）。生化学的データは、ＥＣ−ＳＯＤが内皮細胞の硫酸ヘパリンプロテオグリカンに結合することを示唆し、ここで「保護コート」として働くと推定されている（Marklund，J.，Clin．Invest．74: 1398(1984); Karlsson et al .，Biochem．J．255: 223(1988)）。内皮細胞はＯ₂ ^-（Halliwell，Free Radical Res．Commun．5: 315（1989）および内皮由来弛緩因子（推定的に酸化窒素（ＮＯ・）として同定されている）（Noak and Murphy，Oxidative Stress Oxidants and Antioxidants，eds Sites，H.，Academic，San Diego，pp．445-489(1991) ）の両方を分泌する。ＮＯ・は血管制御剤および神経伝達の制御剤として機能する（Schuman and Madison，Science 254: 1503(1991)）。しかし、ＮＯ・は、場合によっては神経細胞に対して毒性を有する（Dawson et al.，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 88: 6368(1991)）。Ｏ₂ ^-はＮＯ・誘導血管緊張低下を不活性化することが知られている（Gryglewski et al．Nature 320: 454(1986) ; Rubanyi and Vanhoutte，Am．J．Physiol．250: H822(1986); Rubanyi and Va nhoutte，Am．J．Physiol．250: H815(1986); Bult et al.，Br．J．Pharmacol ．95: 1308(1988); Nucci et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85: 2334(1988 )）。したがって、ＥＣ−ＳＯＤの可能な機能は、細胞から放出されたＮＯ・をＯ₂ ^-介在不活性化から防御することである。Ｏ₂ ^-のＮＯ・との反応はまた、ペルオキシ亜硝酸塩アニオン（ＯＮＯＯ^-）の形で潜在的に毒性の中間体を生成することが知られている（Beckman et al.，Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 87: 1620(1990); Mulligan et al.，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 88: 6338(1991); Hogg et al,．Biochem．J．281: 419(1992); Ma theis et al.，Am．J．Physiol．262: H616(1992)）。したがって、ＥＣ−ＳＯＤはまたＯＮＯＯ^-の形成を防止する機能を有しているかもしれない。驚くべきことに、ＥＣ−ＳＯＤが中枢神経系のＯ₂毒性を増大させ（減少させるのではなく）、このＥＣ−ＳＯＤの効果がＮＯ・の調節を通じて生ずることが見いだされた。この結果は、ＮＯ・がＯ₂毒性における重要な媒介物質であることを暗示する。したがって、本発明は、細胞外抗酸化剤の使用を含む酸化窒素の機能を繰る方法に関する。これらの方法は、炎症等の、酸化的ストレスが役割を果たしている種々の疾患および非疾患状態において応用することができる。より広い意味においては、本発明は一般に、Ｏ₂ ^-が関与する細胞内および細胞外プロセスを調節する方法に関する。発明の概要本発明は、スーパーオキシドラジカルの細胞内または細胞外レベルを調節する方法に関する。より詳細には、本発明は、例えば低分子量ＳＯＤ模倣物を用いることにより、スーパーオキシドラジカルが関与する正常または病理学的なプロセスを調節する方法に関する。１つの態様においては、本発明は、窒素含有大環状成分および細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分またはその薬学的に許容しうる塩を含むスーパーオキシドディスムターゼの模倣物に関する。［・・・］の量のＳＯＤ（例えばＥＣ−ＳＯＤ）の活性および組織特異性を有する化合物を、治療が達成されるような条件下で［・・・］。別の態様においては、本発明は、そのような治療を必要とする患者において炎症性状態を治療する方法に関し、この方法は、患者に有効量のＳＯＤ（例えばＥＣ−ＳＯＤ））の模倣物を、治療が達成されるような条件下で投与することを含む。別の態様においては、本発明は、そのような治療を必要とする患者において異常な平滑筋機能により生じた疾患を治療する方法に関し、この方法は、患者に有効量のＳＯＤ（例えばＥＣ−ＳＯＤ））の模倣物を、治療が達成されるような条件下で投与することを含む。さらに別の態様においては、本発明は、ＳＯＤの溶解性模倣物および標的化ＳＯＤ模倣物に関し、特にそれに結合したＧＡＧ結合成分を有するＥＣ−ＳＯＤの模倣物に関する。別の態様においては、本発明は単離されたＥＣ−ＳＯＤ遺伝子配列、またはその部分に関する。本発明の目的および利点は、以下の記載により明らかとなるであろう。図面の簡単な説明図１は、トランスジェニックマウスを作成するために用いられたＥＣ−ＳＯＤ発現ベクターを示す。トランスジェニックマウスは、［・・・］。図２は、トランスジェニックマウスからの組織のノザン分析を示す。トランスジェニックマウスの組織からの総ＲＮＡ２０μｇをグロキサール（ｇｌｏｘａｌ）で変性させ、１．２％アガロースゲル中で電気泳動し、ニトロセルロース上にブロットした。全長ヒトＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡでフィルターを探索した。２．５Ｋｂのバンドは、１Ｋｂの介在配列を含むヒトＥＣ−ＳＯＤトランスジンのｍＲＮＡに対応する（図１を参照のこと）。１．５Ｋｂのバンドは、ヒトＥＣ−ＳＯＤトランスジンの完全にプロセシングされたｍＲＮＡに対応する。図３は、６ＡＴＡの酸素に２５分間暴露されたトランスジェニックおよび非トランスジェニックマウスの生存率（％）を示す。マウスには、圧縮（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）の１０分前に、生理食塩水を注入するかまたはＮ−ω−ニトロ− Ｌ−アルギニン（ＬＮＮＡ）２０ｍｇ／ｋｇを投与した（ｉｐ）。圧縮の５５分前に、生理食塩水中のジエチルジチオカルバメート（ＤＤＣ）４００ｍｇ／ｋｇを注入した（ｉｐ）。ボンフェロニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）補正を含むχ²により検定して、生理食塩水処理トランスジェニックマウスと比較して、＊ｐ＜０．０１７であった。図４は、６ＡＴＡの酸素に暴露されたトランスジェニックおよび非トランスジェニックマウスにおける、最初の急発作の開始の時間を示す。マウスには、圧縮の開始の１０分前に、生理食塩水を注入するかまたはＮ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（ＬＮＮＡ）２０ｍｇ／ｋｇを投与した（ｉｐ）。圧縮の５５分前に、ジエチルジチオカルバメート（ＤＤＣ）４００ｍｇ／ｋｇを注入した（ｉｐ）。結果は、チャンバが６ＡＴＡに到達したときを時間０として、最初の急発作の時間の平均±Ｓ．Ｄ．として表される。シェッフェ（Ｓｃｈｅｆｆｅ）Ｆ−検定を用いる分散の分析により検定して、生理食塩水処理非トランスジェニックマウスと比較して、＊ｐ＜０．０５であった。図５は、６ＡＴＡ酸素中３０分間の生存に及ぼすジエチルジチオカルバメートおよびβ−メルカプトエタノールの影響を示す。圧縮の５５分前に、（Ｃ５７ＢＬ／６ＸＣ３Ｈ）Ｆ１マウスに、生理食塩水、生理食塩水中のβ−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）１８０ｍｇ／ｋｇもしくはジエチルジチオカルバメート（ＤＤＣ）４００ｍｇ／ｋｇを注入した（ｉｐ）。ボンフェロニ補正を含むχ² により検定して、生理食塩水処理マウスと比較して、＊ｐ＜０．０２５であった。図６は、生理食塩水またはＮ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（ＬＮＮＡ）２０ｍｇ／ｋｇ、またはＮ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン２０ｍｇ／ｋｇ＋Ｌ− アルギニン５０ｍｇ／ｋｇ（ＬＮＮＡ＋Ｌ−Ａｒｇ）で処理した後に、６ＡＴＡの酸素に暴露された野生型マウスにおける急発作潜伏期を示す。対スチューデントｔ−検定を用いる分散の分析により検定して、生理食塩水処理マウスと比較して、＊ｐ＜０．０５であった。図７は、６ＡＴＡの酸素に暴露された野生型マウスの生存率（％）を示す。マウスには、圧縮の１５分前に、通常の生理食塩水（０．００８ｃｃ／ｇ）またはＮ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（ＬＮＮＡ）２０ｍｇ／ｋｇ（０．００８ｃｃ／ｇ）を注入した（ｉｐ）。マウスを６ＡＴＡの酸素に２０分間（ｎ＝１０，生理食塩水のみ）、２５分間（ｎ＝１０，両方の群）、３０分間（ｎ＝１０，生理食塩水のみ）、５０分間（ｎ＝６，ＬＮＮＡのみ）、７５分間（ｎ＝１２，ＬＮＮＡのみ）、９０分間（ｎ＝１４，ＬＮＮＡのみ）、１０５分間（ｎ＝６，ＬＮＮＡのみ）および１２０分間（ｎ＝６，ＬＮＮＡのみ）暴露し、それぞれの群について生存率を測定した。図８は、Ｎ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（ＬＮＮＡ）についての生存率の用量依存曲線を示す。野生型マウスに、圧縮の１５分前に、通常の生理食塩水（０．００８ｃｃ／ｇ）または０、２、１０、２０または３０ｍｇ／ｋｇのＬＮＮＡ（０．００８ｃｃ／ｇ）を注入し（ｉｐ）、次に６ＡＴＡの酸素に７５分間暴露した。それぞれの処理群について生存率（％）を計算した。図９は、生理食塩水、Ｎ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（ＬＮＮＡ）２０ｍｇ／ｋｇ、またはＮ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン２０ｍｇ／ｋｇ＋Ｌ−アルギニン５０ｍｇ／ｋｇ（ＬＮＮＡ＋Ｌ−Ａｒｇ）で前処理した後に６ＡＴＡの酸素に７５分間暴露された野生型マウスの生存率（％）を示す。ボンフェロニ補正を含むχ²検定により検定して、＊ｐ＜０．０５であった。図１０は、６ＡＴＡの酸素に７５分間暴露されたトランスジェニックまたは非トランスジェニックマウスの生存率（％）を示す。マウスには、圧縮の１０分前に、生理食塩水を注入するかまたはＮ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（ＬＮＮＡ）２０ｍｇ／ｋｇを投与した（ｉｐ）。χ²検定により検定して、生理食塩水処理した非トランスジェニックマウスと比較して＊ｐ＜０．０５であった。また、 χ²検定により検定して、生理食塩水処理したトランスジェニックマウスと比較して†ｐ＜０．０５であった。図１１は、ＥＣ−ＳＯＤトランスジェニックマウスにおける浮腫形成と、右大脳半球に寒冷誘導障害を生じさせた後の非トランスジェニック同腹仔、ならびに非障害マウスににおける浮腫形成の比較を示す。値は、平均±標準誤差で示される。対スチューデントｔ−検定を用いて、それぞれの非トランスジェニック対照の浮腫指数（ＥｄｅｍａＩｎｄｅｘ）と比較して、＊ｐ＜０．０５であった。図１２は、寒冷誘導脳障害を生じさせた後の、血管透過性の変化に及ぼすＥＣ −ＳＯＤレベルの増加の影響を示す。血管透過性は、非トランスジェニックマウス（対照）およびＥＣ−ＳＯＤトランスジェニックマウスの障害右大脳半球におけるエバンスブルー漏出として示される。図１３は、抗体の特異性を示すためのｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤおよびヒト肺ホモジネートのウエスタンブロット分析を示す。１０％，０．７５ｍｍＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで蛋白質を分離し、ニトロセルロースに移した。蛋白質を組換えヒトＥＣ−ＳＯＤに対する抗体（４．３μｇ／ｍｌ）とハイブリダイズさせ、¹²⁵Ｉ−プロテイン−Ａとのハイブリダイゼーションおよび続くオートラジオグラフィーにより抗体を検出した。ＥＣ−ＳＯＤのレーンは、純粋な組換えヒトタイプＣＥＣ−ＳＯＤ蛋白質０．０５μｇを含む。肺レーンは、ヒト肺ホモジネートの２０，０００×ｇの上清１０μｇを含む。図１４Ａ−１４Ｃは、光学顕微鏡によるヒト肺におけるＥＣ−ＳＯＤの免疫組織化学的局在性を示す。組換えヒトＥＣ−ＳＯＤに対する抗体（５．４ｍｇ／ｍ１；抗ＥＣ−ＳＯＤ）またはＣＮＢｒ−セファロースに結合させた精製組換えＥＣ−ＳＯＤを用いて抗ＥＣ−ＳＯＤＩｇＧを吸着除去した同一の抗体（ＥＣ− ＳＯＤ吸着）を用いて組織を標識した。抗体はビオチン／ストレプトアビジン− セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識技術を用いて検出した。Ａ：抗ＥＣ−ＳＯＤで標識した大弾性肺動脈。内皮の下および血管の弾性層の下の平滑筋の周辺の標識（短い矢印）、および内皮細胞表面（白抜き矢印）およびエラスチン（長い矢印）におけるＥＣ−ＳＯＤの標識の欠失に注目されたい。Ｂ：抗ＥＣ−ＳＯＤで標識した筋肺動脈。血管およびリンパ管を取り囲む結合組織マトリックス（長い矢印）および平滑筋細胞を取り囲むマトリックス（短い矢印）における多量の標識、ならびに内皮細胞表面における標識の欠失（白抜き矢印）に注目されたい。Ｃ：ＥＣ−ＳＯＤ吸着抗血清で標識した筋肺動脈。抗ＥＣ−ＳＯＤＩｇＧの吸着は、筋血管のすべての標識を消失させた。（バー＝５０μｍ）。図１５Ａ−１５Ｃは、ヒト肺におけるＥＣ−ＳＯＤの免疫組織化学的局在性を示す。組換えヒトＥＣ−ＳＯＤに対する抗体（５．４ｍｇ／ｍｌ；抗ＥＣ−ＳＯＤ）を用いて組織を標識した。抗体はビオチン／ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識技術を用いて検出した。Ａ：抗ＥＣ−ＳＯＤで標識した大軟骨性気道。平滑筋の周辺のマトリックス（短い矢印）および上皮細胞の間（長い矢印）におけるＥＣ−ＳＯＤの強い標識、ならびに上皮細胞表面（白抜き矢印）および軟骨のマトリックス（アスタリスク）における標識の欠失に注目されたい。Ｂ：抗ＥＣ−ＳＯＤで標識した非軟骨性気道。上皮の下のマトリックス全体における強いＥＣ−ＳＯＤ標識（短い矢印）および上皮の表面における標識の欠失（白抜き矢印）に注目されたい。Ｃ：抗ＥＣ−ＳＯＤで標識した肺実質。ＥＣ−ＳＯＤ標識は、主として肺胞中隔先端（短い矢印）および小血管を取り囲むマトリックス中（長い矢印）に認められる。肺胞上皮細胞の表面ではＥＣ− ＳＯＤの標識は認められなかった（白抜き矢印）。（バー＝５０μｍ）。図１６Ａ−１６Ｃは、電子顕微鏡による血管結合組織におけるＥＣ−ＳＯＤの免疫局在性を示す。組換えヒトＥＣ−ＳＯＤに対する抗体（４０μｇ／ｍｌ；抗ＥＣ−ＳＯＤ）またはＣＮＢｒ−セファロースに結合させた精製組換えＥＣ−ＳＯＤを用いて抗ＥＣ−ＳＯＤＩｇＧを吸着除去した後の同一の抗体（ＥＣ−ＳＯＤ吸着）を用いて組織を標識した。抗体は１０ｎｍのプロテイン−Ａゴールドを用いて検出した。Ａ：抗ＥＣ−ＳＯＤで標識した血管コラーゲン。Ｂ：抗ＥＣ −ＳＯＤで標識した血管エラスチン。Ｃ：ＥＣ−ＳＯＤ吸着抗血清で標識した血管コラーゲン。タイプＩコラーゲンに付随するＥＣ−ＳＯＤの強い標識およびエラスチン（Ｅ）に付随する標識の欠失に注目されたい。さらに、抗ＥＣ−ＳＯＤ抗体の吸着は、タイプＩコラーゲンに付随するすべてのＥＣ−ＳＯＤ標識を消失させた。（バー＝２００ｎｍ）。図１７は、電子顕微鏡による血管平滑筋の周辺のＥＣ−ＳＯＤの免疫局在性を示す。組換えヒトＥＣ−ＳＯＤに対する抗体（４０μｇ／ｍｌ）を用いて組織を標識した。抗体は１０ｎｍのプロテイン−Ａゴールドを用いて検出した。血管平滑筋細胞（Ｓ）の周辺の結合組織マトリックス（短い矢印）においてタイプＩコラーゲンに付随して、および他の未同定マトリックス要素（長い矢印）において高程度の標識が認められた。（バー＝２００ｎｍ）。図１８Ａ−１８Ｂは、電子顕微鏡による肺内皮細胞表面におけるＥＣ−ＳＯＤの免疫局在性を示す。組換えヒトＥＣ−ＳＯＤに対する抗体（４０μｇ／ｍｌ）を用いて組織を標識した。抗体は１０ｎｍのプロテイン−Ａゴールドを用いて検出した。Ａ：小筋肺動脈からの内皮細胞。Ｂ：肺毛管からの内皮細胞。内皮細胞の表面にはＥＣ−ＳＯＤの標識は認められなかった（短い矢印）。ＥＣ−ＳＯＤは血漿（Ｐ）に認められ、内皮細胞の下の細胞外マトリックス蛋白質に伴っていた。（バー＝２００ｎｍ）。図１９は、電子顕微鏡による気管上皮細胞の周辺におけるＥＣ−ＳＯＤの免疫局在性を示す。組換えヒトＥＣ−ＳＯＤに対する抗体（４０μｇ／ｍｌ）を用いて組織を標識した。抗体は１０ｎｍのプロテイン−Ａゴールドを用いて検出した。ＥＣ−ＳＯＤは上皮細胞の間の連結部において認められ（矢印）、細胞内においてもある程度認められた。（バー＝２００ｎｍ）。図２０Ａ−２０Ｄは、ヒトＥＣ−ＳＯＤクローン＃７の部分的制限酵素地図、シークエンシング方法、ゲノム構造、および蛋白質構造を示す。図２０Ａ：ヒトＥＣ−ＳＯＤゲノムクローン＃７の部分的制限酵素地図が５’から３’方向に示されている。１ｋｂのサイズマーカーが示されている。Ｂ：ＢａｍＨＩ；Ｈ：ＨｉｎdIII；Ｐ：ＰｓｔＩ；Ｓ：ＳａｌＩ；Ｋ：ＫｐｎＩ；Ｅ：ＥｃｏＲＩ。図２０Ｂにおいては、サブクローニングおよびシークエンシングの方法が示されている。ＤＮＡシークエンシング分析のために、種々のサイズの重なり合う制限酵素フラグメントをプラスミドベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）にサブクローニングした。すべてのＤＮＡは、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ）および二本鎖ＤＮＡ鋳型を用いて両方の鎖をシークエンシングした。ただし、３’の７Ｋ３６フラグメントの約２ｋｂについては１方向のみシークエンシングした。図２０Ｃにおいては、ヒトＥＣ−ＳＯＤ遺伝子のエクソン／イントロン構造が示されている。エクソン３中のｐｒｅＥＣ−ＳＯＤのコーディング領域の位置が破線で示されている。図２０Ｄにおいては、ヒトＥＣ−ＳＯＤ蛋白質の４つの構造ドメインが図示されている。シグナルペプチドが矢印で示される。この後に成熟グリコシル化（ＣＨＯ）アミノ末端ペプチドドメインがある。第３の領域は、ヒトＣｕＺｎ−ＳＯＤと非常に高いアミノ酸配列相同性を有する。カルボキシ末端ドメインは、多価荷電塩基性残基（＋）を有し、これはヘパリングリコサミノグリカンへの結合に重要である。図２１Ａ−２１Ｂは、ＥＣ−ＳＯＤのヒトの多数の組織のノザンブロットを示す。図２１Ａ：８つの異なるヒト組織からのポリＡ（＋）ｍＲＮＡ２μｇを変性アガロースゲル上で電気泳動し、帯電ナイロン膜に移し、［³²Ｐ］−標識アンチセンスヒトＥＣ−ＳＯＤｃＲＮＡで探索した。ＲＮＡ分子量マーカー（ｋｂ）が右に示される。臭化エチジウム染色により定量的移動をモニターした。結果は、試験した８つすべての組織においてユニークな１．４ｋｂｍＲＮＡが存在することを示した。興味深いことに、骨格筋は約４．２ｋｂの第２の長いｍＲＮＡを示し、脳は約２．２ｋｂの弱いバンドを示した。図２１Ｂにおいては、レーザー密度走査によりＥＣ−ＳＯＤｍＲＮＡに対応するバンドを定量し、１．４ｋｂの脳のバンドに標準化して、相対的吸収単位で表している。図２２Ａ−２２Ｂは、転写開始部位の分析を示す。ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（５’ＲＡＣＥ）技術を用いて、ヒトＥＣ−ＳＯＤ遺伝子の転写開始部位を同定した。図２２Ａにおいては、種々のオリゴヌクレオチドについてのアニーリング部位が図示されている。濃い線は、ＥＣ７（ＥＣ−ＳＯＤ遺伝子特異的プライマー）でプライミングされ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いてポリＣテイルを付された、ヒト心臓ポリＡ（＋）ｍＲＮＡの第１鎖逆転写ｃＤＮＡを示す。ＨＥＣ１，ＨＥＣ２，ＥＣ４およびＥＣ７は、５’ ヒトＥＣ−ＳＯＤ遺伝子特異的プライマーである。アンカープライマーは５’ＲＡＣＥキット（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）とともに供給され、これをポリＣテイルにハイブリダイズさせた。図２２Ｂにおいては、ＰＣＲを用いて、［アンカー＋ＥＣ４］または［ＨＥＣ１＋ＥＣ７］をプライマーとして、ポリＣテイルｃＤＮＡ（＋ＴｄＴ，レーン１＆４）または非ポリＣテイル（−ＴｄＴ，レーン２＆５）ｃＤＮＡのいずれかを鋳型として用いて、ＤＮＡのセグメントを増幅した。レーン３は、［ＨＥＣ１＋ＥＣ７］をプライマーとして、完全長ヒトＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡを含む。得られた増幅ＤＮＡを２％アガロースゲル上で電気泳動し、帯電ナイロン膜に移し、５’組重ね（ｎｅｓｔｅd）遺伝子特異的ＥＣ−ＳＯＤプライマーである［³²Ｐ］−標識ＨＥＣ２で探索した。ＤＮＡ分子量マーカーは、レーン２と３との間に流した。レーン３、４および５におけるＰＣＲ増幅領域の予想されるサイズは２１７ｂｐである。レーン１には分子サイズ約１８５から２００ｂｐの単一のバンドのみが認められた。図２３は、ヒトＥＣ−ＳＯＤ遺伝子のゲノムサザンブロット分析を示す。ヒトゲノムＤＮＡ１０μｇを示されるそれぞれの制限酵素で完全に消化し、１％アガロースゲル上で電気泳動し、帯電ナイロン膜に移した。このブロットを、最初の約１０５０ヌクレオチドに対応する［³²Ｐ］−標識ＥＣ−ＳＯＤ部分長ｃＲＮＡで探索し、オートラジオグラフィーを行った。特定の制限酵素はそれぞれのレーンの上に示される。ＤＮＡ分子量マーカー（ｋｂ）は右に示される。図２４は、ヒトＥＣ−ＳＯＤ遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。ヒト遺伝子の完全なヌクレオチド配列が示されている。シグナルペプチドおよび成熟蛋白質の推定アミノ酸配列は、１文字アミノ酸コードを用いて表示されている。図２５は、ＭｎＴＢＡＰによるキサンチンオキシダーゼの非競合的阻害のＬｉｎｅｗｅｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す。図２６は、ＭｎＴＢＡＰによる肺動脈内皮細胞のキサンチンオキシダーゼ誘導図２７は、ＳＯＤ模倣物のパラコート誘導障害に対する肺上皮細胞の防御を示す。図２８は、ＭｎＴＢＡＰによる肺動脈内皮細胞のパラコート誘導障害に対する防御を示す。図２９は、ＺｎＴＢＡＰによる肺動脈内皮細胞のパラコート誘導障害に対する防御の欠失を示す。図３０は、パラコート誘導肺障害に対するＭｎＴＢＡＰの防御を示す。発明の詳細な説明本発明は、スーパーオキシドラジカルの有害な影響に対する防御方法ならびに酸化剤ストレスに関連するかまたはそれに起因する疾患状態を予防または治療する方法に関する。本発明はまた、スーパーオキシドラジカルが関与する生物学的プロセスを調節する方法に関する。さらに本発明は、このような方法において用いるのに適当なＳＯＤの低分子模倣物等の化合物および組成物ならびにそれらの処方に関する。本発明の方法において用いるのに適当なＳＯＤ模倣物には、メチン置換ポルフィンのマンガン誘導体またはその薬学的に許容しうる塩が含まれる。好ましい模倣物は次の式のものである：式中、ここで、Ｘはハロゲンであり、Ｙはアルキル基であり、Ｒ₂は、結合、−（ＣＹ'₂）_n ^-、−（ＣＹ'₂−ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^-、−（ＣＹ'₂− ＣＹ'₂−ＣＨ＝ＣＨ）_n ^-、−（ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^- または１から８であり；Ｒ₃は、結合、水素、−Ｙ"、−ＯＨ、−ＮＨ−、−Ｎ⁺（Ｙ"）₃、−ＣＯＯ−、 −ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃−、−ＳＯ₃ ^-、−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ−または−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ^-であり、ここでＹ"はアルキル基であり；そしてＲ₄は、存在しないか、または、水素、細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分またはリンカー−細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分（ここで「リンカー」とは模倣コア（ポルフィリン環およびＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃）を標的化成分に連結する成分である）である。より具体的な態様においては、式中、ＸはＣｌまたはＢｒであり、ＹはＣ_1-4のアルキル基であり；Ｒ₂は、結合、−（ＣＹ'₂）_n ^-、−（ＣＹ'₂−ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^-、−（ＣＹ'₂− ＣＹ'₂−ＣＨ＝ＣＨ）_n ^-、−（ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^- またはｎは１から４であり；Ｒ₃は、結合、水素、−Ｙ"、−ＯＨ、−ＮＨ−、−Ｎ⁺（Ｙ"）₃、−ＣＯＯ−、 −ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃−、−ＳＯ₃ ^-、−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ−または−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ^-であり、ここでＹ"はＣ_1-4のアルキル基であり；そしてＲ₄は、存在しないか、または、水素、細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分またはリンカー−細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分である。さらにより具体的な態様においては、式中、ＸはＣｌまたはＢｒであり、Ｙはメチルまたはエチルであり；Ｒ₂は、結合、−（ＣＹ'₂）_n ^-、−（ＣＹ'₂−ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^-、−（ＣＹ'₂− ＣＹ'₂−ＣＨ＝ＣＨ）_n ^-、−（ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^- またはり、ｎは１または２であり；Ｒ₃は、結合、水素、メチル、エチル、−ＯＨ、−ＮＨ−、−Ｎ⁺（ＣＨ₃）₃、− Ｎ⁺（ＣＨ₂ＣＨ₃）₃、−ＣＯＯ−、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃−、−ＳＯ₃ ^-、−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ−または−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ^-であり；そしてＲ₄は、存在しないか、または、水素、細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分またはリンカー−細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分である。別の具体的な態様においては、式中、Ｙはアルキル、好ましくはＣ_1-4のアルキル、より好ましくはメチルまたはエチルであり；Ｒ₂は、結合、−（ＣＹ'₂）_n ^-、−（ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^-、または _-4のアルキル、より好ましくはメチルまたはエチル）であり、ｎは１から４（好ましくは１または２）であり；Ｒ₃は、結合、水素、Ｃ_1-4のアルキル（好ましくはメチルまたはエチル）、−ＯＨ、−ＮＨ−、−Ｎ⁺（ＣＨ₃）₃、−Ｎ⁺（ＣＨ₂ＣＨ₃）₃、−ＣＯＯ−、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃−、−ＳＯ₃ ^-、−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ−または−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ^-であり；そしてＲ₄は、存在しないか、または、水素、細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分またはリンカー−細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分である。さらに別の具体的な態様においては、Ｒ₂は、結合、−（ＣＹ'₂）_n ^-または−（ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^- であり、ここでＹ' は水素またはアルキル（好ましくはＣ_1-4のアルキル、より好ましくはメチルまたはエチル）であり、ｎは１から４（好ましくは１または２）であり；Ｒ₃は、結合、水素、Ｃ_1-4のアルキル（好ましくはメチルまたはエチル）、−ＯＨ、−ＮＨ−、−Ｎ⁺（ＣＨ₃）₃、−Ｎ⁺（ＣＨ₂ＣＨ₃）₃、−ＣＯＯ−、−ＣＯＯ^-、−ＳＯ₃−、−ＳＯ₃ ^-、−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ−または−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ^-であり；そしてＲ₄は、存在しないか、または、水素、細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分またはリンカー−細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分である。上述の置換基に加え、ポルフィリンの１つまたはそれ以上のピロール環が、脱電子（ｅｌｅｃｔｒｏｎｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ）基、例えばＮＯ₂基、ハロゲン（例えばＣｌ）またはニトリルで置換されていてもよい。本発明の方法において用いるのに適当な特定の模倣物には、Ｍｎ（III）テトラキス（１−メチル−４−ピリジル）ポルフィリン（ＭｎＴＭＰｙＰ）、Ｍｎ（ III）テトラキス（４−トリメチル−アミノフェニル）ポルフィリン（ＭｎＴＭＡＰ）およびＭｎ（III）テトラキス（４−安息香酸）ポルフィリン（ＭｎＴＢＡＰ）が含まれ、これらはＲ₄位に、細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分またはリンカー−細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分を有していてもよく、有していなくてもよい。上述の模倣物はマンガンキレートとして記載されているが、マンガン以外の金属、例えば鉄（III）および銅（Π）を用いることもできる。本発明はまた、金属フリー窒素含有大環状リガンドに関する。模倣物の標的化形態は、上述のＲ₄の定義において示されるように、細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分に直接もしくはリンカーを介してカップリングすることにより製造することができる。標的化模倣物を用いてＥＣ−ＳＯＤを模倣することができる。ヒトＥＣ−ＳＯＤの配列は知られている（Hjalmars son et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 6340(1987)）ため、Ｃ末端オリゴペプチドを製造し、例えば遊離アミンまたはカルボキシ基と１−エチル−３− （３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とのカップリング反応を介して、「模倣物コア」（例えばＭｎ（III）−ポルフィリン）に結合させることができる（Yamada et al.，Biochemistry 20: 4836(1981); Davis and Pr eston，Anal．Biochem．116: 402(1981)）（下記の構造におけるＲ’基に注意されたい）。この簡単なカップリング方法により、ＥＣ−ＳＯＤ模倣物を標的化するために広範な種類の異なる結合ドメインを結合させることができる。模倣物のヘパリン結合親和性は、模倣物をヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラムに通すことにより評価することができる（Karlsson et al.，Biochem．J．256: 29(1 988)）。ＳＯＤ（例えばＥＣ−ＳＯＤ）模倣物に結合させてＧＡＧ結合特性を与えるのに適当な標的成分の候補としては次のものが挙げられる：ｉ）プロテインＣ阻害剤のＡ＋ヘリックス（Boissinot et al.，Biochem．Bio phys．Res．Commun．190: 250(1993)）−ＮＨ₂−Ｈis Ａrg Ｈis Ｈis Ｐro Ａr g Ｇlu Ｍet Ｌys Ｌys Ａrg Ｖal Ｇlu Ａsp Ｌeu−ＣＯＯＨ； ii）ヒトＥＣ−ＳＯＤのＣ末端（ヘパリン結合ドメイン）（Karlsson et al. ，Biochem．J．255: 223(1988)）−ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌy s Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ｇlu Ｓer Ｇlu Ｃys Ｌys Ａla Ａla−ＣＯＯＨ； iii）ヘパリン結合親和性を有するヒトＥＣ−ＳＯＤのＣ末端の変異体（Sandst rom et al.，J．Biol．Chem．267: 18205(1992)）ａ．ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ｇlu− ＣＯＯＨ；ｂ．ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ａla− ＣＯＯＨ；ｃ．ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ａla Ｓer Ｇlu Ｃys Ｌys Ａla Ａla−ＣＯＯＨ；ｄ．ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ｇlu Ｓer Ｇlu Ａla Ｌys Ａla Ａla−ＣＯＯＨ；ｅ．ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ｇlu Ｓer Ｇlu Ｃys Ａla Ａla Ａla−ＣＯＯＨ；ｆ．ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ａla Ｓer Ａla Ｃys Ｌys Ａla Ａla−ＣＯＯＨ；ｇ．ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ａla Ｓer Ｇlu Ｃys Ａla Ａla Ａla−ＣＯＯＨ；ｈ．ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ｇly Ａrg Ａrg Ａla Ｓer Ｇlu Ｃys Ａla Ａla Ａla−ＣＯＯＨ； iv）正に帯電したアミノ酸の繰り返しの任意の組み合わせ（すなわち、ポリ（Ａrg）_n、ポリ（Ｌys）_n、ポリ（Ａrg）_n（Ｌys）_nまたはポリ（ＡrgLyS）_nまたはポリ（ＬysＡrg）_n、ポリ（ＬysＬysＡrgＡrg）_n［式中、ｎは、好ましくは１から１２の範囲であり、より好ましくは１から８であり、最も好ましくは１から６であり、Ｃ末端のＧ1uまたはＡlaを有していても有していなくてもよい］（Sandstrom et al.，J．Biol．Chem．267: 18205(1992)）；およびｖ）ポリエチンイミン、例えば（ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ）_nＨ［式中、ｎは１から６である］。上述に加え、標的化成分はまた一般にヘパリン結合蛋白質および糖（マンノースおよびオリゴ糖を含む）を含有していてもよい。適当なリンカーとしては、適当なＳＯＤ（例えばＥＣ−ＳＯＤ）模倣物の特定の例は、以下のものである：本発明の使用に適した模倣物はＳＯＤ活性および安定性をアッセイすることにより選択できる。ＳＯＤ活性はＭｃＣｏｒｄおよびＦｒｉｄｏｖｉｃｈ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４（１９６９））の方法を用いてＥＤＴＡ存在下および不在下でモニターできる。模倣物の効力は、ＳＯＤを持たない大腸菌株に対する野生型株の増殖についての模倣物の影響を測定することにより決定できる。具体的には、野生型大腸菌（ＡＢ１１５７）およびＳＯＤを持たない大腸菌株（ＪＩ１３２）は０．２％カザミノ酸および０．２％グルコースを含むＭ９培地、ｐＨ７．０および３７℃で増殖させることができ；増殖は分光光度計で７００ｎｍでの濁度によりモニターできる。活性な模倣物は乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を測定することにより哺乳類細胞培養物での毒性について試験できる。具体的には、ラットＬ２細胞（肺型II様細胞；（ＫａｉｇｈｎおよびＤｏｕｇｌａｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５９：１６０ａ（１９７３））を１０％ウシ胎児血清を加えたＨａｍＦ−１２培地、ｐＨ７．４および３７℃で増殖させることができ；細胞は２４ウェル培養皿に等しい密度で播種して約９０％コンフルエントまで増殖し；ＳＯＤ模倣物を対数用量で（例えば、最少必須培地中にマイクロモル量で）細胞に加え、２４時間インキュベートすることができる。毒性は形態学により、およびＶａｓｓａｕｌｔ（ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓｉ、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ編、ｐｐ．１１８−２６（１９８３）；ＮＡＤＨの酸化は３４０ｎｍで測定される）により記載されているごとく細胞質障害マーカー、ＬＤＨ（例えば、熱速度プレートリーダー上で）の放出を測定することにより評価できる。活性模倣物の効力はメチルビオローゲン（パラコート）−誘導毒性に対して哺乳類細胞を保護する能力を決定することにより評価できる。具体的には、上記のように増殖させ２４ウェル皿に播種されたラットＬ２細胞を種々の濃度のＳＯＤ模倣物と前もってインキュベートした後、対照Ｌ２細胞でＬＣ₇₅を生みだすことが前もって示されたメチルビオローゲン濃度でインキュベートできる。模倣物の効力はメチルビオローゲン−誘導ＬＤＨ放出の減少と相関するであろう（Ｓｔ．Ｃｌａｉｒｅｔａｌ，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２９３：１９９（１９９１））。ＳＯＤ模倣物の効力はマウスおよび／またはラットモデルにおいてエアロゾール投与および非経口投与を用いてインビボで試験できる。例えば、オスＢａｌｂ／ｃマウスを各々が標準２ｘ２分割統計モデルを形成するように８匹の４群に無作為化できる。動物はパラコート（４０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内）かまたは食塩水で処理し、ＳＯＤ模倣物または対照担体で処理した。肺障害はパラコート処置４８時間後、従来報告されているように（Ｈａｍｐｓｏｎｅｔａｌ，Ｔｏｘ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍ．９８：２０６（１９８９）；Ｄａｙｅｔａｌ，Ｊ．Ｐｈｒｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２４：１（１９９０））気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）損傷パラメーター（ＬＤＨ、蛋白質および％ＰＭＮ）の分析により評価できる。各々の群の２匹のマウスからの肺は４％パラホルムアルデヒドで点滴注入固定でき、光学顕微鏡レベルで組織病理学用に処理された。本発明の使用に適した模倣物の合成は本分野で認められているプロトコールを用いて達成できる。Ｍｎ（III）−ポルフィリン模倣物の場合、種々のメチン架橋炭素側鎖を持つポルフィリン環は市販品として購入でき、以下の方法によりポルフィリン環内にＭｎ（III）金属イオンが挿入される：（１）酸素存在下Ｍｎ（II）酢酸塩とポルフィリンを混合する、そのような条件下ポルフィリンによるＭｎ（III）の選択的安定化によりＭｎ（II）が自動酸化される；（２）Ｗｉｎｋｌｅｒ法（Ｓａｓｔｒｙｅｔａｌ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４１：８５７（１９６９）の改良法によりＭｎ（III）（ＯＨ）₃を製造し、続いてポルフィリンと反応させる；（３）ＮＨ₂ＯＨの存在下ＭｎＯ₂とポルフィリンを撹拌する、ＮＨ₂ＯＨはＭｎ（IV）をＭｎ（III）に還元し、それがポルフィリンに捕捉される；または、（４）過剰のＭｎＣｌ₃とポルフィリンを加熱還流するＰａｓｔｅｒｎａｃｋｅｔａｌ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２：２４０６（１９８３））の改良法。Ｍｎ（III）−ポルフィリン錯体は過塩素酸ナトリウムで溶液から沈澱でき、洗浄し残留過塩素酸塩は強陰イオン性交換樹脂で除去される。Ｍｎ（III）−ポルフィリンの生成は特徴的な４６８ｎｍのソレー帯をモニターすることにより分光学的に追跡できる。「模倣体コア」への結合領域の連結は上記のように実施できる。本発明の一つの実施態様は、少なくとも部分的には、ＥＣ−ＳＯＤが特異的にＮＯ・機能を制御するという認識に基づく。さらに、本発明は、ＥＣ−ＳＯＤが上皮細胞により合成され、主として間質中、マトリックス要素およびコラーゲン上および平滑筋細胞（特に、肺気道および脈管系）周辺に局在化しているという認識に基づいている。ＮＯ・は細胞間シグナルであり、そのためＮＯ・がその効果を発揮するには細胞外マトリックスを通過しなければならない。しかしながら、ＮＯ・は細胞外空間に存在するＯ₂ ^-により媒介される不活性化に非常に感受性が高い。従って、ＥＣ−ＳＯＤはＯ₂ ^-によるＮＯ・分解を防止することによりＮＯ・の生物学的利用能を増加させるために理想的に適した酵素である。本発明の一つの実施態様は、ＥＣ−ＳＯＤ活性を持つポリペプチドを用いた細胞外ＮＯ・レベルの制御法に関している。上に指摘したように、本発明はまた戦略的な場所を標的にできるＥＣ−ＳＯＤの模倣物および細胞外ＮＯ・レベルの操作におけるそのような模倣物の使用に関する。しかしながら、本発明は本発明の化合物（模倣物など）の作用の機構としてのＮＯ・操作に制限されるわけではない。むしろ、本発明は酸素ラジカル捕捉に広く関係している。さらに特別の実施態様において、本発明はスーパーオキシドラジカル産生を阻害する方法に関している。この実施例において、本発明のＳＯＤ模倣物はスーパーオキシドラジカルの産生に関係するキサンチンオキシダーゼのようなオキシダーゼの阻害に使用される（実施例VII参照）。キサンチン／キサンチンオキシダーゼー誘導障害から哺乳類細胞を保護する模倣物の能力は、例えば、２４ウェル皿におけるラットＬ２細胞の増殖により評価できる。細胞を種々の濃度のＳＯＤ模倣物と前もってインキュベートした後培養液にキサンチン（Ｘ）とともにキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）を加える。この研究に使用されるＸＯ／Ｘの適当な量は、障害についての用量一応答曲線を作ることにより各々の細胞株に対して前もって決定できる。Ｘ／ＸＯは培養物のほぼＬＣ₇₅を生み出す量で使用することができる。模倣物の効力はＸ／ＸＯ−誘導ＬＤＨ放出の減少と相関するであろう。そのようなラジカルの産生を阻害する本模倣物の能力により、本模倣物を通風の処置および再還流障害のための治療薬として使用することが可能であろう。本発明の模倣物はスーパーオキシドラジカル同様に過酸化水素の捕捉にも使用できる。過酸化水素の捕捉剤として、本模倣物はカタラーゼまたはペルオキシダーゼを模倣する。適当な模倣捕捉剤は過酸化水素存在下２４０ｎｍの吸光度を追跡することにより選択できる（ＢｅｅｒｓおよびＳｉｚｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５：１３３（１９５２）参照）。この活性に基づいた治療には以下に示したものが対応する。本発明の模倣物は心筋梗塞、卒中、急性頭部外傷、移植後の器官再還流、腸虚血、肺梗塞、血流の外科的閉塞および軟組織損傷に付随する虚血再還流に対して保護するためのスーパーオキシドラジカルの触媒的捕捉剤として使用できる。本模倣物はさらに、骨格筋再還流損傷の保護に使用できる。本模倣物はまた日光による眼への（および皮膚への）損傷、ならびに緑内障および眼の黄班変性の保護にも使用できる。骨の疾患もまた本模倣物により処置することができる。さらに、コラーゲン合成または分解の欠陥に付随する結合組織の疾患も本模倣物の処置を受けやすいと予想される。上記のことに加えて、本発明の模倣物は移植された心臓、腎臓、皮膚およびその他の器官および組織の非常に制限された保存生存度を増加させるための触媒的捕捉剤として使用できる。本発明はまた、食品製品、医薬および保存血液などにおいてＯ₂ ^-の生成により生じる物質の自動酸化による損傷を保護する方法を提供する。この目的を達成するためには、酸化的損傷を阻害または防止するために十分な量の本発明の模倣物が食品製品、医薬および保存血液などに添加され、それにより自動酸化反応に付随する分解を阻害または防止する。（本発明の模倣物のその他の使用はＵＳＰ５，２２７，４０５を参照されたい）。特定の処置において使用されるべき、または特定の物質に伴われるべき本模倣物の量は当業者が決定することができる。本発明の模倣物を利用できることによりＯ₂ ^-−媒介過程の研究も可能である。上記のことに加え、本発明はＥＣ−ＳＯＤ遺伝子配列を利用できることにより可能になった診断的プロトコールにも関している（実施例Ｖおよび図２４参照）。ＮＯ・により供給される生理学的機能の性質および数のためＥＣ−ＳＯＤ遺伝子中の欠損は酸化窒素合成酵素の欠損より起こり易いであろう。ＥＣ−ＳＯＤ遺伝子欠損の検出は、ＮＯ・不均衡および酸化的ストレスを含む障害を補正するために戦略上の場所での機能的ＥＣ−ＳＯＤ（または関連するスーパーオキシド捕捉化合物）のレベルを上昇させるための手段を講じる必要があることの信号を発するであろう。細胞外ＮＯ・の効力の調整を達成するには（例えば、平滑筋の弛緩）、ＥＣ− ＳＯＤ活性を持つ分子（試薬）が細胞外Ｏ₂ ^-のレベルが変化を受けるような条件下で投与される。この方法での使用に適した分子には、ヘパリン硫酸塩または他のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に結合するＳＯＤの型が含まれる（例えば、それらがカルボキシ末端近くに陽性に荷電したアミノ酸を含んでいることにより）。本方法で使用するのに適した蛋白質性試薬にはＷＯ９１／０４３１５に記載されているようなＥＣ−ＳＯＤＣ、ならびに組換え体ＥＣ−ＳＯＤＣと比較してヘパリンに対し同じ様なまたは促進された結合性を持つとその中で定義および記載されているその他のポリペプチド型が含まれる（例えば、ポリペプチドＧ１およびＳＡ２１６；また、組換え体ＥＣ−ＳＯＤＣと同じヘパリン結合性を持つポリペプチドＳＡ２１９にも注目されたい）。本方法で使用するのに適した別の蛋白質性試薬には標的化された結合力およびＳＯＤ活性を持つキメラ蛋白質、例えば、ＥＣ−ＳＯＤ結合配列に連結されたＣｕ／ＺｎＳＯＤ（Ｂｏｉｓｓｉｎｏｔｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９０：２５０（１９９３））が含まれる。本方法で使用するのに適した蛋白質性試薬は化学的にまたは本分野で認められているプロトコール（ＷＯ９１／０４３１５参照）を用いた組換えにより合成できる。例えば、非−グリコシル化組換え体ペプチドは、グリコシル化を達成できない宿主細胞（例えば大腸菌細胞）を用いるか、またはグリコシル化部位を欠く機能性蛋白質をコードしているＤＮＡ配列を使用して製造することができる。ポリペプチドに加え、本方法で使用するのに適した分子には上に記載されたものを含むＥＣ−ＳＯＤの模倣物（例えば標的化された模倣物）が挙げられる。そのような模倣物に一般的に必要とされることは：（ａ）それらが生体系に存在する多くのキレート化剤の存在下で結合した金属（例えばＣｕまたはＭｎ）を十分安定に保持していること、（ｂ）合理的な量で細胞外空間での全ＳＯＤ活性を有意に増大させることができるように活性であること、（ｃ）細胞外源Ｏ₂ ^-に対する保護が必要とされるときに細胞表面または細胞外マトリックス要素（例えばコラーゲン）に付着できること、および（ｄ）毒性が低いことである。適した模倣物の例には上記のような（例えば、ＭｎＴＭＡＰおよびＭｎＴＭＰｙＰ）メチン架橋炭素上にかさ高い陽イオン性置換基を持つポルフィリンのＭｎ（III）錯体等の、スーパーオキシドを不均化するための触媒として有効な窒素含有大環状リガンドが含まれる。そのような錯体は非常に活性であり、過剰のＥＤＴＡ存在下、または組織抽出物存在下で全活性を十分に保持できるほど安定である。上記のポリペプチドおよび模倣物は本発明での使用に適した医薬組成物内に処方できる。そのような組成物は活性試薬（ポリペプチドまたは模倣物）とともに医薬として受容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含んでいる。組成物は例えば錠剤、カプセルまたは座剤のような単一剤として存在できる。組成物はまた注射または吸入に適した無菌溶液の形でもよい。組成物はまた眼科的使用に適した形でもよい。本発明はまた、例えばローション、クリーム、ゲルまたは軟膏の形をとる組成物のように局所投与に処方された組成物も含んでいる。組成物に含まれるべき活性試薬の濃度は、試薬の性質、投与計画および考えられる結果に基づいて選択することができる。投与されるべき本発明の組成物の用量は過度の実地実験なしで決定でき、活性試薬の性質、投与経路、患者および達成されるべきと考えられる結果を含む種々の因子に依存するであろう。ＩＶ投与される蛋白質の適した用量は約１０−１０００ｍｇ／日の範囲にあると予期される。局所投与に対しては、より低い用量が必要とされると予期され（ＷＯ９１／０４３１５参照）；エアロゾル投与に対しては、１から１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろうことが予期される。模倣物の適した用量は、例えば、使用する模倣物および考えられる結果で変化するであろう。Ｆａｕｌｋｎｅｒｅｔａｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３４７１（１９９４））の結果は、模倣物のインビボでの酸化還元酵素活性は医薬として有効な用量が毒性の問題を避けるのに十分低いものであるであろうことを示唆している。使用される用量は１から５０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。上記の型の組成物に加え、本発明は遺伝子治療型のプロトコールでの使用に適した組成物を含んでいる。例えば、本発明はＥＣ−ＳＯＤ活性を持つ蛋白質をコードしているＤＮＡ配列を含んでおり、接触により（例えば吸入）細胞（例えば肺細胞）内へ取り込まれるように処方される。配列はベクター（例えばウイルスベクター）中に存在するか、および／または配列はリポソームのような輸送担体中に存在するであろう。投与されるべきそのような組成物の量は当業者により容易に決定される。本発明の化合物および組成物を用いて処置するのに適した疾患または障害のさらなる例には中枢神経系の疾患（ＡＩＤＳ痴呆症、卒中、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病を含む）および筋系の疾患（横隔膜疾患（例えば、肺気腫、気管支炎および嚢胞性線維症における呼吸疲労）、うっ血性心不全の心臓疲労、筋障害に付随する筋無力症候群、ＡＬＳおよび多発性硬化症が含まれる）が含まれる。多くの神経性疾患（卒中、ハンチントン病、パーキンソン病、ＡＬＳ、アルツハイマー性およびＡＩＤＳ痴呆症を含む）はグルタミン酸レセプターの主サブタイプであるＮＭＤＡ（またはＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート）サブタイプの過剌激を伴っている。ＮＭＤＡレセプターの刺激により過度の神経カルシウム濃度が一連の膜および細胞質の反応発生を引き起こして酸素フリーラジカルおよび酸化窒素（ＮＯ・）を産生させる。酸素フリーラジカルとＮＯ・の相互作用は神経細胞死に寄与することが示されている。よく確立されたＮＭＤＡ毒性の神経皮質培養モデルが開発され、薬剤開発の基礎として使用されている。これらの同一のシステムにおいて本発明のＳＯＤ模倣物はＮＭＤＡ誘導障害を阻害する。本発明はまた関節炎、全身性高血圧症、アテローム、浮腫、敗血症ショック、肺高血圧症（原発性肺高血圧症を含む）、インポテンツ、不妊症、子宮内膜症、早期子宮収縮、記憶障害、微生物感染および通風の処置法にも関している。上記の病状の処置を達成するのに適した治療計画（投与様式を含む）は当業者により容易に決定されるであろう。炎症（特に肺の炎症）は本発明を用いた処置を受け入れやすい（喘息、酸素障害を含むＡＲＤＳ、肺炎（特にＡＩＤＳ関連肺炎）、嚢胞性線維症、慢性副鼻腔炎、および自己免疫疾患（慢性関節リュウマチのような）の炎症に基づく疾患に特に注目されたい）。ＥＣ−ＳＯＤは気道および脈管系平滑筋細胞の周囲の間質空間に局在している。ＥＣ−ＳＯＤおよびＯ₂ ^-は肺胞中隔において抗炎症−早期炎症平衡に介在している。肺胞中隔細胞によるＮＯ・放出は、それがＯ₂ ^-と反応してＯＮＯＯ^-を形成しなければ、炎症を抑えるように働く。Ｏ₂ ^-を捕捉することにより、ＥＣ−ＳＯＤは肺胞中隔で炎症に逆らった方向に平衡を傾かせる。多量のＯＮＯＯ^-は、ＥＣ−ＳＯＤが欠乏している場合かまたはＯ₂ ^-放出が非常に増加した場合にのみ生成するであろう。ここに記載したようなＥＣ−ＳＯＤ模倣体は高酸素症により起こされる破壊を保護するために使用できる。適当な治療計画は当業者により容易に確立できるであろう。上に指摘したごとく、ＮＯ・機能に関連する病的問題の実際の原因は酸化窒素合成酵素の欠損というよりＥＣ−ＳＯＤ遺伝子の欠損（蛋白質自身に現れる）であることが予期される。従って、別の実施態様において、本発明はＥＣ−ＳＯＤ遺伝子欠損の同定に使用するのに適した診断プロトコールに関係している。本発明のこの態様はＥＣ−ＳＯＤ遺伝子配列が利用できることに基づいている。本発明はその範囲に図２４に示された遺伝子配列ならびに少なくとも１５塩基、好適には少なくとも５０塩基、より好適には少なくとも１００塩基および最も好適には少なくとも５００塩基の非コード領域の一部分の配列を含んでいる。そのような部分、および本発明の範囲内にあるそれらの相補体は、実施例VIに記載されているプロトコールを含むプロトコール類においてプローブまたはプライマーとして使用できる。ＥＣ−ＳＯＤ遺伝子内の欠損に関する被検体のスクリーニングは、β−アドレナリンレセプター遺伝子上の突然変異を同定するために使用される方法を用いて実施できる（Ｒｅｉｈａｕｓｅｔａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：３３４（１９９３））。その方法はＲｏｓｅｎｅｔａｌ（Ｎａｔｕｒｅ２６２：５９（１９９３））により使用された方法と類似している（実施例VI参照）。以下は重要な遺伝子突然変異の予想される部位である：１−５５８位：ここは転写制御要素を含む５’フランク領域を示している。ここでの突然変異はＥＣ−ＳＯＤレベルの欠乏、またはＥＣ−ＳＯＤ濃度の操作を必要とする条件下でのＥＣ−ＳＯＤレベルの不完全な増大または減少を導くことを予想させる。以下の領域が推定制御領域と同定されている。これらの領域の突然変異はＥＣ−ＳＯＤレベルの欠乏を生じさせると予想できる：８９−９５金属制御応答要素１２１−１２６サイクリックＡＭＰ応答要素３７０−３７５グルココルチコイド応答要素２３８−２４４骨格筋トランスー活性化因子応答要素２５１−２５６ｃ−ｆｏｓプロトオンコジン誘導のシス応答要素１６２−１６８ＴＰＡ応答要素１７１−１７９ＳＶ−４０エンハンサー領域５６０−５７０位：ここでの突然変異はイントロン１のスプライシングができないことが予想される。これによりＥＣ−ＳＯＤＡＴＧ開始コドンの上流であるイントロン１に位置している多陰性ＡＴＧ部位での翻訳が開始されＥＣ−ＳＯＤ産生が起こらない（または非常に減少する）。例えば、塩基対６５３、６５６、７２０、７４３、７４８などで翻訳が開始されるであろう。５６４−１１３５位：イントロン１はＥＣ−ＳＯＤにユニークなＤＮＡ配列を含む。さらに、このＤＮＡ範囲内に潜在的転写制御領域が存在し、それらは下に掲げられている；イントロン１での突然変異はＥＣ−ＳＯＤレベルの欠乏、またはＥＣ−ＳＯＤ濃度の操作を必要とする条件下でのＥＣ−ＳＯＤレベルの不完全な増大または減少を導くであろう：１０８５−１０９５生体異物応答要素６５０−６６１抗酸化剤応答要素７１−９５位：ここでの突然変異はイントロン１のスプライシングができないことが予想される。これによりＥＣ−ＳＯＤＡＴＧ開始コドンの上流であるイントロン１に位置している多陰性ＡＴＧ部位での翻訳が開始されＥＣ−ＳＯＤ産生が起こらない（または非常に減少する）。例えば、塩基対６５３、６５６、７２０、７４３、７４８などで翻訳が開始されるであろう。１２１１−１２３０位：ここでの突然変異はイントロン２のスプライシングができないことが予想される。これによりＥＣ−ＳＯＤＡＴＧ開始コドンの上流であるイントロン２に位置している多陰性ＡＴＧ部位での翻訳が開始されＥＣ− ＳＯＤ産生が起こらない（または非常に減少する）。上流ＡＴＧ翻訳開始部位の例は１３３９および１５１８に見いだされている。５０５５−５０８０位：ここでの突然変異はイントロン２のスプライシングができないことが予想される。これによりＥＣ−ＳＯＤＡＴＧ開始コドンの上流であるイントロン２に位置している多陰性ＡＴＧ部位での翻訳が開始されＥＣ− ＳＯＤ産生が起こらない（または非常に減少する）。上流ＡＴＧ翻訳開始部位の例は１３３９および１５１８に見いだされている。５０８５−５１３８位：ここでの突然変異は（１）ＥＣ−ＳＯＤの翻訳効率を妨害し、酵素のレベルを欠乏させ、（２）ＥＣ−ＳＯＤの分泌に必要である小胞体へのＥＣ−ＳＯＤの標的化を妨害し、（３）翻訳に伴ったシグナルペプチドプロセッシング（即ち、シグナルペプチドの除去）を妨害し、成熟蛋白質からのシグナルペプチドの蛋白分解的切断ができないことにより欠乏レベルとなり、このことにより蛋白質は小胞体に捕捉される、（４）翻訳後プロセッシング（特にグリコシル化）が妨害され、溶解度の低い蛋白質の合成により不完全なレベルになるであろう。５１３９−５１５０位：ここでの突然変異はシグナルペプチダーゼ切断部位を妨害し、異なったアミノ末端を含むであろう突然変異体ＥＣ−ＳＯＤを生じて不完全なレベルの欠陥ＥＣ−ＳＯＤ作用を導くであろう。５４０３−５４０５位：ここでの突然変異はグリコシル化の喪失を生じることが予想され、溶解度の低い蛋白質の合成により不完全なレベルになるであろう。５４２４−５７２０位：ここでの突然変異は不完全な活性のＥＣ−ＳＯＤを生じることが予想される。この領域は、基質の結合におよびスーパーオキシドアニオンラジカルの不均化の触媒に決定的である。さらに、この領域はまた、酸化窒素などのような他の化学種の還元を含むこの酵素の他の活性に影響を及ぼすであろう。５７２１−５８０４位：この領域での突然変異は、細胞外マトリックス中および血管および気管の両方の平滑筋細胞周辺のタイプＩコラーゲンのような標的組織へのＥＣ−ＳＯＤの結合の欠損を起こすであろう。そのような突然変異は疾患を非常に起こしやすい。６３８５−６３９５位：ここでの突然変異は不完全なポリアデニル化を生じ、ＥＣ−ＳＯＤｍＲＮＡ種の半減期を減少させることによりＥＣ−ＳＯＤレベルを不完全なものにすることが予想される。本発明は完全ＥＣ−ＳＯＤ遺伝子配列のみに関するだけでなく、例えば、上に示した領域を含む遺伝子領域での突然変異の検出においてのプローブまたはプライマーとしてのその一部分の使用にも関している。そのような一部分は例えば、１８−１５００塩基の長さ、好適には１８−２２塩基の長さ、５０−７５塩基の長さ、１００−４００塩基の長さ、または５００−１５００塩基の長さであると予想される。本発明の詳細は以下の非制限的な実施例においてより詳細に記載されている。実施例Ｉトランスジェニックマウスの製造および特徴付けプロトコール：ｉ）トランスジェニックマウスの作製ヒトＥＣ−ＳＯＤ発現ベクターの構築：ＥＣ−ＳＯＤ発現ベクター（図１）は以下のように構築された：ＥｃｏＲＩ制限部位にフランクされた全ヒトＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡ断片（Ｈｊａｌｍａｒｒｓｏｎｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：６３４０（１９８７）；Ｈｊａｌｍａｒｒｓｏｎｅｔａｌ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ８：７３６（１９９０））はヤエナリヌクレアーゼで平滑端を形成するように変換され、ＳａｌＩリンカーに結合され、ＳａｌＩで消化され、次にヒトβ−アクチン発現ベクターｐＨβＡＰｒ−１のＳａｌＩ部位内へ挿入された。得られたヒトβ−アクチンプロモーター（南カルフォルニア大学のＬａｒｒｙＫｅｄｅｓ博士から提供を受けた）、イントロン、およびＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡを含むプラスミドのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片を単離した。さらに、プラスミドｐＭＳＧ（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）の２６６６位のＳＶ４０のＨｐａＩ部位をリンカー結合によりＨｉｎｄIII部位に変換し、ＳＶ４０初期領域のポリアデニル化部位を含むＨｉｎｄIII−ＰｓｔＩ断片を単離した。次に、これらの２つのＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＫＳベクター（Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅ，Ｌａ．Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に連結した。プラスミド配列を含まず、全発現構築物を含んでいるＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を単離してトランスジェニックマウスの確立に使用した。組換え体ＤＮＡ法のすべては確立された方法に従って行われた（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ３，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）。トランスジェニックマウスの開発：５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１ｍＭＥＤＴＡに溶解した２．５μｇ／ｍｌの精製されたＤＮＡをマウス（（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈ）Ｆ１ｘ（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈ）Ｆ１）（（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈ）Ｆ１マウスはＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒから購入された）から単離された授精卵の前核内へ注入した。マイクロインジェクションで生き残ったマウス卵は次にＨｏｇａｎｅｔａｌにより記載されている方法に従って（Ｈｏｇａｎｅｔａｌ，ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８６，３２）偽妊娠仮母（ＣＤ１）（ＣＤ１マウスはＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒから購入された）の卵管内へ移植された。トランスジンを運んでいるマウスは全ヒトＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡで検出する尾ＤＮＡのサザンブロット分析により同定された。トランスジェニック創始動物はスクリーニングされた最初の同腹仔に観察された。これらのマウスは（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈ）Ｆ１と繁殖させ、さらなる研究のための子孫を産ませた。（ＥＣ−ＳＯＤトランスジェニックマウスについての以下の実験のすべてにおいて、非トランスジェニックマウスはヒトＥＣ−ＳＯＤのためのトランスジンを含んでいないトランスジェニックマウスの同腹仔を意味する。ＥＣ−ＳＯＤトランスジェニックマウスが使用されなかった実験においては野生型（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈ）Ｆ１が使用された。ホモ接合ＥＣ−ＳＯＤトランスジェニックマウスの製造：ホモ接合トランスジェニックマウスはヘテロ接合トランスジェニックマウスのＦ１交雑により産生された。Ｆ２マウスからの尾ＤＮＡを単離し、ＲＮＡアーゼで処理した。各々のマウスからの１０μｇのＤＮＡをＰｓｔＩで切断し、１．２％アガロースゲルを通して電気泳動した。全ヒトＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡで検出する尾ＤＮＡのサザンブロット分析が行われた。ヒトＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡはマウスＥＣ−ＳＯＤ遺伝子と交差反応しなかった。バンド強度を視覚的に比較して、どのマウスがヒトＥＣ−ＳＯＤトランスジンについてホモ接合性、ヘテロ接合性または陰性であるかを決定した。ｉｉ）トランスジェニックマウスの特徴付けノーザンブロット分析：トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニック同腹仔を過剰のペントバルビタールで殺した。組織を素早く切り出し、次の処置の用意ができるまで液体窒素で凍結した。全ＲＮＡはすでに記載されているＣｓＣｌ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ３，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）により単離された。トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニック同腹仔の組織からの全ＲＮＡの２０μｇおよびＲＮＡラダーをグリオキサールで変性させ、１．２％アガロースゲルを通して電気泳動し、記載されているように（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ３，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）ニトロセルロースヘブロットした。ブロットは次に全ヒトＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡで検出した。コンカナバリンＡセファロースクロマトグラフィーによるＳＯＤアイソザイムの分離：３匹のマウスから採られた組織を秤量し、合併して０．３ＭＫＢｒ、３ｍＭジエチレントリアミン五酢酸および０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含む１０容量の氷冷５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４中でホモジナイズした。ＣｕＺｎＳＯＤおよびＭｎＳＯＤからのＥＣ−ＳＯＤの分離は記載されているように（Ｍａｒｋｌｕｎｄｅｔａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１２６：４（１９８２））組織ホモジネートををコンカナバリンＡセファロースカラムを通過させることにより達成された。ＳＯＤ活性：ＥＣ−ＳＯＤ活性およびＥＣ−ＳＯＤ抽出後に残っている全ＳＯＤ活性（ＣｕＺｎＳＯＤおよびＭｎＳＯＤ）は前に記載されているように（Ｃｒａｐｏｅｔａｌ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．５３：３８２（１９７８））ｐＨ１０でチトクロームＣ還元の阻害により測定された。全蛋白質はＢＣＡ蛋白質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により決定された。ＳＯＤ活性は単位／ｍｇ全蛋白質として表現された。結果：ｉ）ＥＣ−ＳＯＤトランスジェニックマウストランスジェニックマウスの特徴付け：ヒトＥＣ−ＳＯＤトランスジンを運んでいるマウスはサザンブロット分析により検出された。トランスジンを運んでいることが観察された１匹のマウスのＦ１からの種々の組織のノーザン分析が図２に示されている。トランスジェニックマウスの心臓、骨格筋および脳においてヒトＥＣ−ＳＯＤの高レベルの信号が検出され、肺、肝臓および脾臓ではほとんどまたは全く信号が観察されなかった。非トランスジェニック同腹仔では何の信号も検出できなかった。ホモ接合性マウスは２匹のヘテロ接合性Ｆ１マウスを繁殖させることにより発生させた。ホモ接合性マウスは子からの等量のＰｓｔＩ消化ＤＮＡのサザンブロット分析を用いて見いだされるバンド強度の差異により検出された。マウスのＥＣ−ＳＯＤ活性はＥＣ−ＳＯＤトランスジンの全コピーに応答して増加していることが観察された（表Ｉ）。実施例 II 中枢神経系酸素毒性プロトコール：酸素暴露：７−８週齢のマウスが小動物チャンバー（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）中で一度に５匹高圧酸素に暴露された。チャンバーに純酸素を流した後、５分以内に５０メーター（６ＡＴＡ）までの圧縮が行われた。チャンバー中の酸素濃度はＳｅｒｖｏｍｅｘ酸素分析器（５７２型，Ｓｙｂｒｏｎ，Ｎｏｒｗｏｏｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で連続的にモニターされ≧９９％に維持された。二酸化炭素濃度は、チャンバーガスを間欠的に取り出してＩＲ検出器（ＩＲＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＳａｎｔａＢａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｌｎｉａ）で分析し、０．１％以上に上がらないようにした。チャンバー温度は２５−２６℃に維持され、チャンバー中での酸素の圧縮は温度を過渡的に３０−３２℃に上昇させたが、環境制御システムが３分以内に正常のチャンバー温度に復帰させた。暴露は２５から７５分続け、５分間で減圧された。暴露開始からチャンバーから取り出して４時間後まで酸素毒性の徴候について連続的にマウスを観察した。最初の一般的な痙攣（発作潜伏期）の時間および死んだ時間が記録された。これらの暴露条件は肺酸素毒性の認知可能な形跡なしにＣＮＳ酸素毒性を起こすように計画された。ジエチルジチオカルバメート処理：６ＡＴＡ酸素に暴露する１時間前に、マウスに０．００８ｃｃ／ｇの食塩水かまたは通常の食塩水に溶解した４００ｍｇ／ｋｇのジエチルジチオカルバメート（０．００８ｃｃ／ｇ）を腹腔内に投与した。マウスは続いて上記のように２５分間６ＡＴＡ酸素に暴露した。ジエチルジチオカルバメートによるＥＣ−ＳＯＤおよびＣｕＺｎＳＯＤの阻害の程度を決定するため、マウスにジエチルジチオカルバメートを投与し１時間後に殺した。脳を取り出し、上記のようにＥＣ−ＳＯＤおよびＣｕＺｎＳＯＤ活性をアッセイした。 β−メルカプトエタノール処理：６ＡＴＡ酸素に暴露する１時間前に、マウスに０．００８ｃｃ／ｇの食塩水かまたは１８０ｍｇ／ｋｇのβ−メルカプトエタノール（０．００８ｃｃ／ｇ）を腹腔内に投与した。β−メルカプトエタノールのこの用量はジエチルジチオカルバメートの用量と等しい数の還元的チオールを含んでいるので選択された。マウスは続いて上記のように３０分間６ＡＴＡ酸素に暴露した。Ｎ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（酸化窒素合成酵素の阻害剤）処置：圧縮開始１０分前に、トランスジェニックおよび非トランスジェニックマウスに０．００８ｃｃ／ｇの食塩水かまたは無菌水に溶解した２０ｍｇ／ｋｇのＮ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（０．００８ｃｃ／ｇ）を腹腔内に投与した。マウスは続いて上記のように２５または７５分間６ＡＴＡ酸素に暴露した。統計分析：対スチューデントのｔ−検定がトランスジェニックおよび非トランスジェニックマウスの酵素活性の比較に使用された。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正によるχ²検定が高圧暴露での生存率の変化に対する有意差の評価に使用された。異なった群のマウスにおける発作潜伏期の相違を比較するために、ＳｃｈｅｆｆｅＦ−検定による分散分析が用いられた。結果：高圧酸素暴露：ＣＮＳ酸素毒性に及ぼす増加した脳ＥＣ−ＳＯＤレベルの影響を試験するため、トランスジェニックおよび非トランスジェニックマウス両方を６ＡＴＡ酸素に２５分間暴露した（実施例Ｉを参照）。トランスジェニックマウスはＣＮＳ酸素毒性に非トランスジェニックマウス（３３％死亡率）よりも感受性が強かった（８３％死亡率）（図３）。続いて、ＣＮＳ酸素毒性に対するトランスジェニックマウスの増加した感受性が増加したＳＯＤ活性の結果であったことを確認するため、トランスジェニックおよび非トランスジェニックマウスはＣｕＺｎＳＯＤの阻害剤（ジメチルジチオカルバメート）で処理された。トランスジェニックおよび非トランスジェニックマウス両方において、４００ｍｇ／ｋｇのジエチルジチオカルバメートで処理すると脳においてＥＣ−ＳＯＤの８０％の阻害およびＣｕＺｎＳＯＤの６０％の阻害が生じた。このことは以前の発見（Ｆｒａｎｋｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｒｍａｃｏｌ．２７：２５１（１９７８）；Ｈｅｉｋｋｉｌａｅｔａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：２１８２（１９７６））と一致している。ジエチルジチオカルバメート処理はトランスジェニックおよび非トランスジェニックマウス両方においてＣＮＳ酸素毒性に対する増加した耐性を与えた。トランスジェニックマウスにおいて１００％へおよび非トランスジェニックマウスにおいて９３％へ生存率が増加した（図３）。ジエチルジチオカルバメート処理したマウスにおいて発作の開始が４倍遅延した（図４）。ジエチルジチオカルバメートがＳＯＤ活性の阻害剤としてより、むしろ還元剤として作用することによりＣＮＳ酸素毒性に対して保護しているかどうかを評価するため、マウスはβ−メルカプトエタノールの形で当モル量の還元的チオールで処理され、高圧酸素に暴露された。図５はβ−メルカプトエタノールがＣＮＳ酸素毒性に対して保護しないことを示している。なぜＥＣ−ＳＯＤがＣＮＳ酸素毒性を悪化させるかを説明するであろう一つの可能性は、酸化窒素がＣＮＳ酸素毒性の媒介物であり、ＥＣ−ＳＯＤはスーパーオキシド媒介不活性化から酸化窒素を保護しているからであろう。酸化窒素がＣＮＳ酸素毒性に寄与しているという仮説を試験するため、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈ）Ｆ１マウスを酸化窒素合成酵素阻害剤、Ｎ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニンで処理した。図６はマウスにおける発作潜伏期に対するＮ−ω−ニトロ− Ｌ−アルギニンの影響を示している。食塩水処理マウス（２．７５±１分）に比較してＮ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン前処理は発作潜伏期を有意に遅らせた（１３．５０．±５．６分）。図７は酸化窒素合成酵素阻害が高圧酸素暴露後の生存率もまた有意に増加させていることを示している。酸化窒素合成酵素阻害剤を与えられたマウスは９０分の６ＡＴＡ暴露後に５０％の死亡率を示し、この暴露で２時間までは１００％死亡率とはならなかった。しかしながら、食塩水処理マウスは６ＡＴＡの酸素で暴露２５分後には５０％の死亡率を示し、３０分後には１００％の死亡率であった。図８は高圧酸素でのパーセント生存率が与えられた阻害剤の用量に依存していることを示している。この酸化窒素合成酵素の拮抗的阻害剤により達成される保護は、過剰のＬ−アルギニンが与えられた場合に逆転することができた（図６および図９）。ＣＮＳ酸素毒性に対する酸化窒素合成酵素阻害剤、Ｎ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニンの影響を次にトランスジェニックマウスにおいて研究した。この処置はトランスジェニックおよび非トランスジェニックマウス両方においてＣＮＳ酸素毒性を劇的に減少させた。６ＡＴＡ酸素への暴露２５分後の生存率が両方の群で１００％まで増加した（図３）。発作潜伏期もまた有意に遅延された（図４）。高圧酸素に対しトランスジェニックマウスが非トランスジェニックマウスよりいまだに感受性がより高いかどうかを調べるため、暴露時間を７５分に延長した。図１０の結果はＮ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン処理により、図３に示した２５分暴露により非処理トランスジェニックおよび非トランスジェニックマウス間で観察された感受性の相違がなくなったことを示している。実施例ＩＩＩ寒冷誘導性脳浮腫プロトコール：損傷モデル：若年（６〜７週令）マウス（実施例Ｉを参照せよ）に６０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタール（Ｎｅｍｂｕｔａｌ、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）での麻酔を施した。その後に頭皮に切開術を施し、そして長さ２０ｃｍ、直径３ｍｍのスチール製桿状体（その桿状体の末端から４ｃｍを液体窒素の８ｃｍの浴槽で液体窒素で平衡化させてある）を頭蓋の右脳半球上に３０秒間乗せた。その後に皮膚切開部を縫合した。損傷後２時間目にこのマウスに追加用量のペントバルビタールを投与した。胸腔を開き、肺を切り出し、そしてその後にこのマウスに心臓左心室を通して２０ｍｌの食塩水の灌注を施した。その後に脳を取り出し、そして小脳を切り出した。右（Ｒ）および左（Ｌ）の大脳半球を分割し、そして即座に重量測定を行った（湿潤重量、Ｗ）。各半球をその後に定常重量が達成されるまで（乾燥重量、Ｄ）熱風炉内で７０℃で２〜３日間乾燥させた。その後に浮腫の指数（Ｉ）を等式１３に示される要領で算出した。Ｉ＝（Ｗ／ＤＲ−Ｗ／ＤＬ）／（Ｗ／ＤＬ）×１００［１３］この計算は、各マウスにおいて、損傷が施された右半球についての左半球を内部対照とすることを意味する。化学処理：６群の実験を実施して、寒冷誘導性脳浮腫における細胞外スーパーオキシド、鉄、および酸化窒素の重要性を調べた。全ての群において各試薬を食塩水に溶解し、そして寒冷損傷１５分前に０．００８ｃｃ／ｇで注射した。群１ではＥＣ−ＳＯＤトランスジェニックマウスの浮腫形成を非トランスジェニック同腹仔のものと比較した。群２では、食塩水で処理した野生型（Ｃ５７ＢＬ／６ ×Ｃ３Ｈ）Ｆ１マウスと、０．３３ｍｇ／ｇのデフェロキサミン（０．５１μｍｏｌ／ｇ）で処理した（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３Ｈ）Ｆ１マウスとの間の浮腫形成を比較した。群３では、食塩水で処理した（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３Ｈ）Ｆ１マウスと、０．５１μｍｏｌ／ｇのＦｅ³⁺−飽和化デフェロキサミンで処理した（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３Ｈ）Ｆ１マウスとを比較した。群４は、食塩水で処理した（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３Ｈ）Ｆ１マウスおよび０．０２ｍｇ／ｇのＮ−ω−ニトロ −Ｌ−アルギニンメチルエステルで処理した（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３Ｈ）Ｆ１マウスからなっていた。群５は、食塩水で処理した（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３Ｈ）Ｆ１マウス、ならびに０．０２ｍｇ／ｇのＮ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルに加えて０．０５ｍｇ／ｇのＬ−アルギニンで処理した（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３Ｈ）Ｆ１マウスからなっていた。群６では、非トランスジェニックマウス、食塩水で処理したＥＣ−ＳＯＤトランスジェニックマウス、および０．０２ｍｇ／ｇのＮ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルで処理したＥＣ−ＳＯＤトランスジェニックマウスの間の浮腫形成を比較した。鉄飽和化デフェロキサミンは食塩水中に等モル量のデフェロキサミンを、次いで塩化第二鉄を溶解することにより作製した。第二鉄でのデフェロキサミンの飽和は、４２５ｎｍでの吸光度を測定することにより分光測光法で決定した（Ｆｅ³⁺ −デフェロキサミンについてはε＝２５００Ｍ^-1ｃｍ^-1である）（ＭｏｎｚｙｋａｎｄＣｒｕｍｂｌｉｓｓ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：４９２１（１９８２）。エバンスブルー処理：寒冷損傷後１時間５０分目に、食塩水中の１％エバンスブル−５ｍｌ／ｋｇをトランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウスの大腿動脈内に注射した。１０分後にマウスを殺した。その後に肺を切り出し、次に、排水中にもはや青色が認められなくなるまで左心室を通してマウスに通常の食塩水を灌注した。次に脳を除去し、写真を撮影した。統計的分析：対スチューデントｔ−検定を用いて、調査を行った各群について非トランスジェニックマウスもしくは食塩水処理化マウスと比較される浮腫発生の有意性を比較した。フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ＰＬＳＤ検定を用いる分散の分析を用いて群６での有意性を比較した。０．０５を下回るＰ値を有意であると見なした。結果：寒冷誘導性脳浮腫：トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニック同腹仔に右大脳半球への寒冷誘導性損傷を施したところ、トランスジェニックマウスは非トランスジェニック同腹仔と比較すると浮腫形成に対して有意に防御されていた（図１１）。パーセント浮腫率は非トランスジェニック同腹仔におけるものと比較してトランスジェニックマウスでは４４％低くなっており、かつエバンスブルー染料の血管外遊出は非トランスジェニック同腹仔と比較するとトランスジェニックマウスでは肉眼的に少なかった（図１２）。このモデルにおける浮腫形成に対する鉄の寄与を調べるために、寒冷誘導性損傷前にマウスをデフェロキサミンもしくは食塩水の腹膜内投与で予備処理した。表ＩＩは、デフェロキサミンでの予備処理によって食塩水のみを投与されたマウスと比較すると４３％低い浮腫形成がもたらされることを示す。次に、マウスを寒冷誘導性損傷前に鉄飽和化デフェロキサミンもしくは食塩水の腹膜内注射により予備処理して、この化合物の鉄キレート特性が浮腫形成に対する防御に真に必要であるかどうかを調べた。表ＩＶは、デフェロキサミンが鉄で飽和されていたとしても浮腫形成に対する防御が可能であり、かつ食塩水処理化対照に見いだされるものと比較すると３２〜４８％低い浮腫がもたらされることを示す。浮腫指数の絶対値は非常に変動性が高いことが見いだされたが、反復実験では一致して、試験した様々な処理における浮腫形成に対する防御という点では同一の有意な傾向が示されている。これらの結果により、デフェロキサミンは、鉄を捕獲する能力とは独立したメカニズムにより浮腫形成に対する防御を行うことが可能であることが示される。デフェロキサミンはペルオキシ亜硝酸塩アニオン（Ｒａｄｉｅｔａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８８（２）：４８１（１９９１））、ならびにヒドロキシルラジカル（Ｈｏｅｅｔａｌ．、Ｃｈｅｍｉｃｏ− ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ４１：７５（１９８２））の両方を捕獲することができるため、デフェロキサミンのこれらの特徴が血管原性浮腫に対する防御を行うことを可能とするものであるという仮説を立てた。この仮説を検証するために、酸化窒素の合成を、酸化窒素シンセターゼの競合阻害剤であるＮ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルで阻害し、このことにより寒冷誘導性損傷後の浮腫形成に対する防御がもたらされるかどうかを決定した。表ＩＩＩは、Ｎ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルでの処理が浮腫形成からマウスを有意に防御することを示し、食塩水処理化対照において生じるものと比較して３７％低い浮腫形成がもたらされた。Ｎ−ω−ニトロ−Ｌ −アルギニンメチルエステルによるこの防御は、マウスへの過剰量のＬ−アルギニンの同時添加により逆転した（表ＩＩＩ）。最終実験においては、ＥＣ−ＳＯＤトランスジェニックマウスを食塩水またはＮ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルのいずれかで処理して、ＥＣ− ＳＯＤならびに酸化窒素シンセターゼの阻害剤の両方の増加したレベルを有するマウスにおいて浮腫形成を防御する点での相加効果が存在するかどうかを判定した。表ＩＶは、ＥＣ−ＳＯＤトランスジェニックマウスに酸化窒素シンセターゼの阻害剤を投与した際には、脳における増加したレベルのＥＣ−ＳＯＤによってのみ防御されたトランスジェニックマウスと比較すると浮腫形成に対する相加防御は検出されなかったことを示す。実施例ＩＶＥＣ−ＳＯＤの免疫局在性プロトコール：ヒト肺：ヒト肺の試料５個を取得してヒト肺組織におけるＥＣ−ＳＯＤの分布を評定した。一つの試料は、年間５０箱の喫煙暦（１年間について一日一箱に相当する）を有し、かつ孤立リンパ小節が胸部Ｘ線において見いだされた４３歳の白人女性から切除された右上肺葉の外科手術的病理標本から取得した。この患者は扁平上皮癌であると診断された。この肺葉からの癌に関連しない領域からの組織を本明細書に記載される研究に用いた。第二の肺は、年間６０箱の喫煙歴を有し、Ｘ線で孤立リンパ小節を有することが見いだされている５１歳の白人男性から切除された右上肺葉の外科手術的病理標本から取得した。この患者は他の疾患は全く有さず、かつ扁平上皮癌であると診断された。この標本からの癌に無関係な肺組織をＥＣ−ＳＯＤの局在性決定のために用いた。第三の肺は痴呆を患うが喫煙もしくは肺疾患歴が全くない６６歳の白人男性の迅速剖検から取得した（死後６時間以内に取得された組織）。調べた第四の肺は、肺移植のレシピエントには大きすぎる肺の余剰肺組織から取得した。この肺は、喫煙もしくは肺疾患歴の全くない４５歳の白人女性から寄贈された。これらの研究で調べた第五の肺もやはり、喫煙もしくは肺疾患歴の全くない３９白人男性からの肺移植用に用いられた余剰肺組織からのものであった。明らかに、外科手術的病理標本と肺移植用のドナーからの剖検組織との間には、標識パターンの点では差異が見いだされなかった。これらの組織を０．０１Ｍのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ；１リットル中、１．２ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄、８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、ｐＨ７．３）中の２％パラホルムアルデヒド／０．２％グルタルアルデヒド中で１時間、次いで４％のパラホルムアルデヒド中４℃で一夜、次いでＯ．Ｃ．Ｔ．化合物中で固定した。これらの組織を液体窒素で冷却させたヘキサン中で凍結し、そしてそれらを光学顕微鏡検査用に切片化するまで−７０℃で保存した。電子顕微鏡検査用には、スクロース中で平衡化するまでは光学顕微鏡調査時と同様に肺組織を処理した。スクロース中での平衡化後にそれらの肺組織を１０％のゼラチンで３７℃で１０分間浸潤させた。次に、ゼラチン中の組織切片を氷上で固化させ、２ｍｍ辺の立方体に切断し、２Ｍのスクロースを含む４％ポリビニルアルコール中で一晩凍結保護処理を施した。これらの試料をその後にスタブ上にマウントし、液体窒素中で瞬間凍結させ、そしてその後に、電子顕微鏡調査用にそれらを切片化するまで液体窒素中に保存した。ヒト組換えＥＣ−ＳＯＤに対する抗体の特徴決定：ヒト組換えＥＣ−ＳＯＤｂｅｌｌｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：６６３４（１９８７）およびヒト肺ホモジネートの２０，０００×ｇの上清を、β−メルカプトエタノールおよびドデシル硫酸ナトリウムの存在下で５分間沸騰させることにより変性させ、そしてその後にドデシル硫酸ナトリウムの存在下で１２％のポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動した。蛋白質をその後に電気泳動的にニトロセルロースに転移させた。このブロットをその後に、ウサギ抗−ｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤの４．３μｇ／ｍｌのＩｇＧ精製化分画（Ｓ．Ｍ．ＭＯＤを用いる親和性精製を行い、次いで¹²⁵Ｉ−プロテインＡと共にインキュベートし、そしてオートラジオグラフィーにかけた。抗−ＥＣ−ＳＯＤＩｇＧの吸着：ＣＮＢｒ活性化セファロースをＰＢＳ中で膨潤させた。沈殿したゲルが容積の５０％を占めるように膨潤したゲルをＰＢＳと混合させた。このゲルを再懸濁させ、そして１００μｌを１００μｇの純粋なｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤと共に２時間、緩やかに震盪させながら室温で混合した。その後にこのゲルをＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で４回洗浄し、そしてＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１００μｌとした。次に、１００μｌのウサギ抗− ｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤを免疫標識用に用いられる２倍濃度で添加し、そして緩やかに震盪させながら室温で２時間混合した。その後に、この方法により除去される抗−ｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤＩｇＧの予想される濃度に等価な濃度で非免疫ウサギのＩｇＧをこの上清に添加した。その後にこの上清を後続の免疫標識に用いた。光学顕微鏡による免疫組織化学的調査：−２０℃の低温槽中でＯ．Ｔ．Ｃ．で包埋した組織の４μｍの一連の切片標本を切断し、そしてこれをポリ−Ｌ−リシン被覆化スライド上に乗せた（３切片標本／スライド）。切片標本は標識が実施されるまで−７０℃に保存した。その後に切片標本を、間接的免疫パーオキシダーゼ法（Ｍｉｌｄｅｅｔａｌ．、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３７：１６０９（１９８９）；Ｒａｎｄｅｌｌｅｔａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４：５４４（１９９１））を用いて、ビオチニル化ヤギ抗−ウサギＩｇＧおよびストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ））でＥＣ−ＳＯＤについて標識した（表Ｖ）。バックグラウンド染色を減らすために、切片標本をメタノール中の１％Ｈ₂Ｏ₂中でインキュベートして内因性ペルオキシダーゼを不活化させ、１０ｍＭのホウ水素化物でアルデヒド類をブロックし、かつ非特異的結合を、ＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、５％の牛乳、および１％のＢＳＡと共にインキュベーションすることにより遮断した。至適の一次および二次抗体の希釈率を実験的に決定し、そして１％の牛乳および１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に作製した（牛乳はストレプトアビジン溶液中には含まれてはいなかった）。これらのスライドをジアミノベンジジン（１０ｍｇのジアミノベンジジン、５０ｍｌの０．０５ＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ７．６、１００ μｌの３％Ｈ₂Ｏ₂）を用いて発色させ、そして１％のメチルグリーンでの対比染色を施した。対照として一連の切片標本を個別に、ウサギ抗−ｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤ（ＥＣ−ＳＯＤ）、非免疫ウサギＩｇＧ、もしくはＥＣ−ＳＯＤ結合性ＩｇＧを予め吸着除去してあるウサギ抗−ｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤ（ＥＣ−ＳＯＤ吸着；先を参照せよ）のいずれかで標識した。電子顕微鏡による免疫細胞化学的調査：ヒト肺組織の超薄凍結切片（７０ｎｍ）を既述の要領でウサギ抗−ｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤおよび１０−ｎｍのプロテインＡ−ゴールドで免疫標識した（Ｃｒａｐｏｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０４０５（１９９２））（表ＶＩ）。簡潔に記述すると、切片標本を最初にＰＢＳ中の０．１５％グリシン中で３回、５分間室温でインキュベートしてアルデヒド基をブロックした。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中での１０分間のインキュベーションにより非特異的結合を更にブロックした。一次抗体および二次抗体の希釈率を実験的に決定し、そして１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で作製した。切片標本を既述の要領で、シュウ酸ウラニルおよびメチルセルロース中の酢酸ウラニルで染色した（Ｃｒａｐｏｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０４０５（１９９２））。対照群は先の光学顕微鏡について記載されるものと同様であった。結果：ＥＣ−ＳＯＤ抗体の特徴決定：ｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤに対する抗体については、ｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤおよびヒト肺ホモジネートのウエスタンブロット分析による特徴決定を行った。図１３は、その抗体がヒト肺ホモジネート中のＥＣ−ＳＯＤタイプＣサブユニット（上方のバンド）およびタイプＡサブユニット（下方のバンド）の両方と反応することを示す（Ｓａｎｄｓｔｒｏｍｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６７：１８２０５（１９９２））。タイプＡサブユニットはインビボでは組織の間質内には存在しない（Ｓａｎｄｓｔｒｏｍｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９０：６２３（１９９３））。この抗体は、精製されたタイプＣｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤを含むレーンでは３本のバンドと反応した。図１３中の２つの小さい分子量の種は高過剰発現性ＣＨＯ−細胞におけるｒｈ− ＥＣ−ＳＯＤの部分的で不十分なグリコシル化に起因する。光学顕微鏡による免疫組織化学的調査：ｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤに対する抗体を用いて、この蛋白質のヒト肺中における免疫的局在化を調べた。光学顕微鏡での免疫組織化学的調査により、肺においてはＥＣ−ＳＯＤは主に血管および気道の周辺の結合組織マトリックスに付随していることが明らかになった（図１４ａおよびｂ、図１５ａ、ｂ、およびｃ）。ＥＣ− ＳＯＤは血管および気道の平滑筋の非常に近位に見いだされた（図１４ａおよびｂ、図１５ａ）。ＥＣ−ＳＯＤは更に肺細胞隔壁の先端の結合組織にも見いだされ（図１５ｃ）、このことは結合組織マトリックスに対するＥＣ−ＳＯＤの親和性を示唆する。大弾性動脈、中サイズの血管、もしくは毛細血管中の血管内皮細胞に付随する標識は見いだされなかった（図１４ａおよびｂ）。ＥＣ−ＳＯＤは気道の上皮細胞表面には明らかに存在せず（図１５ａおよびｂ）、かつ軟骨中にも存在しなかった（図１５ａ）。ＥＣ−ＳＯＤに対する抗体は、ｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤを用いて親和性精製されたＩｇＧポリクローナルウサギ抗体であった。ＥＣ−ＳＯＤについての標識の特異性を試験するために、ＥＣ−ＳＯＤに特異的なＩｇＧを、臭化シアンセファロースに結合させてある純粋なｒｈ−ＥＣ−ＳＯＤを用いて抗血清から吸着除去した。その後に、吸着されたＩｇＧを置換するのに十分な量の非免疫ウサギＩｇＧをこの吸着化抗体に添加した。予備吸着化抗体調製物で肺組織を標識すると、肺の脈管系を含む肺の全領域において標識が欠如していた（図１４ｃ）。非免疫ＩｇＧ単独で肺組織を標識した場合にも、肺の全領域において標識が欠如していた。これらの対照は、一次抗体に関して観察される標識は肺のＥＣ−ＳＯＤに特異的であることを示す。電子顕微鏡による免疫細胞化学的調査：電子顕微鏡による免疫細胞化学的調査を用いて見いだされる肺におけるＥＣ−ＳＯＤについての標識が表ＶＩＩにまとめられている。ＥＣ−ＳＯＤは主に肺の全領域の細胞外マトリックス蛋白質と付随していた。特に、高い程度の標識がタイプＩコラーゲンに富む領域（図１６）に、そして細胞外マトリックス中の他の未同定のプロテオグリカンに付随して（図１７）観察された。顕著なことに、ＥＣ−ＳＯＤについての標識はエラスチンに富む領域には見いだされなかった（図１６）。高い程度の標識が平滑筋細胞の表面付近に、そして血管（図１７）および気道の平滑筋細胞を取り囲む結合組織マトリックス中に観察された。標識は、小血管、中程度の血管、および大血管上の内皮細胞の表面では明らかに存在しなかった（図１８ａおよびｂ）。光学顕微鏡による免疫組織化学的調査で見いだされた内皮細胞の標識の欠如は電子顕微鏡での所見を裏付けしている。ＥＣ−ＳＯＤの標識は血管内腔内での血漿においても観察された（図１８ａ）。血漿中でのＥＣ−ＳＯＤの局在化は予期されており、それはこの蛋白質が最初に血漿中で発見されたためである（Ｍａｒｋｌｕｎｄ、ＡｃｔａＰｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．、５４９２：１９（１９８０））。ＥＣ−ＳＯＤについての標識は気管支上皮細胞間の細胞間結合に観察されたが（図１９）、これらの細胞の先端表面では欠如していた。結局のところＥＣ−ＳＯＤの標識はタイプＩおよびタイプＩＩの細胞の表面では欠如していた。中程度ではあるが一貫した量の細胞内ＥＣ−ＳＯＤがタイプＩＩ上皮細胞および気管支上皮細胞内に見いだされた（図１９）。図１６Ｃに示されるように、一次抗体からＥＣ−ＳＯＤ特異的抗体を吸着除去し、そしてその吸着化抗体を非免疫ウサギＩｇＧで置換することにより作製された対照では、タイプＩコラーゲンが豊富に存在する領域を含む肺の全領域に標識が存在しなかった。その上、一次抗血清の代わりに非免疫ウサギＩｇＧを用いた場合、肺の全領域において標識が存在しなかった。これらの対照に関する標識の欠如は、一次抗血清に関して観察される標識が肺におけるＥＣ−ＳＯＤに特異的であることを示す。平滑筋細胞の表面、ならびに血管および気道の両方におけるこれらの細胞周辺の細胞外マトリックスにおけるＥＣ−ＳＯＤの局在化は、ＥＣ−ＳＯＤがこの位置において重要な機能を有する可能性があることを示す。スーパーオキシドは酸化窒素と即座に反応し、そして平滑筋弛緩剤としての酸化窒素の特性を不活化させることが知られている。従って、平滑筋細胞への酸化窒素の拡散経路に沿うＥＣ−ＳＯＤの存在はこの特定の領域内での短命な細胞間メッセンジャーの半減期を増加させ、そしてそのため血管拡張剤としてのその効力を増加させるはずである。血管および気道の平滑筋細胞周辺に観察されるＥＣ−ＳＯＤの高い標識は、低い肺血管圧および気道抵抗の維持における酸化窒素活性の媒介物としてのＥＣ −ＳＯＤの機能を示している。平滑筋細胞に付随するＥＣ−ＳＯＤの標識に加え、ＥＣ−ＳＯＤは更にタイプＩコラーゲンと共に強力な同時局在化を示すように思われる。コラーゲンは、例えばスーパーオキシドアニオンのような反応性酸素種による攻撃に感受性を示すことが既に証明されている。その上このスーパーオキシドアニオンはおそらく多型核白血球（ＰＭＮ）からの潜在性コラーゲナーゼ類を活性化することが可能であり、このことによりさらにコラーゲンが分解されうる。コラーゲン断片はＰＭＮを化学誘因し活性化させることが知られているため、コラーゲン分解をもたらすスーパーオキシド産生の増加はいずれも、ＰＭＮの動員および活性化を介する炎症性反応および組織破壊をを充進させる可能性がある。その結果、ＥＣ−ＳＯＤがコラーゲンに付随することは、コラーゲンのスーパーオキシド媒介性分解を予防するのに重要である可能性があり、したがって炎症性応答を制御する方法を表す。実施例ＶヒトＥＣ−ＳＯＤ遺伝子プロトコール：材料および放射性化学物質：［α−³⁵Ｓ］ｄＡＴＰ（〜１４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、および［α−³⁵Ｐ］ＣＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ社から購入した。ヒトのゲノムＤＮＡ、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｉｎ、およびｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）プラスミドはＰｒｏｍｒｇａＢｉｏｔｅｃ社から取得した。シークエナーゼ（Ｓｅｑｕａｎａｓｅ）配列決定用キット（Ｖ２．０）はＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社からのものであった。ヒトのポリＡ＋ＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から取得した。ＳｅａＰｌａｑｕｅＧＴＧアガロースはＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社からのものであった。制限酵素類はＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社からのものであった。用いられた他の全ての試薬は分子生物学用等級であった。オリゴヌクレオチドは、ｔｈｅＤｕｋｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｏｔａｎｙＤＮＡ合成施設により、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｒｅｍｓ社の３０８Ｂまたは３９２を用いて合成した。帯電ナイロン膜（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌｕｓ）はＤｕｐｏｎｔ社からのものであった。ヒトのノザンブロットもしくは分析：２μｇのポリＡ＋ＲＮＡを８つの異なるヒト組織から精製した。これらのｍＲＮＡを変性ホルムアルデヒド１．２％アガロースゲル上で電気泳動し、そして荷電改変化ナイロン膜に転移させ、その後にＵＶ照射固定に供した。この膜を、５０％のホルムアミド、０．２５ＭのＮａＰＯ₄（ｐＨ７．２）、０．２５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、７％のＳＤＳ、および５％のポリエチレングリコール（分子量８０００）中で予備ハイブリダイズさせた。このブロットを同一緩衝液中で一晩、６０℃で、［α−³²Ｐ］ＣＴＰの存在下でＴ₃ ＲＮＡポリメラーゼを用いる全長ｃＤＮＡの転写により作成された１×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの［³ ² Ｐ］−標識ヒトＥＣ−ＳＯＤＲＮＡとハイブリダイズさせた。このブロットを０．２５ＭのＮａＰＯ₄（ｐＨ７．２）、１％のＳＤＳ、および１ｍＭのＥＤＴＡ中７５℃で洗浄し、その後に０．０４ＭのＮａＰＯ₄（ｐＨ７．４）、１％のＳＤＳ、および１ｍＭのＥＤＴＡを用いる７５℃の３０分間の第二洗浄を行った。その後に、−７５℃でＬｉｇｈｔｅｎｉｎｇＰｌｕｓ増感用スクリーンを用いてＸＡＲ−５フィルムに露出させた。このオートラジオグラムをＬＢＫＵｌｔｒａｓｃａｎＸＬレーザーデンシトメーターを用いてスキャンし、そして各ピークをそのデンシトメーターの内蔵式デジタル積算機を用いる積分法によるか、もしくはプリンタートレース画からそのピークを切り出して重量を測定することにより定量化した。ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅：ヒト心臓からの０．５μｇのポリＡ＋ｍＲＮＡを２ｐｍｏｌのＥＣ７（５’ＥＣ−ＳＯＤ遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＡＴＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣ−３’）を用い、ＧＩＢＣＯＢＲＬ社（５’ ＲＡＣＥＳｙｓｔｅｍ）のプロトコールに従って逆転写させた。このＲＮＡ鋳型をＲＮアーゼＨの添加により５５℃で１０分間分解させた。得られたｃＤＮＡをＧｌａｓｓＭＡＸＤＮＡ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）の単離用スピンカートリッジを用いて単離した。精製されたｃＤＮＡには末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ、０．５単位／μｌ）、２００μＭのｄＣＴＰ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、２５ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＭｇＣｌ₂、および５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを用いて１０分間、３７℃でｄＣ−テイル付加を施した。このＴｄＴは１０分間７０℃で不活性化させた。次にこの反応の産物を、「アンカー」プライマー（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）（これはホモポリマーテイルにハイブリダイズする）およびＥＣ４（組重ね中間部５’ＥＣ−ＳＯＤ遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＡＧＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＡＧＴＡＧＣ−３’）を用いてＰＣＲ増幅した。別法ではこのｄＣテイル付加産物をＥＣ７およびＨＥＣ１（センス鎖のＥＣ−ＳＯＤ遺伝子特異的プライマー、５’−ＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＧ− ３’）を用いてＰＣＲ増幅した。この反応の最終組成物は２０ｍＭのＴｒｉｓ− ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１００μ ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、４００ｎＭのアンカープライマー、２００ｎＭの遺伝子特異的プライマー、および２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを含んでいた。このＰＣＲ反応物を５分間９４℃でインキュベートした後に、アンプリタック（ａｍｐｌｉｔａｑ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社）を、０．０４単位／μｌの最終濃度で添加した。ＰＣＲサイクルはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ９６００上で、９４℃で４５秒間の融解および５３℃で１５秒間のアニーリングおよび７２℃で９０秒間の伸長からなる３５サイクルを実施した。全長ＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡ（６ｎｇ）をＰＣＲ反応の陽性対照として用いた。ＰＣＲ産物を２％のＳｅａＰｌａｑｕｅＧＴＧアガロースゲル中で電気泳動させ、帯電化ナイロン膜にＳｏｕｔｈｅｒｎ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５））の方法により、アルカリ性転移方法（Ｒｅｅｄｅｔａｌ．、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：７２０７（１９８５））を用いて転移させた。ＤＮＡをこの膜に、８０℃での真空オーブン中で２時間焼くことにより固定させた。得られたブロットを、［³²Ｐ］末端標識ＨＥＣ２（中間部組重ねＥＣ−ＳＯＤ特異的プライマー，５’−ＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＡＧＣ−３’）に、３７℃で一晩ハイブリダイズさせた。このブロットを、バックグラウンドハイブリダイゼーションが除去されるまで緊縮性を増加させて洗浄した。その後、ＬｉｇｈｔｅｎｉｎｇＰｌｕｓ増感スクリーンを用いて−７０℃でＸＡＲ−５フィルムへの露出を実施した。ヒトゲノムのサザンブロット分析：１０μｇのヒトゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、およびＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素で完全に消化させた。その後にこのＤＮＡを１％のアガロースゲル上で電気泳動し、そして帯電化ナイロン膜にＳｏｕｔｈｅｒｎの技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５））により、アルカリ変性（Ｒｅｅｄｅｔａｌ．、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：７２０７（１９８５））を行ってから転移させた。このＤＮＡは、８０℃での真空オーブン中で２時間焼くことによりその膜に固定させた。［³² Ｐ］ＣＴＰ−標識ヒトＥＣ−ＳＯＤアンチセンス鎖ｃＲＮＡを、予めＳｔｕＩで線状化させてあるＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡを用いて合成した。このブロットを、５０％のホルムアミド、０．２５ＭのＮａＰＯ₄（ｐＨ７．２）、０．２５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、７％のＳＤＳ、および５％のポリエチレングリコール（分子量８０００）中、５０℃でハイブリダイズさせた（５００×１０³ ｃｐｍ／ｍｌ）。一晩のハイブリダイゼーションの後に、これらを０．２５ＭのＮａＰＯ₄（ｐＨ７．２）、２％のＳＤＳ、および１ｍＭのＥＤＴＡで、次いで０．０４ＭのＮａＰＯ₄（ｐＨ７．２）、１％のＳＤＳ、および１ｍＭのＥＤＴＡにより、バックグラウンドハイブリダイゼーションが最少値を示すまで緊縮性を増加させて洗浄した。このブロットをＬｉｇｈｔｅｎｉｎｇＰｌｕｓ増感スクリーンを用いて−７０℃でＸＡＲ−５フィルムへ露出させた。ＥＣ−ＳＯＤのヒト遺伝子の単離：ＥＭＢＬ−３ベクター中に構築されたヒト成人女性の白血球ゲノムライブラリーはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から取得した。約１×１０⁶ｐｆｕを〜５０，０００ｐｆｕ／プレートの密度で、［³²Ｐ］ＣＴＰ−標識ヒトＥＣ−ＳＯＤｃＲＮＡ（１×１０⁶ｄｐｍ／ｍｌ）を用いてスクリーニングした。初回から第三回目までのスクリーニングにより約７つのユニークな仮想的陽性プラークが同定された。個々のプラークを単離し、そしてラムダＤＮＡをＬａｍｂｄａＳｏｒｂファージ吸着剤（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ社）を用いて精製した。各クローンからの挿入ＤＮＡのサイズは、ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ消化およびその後の０．７％アガロース中での電気泳動により評定した。選択されたクローンについて広範囲の制限エンドヌクレアーゼマッピングを行った。この制限マッピングの結果、ならびに５’および３’アニール用ＥＣ−ＳＯＤオリゴヌクレオチドを用いる非対称性ハイブリダイゼーションに基づいて、クローン＃７を全ての後続ＤＮＡ配列分析用に選択した。クローン＃７は約１８〜２０ｋｂの断片を含む。ヒトＥＣ−ＳＯＤ遺伝子のＤＮＡ配列決定：クローン＃７の配列決定用に用いられた総体的な手法が図２０に説明される。クローン＃７からの様々なサイズの制限エンドヌクレアーゼ断片をｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）ベクターＤＮＡ中にサブクローン化した。鋳型として二本鎖ＤＮＡ（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｐｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃ．ａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２））およびシークエナーゼ酵素（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を用いるジデオキシ配列決定方法を利用した（Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３（１９７７））。ユニバーサルおよび−４０Ｍ１３配列決定用プライマーの両方を用いて各サブクローン化断片についてのＤＮＡ配列決定を開始した。この最初の配列決定データに由来するオリゴヌクレオチドを、完全なヌクレオチド配列が取得されるまで約２５０塩基対毎に合成した。配列決定データは、図２０に示される要領で両方の鎖から取得したが、但し、遺伝子の３’部分は１本の鎖についてのみＤＮＡ配列を得た。コンピューター援用配列分析および転写データベース調査：ＤＮＡ配列データを体系付けるためにＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム（バージョン２．２）を用いた。相同性調査はＮＣＢＩで、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））ネットワークサービスおよび非冗長ヌクレオチド配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ（７７．０）＋ＥＭＢＬ（３５．０）＋ＥＭＢＬＵｐｄａｔｅ＋ＧＢＵｄａｔｅ）を用いて実施した。転写因子データーベース調査は、ＳＩＧＮＡＬＳＣＡＮ３．０アルゴリズム（Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅｅｔａｌ．、ＣＡＢＩＯＳ９：１１３（１９９３））ならびにＧＣＧＰａｃｋａｇｅ（Ｖ７．２）のＦＩＮＤＰＡＴＴＥＲＮＳプログラムの両方を用い、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｅｒＤａｔａｂａｓｅ（Ｇｏｓｈ、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：１７４９（１９９０））のＲｅｌｅａｓｅ６．３を用いて実施した。シグナルペプチド開裂の部位の予測のためには、プログラムＳＩＧＳＥＱ１（Ｆｏｌｚｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１４７５２（１９８６）およびＳＩＧＳＥＱ２を利用した（Ｆｏｌｚｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４６：８７０（１９８７））。結果：ヒトＥＣ−ＳＯＤの組織特異的発現：ヒトＥＣ−ＳＯＤの発現を調べるために、８つの異なるヒト組織からのポリＡ（＋）ｍＲＮＡを変性用アガロースゲル上で分画化し、そして帯電ナイロン膜に転移させた。以前の論文で、ゲノムのサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）分析の間にＥＣ−ＳＯＤ特異的バンドを同定するためには露出時間が長いことが報告されているため（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎｅｔａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ８：７３６（１９９０））、全長ヒトＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡに由来する放射性標識アンチセンスｃＲＮＡプローブを用いた（Ｏｕｒｙｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９７１５（１９９２））。約１．４ｋｂの孤立したバンドが分析を行った８つ全てのヒト組織に観察可能である（図２１Ａ）。その上、骨格筋は約４．２ｋｂのメッセージを含むが、他の組織ではこれは検出されない。４．２および１．４ｋｂのバンドのデンシトメトリーでのスキャンにより、大きいほうのメッセージは全骨格筋ＥＣ−ＳＯＤメッセージの最高約３２％までを構成すると算出することが可能である。脳では２．２ｋｂの非常に微弱なバンドを観察することが可能である。このバンドはレーザーデンシトメーターによる定量化にとってはあまりに微弱すぎた。これらのバンドの定量化はレーザーデンシトメトリー、および露出の直線領域において取得されるオートラジオグラムのピークの積分により実施した（図２１Ｂ）。脳に対して標準化した後、心臓は脳の１０．１倍の最大発現を示した。この後に、胎盤、膵臓、および肺について調べ、各々１３．６、１０．２、および７．５倍の発現値を示した。骨格筋における発現は１．４ｋｂバンドについては４．７倍であり、あるいは１．４ｋｂおよび４．２ｋｂのメッセージの両方については６．９倍であった。一方、腎臓および肝臓は脳を６．３倍および４．１倍上回る発現を示した。これらの発現のパターンは追加的な独立した複数組織のノザン（Ｎｏｔｈｅｒｎ）ブロットの探索に基づく再現性が示されている。これらのバンドは比較的高い緊縮性での洗浄およびプローブとしてセンス鎖ＥＣ−ＳＯＤｃＲＮＡを用いるデータ（このプローブは、与えられる条件下ではハイブリダイゼーションを示さない）に基づくと特異的である。転写開始部位のマッピング：最初には、転写開始部位のマッピングをプライマー伸長方法を用いて試みた。様々な異なる末端標識５’オリゴヌクレオチド、およびヒトの肺とヒトの心臓との両方のポリＡ＋ｍＲＮＡ、ならびにヒト包皮の繊維芽細胞から単離された総ＲＮＡを用いると、長時間露出の後でさえも陽性シグナルは取得されなかった。この結果は技術に起因するものとは思われず、それはＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡのインビトロ転写によって作製されるＲＮＡを用いて陽性シグナルを取得することができなかったためである。この技術を用いては成功が得られないことが、ＥＣ− ＳＯＤをコードするｍＲＮＡの量が非常に低いことか、もしくは他の問題（一つもしくは複数）に起因するか否かは明らかではない。低量のｍＲＮＡという仮定の下に、このシグナルをＰＣＲ増幅する目的でｃＤＮＡの迅速増幅の技術を試みた。ＥＣ−ＳＯＤ遺伝子特異的プライマーＥＣ７を図２２に示されるようにハイブリダイゼーションおよびヒト心臓のポリＡ＋ｍＲＮＡの逆転写用に用いた。この反応物の半分に末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて３’ ｄＣテイル付加を施し、そして残りの半分にはその処理を施さなかった。その後にこれらの鋳型を、遺伝子特異的プライマーＨＥＣ１＋ＥＣ７、ならびにアンカープライマー＋ＥＣ４を用いるＰＣＲ増幅に供した。これらの反応の産物をアガロース電気泳動により分画化し、ナイロン膜に転移させ、そして中間部組重ね遺伝子特異的プライマーＨＥＣ２での探索を行った。この実験のオートラジオグラムは図２２Ａに示される。ＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡ（対照鋳型として）およびＨＥＣ１＋ＥＣ７を用いる場合は、２１７ｂｐのバンドが予想される（図２２Ａのレーン３）。プライマーＨＥＣ１およびＥＣ７はｄＣテイルに独立に増幅を行うことが予期されるため、レーン４および５において等強度のバンド（これらはＥＣ−ＳＯＤ対照と同一サイズでもある）が観察される。アンカープライマー（これはｄＣテイルにハイブリダイズする）およびＥＣ４を用いると、〜１９０ｂｐの１本のバンドのみが見られた（レーン１）。この鋳型はポリＣテイルを有していなかったため、レーン２は予想どおりにシグナルを全く示さなかった。４８ｂｐを引き去ることにより（アンカープライマーのサイズ）、逆転写されたＤＮＡのサイズはＥＣ４プライマーの５’側の〜１３６ｂｐに相当するであろう。この分析により、このｃＤＮＡクローン上には約６塩基対の追加的５’配列が存在すること、および転写開始は第一イントロン（斜線付き四角形により示される）の約６ｂｐ上流で開始することが予想される。真核生物の転写開始は通常アデノシン残基で開始するものの、これはＧで開始するであろうことが予想される（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈｅｔａｌ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９（１９８１））：ゲノムのサザンブロット分析：ヒトのＥＣ−ＳＯＤ遺伝子の特徴決定を開始するために、１０μｇの全ヒトゲノムＤＮＡを制限消化し、そしてこの反応産物をアガロースゲル上で電気泳動し、それに次いでナイロン膜に転移させた。ブロットは［³²Ｐ］−標識部分的ＥＣ −ＳＯＤｃＲＮＡで探索した。このブロットのオートラジオグラムが図２３に示される。各レーンについて示されるように、各制限消化物に関連する独特のバンドが存在する。偽遺伝子を示唆する可能性のあるシャドウバンドは観察されなかった。全長ｃＲＮＡプローブをＫｐｎＩ消化させたＤＮＡについて用いた際にはこの遺伝子の３’末端に相当する〜４０００ｂｐの追加的バンドが観察された。その上、このＫｐｎＩレーンは０．５ｋｂのバンドを示し、これは他のブロットよりもより良い状態で観察された。このバンドパターンはヒトＥＣ−ＳＯＤクローン＃７の制限マップに類似していた（図２０Ａを参照せよ）。ヒトＥＣ−ＳＯＤの単離およびＤＮＡ配列決定による特徴決定：複数の独立した陽性クローンが、ＥＭＢＬ−３中に構築されたヒト成人白血球のゲノムライブラリーから同定された。これらのクローンについて広範囲にわたる制限エンドヌクレアーゼマッピングを行い、そしてその挿入断片の相対的方向を決定する目的でＥＣ−ＳＯＤ特異的５’および３’オリゴヌクレオチドでの探索を行った。これらの結果に基づいてクローン＃７を更に進んだ分析用に選択した。クローン＃７は約１８〜２０ｋｂであり、そして少なくとも５０００ｂｐの５’フランクＤＮＡおよび少なくとも４０００ｂｐの３’フランクＤＮＡを含む。クローン＃７の制限マッピングが図２０Ａに示される。このマップはゲノムのサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ブロット分析データに関して取得された結果に類似しており、このことによりクローン＃７がＥＣ−ＳＯＤ遺伝子を含むことが示される。クローン＃７をサブクローン化および配列決定するための手法が図２０Ｂに示される。様々なサイズの近接した制限断片および重複した制限断片をプラスミドベクターｐＧＥＭ３２ｆ（＋）中にサブクローン化した（図２０Ｂ）。このＤＮＡ挿入断片を、プライマーウォーキングおよびベクター特異的ユニバーサル配列決定用プライマーの組み合わせを用いて両鎖についての配列決定を行った。７Ｋ３６挿入断片の３’側半分は一本の鎖のみの配列決定を行った。ヒトのＥＣ −ＳＯＤｃＤＮＡについての公開されている配列データ（Ｈｊａｌｍａｒｓｓｏｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：６３４０（１９８１））ならびに追加的５’非翻訳データを含む独立したｃＤＮＡクローンから取得されたＤＮＡ配列情報（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎｅｔａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ８：７３６（１９９０））を用いてゲノムのイントロン／エキソン構造を決定した。これらのデータとゲノム配列情報との比較を基にして、ヒトＥＣ−ＳＯＤ遺伝子は３つのエキソンおよび２つのイントロンを含むと決定された（図２０Ｃ）。エキソン１は少なくとも５塩基対を含み、そしておそらくはより大きく（約６塩基対まで）、それは転写開始の正確な出発点が決定されなかったためである（以下に記載がなされている）。エキソン２は８４ｂｐを含み、かつエクソン１からイントロン１として記載される５７２ｂｐの介在性配列により分断されている。エキソン３はイントロン２（これは３８４９ｂｐのセグメントである）によりエキソン２から分断されている。エキソン３は合計１３３６ｂｐを含み、そしてこのエキソン内に１７ｂｐ進んだ地点でｐｒｅＥＣ− ＳＯＤのための完全なコーディング配列の開始が始まる（図２０Ｄ）。この配列は１８アミノ酸のシグナルペプチドを含み、その後に２２２アミノ酸の成熟蛋白質配列が存在する。ＥＣ−ＳＯＤの様々な構造的ドメインを分割するイントロンは存在しない。これらのドメインは概略的に図２０Ｄに示されており、グリコシル化されているＡｓｎ−８９を含むアミノ酸１〜９５を含み、かつ他の蛋白質とは配列相同性を示さない。残基９６〜１９３は酵素の触媒作用および構造において重要な決定的なアミノ酸の保存に関しては、ＣｕＺｎ−ＳＯＤ蛋白質配列と高い相同性を示す。アミノ酸１９４〜２２２は硫酸化プロテオグリカンへの結合の際に重要であることが示されている複数の荷電残基を含む。仮想的調節用因子を含む５５８ｂｐの５’−フランク領域、および３６７５ｂｐの３’−フランク領域も配列決定を行った。エキソンのＤＮＡ配列データは公開されているｃＤＮＡ配列と一致している（Ｈｊａｌｍａｒｓｓｏｎｅｔａｌ．、ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．ＵＳＡ８４：６３４０（１９８７））。イントロン −エキソン境界部分が表ＶＩＩＩに示されており、そしてこれは真核生物の共通スプライス配列に一致している（Ｓｅｎａｐａｔｈｙｅｔａｌ．、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１８３：２５２（１９９０））。両イントロン共、ＥＣ−ＳＯＤ遺伝子の５’−非翻訳領域内の配列を分断している。図２４はヒトＥＣ−ＳＯＤ遺伝子の全配列を示す。エキソン配列が四角で囲まれた大文字で示され、イントロン、５’および３’フランク配列は小文字で示される。エキソン３はＥＣ−ＳＯＤの完全な連続するコーディング領域を含み、そしてその蛋白質配列が一文字アミノ酸コードを用いて示されている。１８アミノ酸のシグナルペプチドおよび２２２アミノ酸の成熟蛋白質配列にハイライトを施してある。シグナルペプチド開裂部位の同定部は、真核生物のシグナルペプチド開裂の部位を予測するコンピューターアルゴリズムのものと一致している（Ｆｏｌｚｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４６：８７０（１９８７）；ＶｏｎＨｅｉｊｎｅ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７（１９８３））。転写因子データベース調査を用いて転写調節因子を仮想的に同定した。殆ど全ての真核生物プロモーターがＴＡＴＡボックス因子を利用して転写開始の位置を固定しているが、ＥＣ−ＳＯＤ遺伝子については明らかなＴＡＴＡボックスを認めることができない。２つのＣＡＡＴボックス因子が同定された。一つのものは逆方向になっており、かつ第一エキソンの約２０ｂｐ上流に位置していた。一方、第二のものは約３３５ｂｐ上流に見いだされる。ポリアデニル化のための仮想的シグナルが示され、そしてポリＡアデニル化の部位が示されている。５’−非翻訳領域および第一イントロンの転写因子データベース調査により幾つかの可能な調節因子が同定された。アデノウイルス転写ウイルス（ＡＴＦ）因子に類似するｃＡＭＰ応答性因子（ＣＲＥＢ）（ＴＧＡＣＧＴ）が１２１ｂｐで開始することを見いだすことが可能である（Ｆｉｎｋｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：６６６２（１９８８）；Ｓａｓｓｏｎｅ− Ｃｏｒｓｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：７１９２（１９８８））。グルココルチコイド応答因子（ＧＲＥ）（ＴＧＴＣＣＴ）のための半分の部位が３７０ｂｐに位置している（Ｋａｒｉｎｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３０８：５１３（１９８４））。骨格筋特異的トランス−活性化因子応答因子（Ｍ−ＣＡＴ）（ＣＡＴＴＣＣＴ）が逆方向で見いだされ、これは位置２３８で開始している（Ｍａｒｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２７１（１９９０））。生体異物応答性因子（ＸＲＥ）（ＣＡＣＧＣＷ）が第一イントロン内の位置１０８５ｂｐに見いだされ（Ｒｕｓｈｍｏｒｅｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４６４８（１９９０））。金属調節因子（ＭＲＥ）（ＴＧＣＲＣＹＣ）が位置８９に見いだされる（Ｃｕｌｏｔｔａｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１３７６（１９８９））。２つの仮想的抗酸化剤応答因子（ＡＲＥ）（ＲＧＴＧＡＣＮＮＮＧＣ）が位置６５０および５０２２に見いだされる（Ｒｕｓｈｍｏｒｅｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１６３２（１９９１））。ｃ−ｆｏｓプロトオンコジンの誘導の際に重要なシス応答性因子（ＳＩＦ）（ＣＣＣＧＴＣ）が位置２５１に逆方向で見いだされる（Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．、ＥＭＢＯＪ．９：４４７７（１９９０））。ＡＰ１結合性部位すなわちＴＰＡ応答性因子（ＴＲＥ）（ＴＧＡＣＴＣＡ）が存在し、これは位置１６２において見いだされる（Ｒｉｓｓｅｅｔａｌ．、ＥＭＢＯＪ．８：３８２５（１９８９））。ＳＶ４０エンハンサー領域ＡＰ４（ＣＡＧＣＴＧＴＧＧ）を位置１７１に見いだすことが可能である（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．２：２６７（１９８８））。実施例ＶＩＥＣ−ＳＯＤにおける遺伝子欠損についての患者のスクリーニング患者からの白血球由来ゲノムＤＮＡの調製：正常で健常な対照患者、ならびに喘息、原発性肺高血圧症、および続発性肺高血圧症の患者が同定されるであろう。ゲノムＤＮＡはＱｉａｇｅｎＢｌｏｏｄＰＣＲＫｉｔを利用して精製されるであろう。〜１０⁷の白血球／ｍｌを含む１ｍｌの血液が各患者もしくは対照被検体からクエン酸ナトリウム中に回収されるであろう。この血液をＱＩＡＧＥＮ−スピンカラム内に入れ、そして白血球を短時間の遠心分離により樹脂内に捕獲し、一方で赤血球およびヘモグロビンを洗い流す。この白血球を０．７ｍｌの溶菌用緩衝液の添加により溶菌させ、そして室温で３０分間インキュベートする。放出されるＤＮＡは試験管内の樹脂に結合する。残存する細胞破片を複数回の洗浄／スピン周期により洗い落とす。ＤＮＡを１．２ＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＭＯＰＳ、１５％のエタノール、ｐＨ８．３の添加により溶出させる。この作業により典型的には〜１０μｇのゲノムＤＮＡが取得される（Ｒｅｉｈｓａｕｓｅｔａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：３３４（１９９３））。プライマーの設計およびＥＣ−ＳＯＤエキソン配列のＰＣＲ増幅：３’ＧＣクランプを含むセンスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチドプライマー（もしくはゲノムＤＮＡの配列決定から既に取得されているプライマーを用いる）が設計されるであろう（Ｓｈｅｆｆｅｌｄｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２３２（１９８９））。これらのプライマーはＥＣ−ＳＯＤ遺伝子のイントロン非含有性コーディング領域をコードするであろう。３’非翻訳領域内の１７２ｂｐ領域は、ＤＮＡ配列決定用プライマーおよびヒトゲノムＤＮＡを用いて既に増幅されている。ＰＣＲ条件は既述のとおりであり（Ｒｅｉｈａｕｓｅｅｔａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：３３４（１９９３）；Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ（ｅｄｓ）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＳａｎＤｉｅｇｏｐｐ．１〜１２（１９９０）、Ｔａｑポリメラーゼを用い、以下に記載される温度周期を用いる：９５℃で５分間の初期変性、それに次ぐ３５周期分の２０秒間の９４℃での変性、１５秒間の５７℃でのアニーリング、および４５秒間の７２℃での伸長化。ＧＣ組成および実際のプライマー配列のために、各セットのプライマーを用いるＰＣＲ増幅のために実験的に条件を至適化させることが必要となろう。３セットのプライマーを用いれば全コーディング領域が網羅されるであろう。一本鎖の立体配座的多形性（ＳＳＣＰ）分析での突然変異の同定：ＳＳＣＰ分析が単一塩基対ミスマッチを検出するのに用いれられてきている（Ｏｒｉｔａｅｔａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ５：８７４（１９８９））。温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）が移動度の差異を検出するのに用いられるであろう（Ｗａｒｔｅｌｌｅｔａｌ．、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：２６９９（１９９０））。ＴＧＧＥ用の試料は、ＰＣＲ産物を９８℃で５分間熱変性させ、次いでクローン化遺伝子のＰＣＲから取得される対応性野生型ＤＮＡと共に５０℃で１５分間復元させることにより調製されるであろう。電気泳動は、５％のアクリルアミド、８Ｍの尿素ゲル上で、温度勾配に関して実施されるであろう。この温度勾配は各ＥＣ−ＳＯＤＤＮＡセグメントについて至適化されるであろう。β₂ −アドレナリン様レセプター突然変位の検出用の典型的な勾配は３５℃から６０ ℃までの間であり、かつ４〜６時間の泳動時間を必要とした（Ｒｏｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ２６２：５９（１９９３））。ＴＧＧＥにより突然変位について陽性であることが見いだされた全ＰＣＲ試料は、ジデオキシ技術（Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３（１９７７））を直接使用して配列決定されるであろう。実施例ＶＩＩキサンチンオキシダーゼの阻害最初の調査ではアッセイを、５０ｍＭの炭酸塩緩衝液、ｐＨ１０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｎＭのキサンチンオキシダーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社）を含む１ｍｌの石英キュベット中、２５℃で実施した。キサンチンオキシダーゼ活性は２９５ｎｍにおいて時間に伴うキサンチンの喪失を追跡することにより分光測光法で測定した。キサンチンの４つの濃度（２５、５０、２５０、５００μＭ）およびＭｎＴＢＡＰの２つの濃度（５、１０μＭ）を用いた。その後に２つの阻害定数を、曲線修正差（Ｋｉｉ＝５．５μＭ）および傾斜（Ｋｉｓ＝１５μＭ）から取得した。図２５に示される結果により、ＭｎＴＢＡＰはキサンチンオキシダーゼを非競合的様式で阻害することが示される。第二調査では、ウシ肺動脈内皮細胞培養物（ＣＰＡ−４７（ＴｉｓｓｕｅａｎｄＣｅｌｌ１０：５３５（１９８７））を密集するまで１０％のウシ胎仔血清を含むハム（Ｈａｍ）のＦ−１２Ｋ培地中、ｐＨ７．４および３７℃で増殖させた。その後に細胞をトリプシン処理し、そして２４ウエルプレート中に同密度で撒種し、そして９０％密集になるまで増殖させた。細胞を洗浄し、そして最少必須培地（ＭＥＭ）中の５０μＭのＭｎＴＢＡＰもしくはＭＥＭ単独を用いて１時間予備インキュベーションした。様々な量のキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）に加えて２００μＭのキサンチン（Ｘ）を添加し、そして２４時間インキュベートさせた。細胞損傷を、培地中への細胞性ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより定量化した。ＭｎＴＢＡＰの効力は、ＸＯ／Ｘ −誘導化ＬＤＨ放出の減少により図２６に示される。実施例ＶＩＩＩパラコート−誘導化損傷からの細胞性防御を可能にするＳＯＤ擬態物ラットの肺上皮細胞培養物（Ｌ２（ＫａｉｇｈｎａｎｄＤｏｕｇｌａｓ、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．５９：１６０ａ（１９７３））を密集するまで１０％のウシ胎仔血清を含むハム（Ｈａｍ）のＦ−１２Ｋ培地中、ｐＨ７．４および３７℃で増殖させた。その後に細胞をトリプシン処理し、そして２４ウエルプレート中に同密度で撒種し、そして９０％密集になるまで増殖させた。細胞を洗浄し、そしてＭＥＭ中の１００μＭのＭｎＴＢＡＰもしくはＭｎＴＭＰｙＰ、あるいはＭＥＭ単独を用いて１時間予備インキュベーションした。パラコート（２．５ｍＭ）を添加し、そして４８時間インキュベートさせた。細胞損傷を、培地中への細胞性ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより定量化した。図２７は、ＭｎＴＭＰｙＰ（平行線付きの棒グラフ）およびＭｎＴＢＡＰ（グレーの棒グラフ）はパラコート−誘導化ＬＤＨ放出を減少させることを示す。別の調査では、ウシ肺動脈内皮細胞培養物（ＣＰＡ−４７（ＴｉｓｓｕｅａｎｄＣｅｌｌ１０：５３５（１９８７））を密集するまで１０％のウシ胎仔血清を含むハム（Ｈａｍ）のＦ−１２Ｋ培地中、ｐＨ７．４および３７℃で増殖させた。その後に細胞をトリプシン処理し、そして２４ウエルプレート中に同密度で撒種し、そして９０％密集になるまで増殖させた。細胞を洗浄し、そしてＭＥＭ中の様々な濃度のＭｎＴＢＡＰもしくはＭＥＭ単独を用いて１時間予備インキュベートさせた。パラコート（２ｍＭ）を添加し、そして２４時間インキュベートさせた。細胞損傷を、培地中への細胞性ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより定量化した。ＭｎＴＢＡＰは用量依存的様式でパラコート−誘導性ＬＤＨ放出を減少させる（図２８を参照せよ）。ＭｎＴＢＡＰとは対照的に、ＺｎＴＢＡＰはパラコート−誘導性損傷に対する防御を行わない。ウシ肺動脈内皮細胞培養物（ＣＰＡ−４７）を密集するまで１０％のウシ胎仔血清を含むハム（Ｈａｍ）のＦ−１２Ｋ培地中、ｐＨ７．４および３７℃で増殖させた。その後に細胞をトリプシン処理し、そして２４ウエルプレート中に同密度で撒種し、そして９０％密集になるまで増殖させた。細胞を洗浄し、そしてＭＥＭ中の様々な濃度のＺｎＴＢＡＰもしくはＭＥＭ単独を用いて１時間予備インキュベートさせた。パラコート（２ｍＭ）を添加し、そして２４時間インキュベートさせた。細胞損傷を、その培地中への細胞性ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより定量化した。図２９に示される結果により、ＺｎＴＢＡＰはＳＯＤ−様活性を保持しないことが証明される。ＺｎＴＢＡＰを陰性対照として用いて、酸化還元金属はパラコート毒性に対する防御において重要であることを示すことが可能である。実施例ＩＸパラコート−誘導性肺損傷に対するＭｎＴＢＡＰによる防御マウスに、パラコート（ＰＱ、４５ｍｇ／ｍｌ、腹膜内注射）もしくは食塩水（１０ｍｌ／ｋｇ、腹膜内注射）のいずれかでの処理を施し、そしてＭｎＴＢＡＰ（２．５ｍｇ／ｍｌ、２Ｌ／分で３０分間、２日間毎日２回２Ｌのチャンバー内に噴霧した）もしくは室内の空気に露出させた。マウスを処理開始後４８時間目に殺し、そして肺損傷を気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）の分析により評定した。用いたＢＡＬＦ損傷マーカーは、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）単位／Ｌとして）、蛋白質濃度（ｍｇ／ｄｌとして）、および多型核白血球（ＰＭＮ）のパーセンテージであった。ＭｎＴＢＡＰ処理により、パラコート−誘導性肺損傷に対する部分的防御が提供された（図３０を参照せよ）。先に引用される全文献は、引用によりその全内容が本明細書に取り込まれる。当業者はこの開示を読むことにより、形態および詳細における様々な改変物を本発明の真の範囲から逸脱することなく作製可能であることを認識するであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者クラポ，ジェームズ・ディーアメリカ合衆国ノースカロライナ州27705, ダーラム，ティスデール・ストリート 1728 (72)発明者フリドヴィッチ，アーウィンアメリカ合衆国ノースカロライナ州27707, ダーラム，コートランド・ドライブ 3517 (72)発明者アウリー，ティムアメリカ合衆国ノースカロライナ州27704, ダーラム，バナー・ストリート 2423 (72)発明者デイ，ブライアン・ジェイアメリカ合衆国ノースカロライナ州27707, ダーラム，ユニバーシティ・ドライブ 3611 ナンバー３ワイ (72)発明者フォルツ，ロドニー・ジェイアメリカ合衆国ノースカロライナ州27706, ダーラム，クランフォード・ロード 2222 (72)発明者フリーマン，ブルース・エイアメリカ合衆国アリゾナ州35223，バーミンガム，ダンバントン・サークル 3753

Claims

【特許請求の範囲】１．窒素含有大環状成分および細胞表面もしくは細胞外マトリックス標的化成分、またはそれらの薬学的に許容される塩を含む、スーパーオキシドディスムターゼの模倣物。２．前記大環状成分がポルフィリンである、請求項１記載の模倣物。３．前記ポルフィリンがテトラキス（４−安息香酸）ポルフィリンである、請求項１記載の模倣物。４．次式：［式中、ここで、Ｘはハロゲンであり、Ｙはアルキル基であり、Ｒ₂は、結合、−（ＣＹ'₂）_n ^-、−（ＣＹ'₂−ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^-、−（ＣＹ'₂− ＣＹ'₂−ＣＨ＝ＣＨ）_n ^-、−（ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^- または１から８であり；Ｒ₃は、−Ｙ"、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｎ⁺（Ｙ"）₃、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ^-、− ＳＯ₃Ｈ、−ＳＯ₃ ^-、−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ₂または−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ^-であり、ここでＹ"はアルキル基であり；Ｒ₃はＹ”ではなく、Ｒ₃は−Ｙ"、−Ｎ⁺（Ｙ"）₃またはＣＯＯＨではない］のスーパーオキシドディスムターゼ模倣物またはその薬学的に許容される塩。５．前記模倣物が、マンガン、銅および鉄からなる群より選択される金属に錯体化している、請求項１または４に記載の模倣物。６．前記標的化成分が、（ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ）_n−Ｈ［式中、ｎは１から６である］；ＮＨ₂−Ｈis Ａrg Ｈis Ｈis Ｐro Ａrg Ｇlu Ｍet Ｌys Ｌys Ａrg Ｖal Ｇlu Ａsp Ｌeu−ＣＯＯＨ；ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ｇlu Ｓer Ｇlu Ｃys Ｌys Ａla Ａla−ＣＯＯＨ；ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ｇlu−ＣＯＯＨ；ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ａla−ＣＯＯＨ；ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ａla Ｓer Ｇlu Ｃys Ｌys Ａla Ａla−ＣＯＯＨ；ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ｇlu Ｓer Ｇlu Ａla Ｌys Ａla Ａla−ＣＯＯＨ；ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ｇlu Ｓer Ｇlu Ｃys Ａla Ａla Ａla−ＣＯＯＨ；ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ａla Ｓer Ａla Ｃys Ｌys Ａla Ａla−ＣＯＯＨ；ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ａrg Ａrg Ａrg Ａla Ｓer Ｇlu Ｃys Ａla Ａla Ａla−ＣＯＯＨ；ＮＨ₂−Ａrg Ｇlu Ｈis Ｓer Ｇlu Ａrg Ｌys Ｌys Ｇly Ａrg Ａrg Ａla Ｓer Ｇlu Ｃys Ａla Ａla Ａla−ＣＯＯＨ；および（Ａrg）_n、（Ｌys）_n、（Ａrg）_n（Ｌys）_n、（ＡrgＬys）_n、（ＬysＡrg）_n、（ＬysＬysＡrgＡrg）_n［式中、ｎは１から１２である］からなる群より選択される、請求項１記載の模倣物。７．細胞をスーパーオキシドラジカル誘導毒性から防御する方法であって、前記細胞を、無毒性量の前記防御を達成するのに十分な量の請求項１記載の模倣物または次式：［式中、ここで、Ｘはハロゲンであり、Ｙはアルキル基であり、Ｒ₂は、結合、−（ＣＹ'₂）_n ^-、−（ＣＹ'₂−ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^-、−（ＣＹ'₂− ＣＹ'₂−ＣＨ＝ＣＨ）_n ^-、−（ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^- または１から８であり；Ｒ₃は、−Ｙ"、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｎ⁺（Ｙ"）₃、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ^-、− ＳＯ₃Ｈ、−ＳＯ₃ ^-、−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ₂または−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ^-であり、ここでＹ"はアルキル基である］の模倣物であって、マンガン、銅および鉄からなる群より選択される金属に錯体化していてもよい模倣物またはその薬学的に許容される塩と接触させることを含む方法。。８．前記模倣物がマンガン、銅および鉄からなる群より選択される金属に錯体化している、請求項７記載の方法。９．前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項７記載の方法。１０．前記細胞が植物細胞である、請求項７記載の方法。１１．物質の酸化およびそれに続くＯ₂ ^-の形成に起因する損傷を阻害する方法であって、前記物質を、無毒性量の前記阻害を達成するのに十分な量の請求項１記載の模倣物または次式：［式中、ここで、Ｘはハロゲンであり、Ｙはアルキル基であり、Ｒ₂は、結合、−（ＣＹ'₂）_n ^-、−（ＣＹ'₂−ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^-、−（ＣＹ'₂− ＣＹ'₂−ＣＨ＝ＣＨ）_n ^-、−（ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^- または１から８であり；Ｒ₃は、−Ｙ"、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｎ⁺（Ｙ"）₃、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ^-、− ＳＯ₃Ｈ、−ＳＯ₃ ^-、−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ₂または−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ^-であり、ここでＹ"はアルキル基である］の模倣物またはその薬学的に許容される塩と接触させることを含む方法。１２．前記模倣物がマンガン、銅および鉄からなる群より選択される金属に錯体化している、請求項１１記載の方法。１３．スーパーオキシドラジカル誘導性のＮＯ・の分解に起因する患者の病理学的状態を治療する方法であって、前記患者に、有効量のスーパーオキシドディスムターゼ活性を有する化合物を、前記治療が達成される条件下で投与することを含む方法。１４．前記化合物が蛋白質性化合物である、請求項１３記載の方法。１５．前記化合物がＳＯＤの模倣物である、請求項１３記載の方法。１６．前記模倣物がポルフィリン環含有模倣物である、請求項１５記載の方法。１７．グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合成分が前記模倣物に結合している、請求項１５記載の方法。１８．前記ＧＡＧ結合成分が、ヘパリン結合親和性を有するＥＣ−ＳＯＤのＣ末端もしくはその部分に対応する、請求項１７記載の方法。１９．前記ＧＡＧ結合成分が、正に荷電したアミノ酸の繰り返しを含む、請求項１７記載の方法。２０．そのような治療を必要とする患者において炎症性状態を治療する方法であって、前記患者に有効量のＳＯＤもしくはＥＣ−ＳＯＤの模倣物を前記治療が達成される条件下で投与することを含む方法。２１．ＧＡＧ結合成分が前記模倣物に結合している、請求項２０記載の方法。２２．前記ＧＡＧ結合成分が、ヘパリン結合親和性を有するＥＣ−ＳＯＤのＣ末端もしくはその部分に対応する、請求項２１記載の方法。２３．前記ＧＡＧ結合成分が、正に荷電したアミノ酸の繰り返しを含む、請求項２１記載の方法。２４．そのような治療を必要とする患者において異常な平滑筋機能に起因する疾患を治療する方法であって、前記患者に有効量のＳＯＤもしくはＥＣ−ＳＯＤの模倣物を前記治療が達成される条件下で投与することを含む方法。２５．ＧＡＧ結合成分が前記模倣物に結合している、請求項２４記載の方法。２６．前記ＧＡＧ結合成分が、ヘパリン結合親和性を有するＥＣ−ＳＯＤのＣ末端もしくはその部分に対応する、請求項２５記載の方法。２７．前記ＧＡＧ結合成分が、正に荷電したアミノ酸の繰り返しを含む、請求項２５記載の方法。２８．それに結合したＧＡＧ結合成分を有するＥＣ−ＳＯＤの模倣物。２９．前記結合成分が、ヘパリン結合親和性を有するＥＣ−ＳＯＤのＣ末端もしくはその部分に対応する、請求項２８記載の模倣物。３０．前記ＧＡＧ結合成分が、正に荷電したアミノ酸の繰り返しを含む、請求項２８記載の模倣物。３１．請求項１、４または２８に記載の模倣物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。３２．容器手段内に配置されている請求項１、４または２８に記載の模倣物を含むキット。３３．図２４に示される配列もしくはその少なくとも１８ヌクレオチド長の部分を有する、単離されたＥＣ−ＳＯＤ遺伝子。３４．前記部分が前記遺伝子の非コーディング領域に対応する、請求項３３載の遺伝子。３５．細胞または組織のキサンチンオキシダーゼ活性を阻害する方法であって、前記細胞または組織を、前記阻害が達成されるのに十分な量の請求項１記載の模倣物または次式：［式中、ここで、Ｘはハロゲンであり、Ｙはアルキル基であり、Ｒ₂は、結合、−（ＣY'₂）_n ^-、−（ＣＹ'₂−ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^-、−（ＣＹ'₂−ＣＹ'₂−ＣＨ＝ＣＨ）_n ^-、−（ＣＹ'＝ＣＹ'）_n ^- または１から８であり；Ｒ₃は、−Ｙ"、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｎ⁺（Ｙ"）₃、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ^-、− ＳＯ₃Ｈ、−ＳＯ₃ ^-、−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ₂または−Ｃ−ＰＯ₃Ｈ^-であり、ここでＹ"はアルキル基である］の模倣物であって、マンガン、銅および鉄からなる群より選択される金属に錯体化していてもよい模倣物またはその薬学的に許容される塩と接触させることを含む方法。３６．前記病理学的状態が、前記患者の肺におけるものであり、前記投与が前記患者の気道に対してなされ、かつ、前記化合物が細胞外スーパーオキシドディスムターゼの組織特異性を有する、請求項１３記載の方法。